UNIVERSITATEA POLITEHNICĂ DIN BUCUREŞTI

FACULTATEA DE CHIMIE APLICATĂ ŞI ŞTIINŢA MATERIALELOR

REFERAT – METODE MODERNE DE SINTEZĂ

Sinteza combinatorială în fază lichidă a derivaților de
benzimidazol 1,2,5-trisubstituiți ca inhibitori umani
DHODH

Student

Raluca MANEA

BUCUREŞTI

2019

1
CUPRINS
1. Aspecte generale ale sintezei combinatoriale în fază lichidă .................................................................... 3
1.1 Introducere .......................................................................................................................................... 3
1.2 Metoda de sinteză în fază lichidă ........................................................................................................ 3
1.3 Suport solubil ...................................................................................................................................... 4
1.4 Sinteze combinatoriale ale fazei lichide vs ale fazei solide ................................................................ 4
2. Sinteza combinatorială în fază lichidă a derivaților de benzimidazol 1,2,5-trisubstituiți ca inhibitori
umani DHODH ............................................................................................................................................. 5
2.1 Introducere .......................................................................................................................................... 5
2.2 Materiale și metode ............................................................................................................................. 6
2.2.1 Procedura generală pentru sinteza 4-fluor-3-nitro-benzoatuluiPEGester (3) ................................... 6
2.2.2. Procedură generală pentru sinteza 4-amino- (3-fluor-benzil) -3-nitro-benzoat PEGester (4)......... 7
2.2.3. Procedură generală pentru sinteza 4-amino- (3-fluor-benzil) -3- amino-benzoat PEGester (5) ..... 7
2.2.4 Procedură generală pentru sinteza 2- (substituit) -1- (3- fluorbenzil) -1 H-benzimidazol-5-
carboxilat PEGester (6a-k) ........................................................................................................................ 8
2.2.5. Procedură generală pentru sinteza 1,2,5-trisubstituită benzimidazol (7a-k) (seria-1) ..................... 8
2.2.6. Procedură generală pentru sinteză benzimidazolului carboxylic 1,2,5-trisubstituit (8a-k) (seria 2)
.................................................................................................................................................................. 8
2.3 Testarea farmacologică ....................................................................................................................... 9
2.4 Evaluare farmacologică..................................................................................................................... 10
2.5 Studii cinetice In-Vitro ..................................................................................................................... 10
2.6 Concluzii ........................................................................................................................................... 11
3. Bibliografie ............................................................................................................................................. 12

2
1. Aspecte generale ale sintezei combinatoriale în fază lichidă
1.1 Introducere
Conceptul de chimie combinatorială a fost introdus pentru prima dată de Merryfield în
anul 1986 și implica metode de sinteză în fază solidă a unor amestecuri de peptide. Această idee
a fost dezvoltată la începutul anilor 1990 de Geysen, Dibo, Houghten și colegii acestora. Tehnica
lor era reprezentată printr-o metodă de sinteză diferita, capabilă sa genereze un numar vast de
compusi într-o perioadă de timp relativ mică comparativ cu sinteza chimică clasică. Chimia
combinatorială s-a axat inițial pe sinteza în fază solidă a peptidelor și oligonucleotidelor, dar din
cauza biodisponibilității reduse a acestora, interesul s-a îndreptat spre sinteza
peptidomimeticelor. La inceput, metoda dezbina-cupleaza-recombina a fost folosită pentru
obținerea unuia sau mai multor amestecuri sau biblioteci de compuși printr-un proces de
randomizare. Chiar dacă această metodă este încă foarte utilizată, a fost în mare parte înlocuită
de sinteza paralelă în fază solidă și fază lichidă, care prezintă o viteză mai mare. Comparativ cu
chimia combinatorială, sinteza paralelă poate produce un număr mare de compuși individuali (nu
amestecuri) în cantități mari ce pot fi purificate și analizate mai riguros, ceea ce face bibliotecile
combinatoriale mai ușor de analizat și păstrat.[1] Datorită abordării din punct de vedere
combinatorial, sinteza nu mai reprezintă un pas limitativ în descoperirea de noi medicamente.
Având în vedere că majoritatea tehnicilor de caracterizare analitice sunt tehnici de serie,
purificare și analiza bibliotecilor au devenit noua provocare. Aceasta impune, desigur, noi
metode analitice in acest domeniu.

1.2 Metoda de sinteză în fază lichidă

Sinteza combinatorială în fază lichidă este utilizată pentru a produce bibliotecile care sunt
formate din compuși unici sau amestecuri de compuși organici. Bibliotecile de compuși simpli
sunt sintetizate utilizând tehnica de sinteză paralelă. Strategia de sinteză a suportului solubil este
cunoscută sub denumirea de "Sinteză în fază lichidă", care diferențiază abordarea de la metoda
clasică în fază de soluție. Suportul în fază lichidă necesită utilizarea unei legături chimice pentru
a lega ținta suportul și reacție omogenă în timp ce condițiile reacției sunt menținute.

3
1.3 Suport solubil

Suporții solubili sunt stabili mecanic și chimic pentru solvenții și reactivii care sunt
implicați în bibliotecă de sinteză (figura 1). În prezent, suporturile polimerice solubile
(dendrimele) sunt introduse în chimia combinatorică, având capacitatea de a avea reactivitate în
fază de soluție și poate fi supus analizei spectroscopice (de exemplu RMN). Reacțiile în fază de
soluție sunt potrivite combinatorial, deoarece acestea nu necesită purificare. Reactivii legați la
polimeri sunt aplicați într-un vas în mai multe etape în sinteză combinatorială în fază de soluție.
[2]

Figura 1- Suporturile de polimer solubile utilizate în sinteză în fază lichidă

1.4 Sinteze combinatoriale ale fazei lichide vs ale fazei solide

Multe abordări, cum ar fi scindări, mixte, codificate, indexate sau paralele care se referă la
sinteză pe pini, mărgele,chipsuri și alte suporturi solide sunt dezvoltate în timp ce soluția fază
este sintetizată în prezent și dezvoltată ca o alternativă utilă. De asemenea, se datorează
extinderii naturale a metodologie din sinteza peptidelor și oligonucleotidelor unde sinteza în fază
solidă a apărut ca repetarea reacției de cuplare. Utilizarea este, de asemenea, limitată la
repertoriul de reacție care prezintă în mare măsură faza solidă și necesită sprijin solid pentru
suporturi funcționale . Compatibilă cu link-uri de separare și ortogonale, chimia de atașament /
detașare este adesea asociată cu eliberarea grupărilor funcționale ale martorilor. [3]

4
2. Sinteza combinatorială în fază lichidă a derivaților de benzimidazol 1,2,5-
trisubstituiți ca inhibitori umani DHODH

2.1 Introducere

Tehnica sintezei combinatorială în fază lichidă este bine cunoscută pentru sinteza bibliotecii
de compuși. O metodă corespunzătoare de a face sinteza în fază de soluție este folosirea ca
legături substanțe chimice sau agenți de legare cu suport pentru a permite eliminarea de
impurități sau reactivi suplimentari din soluția care conține membrii anticipați ai bibliotecii. Prin
intermediul componentelor legate de polimeri; chimia combinatorială este dezvoltată ca o
organizație pentru construirea bibliotecilor cu molecule mici pentru accelerarea procedurii de
descoperire a medicamentelor. Suportul poli (etilenglicolul) este o parte a legăturii ester care este
eliberat la ultimul pas. Matrițele solubile, cum ar fi poli (etilen glicol) - PEG, suporturile
fluorurice și poli (stirenul) liniar sunt utilizate pentru eficacitatea lor în producerea de molecule
variate.
Pentru a îndeplini toate necesitățile unei sinteze în etape o matrice solubilă ar trebui să fie
constantă într-o mare varietate de medii de reacție. Organizarea inelului benzimidazol este în
esență asociată cu nucleul benzodiazepinic larg utilizat dar nu a fost extensiv utilizat în chimia
medicamentelor. În plus, compușii benzimidazolici au dezvăluit acțiuni biologice largi: antiulcer,
antihistaminic, antiparazitar și proprietăți antivirale.
O tehnică generală pentru sinteza rapidă a varietăților de benzimidazoli ar avea nenumărate
importanțe pentru descoperirea medicamentelor. Faza lichidă abordată în sinteză combinatorială
este larg aplicată pentru sinteza compușilor care pot fi examinați pentru o anumită activitate
biologică și poate fi pregătită o bibliotecă de compuși.
Dihidroorotat dehidrogenază (DHODH) este o enzimă esențială pentru cea de-al patrulea pas în
biosinteza de novo pirimidină și acesta catalizează conversia dihidroorotatului (DHO) în orotat
(ORO) cu reducerea ubicinonei. [4]

5
 Semnificația bazelor pirimidinice pentru metabolism, celulă și proliferare determină
DHODH uman ca o țintă atractivă din punct de vedere chemoterapeutic pentru dezvoltarea noilor
medicamente în diferite aplicații biologice și clinice pentru cancer, artrită și malarie.
Leflunomida și brequinar sunt cele mai de bune exemple de molecule mici inhibitori ai
hDHODH. Leflunomida este primul inhibitor hDHODH care a fost aprobat pentru utilizare în
medicina umană în tratamentul artritei reumatoide și se dovedește a fi un pro-medicament la
metabolitul activ A771726, în timp ce brequinar este un medicament antitumoral și agent
imunosupresor care prezintă activitate imunosupresoare. Din păcate, reacțiile adverse severe
cum ar fi leucocitopenia, mucozități și anomalii ale enzimelor hepatice au fost observate în
timpul utilizării clinice a brequinar și lefluonomide.[5]

2.2 Materiale și metode

Intervalul punctului de topire pentru toți compușii a fost înregistrat pe aparate de puncte
de topire MP1 și puncte de topire raportate sunt necorectate. Mantaua de încălzire Remi și
agitatoarele magnetice au fost utilizate pentru refluxarea reacțiilor și agitarea reacțiilor. Lampa
IR și uscătorul în vid au fost utilizate pentru uscarea compușilor. Spectrele IR au fost înregistrate
pe FTIR Jasco, prin metoda dispersiei KBr. Spectrele de masă au fost înregistrate, utilizând
spectrometru de masă Shimadzu împreună cu Waters, ESI a fost folosit ca sursă de ioni pentru
analiză. Spectrele RMN de proton s-au înregistrat utilizând instrumentul 400 MHz BRUKER 1H
NMR și spectrul 13C RMN au fost înregistrate folosind instrumentul RMN BRUKER (100
MHz). Au fost efectuate protocoale experimentale în nișe folosind produse chimice procurate de
la Sigma-Aldrich, Spectrochem, Merck și TCI. (Figura 2)

2.2.1 Procedura generală pentru sinteza 4-fluor-3-nitro-benzoatuluiPEGester (3)

La un amestec de 0,5 g (2,7 mmoli) acid 4-fluor-3-nitrobenzoic (1) și PEG-5000 mono

metil eter (13,51 g, 2,7 mmoli) în diclormetan (DCM) (100 ml) s-a adăugat N, N-
diciclohexilcarbodii (DCC) (0,61 g, 2,97 mmoli) la 0 ° C. După finalizarea adiției, 4-
dimetilaminopiridină (DMAP) a fost adăugat (0,033 g, 0,27 mmoli) la aceeași temperatură [6].

6
Amestecul de reacție a fost apoi agitat timp de 24 de ore la temperatura camerei. Reacția a fost
monitorizată utilizând TLC (utilizând hexan: acetat de etil, 3: 7 ca fază mobilă) care a confirmat
că reacția s-a terminat după 24 de ore de agitare la temperatura camerei. Amestecul de reacție a
fost filtrat și filtratul a fost turnat în dietileter rece. Solidul rezultat a fost filtrat la presiune redusă
pentru a se obține intermediarul brut 3, care a fost utilizat în etapa următoare fără purificare
ulterioară.

2.2.2. Procedură generală pentru sinteza 4-amino- (3-fluor-benzil) -3-nitro-benzoat

PEGester (4)
La soluția de intermediar 3 (10,0 g, 1,94 mmoli) în DCM (50 ml) s-a adăugat 3-
fluorbenzilamină (0,484 g, 3,87 mmoli) la temperatura camerei. Amestecul de reacție a fost
agitat în continuare 18 ore la temperatura camerei [5,6]. Reacția a fost monitorizată cu TLC
(utilizând hexan: acetat de etil, 2: 8 ca fază mobilă) care a confirmat că reacția a fost terminată
după 18 ore de agitare la temperatura camerei. Amestecul de reacție a fost turnat în dietil eter
rece. Solidul rezultat a fost filtrat sub presiune redusă pentru a se obține intermediarul brut 4,
care a fost folosit în următoarea etapă fără purificare.

2.2.3. Procedură generală pentru sinteza 4-amino- (3-fluor-benzil) -3- amino-benzoat

PEGester (5)
La o soluție de intermediar 4 (8,0 g, 1,52 mmoli) în metanol (40 ml) s-au adăugat
clorură de amoniu (0,407 g, 7,6 mmoli) și Zinc (0,292 g, 4,56 mmoli) la temperatura camerei.
Reacția amestecul a fost agitată suplimentar timp de 18 ore la temperatura camerei [5]. Reacția a
fost monitorizată pe TLC (utilizând 100% acetat de etil, ca fază mobilă) care a confirmat că
reacția a fost finalizată după 18 ore de agitare la temperatura camerei. Amestecul de reacție a fost
filtrat pentru a îndepărta zincul și filtratul a fost turnat în dietil eter rece. Solidul rezultat a fost
filtrat sub presiune redusă pentru a se obține intermediarul brut 5, care a fost utilizat în următorul
pas fără altă purificare.

7
2.2.4 Procedură generală pentru sinteza 2- (substituit) -1- (3- fluorbenzil) -1 H-
benzimidazol-5-carboxilat PEGester (6a-k)
La o soluție de intermediar 5 (7,0 g, 1,34 mmoli) în dicloretan (DCE) (40 ml),
benzaldehida substituită (1,6 mmoli) a fost adăugată la temperatura camerei. Amestecul de
reacție a fost apoi agitat sub reflux [7]. Reacția a fost monitorizată pe TLC (utilizând hexan:
acetat de etil, 2: 8 ca fază mobilă) care a confirmat că reacția s-a terminat după 8 ore de reflux.
Amestecul a fost răcit și turnat în dietil eter rece. solidul rezultat s-a filtrat sub presiune redusă
pentru a se obține intermediarii (6a-k), care au fost utilizați în etapa următoare fără purificare
ulterioară.

2.2.5. Procedură generală pentru sinteza 1,2,5-trisubstituită benzimidazol (7a-k) (seria-1)

La o soluție de intermediar 6a-k (1 echiv.) în metanol (40 ml), s-a adăugat metoxid de
sodiu (3 echiv.) la 0 ° C. Amestecul de reacție a fost lent adus la temperatura camerei și apoi
agitat la temperatura camerei [5]. Reacția a fost monitorizată pe TLC (utilizând hexan: acetat de
etil, 2: 8 ca fază mobilă) care a confirmat că reacția a fost terminată după 24 de ore de agitare la
temperatura camerei. Amestecul de reacție a fost răcit și turnat în dietil eter rece. Solidul rezultat
a fost filtrat sub presiune redusă până la obținerea compușilor finali (7a-k) ca seria-1, care au fost
în continuare purificați prin cromatografie pe coloană.

2.2.6. Procedură generală pentru sinteză benzimidazolului carboxilic 1,2,5-trisubstituit (8a-

k) (seria 2)
La o soluție de intermediar 6a-k (1 echiv.) în metanol (40 ml), s-a adăugat hidroxid de
sodiu (3 echiv.) la 0 ° C. Amestecul de reacție a fost lent adus la temperatura camerei și apoi
agitat la temperatura camerei [8]. Reacția a fost monitorizată pe TLC (utilizând hexan: acetat de
etil, 2: 8 ca fază mobilă) care a confirmat faptul că reacția s-a terminat după 24 de ore de agitare
la temperatura camerei. Amestecul de reacție a fost răcit și turnat în dietileter rece. Solidul
rezultat a fost filtrat sub presiune redusă pentru a se obține compușii finali bruți (8a-k) ca serie-2,
care au fost apoi purificați prin cromatografie pe coloană.

8
 Figura 2- Schema de sinteza

2.3 Testarea farmacologică

Pregătirea probelor pentru studiul de inhibare a enzimelor- Soluțiile de testare a

compușilor au fost preparate în DMSO 0,1% la concentrație de 10 mM pentru toți compușii
sintetizați prin metoda de diluare. Inițial, 0,01 mmoli de compuși au fost cântăriți cu precizie, s-
au dizolvat în 1 ml DMSO și s-au folosit ca stoc cu o concentrație de 10 mM. Diluția în serie
continuă de trei ori utilizând un volum de 0,1 ml (stoc) realizat până la 1 ml făcut folosind soluție
tampon proaspăt preparat, Triton X-100 0,1% în 50 mM soluție tampon Tris-HCI, 150 mM KCI
la pH 8,0 pentru a obține compușii de testare cu concentrație de 10 mM (concentrație de testare).

9
2.4 Evaluare farmacologică
Toate analizele au fost efectuate de trei ori pentru rezultate precise. Absorbanța
fiecăruia a fost măsurată la 600 nm și cuantificată în triplicat utilizând un cititor de microplaci 96
(instrument Bio-Rad-680) iar datele au fost exportate într-o foaie de calcul Excel (Microsoft)
pentru analiză. Rezultatele pentru inhibarea procentuală a enzimei sunt prezentate în tabelul 1
sub forma suplimentară de materiale. Toți compușii sintetizați au demonstrat activitatea
biologică și cei mai buni compuși din primele serii au fost 7d și 7e, care au prezentat inhibarea
81,44%, respectiv 81,22% iar din a doua serie compușii au fost 8d și 8e care au prezentat
inhibarea 86,04%, respectiv 83,39%. [9]
Tabelul 1

2.5 Studii cinetice In-Vitro

Metoda reciprocă de plot Lineweaver-Burk a fost utilizată pentru determinarea modului
de inhibare a enzimei. Compusul 8d a fost utilizat ca prototip pentru a identifica modul de
inhibare a enzimei. Rata de reacție a fost documentată în prezența, precum și în absența
inhibitorului, adică compusul 8d. Rezultatul a fost expus (Vmax) în prezența inhibitorului 8d fără

10
alte modificări a valorii Km. Acest profil cinetic a indicat faptul că compusul 8d are un potențial
de inhibare mixt sau necompetitiv împotriva hDHODH.

2.6 Concluzii

Lucrarea aceasta a demonstrat sinteza combinatorială în fază lichidă, elucidarea

structurii, analiza in vitro, activitatea umană de inhibare a enzimei DHODH a benzimidazolului
1,2,5-trisubstituit. Sinteza combinatorială în fază lichidă a fost utilizată pentru a sintetiza și
evalua o serie de 1,2,5- trisubstituiți cu randamente bune. Compușii 7d, 7e, 8d, 8e și 8i au arătat
o bună inhibare a enzimei DHODH umane, în timp ce alți compuși au prezentat moderate până la
semnificative inhibări in vitro a enzimei DHODH umane. [10]

11
3. Bibliografie

1. B. Yan, Analysis and Purification Methods in Combinatorial Chemistry, 2004

2. Vandersteen, A.M.; Han, H.; Janda, K.D. Liquid-phase combinatorial synthesis: in search of
small-molecule enzyme mimics. Mol. Divers., 1996, 2, 89-96.
3. Wilson, A.J. Inhibition of protein-protein interactions using designed molecules. Chem. Soc.
Rev., 2009, 38, 3289-3298.
4. C. Yeh, C. Tung, C. Sun, Combinatorial liquid-phase synthesis of structurally diverse
benzimidazole libraries, J. Comb. Chem. 2 (2000) 341–348.
5. I. Abdullah, C.C. Fei, L.Y. Kee, S.S. Rao Thunuguntla, K.S. Reddy, K. Nellore, T.Antony, J.
Verma, K.W. Mun, S. Othman, H. Subramanya, N.A. Rahman, Benzimidazole derivatives as
potential dual inhibitors for PARP-1 and DHODH, Bioorg. Med. Chem. 23 (2015) 4669–4680.
6. L. Chen, C. Chang, D.B. Salunke, C. Sun, Divergent synthesis of unsymmetrical annulated
biheterocyclic compound libraries: benzimidazole linked Indolobenzodiazepines/quinoxaline,
ACS Comb. Sci. 13 (2011) 391–398.
7. H. Akamatsu, K. Fukase, S. Kusumoto, New efficient route for solid-phase synthesis of
benzimidazole derivatives, J. Comb. Chem. 4 (2002) 475–483.
8. K. Chaudhari, S. Surana, P. Jain, H.M. Patel, Mycobacterium Tuberculosis (MTB) GyrB
inhibitors: an attractive approach for developing novel drugs against TB, Eur. J. Med. Chem. 124
(2016) 160–185.
9. K. Shih, C. Lee, C. Tsai, Y. Lin, C. Tang, Development of a human dihydroorotate
dehydrogenase (hDHODH) pharma-similarity index approach with scaffoldhopping strategy for
the design of novel potential inhibitors, PLoS One 9 (2014) 1–11.
10. Nikum D. Sitwala a, Vivek K. Vyas a, Bhavesh C. Variya b, Snehal S. Patel b, Chirag C.
Mehta c, Dharmraj N. Rana c, Manjunath D. Ghate, Liquid phase combinatorial synthesis of
1,2,5-trisubstituted benzimidazole derivatives as human DHODH inhibitors, Bioorg Chem, 75
(2017) 118–126

12