STUDIUL MORFOLOGIEI BACTERIENE

-_PREPARATE MICROSCOPICE

STUDIUL MORFOLOGIEI BACTERIENE -_PREPARATE MICROSCOPICE

Examinarile bacteriologice urmaresc evidentierea si identificarea bacteriilor din produsele

patologice.

Bacteriile avand dimensiuni de ordinul micrometrilor nu pot fi vazute cu ochiul liber, de aceea
examinarea lor se efectueaza cu ajutorul microscopului.

Examenul microscopic se executa fie direct din produsele patologice (examen microscopic
direct), fie din culturi pure.

Preparatele microscopice sunt de doua feluri:

- preparat nativ, cu germeni vii;

- frontiu sau preparat colorat, cu germeni omorati;

Pause
Unmute
Loaded: 22.35%
Fullscreen

Examenul microscopic al unui preparat nativ reprezinta examinarea directa intre lama si lamela
a unei suspensii de germeni vii intr-o picatura de solutie salina fiziologica, sau mediu de cultura
lichid, precum si a produsului patologic (sange, sediment urinar,etc).

Pentru executarea preparatului nativ dintr-un produs patologic lichid sau din cultura in mediu
lichid, se ia cu pipeta Pasteur o picatura din produsul respectiv, se depune pe mijlocul lamei si se
acopera cu o lamela. Din cultura obtinuta pe mediul solid, se ia cu ansa sterila o cantitate mica
dintr-o colonie izolata si se suspenda omogen intr-o picatura de solutie salina fiziologica depusa
pe mijlocul lamei. Se acopera cu o lamela.

Examinarea la microscopul optic se face cu ajutorul unor obiective uscate.

Se coboara condensatorul si se diafragmeaza in asa fel incat campul microscopic nu sa fie

luminat prea puternic, obtinandu-se astfel un contrast mare. Punerea la punct a imaginii se
realizeaza in trei timpi:

- ne apropiem cu obiectivul de preparat cu ajutorul vizei macrometrice privind lateral;

- privim prin ocular si ridicam obiectivul cu ajutorul vizei macrometrice, pana cand apare campul
microscopic;
- realizam obtinerea detaliilor in campul microscopic cu ajutorul vizei micrometrice;

Examenul microscopic al unui preparat colorat (frontiu).

Proprietatile morfotinctoriale ale bacteriilor pot fi studiate mai detaliat pe preparate fixate si
colorate, cu germeni omorati.

Obtinerea unui preparat colorat se executa in mai multi timpi:

      timpi pregatitori: etalarea, uscarea, fixarea;

      timpi terminali: colorarea, spalarea, uscarea

Etalarea (intinderea frontiului).

In acest scop se folosesc lame perfect curate si degresate. Daca frotiul se face dintr-un lichid, se
depune cu ansa, sau pipete Pasteur o picatura foarte mica pe mijlocul lamei. Daca frotiul se face
dintr-un produs semisolid, sau dintr-o cultura pe mediu solid, se depune pe lama o picatura de
solutie salina fiziologica in care se suspenda cu ansa sterilizata in prealabil, o cantitate mica de
produs, se omogenizeaza bine, apoi se intinde cu grija. Un frotiu corect etalat trebuie sa
indeplineasca urmatoarele conditii: sa fie intins subtire si uniform pe suprafata lamei, lasand de
la marginile lamei un spatiu liber de 1-2 cm.

Uscarea se face lent, lasand lama la temperatura camerei ferita de praf, curenti de aer etc.

Fixarea se face prin procedee fizice si chimice.

Procedeul fizic cel mai utilizat este fixarea prin incalzire si consta prin trecerea rapida a lamei
cu preparatul uscat, de cel putin trei ori, prin flacara unui bec de gaz, pana cand primeste o
temperatura suportata de partea dorsala a mainii.

Pentru scopuri speciale se folosesc procedee chimice, care constau in tratarea frotiului uscat cu
alcool metilic, etilic, amestec de acloolo-eter.

Scopul fixarii este multiplu. Microorganismele sunt omorate si deci preparatul nu mai este
infectios. Printr-o fixare corecta preparatul adera mai bine pe lama si nu se detaseaza in timpul
operatiilor de colorare si spalare. Prin omorarea microorganismelor se mareste permeabilitatea
peretelui celular si se produc modificari ale citoplasmei, care cresc afinitatea fata de unii
coloranti.

Colorarea

Dupa scopul urmarit se pot utiliza mai multe tipuri de coloratii:

- coloratia simpla, care se executa cu un singur colorant;

- coloratia combinata, care se realizeaza prin actiunea succesiva sau simultana a mai multor
coloranti, fiecare colorant actionand independent si fixandu-se pe anumite elemente;

- coloratii speciale, pentru formatiuni morfologice celulare si extracelulare: corpusculi, cili,

spori, capsula.
Spalarea frotiului colorat se realizeaza cu apa de robinet, sau cu apa distilata, pana la
indepartarea completa a procesului de colorant de pe lama.

Uscarea frotiului colorat se face la temperatura camerei.

Examinarea microscopica a frotiului colorat se face cu ajutorul microscopului optic, intotdeauna

cu obiectivul de imersie.

Metode de colorare folosite in microbiologie:

     Coloratia simpla

Frotiul fixat este acoperit complet cu un singur colorant, de obicei albastru de metilen, sau fuxina
diluata, timp de 1-2 minute, apoi se spala cu apa curenta si se usuca. In coloratia cu albastru de
metilen toate elementele se coloreaza in albastru, iar in cea cu fuxina, toate elementele se
coloreaza in rosu.

Coloratia simpla permite stabilirea unor proprietati morfologice ca: forma si marimea microbilor.
Este foarte utila in diagnosticul prin examen microscopic direct din produsul patologic in
gonoree, meningita cerebrospinala epidemica si in alte infectii.

     Coloratia combinata

Friotiul fixat este supus actiunii mai multor coloranti.

     Coloratia GRAM

Este larg utilizata in microbiologie, pentru ca deosebeste germenii gram pozitivi de cei gram
negativi.

Timpi coloratiei Gram:

Frotiul fixat este acoperit cu violet de gentiana filtrat extemporaneu, timp de 2 minute, apoi se
scurge colorantul.

Se acopera cu o solutie lugol pentru mordansare (fixare colorant), timp de 2 minute. Se scurge
mordantul. Prin aceasta operatie toate elementele din frotiu se coloreaza in albastru violet.

Se decoloreaza cu alcool-acetona timp de 20 secunde pana nu se mai dizolva colorant. Se spala

cu apa curenta.

Se recoloreaza cu fuxina diluata timp de 2 minute.

Se spala cu apa curenta pana la indepartarea completa a colorantului in exces.

Se usuca frotiul si se examineaza cu imersia.

Germenii gram pozitivi rezista la decolorare si isi mentin culoarea albastru violet initiala.
Germenii gram negativi se decoloreaza si se recoloreaza in rosu cu fuxina diluata.
Diferenta de comportament in coloratia gram se explica prin structura si compozitia chimica
diferita a peretelui celular la bacteriile gram pozitive si gram negative.

Coloratia gram permite dezvaluirea urmatoarelor grupe importante la bacterii

- coci gram pozitivi: stafilococ, steptococ;

- coci gram negativi: meningococ;

- bacili gram pozitivi: bacilul coli;

- cocobacili gram negativi: brucele;

     Coloratia ZIEHL-NEELSEN

Pune in evidenta germenii acido-acloolo-rezistenti.

Timpii coloratiei Ziehl-Neelsen:

Se acopera frotiul fixat, cu fuxina concentrata si se incalzeste trecand flacara pe sub preparat,
pana cand incep sa iasa vapori, fara sa se ajunga la fierbere si fara sa se usuce colorantul pe lama,
timp de 5-10 minute. Se spala cu apa curenta.

Se decoloreaza cu acid sulfuric 20% timp de 30 secunde. Se spala cu apa curenta.

Se decoloreaza cu alcool etilic 96%, 30 secunde, pana la indepartarea colorantului. Se spala cu

apa curenta.

Se recoloreaza cu albastru de metilen 2-3 minute, se spala cu apa curenta si se usuca. Se

examineaza cu imersia.

Germenii acido-alcoolo-rezistenti apar colorati in rosu, ceilalti germeni si elementele celulare

apar colorate in albastru. Proprietatea acido-alcoolo-rezistenta este caracteristica genului
"Myobacterium" (bacilul tuberculos, bacilul leprei) si se datoreaza structurii particulare a
peretelui celular, cantitatii mari de lipide pe care acesta le contine si in special acidul micolic.