Diagnosticul de laborator bacteriologic/micologic are mai multe etape, şi
anume: 1. Recoltarea şi transportul produsului patologic. Trebuie să se realizeze cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să i se fi administrat antibiotice sau chimioterapice, cât mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de asepsie şi antisepsie, prelevând un anumit produs patologic în funcţie de manifestarea clinică în cazul respectiv, de exemplu urină în cazul unei infecţii urinare, materii fecale în cazul dizenteriei, spută în cazul tuberculozei sau aspergilozei. 2. Pentru examenul microscopic se va realiza minim un frotiu din produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se va colora în coloraţia Gram. Este preferabil să avem întotdeauna cel puţin încă un frotiu (de rezervă), în special în cazul în care produsul patologic este „preţios” (LCR, produs recoltat prin puncţie-biopsie etc). În cazul suspicionării unei infecţii mycobacteriene este necesară realizarea unui al doilea frotiu, care se va colora Ziehl-Neelsen. Frotiurile se examinează la microscopul optic, iniţial cu obiectivul 40× pentru o analiză mai generală, pentru stabilirea câmpului microscopic sau al zonei „de interes”, apoi cu obiectivul de imersie. Se notează prezenţa diferitelor celule (eventual modificate faţă de normal, „burate” de microorganisme), prezenţa celulelor inflamatorii (dovada reactivităţii organismului, ex. leucocite, surprinzând eventual fenomenul de fagocitoză), precum şi eventuala prezenţă a microorganismelor (bacterii, levuri, pseudofilamente, micelii), care va fi interpretată cu precauţie, în contextul dat. Atunci când produsul recoltat este reprezentat de sânge, urină sau materii fecale, de regulă nu se realizează frotiuri fixate şi colorate. Spre exemplu, în cazul materiilor fecale, se va face un preparat proaspăt (nativ) între lamă şi lamelă, căutându-se în special prezenţa leucocitelor (dar şi a unor structuri care pot da anumite informaţii cu privire la funcţionalitatea tractului digestiv). În cazul suspicionării unei infecţii urinare, se va realiza un sediment urinar (după centrifugarea urinei), care se va examina între lamă şi lamelă în vederea aprecierii numărului de leucocite pe câmp microscopic, în cazul în care acestea există, în vederea aprecierii prezenţei unor cilindrii leucocitari precum şi a altor celule normale sau patologice, a prezenţei unor elemente fungice etc., date care pot fi deosebit de utile în vederea unui diagnostic corect şi util pentru pacient. 3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se va face în funcţie de situaţie (mediile şi condiţiile de incubare se vor alege în funcţie de presupusul microorganism pe care trebuie să-l izolăm; spre ex. în cazul în care infecţia este produsă de microorganisme strict anaerobe, în lipsa condiţiilor anaerobe de cultivare este imposibilă izolarea agentului etiologic). Pentru fungi trebuie utilizate mediile potrivite şi o temperatură mai mică decât cea utilizată în cazul bacteriilor. Cultivarea se va realiza în aşa fel încât să se poată obţine colonii izolate (tehnica „însămânţării în poligon”) şi respectiv o cultură pură, care se va identifica. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: a) Caractere morfologice: se va realiza un frotiu din colonia izolată, frotiu care se va fixa şi colora Gram sau Ziehl-Neelsen, după caz, şi se va examina microscopic. Prin examinarea frotiurilor se vor evidenţia numai microorganisme cu formă şi tinctorialitate similară (în cazul germenilor cu polimorfism important, ex. Proteus spp., pe frotiu vom observa aspecte morfologice diferite, de la aspecte cocobacilare până la forme filamentoase). În cazul levurilor, aspectul este cocobacilar, Gram-pozitiv, dar de dimensiuni mai mari. b) Caractere de cultură: se vor examina coloniile izolate apărute pe mediile de cultură solide şi care pot fi de tip S pentru majoritatea germenilor studiaţi inclusiv pentru levuri, de tip R în cazul Corynebacterium diphteriae, Mycobacterium tuberculosis şi Bacillus anthracis, de tip M în cazul bacteriilor capsulate, de exemplu Klebsiella pneumoniae şi respectiv un aspect pufos în cazul mucegaiurilor(detalii privind aspectele coloniilor microbiene sunt prezentate în capitolele dedicate fiecărui gen în parte). c) Caractere biochimice: acestea pot fi foarte variate de la o specie microbiană la alta şi pot fi foarte utile spre exemplu în cazul diferenţierii enterobacteriilor (introducerea în practică a „mediilor multi-test” permite evaluarea mai multor caractere simultan, ex. mediile TSI, MIU, sistemele API etc). d) Caractere antigenice: caracterele antigenice vor fi examinate bazându-ne pe structura şi antigenicitatea microorganismelor şi pe specificitatea reacţiilor antigen-anticorp. Vom utiliza anticorpi cunoscuţi pentru a identifica antigenele microbiene necunoscute. Spre exemplu, prin reacţii de aglutinare directă, pe lamă, se pot identifica antigenele şi respectiv speciile şi tulpinile din genul Shigella, Salmonella, Vibrio etc). Reacţii de aglutinare indirectă se pot utiliza pentru detectarea în p.p. a streptococilor de grup A sau B etc., pentru detectarea unor enterotoxine, pentru detectarea unor fungi (Cryptococcus neoformans, Candida albicans, Aspergillus spp.) etc. e) Caractere de patogenitate: putem examina capacitatea unui microorganism de a elabora anumite substanţe cu rol în patogenitate (ex. coagulaza produsă de Staphylococcus aureus) sau infecţia experimentală a unui animal de laborator (ex. izolarea pneumococilor de la un pacient cu pneumonie după inocularea sputei la şoarecele alb; în cazul în care în spută există pneumococi, animalul va muri în 24-48 de ore, iar din sângele lui se va izola o „cultură pură” de Streptococcus pneumoniae). f) Sensibilitatea la un anumit bacteriofag specific (lizotipie); g) Alte caractere (identificate de ex. prin metode ale biologiei moleculare sau alte metode moderne). 3. Antibiograma şi respectiv antifungigrama (testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice antibacteriene şi antifungice, în vederea stabilirii tratamentului) se realizează de obicei prin metode difuzimetrice. În cazul unor infecţii grave, antibiograma difuzimetrică trebuie să fie completată de determinarea concentraţiei minime inhibitorii (CMI) şi respectiv bactericide (CMB). În infecţii grave, cu potenţial fatal, poate fi necesară determinarea nivelului de eficienţă pentru antibioticul utilizat, respectiv stabilirea nivelul de eficienţă inhibitorie (NEI) şi nivelului de eficienţă bactericidă (NEB).