LP. 7.

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR

TRACTUSULUI RESPIRATOR INFERIOR.
IDENTIFICAREA STREPTOCOCILOR ALFA-HEMOLITICI.

I. OBIECTIVE

Să cunoască condiția microbiologică a tractusului respirator inferior (TRI).

Să cunoască entitățile nosologice și etiopatogenice.
Să cunoască agenții etiologici ai pneumoniilor acute şi ai tuberculozei pulmonare.
Să știe cum se realizează diagnosticul de laborator în pneumoniile acute şi algoritmul de
identificare a streptococilor α-hemolitici.
Să știe cum se efectuează diagnosticul de laborator în tuberculoza pulmonară, etapele identificării
Mycobacterium tuberculosis.

II. CONDIŢIA ANATOMO-HISTOLOGICĂ A TRI

Tractusul respirator inferior (TRI): se extinde din etajul subglotic al laringelui până la alveolele
pulmonare, via trahee, bronhii lobare, segmentare, lobulare, bronhiole.
Epiteliu de tip respirator (epiteliu pseudostratificat, ciliat, dublat cu un strat de mucus) acoperă
mucoasa traheo-bronşică.

III. CONDIȚIA MICROBIOLOGICĂ A TRI (vezi curs microbiota indigenă)

Etajul infraglotic al TR este în permanenţă contaminat, dar necolonizat datorită unor mecanisme
de apărare eficiente. Care sunt mecanismele de apărare ale TRI?

IV. ENTITĂȚI NOSOLOGICE ȘI CONDIȚII ETIOPATOGENETICE TRI

Infecţiile TRI se manifestă ca: traheită (trahee), traheobronşită (trahee+bronhii), bronşită (bronhii),
bronşiolită (bronhiole mici terninale si respiratorii), pneumonie cu alveolită, pneumonie interstiţială,
pneumopatie cronică (pulmon).

V. INFECȚII PULMONARE – AGENȚI ETIOLOGICI

Pneumonia cu alveolită (pneumonia acută lobară) este determinată de bacterii condiţionat

patogene care aparţin florei comensale a TRS: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae,
Moraxella catarrhalis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae.
Pneumonia interstiţială (pneumonia atipică primară) este determinată de patogeni primari care
includ virusuri (ex. virusuri gripale, paragripale), Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila spp.,
Coxiella burnetii, etc.
Tuberculoza pulmonară (pneumopatie cronică) este cauzată de Mycobacterium tuberculosis,
Mycobacterium bovis, Mycobacterium africanum.

VI. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR ÎN PNEUMONIA CU ALVEOLITĂ (pneumonia

lobară acută = pneumonie care evoluează cu leziuni inflamatorii exsudative în alveole),
fiind determinată de „bacterii obişnuite” se realizează prin metode directe – presupune
examenul microbiologic al sputei

1
Prelevat: sputa.
Recoltare spută: sputa provine din căile respiratorii inferioare şi se recoltează prin tuse spontană şi
profundă.
Vezi LP 5, reguli de prelevare ale produselor destinate examenului microbiologic.
Când recoltăm? Sputa se recoltează după igiena cavităţii orale (clătirea gurii cu apă; NU pastă
de dinţi, apă de gură ce conţin antiseptice), pentru reducerea contaminării cu salivă.
Cum recoltăm? Sputa se recoltează în recipiente sterile, de aproximativ 100 mL, cu gura largă şi
capac ermetic. În infecţiile acute 1 probă de spută mucopurulentă de 1-2 mL este suficientă.
Transport: Proba de spută trebuie expediată imediat la laborator pentru a fi prelucrată în maxim 1
oră de la prelevare.

Decontaminarea sputei: reprezintă prima etapă a prelucrării şi urmăreşte reducerea contaminării

cu microorganisme orale. Aceasta se realizează prin spălarea fragmentelor mucopurulente în 3 băi
succesive de ser fiziologic.

Examenul microscopic: efectuăm un frotiu colorat Gram și examinăm mai multe câmpuri (sputa
este un produs neomogen); realizăm triajul de calitate al probelor și bacterioscopia cantitativă.

Triajul de calitate (efectuat cu obiectiv uscat, la o putere de mărire de 100x, examinăm 5-10
câmpuri și calculăm scorul de calitate Q – fundamentat de prezența fibrinei, numărul de
celule inflamatorii și numărul de celule epiteliale scuamoase – vezi tabel). Probele cu un scor
Q de minim +1 au calitate corespunzătoare pentru a efectua bacterioscopia cantitativă și a
continua diagnosticul.

Prezenţa fibrinei = +1
Numărul de celule/câmp Celule inflamatorii Celule epiteliale
microscopic (mărire de 100x) (CI) scuamoase (CES)
0 0 0
1-9 0 0
10-24 +1 -1
≥ 25 +2 -2

Bacterioscopia cantitativă (prin examen microscopic cu obiectiv cu imersie, la o putere de

mărire de 1000x) pe frotiurile cu scorul Q ≥ +1. Asocierea dintre CI și ≥ 10 bacterii din
aceeași categorie microscopică/câmp (ce corespunde la un numar de bacterii de 105 - 106
UFC/ml în sputa) o numim asociere semnificativă clinic.

De exemplu: CI şi ≥ 10 coci gram pozitivi ovali, lanceolaţi (aspect de flacără de lumânare)

aşezaţi în diplo, cu axul longitudinal în prelungire, privindu-se prin extremităţile bombate,
capsulaţi, este semnificativă pentru o pneumonie pneumococică.

Cultivarea
Mediul de cultivare: agar-sânge repartizat în plăci Petri.
Însămânțare: Se utilizează tehnica de însămânțare în 4 cadrane: se depune un fragment de spută în
primul cadran și apoi se epuizează cu ansa în celelalte 3 cadrane. După aceea, pe aceste 3 cadrane
se va depune o strie de Staphylococcus aureus (pentru a observa eventual fenomenul de satelitism la
stria de stafilococ, realizat de H. influenzae).
Incubare: 37°C, aerob, pentru 24 ore.
Citirea culturilor: se urmărește prezența coloniilor cu creştere predominantă şi în număr mare.
(dacă observăm că domină coloniile mici, cenuşiu-transparente, înconjurate de o zonă largă de α-
hemoliză – pot fi pneumococi şi trebuie identificaţi)

Identificarea izolatului cu semnificație (vezi şi schema de mai jos):

2
Caractere microscopice – observate pe frotiul din coloniile suspecte – coci gram pozitivi ovali,
aşezaţi în perechi sau scurte lanţuri
Caractere de cultură – colonii mici, cenuşiu-transparente, înconjurate de o zonă largă de α-
hemoliză, catalază negative

IDENTIFICAREA STREPTOCOCILOR (vezi LP 6)

IDENTIFICAREA STREPTOCOCILOR ALFA-HEMOLITICI

Identificare prezumtivă: testul de sensibilitate la OPTOCHIN

Testarea sensibilității la Streptococcus pneumoniae streptococi viridans

OPTOCHIN Sensibil Rezistent

Identificare definitivă: pe baza caracterelor antigenice cu seruri specifice (latex

aglutinare/reacție de umflare a capsulei cu seruri specifice anticapsulare). Pe baza antigenelor
capsulare se pot diferenţia mai mult de 80 de serotipuri de Streptococcus pneumoniae.

Antibiograma: Streptococcus pneumoniae nu și-a păstrat sensibilitatea naturală la penicilină.

Antibiograma este obligatorie. Se realizează antibiograma difuzimetrică sau E-test.
Tratamentul antibiotic în pneumonia acută lobară este o urgenţă. Până la venirea rezultatelor
se administrează CEFTRIAXONĂ de primă intenţie.

ALGORITM DE IDENTIFICARE A STREPTOCOCILOR ALFA-HEMOLITICI

Cultivare ⇒ cultura pură – colonii mici, α-hemolitice

Frotiu
Coci gram pozitivi Testul catalazei
Negativ(-) Pozitiv (+)

Streptococcus spp. Staphylococcus spp.

β-hemolitici α-hemolitici γ-hemolitici

Identificare prezumtivă (vezi mai sus tabelul cu sensibilitatea la optochin)

Identificare definitivă (antigenică prin reacții Ag-Ac cu seruri de referinţă)

VII. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR ÎN PNEUMONIA INTERSTIŢIALĂ (pneumonia

atipică primară = pneumonie care evoluează cu leziuni inflamatorii în interstiţiul
pulmonar), fiind determinată de virusuri sau de bacterii particulare (invizibile la
microscop şi greu cultivabile, pe culturi de celule) se realizează în laboratoarele obişnuite
prin metode indirecte = diagnostic serologic (detectarea anticorpilor – vezi LP 5, criterii de
semnificaţie clinică a anticorpilor).

Metoda rapidă de diagnostic în gripa este detecţia virusului gripal prin PCR direct în exsudatul
nazal sau nazofaringian.
Diagnosticul serologic în penumonia interstiţiala se poate face prin RFC (reacţia de fixare a
complementului) în care serul pacientului este pus în contact cu o barerie de antigene de
referinţă corespunzătoare microorganismelor care dau pneumonie interstiţială.

3
 Diagnosticul serologic în gripă - putem detecta anticorpii serici anti-virus gripal prin reacţia
de inhibare a hemaglutinării (RIH).
Principiu RIH: unele virusuri (ex. virusurile gripale) aglutinează prin hemaglutininele de pe
peplosul lor hematiile umane sau animale (RH). Reacţia este blocată de prezenţa anticorpilor
specifici în serul de testat (post-infecţie sau post-vaccinare), în prezenţa antigenului omolog.
Exemplu:
Citire reacţie (serurile pacientului, acut şi convalescent), in diluţii duble succesive, este
pus in contact cu hematiile test în prezenţa antigenelor de referinţă, in aceeaşi camtitate
in toate godeurile reacţiei).
- Reacţie negativă – aglutinare a hematiilor test de catre hamaglutinina virală
(antigenul de referinţă)
- Reacţie pozitivă – hemaglutinare inhibată prin neutralizarea hemaglutininei
(antigenul introdus în reacţie) de către anticorpii serici

Antigen de virus gripal tip A/Beijing/262/95 (A/H1N1)2000

Diluţii ser 1/7 1/14 1/28 1/56 1/112 1/224 1/448
Ser I (ser acut) + + - - - - -
Ser II (ser convalescent) + + + + + + -

Antigen de virus gripal tip A/Sydney/15/97/ (A/H3N2)1999

Diluţii ser 1/7 1/14 1/28 1/56 1/112 1/224 1/448
Ser I (ser acut) - - - - - - -
Ser II (ser convalescent) - - - - - - -

Antigen de virus gripal tip B/Shandong

Diluţii ser 1/7 1/14 1/28 1/56 1/112 1/224 1/448
Ser I (ser acut) + - - - - - -
Ser II (ser convalescent) + - - - - - -

Diagnostic: infecţie cu virusul gripal A/H1N1 (dinamică semnificativă a anticorpilor serici în

serul II faţă de serul I)

VIII. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR ÎN TUBERCULOZA PULMONARĂ

(pneumopatie cronică) se realizează prin metode directe – presupune examenul
microbiologic al sputei

Prelevat: sputa
Recoltare spută: se recoltează prin tuse spontană şi profundă, de la pacient cooperant.
Vezi LP 5, reguli de prelevare ale produselor destinate examenului microbiologic.
Când recoltăm? Sputa se recoltează după igiena cavităţii orale (mai puţin importantă decat
pentru penumonia lobară).
Cum recoltăm? Sputa se recoltează în recipiente sterile, de aproximativ 100 mL, cu gura largă şi
capac ermetic. Se recoltează toată sputa pe care pacientul o poate expectora. Se recoltează 3 probe
matinale, 3 zile consecutiv.
Transport: Proba de spută trebuie expediată imediat la laborator. Proba se poate conserva la
frigider până la prelucrare. Prelucrarea se face în hote de siguranţă microbiologică (pentru
impiedicarea contaminării celui care lucrează proba).

Prelucrarea sputei pentru diagnosticul tuberculozei are unele particularităţi, legate de structura
agentului etiologic urmărit. Bacilii tuberculozei sunt patogeni primari (nu se găsesc în mod normal
în spută), care sunt rari si neuniform repartizaţi în spută. De aceea se recoltează o cantitate mai mare
şi mai multe probe de spută. Rezistenţa lor la agenţii de decontaminare face posibilă
decontaminarea chimică a sputei, care omoară toate bacteriile cu creștere rapidă, în vederea
cultivării acestor specii cu creştere lentă.
4
Decontaminarea: se realizează chimic, prin tratare cu soluție NaOH 4%, timp de 30 minute. După
centrifugarea şi neutralizarea probei, sedimentul este folosit pentru examenul microscopic și pentru
cultivare.

Examenul microscopic: efectuăm din spută sau din sediment frotiuri colorate Ziehl-Neelsen și
examinăm 100 – 300 de câmpuri.

Bacterioscopia pozitivă - prezenţa bacililor acido-alcoolo-rezistenţi (BAAR) – bacili lungi, subțiri,

filamentoși, care se așează în litere unghiulare, roșii stralucitori pe fondul albastru al preparatului,
nesporulați, necapsulați = stabileşte diagnosticul de tuberculoză pulmonară
Bacterioscopie negativă nu exclude diagnosticul.

Metode rapide de diagnostic direct - PCR cu detcţia genelor specifice M. tuberculosis direct în
spută sau in LCR (în suspiciunea de tuberculoză meningiana) şi cu detecţia simultană a genelor de
rezistenţă la HIN și RIF, este metoda modernă care perminte diagnosticul rapid al tuberculozei şi
orientarea terapiei specifice, dar este accesibilă numai laboratoarelor dotate din centrele de referinţă.

Cultivarea
Mediul de cultivare: Löwenstein-Jensen repartizat în tuburi închise ermetic (patogen respirator cu
creştere lentă)
Incubare: 37°C, aerob, pentru 3-8 săptămâni, dacă este necesar până la 90 de zile.
Citirea culturilor: după 2-3 săptămâni se urmărește prezența coloniilor R, rugoase, conopidiforme,
uscate, de culoare crem-bej.

Bacilii tuberculozei (bacterii inalt patogene ce aparțin genului Mycobacterium):

Mycobacterium tuberculosis (bacilul lui Koch)
Mycobacterium bovis
Mycobacterium africanum

Identificare Mycobacterium tuberculosis:

PREZUMTIVĂ
Caractere microscopice – BAAR (bacili roșii pe fond albastru), nesporulați, necapsulați,
filamentoși, subțiri, lungi, care se așează în litere unghiulare în produsul patologic sau paralel în
corzi flexuoase pe frotiul din cultură (tulpini virulente);
Caractere de cultură – colonii R, rugoase, conopidiforme, uscate, de culoare crem-bej.

DEFINITIVĂ
Caractere biochimice
Caractere genetice (PCR, hibridizare)

Antibiograma: fiind o bacterie cu creştere lentă se realizează printr-o variantă a metodei diluţiilor
numită metoda concentrațiilor absolute.

Antituberculostatice de primă linie:

- IZONIAZIDA (HIDRAZIDA ACIDULUI IZONICOTINIC)
- PIRAZINAMIDĂ
- ETAMBUTOL
- RIFAMPICINĂ
- STREPTOMICINĂ