CAPITOLUL III

BIOTEHNICI DERIVATE SAU FINALIZATE PRIN TRANSFER DE

EMBRIONI

3.1. Fecundaţia „in vitro“

Este o biotehnică de actualitate, prin intermediul căreia procesele

fiziologice de maturare a gameţilor femeli şi de capacitare a spermatozoizilor,
fecundaţie şi cultură a embrionilor până la stadiul transferului acestora în
organismul femelelor receptoare, sunt dirijate şi se produc, parţial sau total, în
afara organismului femelei („in vitro“) în diferite medii de cultură. Această
biotehnică, deşi bazele teoretice şi practice au fost puse cu circa 4-5 decenii mai
înainte, a căpătat un interes mai deosebit în ultimele două decenii. Cu toate
preocupările destul de intense în acest domeniu, succesul înregistrat la mamiferele
domestice este destul de limitat.
La mamifere, fecundaţia fiind internă, analiza intimă a mecanismelor
implicate în acest proces biologic este delicată şi costisitoare. Fecundaţia „in
vitro“ constituie o biotehnică ce permite studierea „in vitro“ a interacţiunilor
dintre cei doi gameţi sub rezerva reproducerii artificiale a condiţiilor identice
existente ,,in vivo“. După cum s-a studiat la capitolul „Fecundaţie“, elementele
esenţiale ale acestui interesant şi complex proces, constau dintr-o serie de
interacţiuni între cei doi gameţi care, în final, conduc la unirea lor şi la
combinarea genotipurilor.
Principalele „secvenţe“ ale fecundaţiei se referă la:
- fixarea spermatozoizilor de zona pelucidă, urmată de străbaterea
acestei membrane;
- fuzionarea membranelor plasmatice ale celor doi gameţi;
- încorporarea spermatozoidului în ooplasmă şi activarea ovocitului;
- singamia.
În momentul ovulaţiei, ovocitul este captat de pavilion şi descinde de-a
lungul oviductului. La majoritatea animalelor de fermă, celulele coroanei radiata
sunt eliminate rapid după ovulaţie. Spermatozoizii dobândesc puterea lor
fecundantă în cursul înaintării prin tractusul genital femel. Numărul gameţilor
masculi care ajung la nivelul oviductului, în momentul ovulaţiei, este foarte
restrâns, astfel încât raportul dintre spermatozoizi şi ovocite la rumegătoare
variază de la 1 la 10. De asemenea, reacţia acrozomului spermatozoidului se
produce la nivelul zonei pelucide. În consecinţă, rolul oviductului este de a
asigura dezvoltarea embrionului până la stadiul de 8-16 celule, apoi acesta trece în
vârful cornului uterin.
Cercetările efectuate au relevat faptul că fluidul oviductului (sau lichidul
tubar) nu este un simplu transsudat sanguin, ci este un mediu cu unele însuşiri
fizico-chimice speciale: concentraţie mai ridicată a ionilor de K+ şi un nivel mai
scăzut al concentraţiei ionilor de Mg++, comparativ cu serul sanguin. Volumul
secreţiei tubare este hormono dependent. Lichidul tubar poate suferi unele
schimburi cu lichidul peritoneal.
În condiţii naturale, embrionul părăseşte oviductul, în general, după al 3-
lea clivaj, iar dezvoltarea zigotului la nivelul oviductului nu este strict specifică.
Astfel, embrionii bovini se dezvoltă în oviductul ligaturat de oaie sau iepuroaică.

93
Această dezvoltare a embrionului până la stadiul de blastocist la nivelul
oviductului chiar provenind de la altă specie, constituie un fenomen remarcabil.
Primele rezultate obţinute cu ovocite maturate „in vivo“ au fost obţinute în
anul 1954 la iepuroaică, în 1969 la şoarece şi în 1980 la bovine (Marquant B. şi
colab.,1991). Primul produs obţinut printr-o astfel de biotehnică este consemnat în
anul 1959 la iepure, 1978 la om şi în 1982 la bovine. În ceea ce priveşte produşii
rezultaţi prin fecundaţia cu ovocite maturate „in vitro“, în 1972 s-au obţinut primii
zigoţi de şoarece prin fecundarea ovocitelor cu spermatozoizi recoltaţi de la
nivelul epididimului; în anul 1973 s-au obţinut produşi la iepure prin fecundarea
ovocitelor cu spermatozoizi capacitaţi în uter; în anul 1986 s-au obţinut primii
miei, prin folosirea la fecundarea ovocitelor a spermatozoizilor ejaculaţi; în 1986
s-au obţinut primii viţei folosindu-se pentru fecundarea ovocitelor spermatozoizi
conservaţi prin congelare (Marquant B. şi colab.,1991).
După aceste prime succese înregistrate, fecundaţia „in vitro“ s-a
generalizat, după cum s-a văzut, la toate mamiferele de interes zootehnic, însă
obţinerea unui nivel ridicat de fecundaţie „in vitro“ s-a înregistrat mult mai târziu.
Nivelul relativ scăzut de fecundaţie înregistrat în perioada de început a aplicării
fecundaţiei „in vitro“s-a datorat în special, folosirii unei temperaturi inadecvate
acestei etape. S-a demonstrat că temperatura centrală la mamifere este de 39 oC
ceea ce face ca nivelul procentului de fecundaţie înregistrat la incubarea gameţilor
la 37oC să fie extrem de scăzut.
Etapele fecundaţiei „in vitro“ sunt:
- obţinerea ovocitelor;
- maturarea „in vitro“ a ovocitelor;
- capacitarea spermatozoizilor;
- fecundarea şi cultura „in vitro“;
- transferul embrionilor rezultaţi.

3.1.1. Obţinerea ovocitelor

Sursele posibile pentru ovocite sunt:

- ovocite provenite prin puncţia foliculilor maturi de la femele cu estru
spontan sau superovulat, recoltate înainte sau imediat după ovulaţie;
- ovocite obţinute din foliculi imaturi, recoltate din ovarele femelelor
sacrificate sau ovariectomizate;
- ovocite rezultate din oviducte, imediat după ovulaţie. Prima şi a treia
sursă de ovocite sunt limitate, deoarece numai un număr mic de foliculi se
maturează şi ovulează spontan, sau numai un număr relativ restrâns de foliculi pot
fi activaţi prin injectarea hormonilor gonadotropi. Ovocitele mature pot fi
recoltate din foliculi maturi sau din oviduct în primele 6 ore de la ovulaţie, plasate
într-un mediu Krebs-Ringer şi incubate la 38oC, umiditatea relativă de 100% şi
5% atmosferă de CO2.
Ovocitele obţinute prin puncţia ovarelor provenite de la animalele
sacrificate la abator sau a ovarelor obţinute prin ablaţia acestora, constituie o sursă
importantă de gameţi femeli, însă aceste ovocite necesită a fi maturate ,,in vitro“.
Puncţia foliculilor pe animalul viu permite folosirea donatoarelor de ovocite cu
potenţial genetic cunoscut. Pentru recoltarea ovocitelor în astfel de condiţii se mai
poate folosi un endoscop, cuplat la un sistem de aspirare, în vederea prelevării
lichidelor foliculilor cu un diametru de 2-6 mm, de la vaci stimulate sau nu cu
hormoni gonadotropi exogeni. De asemenea, puncţia foliculilor, ghidată prin

94
ecografie transvaginală permite colectarea fluidului folicular şi a complexelor
ovocite-cumulus. Această tehnică poate fi repetată de mai multe ori în cursul
aceluiaşi ciclu, fără a afecta fertilitatea ulterioară a femelei donatoare.

3.1.2. Maturarea „in vitro “ a ovocitelor

Ovocitele prelevate din foliculii antrali, prin laparotomie sau sacrificarea

femelelor, reiau spontan meioza dacă sunt plasate într-un mediu special de cultură,
la 38oC, incubate într-o atmosferă de 5% CO 2. Prezenţa unui cumulus compact şi
intact în momentul cultivării ovocitelor favorizează reluarea meiozei pentru
majoritatea ovocitelor. Studii de microscopie electronică au arătat că celulele
cumulus-ului emit numeroase prelungiri ce traversează zona pelucidă şi stabilesc
legături funcţionale complexe cu citoplasma ovocitului. Aceste legături, parţial
sunt întrerupte, după 3 ore de cultură a ovocitului în mediul special, pentru ca
după 16-18 ore de cultură, contactele dintre celulele cumulus-ului şi ovocit să
dispară complet. Ruperea membranei nucleare se produce după 6-12 ore de
cultură şi emiterea primului globul polar după 24 de ore. Aceste transformări
nucleare, ce deosebesc maturarea „in vitro“ a ovocitelor, modificări observabile
prin tehnici histologice, sunt însoţite de modificări citoplasmatice mult mai greu
de decelat prin mijloace actuale de investigare. S-a dovedit, prin multiple
experienţe, că ovocitele cultivate în foliculul lor se maturează asemănător celei
observate ,,in vitro“.
La oaie, Staigmiller şi Moor, 1984 (citaţi de Marquant B., 1991) au arătat
că adăugarea unei suspensii de celule obţinute din granuloasa foliculilor ovarieni
în mediul de cultură, permite o maturare normală a ovocitelor. La vacă, nivelul
maturării ovocitelor în medii cu sau fără adaos de celule din granuloasă, nu
variază mult, însă prezenţa acestor celule permite restabilirea potenţialului de
dezvoltare a ovocitelor după fecundaţia „in vitro“.
Ovocitele obţinute prin puncţia foliculilor dispuşi mai în profunzimea
cortexului ovarian au un potenţial de maturare şi dezvoltare ulterioară mult mai
slabe, comparativ cu ovocitele obţinute prin puncţia foliculilor mari, maturi,
situaţi la suprafaţa ovarului.

3.1.3. Capacitarea spermatozoizilor

Spermatozoizii mamiferelor nu sunt capabili de fecundare a ovocitelor, din

momentul ejaculării. Spermatozoizii trebuie să parcurgă o perioadă de pregătire,
numită „capacitare“, care are loc „in vivo“, în tractusul genital femel. Capacitarea
este o etapă pregătitoare necesară, în urma căreia spermatozoizii dobândesc
capacitatea de a se fixa pe zona pelucidă a ovocitului şi suferă, apoi, reacţia
acrozomului.
Studiile de microscopie electronică au arătat că în decursul etapei de
„capacitare“ au loc două fenomene mai importante:
- modificări la nivelul membranelor spermatozoidului şi acrozomică
externă, precum, migrarea proteinelor de acoperire cu formarea de zone libere de
proteine, ceea ce permite fuziunea membranelor plasmatice şi acrozomică externă,
în momentul reacţiei acrozomului. Prin orificiile create, se elimină o cantitate din
colesterolul care antrenează o diminuare a raportului colesterol/fosfolipide,

95
asociate unei permeabilităţi membranare crescute pentru ionii de calciu. Pe baza
acestei constatări, toate mediile de capacitare folosite au în comun prezenţa
serului albuminic, care este un acceptor de colesterol;
- modificarea mişcării spermatozoidului care, din liniară (prin înşurubare)
traiectoria devine, mai mult sau mai puţin circulară, mişcare ce se datorează
creşterii permeabilităţii pentru ionii de calciu. Amplitudinea mişcărilor cozii se
măreşte, spermatozoidul fiind calificat ca „hipermobil“.
Diversele medii şi tehnici întrebuinţate pentru capacitarea spermatozoizilor
,,in vitro“ au în vedere faptul de a permite spermatozoizilor să sufere toate aceste
modificări şi mai ales să le menţină o mobilitate ridicată.
Capacitarea spermatozoizilor s-a obţinut prin incubarea acestora la 37oC,
timp de una-două ore, într-un mediu cu o forţă ionică crescută, ceea ce a dus la
detaşarea proteinelor de acoperire. Aplicarea acestei tehnici la sperma recoltată
prin ejaculare de la taur, a permis obţinerea unui procent de fecundaţie ridicat şi
naşterea de viţei normali, după transferul embrionilor obţinuţi prin fecundarea
gameţilor în astfel de medii. Diversele studii întreprinse pe această problemă, au
arătat că fenomenul de capacitare a spermatozoizilor ,,in vitro“ este mult diferit de
cea realizată „in vivo“. În oviduct, în condiţii naturale, fecundaţia are loc în
absenţa celulelor din cumulus, pe când „in vitro“ ovocitele nude, în momentul
contactului cu spermatozoizii sunt fecundate într-o proporţie foarte scăzută
comparativ cu ovocitele înconjurate de celule din cumulus. Aceasta presupune că
celulele din cumulus au probabil un rol în capacitarea „in vitro“ a
spermatozoizilor.
Majoritatea cercetătorilor care se ocupă de aspectele fecundaţei „in vitro“
folosesc sperma congelată, cu rezultate bune. Alte medii capacitante pentru
spermatozoizi sunt cele care conţin ionoforul calcic, asociat sau nu cu cafeina.
Totodată, cafeina pare a fi un agent capacitant mai apropiat de condiţiile naturale,
deoarece această substanţă se găseşte pe traiectul căilor genitale după ovulaţie. S-a
dovedit că spermatozoizii de taur posedă receptori pentru heparină, aceştia
acţionând în funcţie de doză şi uşurează pătrunderea calciului în spermatozoid. Se
mai foloseşte, în mediile capacitante, lichidul folicular, care, între altele, conţine şi
heparină.
Un nivel de capacitare satisfăcător se obţine atunci când se practică o
concentraţie ridicată de spermatozoizi în mediu, care trebuie să fie de 3-4 miliarde
spermatozoizi/ml, când nivelul fecundaţiei atinge 87% dintre ovocite.

3.1.4. Fecundaţia şi cultura „in vitro“ a embrionilor

Fecundarea se realizează prin cultura timp de o zi într-un mediu special a

0,1ml suspensie de spermatozoizi, cu concentraţie ridicată, împreună cu ovocite
mature, în atmosferă de 5%CO2, 5%O2 şi 90%N2.
După 24 de ore de cultură împreună cu spermatozoizii, ovocitele fecundate
sunt transferate într-un mediu special în vederea dezvoltării ulterioare. Ovocitele
se examinează la stereolupă şi sunt considerate ca fecundate atunci când se
constată:
- prezenţa spermatozoizilor în spaţiul perivitelin;
- prezenţa spermatozoizilor în ovoplasmă;
- prezenţa pronucleilor şi apariţia segmentaţiei.
„In vivo“, după fecundaţie, embrionul începe dezvoltarea sa în oviduct,
înainte de a ajunge în uter (ziua 4-5 la rumegătoare), în stadiul de morulă tânără.
„In vitro“, oricare este mediul de cultură folosit, zigoţii se blochează în
stadiul de 8 celule. Pentru mult timp, singurul mijloc de a asigura depăşirea

96
stadiului de blocaj evolutiv l-a constituit transferul tinerilor zigoţi în oviductul
unei gazde intermediare (iepuroaică) şi apoi transferul lor în uterul femelelor
receptoare. Experienţele au dovedit că cultura zigoţilor de rumegătoare pe un strat
de celule tubare a permis obţinerea blastociştilor şi a nou-născuţilor, după
transferul la femelele receptoare. Totodată s-a demonstrat că prin co-cultura
zigoţilor cu vezicule trofoblastice permitea la circa 40% dintre aceştia să
depăşească stadiul de 8 celule (Marquant B. şi colab.,1991).
Ouăle fecundate „in vivo“, apoi cultivate „in vitro“ pe un strat de celule
prelevate din oviduct, unde evoluează până la stadiul de blastocist, au un aspect
morfologic normal. Totuşi, studiul histologic atent a relevat faptul că aceşti
blastocişti, comparativ cu cei prelevaţi „in vivo“ sunt alcătuiţi dintr-un număr
redus de celule, multe dintre ele pe cale de degenerare. Însă cultura embrionilor pe
un strat de celule tubare, apoi uterine şi adiţionarea unui factor de creştere în
mediul de cultură a permis realizarea unui nivel important de dezvoltare până la
stadiul de blastocist ca şi a unui nivel de ecloziune, comparabil cu cel realizat „in
vivo“. Aceste experienţe demonstrează faptul că oviductul nu îndeplineşte un rol
specific în trecerea de la starea de blocaj spre stadiile ulterioare evolutive,
deoarece blastociştii pot fi obţinuţi şi prin co-cultura cu celule trofoblastice, din
cumulus, ca şi cu celule prelevate din oviduct.

3.1.5. Transferul embrionilor obţinuţi „in vitro“

Se face în uterul femelelor receptoare, din aceeaşi specie, a cărei ciclu

sexual a fost sincronizat cu vârsta embrionilor obţinuţi „in vitro“.
Nivelul gestaţiei în urma transferului sincron şi asincron a embrionilor bovini
cultivaţi „in vitro“ arată că nivelul cel mai ridicat de gestaţii s-a obţinut atunci
când femelele receptoare se găsesc în ceea ce priveşte ciclul sexual, în întârziere
cu una-două zile, faţă de vârsta teoretică a embrionilor (tab. 1).
Embrionii obţinuţi conţin un număr mai redus de celule, cu toate că
morfologic apar normali, de aceea nivelul gestaţiei este mai ridicat atunci când
receptoarele sunt din punct de vedere al ciclului sexual în întârziere, în raport cu
vârsta teoretică a embrionului. Aceasta evidenţiază faptul că mediile de cultură
folosite nu sunt adecvate integral. Nivelurile de dezvoltare a embrionilor obţinuţi
„in vitro“ transferaţi receptoarelor şi a gestaţiei sunt mai scăzute comparativ cu cei
obţinuţi după transferul de embrioni „in vivo“.
Tabelul 1
Nivelul gestaţiei după transferul sincron al embrionilor bovini după
maturare, fecundare şi cultură „in vivo“ în condiţiile transferului a câte 2
embrioni/receptoare (Kajihira şi colab.,1990 cit. de Marquant B. şi colab.,
1991)
Sincronism între stadiul de
Număr de Gestaţii
dezvoltare al embrionilor şi stadiul
receptoare (%)
ciclului sexual al receptoarelor
-2,5 8 63
-2,0 22 82
-1,5 17 59
-1,0 27 59
0 la +1 13 46

97
 Pe ansamblul aplicării acestei biotehnici, nivelurile gestaţiei sunt mai slabe
în raport cu numărul ovocitelor folosite, chiar atunci când zigoţii sunt cultivaţi în
oviductul unei gazde intermediare.

3.1.6. Importanţa, perspectivele şi aplicaţiile fecundaţiei

„in vitro“

Contrar ameliorărilor tehnice aduse în ultimii ani acestei biotehnici,

randamentul global rămânea relativ scăzut, fapt ce a încetinit ritmul aplicării în
practică pe o scară mult mai mare. Cercetările ulterioare trebuie să fie orientate,
mai ales, spre creşterea randamentului diverselor etape, în particular cea a culturii
embrionilor.
Cu toate dificultăţile întâmpinate, fecundarea „in vitro“ rămâne un necesar
şi indispensabil stadiu pentru înţelegerea diferitelor fenomene, îndeosebi a
stadiilor dezvoltării iniţiale a embrionului.
La bovine, folosirea pentru fecundaţia „in vitro“ a ovocitelor provenite de
la femele fără valoare genetică (recoltate de la abator) permite stabilirea unui
diagnostic precoce a fertilităţii taurilor folosiţi la însămânţări artificiale. Într-
adevăr, s-a pus în evidenţă o corelaţie între nivelul dezvoltării globale „in vitro“
(numărul de blastocişti/număr ovocite supuse fecundării) şi fertilitatea taurilor „in
vivo“ (nivelul NR% la două-trei luni).
Tehnica maturării „in vitro“ permite producerea la preţuri scăzute a unui
număr mare de ovocite care pot fi utilizate ca receptoare de nuclei ai embrionilor
proveniţi de la vacile cu înalt potenţial genetic, în cursul clonării. Acest aspect este
valorificat comercial de unele firme americane.
Puncţia foliculilor antrali, pe animalul în picioare, prin folosirea metodelor
endoscopice sau ecografice transvaginale permite folosirea femelelor donatoare de
ovocite de un înalt potenţial genetic, într-un număr ridicat. Acest tip de colectare
şi maturare „in vitro“ a ovocitelor va deveni rentabil numai atunci când
randamentele realizate vor permite producerea, pe donatoare, a unui număr de
embrioni superior celui obţinut în prezent prin superovulare, fecundaţie „in vivo“
şi colectare transcervicală a zigoţilor.
Prin practicarea acestei biotehnici există posibilitatea reducerii numărului
necesar de spermatozoizi pentru a obţine o fecundaţie, şi în consecinţă, folosirea
cu intensitate sporită a spermei provenită de la animale valoroase pentru
fecundarea unui număr crescut de ovocite, comparativ cu celelalte biotehnici
(însămânţări artificiale şi transfer de embrioni).
Totodată, fecundaţia „in vitro“ va permite în viitorul apropiat
intensivizarea procesului de ameliorare genetică a efectivelor de animale.
Prin această biotehnică, se pot obţine mai multe ovocite de la aceeaşi
femelă, ovocite care pot fi fecundate cu spermatozoizi proveniţi de la mai mulţi
reproducători, fapt ce ar constitui un mare avantaj pentru testarea reproducătorilor
masculi şi femeli.
Microinjecţia de spermatozoizi în ovocitele maturate „in vitro“ reprezintă
o altă cale de obţinere de embrioni normali. După activarea ovocitei, ouăle au fost
cultivate până la stadiul de morulă-blastocist şi transferate la femele receptoare,
obţinându-se, deja, unele rezultate.
Posibilitatea de a avea, după fecundaţia „in vitro“, un număr crescut de
embrioni într-un stadiu precis de dezvoltare prezintă un mare avantaj pentru o altă
biotehnică de reproducţie, transgeneza. Într-adevăr, microinjecţia artificială a unei
gene se efectuează în stadii precise de dezvoltare, în general în stadiul de doi
pronuclei sau de două blastomere. Deja, unele echipe de cercetători şi-au propus

98
să folosească spermatozoidul ca vector al genei ce urmează a fi transferată, în
cazul fecundaţiei „in vitro“, rezultate încurajatoare obţinându-se pe şoareci.
Oricare ar fi biotehnicile utilizate (clonaj transgeneză), rezultatul este
totdeauna un ou în stadiul de una-două celule pe care trebuie testată dezvoltarea
ulterioară prin tehnici mai puţin costisitoare, comparativ cu transferul pe cale
chirurgicală în oviductul unei femele receptoare.
Maturarea ovocitelor, fecundaţia „in vitro“ şi cultura embrionilor obţinuţi
sunt etape de mare interes pentru mamiferele domestice, însă dirijarea acestor trei
etape prezintă importanţă pentru dezvoltarea tehnicilor de clonare şi transgeneză.

3.2. Bisecţia embrionilor

Tehnicile de micromanipulare perfecţionate şi simplificate în ultimul timp,

au făcut posibilă microchirurgia embrionară. Micromanipulările sunt facilitate de
faptul că ouăle (zigoţii) majorităţii speciilor de mamifere sunt circumscrise de o
zonă pelucidă acelulară. Zona pelucidă îndeplineşte mai mult atribuţii referitoare
la protecţia fizică a zigotului. Rezistenţa acestei membrane permite menţinerea
oului
în depresiunea extremităţii unei micropipete fără a afecta structura internă a oului.
Această însuşire uşurează mult intervenţia microinstrumentelor. Prin practicarea
tehnicilor de micromanipulare, în prezent se poate interveni pe zigot pentru:
- obţinerea jumătăţilor monozigote, prin bisecţie;
- sexarea embrionului;
- producerea de himere;
- obţinerea de indivizi transgenici;
- producerea clonelor.
Bisecţia embrionilor
constă în secţionarea în două
jumătăţi a zigoţilor aflaţi în
stadiul de morulă târzie sau de
blastocist tânăr (6-8 zile) (foto
25). Această biotehnică are ca
bază fiziologică constatarea că
la mamifere, în mod natural,
apar jumătăţi şi uneori chiar
triplete monozigote. Primele
studii făcute pe embrioni de
şoareci şi iepure au arătat că un
Foto 25 Bisecţia embrionilor blastomer protejat de propria
zonă pelucidă este capabil de a
se dezvolta şi de a produce un
individ normal. Însă, un blastomer izolat, transferat fără zona pelucidă sau
reintrodus într-o zonă pelucidă larg deschisă este incapabil de evoluţie (Nibart M.,
1991).
Ozil, 1982 (cit de Nibart M.,1991) a propus secţionarea în două părţi egale
a embrionilor de 6-8 zile, stadiu în care rolul zonei pelucide nu mai prezintă
importanţă. El a dezvoltat un sistem de microchirurgie cu ajutorul mai multor
instrumente, folosite în aşa fel încât să lezioneze cât mai puţin posibil zona
pelucidă şi repunerea fiecărui demiembrion în câte o zonă pelucidă. Rezultatele
obţinute, exprimate în G% după transfer, au fost considerate ca excelente: 27 de
produşi pentru 25 de embrioni secţionaţi. Numeroşi autori au continuat bisecţia
99
embrionilor bovini simplificând tehnica, ce este formată numai din două
microinstrumente.
Voelkel şi colab., (1948), Baker şi Shea (1985), Picard şi colab.,(1985, cit.
de Nibart M., 1991) ş.a. au demonstrat că nu mai este necesară repunerea
embrionului într-o zonă pelucidă înaintea transferului, ceea ce a simplificat mult
metoda.
Cu ajutorul a două micromanipulatoare, unul purtând micropipeta, celălalt
microcuţitul, un operator antrenat poate obţine în câteva minute doi
demiembrioni, viabili, în condiţiile bisecţiei unice a embrionilor de bună calitate,
apreciaţi în stadiul de morulă compactă-blastocist tânăr.
După transferul celor două jumătăţi la femelele receptoare, nivelurile
gestaţiei se situează între 50% şi 65%, însă pentru majoritatea autorilor, nivelurile
gemelarităţii au fost de 50%. Nu s-au înregistrat diferenţe în nivelul obţinerii de
gemeni, indiferent dacă aceştia au fost repuşi amândoi în cornul uterin ipsilateral
ovarului cu corp galben sau repus fiecare în câte un corn uterin al aceleiaşi
receptoare.
S-au obţinut unele rezultate (50% gestaţii) după transferul jumătăţilor de
embrion conservate prin refrigerare timp de 24 de ore la 2-4 oC. Congelarea în azot
lichid a jumătăţilor de embrion repuse în zona pelucidă, a condus la obţinerea unui
nivel scăzut de gestaţii (20%). Dacă înainte de congelare embrionii sunt menţinuţi
într-un mediu de cultură (2-24 de ore), nivelul gestaţiilor obţinute este mult mai
ridicat.
Rezultatele obţinute arată că embrionii buni de 40-80 de celule, sunt
capabili, prin bisecţie, să dea doi demiembrioni care, transferaţi în uterul
receptoarelor, să evolueze normal, cu toate că au de recuperat circa jumătate din
celulele embrionului iniţial. Rezultate în obţinerea gemenilor monozigoţi, sunt
superioare când se lucrează cu blastocişti tineri, comparativ cu stadiul de morulă
tânără.
Încercarea de a obţine gemeni tripli sau cvadrupli, prin secţionarea
embrionilor în stadiul de 40-80 de celule nu s-a soldat cu rezultate satisfăcătoare,
ceea ce arată că această biotehnică este limitată de numărul restrâns de gemeni (2)
ce pot fi obţinuţi dintr-un singur embrion. Dacă, de exemplu, considerăm în medie
pe donatoare 5 embrioni viabili (trei buni şi doi medii), după transferul acestora se
obţin în principiu trei viţei. Prin bisecţia celor trei embrioni buni şi transferul
fiecărei jumătăţi la câte o receptoare, este posibil să se obţină tot trei viţei (50%
gestaţie) sau, per total 4 viţei. Câştigul de un viţel presupune existenţa a 8
receptoare, în loc de 5. Dacă nivelurile gestaţiei sunt mai scăzute (50%-30%)
sporul de un viţel obţinut pe o donatoare superovulată este anulat. În condiţiile
atingerii unor rezultate normale, prin practicarea bisecţiei embrionilor se pot
obţine, în medie, 4 viţei pe donatoare în loc de trei viţei, ceea ce presupune un
câştig de 33% a numărului descendenţilor proveniţi de la fiecare femelă
superovulată. În aceste condiţii, o selecţie bine dirijată, acceptă cu rezerve
păstrarea a mai mult de un singur exemplar al unei familii clonate, din cauza
reducţiilor majore survenite în varianţa genetică şi în sporirea consangvinităţii. În
aceste circumstanţe, producerea unor familii biclonate pentru toţi indivizii
distincţi genetic se poate face numai prin reducerea la jumătate a numărului unor
astfel de indivizi, prin aceasta scăzând însăşi intensitatea selecţiei. Continuarea
bisecţionării embrionilor (clonării) erodează intensitatea selecţiei prin reducerea
progresului genetic, măreşte consangvinitatea, scăderea intensităţii selecţiei
nefiind compensată prin câştigurile obţinute în precizia selecţiei sau exactităţii
rezultatelor ei (Woolliams G.A., 1989).

100
 Biotehnica bisecţiei embrionilor este totuşi bună pentru producerea
adevăraţilor gemeni, necesari testării unor preparate farmaceutice sau a furajelor,
factorul genetic fiind înlăturat.
Obţinerea himerelor s-a realizat prin microchirurgie, la rumegătoare şi
suine, constând în amestecul de celule embrionare de la specii diferite.

3.3. Sexarea embrionilor

Determinarea sexului embrionului nu este realizabilă decât la vârsta la care

se face transferul acestuia (6-8 zile). Este considerată ca o descoperire economică
de mare importanţă şi constă în prelevarea câtorva celule care sunt investigate
citogenetic, imunologic, enzimologic etc. în vederea determinării sexului
produsului de concepţie încă din acest stadiu incipient de dezvoltare.
Metoda genetică (cariotipică) se bazează pe recunoaşterea citologică a
cromozomului y, specific masculilor. Este vorba de o tehnică ce permite
efectuarea sexării zigoţilor, pornind de la un număr mic de celule prelevate de la
zigoţi şi care să nu compromită dezvoltarea ulterioară a embrionului. Recent,
folosirea unei „sonde“ moleculare specifice cromozomului y la bovine, pare să
răspundă tuturor aşteptărilor. Unele echipe de cercetare acţionează în direcţia
trierii spermatozoizilor purtători ai cromozomului x şi y , pe baza diferenţei
acestora în ce priveşte conţinutul în ADN. Această metodă, împreună cu
fecundaţia „in vitro“ ar furniza un procedeu ideal care să răspundă necesităţilor
zootehnice moderne.
Metoda imunologică constă în căutarea pe suprafaţa celulelor masculine a
antigenului de citocompatibilitate, prin folosirea unor anticorpi monoclonali
specifici pentru acest tip de antigen.
Metoda enzimologică se bazează pe faptul că unele enzime celulare sunt
codificate de către gene aparţinând cromozomului x. Cantitatea acestor enzime
este , deci, de două ori mai mare în celulele femele decât în celulele mascule.
Determinarea activităţii acestor enzime într-un blastomer izolat a permis sexarea
embrionilor într-o proporţie ridicată.
Tehnica amplificării ADN (PCR). După descoperirea posibilităţilor de
amplificare enzimatică dirijate de ADN-ul celular, unii cercetători au dezvoltat o
tehnică de sexare prin amplificarea enzimatică (PCR-Polimerase Chaine Reaction)
a secvenţei lor specifice. Sexajul este efectuat pe 5-10 celule prelevate prin
biopsia embrionilor de bună calitate. Plecând de la aceste celule, determinarea
sexului se sprijină pe detectarea unei secvenţe specifice a ADN-ului
cromozomului y printr-o sondă moleculară complementară. Această secvenţă este
amplificată de PCR. ADN-ul amplificat este separat prin electroforeză şi
vizualizat prin fluorescenţă.
Având în vedere tehnicile pentru sexare (evidenţierea ADN specific) şi
sensibilitatea specifică (amplificarea ADN de ordinul a 10 5), biopsia trebuie să fie
realizată în cele mai bune condiţii igienice şi tehnice.
Sexarea embrionilor înainte de implantare, oferă posibilitatea stabilirii
raportului de sexe într-o populaţie, în sensul dorit de crescători funcţie de
necesarul de animale de reproducţie, carne, lapte etc.

3.4. Transplantarea nucleilor şi obţinerea de clone

101
 Clonajul embrionar constă în producerea mai multor animale pornind de la
un singur embrion. Acestea pot fi obţinute prin simpla secţiune sau disociere a
unui embrion, în stadiul de preimplantare (bisecţia embrionilor). Prin această
metodă s-au produs numeroase perechi de viţei gemeni, însă foarte rar s-au putut
obţine triplete sau gemeni cvadrupli. Teoretic, tehnica transferului nucleului
permite obţinerea unui număr mare de indivizi plecând de la un singur embrion,
având în vedere faptul că patrimoniul genetic al tuturor nucleilor unui embrion
tânăr este identic, în sensul că poartă aceeaşi informaţie genetică. Transferul
nucleilor celulelor provenite de la acelaşi embrion în mai multe ovocite enucleate
şi activate, este urmat de evoluţia ovocitelor spre indivizi genetic identici.
Posibilitatea obţinerii de serii de animale identice genetic prezintă interese
multiple pentru zootehnie. Astfel, în activitatea de selecţie, folosirea unor clone,
chiar limitate numeric, oferă posibilitatea evaluării cu înaltă precizie a valorii
reproducătorilor. Animale cu acelaşi genotip, întreţinute în ferme diferite, sunt
excelenţi subiecţi de studiere a influenţei factorilor de mediu asupra
performanţelor acestora. Totodată, obţinerea mai multor copii a reproducătorilor
foarte valoroşi va contribui la creşterea şi difuzabilitatea progresului genetic, însă
cu reversul micşorării patrimoniului genetic al efectivelor de animale.
Pentru producţie, plecând de la rasele de carne, embrionii proveniţi de la
un genitor cu o excelentă conformaţie (caracter cu coeficient mare de
heritabilitate) vor putea fi multiplicaţi prin clonare şi transplantaţi, cu producerea
unor loturi de animale cu carcase omogene şi de calitate superioară.
De asemenea, pe termen lung, obţinerea şi comercializarea embrionilor
clonaţi în mari serii, asociată cu maturarea „in vitro“ vor permite scăderea
considerabilă a transferului embrionar.
Briggsi şi King (1952) au arătat că nucleii prelevaţi, în stadiul de blastulă,
la broască şi grefaţi în ovocite, pot să-şi continue dezvoltarea până la stadiul de
blastulă, iar în 1962 Mc Kinnel a obţinut, prin aceeaşi metodă, broaşte adulte.
Pentru embrionul de mamifere, în 1986 Willadsen S., la Cambridge a
obţinut pentru prima dată trei miei după transfer de nuclei, proveniţi de la un
embrion în stadiul de 8 celule (Heyman Y. şi colab., 1991).
La taurine, s-au obţinut de către diferite echipe de cercetători clone
constituite din 8-9 viţei, iar la iepure s-a obţinut o clonă de 6 indivizi, plecând de
la un embrion congelat în stadiul de morulă.
Transferul de nuclei parcurge trei etape (Heyman Y. şi colab., 1991):
- obţinerea de ovocite enucleate destinate de a primi nucleii;
- izolarea nucleilor embrionului donator;
- reconstituirea de serii de embrioni monocelulari.

3.4.1. Pregătirea ovocitelor receptoare

Prima operaţie constă în extragerea genomului maternal al ovocitei

„receptoare“. Pentru aceasta, se folosesc ovocite mature care, în absenţa
fecundaţiei sau a activării, se găsesc blocate în stadiul de metafază II a meiozei.
Retragerea nucleului poate fi realizată prin micromanipulare, pătrunzând cu vârful
unei micropipete în interiorul celulei şi aspirând uşor cromozomii. Pentru a se
evita ruperea membranei viteline a ovocitului, cum se întâmplă cel mai adesea,
ovocitele sunt pretratate cu droguri care inhibă polimerizarea microfilamentelor şi
microfibrilelor scheletului celular.

102
 Ovocitele prelevate „in vivo“, imediat după ovulaţie sau obţinute prin
maturare „in vitro“ sunt debarasate de celulele lor periovocitare printr-un
tratament enzimatic cu hialuronidază şi apoi incubate în prezenţa cytochalasinei B
(5-7 µg/ml). După denudare, fiecare ovocit este enucleat, prin imobilizare în
depresiunea unei micropipete, apoi cu cea de-a doua micropipetă se puncţionează
zona pelucidă, se aspiră globulul polar împreună cu o fracţiune de citoplasmă
adiacentă, conţinând cromozomii metafazici.

3.4.2. Izolarea nucleilor embrionului donator

Embrionul, selecţionat ca donator de nuclei, este prelevat în stadiul de

morulă, când posedă 16-64 de celule, funcţie de specie şi vârsta acestuia. În acest
stadiu evolutiv, punerea în mişcare a genomului embrionar deja s-a produs. Se
folosesc şi embrioni congelaţi şi care se găsesc în stadiul de morulă.
Embrionul donator este debarasat cu multă atenţie de zona pelucidă,
folosind o soluţie de tyrode acid. În acest stadiu, celulele au început deja să
stabilească între ele relaţii funcţionale (de exemplu gap-joncţion). Pentru
disociere, embrionul este incubat timp de treizeci de minute, într-un mediu lipsit
de ioni de calciu, după care blastomerele pot fi separate, fără leziuni, prin
intermediul unor micropipete.

3.4.3. Reconstituirea embrionilor

După separarea blastomerelor, în cel mai scurt timp se introduce fiecare
blastomer în interiorul zonei pelucide a ovocitei „receptoare“, enucleate în
prealabil.
După introducerea blastomerului sub zona pelucidă, fuziunea
membranelor celulei donatoare şi ovocitul receptor se realizează prin
electrofuziune. Pentru aceasta, ovocitul se plasează între doi electrozi şi este supus
la unul sau mai multe impulsuri foarte scurte de curent continuu. Stimulii electrici
provoacă pori membranari, destabilizând straturile de fosfolipide juxtapuse, iar
membranele fuzionate permit astfel nucleului donator să pătrundă în noul său
mediu citoplasmatic. Pe de altă parte, stimularea electrică activează ovocitul
receptor, prin declanşarea mecanismelor de reprogramare a nucleului transplantat.
Electrofuziunea se realizează într-un mediu izotonic şi se observă în următoarele
treizeci de minute de la stimulare şi estimată, fie prin umflarea nucleului donator
în noul său mediu citoplasmatic, fie prin terminarea diviziunii celulare şi apariţia
stadiului de două celule.
În prezent, unul din factorii limitanţi în aplicarea acestei biotehnici îl
reprezintă numărul relativ redus de ovocite „receptoare“. Creşterea numărului de
ovocite ,,receptoare“ se poate obţine prin maturarea „in vitro“ a acestora, pornind
de la ovarele recuperate în abator de la femelele sacrificate. Tot în plan practic,
este de mare interes posibilitatea congelării acestor ovocite, astfel încât să se
dispună în orice moment de necesarul de ovocite receptoare. Un alt factor limitant
este reprezentat de numărul relativ redus de celule ale embrionilor de la care
urmează să se transfere nucleii.
Cu toate dificultăţile pe care le ridică, clonajul embrionilor creează o nouă
cale în optimizarea reproducerii animalelor.

103
 3.5. Transgeneza

Ameliorarea efectivelor de animale s-a bazat, tradiţional, pe progresele

înregistrate în selecţia genetică, dirijarea reproducţiei, echilibrul raţiilor de hrană,
etc. Tehnicile geneticii moleculare oferă, în prezent, noi posibilităţi care încep a fi
exploatate eficient. Astfel, sondele moleculare vor permite cunoaşterea
patrimoniului genetic al animalelor iar multiplele combinaţii rezultate din mutaţie
şi asocierea secvenţelor de ADN oferă multe posibilităţi de reprogramare a unei
celule sau a unui organism întreg. Astfel, dacă o genă izolată este introdusă într-o
celulă, aceasta va sintetiza o nouă proteină şi caracteristicile acestei celule vor
putea fi astfel modificate. De asemenea, dacă o genă izolată este introdusă într-un
organism întreg, însuşirile genetice ale acestuia vor fi modificate. Această operaţie
poartă numele de transgeneză. Gena străină, introdusă în noul organism, va fi
transmisă la descendenţi obţinându-se în acest fel o linie de animale care au
însuşiri biologice noi.
Primele observaţii în acest domeniu s-au făcut în 1981 pe şoareci. Este
posibilă, prin transgeneză, obţinerea de noi animale, perspectivele deschise de
această nouă biotehnică fiind considerabile.
Obţinerea de animale transgenice include mai multe etape:
- izolarea sau construcţia genei de transferat;
- colectarea embrionilor;
- introducerea genei în embrioni;
- transferul embrionului la o femelă receptoare;
- identificarea transgenei la nou-născuţi;
- măsurarea expresiei transgenei;
- stabilirea de linii homozigote, pornind de la animale transgenice
fondatoare.
Izolarea sau construcţia genelor se face prin tehnici genetice adecvate
care permit atât izolarea cât şi mutarea după voinţă a oricărei gene. O genă
funcţională material sau reconstruită conţine totdeauna aceleaşi elemente:
regiunea regulatore, regiunea codantă şi terminatorul. Astfel, regiunile care
participă la reglarea transcripţiei genei se situează în amonte de zona codantă.
Colecţia de embrioni. Transgeneza fiind o operaţie cu randament scăzut,
sunt necesari mai mulţi embrioni pentru a economisi la maximum femele
donatoare. Embrionii pot fi obţinuţi în mai multe moduri:
- prelevând ovare de la femelele sacrificate la abator;
- prin maturarea ovocitelor „in vitro“;
- prin practicarea fecundaţiei „in vitro“.
Introducerea genei în embrion se poate realiza prin microinjecţie, prin
folosirea de vectori retrovirali sau prin folosirea celulelor ES (Embryo stem cels).
Microinjecţia constă în injectarea directă a soluţiei de ADN în pronucleul
mascul, care este mai mare, mai apropiat de periferia zigotului în momentul
injecţiei. Un obstacol important la injectare este dat de opacitatea ouălor, ceea ce
face dificilă vizualizarea celor doi pronuclei.
Virusurile, înainte de a folosi mecanismul celular pentru replicarea lor,
sunt ,,a priori“ excelenţi vectori pentru a introduce gene străine într-o celulă.
Retrovirusurile se încorporează în genomul gazdă, în general, într-o singură copie
şi fără rearanjare, deci sunt extrem de utile pentru introducerea genei străine în
celulele somatice în cultură şi apoi se reintroduc aceste celule în individ.
Utilizarea celulelor ES, constă în izolarea celulelor unui embrion precoce
şi cultivarea lor în condiţii în care celulele nu se diferenţiază. Când aceste celule
ES sunt reintroduse într-un embrion precoce participă la dezvoltarea embrionului,
dând naştere la animale himere. O genă străină poate fi introdusă, prin procedee

104
clasice de transfer, în celule ES, în cultură. Aceste celule reintroduse în embrion
constituie vectorul transgenei. Animalele himere transgenice care rezultă sunt
mozaicate. Descendenţii lor moştenesc sau nu transgena numai dacă celulele
germinale parentale conţin sau nu transgena.
Transgenele introduse, prin una din aceste metode, se inseră în genomul
gazdă în poziţii imprevizibile.
Introducerea transgenelor se mai poate realiza şi prin alte mijloace. Unul
dintre aceste mijloace constă în a pune în contact ADN-ul şi spermatozoizii şi a
proceda apoi la o fecundaţie „in vitro“sau „in vivo“. O altă cale prin care gena
străină poate fi transferată în celule în cultură, cu o eficacitate înaltă, este
electroporaţia. Tehnica aceasta constă în a supune celulele incubate în prezenţa
ADN, la câmpuri electrice care destabilizează membrana şi creează pori prin care
ADN-ul pătrunde în celule. Această tehnică se foloseşte şi pentru spermatozoizii
şi embrionii de mamifere.
Detectarea transgenelor se face prin metode clasice ale geneticii
moleculare. Ele constau în a hibrida un fragment de ADN complementar genei,
radioactivat, cu ADN-ul celular total.
Detecţia produşilor transgenici constă în a evalua expresia transgenelor
prin măsurarea cantităţii de ARN corespondent. Proteinele derivate din transgene
pot fi măsurate în sânge, dacă sunt secretate, cu ajutorul testului RIA
(radioimunoanaliză). Aceste metode permit să se determine în care organ, tip
celular şi moment al dezvoltării, transgena se exprimă.
Tansgeneza a fost încercată pe multe specii de animale, cu anumite
succese. Randamentul biotehnicii, evaluat în număr de celule transgenice obţinute,
raportat la numărul embrionilor microinjectaţi, variază mult cu colectivele de
cercetători. O evaluare sumară a acestui randament arată că este nevoie de circa
10 şoareci adulţi pentru a spera obţinerea unuia transgenic, 40 de oi pentru un miel
transgenic şi 40 de vaci pentru un viţel transgenic. Aceste rezultate arată că preţul
de cost al unui produs transgenic este foarte ridicat.
Prin transgeneză s-a încercat obţinerea de animale cu un ritm de creştere
accelerat, cu o producţie de lapte mai mare şi cu un conţinut în proteină mai
ridicat, cu o producţie de carne mai bună, cantitativ şi calitativ, rezistente la
diverse maladii etc. Cu toate rezultatele încurajatoare obţinute la diverse specii,
această biotehnică se găseşte doar la perioada de început, necesitând multe
ajustări, astfel încât randamentul obţinut să micşoreze preţul de cost al produsului
transgenic şi care să fie conform cu normele sanitare şi sanitar-veterinare
internaţionale etc.

105
 BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1. Aughtry, S.D., 1987 - Embryo Transfer, 2, 3, p 3-4

2. Baril, G. şi colab., 1993 - Manuel de formation pour l'insémination artificielle
ches les ovins et les caprins. Etude FAO, Roma.
3. Baril, G. şi colab, 1993 - Manuel de formation practique pour la
transplantation embryonnaire chez la brebis et la chevre. Etude FAO,
Roma.
4. Bogdan, Al. şi colab., 1981 - Reproducţia animalelor de fermă. Edit.Scrisul
românesc, Craiova
5. Bogdan, Al. şi colab.,1984,1985 - Fertilitatea, natalitatea şi prolificitatea în
zootehnie, vol I şi II, Edit Dacia, Cluj-Napoca
6. Boitor, I., 1979 - Endocrinologia reproducţiei la animalele de fermă. Edit.
Ceres, Bucureşti
7. Bunaciu, P., 1977 - Însămânţarea artificială a găinilor de reproducţie întreţinute
în baterii. Rev. de creştere a animalelor, nr. 10
8. Cârlan, M., 1982 - Sincronizarea căldurilor şi ovulaţiei la taurine. Redacţia de
propagandă tehnică agricolă, Bucureşti
9. Confederat Margareta, 1998 - Cercetări cu privire la influenţa alimentaţiei
asupra supravieţuirii embrionilor la caprine în condiţiile efectuării
transferului de embrioni. Teză de doctorat, Univ. Agron. şi de Med. Vet.,
Iaşi
10. Drugociu, G. şi colab., 1977 - Patologia reproducţiei şi clinică obstetricală.
Edit. Did. şi Ped., Bucureşti
11. Dumitrescu, I. şi colab., 1976 - Reproducţia la bovine. Edit Ceres, Bucureşti
12. Dumitrescu, I. şi colab., 1978 - Însămânţările artificiale la animale. Edit.
Ceres, Bucureşti
13. Dumitrescu, I., 1987 - Reproducţia la cabaline. Edit. Ceres, Bucureşti
14. Elsden Peter, R., 1987 - Manual for embryo transfer, 6599 Country Rd. 29C,
Bellvue, , USA
15. Feredean, T., 1974 - Reproducţia la porcine. Edit. Ceres, Bucureşti
16. Feredean, T., Drume, Ch., 1977 - Transferul de embrioni la animale. Edit.
Ceres, Bucureşti
17. Gluhovschi, N. şi colab., 1972 - Biologia şi patologia reproducţiei. Edit. Did.
şi Ped.,Bucureşti
18. Groza, {t. I., 1996 - Actualităţi şi perspective în biotehnologia transferului de
embrioni la specia ovină. Edit. Ceres, Bucureşti
19. Halga, P. şi colab., 1999 – Alimentaţia şi reproducţia la erbivore domestice.
Edit. Dosoftei, Iaşi
20. Hansel, W. şi colab.,1983 - Fiziologia ciclului estral. Rev. Soc. de Med. Vet.,
Bucureşti
21. Haubebine, L. M., 1991 - Rec. Med. Vet., 167(314), 323-333
22. Heyman, Y., Chesne, Renard, J.P.,1991 - Rec. Med. Vet., 167(314), 315-322
23. Liciu, Gh., Roşca, O., 1988 - Ghid tehnic privind însămânţarea la ovine şi
caprine. Edit. Ceres, Bucureşti
24. Liciu, GH.,Roşca, O., 1998 – Tehnica însămânţării artificiale la bovine –
Ghid practic. Edit. Ceres, Bucureşti.
25. Liciu, GH., Roşca, O., 1999 - Tehnica însămânţării artificiale la suine - Ghid
practic. Edit. Ceres, Bucureşti.

106
26. Mantea, {t., 1998 - Contribuţii la biotehnologia transferului de embrioni la
suine. Teză de doctorat, Fac. de Med. Vet., Bucureşti
27. Mapletoft, R. J., 1987 - Embryo Transfer, 2, 3, p. 4-6
28. Marquant, Le Guienne, 1991 Rec. de Med. Vet., Ian. 167, nr. 314, p. 303-
312
29. Nibart, M., 1991 - Rec. de Med. Vet., 167(314), 261-290
30. Paraipan, V., 1982 - Hormonoterapia în reproducţia animalelor. Edit. Ceres,
Bucureşti
31. Paraschivescu, M., 1969 - Reproducţia la ovine. Edit. Agro-Silvică, Bucureşti
32. Peyraud, J. C., 1986 - La transplantion embryonnaire s'implante, Elevage
2000, nr. 1, p. 47-49
33. Roşca, O ., 1994 - Biotehnica reproducţiei la porcine prin însămânţare
artificială. Edit. Ceres, Bucureşti
34. Runceanu, L.,1995 - Reproducţia şi patologia reproducţiei. Lito., Univ.
Agron. Iaşi
35. Sauveur, B., Reviers, M., 1988 - Reproduction des volailles et production
d'oeufs. INRA, Station de Recharches Avicoles, Paris
36. Seiciu, Fl. şi colab.,1989 - Reproducţia normală şi patologică la animalele
domestice, vol. I şi II, Edit. Ceres, Bucureşti
37. Tănase, D.,1993 - Biologia reproducerii animalelor şi transferul de embrioni .
Lito., Univ. Agron. Iaşi
38. Tănase, D.,1995 - Biologia şi patologia reproducerii animalelor. Curs, Lito.,
Univ. Agron. Iaşi
39. Vallet, J. Ch. şi colab., 1991 - Rec. Med. Vet., 167(314), 293-301
40. Woolliams, G. A., 1989 - Animal Production, t 48, partea I, p.31-36, Anglia

107