Despre Catina

ing.
Ionu GOTEA

Studiul variabilitii genetice cu
ajutorul markerilor moleculari la
specia dioic Hippopha rhamnoides L.
ssp. carpatica Rousi

Rezumat al tezei de doctorat

Conductor tiinific:
Prof. Dr. Doru PAMFIL

Cluj-Napoca
2010

CUPRINS
Cuprins................................................................................................................................................ 1
Introducere ......................................................................................................................................... 3
Capitolul I. Stadiul actual al cunoaterii.......................................................................................... 4
1.1. Importana economic i cultural a speciei Hippophae rhamnoides....................................... 4
1.2. Stadiul actual al cunoaterii...................................................................................................... 5
Capitolul II. Cadrul i obiectivele cercetrilor................................................................................ 9
2.1. Particulariti i aspecte din zonele studiate............................................................................. 9
2.2.1. Zona Deltei Dunrii ..................................................................................................... 9
2.2.2. Judeul Mure............................................................................................................. 10
2.2.3. Judeul Cluj ................................................................................................................ 10
2.2. Concluzii privind amplasarea geografic ............................................................................... 12
2.3. Obiective propuse................................................................................................................... 13
Capitolul. III. Materialul biologic i metodele de lucru................................................................ 14
3.1. Materialul biologic ................................................................................................................. 14
3.2. Metode de determinare a apropierii genetice la genotipurile studiate.................................... 14
3.3. Metode de determinare a germinaiei seminelor ................................................................... 18
3.4. Metode statistico-matematice utilizate n prelucrarea i interpretarea rezultatelor studiului
variabilitii fenotipice i genotipice ............................................................................................. 20
3.5. Metode statistico-matematice utilizate n prelucrarea i interpretarea rezultatelor studiului
variabilitii moleculare................................................................................................................. 20
3.6. Metode pentru determinarea coninutului de substan uscat din fructe .............................. 21
Capitolul IV. Rezultate i discuii ................................................................................................... 23
4.1. Rezultate obinute privind variabilitatea existent la ctin, prin aplicarea metodelor de
determinare a apropierii filogenetice............................................................................................. 23
4.1.1. Rezultatele aplicarii metodei taxonomice la genotipurile provenite din flora spontan,
pe baza caracteristicilor plantelor i semintelor ................................................................... 23
4.2. Rezultate obinute privind variabilitatea existent la ctin, prin studiul principalelor
caracteristici ale seminelor ........................................................................................................... 24
4.2.1. Caracteristicile seminelor obinute de la plantele din zona Deltei Dunrii .............. 24
4.2.2. Caracteristicile seminelor obinute de la plantele din judeului Mure..................... 25
4.2.3. Caracteristicile seminelor obinute de la plantele din judeului Cluj ........................ 25
4.2.4. Variabilitatea greutii seminelor la populaiile din cele trei zone luate n studiu.... 25
2
4.3. Rezultate obinute privind variabilitatea existent la catin prin aplicarea metodelor de
markare molecular ....................................................................................................................... 26
4.3.1. Rezultatele izolrii ADN-ului .................................................................................... 27
4.3.2. Rezultatele amplificrii ADN-ului............................................................................. 27
4.3.3. Dendrograma populaiilor de ctin analizate din flora spontan.............................. 28
4.4. Rezultate obinute privind variabilitatea existent la ctin, prin studiul principalelor
caracteristici ale fructelor .............................................................................................................. 31
4.4.1. Caracteristicile fructelor obinute de la plantele din zona Deltei Dunrii.................. 31
4.4.2. Caracteristicile fructelor obinute de la plantele din zona judeului Mure ............... 32
4.4.3. Caracteristicile fructelor obinute de la plantele din zona judeului Cluj .................. 32
4.4.4. Variabilitatea greutii fructelor la populaiile luate n studiu................................... 32
4.4.5. Corelaiile fenotipice dintre greutatea seminelor i greutatea fructelor n populaiile
studiate ................................................................................................................................. 33
4.5. Rezultate obinute privind mbuntirea capacitii de germinaie a seminelor i
posibilitatea aplicrii unor tratamente de cretere a procentului de germinare ............................. 34
4.5.1. Rezultate obinute prin determinarea energiei germinative a seminelor................... 34
4.5.2. Rezultate obinute prin determinarea capacitii de germinare a seminelor ............. 35
4.6. Rezultate obinute privind variabilitatea existent la ctin, prin studiul substanei uscate din
fructe.............................................................................................................................................. 37
Capitolul V. Concluzii i recomandri ........................................................................................... 38
Bibliografie selectiv ........................................................................................................................ 41
Introduction...................................................................................................................................... 45
Proposed objectifs ............................................................................................................................ 45
Material and methods ...................................................................................................................... 46
Conclusions ....................................................................................................................................... 47

3

INTRODUCERE

Teza de doctorat Studiul variabilitii genetice cu ajutorul markerilor moleculari la specia
dioic Hippopha rhamnoides L. ssp. carpatica Rousi are ca obiect studiul variabilitii fenotipice,
genotipice i moleculare la ctina alb (Hippopha rhamnoides L. ssp. carpatica Rousi) n trei zone
din ara noastr n care acest arbust crete n mod spontan, i anume: judeul Cluj, judeul Mure i
Delta Dunrii.
Raportat la cercetrile efectuate n ara noastr pn n prezent putem spune c acest studiu
se distinge prin originalitate deoarece analiza la nivel molecular pentru aceast specie a fost fcut
pentru prima dat n ara noastr la aceast specie. Studiile anterioare, dintre care cel mai amnunit
fiind cel al botanistului Emil opa (opa 1960), si nici cele mai actuale, nu trateaz din punct de
vedere molecular variabilitatea acestei specii la noi n ar.
La nivel mondial, putem enumera ca i elocvente n aceast privin studiile lui (Bartish et al.
1999) i cel a lui (Kun Sun 2006) care trateaz problematica variabilitii genetice la nivel
populaional la alte dou subspecii, i anume subspecia rhamnoides i sinensis. Rezultatele lor
asemntoare, confirm rezultatele obinute n prezenta tez de doctorat.
Motivaia alegerii acestei teme se datoreaz dorinei mele de cunoatere a acestei plante i de
identificare a unor genotipuri valoroase care s poat fi introduse mai apoi n culturi intensive pentru
producerea de fructe.
Toate plantele identificate la noi n ar corespund subspeciei carpatica, identificate de ctre
Rousi n 1971.
n cadrul tezei mele de doctorat, mi-am propus ca i prim etap identificarea pe criterii
morfologice a unor genetipuri valoroase din punct de vedere al fructificaiei, n ceea ce privete
plantele femele i din punct de vedere al numrului de muguri florali masculi, n ceea ce privete
plantele mascule.
Am rmas surprins s constat ct este de mare variabilitate formelor i a mrimii fructelor
ntlnite la aceast specie n arealele cercetate, ct i a numrului de ameni la plantele mascule.
Acest lucru este un fapt mbucurtor din punct de vedere al amelioratorului, din prisma numrului
mare de posibiliti de alegere al unor genetopuri valoroase.
Caracterizarea molecular a indivizilor luai n studiu s-a realizat cu ajutorul markerilor
RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA). Aceast etap s-a desfurat n cadrul
Departamentului de Biotehnologii al USAMV-Cluj-Napoca, avnd ca suport financiar grantul
CNCSIS tip TD, pe care l-am ctigat n 2006 n cadrul competiiei CNCSIS. n acelai an am
obinut i o burs CNCSIS BD pentru tineri doctoranzi care a contribuit de asemenea la finalizarea
cercetrilor intreprinse.
Pe parcursul anilor de doctorat am depus o munc consistent de aducere din teren i
selectare a unor genotipuri valoroase, n special prin prisma puterii acestora de fructificare, n scopul
utilizrii lor ca genitori pentru crearea de plantaii comerciale prin metode de nmulire vegetative
clasice, dar i pentru selectarea unor genetipuri care s se preteze la modalitile de nmulire in
vitro.
Seleciile obinute astfel au constituit punctul de plecare al unei alte teze de doctorat axat pe
nmulirea in vitro la ctin, activitate desfurat n cadrul Departamentului de Biotehnologii
Vegetale, care deja are rezultate promitoare n acest domeniu, prezentate la simpozione de
specialitate internaionale.
4
CAPITOLUL I. STADIUL ACTUAL AL CUNOATERII
1.1. IMPORTANA ECONOMIC I CULTURAL A SPECIEI HIPPOPHAE RHAMNOIDES
Ctina (Hippopha rhamnoides L.) este o plant vivace, un arbust dioic ce aparine familei
Elaeagnaceae. Acesta produce bace de culoare galben-portocalie, care au fost folosite de secole n
Europa i Asia. Habitatul natural al ctinei se ntinde pe mari suprafee n China, Mongolia, Rusia, i
cea mai mare parte a Europei de Nord.
Este o plant unic i valoroas cultivat actualmente n mai multe pri ale lumii, inclusiv n
Canada. Aceasta poate suporta temperaturi cuprinse ntre -43C pn la +40C i este considerat un
arbust rezistent la secet. Oricum, irigaia este necesar n regiunile n care precipitaiile nu depesc
mai mult de 400 mm pe an (Chen et al. 2005).
Ctina dezvolt rapid un sistem radicular extensiv, iar pentru acest lucru este considerat o
plant excelent pentru prevenirea eroziunii solului. Ctina a fost folosit n amelioarea terenurilor
pentru capacitatea sa de a fixa azotul i de a pstra alte elemente eseniale.
Ctina este un arbust foios, dioic, n mod obinuit cu spini, ce atinge 2 - 4 m nlime.
Scoara este de culoare brun-cenuie cu frunziul de culoare verde-cenuie. Dispoziia frunzelor
este altern, subiri, lanceolate, cu o culoare verde-argintie pe partea superioar. Sexul puieilor nu
se poate identifica pn cnd acetia ncep s nfloreasc. Mugurii florali se formeaz n special pe
ramuri n vrst de trei ani, care difereniaz n timpul sezonului precedent de vegetaie.
Inflorescena mascul const n 4-6 flori apetale. Inflorescena femel const ntr-o floare
apetal cu un ovar i un ovul. Planta depinde n ntregime de polenizarea fcut de ctre vnt, nici
una dintre flori, mascule sau femele, neavnd nectarine, prin urmare nu atrag insectele (Prokkola
2003). Ctina este o plant ideal pentru a controla eroziunea solului, ameliorarea terenurilor,
mrirea habitatului slbatic i protecia fermelor (Qinxiao and Zhao 2003).
Ctina este menionat n scrierile vechilor nvai greci ca Dioscorid i Therophast. n
vechea Grecie, ctina a fost cunoscut ca un remediu pentru cai. Frunzele i lstarii tineri au fost
adugate n hrana animalelor. Acest lucru a provocat o cretere rapid n greutate i un pr
strlucitor al cailor. Astfel a luat natere numele plantei, n latin 'Hippo' - cal, 'phaos' - a strlucii
(Sanjai K. and Singh 2003).
Valoarea nutriional i medicinal a ctinei este n mare parte necunoscut n America de
Nord. Oricum, proprietile sale au fost cunoscute i exploatate n Eurasia de secole. Valoarea
medicinal a ctinei a fost nregistrat n medicina tibetan clasic "rGyud Bzi" n cel de-al optulea
secol. Exist multe povestiri care expun minunatele proprieti ale ctinei ca un produs hrnitor i
revigorator. Pe baza acestor povestiri ct i pe cercetrile tiinifice, ctina a devenit un important
produs medicinal i nutriional, n special n Rusia unde este cunoscut sub numele 'ananas siberian'
sau 'Siberian pineapple' pentru gustul i suculena sa (Natalia 2003).
Industria ctinei s-a dezvoltat n Rusia din anii 1940 cnd biologii au nceput s investigheze
substanele active gsite n fruct, frunze i scoar. Prima fabric rus pentru dezvoltarea produselor
pe baz din ctin a fost n Bisk. Produsele sale au fost folosite n dieta cosmonauilor rui ct i ca o
crem de protecie mpotriva radiaiilor cosmice (Aksenova and Dolgacheva 2003).
Experiena chinez n ceea ce privete producerea ctinei la scar mare este mai recent,
chiar dac utilizrile tradiionale dateaz n urm cu multe secole. Cercetrile i plantaiile au fost
ncepute n anii 1980. ncepnd cu 1982 peste 300.000 hectare cu ctin au fost plantate n China. Pe
lng acest lucru, 150 de fabrici pentru procesarea acesteia au fost create care produc un sortimen de
200 de produse (Huang 2003).
5
1.2. STADIUL ACTUAL AL CUNOATERII
Obiectivul major al cercetrilor care au fost ntreprinse pe plan naional n ara noastr a fost
introducerea i popularizarea culturii ctinei n sistem comercial. n prima perioad (1975-1989), a
fost explorat flora spontan a Romniei, zonele deluroase din jurul munilor Carpai i din jurul
Mrii Negre. Au fost identificate numeroase biotipuri ale subspeciei carpatica i aduse la Institutul
de Cercetare Piteti Mrcineni.
Cele mai valoroase i interesante biotipuri au fost nmulite i plantate n loturi
experimentale. n cea de-a doua perioad (1989-1999), munca de cercetare s-a canalizat spre
mbuntirea i stabilirea tehnologiei de cultivare: distane i sisteme de plantare, conducerea i
tierea arbutilor, metode de nmulire i recoltare eficiente. Institutul a studiat caracteristicile
varietilor i seleciilor indigene i exotice, caracteristicile biochimice ale fructelor diferitelor
biotipuri, precum i alte caracteristici.
Au fost fcute de asemenea studii privind procesarea fructelor i diferitele utilizri ale
produselor pe baz de ctin (studii de nutriie, utilizri medicinale i cosmetice).
Obiectivele care trebuie urmrite n continuare i pe care se va axa Institutul de Cercetare
pentru Pomicultur Piteti-Mrcineni sunt:
1. Conservarea, evaluarea i dezvoltarea resurselor genetice de catin;
2. nfiinarea plantaiilor de ctin cu varieti care s aib urmtoarele caracteristici:
productivitate bun, fructe mari i cu pedicel lung pentru uurarea recoltrii (pentru recoltat manual
sau scuturare), i cu randament mare la sortare;
3. Identificarea unor noi genotipuri valoroase din flora neexplorat a Romniei;
4. Analize mai detaliate asupra compoziiei fructelor (carotenoizi, uleiuri, aminoacizi i alte
componente);
5. Studii cu privire la efectele plantaiilor de catin asupra ameliorrii caracteristicilor fizice
i chimice ale solului;
6. Studii asupra asocierii simbiotice dintre plante, ciuperci i bacterii.
Pe plan international cercetrile n acest domeniu sunt mult mai avansate decat n ara noatr,
guvernele strine investind din ce n ce mai muli bani n programele de cercetare care studiaz
aceast specie.
Dintre rile care au deja o tradiie n cultivarea ctinei putem enumera: Rusia, Suedia, China
i mai nou Canada.
Astfel, n Rusia regsim pe un loc aparte ntre arbutii fructiferii cultivai, ctina alb
(Hippopha rhamnoides L.). Industria ctinei se dezvolt tot mai mult ncepnd din anii '40, iar in
anii urmtori va fi nfiinat prima fabric ce va folosi exclusiv ca materie prima ctina.
Amelioratorii din Rusia ncearc crearea unor varieti cu productivitate mare i de calitate deosebit
care se preteaz pentru recoltatul mecanizat deoarece culesul manual implic costuri economice
deosebit de ridicate.
La Institutul de Genetic i Citologie, mpreun cu Staiunea Regional pentru Pomicultur
Novosibirsk, au fost create varieti noi avnd o perioad diferit de coacere pentru diferite utilizri,
ce corespund principalelor cerine agrotehnice ale recoltatului mecanizat: fructe tari, care pot fi
culese mpreun cu peiolul (desprindere uscat).
Pentru crearea acestor varieti s-au folosit metode moderne de genetic i citologie.
O alta ar cu tradiie veche deja n cultura catinei este Suedia (Rousi 1965) unde scopul
principal al cercetrii ctinei este introducerea acestei plante n culturile comerciale din Suedia.
6
Activitiile cuprind: ameliorarea plantelor, dezvoltarea sistemelor de cultur, recoltatul mecanizat,
analiza calitativ a fructelor i analiza diversitii genetice (Bartish et al. 2002).
n programele de ameliorare sunt folosite cu precdere varieti din Rusia i plante din flora
spontan a Europei de Nord. La Balsgrd exist o colecie mare de germoplasm pentru evaluarea i
ameliorarea ctinei.
Pentru culturi la scar mare n Suedia este necesar recoltatul mecanic. n acest scop, unul din
obiectivele de ameliorare este adaptabilitatea la recoltatul mecanizat. Au fost testate diferite maini
de recoltat i au fost nfiinate plantaii speciale n acest scop la Balsgrd i la Staiunea
experimental Torslunda.
Recent a fost descoperit un marker molecular pentru identificarea sexului (Persson and
Nybom). Din nefericire, acesta nu a fost universal i sunt necesare noi studii n continuare. A fost
urmarit de asemenea diversitatea genetic din populaiile slbatice de ctin (ssp. rhamnoides)
pentru a obine informaii care pot fi folosite la coleciile de germoplasm i conservare (Bartish et
al. 1999).
Cercettorii din Suedia susin c pe viitor este necesar s se continue munca de ameliorare i
dezvoltare a tehnicilor de cultur. Se vor intensifica studiile pentru calitatea fructelor i factorii care
o influeneaz.
O alt ar cu tradiie n cultura ctinei este China. Cu toate c, medicina tradiional chinez
menioneaz ctina ca fiind o plant valoroas, plantaiile comerciale de ctin au fost nfiinate
ncepnd cu anii 1980. De atunci au fost plantate 300.000 ha cu ctin, nfiinate peste 150 de fabrici
de transformare care produc nu mai puin de 200 de produse pe baz de ctin.
n ultimii ani, guvernul chinez a acordat mult atenie cercetrii tiinifice pentru catin i
extinderea sa la scar naional. Domeniile de interes sunt: studii asupra biologiei i ecologiei
ctinei, analize fizico-chimice, cercetri aplicate n plantaiile de ctin, efectul asupra conservrii
solului i apei, ameliorarea ctinei, procesarea i dezvoltarea produselor alimentare i medicinale .
Totui, persist probleme precum cele legate de standardele tiinifice i lipsa de orientare a
pieei.
n prezent, sunt dou domenii de interes ale Chinei n studiul ctinei i anume:
1. Cercetarea germoplasmei i colectarea acesteia, ameliorarea pe baza studiilor efectuate,
pentru a stabili condiiile de baz pentru schimbul de germoplasm existent i pentru cercetarea n
cooperare pentru a dezvolta produse la scar internaional (mpreun cu Institutul de Biologie din
Chengdu, Academia Chineza de tiine);
2. Cercetarea i dezvoltarea de produse cu nalt valoare alimentar i medicinal. Scopul
este acela de a obine rezultate clinice cu ajutorul tehnologiei moderne, pentru a crete importana
ctinei n medicin i n aplicaiile acesteia.
Cercettorii chinezi afirm c este necesar ca, n viitor sa fie abordate urmtoarele probleme:
1. Studii de pia n China i n lume referitoare la produsele pe baz de ctin;
2. Determinarea optimului de cules a ctinei n diferitele regiuni ale Chinei i dezvoltarea
echipamentului de stocare i recoltare;
3. Ameliorarea ctinei pentru scopuri economice i ecologice;
4. Studierea fenomenului de fixare a azotului de ctre ctin i aplicaiile acestuia;
5. Dezvoltarea metodelor de multiplicare vegetativ pentru varietile superioare;
6. Gestionarea plantaiilor comerciale.
ara care nregistreaz plantaii recente de ctin la scar mare este Canada. Baza genetic
de ameliorare din Canada este constituit de germoplasma de la PFRA Shelterbelt Centre, Manitoba,
Saskatchewan care cuprinde 2000 de fenotipuri reprezentnd 4 specii i 5 subspecii de Hippopha.
7
Indivizii cu caracteristici fenotipice dorite vor fi selectai i folosii n programele de ameliorare
(Thomas 2008).
Obiectivele urmrite sunt: obinerea unor forme cu cretere pitic, lipsa spinilor, drajonarea
redus, forma tulpinii i caracteristicile fructelor.
Pentru selecia exemplarelor se vor evalua exemplarele din ambele sexe selectate n ultimii
ani.
Astfel, se vor realiza urmtoarele activiti: nmulirea varietilor selectate, efectuarea de
teste n 6 locaii diferite i analiza detaliat a fructelor, florilor, polenului i seminelor n laborator.
Cultivarele femele: Scopul este de a crea cultivare cu producie mare, compacte, fr
drajonare, spini puini i care pot fi culese eficient mecanic.
Cultivarele sunt selectate folosind un scuturtor de crengi care a fost dezvoltat n Letonia .
Obiectivele de ameliorare la arbuti sunt: rezistena la ger, drajonarea slab, tulpina unic cu
ramuri puternice, forma compact de coroan, fructele localizate n jurul ramurilor principale,
mrimea mare a frunzelor.
Obiectivele de ameliorare la exemplarele femele sunt: productivitatea, mrimea,
caracteristicile de desprindere, zaharuri solubile totale, coninutul n vitamine (C&E), coninutul n
uleiuri i caroten i maturarea trzie.
Legat de exemplarele mascule, scopul este acela de a crea cultivare mascule rezistente la ger,
cu nflorire abundent i cu producie mare de polen. Pentru a ajuta polenizarea facut de vnt,
cultivarele mascule selectate trebuie sa fie mai mici decat cele femele.
O parte din cercetrile canadiene se axeaz pe studiul coninutului n uleiuri a fructelor de
ctin. Proprietile fizico-chimice ale seminelor de ctin (coninutul iniial de ulei) sunt
determinate folosind spectroscopia cu rezonan magnetic nuclear (NMR) .
Este cunoscut faptul c, calitatea uleiului din semine la culturile oleaginoase i la plantele
horticole, este controlat genetic, fiind exprimat n compoziia uleiului fiecrei semine. Deoarece
ctina este o plant dioic, seminele individuale ale diferitelor plante sau populaii, i semine
colectate de pe aceeai plant sunt diferite din punct de vedere genetic, i deci, heterogene pentru
coninutul n ulei.
Aceast variaie poate s fie utilizat comercial prin selectarea individual a seminelor,
urmat de regenerarea plantelor din seminele care conin uleiuri n cantitate mare i cu caliti
superioare. Pentru acest lucru este necesar s se evalueze seminele n mod individual, ntr-o
manier nedestructiv. Plantele cu caliti deosebite sunt nmulite vegetativ pentru a nfiina
plantaii superioare. Rezonana magnetic nuclear (NMR) permite analiza nedestructiv a
seminelor ntr-un timp foarte scurt i cu costuri mai mici comparativ cu analizele traditionale: gaz-
cromatograf (GC) i cromatografie lichid de nalt performan (HPLC).
Un alt domeniu de studiu n Canada l constituie dezvoltarea i verificarea sistemelor de
tiere care vor uura recoltatul mecanic folosind scuturtoare de fructe (tulpini sau ramuri) i
controlul drajonrii prin metode chimice i mecanice.
Alte proiecte n desfurare sunt: dezvoltarea metodelor de cules mecanic, determinarea
cerinelor de irigare i fertilizare, i metode pentru controlul buruienilor.
n ceea ce privete modalitile de nmulire ale acestei specii sunt dezvoltate metode pentru
multiplicare vegetativ, n special butirea cu butai lignificai i semilignificai.
Factorii care sunt analizai sunt: alegerea locului de recoltare a butailor, mediul de
nmulire, tratamentele prealabile nrdcinrii i faciliti de nmulire.
Pentru studii viitoare, cercettorii canadieni vor aborda urmtoarele aspecte:
1. Dezvoltarea sistemelor de recoltat mecanizat;
8
2. Dezvoltarea metodelor de manipulare a fructelor i a echipamentelor pentru a asigura
calitatea optim a fructelor;
3. Elaborarea de standarde pentru controlul calitii (la nivel mondial) pentru a asigura
produse sigure;
4. Studii clinice pentru a valida calitaile atribuite ctinei;
5. Utilizarea ctinei pentru fito-remedierea mediului poluat;
6. Dezvoltarea tehnicilor de multiplicare in vitro;
7. Biologia molecular cu transfer de gene i amprente ADN;
8. Selecia pentru rezistena la duntori i boli.

9
CAPITOLUL II. CADRUL I OBIECTIVELE CERCETRILOR

Cadrul de recoltare a plantelor din flora spontan este reprezentat de trei zone din ara
noastr, respectiv zona Deltei Dunrii (localitatea Periprava de la captul Braului Sulina, pdurea
Letea i localitatea Sfntu Gheorghe de pe bratul Dunrii cu acelai nume); Judeul Mure
(localitile Socol, Crieti, Frgu); Judeul Cluj (zonele limitrofe oraului Cluj-Napoca,
localitatea Ctina, localitatea Nicula).
Toate plantele au fost recoltate din flora spontan, din areale naturale, n care intervenia
omului nu poate fi observat iar plantele se regsesc n habitusul lor natural.
2.1. PARTICULARITI I ASPECTE DIN ZONELE STUDIATE
2.2.1. Zona Deltei Dunrii
Amintit de opa (1960) ca fiind prezent n aceast zon, ctina alb este extrem de
rspndit n Delta Dunrii, unde creeaz n perioada de toamn prin coloritul portocaliu plcut al
fructelor peisaje deosebit de pitoreti.
Zonele cercetate n prezentul studiu au fost localitatea Periprava, Pdurea Letea, Localitatea
Sfntu Gheorghe.
Localitatea Sfntu-Gheorghe se intinde pe partea stng a pe celui mai vechi bra al
Dunrii - Sfntu-Gheorghe, n apropierea gurii de vrsare a Dunrii n Marea Neagra. Pe o suprafa
administrativ de 60575,87 ha, comuna este alcatuit din aproximativ 358 gospodarii n care triesc
aproximativ 971 oameni ce i-au pstrat tradiiile i limba ucrainean.
Aflat n extremitatea estic a Deltei Dunrii, localitatea Sfntu-Gheorghe este situat n
partea de est a judeului Tulcea la 120 Km de Tulcea pe braul Sfntu-Gheorghe i la 35 Km de
orasul Sulina. Comuna este delimitat la nord de comuna Crian i orasul Sulina, la est i sud de
Marea Neagr, iar la vest de comuna Murighiol.
Clima este continental cu veri clduroase, ierni geroase cu vnturi puternice, temperatura
medie anuala de 11C, iar cantitatea medie de precipitaii este de 440l/mp anual.
Accesul n localitate este posibil doar naval. Se poate lua vaporul din portul Tulcea (Tulcea -
Sfntu-Gheorghe 4h), portul Mahmudia (Mahmudia - Sfntu-Gheorghe 2h 30) sau portul Murighiol
(Murighiol - Sfntu-Gheorghe 2h).
Biotopurile care adpostesc acest plant sunt diverse, dar de cele mai multe ori ea apare pe
digurile de pe marginea canalelor i chiar la malul mrii.
Alteori apare n luminiurile pdurii din zona Sf. Gheorghe dar mai ales pe teren deschis,
nenpdurit, unde se poate desfura n voie.
O populaie abundent i deosebit de valoroas se afl pe insula Sacalin, unde localnicii
strbat distane mari cu barca pentru a recolta uor fructe de calitate bun i foarte mari spre
deosebire de restul zonelor.
Localitatea Periprava aparine de comuna C.A. Rosetti, situat n judeul Tulcea. Aceasta
se afl la limita nordic a grindului Letea, la 120 km de Tulcea fiind punctul terminus al navigaiei
fluviale de pasageri.
Din Periprava, pe uscat, se poate porni ctre Sulina, trecnd prin aezarea Cardon, precum i
spre localitatea Letea, n apropierea creia se afl rezervaia natural Pdurea Letea (circa 8 km de
Periprava).
10
n zona Periprava ea apare frecvent pe digurile canalelor, mai rar pe terenurile mai secetoase,
n zona uscat. Poriunile ocupate de ctre un individ sunt mai mari dect cele din zona Sf.
Gheorghe.
ntlnit mai ales pe digurile canalelor, n aceast zon, ctina formeaz adevrate cordoane
de nestrbtut. Populaiile sunt mult mai compacte dect n zona Sf. Gheorghe, n aceast zon
aprnd i exemplare arborescente. Ca not general, plantele au o talie mult mai mare dect n
restul zonelor vizitate.

Pdurea Letea ( 2825 ha ) : Pdurea Letea este situat n partea de nord a Deltei, la est de
comuna C.A.Rosetti. Zona strict protejat cuprinde doar o parte din suprafaa total a pdurii, parte
ce a fost pus sub ocrotire nca din anul 1930 i devenit rezervaie natural ncepnd cu 1938.
Pdurea s-a dezvoltat sub forma unor fii late (hmacuri) n spaiile dintre dunele de
nisip i este format din stejar de lunc, stejar brumriu, plop alb, frasin de lunc, tei alb.
O caracteristic a pdurii o constituie abundena de plante crtoare: via slbatic,
hameiul, curpenul de pdure i nu n ultimul rnd liana greceasc (Periploca graeca), cea care d
pdurii un aspect mediteranean. Totodata, aici au fost identificate peste 2.000 de specii de insecte,
vipera de nisip (Vipera ursinii), vulturul codalb (Haliaeetus albicilla) - care cuibrete aici, trei
specii de oim, corbul, etc.
Toate aceste specii de plante i animale, unele dintre ele foarte rare sau cu caracteristici
deosebite au fcut ca aceast pdure s necesite o atenie deosebit pentru conservarea i pstrarea
valorilor ei naturale.
2.2.2. Judeul Mure
n Judeul Mure, judeul meu natal, am cercetat zonele din jurul localitilor Crieti,
Frgu i Socol. Aceste zone se caracterizeaz printr-un relief colinar de podi, cu dealuri
predominant lipsite de vegetaie forestier, unde ctina formeaz ctiniuri puternice pe suprafee
ntinse.
n regiunea dealurilor carpatiene (opa 1960), situate pe zona fliului, ntre Olt i Bistria,
apare din nou Hippopha rhamnoides, ncetenit pe prundiuri, aluviuni, maluri, terase, ori pe
cmp. n regiunea aceasta, ctina alb ocup suprafee mult extinse fa de cele din Delta Dunrii.
Pe unele poriuni, ctiniurile albe ocup 15% din suprafaa total a zvoaielor. Ca i n Delta
Dunrii, ctiniurile de aici formeaz mai multe variante. Prin produsele lor, ele acoper o bun
parte din nevoile n lemn ale locuitorilor, nct merit s fie cunoscute mai ndeaproape.
n aceast zon am ntlnit-o frecvent n locurile scurse de ap, pe versani nsorii cu
expoziie sudic, unde datorit drajonrii puternice formeaz grupuri n care abia poate intra un om
nenarmat cu unelte pentru tiat.
2.2.3. Judeul Cluj
n aceast zon am prospectat localitile Ctina, Nicula i mprejurimile oraului Cluj-
Napoca.
Comuna Ctina este situat n Cmpia Fizeului, pe cursul superior al rului Fize, n partea
estic a judeului Cluj, la grani cu judeul Bistria-Nsud spre est i sud-est. Se nvecineaz la
nord cu comuna Buza, la vest cu comuna Geaca, iar n partea de sud-vest cu comuna Cmrau,
toate cele trei comune fiind situate n judeul Cluj.
11
Comuna se afl la 60 km de Cluj-Napoca i 35 km sud-est de Gherla, legtura cu cele dou
orae realizndu-se pe direcia nord-vest - sud-est de drumul judeean 109C Gherla-Cmrau-
Mociu-Cluj. Drumul comunal DC 18 face legtura ntre comuna Ctina i comuna Buza din judeul
Cluj.
Relieful comunei este tipic Cmpiei Transilvaniei, fiind o mbinare ondulatorie de dealuri i
depresiuni largi, uor nclinate dinspre hotarele de margine ale comunei spre Lacul Ctina.
O caracteristic a reliefului local este forma de amfiteatru natural ale crui margini sunt o
cunun de dealuri mai nalte, care nconjoar spaiul geografic comunal i separ prin culmile lor
hotarele Ctinei de celelalte comune nvecinate Buza i Cmrau.
Dealurile - cu altitudine cuprins ntre 300 i 550 m -i depresiunile au fost modelate prin
eroziunea precipitaiilor i a apelor curgtoare, n erele geologice n roci moi, argile, marne i
nisipuri.
Spaiul geografic al comunei Ctina este strbtut de o modest reea hidrografic format
din praie, vi i Lacul Ctina.
Valorile climatice n zon, sunt specifice Podiului Transilvaniei i respectiv Cmpiei
Transilvaniei, temperatura medie anual fiind de +8,2 grade Celsius. Caracteristic acestei zone sunt
vnturile de vest, solurile cernoziom levigat, solurile brune de pdure i solurile brune de fnae.
Condiiile de relief, sol i clim au determinat o vegetaie specific de silvostep reprezentat
de vegetaie de lac i teren mltinos (papur, stuf, pipirig, stnjeni de balt), vegetaie de pune i
fnea pe dealuri i vegetaie de pdure (stejar, gorun, salcm, arbuti etc.).
Localitatea Ctina, este o zon bogat n plante, de unde deriv i numele localitii. Din
pcate calitatea plantelor nu iese n eviden fa de celelalte zone ale rii, ca de altfel i toat zona
judeului, care se caracterizeaz prin plante de ctin care sunt greu accesibile, cu drajonare extrem
de puternic.
Satul Nicula este o localitate ce aparine de comuna Fizeu Gherlii, judeul Cluj, n partea de
nord-est a teritoriului administrativ al comunei i a judeului Cluj. Este aezat ntr-o vale strmt
nconjurat de dealuri din toate prile. Se afl la o distan de 3 km de municipiul Gherla, la 17,6
km de municipiul Dej i la 52 de km de municipiul Cluj-Napoca. Accesul dinspre Cluj-Napoca se
poate face pe drumul european E 576 pn la Gherla, apoi pe drumul judetean 109 D, iar prin sat
pn la Mnstire, pe drumul comunal DC 15
Relieful este specific unei zone deluroase. Dealurile care nconjoar satul nu depesc 300 m
altitudine i erau n trecut acoperite cu vii i livezi de pomi fructiferi. Acestea sunt pe alocuri
mpdurite, iar cele dinspre est sunt erodate din cauza apelor ce provin de la ploile care cad, mai ales
primvara i toamna. Cmpiile lipsesc, dar sunt suplinite de cteva lunci mai joase care sunt folosite
ca fnee naturale.
Municipiul Cluj-Napoca este situat n zona central a Transilvaniei, avnd o suprafa de
179,5 km. Situat n zona de legtur dintre Munii Apuseni, Podiul Somean i Cmpia
Transilvaniei, oraul este plasat la intersecia paralelei 46 46 N cu meridianul 23 36 E. Se ntinde
pe vile rurilor Someul Mic i Nad i, prin anumite prelungiri, pe vile secundare ale
Popetiului, Chintului, Borhanciului i Popii. Spre sud-est, ocup spaiul terasei superioare de pe
versantul nordic al dealului Feleac, fiind nconjurat pe trei pri de dealuri i coline cu nlimi ntre
500 i 825 metri.

12
2.2. CONCLUZII PRIVIND AMPLASAREA GEOGRAFIC
Din prezentarea celor trei zone putem observa marea plasticitate de adaptare a speciei pe
care o putem ntlnii de la malul mrii i pn la mari altitudini (Sinaia).
Ctina alb, n virtutea marei ei puteri de deseminaie i regenerare, se ridic de-a lungul
vilor, pn la altitudinea de 1.100 m, cariera "Piatra Ars" de la Grbova, dintre Sinaia i Poiana
apului, din M-ii Bucegi. Ea trebuie socotit ca un pionier de primul rang ce poate fixa nisipurile
mobile, ameliora terenurile neproductive prin azotul elaborat de bacteriile nitrificante (Schinzia
alni), ce triesc pe rdcinile ei.
Mai bine de jumtate de an, fructele ctinei albe ofer hran abundent i de calitate pentru
vrbii, ciocnitoare, corbi, rci, gaie, stncue alpine, ciori, sturzi, etc. Seminele ei, trec aproape
nevtmate prin tubul digestiv al psrilor. Odat cu ivirea anotimpului prielnic, cnd temperatura
urc i se menine ntre 5 - 30
o
C, seminele germineaz n curs de 7 - 60 de zile.

C tina
Nicula
Cluj-Napoca
Socol
F r
Cr
Sf. Gheorghe
Periprava

Fig. 1. Zonele studiate reprezentate n rou pe harta Romniei
Fig. 1. The studied areas represented in red on the Romania map

n raport cu cele trei zone exist diferenieri fenotipice pentru toate aspectele plantelor, dar
cele mai evidente, i tot odat cele mai interesante sunt cele legate de habitusul plantelor. Astfel,
putem observa, c n zona Sf. Gheorghe portul plantelor este mai mic, capacitatea de drajonare mai
redus, ntlnim exemplare isolate cu o frecven mult mai mare dect n celelalte zone. Tot odat, i
13
fructificaia acestor plante este mai abundent, prezent pe ramurile de ordin doi sau trei i rareori pe
tulpina principala. Aceste lucruri constituie avantaje deosebite ce trebuie s fie luate n considerare
la formarea unei varieti clonale. De asemenea densitatea spinilor nu este aa de mare n comparaie
cu plantele din celelalte zone.
Spre deosebire de zona Deltei, zona Podiului Transilvaniei ne pune n faa unor tufe de
ctin compacte, foarte greu de strbtut, cu drajonare puternic, care au o raz de raspndire uneori
de 20m. Fructificarea acestor plante este prezent n cea mai mare parte pe axul principal i mai
puin pe ramuri de ordin doi. Fructific exemplarele care se gsesc n in mijlocul tufelor, fapt care
ngreuneaz n plus recoltarea fructelor.
De asemenea, fa de zona maritim i de Delt, plantele mascule nu dezvolt un frunzi la
fel de bogat i de mare. Drajonarea la plantele mascule este tot aa de puternic n Podiul
Transilvan fa de zona maritim.
Avnd n vedere considerentele enumerate mai sus, putem recomanda fr tgad, ca
alegerea unor genitori pentru introducerea acestei plante n cultur s se fac din zona Sfntu
Gheorghe.
2.3. OBIECTIVE PROPUSE
Datorit interesului deosebit acordat actualmente acestei specii, ne-am propus ca n cadrul
doctoratului s studiem din punct de vedere al variabilitii fenotipice i genotipice a materialului
biologic recoltat din flora spontan din cele trei zone amintite anterior n vederea selectrii de
genotipuri valoroase din punct de vedere al fructificrii (la plantele femele) i din punct de vedere a
produciei de polen (la plantele mascule) n vederea introducerii ulterioare n circuitul comercial.
Evaluarea fenotipic i genotipic a presupus analiza caracterelor cantitative i calitative a
genotipurilor luate n studiu, prelucrarea datelor experimentale prin analiza varianei, aprecierea
variabilitii caracteristicilor pe baza coeficienilor de variabilitate, estimarea corelaiilor dintre
caracteristicile studiate, prin calculul coeficienilor de corelaie.
Evaluarea la nivel molecular s-a realizat prin markarea molecular PCR-RAPD (Random
Amplified Polymorphic, ADN polimorfic amplificat la ntmplare), presupunnd testarea primerilor
RAPD, extracia ADN la materialul analizat, efectuarea amplificrilor PCR cu primerii RAPD.
Analiza variabilitii fenotipice i genotipice, a urmrit selecia genotipurilor considerate
valoroase, ca i producie de fructe, respectiv produciei de polen. Formele identificate pentru
particularitile lor valoroase s-au utilizat ca genitori, pentru nmulirea acestora in vitro. Din pcate,
din datele pe care le avem pn n prezent, nu toi din aceti genitori selectai, prezint pretabilitate
pentru acest gen de nmulire.

14
CAPITOLUL. III. MATERIALUL BIOLOGIC SI METODELE DE LUCRU

3.1. MATERIALUL BIOLOGIC
Materialul biologic folosit la determinri a fost recoltat din zona spontan din trei zone ale
rii: Delta Dunrii, Judeul Cluj i Judeul Mure. Aceste zone nu acoper nici pe departe ntregul
areal al speciei n ara noastr, el fiind mult mai larg (vezi cap. 2.2)
Populaiile au fost mprite n trei grupe, funcie de regiunea din care provin. Prima grup
cuprinde populaiile din Delta Dunrii: P1 (Periprava), P2 (Sfntu Gheorghe) i P3 (Pdurea Letea).
A doua grup cuprinde populaiile din judeul Mure: P4 (Frgu), P5 (Crieti), P6 (Socol). A
treia grup cuprinde populaiile din judeul Cluj: P7 (zonele limitrofe oraului Cluj-Napoca), P8
(Ctina), P9 (Nicula).
Localizarea acestor populaii i numrul de indivizi recoltai din fiecare loc sunt prezentate n
Tabelul 18.
Tabelul 1/Table 1
Identificare populaiilor studiate, zona de amplasare i numrul de indivizi
Identification of the studied populations, area of amplasament and the number of individuals

Numrul
populaiei
Population
number
Numrul de
indivizi
Individuals
number
Locaia
Location
Altitudinea
Altitude
P1 18 Loc. Periprava, Delta Dunrii 4
P2 19 Loc. Sf. Gheorghe, Delta Dunrii 3
P3 22 Pdurea Letea, Delta Dunrii 15
P4 20 Loc. Frgu, Jud. Mure 400
P5 21 Loc. Crieti, Jud. Mure 350
P6 19 Loc. Socol, Jud. Mure 450
P7 20 Oraul Cluj-Napoca, Jud. Cluj 540
P8 19 Loc. Ctina, Jud. Cluj 400
P9 20 Loc. Nicula, Jud. Cluj 300

Din fiecare populaie a fost recoltat aproximativ un numr de aproximativ 20 de indivizi, att
plante mascule ct i femele, la un interval de cel puin 50 de m, pentru a preveni recoltarea
frunzelor de la acelai individ.
Au fost recoltate frunze proaspete care au fost puse n cmp n pungi separate cu silicagel.
3.2. METODE DE DETERMINARE A APROPIERII GENETICE LA GENOTIPURILE
STUDIATE
Toate genotipurile studiate n prezenta cercetare au fost analizate utiliznd urmtoarele
metode de determinare a apropierii filogenetice: metoda sistematic (taxonomic) i metoda
markerilor moleculari.
15
3.2.2.1. Materialul vegetal utilizat pentru izolarea ADN-ului

Materialul vegetal a fost constituit din 178 de probe cu diferite proveniene (vezi tabel
proveniene). De la toate aceste proveniene s-au recoltat frunze tinere n teren care au fost puse n
pungi de plastic cu silicagel, iar la ntoarcerea n laborator aceste pungi au fost puse n congelator la
80

pentru pstrare (Gotea et al. 2010).
3.2.2.2. Izolarea ADN-ului

Extracia ADN-ului genomic s-a efectuat n laboratorul de Genomic al Departamentului de
Biotehnologii Vegetale, al Universitii de tiine Agricole i Medicin Veterinar Cluj-Napoca
(USAMV-CN).
Procesul de izolare al ADN-ului a cuprins trei etape majore, i anume: distrugerea integritii
celulare (liza celular) i eliberarea ADN-ului ntr-un omogenat, numit lizat celular, purificarea unui
anumit tip de ADN de restul ADN-ului prezent eventual n lizat, precum i de ARN, proteine i ali
compui metabolici i realizarea unei soluii de ADN de concentraie dorit i de puritate cunoscut.
Procesul de izolare al ADN-ului la toate variantele de studiu s-a realizat utiliznd
protocolul de extracie ADN a lui (Ge et al. 1999) mbuntit de ctre (Sun et al. 2006)
Lista reactivilor i a soluiilor necesare parcurgerii protocolului de extracie ADN este
prezentat n Anexa I.

Protocolul de izolare al ADN-ului

1. Frunzele uscate au fost mojarate cu azot lichid ntr-o pulbere fin n tuburi Eppendorf de
1.5 ml
2. S-a repartizat 750 l tampon de extracie 2X CTAB care conine mercaptoetanol
(meninut la 65
o
C) n fiecare tub i s-au inversat tuburile de cteva ori pentru a omogeniza
amestecul.
3. S-au aezat probele pe baia marin la 65
o
C timp de 30 minute i s-au agitat prin
inversare la intervale de aproximativ 5 minute. Dup aceasta, s-au rcit tuburile la
temperatura camerei.
4. S-a adugat 750 l de cloroform: alcool izoamilic (24 : 1, v/v) i s-a amestecat uor
prin inversarea tuburilor timp de 5 minute pn la obinerea unei emulsii.
5. Centrifugarea s-a fcut la 10 000 rpm timp de 5 minute.
6. S-a transferat faza apoas ntr-un alt tub steril. Daca faza apoas este tulbure, se
recomand repetarea extraciei cu cloroform: alcool izoamilic (etapele 4-6).
7. S-au adugat 2/3 volume de alcool izopropilic meninut n congelator la -20C i s-
au pus tuburile n frigider la 4-6C timp de 15-20 minute, pn cnd filamentele de ADN au
devenit vizibile n soluie.
8. S-a centrifugat la 3000 rpm timp de 3 minute, i apoi s-a mrit viteza la 11 000 rpm
pentru nc 5 minute.
9. S-a ndeprtat cu grij supernatantul, fr a desprinde sedimentul de ADN de pe
pereii tubului Eppendorf.
10. S-au adugat 500 l alcool etilic 70% meninut la 0-4
o
C.
16
11. S-a centrifugat din nou la 10 000 rpm timp de 5 minute i s-a ndeprtat cu grij
supernatantul.
12. Tuburile deschise s-au aezat n hota steril pentru evaporarea alcoolului timp de
aproximativ 20-30 minute.
13. S-a redizolvat sedimentul de ADN n 100 l de soluie tampon TE 1X.
ADN-ul obinut s-a pstrat n congelator la temperatura de -20C.
3.2.2.3. Purificarea ADN-ului i prepararea soluiei de ADN
Din punct de vedere practic, purificarea ADN-ului presupune: ndeprtarea din lizat a tuturor
componenilor, cu excepia ADN-ului, fracionarea ADN-ului, adic separarea diferitelor specii de
ADN n categorii distincte.
Cele dou aspecte nu se constituie neaprat n evenimente separate. De altfel, procesul de
purificare al ADN-ului poate s nceap nc din stadiul de formare al lizatului celular.
ndeprtarea (dup formarea lizatului) tuturor biomoleculelor i substanelor care constituie
contaminani ai ADN-ului se realizeaz prin mai multe metode: denaturarea i precipitarea
proteinelor cu solveni organici, cum sunt fenolul i cloroformul; n urma centrifugrii, proteinele
precipitate pot fi separate de ADN, care rmne n supernatant.
Fenolul, cloroformul sau o combinaie a lor sunt foarte eficieni n precipitarea proteinelor.
Amestecarea lor cu lizatul, urmat de centrifugare, a dus la formarea a dou faze n tub, cea
inferioar, a solvenilor organici, i cea superioar, apoas. ADN-ul rmne solubilizat n faza
apoas i a fost transferat ntr-un alt tub. Proteinele precipit la interfaza celor doua faze. Cele cu
mas molecular mare sedimenteaz la centrifugare, restul rmne n stratul solvenilor organici.
n timpul extraciei cu cloroform s-a adugat i alcool isoamilic, care are rol antispumant i
ajut la separarea clar a fazelor. Extracia proteinelor poate fi repetat de cteva ori, pn cnd
supernatantul devine limpede, transparent. Solvenii organici prezint dezavantajul ca sunt toxici i
corozivi, manipularea lor prezentnd riscuri. De asemenea, extraciile repetate pot duce la
fragmentarea ADN-ului, iar contaminarea ADN-ului cu mici cantiti de fenol sau cloroform poate
avea consecine nedorite pentru aplicaiile ulterioare.
La plante, cantitile mari de metabolii secundari nu pot fi extrase cu fenol sau cloroform i
pot ngreuna considerabil purificarea ADN-ului. De aceea, pe lng extracia proteinelor, se parcurg
i etapele de precipitare a ADN-ului i separarea sa prin centrifugare. CTAB este folosit la plante,
att pentru liza membranelor celulare ct i pentru formarea de complexe insolubile reversibile cu
ADN. Aceste complexe sedimenteaz la centrifugare. Supernatantul conine n urma centrifugrii,
majoritatea contaminanilor i este ndeprtat.
Soluia final de ADN se realizeaz in funcie de specificul metodei de preparare, fie prin
resuspendarea sedimentului de ADN, n urma precipitrii sale cu alcooli (etanol sau isopropanol) n
prezena srurilor. ADN-ul se pstreaz (la -20C. ) n soluie TE dar se poate pstra i n ap steril
deionizat. n prezentul experiment s-a resuspendat sedimentul n 100 l TE pH 8,0 (Anexa I).
Exist mai multe metode de verificare a concentraiei de ADN i anume: metoda
spectofotometric; metoda minigel.
n prezentul studiu s-a folosit metoda spectofotometric; citirea cantitii de ADN s-a
realizat cu ajutorul aparatului Nanodrop spectrophotometer nd-1000
Raportul absorbiilor soluiei la 260 nm i 280 nm, reprezint maximul de absorbie al ADN-
ului, respectiv al proteinelor. ADN-ul este considerat suficient de pur dac raportul celor dou citiri
(A
260
-A
280
) d o valoare ntre 1,8 i 2,0. Valori mai mari de 2,0 indic impurificarea cu ARN, iar
valori mai mici de 1,8 indic impurificarea cu proteine sau fenol.
17
Valoarea determinat a concentraiei ADN-ului nu a fost convenabil aplicaiilor ulterioare
specifice. Astfel s-a procedat la ajustarea concentraiei soluiilor de ADN i redizolvarea sa n
volumul dorit de soluie (TE sau ap distilat).
3.2.3.1. Amplificarea ADN-ului
Amestecul de reacie pentru toate probele s-a preparat pe suport cu ghea n hota steril,
(pentru a evita contaminarea ADN-ului) i s-a repartizat apoi n tuburi Eppendorf de 0,5 ml n
vederea amplificrii.
Amestecul de reacie pentru analiza RAPD are un volum de 25l i urmtoarea componen:
- 3 l tampon 10 X (Promega)
- 2 mM MgCl
2

- 200 M din fiecare dATP, dTTP, dCTP i dGTP = 0,5l
- 0.2 mol/L amors
- 40 ng matri AND
- 2 uniti ADN polimeraz
Amplificarea ADN-ului s-a realizat utiliznd urmtorul program de amplificare, care
a fost setat n memoria Termocyclerului (Eppendorf Mastercycler Gradient): denaturare timp de 120
s la 94C, 10 s la 35C, 20 s la 72C timp de dou cicluri, urmat de 40 cicluri de 0 s la 94C, 0 s la
35C, i 60 s la 72C, i un stagiu final de 7 min la 72C.
4
o
C pstrarea probelor / - 80
o
C pstrarea pe timp ndelungat
3.2.3.2. Primeri utilizai
Secvenele de ADN necunoscute pot fi amplificate cu ajutorul primerilor arbitrari. Cu toate
c alegerea secvenelor de nucleotide ale unui astfel de primer (pereche) este complet ntmpltoare,
de obicei se pot amplifica fragmente caracteristice de ADN n condiii experimentale apropiate.
Aceast strategie este cea mai util n cartarea genic sau pentru stabilirea amprentei ADN.
Primerii folosii n experienele noastre au fost cei utilizai de ctre (Bartish et al. 1999) ntr-
un studiu asemntor fcut pentru Hippopha rhamnoides ssp. rhamnoides.

Tabelul 2/Table 2
Primeri folosii pentru analiza RAPD la populaiile de ctin recoltate din flora spontan
The RAPD primers used to analize the studied plants

Nr. crt.
No. of entry
Primer
Primer
Secven nucleotidic (5-3)
Nucleotidic sequence
G-C % Greutatea molecular
Molecular weight
1. OPA-07 GAAACGGGTG 60 3117,1
2. OPA-08 GTGACGTAGG 60 3108,1
3. OPA-10 GTGATCGCAG 60 3068,1
4. OPA-11 CAATCGCCGT 60 2988
5. OPA-15 TTCCGAACCC 60 2948
6. OPB-02 TGATCCCTGG 60 3019
7. OPB-04 GGACTGGAGT 60 3108,1
8. OPB-11 GTAGACCCGT 60 3028
9. OPB-18 CCACAGCAGT 60 2997
10. OPD-03 GTCGCCGTCA 70 3004

18
Pentru amplificarea ADN-ului, la exemplarele de ctin luate n studiu am folosit 10 primeri
care au fost achiziionai de la compania Microsynth AG, Elveia (Tabelul ?). Toi acetia au generat
produi de amplificare, aa cum au fost prezentai n studiul lor de ctre (Bartish et al. 1999).
Coninutul de guanin-citozin la toi primerii luai n studiu a fost de 60% n afar de
unul la care a fost de 70%.
3.2.3.3. Electroforeza ADN-ului n gel de agaroz
Electroforeza n gel de agaroz i poliacrilamid este o metod standard de separare,
identificare i purificare de fragmente de ADN (n soluie tampon, ADN-ul are o sarcin electric
net negativ, deci poate migra electroforetic, ndreptndu-se spre anod).
Agaroza este un amestec de poliglucide, obinute din agar. Agarul se extrage din specii de
alge roii (Rodophyta). Agaroza (sub form de pudr), disponibil comercial, nu este complet
natural. Ea este contaminat cu alte poliglucide, sruri i proteine. Gradul de contaminare poate
influena migrarea ADN-ului.
Moleculele de ADN, care strbat gelul, se gsesc ntr-un mediu lichid, care este asigurat de
tamponul de electroforez. Exist diferite soluii tampon de electroforez. Cele folosite pentru
migrarea moleculelor de ADN native, dublu catenare, conin EDTA la pH 8,0 i Tris-acetat (TAE),
sau Tris-borat (TBE), sau Tris-fosfat (TPE). Tampoanele sunt preparate ca soluii stoc i sunt
pstrate la temperatura camerei.
Migrarea produilor de amplificare s-a realizat ntr-un gel de agaroz de concentraie 1,5%,
timp de 3,5 h la 32 V/cm, ntr-o soluie tampon de 0,5 x TAE, dup protocolul descris de (Ge et al.
1999).
Pentru migrarea n gel de agaroz, s-a pipetat un volum de 8 l produs amplificare / prob, s-
a omogenizat cu 2 l tampon de ncrcare i astfel (volumul total de 10 l) s-a injectat n godeurile
gelului de agaroz, iar n primul godeu s-a ncrcat Ladderul (=100 pb DNA Step Ladder).
Colorarea gelului s-a fcut ntr-o soluie de bromur de etidiu 0,5l/ml, iar vizualizarea
fragmentelor de ADN amplificate a fost realizat n lumin UV.
Imaginea gelului a fost preluat cu sistemul ALPHA IMAGE 2 200 i stocat n baza de date
a calculatorului.
n Anexa I sunt prezentate soluiile i reactivii utilizai n pregtirea amestecului de reacie i
pentru migrarea n gelul de agaroz a produilor amplificai.
3.3. METODE DE DETERMINARE A GERMINAIEI SEMINELOR
Germinaia cuprinde ansamblul transformrilor fiziologice i biochimice care au loc n
smn, n timpul trecerii embrionului de la viaa latent, la viaa activ (DUDA, 2003).
nmulirea prin semine este o metod de reproducere cu o importan deosebit, deoarece
menine diversitatea genetic a populaiilor de ctin.
Pentru ctina, semnatul este o metod relativ simpl pentru producerea unui numr relativ
mare de plante la un cost sczut n comparaie cu celelalte metode. Seminele pot s fie pstrate pn
la trei ani, fr ca acestea s i piard capacitatea germinativ (APAQ 1999). Dup o perioad de
pstrare de cinci ani, capacitatea germinativ scade la 40% (Rousseau 2002).
Germinaia seminelor s-a determinat sub dou aspecte: energia germinativ i
facultatea germinativ.
19
Energia germinativ este viteza cu care se declaneaz procesul de germinaie la o smn
pus n condiii de germinat. S-a exprimat procentul de semine pure germinate normal n perioada
de 6-7 zile din timpul stabilit pentru determinarea facultii germinative la ctin (Rousseau 2002).
Facultatea germinativ (capacitatea germinativ) este capacitatea seminelor de a germina
ntr-un numr limitat de zile, stabilit pentru fiecare specie n parte, la ctin, 17-20 zile. Se exprim
n procente fa de numrul de semine pure, puse la germinat.
Pentru efectuarea acestei analize s-au folosit diverse materiale, ustensile i aparate,
cum ar fi: vase de vegetaie, aparate de germinaie, termostat, planet pentru numrarea seminelor.
Vasele de germinaie folosite n prezenta cercetare au fost vasele Linhardt. Ca strat
de germinaie poate fi folosit nisipul i hrtia sugativ. n prezenta cercetare s-a folosit hrtia
sugativ (hrtia de filtru), care trebuie s fie din celuloz vegetal 100%, alb, curat, s nu conin
colorani toxici i s nu fie sterilizat chimic. De asemenea, este necesar, s aib o structur poroas
i o bun putere de absorbie, o ascensiune capilar bun a apei (n jur de 30 mm/min) i un pH
cuprins ntre 6,0 i 7,5.
Determinarea capacitii i energiei germinative (conform SR/99) s-a fcut n patru
repetiii. Seminelor nu li s-a fcut nici un tratament. Din smna pur s-au luat la ntmplare
(randomizat) patru repetiii, a cte 40 de semine, i s-au aranjat distanat, ct mai uniform, pe
suprafaa stratului de germinaie umed.
naintea punerii la germinat, hrtia de filtru s-a mprit n patru sectoare cu ajutorul
unui creion negru i s-a numerotat repetiia. Apoi s-a umectat cu ap de robinet pn la saturaie,
lsnd s se scurg excesul de ap, i s-a aezat pe suport. S-au confecionat fitile din hrtie de filtru
pentru asigurarea umiditii stratului de germinaie. S-a trecut apoi la punerea seminelor pe stratul
de germinaie, cu penseta, ct mai uniform la distana de 0,5-1,5 cm ntre ele.
Probele la care a aprut mucegai ce a acoperit peste 5% din numrul seminelor germinate s-
au trecut pe un strat de germinaie nou, iar germinaia s-a repetat cu alte semine.
Citirea germinaiei s-a fcut prin numrarea seminelor germinate i aprecierea germenilor.
Numrarea seminelor germinate s-a fcut de dou ori. Prima numrare s-a fcut pentru
determinarea energiei germinative, iar a doua la sfritul perioadei de germinaie, pentru
determinarea capacitii germinative. Numrarea s-a fcut la fiecare repetiie n parte, ncepnd cu
prima, prin ndeprtarea seminelor normal germinate cu ajutorul unei pensete.
Structurile eseniale ale unui germen normal sunt: rdcinia, tulpina i cele dou
cotiledoane.
Energia i capacitatea germinativ, s-a calculat fcnd media aritmetic a rezultatelor
obinute la numrarea seminelor care au germinat normal n timpul stabilit.
Procentul de germinaie pentru facultatea germinativ s-a calculat fcnd media aritmetic a
celor trei repetiii, la sfritul perioadei de germinaie, prin rotunjire la un numr ntreg.
Din diferite motive (repaus germinativ, testa seminei) un numr considerabil de semine
proaspete au putut fi gsite pe substratul de germinaie la sfritul testrii germinaiei (V
1
).
O germinaie mult mai complet a fost obinut prin retestare, folosind trei combinaii de
tratamente, comparate cu o prim variant de tratament (V
1
), n care s-a utilizat semine inute la
frigider la o temperatur de 1-2 C (Rai and Rai 2003). n cea de-a doua variant de tratament (V
2
)
s-a folosit semine stratificate timp de 90 de zile n nisip umed la temeperatura de 5C (APAQ 1999) .
n cea de a treia variant de tratament (V
3
) s-a folosit semine care au fost nmuiate timp de
48 de ore n ap cald la temperatura de 70C (APAQ 1999).
20
3.4. METODE STATISTICO-MATEMATICE UTILIZATE N PRELUCRAREA I
INTERPRETAREA REZULTATELOR STUDIULUI VARIABILITII FENOTIPICE I
GENOTIPICE
Au fost analizate 178 genotipuri de ctin, provenite din flora spontana astfel: Periprava (18
plante, noua female si noua masculi), Sfntu Gheorghe (19 plante, 9 masculi i 10 femele), Pdurea
Letea (22 de plante, 11 femele i 11 masculi), Frgu (20 de plante, 10 masculi i 10 femele),
Crieti (21 plante, 10 masculi i 11 femele), Socol (19 plante, 10 masculi i 9 femele), Cluj (20 de
plante, 10 masculi i 10 femele), Ctina (19 plante, 10 masculi i 9 femele), Nicula (20 de plante, 10
masculi i 10 femele). La acestea, au fost studiate urmtoarele particulariti considerate edificatoare
pentru caracterizare, pe baza literaturii de specialitate: greutatea fructelor (g), greutatea seminelor,
numrul de spini, procentul de germinare, lungimea frunzelor, coninutul de substan uscat.
Diferenele dintre genotipuri, privind greutatea fructelor, greutatea seminelor i cantitatea
de substan uscate au fost analizate statistic folosind analiza varianei - ANOVA, testul t,
considernd media experienei variant martor. De asemenea, la aceleai genotipuri s-a procedat i
la calcularea coeficienilor de variabilitate i a corelaiilor simple dintre caractere.
Datorit procentului relativ sczut de semine germinate i a datelor contradictorii din
literatur, ulterior s-a procedat i la determinarea germinaiei n condiii de laborator, metod
descris anterior. Pentru calcularea i interpretarea rezultatelor germinaiei n condiii de laborator s-
a apelat la modelul statistic de experien bifactorial.
Factorul A, tratamentul a avut trei graduri: V
1
=semine pstrate n frigider la 1-2
C;
V
2
=semine stratificate n nisip; V
3
= semine inute n ap cald. Factorul B, genotipul, a avut 30 de
graduri. Experiena a fost aezat dup metoda blocurilor randomizate, n patru repetiii (n=b=4),
cu un numr de variante v=90.
S-au efectuat mai multe tipuri de comparaii, studiindu-se influena genotipului i a
tratamentului asupra energiei i facultii germinative a seminelor, dar i influena unilateral a
genotipului, respectiv tratamentului, asupra energiei i facultii germinative, n raport cu media
experienei, considerat martor.
3.5. METODE STATISTICO-MATEMATICE UTILIZATE N PRELUCRAREA I
INTERPRETAREA REZULTATELOR STUDIULUI VARIABILITII MOLECULARE
Analiza statistic a datelor a facilitat calcularea indicelui de similaritate (S), a distanelor
genetice i, n final, construirea dendrogramei celor 9 populaii luate n studiu. Aceast analiz a
presupus notarea benzilor prezen/lips direct pe fotografiile gelurilor (stocate iniial n baza de
date a calculatorului), cu ajutorul unei rigle.
n acest caz, prezena sau absena fragmentelor la fiecare din cele 9 populaii s-a notat cu
cifra 1 (pentru prezena fragmentului) i cifra 0 (pentru absena fragmentului). Toate cifrele au fost
introduse n programul Microsoft Excel pentru a pregti un fiier care s poat fi interpretat cu
ajutorul programului Genetix i PopGene (YEH and BOYLE 1997).
Cu ajutorul acestui program s-au calculat urmtorii parametrii : procentul locilor polimorfici
(PPB), indicele pentru diversitate a lui Nei (h), indicele pentru diversitate a lui Shannon (I),
diversitatea genelor n populaie Aceti parametrii au fost calculai la nivel de populaie, grup i
subspecie.
21
Arborele filogenetic (istoria dezvoltrii evolutive a unui organism) se aseamn din punct de
vedere grafic cu un copac, alctuit dintr-un nod i o ramur. ntre dou noduri ale unui arbore exist
doar un singur segment. Evolutiv, nodul este reprezentat de o gen, o specie sau o populaie; ramura,
reprezint relaia topologic care exist ntre noduri, lungimea acesteia reflect modificri
determinate de mutaii sau durata evoluiei.
Scopul reconstruirii unui arbore filogenetic sau a unei dendrograme este de a estima ct mai
bine istoria evolutiv a unor specii nrudite.
Pentru realizarea dendrogramei au fost utilizate distanele genetice calculate cu ajutorul
programului PopGene iar apoi modelarea grafic a fost fcute cu programul Mega (Tamura et al.
2007). Construcia arborilor filogenetici s-a realizat prin metode care se bazeaz pe matricea
distanelor genetice.
Matricea distanelor genetice const dintr-un set de n (n-1) / 2 valori ale distanelor pentru un
numr n de noduri. UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic Averages), metoda
Neighbor-Joining sau metoda asocierii vecinilor, metoda Fitch i Margoliash, metoda Wagner i
metoda minimum evolution (evoluiei minime), sunt metode care utilizeaz matricea distanelor.
Metodele care folosesc matricea distanelor, prezint arborele filogenetic construit pe baza
relaiei care exist ntre valorile distanelor din matricea respectiv. Distanele ntre noduri au la
baz asemnrile generale ntre perechile de noduri. La final se obine numai o singur dendrogram
optim, neexistnd nici o alt metod de comparare a dendrogramelor suboptimale sau de stabilire a
celei mai bune dintre acestea (Weising et al. 1995).
Arborele filogenetic, reprezentat de dendrogram, a fost interpretat conform modelelor
prezentate de Saitou (1987)
3.6. METODE PENTRU DETERMINAREA CONINUTULUI DE SUBSTAN USCAT DIN
FRUCTE
Gradele Brix (simbol Bx) sunt o unitate reprezentativ pentru coninutul n zahr a unei
soluii apoase. Un grad Brix corespunde unui gram de sucroz dizolvate n 100 grame de soluie i
reprezint concentraia soluiei ca i procent din greutate (% w/w) (n mod direct, din mas). Dac
soluia conine dizolvate alte solide dect sucroz pur, precum alte tipuri de zaharuri, minerale, etc.,
atunci gradele brix (Bx) aproximeaz doar coninutul de substan solid dizolvat. Gradele brix
sunt folosite n mod current n oenologie, industria zahrului, a mierii i dulceurilor.
Tabelul 3/Table 3
Coninutul de substan uscat n fructe cu diferite origini (Antoneli et al. 2005)
Soluble solids content in the berries of different origins

Valoare
Value range
Specia
Species
10,83-15,55 ctin chinezeasc
10,19-22,74 ctin chinezeasc
5,6-20,1 subsp. sinensis
0,9-3,2 subsp. rhamnoides
2,85-4,79 ctin ruseasc
8,9-11,7
Cultivare din zona
Altai
Substan uscat
( Brix)
Soluble solids
8,2-10 Cultivare din zona
22
Moscova

(Antoneli et al. 2005) precizeaz de asemenea c odat cu procesul de maturare, coninutul
n solide solubile scade vertiginos la unele exemplare de ctin din Germania.
n experiena noastr am determinat coninutul n substan uscat cu ajutorul unui
refractometru de mn de construcie ALLA, Frana.
Refractometrul este compus din: prism, capac, urub de setare, tub oglind, obiectiv cu inel
de setare a dioptriei.
Pentru executarea msurtorilor (Gotea et al. 2010) se ajusteaz linia de citire la zero cu
ajutorul urubului de setare. Dup calibrare se trece la citirea probelor n felul urmtor: se ridic
capacul i se pun 1-2 picturi pe prism. Citirea se face pe scala refractometrului cu capacul nchis.
Dup efectuarea citirii se cura lichidul rmas cu un tifon umed. Citirea se face direct n grade brix.

23
CAPITOLUL IV. REZULTATE I DISCUII

4.1. REZULTATE OBINUTE PRIVIND VARIABILITATEA EXISTENT LA CTIN, PRIN
APLICAREA METODELOR DE DETERMINARE A APROPIERII FILOGENETICE
Conform literaturii de specialitate, metodele sistematice (taxonomice) se bazeaz pe
clasificrile botanice ale familiilor, genurilor i speciilor, clasificri efectuate n principal pe baza
fenotipului plantelor. Principalele caracteristicile morfologice care pot fi luate n considerare la
ctin, n aplicarea unor astfel de metode, sunt: greutatea fructelor, numrul de spini, lungimea lor,
mrimea frunzelor, etc.
n prezentul studiu au fost analizate cu ajutorul metodei taxonomice (sistematice) 178 de
genotipuri de ctin din flora spontan.
Pentru o bun sistematizare, genotipurile au fost mprite n funcie de proveniena lor,
precum i n funcie de tipul materialului vegetal analizat.
4.1.1. Rezultatele aplicarii metodei taxonomice la genotipurile provenite din flora spontan, pe
baza caracteristicilor plantelor i semintelor
Analiza exhaustiv a caracteristicilor plantelor i aplicarea metodelor taxonomice de
difereniere a genotipurilor de ctin provenite din flora spontan, a evideniat o variabilitate
relativ mare a materialului biologic, n funcie de genotipul analizat, dar i n funcie de
caracterul analizat.
n Delta Dunrii, variabilitatea puternic existent la fructele de ctin se caracterizeaz prin
fructe predominant portocalii, de form predominant alungit, de mrime medie spre mare (300-500
mg/fruct).
n ceea ce privete spinii, acetia au prezentat un numr ntre 3-14 spini/10 cm lstar, iar
lungimea maxim a acestora este de 2-9 cm.
Frunzele exemplarelor femele din aceast zon sunt relativ mici, improprii pentru recoltat
frunze n scop medicinal, cu lungimea cuprins ntre 2,5 6,4 cm.
n Judeul Mure, variabilitatea puternic existent la fructele de ctin se caracterizeaz prin
fructe predominant portocaliu deschis cu exemplare care prezint fructe glbui. Putem deduce din
acest lucru, conform literaturii, c procentul de ulei din fructele de ctin este mai mare, lucru
semnalat de culoarea deschis a acestora. Forma fructelor este predominant sferic, cu mic spre
mijlocie (200-400 mg/fruct).
frunze n scop medicinal, cu lungimea cuprins ntre 3 6,2 cm.

n Judeul Cluj, variabilitatea puternic existent la fructele de ctin se caracterizeaz prin
fructe predominant de culoare portocalie cu exemplare care prezint fructe glbui i albicioase.
Putem deduce din acest lucru, conform literaturii, c procentul de ulei din fructele de ctin este mai
mare, lucru semnalat de culoarea deschis a acestora. Forma fructelor este predominant sferic, cu
mrime medie spre mijlocie (300-400 mg/fruct).
24
frunze n scop medicinal, cu lungimea cuprins ntre 3 6,1 cm.
n ceea ce privete exemplarele mascule, n Delta Dunrii am gsit n teren exemplare
deosebit de atractive care se pot folosi ca i genitori paterni n plantaii prin prisma cantitii de
polen care acetia o pot produce. Astfel, lungimea amenilor variaz de la un minim de 5 mm la un
maxim de 16 mm. Forma lor predominant n Delta Dunrii este alungit.
Spinii gsii pe 10 cm lstar prezint un minim de 3 i un maxim de 14 iar lungimea acestora
este cuprins ntre 2 i 9 cm.
Ceea ce difer ns de plantele femele este lungimea frunzelor care este cuprins ntre 6 i
8,6 cm iar limea ntre 4,3 i 7,5 mm. Acest lucru reprezint o calitate deosebit n ceea ce privete
posibilitatea de recoltare a frunzelor cu un randament ridicat n scopuri medicinale.
n judeul Mure, la genotipurile studiate, mugurii floriferi masculi prezint o variaie ntre 4-
14 cm. Forma predominanta este sferic.
Numrul spinilor pe o poriune de 10 cm este cuprins ntre 3-13 iar lungimea acestora ntre
2 i 9 cm. Observm aici o reducere a mrimii spinilor fa de populaiile din Delta Dunrii. Chiar
dac sunt menionate n literatur exemplare fr spini n Delta Dunrii (Rai and Rai 2003) nu am
avut ocazia s le ntlnesc n teren.
Lungimea frunzelor este cuprins ntre 4,5 8,5 cm, deci mai mari dect a populaiilor din
Delta Dunrii. Limea frunzelor este cuprins ntre 4-7,6 mmm.
Lungimea amenilor la genotipurile din zona Cluj este cuprins ntre 5-16 mm, la fel ca i
cele din Delta Dunrii.
Spinii sunt prezeni n numr de 3-14 pe o lungime de 10 cm lstar. Lungimea frunzelor
prezint un minim de 4,2 cm i un maxim de 7,1cm, iar limea este cuprins ntre 4 i 7 mm.

STUDIUL PRINCIPALELOR CARACTERISTICI ALE SEMINELOR
Aa cum s-a prezentat foarte detailat n subcapitolul 3.1, metoda de nmulire la ctin este
folosit pentru obinerea plantelor folosite n lucrrile de mpduriri i n programele de ameliorare.
n prezentul studiu am analizat semine provenite de la exemplarele femele din cele trei zone
geografice.
4.2.1. Caracteristicile seminelor obinute de la plantele din zona Deltei Dunrii
n cadrul celor 30 de genotipuri studiate din zona Deltei Dunrii, greutatea seminelor a avut
valori diferite, media experimentului fiind de 10,62 mg, iar amplitudinea de variaie fiind cuprins
ntre 7,42 mg la genotipul Sf. Gheorghe 6 i 13,72 mg la genotipul Periprava 5 (Tabelul 7.26.).
Seminele cu greutatea cea mai mare au aparinut genotipurilor : Periprava 6 (12,27 mg), Sf.
Gheorghe 3 (12,31 mg), Sf. Gheorghe 11 (12,71 mg), Padurea Letea (12,92 mg), Sf. Gheorghe 10
(13,07 mg).
Seminele cu greutatea cea mai mic au aparinut genotipurilor: Periprava 1 (7.50 mg),
Periprava 3 (7.69 mg), Sf. Gheorghe 1 (7.83 mg), Sf. Gheorghe 8 (7.88 mg), Padurea Letea 3
(8.13 mg).
25
Pe baza coeficienilor de variabilitate se poate afirma c variabilitatea caracterului greutatea
seminelor a fost medie, doar genotipul Pdurea Letea 2 a prezentat o variabilitate mare
(CV=13,00%).
Poteniali genitori pentru o plante destinate producerii uleiului din semine poate fi
genotipul Periprava 5 i Sf. Gheorghe 10.

4.2.2. Caracteristicile seminelor obinute de la plantele din judeului Mure
n cadrul celor 30 de genotipuri studiate din zona judeului Mure, greutatea seminelor a
avut valori diferite, media experimentului fiind de 8,05 mg, iar amplitudinea de variaie fiind
cuprins ntre 5,61 mg la genotipul Socol 7 i 12,28 mg la genotipul Crieti 1 (Tabelul 7.26.).
Seminele cu greutatea cea mai mic au aparinut genotipurilor : Socol 9 (5.65mg), Frgu 5
(5.83mg), Frgu 4 (5.91mg), Frgu 3 (5.99mg), Frgu 8 (6.00mg).
Seminele cu greutatea cea mai mare au aparinut genotipurilor: Crieti 10(10.00mg),
Crieti 5(10.07mg), Frgu 10(10.27mg), Frgu 7(10.35mg), Crieti 11(10.65mg)
seminelor a fost medie, doar genotipul Pdurea Letea 2 a prezentat o variabilitate mare
(CV=12,2,00%).
Poteniali genitori pentru o plante destinate producerii uleiului din semine pot fi
genotipurile Crieti 1 i Crieti 11.

4.2.3. Caracteristicile seminelor obinute de la plantele din judeului Cluj
n cadrul celor 29 de genotipuri studiate din zona judeului Cluj, greutatea seminelor a avut
ntre 6,70 mg la genotipul Nicula 9 i 11,56 mg la genotipul Nicula 8 (Tabelul 7.26.).
Seminele cu greutatea cea mai mic au aparinut genotipurilor : Nicula 10 (9.23mg), Ctina
1 (10.65mg), Ctina 2 (13.16mg), Ctina 3 (5.56mg), Ctina 4 (11.06mg).
Seminele cu greutatea cea mai mare au aparinut genotipurilor: Nicula 3 (8.39mg), Nicula 4
(8.63mg), Nicula 5 (10.05mg), Nicula 6 (11.66mg), Nicula 7 (11.85mg),
seminelor a fost medie, doar genotipul Pdurea Letea 2 a prezentat o variabilitate mare (CV=14,67
%).
Poteniali genitori pentru o plante destinate producerii uleiului din semine pot fi
genotipurile Nicula 6 i Ctina 7.

4.2.4. Variabilitatea greutii seminelor la populaiile din cele trei zone luate n studiu
Analiznd media greutii seminelor la toate provenienele din cadrul celor trei zone, s-a
constatat c valoarea medie a caracterului a prezentat diferene mici.
26
9.53
8.05
10.62
0.00
2.00
4.00
6.00
8.00
10.00
12.00
Cluj Mures Delta Dunarii
\

Fig. 2. Media caracterului greutatea seminelor din fructele populaiilor studiate
Fig. 2. The mean of seeds weight from fruits of the studied populations

Valorile cele mai mari au fost nregistrate n zonele Delta Dunrii i Cluj. Zona Mure a
prezentat cea mai mic valoare a mediei greutii seminelor (8.05 mg).
21.68
22.80
17.14
0.00
5.00
10.00
15.00
20.00
25.00

Fig. 3. Coeficienii de variabilitate pentru greutatea seminelor la fructele din populaiile studiate
Fig. 3. The coefficients of variability for seeds weight from fruits of the studied populations

n schimb, analiznd coeficienii de variabilitate, se poate afirma c, variabilitatea greutii
seminelor n cadrul celor trei zone studiate, a fost mijlocie. Limitele coeficienilor de variabilitate s-
au situat ntre 17,14,0% penutru Delta Dunrii i 22,8 la pentru zona Mure.
4.3. REZULTATE OBTINUTE PRIVIND VARIABILITATEA EXISTENTA LA CATINA PRIN
APLICAREA METODELOR DE MARKARE MOLECULARA
Utilizarea markerilor moleculari, prin analiza genoamelor, a determinat o ascensiune
puternic a eficienei activitilor de ameliorare, att la plante ct i la animale, aplicabilitatea lor
27
fiind demonstrat n: identificarea i taxonomia genetic a indivizilor, realizarea hrilor genetice,
realizarea studiilor de filogenie (VOS i colab., 1995). De la aceste considerente, i de la cele
prezentate anterior, n prezenta experien, s-a impus analiza diversitii populaiilor investigate la
nivel molecular, prin analize ADN i prin ntocmirea arborelui filogenetic al acestora.
4.3.1. Rezultatele izolrii ADN-ului
Folosind protocolul descris mai sus, cantitatea medie de ADN care s-a obinut a variat de la
45, 9 ng /l pn la 420 ng /l.
Probele de ADN cu valori ale citirilor OD
260
/OD
280
cuprinse ntre 1.70 i 1.90 au fost alese
iar concentraia de ADN a fost diluat la 20 ng /l cu ddH
2
O pentru a reduce erorile i a creea un
standard uniform.

4.3.2. Rezultatele amplificrii ADN-ului
Profilului benzilor formate de produii de amplificare n gelul de electroforez s-a urmrit
prin tehnica RAPD, deseori utilizat n acest scop (Ruan et al. 2004; Sheng et al. 2006; Sun et al.
2006).
Au fost testai un numr de 10 primeri decameri, a cror coninut de guanin i citozin s-a
ncadrat ntre 60%-70%. Din cei 10 primeri decameri folosii pentru amplificare, toi au dat produi
de amplificare, fiind selecionai pentru analiza RAPD.
Tabelul 4/Table 4
Primerii folosiii n analizele moleculare
The primers used in molecular analysis

Nr. crt.
No. of entry
Primer
Primer
Secven nucleotidic (5-3)
Nucleotidic sequence
G-C %
Greutatea molecular
Molecular weight
1. OPA-07 GAAACGGGTG 60 3117,1
2. OPA-08 GTGACGTAGG 60 3108,1
3. OPA-10 GTGATCGCAG 60 3068,1
4. OPA-11 CAATCGCCGT 60 2988
5. OPA-15 TTCCGAACCC 60 2948
6. OPB-02 TGATCCCTGG 60 3019
7. OPB-04 GGACTGGAGT 60 3108,1
8. OPB-11 GTAGACCCGT 60 3028
9. OPB-18 CCACAGCAGT 60 2997
10. OPD-03 GTCGCCGTCA 70 3004

Primerii OPB-02 i OPB-04 au generat cel mai mare numr de benzi polimorfice
(Tabelul 32). Aa cum se observ n Tabelul 32. diferenele dintre numrul de benzi generate de
fiecare primer sunt destul de mari. La toate populaiile, toi primerii RAPD au determinat formarea
unor benzi constante i bine determinate de-a lungul tuturor probelor.
A fost obinut un numr de 119 markeri, cu mrimea cuprins ntre 200 i 1900 pb.
Polimorfismul a fost foarte pronunat, cu o medie de 88,6% markeri polimorfici la toi primerii.
Numrul de markeri identificai i procentul de loci polimorfici, calculat pentru ntregul
material, a variat de la 7 i 71% pentru primerul OPA-15, la 17 i 100% pentru markerul OPB-04.
28
Tabelul 5/Table 5
Numrul de benzi pentru fiecare amors i procentul locilor polimorfici calculai pentru ntregul
eantion ct i pentru fiecare populaie
The number of obtained bands, percentage polymorphic loci calculated across the entire sample,
as well as in each population

Procentul de markeri polimorfici
n populaie
Primer
Numr
markeri
Total P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 Media
OPA-07 12 100 33.3 58.3 75 66.7 58.3 83.3 75 75 83.3 67.58
OPA-08 9 77 55.6 66.7 55.6 81.8 81.8 81.8 81.8 81.8 66.7 72.62
OPA-10 16 81 68.8 50 50 56.3 36.5 50 68.8 68.8 68.8 57.56
OPA-11 11 82 27.3 54.6 45.5 54.6 36.4 45.5 45.5 63.6 54.6 47.51
OPA-15 7 71 14.3 80 42.9 71.4 42.9 42.9 28.6 42.9 57.1 47.00
OPB-02 16 100 62.5 62.5 50 56.3 31.3 81.3 68.8 81.3 81.3 63.92
OPB-04 17 100 64.7 52.9 47.1 47.1 47.1 70.6 35.3 41.2 35.3 49.03
OPB-11 13 85 46.2 69.2 38.5 61.5 53.9 46.2 38.5 61.5 53.9 52.16
OPB-18 10 90 30 50 50 30 50 60 60 60 60 50.00
OPD-03 8 100 75 87.5 37.5 50 50 87.5 62.5 45.5 37.5 59.22

Procentul markerilor polimorfici n populaie a variat de la 14,3% pentru primerul OPA-15
n populaia P
1
, la 87,5% pentru primerul OPD 03 n populaia P
2
i P
6
.
Media procentului de markeri polimorfici n diferitele populaii a fost cuprins ntre 47%
pentru primerul OPA -15 i 72.62% primerul OPA -08.
(Weising et al. 1995) subliniaz faptul c relaiile filogenetice care rezult din analiza RAPD
se bazeaz pe dou presupuneri: independena caracterelor analizate (benzilor) n cadrul fiecrei
specii (sunt rare situaiile n care se tie, cu certitudine, dac benzile considerate ca i caractere
independente reprezint, de fapt, fragmente linkate sau alele); omologia caracterelor (benzilor) la
comparaiile ntre specii (fragmentele care au migrat n aceeai poziie n gel, reprezint secvene
omoloage).
Dei se consider c fiecare fragment de ADN este un locus (LANDRY et al. 1994), este
posibil totui ca unele benzi s reprezinte loci multiplii, care au migrat mpreun (PAMFIL et al.
2000). (JNTSCHI et al. 2009) sugereaz, n acest sens utilzarea algoritmilor genetici pentru
elucidarea analizei secvenelor nucleotidice (alinierea, repetarea secvenelor, comparaii ntre ele).
n 1978, NEI afirma faptul c exist un avantaj al utilizrii unui numr mare de loci
pentru a estima distana genetic i recomanda un numr de cel puin 50 de loci pentru analiz.
4.3.3. Dendrograma populaiilor de ctin analizate din flora spontan
n cazul analizelor RAPD, dendrogramele rezultate prin prelucrarea datelor pe computer
constituie o reprezentare fidel a relaiilor filogenetice dintre diferitele populaii de ctin analizate
precum i a diversitii genetice existente n cadrul acestor populaii de ctin.
29
n dendrograme, variantele (populaiile) ntre care exist cele mai mici distane genetice sunt
grupate apropiat, n timp ce variantele ntre care distanele genetice sunt mai mari sunt plasate mai
deprtat unele de altele (Tabelul 33).
Tabelul 6/Table 6
Distanele dintre populaiile de ctin calculate cu ajutorul metodei originale a lui Nei (Nei 1972)
Nei's Original Measures of Genetic Identity and Genetic distance (Nei 1972)

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9
P1 *** 0.9371 0.9354 0.9337 0.9409 0.9140 0.9327 0.9050 0.9011
P2 0.0650 **** 0.9368 0.9530 0.9372 0.9322 0.9234 0.9227 0.9177
P3 0.0668 0.0653 **** 0.9611 0.9731 0.9218 0.9564 0.9387 0.9444
P4 0.0686 0.0482 0.0397 **** 0.9618 0.9210 0.9458 0.9488 0.9430
P5 0.0609 0.0648 0.0272 0.0389 **** 0.9127 0.9503 0.9164 0.9104
P6 0.0899 0.0702 0.0815 0.0823 0.0913 **** 0.9403 0.9266 0.9252
P7 0.0697 0.0797 0.0446 0.0557 0.0510 0.0616 **** 0.9516 0.9548
P8 0.0998 0.0804 0.0632 0.0525 0.0873 0.0762 0.0497 **** 0.9660
P9 0.1041 0.0859 0.0572 0.0587 0.0939 0.0778 0.0463 0.0346 ****

Cele mai apropiate populaii din punct de vedere genetic, prin metoda original a lui Nei sunt
urmtoarele: Letea (Delta Dunrii), Crieti (Jud. Mure) cu distana de 0,0272. Cele mai deprtate
populaii din punct de vedere genetic sunt : Periprava ( Delta Dunrii) de Nicula (Jud. Cluj) cu
distana 0,1041.

Tabelul 7/Table 7
Distanele genetice nedeplasate calculate cu metoda lui Nei (1978)
Nei's Unbiased Measures of Genetic Identity and Genetic distance (Nei 1978)

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9
P1 *** 0,9556 0,9511 0,9512 0,9562 0,9320 0,9495 0,9228 0,9179
P2 0,0455 *** 0,9540 0,9723 0,9540 0,9520 0,9415 0,9423 0,9363
P3 0,0501 0,0471 *** 0,9778 0,9877 0,9386 0,9724 0,9559 0,9607
P4 0,0500 0,0281 0,0225 *** 0,9781 0,9396 0,9634 0,9680 0,9611
P5 0,0448 0,0471 0,0124 0,0222 *** 0,9290 0,9656 0,9328 0,9257
P6 0,0705 0,0492 0,0633 0,0623 0,0737 *** 0,9586 0,9462 0,9438
P7 0,0518 0,0603 0,0280 0,0373 0,0350 0,0423 *** 0,9701 0,9724
P8 0,0804 0,0594 0,0451 0,0325 0,0696 0,0553 0,0303 *** 0,9855
P9 0,0857 0,0659 0,0401 0,0397 0,0772 0,0578 0,0279 0,0146 ***

Cele mai apropiate populaii din punct de vedere genetic, prin metoda unbiased mesure sunt
urmtoarele: Letea (Delta Dunrii), Crieti (Jud. Mure) cu distana de 0,0124. Cele mai deprtate
populaii din punct de vedere genetic sunt : Periprava ( Delta Dunrii) de Nicula (Jud. Cluj) cu
distana 0,0857.

30
Padurea Letea
Craiesti
Faragau
Periprava
Sf.Gheorghe
Socol
Cluj
Catina
Nicula

Fig. 4. Dendrograma populaiilor de ctin analizate realizat prin metoda Neighbor-Joining
Fig. 4. The dendrogram of sea buckthorn populations analized constructed with Neighbor-Joining
method

Padurea Letea
Craiesti
Faragau
Sf.Gheorghe
Periprava
Socol
Cluj
Catina
Nicula
0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.035

Fig. 5. Dendrograma populaiilor de ctin analizate realizat prin metoda UPGMA
Fig. 6. The dendrogram of sea buckthorn populations analized constructed with UPGA method

Pentru a investiga o posibil asociere ntre nrudirea genetic i originea geografic am
comparat matricea distanelor genetice cu matricea distanelor corespondente. Aceste dou matrici
nu au fost semnificativ corelate: (r = 0.14 i P= 0.851)
Procentul mediu de loci polimorfici n cadrul ssp. carpatica este de 56,6 (Tabel 5)

Tabelul 8/Table 8
Procentul mediu de loci polimorfici n cadrul populaiilor studiate (%P) i indicele de diversitate a
lui Nei (H)
Percentage of polymorphic loci (%P) and mean gene diversity (H)

Populaia %P H
31
Population
P1 47,8 0,179
P2 63,2 0,140
P3 49,2 0,162
P4 57,6 0,170
P5 48,9 0,148
P6 64,9 0,220
P7 56,5 0,175
P8 62,2 0,192
P9 59,9 0,203
Media 56,6 0,175
%P procentul mediu de loci polimorfici
H indicele mediu de diveristatea a genelor a lui Nei

4.4. REZULTATE OBTINUTE PRIVIND VARIABILITATEA EXISTENTA LA CATINA, PRIN
STUDIUL PRINCIPALELOR CARACTERISTICI ALE FRUCTELOR
Principalul produs al acestui minunat arbust sunt fructele. Variabilitatea deosebit pe care o
ntlnim n ara noastr la ctin n ceea ce privete culoare, mrimea, forma etc. este extrem de
mare. n studiul nostru am ntlnit plante cu fructe mici, sub 0.2 g-fruct pn la plante cu fructe mari
de 0,5 g/fruct sau chiar mai mult. De altfel, odata cu mrimea fructelor, se schimb i culoarea, de la
galben auriu, portocaliu splcit, portocaliu aprins, portocaliu spre rou i combinaiile acestor
culori. Aproape ca nu exist dou tufe de ctin care s fie asemntoare din acest punct de vedere.
4.4.1. Caracteristicile fructelor obinute de la plantele din zona Deltei Dunrii
n cadrul celor 30 de genotipuri studiate din zona Deltei Dunrii, greutatea fructelor a avut
valori diferite, media experimentului fiind de 362,02, mg, iar amplitudinea de variaie fiind cuprins
ntre 233,03 mg la genotipul Pdurea Letea 10 i 519,96 mg la genotipul Pdurea Letea 4 (Tabelul
7.26.).
Fructele cu greutatea cea mai mic au aparinut genotipurilor : Padurea Letea 9 (238.56 mg),
Sf. Gheorghe 2 (250.17 mg), Sf. Gheorghe 8 (250.60 mg), Padurea Letea 3 (251.47 mg), Sf.
Gheorghe 1 (252.61 mg)
Fructele cu greutatea cea mai mare au aparinut genotipurilor: Padurea Letea 5 (500.46 mg),
Padurea Letea 11 (501.53 mg), Periprava 5 (518.13 mg), Sf. Gheorghe 9 (518.89 mg), Sf. Gheorghe
3 (519.27 mg)
fructelor a fost medie, doar genotipul Periprava 2 a prezentat o variabilitate mare (CV=13,19%).
Poteniali genitori pentru plante destinate producerii de fructe pot fi genotipurile: Padurea
Letea 11(501.53 mg), Periprava 5(518.13 mg), Sf. Gheorghe 9(518.89 mg), Sf. Gheorghe 3(519.27
mg), Padurea Letea 4 (519.96 mg).
32
4.4.2. Caracteristicile fructelor obinute de la plantele din zona judeului Mure
n cadrul celor 30 de genotipuri studiate din zona judeului Mure, greutatea fructelor a avut
ntre 245,11 mg la genotipul Frgu 10 i 516,15 mg la genotipul Frgu 5 (Tabelul 7.26).
Fructele cu greutatea cea mai mic au aparinut genotipurilor : Crieti 6 (245.53 mg), Socol
1 (246.40 mg), Frgu 9 (250.63 mg), Crieti 5 (251.06 mg), Crieti 11 (251.93 mg)
Fructele cu greutatea cea mai mare au aparinut genotipurilor: Crieti 8 (431.76 mg),
Crieti 7 (513.83 mg), Crieti 1 (514.20 mg), Socol 7 (514.61 mg), Socol 2 (514.89 mg)
fructelor a fost medie, doar genotipul Frgu 10 a prezentat o variabilitate mare (CV=11,19%).
Poteniali genitori pentru plante destinate producerii de fructe pot fi genotipurile: Crieti 7
(513.83 mg), Crieti 1 (514.20 mg), Socol 7 (514.61 mg), Socol 2 (514.89 mg), Frgu 5 (516.15
mg)

4.4.3. Caracteristicile fructelor obinute de la plantele din zona judeului Cluj
n cadrul celor 29 de genotipuri studiate din zona judeului Cluj, greutatea fructelor a avut
ntre 239,21 mg la genotipul Ctina 4 i 511,02 mg la genotipul Cluj-Napoca 5 (Tabelul 7.26).
Fructele cu greutatea cea mai mic au aparinut genotipurilor : Cluj-Napoca 10 (239.97 mg),
Nicula 1 (240.08 mg), Ctina 3 (244.74 mg), Cluj-Napoca 9 (245.50 mg), Ctina 9(245.61 mg).
Fructele cu greutatea cea mai mare au aparinut genotipurilor: Nicula 10 (489.63 mg), Ctina
5 (507.51 mg), Nicula 7 (508.29 mg), Nicula 2 (508.57 mg), Ctina 1 (509.07 mg).
fructelor a fost medie, doar genotipul Cluj-Napoca 10 a prezentat o variabilitate mare (CV=11,7%).
Poteniali genitori pentru plante destinate producerii de fructe pot fi genotipurile: Ctina 5
(507.51 mg), Nicula 7 (508.29 mg), Nicula 2 (508.57 mg), Ctina 1 (509.07 mg), Cluj-Napoca 5
(511.02 mg).
4.4.4. Variabilitatea greutii fructelor la populaiile luate n studiu
Analiznd media greutii fructelor la toate provenienele din cadrul celor trei zone studiate,
s-a constatat c valoarea medie a caracterului a prezentat diferene mici ntre zona Cluj i Mure.
Zona Deltei Dunrii s-a remarcat printr-o greutate medie mai mare a fructelor dect n celelalte dou
zone.
n schimb, analiznd coeficienii de variabilitate, se poate afirma c variabilitatea greutii
fructelor n cadrul celor trei zone studiate, a fost mare. Limitele coeficienilor de variabilitate s-au
situat ntre 26,9 pentru zona Mure i 28,4 pentru zona Cluj.

33
355.40
356.67
363.02
350.00
352.00
354.00
356.00
358.00
360.00
362.00
364.00
mg
cluj Mures Delta Dunarii

Fig. 6. Media caracterului greutatea fructelor din populaiile studiate
Fig. 6. The mean of fruits weight among the studied areas

28.4
26.9
27.5
26.0
26.5
27.0
27.5
28.0
28.5

Fig. 7. Coeficienii de variabilitate pentru greutatea fructelor din populaiile studiate
Fig. 7. The coefficients of variability for fruits weight among the studied areas
4.4.5. Corelaiile fenotipice dintre greutatea seminelor i greutatea fructelor n populaiile
studiate
La populaiile studiate s-au studiat i coeficienii de corelaie dintre greutatea seminelor i
greutatea fructelor. Calcularea coeficienilor de corelaie fenotipic s-a efectuat conform variantelor
existente.
ntre cele dou caractere s-au pus n eviden corelaii semnificativ pozitive ntre greutatea
seminelor i cea a fructelor la populaiile Periprava i Letea, aceasta nsemnnd c greutatea
seminelor influeneaz semnificativ greutatea fructelor. Acest lucru nseamn c ntotdeauna n
fructele mari exist semine mari.
34
n restul populaiilor, greutatea seminelor a avut o influen nesemnificativ asupra greutii
fructelor, nsemnnd c exist fructe mari cu semine mici i fructe mici cu semine mari.
Tabelul 9/Table 9
Corelaiile fenotipice dintre greutatea seminelor (mg) i greutatea fructelor (mg)
Phenotypic correlations between seeds weight (mg) and fruits weight (mg)

Valoarea teoretic
The theoretical value Populaia
The population
Nr indivizi
Sample numbers
Corelaiile fenotipice
(r valoarea calculat)
Phenotypical correlations
(r calculated value)
r5% r1%
Semnificaia
The significance
Periprava 8 0,921 0,71 0,83 **
Sf. Gheorghe 11 0,588 0,60 0,74 -
Letea 11 0,079 0,60 0,74 **
Frgu 10 -0,546 0,63 0,76 -
Crieti 10 0,266 0,63 0,76 -
Socol 9 -0,027 0,67 0,80 -
Cluj 10 0,380 0,63 0,76 -
Ctina 9 0,164 0,67 0,80 -
Nicula 10 0,438 0,63 0,76 -

4.5. REZULTATE OBTINUTE PRIVIND IMBUNATATIREA CAPACITATII DE GERMINATIE
A SEMINTELOR SI POSIBILITATEA APLICARII UNOR TRATAMENTE DE CRESTERE A
PROCENTULUI DE GERMINARE
nmulirea prin semine este o metod de reproducere cu o importan deosebit, deoarece
produce relativ uor un numr foarte mare de plante folosite n procesele de mpduriri i tot odat
menine diversitatea genetic a diferitelor populaii de ctin. Cu toate acestea, studiile privind
viabilitatea, longevitatea seminelor, precum i aplicarea unor tehnici de mbuntire a germinaiei
sunt relativ puine (APAQ 1999).
Pe baza acestor considerente i datorit faptului c n studiile din litaratur datele referitoare
la germinaia semineelor n funcie de tratamentul aplicat nu corespund, s-a iniiat un alt
experiment, n care s-a studiat facultatea germinativ i capacitatea germinativ a seminelor n
condiii de laborator. n acest scop, s-au utilizat diferite variante de tratamente (descrise n capitolul
de material i metod).
4.5.1. Rezultate obinute prin determinarea energiei germinative a seminelor
Energia germinativ a seminelor a prezentat valori diferite n cadrul celor 90 de variante
luate n studiu (Tabelul 40), amplitudinea de variaie fiind cuprins ntre 13,0% (genotipul Socol 6,
V
1
) i 24,8% (genotipul Crieti 8, V
3
), comparativ cu media experienei de 18,6% (considerat
variant martor).
Cele mai mari valori ale energiei geminative pentru varianta a doua de tratament (stratificare
n nisip) s-au nregistrat la urmtoarele genotipuri: Crieti 8 (23,5%), Ctina 4 (23,5%), Ctina 7
(22,5%).
Pentru cea de-a treia variant de tratament (semine inute n ap cald), cele mai mari valori
ale energiei germinative s-au nregistrat la genotipurile: Crieti 8 (24,8%), Ctina 4 (22,5%), Ctina
7 (22,5%), Ctina 2 (22,8%) i Nicula 8 (22 %).
35
n cazul primei variante de tratament (V
1
), respectiv semine puse inute n frigider, valori
pozitive s-au nregistrat la genotipurile: Periprava 1 i Cluj-Napoca 6, ns fr abateri asigurate
statistic.
Analiznd influena genotipului asupra energiei de germinare a seminelor (Tabelul 7.53.) s-a
constatat c valorile medii ale energiei de germinare pentru variantele analizate au fost diferite n
comparaie cu martorul experienei (18,6%) la majoritatea genotipurilor. Cel mai mic procent al
energiei germinative a fost nregistrat la genotipul Frgu 4 (15,2%), iar cel mai mare la genotipul
Crieti 8 (21,8%).
Genotipurile Crieti 8, i Ctina 2, Ctina 4 i Ctina 7 au nregistrat cele mai mari procente
ale energiei germinative, n timp ce la genotipurile Crieti 4, Frgu 4 i Sf. Gheorghe 6 s-au
observat cele mai mici procente.
Cu un procent al energiei germinative relativ mare comparativ cu media experienei (ns
fr diferene asigurate statistic), s-au remarcat i genotipurile Periprava 1, Periprava 3, Periprava 5.
Comparnd variantele tratate (Tabelul 40) cu media experienei, valori asigurate statistic s-au
remarcat n toate cele trei variante experimentale. n cazul seminelor care au fost inute la frigider
(V
1
), precum i n cazul tratrii acestora cu ap cald, valorile energiei germinative au fost foarte
distinct semnificative n ambele cazuri. n cazul seminelor inute la frigider, procentul energiei
germinative a fost negativ, fiind mult mai mic (16 %) fa de media experienei (18%).

Tabelul 10/Table 10
Influena tratamentului asupra energiei de germinare a seminelor
The treatment influence over the germination energy

Tratamentul
The treatment
Media energiei germinative d (%)
Energy germination average d (%)
Media relativ (%)
Relative average
V
1
16,0 2,6
ooo
86.20
V
2
19,3 0,8
**
104.10
V
3
20,4 1,8
***
109.70
Media experienei (Mt.)
Mean of experiment (Control)
18,6 100
DL 5% 0,51
DL1% 0,68
DL 0,1% 0,90

Rezultatul foarte bun n cazul seminelor tratate cu ap este confirmat i de cei de la
Institutul de Cercetare i Dezvoltare pentru Agromediu, Canada. (Rousseau 2002)
4.5.2. Rezultate obinute prin determinarea capacitii de germinare a seminelor
n experiena efectuat, genotipurile de ctin au prezentat valori ale capacitii germinative
semnificativ diferite (Tabelul 41.), amplitudinea de variaie fiind cuprins ntre 24,0% (Crieti 4,
semine inute n frigider) i 33,3% (Sf. Gheorghe 6, tratament cu ap cald), comparativ cu media
experienei, de 29% (martor).
Cea mai slab capacitate de germinare au avut seminele genotipurilor: Crieti 4, Crieti 6,
Cluj-Napoca 3, Periprava 1, Letea 5, Frgu 4.
Cele mai mari valori ale capacitii de geminare a seminelor s-au nregistrat la urmtoarele
genotipuri: Sf. Gheorghe 6, Letea 1, Ctina 2 i Socol 1.
36
Cele trei variante de tratament au influenat i ele n mod semnificativ capacitatea de
germinare. Cele mai mici valori ale capacitii de germinare s-au nregistrat la prima variant de
tratament (semine inute n frigider), cu abateri asigurate statistic, negative.
Stratificarea seminelor n nisip (V
2
) a asigurat valori pozitive la unele genotipuri, dar relativ
puine ca numr, comparativ cu V
1
, sau V
3
.
La varianta de tratament ap cald, s-au nregistrat cele mai multe valori pozitive,
semnificative sau foarte semnificative, ale capacitii de germinare la mai multe genotipuri,
comparativ cu varianta V
2
, sau V
1
de tratament. S-a confirmat, ca i n cazul energiei germinative,
c tratamentul cu ap cald poate mbunti semnificativ capacitatea de germinare a seminelor de
ctin.
Analiznd influena genotipului asupra capacitii de germinare a seminelor (Tabelul 43) se
poate afirma c valorile capacitii de germinare pentru variantele analizate au fost diferite n
comparaie cu martorul experienei (29%) la majoritatea genotipurilor. Cel mai mic procent al
capacitii de germinare a seminelor a fost nregistrat la genotipul Crieti 4 (26,3%), iar cel mai
mare la genotipul Sf. Gheorghe 6 i Letea 1 (31,1%).
Genotipurile Cluj-Napoca 7, Crieti 8, Socol 6, Frgu 4, Periprava 3 i Periprava 1, au
nregistrat cele mai mici procente ale facultii germinative, n timp ce la genotipurile: Periprava 5,
Sf. Gheorghe 1 i Socol 1 s-au obinut cele mai mari procente.
Comparnd variantele de tratament (Tabelul 44.) cu media experienei, valori asigurate
statistic s-au obinut la variantele experimentale V
1
i V
3
. n cazul tratrii seminelor cu ap cald
(V
3
), valorile capacitii germinative sunt foarte semnificative. n cazul seminelor pstrate la
frigider, procentul capacitii germinative este negativ, fiind mult mai mic (27,04%) fa de media
experienei.

Tabelul 11/Table 11
Influena tratamentului asupra capacitii de germinare a seminelor
The treatment influence over the germination capacity

Tratamentul
The treatment
Media energiei germinative d (%)
Energy germination average d (%)
Media relativ (%)
Relative average
V
1
27.04 1,96
ooo
93.2
V
2
29.18 0,19 100.6
V
3
30.77 1,77 *** 106.1
Media experienei (Mt.)
Mean of experiment (Control)
29 100
DL 5% 0,34
DL1% 0,46
DL 0,1% 0,60

Indiferent de genotipul analizat, se poate afirma c tratarea seminelor la ctin cu ap
cald mbuntete semnificativ att energia germinativ, ct i capacitatea de germinaie a
seminelor.
37
STUDIUL SUBSTANEI USCATE DIN FRUCTE
Prezentm n tabelele ce urmeaz coninutul de substan uscat din fructe pentru fiecare
exemplar femel luat n studiu. Spre deosebire de datele obinute de ctre (Antoneli et al. 2005),
coninutul n substan uscat este mult mai mare dect cel prezentat de ei pentru subspecia
carpatica.
n msurtorile efectuate reiese c pentru regiunea Delta Dunrii, valoarea maxim este de
15,3 Brix la accesiunea Periprava 4 iar valoarea minim este de 9 Brix pentru accesiunea Sf.
Gheorghe 7.
Pentru judeul Mure, valoarea cea mai mare este de 14,2 Brix la accesiunea Crieti 2 i
cea mai mic valoare la Frgu 4 de doar 8 Brix.
Pentru judeul Cluj, valoarea cea mai mare este de 12,4 Brix la accesiunea Ctina 9 i cea
mai mic de 7,5 Brix la Cluj-Napoca 2.
Analiza varianei cu ajutorul testului t pentru datele prezentate s-a facut avnd ca i
variante experimentale zonele din care s-au recoltat probele, iar ca i repetiiile variantelor, plantele
din cadrul populaiei. Astfel, zona Delta Dunrii cuprinde populaiile din Periprava, Sf. Gheorghe i
Pdurea Letea; Zona Mure cuprinde populaiile Frgu, Crieti i Socol iar zone Cluj cuprinde
populaiile Cluj-Napoca, Ctina i Nicula. Varianta martor este considerat media experienei.

Tabelul 12/Table 12
Coninutul de substan uscat n fructele din zonele studiate
Soluble solids content in the berries from the studied areas

Solide solubile
( Brix)
Soluble solids Nr.

Zona studiat
Studied areas
Nr.
plante
Plants
Media sx
( Brix)
Mean sx
t
Semnif.
Signif
CV%
1 Delta Dunrii 30 12.630,33 3.51 ** 14.51
2 Judeul Mure 30 11.730,31 1.34 - 14.48
3 Judeul Cluj 29 9.280,23 -6.06 ooo 13.06

Media
Mean
11.210,23
*, **, ***/
o, oo, ooo
Semnificaia pentru P<0,05; 0,01 i 0,001 (*, **, *** pozitiv;
o, oo, ooo
negativ)
*, **, ***/
o, oo, ooo
Significant at P<0.05; 0.01 and 0.001 (*, **, *** positive,
o, oo, ooo
negative)

Din analiza varianei reiese faptul c zona Delta Dunrii prezint valori semnificative
pozitive n ceea ce privete coninutul de substan uscat, pe cnd zona Cluj prezint valori distinc
semnificativ negative fa de valoarea martor considerat media experienei. Zona Mure nu prezint
diferene asigurate statistic.

38
CAPITOLUL V. CONCLUZII I RECOMANDRI

Diversitatea genetic i structura genetic a populaiilor a speciei H. rhamnoides a fost
investigat prin intermediul markerilor moleculari precum alozimele i markeri RAPD. (Yao 1993;
Bartish et al. 1999)
Pe baza a 6 loci izozimi, Yao i Tigerstedt (1993) au studiat diversitatea genetic a 11
populaii de H. rhamnoides ssp. sinensis i au gsit un nivel mic de diversitate genetic la nivel
populaional, cu valoarea lui h de 0.117.
n studiul lor RAPD n 10 populaii din flora spontan de ctin aparinnd ssp. rhamnoides
cu distribuie n Europa, Bartish et al. (1999) au gsit c 89.7% i 55.2% dintre markeri au fost
polimorfici la nivel de populaie i subspecie, i c n cadrul populaiei, indicele pentru diversitate
genetic (h) a fost de 0.159.
n studiul de fat pentru H. rhamnoides ssp. carpatica, procentul de markeri polimorfici la
nivel populaional a fost de 56,6% iar indicele pentru diversitate genetic a lui Nei a variat de la 0,14
la 0,22 n cele nou populaii studiate, cu o medie de 0,175 (Tabel 35).
Este interesant de notat faptul c diversitatea genetic ntre populaii studiate aici ale
subspeciei carpatica, se poate compara cu cea a subspeciei ssp. rhamnoides (Bartish et al. 1999) i
cu cea a subspeciei sinensis (Sun et al. 2006) chiar dac distribuia acestei subspecii este mai mic
dect a ambelor subspecii.
Din analiza datelor RAPD publicate, (Bartish et al. 1999) a mprit studiile precedente n
trei grupuri: (1) grupul care cuprinde taxoni cu polenizare strin fcut de vnt, lemnoase i cu
durat de via mare, la care se ateapt un nivel mare de variaie intra populaional; (2) gruul care
cuprinde taxoni cu polenizare strin, plante perene, n principal ierboase, polenizate de ctre
insecte ; (3) grupul care cuprinde plante anuale sau perene cu via scurt, cu autopolenizare, i care
prezint n general o diversitata intrapopulaional mic. Pe aceast baz, Barthis (1999)
concluzioneaz c sistemul de nmulire apare s fie un factor critic pentru explicarea variaiei
genetice din cadrul populaiilor, i consider c ceea ce s-a obinut la H. rhamnoides ssp.
rhamnoides, ca plant lemnoas, cu via moderat de lung, cu polenizare obligatoriu strin i
fcut de vnt, este mai mic dect s-a ateptat.
Barthis (1999) atribuie nivelul mic al diversitii genetice intrapopulaionale distribuiei
isolate i fragmentate ntre populaiile continentale. Se pare totui, c acest factor nu poate explica
nivelul similar de variabilitate la subspecia carpatica, deoarece aceasta are o distribuie mare n
cadrul rii noastre i mai puin izolat. O explicaie alternativ a acestui lucru poate s fie stagiul
succesional. Subspecia carpatica este o specie pionier i ocup teritorii n stagiul succesional
timpuriu.
Aa cum a fost artat (Hamrick and Godt 1990), speciile care apar timpuriu n stagiul
succesional tind s aib un nivel relativ mic al diversitii genetice intrapopulaionale. n plus,
subspecia carpatic prezint un grad ridicat de nmulire prin drajonare, care determin existena
unui individ ntr-o structur aglomerat (Sun et al. 2006).
Datele din literatur i observaiile personale arat c subspecia carpatica poate s produc
10 pn la sute de noi plante prin drajonare (Sun et al. 2006). Aadar, nivelul mare de reproducere
clonal, poate fi rspunztor de nivelul relativ mic al diversitii genetice intra populaionale din
cadrul speciilor de ctin, aa cum s-a artat la alte plante (Sun et al. 2006)
Merit de menionat faptul c diversitatea genetic din cadrul populaiilor subspeciiei
carpatica detectat de prezentul studiu este remarcabil similar cu studiile morfologice pe fructe i
trsturi vegetative ale subspeciei, de ex variaia detectat de ctre RAPD n cadrul populaiilor se
39
coreleaz bine cu ceea ce s-a detectat prin observaii morfologice. De exemplu, populaia P
2
i P
6
,
reprezint valori sczute, respective ridicate pentru diversitatea genetic, n ceea ce privete forma,
culoarea i mrimea fructelor. Acest lucru este artat i de ctre analiza RAPD.

Structura genetic a populaiilor
Bussell (Bussell 1999) face o recenzare a datelor obinute prin RAPD la 35 de specii i arat
c n medie, 19.3% din diversitatea genetic total exist n cadrul populaiilor la 29 de specii cu
polenizare strin i c 62.5% din diversitatea genetic total exist n populaii la 6 specii cu
autopolenizare. De altfel, este de ateptat faptul c majoritatea diversitii genetice s existe n
populaii, att la ssp. sinensis (81.7%) (Sun et al. 2006) ct i la ssp. rhamnoides (84.9% rezultat
din analiza AMOVA) descoperit de (Bartish et al. 1999) deoarece H. rhamnoides este o specie cu
polenizare strin i cu polenizare fcut de vnt.
Aceste valori sunt mai mici dect media la alte specii cu acelai tip de polenizare (Bussell
1999). Pe lng sistemul de polenizare, aa cum se arat de ctre muli autori, fluxul de gene dintre
populaii are o semnificaie important la distribuia variaiei genetice (Hamrick and Godt 1990).
Chiar dac studiile recente arat c polenul subspeciei sinensis nu se mprtie pe o distan
mai mare de 20 m, avnd 6090% din pollen care cade pn la 12 m (Tian et al. 1993), incidena
dispersrii seminelor facilitat de ctre psri i animalele mici a fost foarte mare la ssp. sinensis
(Sun et al. 2006).
Aadar, diferenierea limitat din punct de vedere genetic ntre populaiile de ctin poate s
fie atribuit distanei mari de dispersie a seminelor.
La multe specii de plante exist o corelare ntre poziia geografic i distanele genetice
dintre populaii, care poate fi explicat prin ipoteza izolrii prin distan (Comes and Abbot 2000).
n studiul pe 10 populaii de H. rhamnoides ssp. rhamnoides, (Bartish et al. 1999) nu au gsit
nici o corelaie ntre distanele genetice i cele geografice ntre populaii, analiz RAPD pe dou
seturi de date (r = 0.11, P = 0.763; r = 0.04, P = 0.641).
n mod asemntor, datele noastre RAPD nu au artat o corelare semnificativ ntre
distanele genetice i cele geografice pentru 10 populaii ale subspeciei carpatica (r = 0.14, P =
0.851).
Acest tip de difereniere a populaiilor poate implica adaptarea ssp. carpatica la condiiile
locale de mediu, dat fiind faptul c habitatul ssp. carpatica difer foarte mult funcie de distribuia
sa (opa 1960).
O alt explicaie dat de Bartish et al. 1999, sugereaz c, este posibil ca marea dispersie
geografic i diferenierea ecotipurilor s nu fie reflectat de ctre profilele RAPD.
Variabilitatea fenotipic per ansamblu caracterlor ntlnit la populaiile studiate este
deosebit de mare, ceea ce constituie un fapt imbucurator pentru pentru amelioratori, care pot selecta
n procesul de ameliorare indizi cu caracteriticile dorite de ei.
n ceea ce privete variabilitatea greutii fructelor, s-a observat n analiza dedicat acestui
aspect c aceasta este mare, cu o limit maxim a greutii medii a fructelor de 519,96 mg la
genotipul Pdurea Letea 4. Comparnd acest rezultat cu genotipurile existente pe piaa din Romnia
constatm cu mndrie c acesta este un genotip care se ncadreaz n clasa superioar de calitate n
oferta actual romneasc.
n schimb ns, dac comparm acelai individ cu ceea ce exist pe piaa internaional,
observm c este un individ de clas medie, Rusia propunnd la vnzare varieti obinue prin
selecie n hibrizi obinui prin polenizare liber care au o greutate medie a fructelor de 0,8 1,1 g.
40
Acest lucru ne face s afirmm c exist o cale lung nc n procesul de ameliorare al
ctinei n ara noastr, care abia este pe cale de pionierat, varietile existente pe piaa actual fiind
doar selecii din flora spontan cu o fi bogat de observaii.
Exist n curs de desfurare alte studii axate pe biologia reproduciei, ecologie i genetica
populaiilor care folosesc alte tehnici de analiz molecular care vor aduce lmuriri pentru
conservarea i folosirea acestei imporatante specii economice.

41
BIBLIOGRAFIE SELECTIV

1. Aksenova, N. A. and V. S. Dolgacheva (2003). Seabuckthorn culture in the botanical garden of
the Moscow State University. Seabuckthorn (Hippophae L.) A multipurpose wonder plant.
V. Singh. 1: 165-169.
2. Antoneli, M., A. Raffo and F. Paoletti (2005). Biochemichal changes during ripening of
Seabuckthorn (Hippophae rhamnoides) fruits. Seabuckthorn, a multipurpose wonder plant.
V. Singh, Daya publishing house, New Delhi, India. 2: 285-312.
3. APAQ (1999). Argousier - Guide de production, Mycoflor Inc.
4. Bartish, I. V., N. Jeppsson and H. Nybom (1999). "Population genetic structure in the dioecious
pioneer plant species Hippophae rhamnoides investigated by random amplified polymorphic
DNA (RAPD) markers." Molecular Ecology 8(5): 791-802.
5. Bartish, I. V., N. Jeppsson, H. Nybom and U. Swenson (2002). "Phylogeny of Hippophae
(Elaeagnaceae) inferred from parsimony analysis of chloroplast DNA and morphology."
Systematic Botany 27(1): 41-54.
6. Bussell, J. D. (1999). "The distribution of random amplified polymorphic DNA (RAPD) diversity
amongst populations of Isotoma petraea (Lobeliaceae)." Mol. Ecol. 8: 775789.
7. Chen, Y., G. Liu and B. Xu (2005). "[Effects of artificial seabuckthorn forest on soil and water
conservation in loess hilly region]." Ying Yong Sheng Tai Xue Bao 16(4): 595-599.
8. Comes, H. P. and R. J. Abbot (2000). "Random amplified polymorphic DNA (RAPD) and
quantitative trait analyses across a major phylogeographical break in the Mediterranean
ragwort Senecio gallicus Vill. (Asteraceae)." Mol. Ecol. 9: 6176.
9. Ge, S., G. C. Oliveira, B. A. Schaal, L. Z. Gao and D. Y. Hong (1999). "RAPD variation within
and between natural populations of the wild rice oryza rufipogon from china and brazil."
Heredity 82 (Pt 6): 638-644.
10. Gotea, I., D. Pamfil and R. Gotea (2010). "The study of principal characteristics of fruits from
different seabuckthorn populations (Hippophae rhamnoides L. ssp. carpatica) and the
filogenetics relations among them." Notulae Scientia Biologicae 2(4): in press.
11. Gotea, I., D. Pamfil and R. Gotea (2010). "The variability of soluble solids content in the
seabuckthorn fruits (Hippophae rhamnoides L. ssp. carpatica) from three regions of
Romania." Bulletin UASVM, Agriculture 67(2): 521.
12. Hamrick, J. L. and M. J. Godt (1990). Allozyme diversity in plant species. Plant population
genetics, breeding, and genetic resources. A. H. D. Brown, M. T. Clegg, A. L. Kahler and B.
S. Weir. Sinauer, Sunderland, MA.: 4363.
13. Huang, Q. (2003). Breeding of seabuckthorn (Hippophae rhamnoides L.) in China.
Seabuckthorn (Hippophae L.) A multipurpose wonder plant. V. Singh. 1: 187-193.
14. JNTSCHI, L., S. D. BOLBOAC and R. E. SESTRA (2009). "Hard Problems in Gene
Sequence Analysis: Classical Approaches and Suitability of Genetic Algorithms
" Biotechnology & Biotechnological Equipment 23(2): 1275-1280.
15. Kun Sun, W. C., Ruijun Ma, Xuelin Chen, Ang Li, and Song Ge (2006). "Genetic variation in
Hippopha rhamnoides ssp. sinensis (Elaeagnaceae) revealed by RAPD markers." Biochem.
Genet. 44(5-6): 186-197.
16. LANDRY, B., L. R.Q., W. Y. CHEN and R. L. GRENGER (1994). "Phylogeny analysis of 25
apple rootstocks using RAPD markers and tactical gene tagging." Theor. Appl. Genet. 89:
847-852.
42
17. Natalia, D. (2003). Research on the introduction of seabuckthorn varieties in North Russia.
Seabuckthorn (Hippophae L.) A multipurpose wonder plant. V. Singh. 1: 125-136.
18. Nei, M. (1972). "Genetic distance between populations." Am. Nat. 106: 283-292.
19. Nei, M. (1978). "Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number
of individuals." Genetics 89: 583-590.
20. PAMFIL, D., R. H. ZIMMERMAN, S. K. NAESS and H. J. SWARTZ (2000). "Investigation of
Rubus Breeding Anomalies and Taxonomy Using RAPD Analysis." Small Fruits Review
1(1): 43-56.
21. Persson, H. A. and H. Nybom (1998). "Genetic sex determination and RAPD marker segregation
in the dioecious species sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.)." Hereditas 129(1): 45-
51.
22. Prokkola, S. (2003). "Reliability of russian sea buckthorn cultivars in north Ostrobothnia,
Finland." ISHS Acta Horticulturae 626 XXVI International Horticultural Congress:
Berry Crop Breeding, Production and Utilization for a New Century: 381-387.
23. Qinxiao, W. and H. Zhao (2003). Seabuckthorn for the control of soil erosion in mountainous
lands. Seabuckthorn (Hippophae L.) A multipurpose wonder plant. V. Singh. 1: 401-408.
24. Rai, I. V. and L. Rai (2003). Ctina alb n exploataii agricole.
25. Rousi, A. (1965). "Observation on the cytology and variation of European and Asiatic
populations of Hippopha rhamnoides." Ann. Bot. Fenn. 2: 1-18.
26. Rousseau, H. (2002). Dveloppment des techniques de reproduction vgtative et essais de
cultivars d'argousiers. Projet # 0121/IRDA, Institut de recherche et de dveloppement en
agroenvironnement, Quebec, Canada,.
27. Ruan, C. J., P. Qin, J. W. Zheng and Z. X. He (2004). "Genetic relationships among some
cultivars of sea buckthorn from China, Russia and Mongolia based on RAPD analysis."
Scientia Horticulturae 101(4): 417-426.
28. Sanjai K., D. and B. Singh (2003). Research on seabuckthorn in Ladakh. Seabuckthorn
(Hippophae L.) A multipurpose wonder plant. V. Singh. 1: 499-503.
29. Sheng, H. M., L. Z. An, T. Chen, S. J. Xu, G. X. Liu, X. L. Zheng, L. L. Pu, Y. J. Liu and Y. S.
Lian (2006). "Analysis of the genetic diversity and relationships among and within species of
Hippophae (Elaeagnaceae) based on RAPD markers." Plant Systematics and Evolution
260(1): 25-37.
30. Sun, K., W. Chen, R. Ma, X. Chen, A. Li and S. Ge (2006). "Genetic Variation in Hippophae
rhamnoides ssp. sinensis (Elaeagnaceae) Revealed by RAPD Markers." Biochem Genet
44(5-6): 186-197.
31. Tamura, K., J. Dudley, M. Nei and S. Kumar (2007). "MEGA4: Molecular Evolutionary
Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0." Molecular Biology and Evolution 24:
1596-1599.
32. Thomas, S. C. L. (2008). Plantation and management practices of seabuckthorn. Seabuckthorn
(Hippophae L.) A multipurpose wonder plant. V. Singh. 3: 27-48.
33. Tian, L. C., F. L. Guan and M. Y. Zhang (1993). "The preliminary study of flowering features in
Hippophae rhamnoides L. ssp. sinensis Rousi and artificial hybridization." Hippophae 6: 29
33.
34. opa, E. (1960). "Hippophae rhamnoides n R.P.R." Contr. bot.: 239-245.
35. Weising, K., R. G. Atkinson and R. C. Gardner (1995). "Genomic fingerprinting by
microsatellite-primed PCR: a critical evaluation." PCR Methods Appl 4(5): 249-255.
43
36. Yao, Y. (1993). "Effects of temperature sum on vitamin C concentration and yield of sea
buckthorn (Hippophae rhamnoides) fruit: optimal time of harvest." Agricultural Science in
Finland 2: 497-505.
37. YEH, F. C. and T. J. B. BOYLE (1997). "Population genetic analysis of co-dominant and
dominant markers and quantitative traits." Belgian Journal of Botany 129: 157.

ing. Ionu GOTEA

The study of the genetic variability with
molecular markers at the dioecious
species Hippopha rhamnoides L. ssp.
carpatica Rousi

Summary of the PhD Thesis

Scientific advisor:
Prof. Dr. Doru PAMFIL

Cluj-Napoca
2010

TABLE OF CONTENTS
Table of contents .................................................................................................................................1
Introduction.........................................................................................................................................3
Chapter I. Curent stage of the researches ........................................................................................4
1.1. Economic and cultural importance of the Hippophae rhamnoides species...............................4
1.2. Curent stage of the researches...................................................................................................5
Chapter II. Research framework and objectives.............................................................................9
2.1. Features and aspects of the studied areas..................................................................................9
2.2.1. Danube Delta area.........................................................................................................9
2.2.2. Mure county ..............................................................................................................10
2.2.3. Cluj county..................................................................................................................11
2.2. Conclusions regarding the geographical distribution..............................................................12
2.3. Proposed objectives.................................................................................................................13
Chapter. III. Biological material and working methods ...............................................................14
3.1. Biological material ..................................................................................................................14
3.2. Methods to measure phylogenetical closeness at the studied genotypes ................................15
3.3. Methods to persuade seeds germination .................................................................................18
3.4. Statistical and mathematical methods used for processing the results of the
phenotypical and genotypical variability study..............................................................................20
3.5. Statistical and mathematical methods used for processing the results of the
molecular variability study.............................................................................................................20
3.6. Methodes to persuade the soluble solid content from berries .................................................21
Chapter IV. Results and discussions ...............................................................................................23
4.1. The obtained results regarding the available variability at seabuckthorn, through
applying phylogenetical closeness methods...................................................................................23
4.1.1. The results of the applied taxonomical methods at the genotypes provided
from collection, on the base of plants and seeds traits .........................................................23
the study of the main traits of the seeds .........................................................................................24
4.2.1. The characteristic features of seed obtained from Danube Delta region....................24
4.2.2. The characteristic features of seed obtained from Mure county...............................25
4.2.3. The characteristic features of seed obtained from Cluj county ..................................25
4.2.4. Seed weight variability in populations from the three studied areas ..........................25
the applying molecular markers methods ......................................................................................26
4.3.1. The results of the DNA extraction..............................................................................27
4.3.2. The results of the DNA amplification ........................................................................27
4.3.3. The dendrogram of the studied seabuckthorn populations .........................................28
the study of berries .........................................................................................................................31
The characteristics of berries obtained from Danube Delta region ......................................31
4.4.2. The characteristics of berries obtained from Mure county .......................................32
4.4.3. The characteristics of berries obtained from Cluj region ...........................................32
4.4.4. The variability of fruits weight at the studied populations .........................................32
4.4.5. Phenotypic correlations between seed weight and fruit weight in the
studied populations ...............................................................................................................33
4.5. The results regarding the improvement of the seeds germination and the
possibility to apply treatments to increase the germination percentage.........................................34
4.5.1. The results obtained through the persuade seeds germination energy .......................34
4.5.2. The results obtained through the persuade seeds germination capacity.....................35
the soluble solid content in fruits ...................................................................................................37
Chapter V. Conclusions and recomandations................................................................................38
Selective bibliography.......................................................................................................................41

45
INTRODUCTION

The thesis The study of the genetic variability with molecular markers at the dioecious
species Hippopha rhamnoides L. ssp. carpatica Rousi has as objectiv the study of the phenotipic,
genotipic and molecular variability of the seabuckthorn (Hippopha rhamnoides L. ssp. carpatica
Rousi) in three areas from our country where this shrub is widely naturaly spread: Cluj county,
Mure county and Danube Delta region.
Raporting this study to the researches made in Romania until now we can say that this study
disthinguis by originality because the molecular analysis was made for the first time at this species.
The motivation of this study was my desire to know this plant and to identify valuable
genotyps that could be introduced in comercial plantations for fruits productions.
During my research period I had as objectives, for the first period, to identify based on
morfological criteria valuable genotips regarding the fructifications, for the female plants, and
regerding the number of floral buds, for the male plants.
I was surprised to find out how big is the variability of fruits form and weight, at the female
plants, and the form of floral buds at the male plants.
This is a really good breeder's point of view, in light of the large number of choices for
valuable genotips.
The molecular characterization of individuals taked into the study was conducted using
RAPD markers (Randomly Amplified polymorphic DNA). This phase was conducted in the
Department of Biotechnology of Veterinary Medicine, Cluj-Napoca, with financial support from the
TD CNCSIS grant that I won in the competition of 2006. In the same year I obtained a scholarship
for young PhD BD CNCSIS who has also contributed to the completion of the research undertaken.
The results obtained by RAPD technique have been encouraging us and we have estimated
the degree of genetic relationship between populations studied by construction of dendrograms.
Over the years we have made a hard work in the field to bring consistent selection of
valuable genotypes, especially in terms of their fructification strength in order to be used as genitors
for creation of commercial plantations by classical propagations methods, but also for the selection
of somme genotypes that can be propagated trough in vitro methods.
The resulting selections were the starting point of another doctoral thesis focused on the in
vitro propagation of sea buckthorn. The researches are made in the Plant Biotechnology Department
of our University, and which already has promising results in this field, presented at the international
symposiums.
PROPOSED OBJECTIFS

Because of special interest now given to this species, we proposed to study the phenotypic
and genotypic variability of biological material collected from spontaneous flora of three areas
mentioned above for the selection of valuable genotypes in terms of fructification (for female plants)
and in terms of production of pollen (the male plants) for further introduction in commercial
distribution.
Evaluation of phenotypic and genotypic characters involved quantitative and qualitative
analysis of the genotypes studied, interpretation of experimental data by analysis of variance, the
estimation of correlations between the characteristics studied by calculating the correlation
coefficients.
Assessment at the molecular level was achieved by PCR-RAPD molecular markers,
assuming RAPD primers tests, extraction of DNA from the analyzed material, performing PCR
amplifications with RAPD primers.
46
Analysis of phenotypic and genotypic variability, followed the selection of genotypes
considered valuable, as a fruit production, pollen production respectively. Forms identified for their
valuable features were used as genitors for their propagation in vitro. Unfortunately, the data we
have so far conclude that not all of these genitors selected shows suitability for this type of
propagation.

MATERIAL AND METHODS

The biologic material used in our researched was harvested from spontaneous flora of three
natural areas: Danube Delta, Cluj county and Mure county. This areas do not represent the entire
areal of distribution of this species in Romania.
Populations where diveded into three areas, according to the region of origin. The first
group includes populations from the Danube Delta: P1 (Periprava), P2 (Sf. Gheorghe) and P3
(Letea). The second group comprises populations from Mures county: P4 (Faragau), P5 (Craiesti),
P6 (Socol). The third group includes populations of Cluj County: P7 (adjacent areas of Cluj-
Napoca), P8 (Catina), P9 (Nicula).
The location of these populations and the number of individuals collected from each site are
presented in Table 1.
Table 1
Identification of the studied populations, area of amplasament and the number of individuals

Population number Individuals number Location Altitude
P1 18
Loc. Periprava, Delta
Dunrii
4
P2 19
Loc. Sf. Gheorghe,
Delta Dunrii
3
P3 22
Pdurea Letea, Delta
Dunrii
15
P4 20
Loc. Frgu, Jud.
Mure
400
P5 21
Loc. Crieti, Jud.
Mure
350
P6 19 Loc. Socol, Jud. Mure 450
P7 20
Oraul Cluj-Napoca,
Jud. Cluj
540
P8 19 Loc. Ctina, Jud. Cluj 400
P9 20 Loc. Nicula, Jud. Cluj 300

From each population was harvested approximately 20 individuals, both male and female
plants at an interval of at least 50 m to prevent collection of leaves from the same individual. Fresh
leaves were collected in the field and preserved in separate bags with silica gel.

47
CONCLUSIONS

In the present study for H. rhamnoides ssp. carpatica, the percentage of polimorfic markers
at the populational level is 56,6% and Nei index for genetic diversity varied between 0,14 to 0,22 in
the nine studied population, with an average of 0,175.
It is interesting to observe that the genetic diversity between the population taken into study
from the carpatica subspecies can be compared with the genetic diversity revealed for ssp.
rhamnoides (Bartish et al. 1999) and with sinensis suspecies (Sun et al. 2006) even if the
distribution of these subspecies is smaller than both subpecies.
Barthis (1999) confer the low level of intrapopulational genetic diversity to the fragmentate
and isolate distribution between the continental populations. It seems nevertheless, that this factor
canot explains the similar level of variability at the carpatica subspecies, because this subspecies
has a wider distribution in Romania and is not fragmented. An alternative explanation for this can be
the succesional stage. Seabuckthorn is a pionier species and occupy territories in the succesional
stage at an earlier time.
As has been shown (Hamrick and Godt 1990), the species wich appear earlier in the
succesional stage present a relatively low level of intrapopulational genetic diversity. Besides,
carpatica subspecies present a high degree of suckers multiplication which determine the presence
of an individual in an agglomerate form (Sun et al. 2006).
The datas from the literature and personal observations show that carpatica subspecies can
produce then to hundreds of new plants from suckers. (Sun et al. 2006). Thus, the high level of
clonal reproduction can be the cause for the low level of intrapopulational genetic diversity from the
seabuckthorn species, situation showed also to other plants. (Sun et al. 2006)
It deserves to mention that the genetic diversity among populations of carpatica subspecies
detected by the present study is remarcably similar with morofological stdudies on berries and with
the vegetative traits of the subspecies. As an example, genetic variation detected by RAPD markers
inside the population is well correlated with the one detected by morphological observations. The
population P
2
and P
6
, presents low values, respectevly high values for the genetic diversity,
regarding the form, color and the size of the berries. The same values are obtained from the RAPD
analysis.
At a lot of plant species there is a positive correlation between geographic position and
genetic distances among populations, which can be explained trough the hipothese of isolation by
distance (Comes and Abbot 2000).
In their study on 10 populations of H. rhamnoides ssp. rhamnoides, (Bartish et al. 1999) do
not found any correlation between geographic and genetic distances, on data resulted from two data
sets (r = 0.11, P = 0.763; r = 0.04, P = 0.641).
Similar, our RAPD data has not revealed a significant correlation between genetic and
geographic distances for the 10 analysed populations of carpatica subspecies (r = 0.14, P = 0.851).
This type of differentiation can involve the adaptation of carpatica subspecies to the
environment condition, because the habitat of the carpatica subspecies differ allot with their habitat
(opa 1960).
Another explanation given (Bartish et al. 1999) sugest that, it is possible that the wide
geographical dispersion and the differentiation of ecotypes to be not reflected by RAPD profiles.
The phenotypic variability from all plants traits is vert high, which is good news for the
breeders that can select in the breeding process individuals that present the desired traits.
Regarding the berries wheight variability it was observed that this is very high, presenting a
maximum limit of average berries wheight of 519, 96 mg from Pdurea Letea 4 genotype.
48
Comparing this result whith the genotypes available on the Romanian market we findt out
with pride that our genotype can be classified in the superior class of quality.
Instead, if we compare the same genotype with the varieties existing on the international
market, we discover that this is a medium class genotype, because Russia offer to the market
varieties obtained from selection with berries wheight varies from 0,8 1,1 g.
We can conclude that there is still a long way in the seabuckthorn breeding process in
Romania, which is only into a pionierat phase, existing Romanian varieties being only selections
from spontaneous flora with a rich observation list.

Despre Catina

Încărcat de

Informații document

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Despre Catina

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

ing.

S-ar putea să vă placă și