Separarea ADN-ului prin electroforeză

Electroforeza în geluri de agaroză reprezintă metoda standard de analiză a

acizilor nucleici. Deplasarea moleculelor se face în prezenţa unui curent electric
(acizii nucleici sunt încărcaţi negativ datorită prezenţei grupărilor fosfat şi
migrează spre electrodul încărcat pozitiv).
Mobilitatea electroforetică este influenţată de următorii factori: concentraţia
de agaroză, conformaţia moleculei de ADN (monocatenar, bicatenar sau
superrăsucit), prezenţa compusului fluorescent în gel, tamponul utilizat, tipul de
agaroză şi voltajul aplicat.

Tehnica de separare a acizilor nucleici prin

electroforeza orizontală (de tip submarin)

Tehnica se foloseşte pentru determinarea purităţii ADN-ului sau ARN-ului,

la verificarea existenţei produşilor rezultaţi în urma PCR-ului (reacţie de
polimerizare a nucleotidelor) sau la analiza fragmentelor rezultate după clivarea
enzimatică (cu ajutorul enzimelor de restricţie) a ADN-ului. Fragmentele analizate
pot avea mărimi între 1000 şi 23000 pb (pb – perechi de baze). Unul dintre
avantajele acestei tehnici este acela că ADN-ul nu este denaturat, păstrându-şi
intact elementele structurale. Pentru a evita fragmentarea ulterioară a ADN-ului
manipularea trebuie făcută în aşa fel încât să se evite contaminarea cu amprente,
picături, salivă sau microorganisme. Din acest motiv se preferă utilizarea de
materiale sterile (vârfuri etc.). Cele mai folosite sisteme tampon (pH 8) pentru
electroforeza în geluri de agaroză sunt: TAE (Tris-acetat 40 mM, EDTA 1 mM),
TBE (Tris – borat 45 mM, 1 mM EDTA), TPE (Tris-fosfat 90 mM, EDTA 2 mM).
Soluţiile tampon pentru electroforeză se păstrează sub forma unor stocuri
concentrate (10X-50X) şi păstrate la temperatura camerei. Tamponul de încărcare
are în componenţă un colorant (albastru de bromfenol sau roşu de crezol 0,25%)
care permite vizualizarea frontului de migrare şi zaharoză (40%) sau glicerină
(30%) pentru a asigura o vâscozitate corespunzătoare la aplicarea probei.
Benzile sunt vizualizate cu compuşi fluorescenţi (bromura de etidiu sau
SYBR Green) prin iradiere cu lumină UV. Sensibilitatea variază între 100 pg şi 1
ng/bandă. Datorită faptului că aceşti coloranţi se intercalează între bazele ADN-
ului dublu catenar, sensibilitatea detecţiei depinde de lungimea lanţului acizilor
nucleici.

Întrebări:
1. Electroforeza este:
a) procesul de separare a fragmentelor ADN;
b) procesul de adăugare de noi nucleotide la ADN cu ajutorul câmpului
electric;
c) procesul de replicare al fragmentelor de ADN în câmp electric;
d) nici un răspuns.
2. Ce se întâmplă cu lanţurile de ADN de aceeaşi lungime:
a) se deplasează cu aceeaşi viteză şi se plasează în zone diferite;
b) se deplasează cu aceeaşi viteză şi se grupează în aceeaşi zonă;
c) se deplasează cu viteze diferite şi se grupează în aceeaşi zonă;
d) nu se deplasează.
3. Ce compus este utilizat pentru developarea gelurilor în care se
separă fragmentele de ADN?
a) agaroză; b) poliacrilamidă; c) glicerină; d) bromura de etidiu.
4. Electroforeza poate fi aplicată pentru separarea:
a) lipidelor; b) proteinelor; c) zaharurilor; d) acizilor nucleici.
5. Din ce motive se utilizează albastru de bromfenol la electroforeza
acizilor nucleici?
6. Un fragment de ADN liniar a fost tăiat cu o enzimă de restricţie. Ţinând
cont de faptul că ADN-ul are două situsuri de legare susceptibile la
clivarea cu această enzimă, identificaţi numărul de fragmente separate
prin electroforeză după clivare.