Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Capitolul3 PDF
Capitolul3 PDF
Aplicaii i controverse
C. P. Cornea
Intr-o lume n care creterea populaiei este accelerat (se preconizeaz c pn n anul
2050 populaia globului va numra aproximativ 10 miliarde de locuitori), iar producia
agricol crete ntr-un ritm mai lent este necesar gsirea unor soluii moderne prin care
agricultura s asigure cantiti suficiente de hran, cu o calitate corespunztoare. Agricultura
tradiional se confrunt n prezent cu o serie de limitri extrem de serioase:
- limitri ce in de pia: n condiiile globalizrii, regulile unei piee libere ngrdesc
politicile locale de preuri, acestea fiind dictate de tendinele i politicile internaionale
- resursele naturale devin, din ce n ce mai mult, factori limitativi ai dezvoltrii agriculturii
tradiionale datorit modificrilor climatice, a industrializrii i urbanizrii care determin
deteriorri ale solului, apei i a calitii aerului.
- resursele biologice (genetice) sunt, n mod inevitabil, limitate. Astfel, dei considerat la
nceput foarte eficient, obinerea i eliberarea n mediu a plantelor ameliorate prin
metode tradiionale a devenit extrem de nceat, nu fac fa cerinelor, iar numrul de
nsuiri naturale care pot fi mbuntite prin aceste metode este foarte mic.
Specialitii consider c pentru depirea acestor probleme, pe lng mbuntirea
continu a practicii agricole, exist dou soluii: gsirea unor surse alternative de hran (de
exemplu, valorificarea resurselor marine) sau ameliorarea plantelor prin metode
biotehnologice (Altman, 1999).
Cu toate c pentru unii oameni biotehnologia reprezint un domeniu oarecum
controversat, prin integrarea metodelor biotehnologice cu metodele clasice de ameliorare (att
la plante ct i la animale) se pot obine rezultate care s mulumeasc pe toat lumea,
declanndu-se o adevrat revoluie verde n agricultur.
Prima generaie de cercetri n domeniul biotehnologiei vegetale a fost axat pe
transferul de gene n plante de interes economic care s permit obinerea unor beneficii mai
mari n urma cultivrii lor. De exemplu, au fost obinute plante rezistente la atacul unor
insecte sau la aciunea unor erbicide ceea ce a condus la reducerea pierderilor datorate
buruienilor sau duntorilor precum i a cantitilor de compui chimici aplicai culturilor de
plante.
Utilizarea plantelor transgenice, limitat iniial doar la loturi experimentale, s-a extins
n ultimii ani la suprafee semnificative mai ales n SUA, Canada, Argentina, China i mai
puin n Europa.
Dei cercetrile privind introducerea de noi gene de interes la plante va continua, este
de ateptat ca noua generaie de cercetri n domeniul biotehnologiilor vegetale s aib
drept principal scop obinerea de plante transgenice sigure pentru utilizarea lor n
alimentaia omului, cu rezisten la atacul fungilor astfel nct s nu se acumuleze compui
toxici pentru om (compui de tipul aflatoxinelor), cu valoare nutritiv superioar (cum ar fi
83
C. P. Cornea
mbogirea lor n vitamine, n uleiuri sau proteine care nu s nu determine reacii alergice la
persoanele sensibile) sau capabile s produc substane de interes medical (de exemplu
vaccinuri comestibile). De asemenea, cercetrile privind obinerea i utilizarea plantelor
transgenice trebuie s fie corelate cu studii care s lmureasc opinia public asupra
beneficiilor i eventual a riscurilor pe care aceste plante i mai ales produsele alimentare
derivate de la ele le presupun.
1.1. Clonarea genelor n celulele vegetale prin utilizarea bacteriilor din genul
Agrobacterium
Pentru evidenierea particularitilor procesului de clonare n celulele vegetale vor fi
prezentate n continuare unele aspecte legate de sistemul natural de transfer de gene prin
intermediul bacteriilor din genul Agrobacterium precum i elementele specifice ale vectorilor
de clonare i a markerilor de selecie pentru celulele vegetale.
genelor reglatoare virA i virG. Produii acestor gene sunt asemntori cu alte proteine
membranare bacteriene cu rol n reglare (Env Z, Omp R etc).
Alturi de genele vir plasmidiale au mai fost identificate unele gene, localizate la
nivelul cromosomului bacterian, implicate, se pare, ntr-o mai mic msur n procesul de
transformare genetic. Dintre aceste gene menionm: genele chvA i chvB implicate n
sinteza i secreia 1,2 glucanului; gena chvE necesar pentru inducerea regiunii vir i pentru
chemotactismul bacterian; locusul cel responsabil de sinteza fibrilelor de celuloz implicate n
ataarea bacteriilor la celulele vegetale; gena pscA (exoC) implicat n sinteza glucanului ciclic
i a acidului succinoglicanic; locusul att implicat n sinteza unor proteine celulare de suprafa
(Matthysse, 1987; Cangelosi i colab.,1991)
Funciile de recunoatere i ataare a bacteriilor la peretele celulei vegetale nu sunt
codificate de gene plasmidiale ci de gene cromosomale. Aceste gene determin, ntre altele,
structura exopolizaharidelor de la suprafaa bacteriilor, implicate n procesele de recunoatere.
Regiunea ADN-T reprezint o poriune din plasmida Ti (sau Ri) care este transferat
n celula vegetal, integrndu-se stabil n genomul celular. Aceast regiune ADN-T (de la
ADN transferat) are aproximativ 20-25 kb lungime (n funcie de tulpina bacterian gazd) i
conine toate genele (oncogenele) care transferate n celula vegetal vor determina fenotipul
caracteristic al celulelor transformate. Genele localizate pe ADN-T determin dou proprieti
caracteristice pentru celulele vegetale tumorale: creterea pe medii de cultur n absena
fitohormonilor; sinteza i secreia de opine, substane specifice pentru aceste tipuri de celule.
Nester i colab. (1984) au reuit identificarea i cartarea a opt gene aflate la nivelul
ADN-T: aux1, aux2, iaaM, iaaH, toate fiind implicate n codificarea sintezei de auxine, ipt ce
codific sinteza de citochinine, ops ce determin sinteza opinelor de ctre celulele
transformate (de exemplu, gene ocs sau nos, n funcie de tipul de plasmid Ti) i o a opta
gen ce interacioneaz cu celelalte, mrind se pare, sensibilitatea celulelor transformate la
auxin.
De remarcat c, ADN-T coninut de toate plasmidele Ti naturale este flancat de scurte
secvene de nucleotide, de aproximativ 25 pb, repetate direct, eseniale pentru procesul de
transfer n celulele vegetale. Analiza acestor secvene terminale a artat c acestea sunt
conservate la diferitele tulpini de Agrobacterium, ele fiind recunoscute de echipamentul
enzimatic implicat n transferul ADN-T din celula bacterian n celula vegetal.
n cazul plasmidelor Ri, analiza regiunii ADN-T a dovedit c aceasta conine o serie
de gene, responsabile de fenotipul de tip "hairy" al esuturilor vegetale transformate. De
remarcat c, genele ce se transfer n celulele vegetale sunt grupate la marginile regiunii
ADN-T. Astfel, n partea stng a ADN-T sunt localizate genele rolA, B, C i D care
sensibilizeaz celulele vegetale la aciunea auxinelor. S-a dovedit c, la anumite specii
vegetale, simpla prezen a genelor rol, chiar n absena celorlalte gene din ADN-T, determin
apariia fenotipului caracteristic ("hairy root"). n partea dreapt a ADN-T din plasmidele Ri
se afl dou gene ce codific sinteza de auxine (acid indolilacetic) n celulele transformate; de
asemenea, alturi de aceste gene se afl cele responsabile de sinteza unor opine (manopina i
agropina)(Tepfer i Casse-Delbart, 1987). Plantele regenerate din esut vegetal transformat cu
acest bacterie prezint un aspect modificat, comparativ cu plantele regenerate dinesut
normal (figura 2).
86
Modificarea genetic a plantelor: principii generale de realizare; Aplicaii; Controverse
1 2 3
Figura 2. Aspectul plantelor de tutun regenerate din esut vegetal transformat
cu A. rhizogenes (poziiile 2 i 3) comparativ cu plantele normale (poziia 1).
Figura 3. Etapele transferului natural ADN-T din celulele bacteriene n celulele vegetale rnite (adaptare dup
Weising i Kahl, 1996).
87
C. P. Cornea
Figura 4. Reprezentarea schematic a etapelor formrii complexului ADN-T-proteine (dup Weising i Kahl,
1996).
88
Modificarea genetic a plantelor: principii generale de realizare; Aplicaii; Controverse
89
C. P. Cornea
Figura 5. Model ipotetic al integrrii ADN-T n genomul vegetal (dup Tinland, 1995)
90
Modificarea genetic a plantelor: principii generale de realizare; Aplicaii; Controverse
T dezarmate a plasmidei pBR322 permite, ulterior, co-integrarea la acest nivel a celor mai
multe plasmide folosite n tehnicile de clonare n E.coli, printr-o singur treapt de
recombinare (Figura 6).
Figura 6. Obinerea unei plasmide co-integrate, n care gena clonat iniial n pBR322
este introdus n pGV3850 (dup Schell i colab., 1985).
92
Modificarea genetic a plantelor: principii generale de realizare; Aplicaii; Controverse
Toate aceste gene sunt situate ntre extremitile unui ADN-T, sub controlul unor
secvene promotor i terminator adecvate (Figura 8). De asemenea, aceasta plasmid mai
conine un marker de selecie bacterian, funcii de replicare i, eventual, mobilizare prin
conjugare.
tomatelor (TGMV) etc. Mai mult, dintre virusurile vegetale, asemntoare ca organizare
retrovirusurilor animale, cel mai cunoscut este CaMV. Cu toate acestea, dei funciile genelor
CaMV sunt asemntoare celor ale retrovirusurilor, spre deosebire de acestea, ele nu se
integreaz n genomul celulei vegetale.
Un alt exemplu este cel al virusului mozaicului tutunului (VMT), virus cu genom
ARN, a crui lungime este 6,5kb, ce codific patru polipeptide: cele dou subuniti ale
replicazei, o protein de nveli i o protein important n procesul de infecie al celulelor
vegetale nvecinate. Genomul viral a fost prelucrat "in vitro", nlocuindu-se genele pentru
proteinele capsidale cu gene marker a cror exprimare s-a urmrit la plantele inoculate.
Dezavantajul const n faptul c se pot transfera doar fragmente de ADN cu dimensiuni mici.
n orice caz, chiar i n absena unor vectori derivai de la virusuri, o serie de elemente
virale sunt deja utilizate pentru construirea vectorilor de exprimare pentru celula vegetal.
Este cazul promotorilor genelor pentru ARN 19S i 35S de la CaMV care sunt foarte eficieni,
mai ales pentru cereale.
Pentru a se putea evalua rapid transferul i, mai ales, integrarea genelor clonate n
celulele vegetale, este absolut necesar ca, odat cu gena de interes, n celulele vegetale s se
integreze i anumite gene marker specifice. In prezent, genele utilizate drept markeri pentru
celulele vegetale transformate sunt de dou tipuri: markeri de selecie care asigur doar
diferenierea ntre celulele vegetale normale i cele modificate genetic i markeri
cuantificabili care permit i determinarea nivelului exprimrii genelor clonate.
Dintre cele mai utilizate gene marker de selecie pentru celulele vegetale transformate
menionm: gena pentru neomicin fosfotransferaz (gena nptII ce determin rezisten la
kanamicin, gena pentru cloramfenicol-acetiltransferaz (gena cat ce confer rezisten la
cloramfenicol); gena pentru sinteza nopalinei (gena nos) sau octopinei (gena ocs); gena pentru
luciferaz (gena lux ce determin sinteza luciferazei care, n prezena substratului specific,
luciferina, produce lumin; plantele transgenice ce conin o asemenea gen au primit
denumirea de plante "lampion"); gena pentru -glucuronidaza bacterian (gena gus); gena
pentru proteina cu fluorescen verde (gena gfp = "green fluorescence protein")(Jefferson,
94
Modificarea genetic a plantelor: principii generale de realizare; Aplicaii; Controverse
1988, Niedz i colab., 1995), n timp ce drept markeri cuantificabili pot fi utilizai: activitatea
NPT II, producerea de opine; activitaea -glucuronidazic; activitatea cloramfenicol-acetil-
transferazei; activitatea luciferazic; nivelul proteinei GFP (McClean, 1998).
Selecia celulelor vegetale transformate se poate realiza, fie prin cultivarea acestora pe
medii de cultur specifice ce conin antibioticele corespunztoare (kanamicin, cloramfenicol,
higromicin), prin teste histochimice aplicate celulelor vegetale (pentru evidenierea, de
exemplu, a produsului genei gus sau a genei lux) (Figura 8) sau prin teste fluorimetrice
(pentru produsul genelor gus sau gfp). De remarcat c, vectorii de clonare cel mai recent
construii conin cel puin dou gene marker.
Figura 8. Lstar de vi de vie transformat cu un vector de clonare specific ce conine gena pentru -
glucuronidaz i evidenierea activitii enzimatice cu ajutorul unui test histochimic (dup Martinelli i
Mandolino, 1994).
95
C. P. Cornea
Figura 10. Comparaie ntre aspectul unor plante transgenice de tutun rezistente la aciunea erbicidelor i cel al
unor plante normale (dup Tarano, 1993)
96
Modificarea genetic a plantelor: principii generale de realizare; Aplicaii; Controverse
Figura 11. Reprezentarea schematic a plasmidelor recombinate ce conin gena cry A(b) de la Bacillus
thuringiensis, folosite pentru obinerea de plante transgenice rezistente la atacul unor duntori (dup Carozzi i
colab., 1992).
98
Modificarea genetic a plantelor: principii generale de realizare; Aplicaii; Controverse
Mrimea plasmidelor recombinate obinute variaz ntre 5000 i 10.000 pb, n funcie
de dimensiunea genei bacteriene i a secvenei promotor integrate n vector (Koziel i colab.,
1993).
Tulpinile bacteriene recombinate au fost apoi utilizate pentru infectarea plantelor test
(cartof, tutun, bumbac). Selecia s-a realizat mai nti n funcie de markerii de selecie purtai
de vectori (rezistena la antibiotice, testul GUS, rezistena la erbicid etc), iar n final, plantele
regenerate au fost supuse atacului insectelor. Plantele transgenice regenerate au manifestat
rezisten la atacul insectelor duntoare, caracterul meninndu-se i exprimndu-se i n
cazul experimentelor n cmp.
Prima plant transgenic obinut care manisfest rezisten la atacul insectelor
aparine speciei Nicotiana tabacum (Vaeck i colab., 1987), ea exprimnd gena cry 1A,
ntreag sau trunchiat, clonat sub controlul unui promotor constitutiv astfel nct proteina
inhibitoare reprezint 0,02% din totalul de proteine vegetale (din frunze).Civa ani mai trziu
(1992) au fost obinute plante de bumbac n care a fost introdus gena cry 1A(c) modificat,
clonat sub controlul promotorul CaMV 35S sau sub controlul unui promotor i a unei
secvene pentru o peptid de tranzit prin cloroplaste izolate de la Arabidopsis, astfel c nivelul
exprimrii genei de interes a condus la obinerea unui nivel ridicat al toxinei: 0,1% din
proteina total, respectiv 1%. O alt variant de clonare a genei pentru toxina bacterian a fost
aceea a utilizrii unor elemente genetice care asigur exprimarea genei de interes exclusiv n
poriunile verzi ale plantei (promotorul deriv de la gena pentru PEPC)(Hudspeth i Grula,
1989) sau n polen (prin folosirea unui promotor derivat de la gena pentru o protein kinaz
dependent de calciu = CDPK)(Estruch i colab., 1994).
Fujimoto i colab. (1993) au utilizat o metodologie asemntoare pentru a transforma
plante de orez, iar Perlak i colb.(1993), prin clonarea unei gene cry III sintetic au obinut
plante transgenice de tutun i cartof rezistente la atacul gndacului de Colorado.
Mai recent, Arencibia i colab.(1997) au utilizat pentru clonare o gen modificat cry
1A(b) sub controlul promotorului CaMV i au obinut plante transgenice de trestie de zahr cu
rezisten la larvele de Diatraea saccharalis.
Dat fiind semnificaia practic a rezistenei plantelor la insectele duntoare
cercetrile au fost extinse i la alte specii de plante, obinndu-se plante de vinete rezistente la
atacul unor coleoptere (Arpaia i colab., 1997), brocoli cu rezisten la anumite specii de
lepidoptere (Selvapandian i colab., 1998), porumb cu rezisten la Busseola fusca (Rensburg
i colab., 1999) etc precum i o serie de progrese la plante leguminoase (Ortiz i colab.,
2000).
Studiile de toxicitate efectuate asupra plantelor transgenice ce exprim gena pentru
endotoxin au dovedit c existena transgenei nu modific particularitile normale ale
respectivelor plante, cu excepia rezistenei la atacul insectelor.
Pe lng endotoxina produs de tulpini de B.thuringiensis, au mai fost identificate i
alte specii de bacterii care produc proteine cu efect insecticid. Acesta este cazul unor tulpini
de Bacillus cereus care produc dou proteine, VIP 1 i VIP2 cu efect asupra unor insecte,
modul lor de aciune fiind asemntor cu al endotoxinei (Estruch i colb., 1997).
2.1.2. Gene pentru sinteza unor enzime sau a unor inhibitori enzimatici cu efect
insecticid
Exprimarea de ctre plantele transgenice a unor enzime cum ar fi chitinaza, colesterol
oxidaza, lipoxigenaza, fenol-oxidaza, peroxidaza sau izopentenil transferaza (ipt) ar putea
constitui o alternativ la utilizarea genei pentru endotoxin (Sharma i colab., 2000).
Dintre enzimele care pot asigura protecie plantelor transgenice fa de atacul
insectelor, un loc aparte este ocupat de chitinaze, enzime care acioneaz asupra chitinei,
component de baz al nveliurilor insectelor. Astfel, plantele transgenice de tutun care
99
C. P. Cornea
exprim gene pentru chitinaz izolate de la insecte (Ding i colab., 1998) sau de la fasole
(Gatehouse i colab., 1993) manifest o rezisten crescut la lepidoptere. Mai mult, s-a
observat faptul c prin clonarea genei pentru chitinaz izolat de la bacteria Serratia
marcescens s-a evideniat un efect sinergic al endochitinazei produse de plantele transgenice
ce conin suplimentar gena pentru -endotoxin fa de larvele de Spodoptera litoralis (Rigev
i colab., 1996).
O alt enzim de origine bacterian care manifest aciune insecticid este colesterol
oxidaza. Spre exemplu, introducerea i exprimarea genei cho A pentru colesterol oxidaz de
la Streptomyces sp. n plante de tutun a condus la o rezisten crescut a plantelor transgenice
obinute fa de larve de Anthonomus grandis (Cho i colab.,1995).
Utilizarea pentru clonare a genei pentru enzima izopentenil transferaza (ipt) bacterian
(implicat n biosinteza citochinelor) prin fuziune cu promotorul genei pentru inhibitorul
proteazic II (PI-IIK) a determinat obinerea unor plante transgenice de Nicotiana
plumbaginifolia rezistente la aciunea larvelor unor lepidoptere specifice (Manduca sexta sau
M.persicae)(Smigocki i colab., 1993).
O alt realizare important a fost aceea a introducerii n celulele vegetale a genei cpt2
ce codific o protein inhibitoare pentru tripsina, izolat de la Vicia faba. Aceast protein are
efect antimetabolic, protejnd n felul acesta plantele transgenice de atacul unor duntori. n
mod similar au fost clonate n diferite gazde i alte gene ce codific inhibitori proteazici
(Kunitz trypsin inhibitor, Bowman Birk proteinase inhibitor) sau lectine, proteinele codificate
putnd constitui adevrate "arme de aprare" pentru plantele transgenice ce le conin (Foard i
colab., 1983). Astfel, este cunoscut faptul c numeroase insecte, cum ar fi lepidopterele,
depind de serin-proteaze (tripsin, chemotripsin sau elastaz), acestea fiind primele enzime
ce realizeaz procesul de digestie.
O serie de gene ce codific diferii inhibitori pentru serin-proteaze au fost izolate
din diferite surse (plante, microorganisme) i clonate n diferite specii vegetale, cum ar fi
Medicago sativa, tutun, porumb etc; plantele transgenice obinute au manifestat o rezisten
crescut fa de diferite insecte duntoare comparativ cu plantele normale, nemodificate
genetic (Edmonds i colab., 1996; Yeh i colab., 1997). De asemenea, n anumite cazuri s-a
remarcat faptul c introducerea n plante a unor gene suplimentare pentru inhibitori proteazici
care s se alture celor endogene determin un nivel crescut al rezistenei la patogeni a
plantelor transformate. Cu toate acestea, utilizarea inhibitorilor proteazici pentru controlul
insectelor duntoare necesit studii amnunite asupra interaciunilor dintre plante i insecte
deoarece s-a observat c, n cazul anumitor inhibitori, cum sunt cei pentru serin-proteaze,
efectul insecticid se manifest i asupra unor insecte utile (asupra albinelor, de
exemplu)(Malone i colab., 1995).
Metabolismul glucidelor de la insecte reprezint o alt int pentru agenii inhibitori
testai n numeroase studii. Astfel, au fost izolate i caracterizate genele pentru diferii
inhibitori pentru -amilaz (de la gru i fasole); dup clonarea n plante de tutun a genei
izolate de la gru n tutun s-a observat o cretere a mortalitii larvelor de lepidoptere de pn
la 40%. In cazul clonrii n plante de mazre a genei pentru inhibitorul -amilazei de la fasole
sub controlul promotorului genei pha 1 s-a obinut o exprimare crescut a genei strine la
nivelul seminelor, ceea ce a condus la o rezisten mai mare fa de Collasobruchus sp.
(Schroeder i colab., 1995).
Lectinele vegetale reprezint un grup special de glicoproteine care au funcii
protectoare fa de o serie de organisme duntoare. Studiile asupra acestor glicoproteine au
dovedit c acestea produc efecte puternice asupra dezvoltrii unor tipuri variate de insecte.
Primul exemplu de plante transgenice ce conin gene pentru lectine nespecifice i care
manifest toxicitate pentru duntori este reprezentat de plante tutun la nivelul crora au fost
clonate genele pentru lectina de la mazre (Boulter i colab., 1990). Cu toate acestea, multe
100
Modificarea genetic a plantelor: principii generale de realizare; Aplicaii; Controverse
dintre lectinele vegetale au efect toxic i asupra mamiferelor, ceea ce limiteaz utilizarea lor
ca ageni de mrire a rezistenei plantelor la duntori. O atenie special a fost acordat, de
muli specialiti, lectinei cu specificitate pentru manoz de la ghiocel i concanavalinei A:
genele pentru aceste lectine au fost clonate n diferite specii de plante (tutun, tomate, cartof,
trestie de zahr, orez, gru) iar proteinele heterologe sintetizate de acestea au determinat o
sensibilitate redus fa de atacul unor insecte duntoare (larve de lepidoptere, afide,
coleoptere)(Nutt i colab., 1999; Stoger i colab., 1999). Rezultatele obinute sugereaz c
utilizarea plantelor transgenice ce conin gene insecticide (cum ar fi cea pentru lectina din
ghiocel) mpreun cu un management integrat reprezint posibiliti promitoare pentru
controlul duntorilor de la multe specii vegetale, inclusiv la gru sau orez (Rao i colab.,
1998).
Ca o concluzie se poate spune c, n ciuda rezultatelor remarcabile obinute pn
acum, genele utilizate pentru transformarea plantelor de cultur sunt fie prea specifice fie sunt
doar parial efective asupra intelor reprezentate de insectele duntoare. De aceea, pentru a
folosi plantele transgenice ca adevrate arme pentru controlul duntorilor ar fi necesar ca
la nivelul lor s existe transgene care s determine sinteza unor compui cu aciuni diferite
asupra aceleiai inte. Cercetrile efectuate sunt de dat relativ recent i vizeaz, n principal
combinarea n aceeai gazd a genelor pentru o -endotoxin de la B.thuringiensis cu o alt
gen cu efect inhibitor: de exemplu, gena pentru inhibitorul tripsinei de la Vicia faba (CpTI)
sau pentru serin-proteaze (Cornu i colab., 1996, Zhao i colab., 1998); gena pentru proteina
din nveliul virusului Y de la cartof (Li i colab., 1999). O alt abordare interesant este
aceea prezentat de Herrera i colab.(1997) care au introdus gena cry1A(c) ntr-o tulpin de
Pseudomonas fluorescens capabil s colonizeze trestia de zahr prin intermediul a dou
plasmide, pDER405 i pKT240 la nivelul crora gena se gsete n 13, respectiv 28 de copii.
Testarea tulpinilor bacteriene recombinate asupra unor insecte duntoare specifice trestiei de
zahr a evideniat o rezisten mai mare a plantelor tratate cu bacteriile respective dect cele
netratate.
De asemenea, dei s-au obinute plante transgenice cu rezisten la insecte duntoare
n cazul mai multor specii de plante cultivate, mai puine rezultate au fost raportate n cazul
cerealelor, a legumelor i a plantelor oleaginoase. Mai mult, n cazul acestor plante sunt
necesare studii suplimentare referitoare la sigurana lor, la posibila toxicitate pentru om i
animale, a implicaiilor ecologice ale utilizrii lor i, nu n ultimul rnd la preul de cost care
trebuie s fie accesibil fermierilor i rilor srace(Riva i colab., 2000).
(Schneider i colab., 1997; Gold i colab., 1999). Aplicarea markerilor moleculari a permis
izolarea a aproape 20 de gene de rezisten (gene R) de la specii de plante bine caracterizate
din punct de vedere genetic, dovedindu-se c multe dintre ele sunt grupate la nivelul unor
regiuni cromosomale specifice (formeaz clusteri). Dintre aceste gene de rezisten, unele
au fost transferate altor specii de plante dect cele de origine, prin tehnici de clonare
molecular, cu ajutorul unor vectori specifici care asigur transferul unor fragmente de
dimensiuni mari (Hamilton, 1997), evideniindu-se faptul c n acest fel c genele R
acioneaz sinergic i asigur o rezisten durabil la unele boli.
Aa cum s-a menionat deja, puine gene R s-au dovedit a asigura un control durabil al
bolilor la plante. Aa este cazul genelor Bs2 de la ardei i Xa21 de la orez care asigur
rezistena la diferite tulpini fitopatogene de Xanthomonas campestris sau X.oryzae n cazul
unor specii n care genele respective au fost clonate (de exemplu, la tomate)(Wang i colab.,
1996). Rezistena n cazul acestor gene se datoreaz faptului c ele asigur recunoaterea unor
proteine pe care le produc bacteriile sau fungii fitopatogeni, rezultatul fiind declanarea unui
fenomen de hipersensibilitate al plantei i necroza esuturilor afectate (Lauge i colab., 1998).
Un alt exemplu de gen R cu aciune durabil este gena recesiv mlo de la orz care asigur
rezistena plantelor ce o conin la toate tulpinile de Erysiphe graminis, prin acumularea n
celulele vegetale a unui compus antifungic de tip fenolic denumit p-cumaroil-
hidroxiagmatina. Se preconizeaz ca aceast gen s fie utilizat pentru supresia prin tehnica
antisens a genei dominante Mlo de la gru sau de la alte specii de plante sensibile la Erysiphe
sp.(Rommens i Kishore, 2000).
Prelucrarea in vitro a numitor gene R i apoi introducerea lor n noi gazde confer
posibiliti noi de rezisten. Acestea este cazul genei avrPto de la tomate care, dup clonarea
sa sub controlul unui promotor puternic cum este cel de 35S la CaMV determin rezistena
plantelor de tomate transformate att la tulpinile de Pseudomonas syringae pv.tomato ct i la
patogeni nenrudii, cum ar fi Xanthomonas campestris i Cladosporium fulvum (Tang i
colab., 1999).
Eforturile cercettorilor de a obine sisteme de rezisten aplicabile la un numr ct
mai mare de specii vegetale nu se limiteaz doar la genele R ci includ i mecanismele
sistemice de aprare pe care le declaneaz infecia cu un anumit patogen (systemic acquired
resistance = SAR). Au fost izolate i caracterizate mai multe gene implicate n SAR, dintre
care, gena Npr1 care codific un reglator transcripional constituie o gen cheie n acest
sistem. Supraexprimarea acestei gene mrete rezistena plantelor de Arabidopsis thaliana sau
de orez la o mare varietate de patogeni (Cao i Dong, 1998). Un comportament interesant a
fost observat n cazul genei Myb1 care este indus prin infecia cu VMT a plantelor de tutun
rezistente i care determin sinteza unui factor de transcriere care se leag la nivelul
promotorului unei gene implicate n patogenez (gena PR1a). Modificarea nivelului de
exprimare a genei Myb1 n plantele transgenice de tutun conduce la o rezisten crescut fa
de infecia viral (cu VMT) ca i fa de fungul patogen Rhizoctonia solani(Klessig i Yang,
1999). Alturi de aceasta, o alt gen recent clonat, Pad4, izolat de la Arabidopsis thaliana,
se dovedete extrem de interesant pentru dezvoltarea rezistenei cu spectru larg.:
supraexprimarea genei respective n plante transgenice sporete i rezistena fa de
fitopatogeni (Jirage i colab., 1999).
In ultimii ani, numeroase companii biotehnologice i universiti au nceput s
evalueze performanele plantelor transgenice ce exprim proteine antifungice att prin
experimente in vitro ct i n cmp. Au fost examinate att plante ce conin gene R sau gene
implicate n SAR, ct i gene de tipul celor ce codific glucooxidaza (AGO) de la Aspergillus
sp, a defensinelor, a enzimelor generatoare de H2O2, a glucanazelor sau chitinazelor
(Broekaert i colab., 1999). Spre exemplu, dei la nivel de laborator plantele transgenice de
cartof ce conineau gena fungic pentru glucozoxidaz au manifestat o rezisten crescut fa
102
Modificarea genetic a plantelor: principii generale de realizare; Aplicaii; Controverse
de fitopatogeni, atunci cnd au fost trecute n cmp rezultatele au fost neconcludente. In cazul
altor gene, cum ar fi cele pentru chitinaz i pentru -1,3-glucanaza intracelular,
supraexprimarea acestora n plante transgenice de tomate a determinat o rezisten
semnificativ fa de Fusarium oxysporum (Cornelissen i colab., 1997)
transgenice ca vaccinuri orale sau nazale: prin administrarea la oareci a probelor respective i
examinarea ulterioar a unor fluide recoltate de la animalele tratate (de la nivelul bronhiilor
sau a intestinului) au fost detectate imunogloguline de tipul IgA i IgG specifice pentru
antigenul folosit n toate fluidele testate. In paralel se realizeaz teste pe voluntari umani,
pentru anumite tipuri de vaccinuri produse de plante: vaccin antidiareic ce conine o protein
sintetic derivar de la subunitatea B a toxinei termolabile de E.coli, produs de plante de
cartof transgenic; vaccin oral obinut din cartof care conine antigenul de suprafa al virusului
hepatitei B (HbsAg); vaccin antidiareic (pentru formele de boal de origine viral) ((Walmsey
i Arntzen, 2000).
O a doua strategie interesant este clonarea n plante a genelor ce codific sinteza unor
anticorpi specifici, pentru obinerea de anticorpi monoclonali vegetali. Producerea primului
tip de anticorp recombinat sintetizat de plante a fost descris de Hiatt i colab.(1989).
Experimentele realizate la tutun au presupus dou etape, urmrind clonarea separat, n plante
diferite, a genelor ce codific lanul greu (catena H), respectiv uor (catena L), ce alctuiesc
anticorpii (de exemplu, IgG1). Plantele transgenice au fost obinute prin utilizarea sistemului
de transformare mediat de Agrobacterium tumefaciens. Cele dou tipuri de plante transgenice
regenerate, una exprimnd catena H iar cealalt caten L, au fost ncruciate ntre ele i s-a
examinat producerea de anticorpi funcionali (asamblai) de ctre plantele aprute n
descenden (Figura 12).
Figura12. Prezentarea schematic a procedeului de obinere de anticorpi prin clonarea genelor codificatoare n
celulele vegetale (adaptare dup Watson i colab. 1992).
ale unui anticorp conin o secven semnal derivat de la genele pentru anticorpi de oarece.
Acest fapt sugereaz c echipamentul enzimatic al celulelor vegetale recunoate secvene
leader heterologe, permind exprimarea genelor clonate sub controlul lor. Dei promitoare,
aceste experimente sunt abia la nceput, fiind necesare studii suplimentare n vederea
optimizrii producerii unor asemenea compui de ctre celulele vegetale, la nivel de
bioreactor sau direct n cmp, la un pre de cost convenabil (Whitelam i colab., 1994).
2.4. Plante transgenice folosite pentru cercetri asupra unor procese fiziologice
fundamentale
Concluzia acestor observaii este aceea c produii genelor menionate prezint inte tisulare
diferite sau c influeneaz etape diferite ale procesului de dezvoltare fr a necesita
promotori specifici (Coles i colab., 1999).
Reducerea nivelului giberelinelor la diferite plante de interes se poate realiza i pe alte
ci, utilizndu-se tot plante transgenice. Astfel, clonarea n planta test A.thaliana a genei
pentru o GA 20-oxiadaz de la fasole i asigurarea condiiilor de supraexprimare determin
producerea de plante pitice. Fenomene similare au fost evideniate i n cazul plantelor
transgenice de Solamun dulcamara ce exprim gena pentru aceeai enzim izolat de la
pepene (Hedden i colab., 1999).
O alt substan produs de plante care, prin controlul biosintezei sale, determin
aplicaii practice deosebite este etilena. Astfel, plante transgenice de tomate, pepene, brocoli
sau de Torenia fournieri (plant ornamental) n care a fost introdus o gen antisens care
blocheaz funcionarea genei pentru ACCS (1-aminociclopropan-1-carboxilat sintetaza) sau
ACCO (1-aminociclopropan-1-carboxilat oxidaza) prezint modificri legate de procesul de
nflorire i de coacere (Hedden i Phillips, 2000).
Studii genetice recente asupra unor plante transgenice au permis realizarea unor
progrese semnificative legate de rolul brasinosteroizilor i de identificarea genelor ce i
codific (Chory, 1999). Astfel, clonarea genei BAS1 de la Arabidopsis i asigurarea
condiiilor de supraexprimare a acesteia n plante de tutun determin reducerea nivelului de
brasinosteroizi i producerea de plante pitice (Nef i colab, 1999).
De asemenea. cercetrile complexe efectuate asupra biosintezei diferiilor hormoni
produi de plante i a interaciunilor dintre acetia pentru controlul proceselor fiziologice
normale au condus la o serie de observaii interesante: modificarea nivelului de exprimare a
unui hormon afecteaz i nivelul altora, astfel c influenele fiziologice sunt greu de estimat.
De exemplu, IAA i CK i inhib reciproc sinteza, iar IAA stimuleaz sinteza de etilen. La
plantele transgenice de tutun s-a evideniat c auxina induce prelucrarea post-transcripional
a enzimei o-xilosiltransferaza care determin blocarea citokininelor.
In concluzie, prelucrarea genelor ce codific enzimele implicate n biosinteza
fitohormonilor demonstreaz posibilitatea obinerii de plante transgenice care s prezinte
niveluri mai ridicate sau mai sczute ale acestor hormoni, n funcie de scopul urmrit cu
aceste plante. Plantele rezultate, ce prezint modificri ale procesului de dezvoltare sau ale
rspunsurilor fa de condiiile de mediu, pot avea aplicaii comerciale astfel c pentru o
reglare mai eficient a proceselor respective genele de interes sunt clonate sub controlul unor
promotori inductibili sau esut-specifici. Cu toate acestea, deoarece interaciunile dintre
fitohormoni determin efecte pleiotropice neateptate n plantele transgenice, sunt necesare
studii suplimentare pentru nelegerea i controlul acestor procese.
De asemenea, reglarea exprimrii transgenelor reprezint un element de baz att
pentru cercetrile fundamentale de biologie molecular vegetal ct i pentru aplicaiile
biotehnologice. Modalitile de reglare sunt variate, un loc aparte fiind deinut de sistemele
inductoare reprezentate de diferite substane chimice care acioneaz asupra genei de interes
(int), activnd-o sau inactivnd exprimarea sa. Utilitatea promotorilor inductibili a fost deja
demonstrat prin elaborarea unui sistem de transformare genetic fr a folosi gene marker de
selecie i prin utilizarea unui numr variat de transgene. In plus, aplicaiile practice par a fi
promitoare prin utilizarea ca inductori a unor compui agrochimici nregistrai. Aceasta ar
permite activarea n cmp a funcionrii anumitor gene de interes prin folosirea unei substane
specifice ceea ce ar elimina pierderile firmelor productoare de semine transgenice datorate
fermierilor care pstreaz o parte din recolt pentru nsmnrile din anul urmtor (Gatz,
1998).
Sistemele inductoare de acest tip pot aciona n sensul activrii unor recombinaze
specifice care s determine anumite remodelri ale ADN nuclear al plantelor transgenice.:
106
Modificarea genetic a plantelor: principii generale de realizare; Aplicaii; Controverse
uman) se datoreaz proceselor de prelucrare la care sunt supuse alimentele n corpul uman, n
urma crora ADN este i el degradat pierzndu-i nsuirile transformate.
In ceea ce privete posibilitatea toxicitii unor produse alimentare obinute din
organisme modificate genetic, aici lucrurile nu sunt excluse, date fiind unele accidente aprute
n urma consumului unor alimente provenite din materii prime insuficient controlate, fiind
necesare studii extrem de laborioase asupra clarificrii acestor aspecte. De altfel, att pe plan
internaional ct i naional au fost elaborate o serie de documente legislative care
reglementeaz utilizarea organismelor modificate genetic pentru obinerea de alimente de uz
uman, fiind unanim acceptat ideea etichetrii obligatorii a produselor de acest tip. Se ofer
consumatorului, n acest fel, posibilitatea de opiune n vederea utilizrii sau nu a produselor
obinute din materii prime de origine transgenic. Spre exemplu, recent s-a aprobat utilizarea
plantelor de porumb transgenic ce conin gena pentru proteina insecticid Cry (derivat de la
B.thuringiensis) dar numai pentru hrana animalelor i pentru prelucrare industrial, nu i
pentru consumul uman deoarece exist posibilitatea ca proteina respectiv s fie alergen
(Hileman, 2002). De asemenea, pentru a elimina posibilitatea ca anumite substane produse de
organismele modificate genetic s produc alergii dar, n acelai timp s nu se exclud
utilizarea acestora, multe instituii naionale sau internaionale iau msuri pentru elaborarea de
teste rapide i eficiente de identificare a posibililor compui alergeni sau duntori.
Cu toate acestea, indiferent de curentele de opinie potrivnice obinerii i utilizrii
plantelor transgenice, avantajele oferite de aceast tehnologie modern sunt certe. Aa cum
s-a prezentat pe parcursul acestui material, transgeneza la plante joac un rol esenial n
cunoaterea i analiza genomului vegetal, n controlul procesului de dezvoltare, n nelegerea
metabolismului plantelor. De asemenea, aplicarea tehnologiei ADN recombinant plantelor de
cultur n vederea obinerii de noi soiuri cu caracteristici utile din punct de vedere economic
constituie un demers economic cu implicaii deosebite, benefice. De altfel, perfecionarea
permanent a tehnicilor moleculare aplicate, a diversificrii cunotinelor asupra structurii i
funcionrii materialului genetic constituie argumente convingtoare pentru continuarea i
aprofundarea experimentelor de inginerie genetic la plante, astfel c noile generaii de plante
transgenice obinute vor fi sigure att pentru mediul nconjurtor ct i pentru om.
Bibliografie selectiv
1. Altman, A., 1999, Plant biotechnology in the 21st century: the challenges ahead, EJB, 2,
2.
2. Carozzi,N., WarrenW., Rice,D.A., Evola,S., Koziel,M.G., 1992, Expression of chimeric
CaMV 35S Bacillus thuringiensis insecticidal protein gene in transgenic tobacco, Plant
Molec.Biol., 20, p.539-548.
3. Cucu, N., Stefan, M., Mitru, M, Gavril, L., 1998, Modification of plant genome by
genetic transformation: interaction of alogenes with the host genome, n Implicaii
tiinifice i bioetice n analiza i manipularea genomului, Edit.Ars Docendi, p.161-169
4. Gatz,C., 1997, Chemical control of gene expression, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant
Molec. Biol., 48, p.89-108.
5. Gold, J., Harder, D., Smith, F., Aung, T, Procunier, J., 1999, Development of a molecular
marker for rust resistance genes Sr39 and Lr35 in wheat breeding lines, EJB., 2, nr.1.
6. Hedden, P., Phillips, A. L., 2000, Manipulation of hormone biosynthetic genes in
transgenic plants, Current Opinion in Biotechnology, 11, p.130-137.
7. Hileman, B., 2002, Whats hiding in transgenic foods? Chemical Eng. news, ian. 2002, p.
20-2.
108
Modificarea genetic a plantelor: principii generale de realizare; Aplicaii; Controverse
8. Ho, M. W., 2001, Horizontal gene transfer the hidden hazards of genetic engineering,
Institute of Science in Society.
9. Martinelli, L., Mandolino, G., 1994, Genetic transformation and regeneration of
transgenic plants in grapevine (Vitis rupestris), Theor. Appl. Geneti., 88, p.621-628
10. Riva, G. A., Cabrera, J. G., Padron, C. A., 1998, Agrobacterium tumefaciens: a natural
tool for plant transformation, EJB, 1, nr.2.
11. Robinson,J., 1999, Ethics and transgenic crops, Electronic Journal of Biotechnology, 2,
nr.2.
12. Sharma, H. C., Sharma, K. K., Seetharama, N., Ortiz, R., 2000, Prospects for usig
transgenic resistance to insects in crop improvement, EJB, 3, nr.2.
13. Tinland, B., 1996, The integration of T-DNA into plant genomes, Trends in Plant Science,
1., nr.6.p.178-183.
14. Tourte, Y., 1998, Genie genetique et biotechnologie: concepts et methodes, Edit.Dunod
15. Walmsley, A. M., Arntzen, C. J., 2000, Plants for delivery of edible vaccines, Current
Opinion in Biotechnology, 11, p.121-129.
16. Watson, J. D., Gilman, M., Witkowski, J., Zoller, M., 1992, Recombinant DNA, Scientific
Academic Books.
17. Weising, K., Kahl., G., 1996, Natural genetic engineering of plant cells: the molecular
biology of crown gall and hairy root disease, World J. Microbiol.Biotechnol., 12, p.327-
351.
18. Whitelam, G. C., Cockburn,W., Owen, M. R. L., 1994, Antibody production in transgenic
plants, Biochem. Society Transact., 22., p.940-943.
19. Zuo, J., Chua, N. H., 2000, Chemical inducible systems for regulated expression of plant
genes, Current Opinion in Biotechnology, 11, p.146-151.
109