Lp 2

Diagnosticul bacteriologic: schema generală

Diagnosticul de laborator bacteriologic/micologic are mai multe etape, şi

anume:
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic.
Trebuie să se realizeze cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca
pacientului să i se fi administrat antibiotice sau chimioterapice, cât mai rapid şi
corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de
asepsie şi antisepsie, prelevând un anumit produs patologic în funcţie de
manifestarea clinică în cazul respectiv, de exemplu urină în cazul unei infecţii
urinare, materii fecale în cazul dizenteriei, spută în cazul tuberculozei sau
aspergilozei.
2. Pentru examenul microscopic se va realiza minim un frotiu din produsul
patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se va colora în coloraţia
Gram. Este preferabil să avem întotdeauna cel puţin încă un frotiu (de rezervă),
în special în cazul în care produsul patologic este „preţios” (LCR, produs
recoltat prin puncţie-biopsie etc). În cazul suspicionării unei infecţii
mycobacteriene este necesară realizarea unui al doilea frotiu, care se va colora
Ziehl-Neelsen. Frotiurile se examinează la microscopul optic, iniţial cu
obiectivul 40× pentru o analiză mai generală, pentru stabilirea câmpului
microscopic sau al zonei „de interes”, apoi cu obiectivul de imersie. Se notează
prezenţa diferitelor celule (eventual modificate faţă de normal, „burate” de
microorganisme), prezenţa celulelor inflamatorii (dovada reactivităţii
organismului, ex. leucocite, surprinzând eventual fenomenul de fagocitoză),
precum şi eventuala prezenţă a microorganismelor (bacterii, levuri,
pseudofilamente, micelii), care va fi interpretată cu precauţie, în contextul dat.
Atunci când produsul recoltat este reprezentat de sânge, urină sau materii fecale,
de regulă nu se realizează frotiuri fixate şi colorate. Spre exemplu, în cazul
materiilor fecale, se va face un preparat proaspăt (nativ) între lamă şi lamelă,
căutându-se în special prezenţa leucocitelor (dar şi a unor structuri care pot da
anumite informaţii cu privire la funcţionalitatea tractului digestiv). În cazul
suspicionării unei infecţii urinare, se va realiza un sediment urinar (după
centrifugarea urinei), care se va examina între lamă şi lamelă în vederea
aprecierii numărului de leucocite pe câmp microscopic, în cazul în care acestea
există, în vederea aprecierii prezenţei unor cilindrii leucocitari precum şi a altor
celule normale sau patologice, a prezenţei unor elemente fungice etc., date care
pot fi deosebit de utile în vederea unui diagnostic corect şi util pentru pacient.
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se va face în funcţie
de situaţie (mediile şi condiţiile de incubare se vor alege în funcţie de presupusul
microorganism pe care trebuie să-l izolăm; spre ex. în cazul în care infecţia este
produsă de microorganisme strict anaerobe, în lipsa condiţiilor anaerobe de
cultivare este imposibilă izolarea agentului etiologic). Pentru fungi trebuie
utilizate mediile potrivite şi o temperatură mai mică decât cea utilizată în cazul
bacteriilor. Cultivarea se va realiza în aşa fel încât să se poată obţine colonii
izolate (tehnica „însămânţării în poligon”) şi respectiv o cultură pură, care se va
identifica.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza
mai multor caractere:
a) Caractere morfologice: se va realiza un frotiu din colonia izolată, frotiu
care se va fixa şi colora Gram sau Ziehl-Neelsen, după caz, şi se va examina
microscopic. Prin examinarea frotiurilor se vor evidenţia numai microorganisme
cu formă şi tinctorialitate similară (în cazul germenilor cu polimorfism
important, ex. Proteus spp., pe frotiu vom observa aspecte morfologice diferite,
de la aspecte cocobacilare până la forme filamentoase). În cazul levurilor,
aspectul este cocobacilar, Gram-pozitiv, dar de dimensiuni mai mari.
b) Caractere de cultură: se vor examina coloniile izolate apărute pe mediile
de cultură solide şi care pot fi de tip S pentru majoritatea germenilor studiaţi
inclusiv pentru levuri, de tip R în cazul Corynebacterium diphteriae,
Mycobacterium tuberculosis şi Bacillus anthracis, de tip M în cazul bacteriilor
capsulate, de exemplu Klebsiella pneumoniae şi respectiv un aspect pufos în
cazul mucegaiurilor(detalii privind aspectele coloniilor microbiene sunt
prezentate în capitolele dedicate fiecărui gen în parte).
c) Caractere biochimice: acestea pot fi foarte variate de la o specie
microbiană la alta şi pot fi foarte utile spre exemplu în cazul diferenţierii
enterobacteriilor (introducerea în practică a „mediilor multi-test” permite
evaluarea mai multor caractere simultan, ex. mediile TSI, MIU, sistemele API
etc).
d) Caractere antigenice: caracterele antigenice vor fi examinate bazându-ne
pe structura şi antigenicitatea microorganismelor şi pe specificitatea reacţiilor
antigen-anticorp. Vom utiliza anticorpi cunoscuţi pentru a identifica antigenele
microbiene necunoscute. Spre exemplu, prin reacţii de aglutinare directă, pe
lamă, se pot identifica antigenele şi respectiv speciile şi tulpinile din genul
Shigella, Salmonella, Vibrio etc). Reacţii de aglutinare indirectă se pot utiliza
pentru detectarea în p.p. a streptococilor de grup A sau B etc., pentru detectarea
unor enterotoxine, pentru detectarea unor fungi (Cryptococcus
neoformans, Candida albicans, Aspergillus spp.) etc.
e) Caractere de patogenitate: putem examina capacitatea unui microorganism
de a elabora anumite substanţe cu rol în patogenitate (ex. coagulaza produsă
de Staphylococcus aureus) sau infecţia experimentală a unui animal de laborator
(ex. izolarea pneumococilor de la un pacient cu pneumonie după inocularea
sputei la şoarecele alb; în cazul în care în spută există pneumococi, animalul va
muri în 24-48 de ore, iar din sângele lui se va izola o „cultură pură”
de Streptococcus pneumoniae).
f) Sensibilitatea la un anumit bacteriofag specific (lizotipie);
 g) Alte caractere (identificate de ex. prin metode ale biologiei moleculare sau
alte metode moderne).
3. Antibiograma şi respectiv antifungigrama (testarea sensibilităţii la
antibiotice şi chimioterapice antibacteriene şi antifungice, în vederea stabilirii
tratamentului) se realizează de obicei prin metode difuzimetrice. În cazul unor
infecţii grave, antibiograma difuzimetrică trebuie să fie completată de
determinarea concentraţiei minime inhibitorii (CMI) şi respectiv bactericide
(CMB). În infecţii grave, cu potenţial fatal, poate fi necesară determinarea
nivelului de eficienţă pentru antibioticul utilizat, respectiv stabilirea nivelul de
eficienţă inhibitorie (NEI) şi nivelului de eficienţă bactericidă (NEB).