Biotehnologia obtinerii antibiotecelor

Descoperirea şi introducerea antibioticelor în secolul XX au revoluţionat medicina în

multe privinţe şi au salvat nenumărate vieţi, ceea ce a reprezentat un punct de cotitură în
istoria omenirii. Antibioticele rămân unul dintre cele mai importante instrumente
farmacologice pentru controlul bolilor infecţioase. De asemenea, antibioticele sunt
utilizate pe scară largă, ca agenţi terapeutici sau profilactici, în practicile agricole. Din
nefericire, utilizarea acestor medicamente minunate a fost însoţită de apariţia rapidă a
tulpinilor bacteriene rezistente şi de erodarea utilităţii clinice.
Rezistenţa antimicrobiană este una dintre cele mai grave ameninţări la adresa sănătăţii
umane, unii agenţi patogeni devenind rezistenţi la mai multe clase de antibiotice
(multidrug resistant = MDR). În momentul actual se exprimă marea îngrijorare a revenirii
la epoca preantibiotică. În SUA, CDC estimează că aproximativ două milioane de
persoane sunt infectate cu bacterii care nu pot fi tratate cu antibiotice şi cel puţin 23 000 de
persoane mor anual din cauza acestor infecţii(1). Pe tot globul se înregistrează acum
aproximativ 700 000 de decese în fiecare an cauzate de infecţii cu aceşti microbi rezistenţi
la antibiotice. Potrivit unui studiu riguros comandat de guvernul britanic, această cifră ar
putea creşte la 10 milioane, depăşind la nivel mondial chiar şi decesele cauzate de cancer.
Nevoia de noi terapii cu antibiotice este acută şi creşte în mare parte din cauza apariţiei
agenţilor patogeni rezistenţi la medicamente. Sunt enumerate în secvenţele genomului
bacterian peste 20 000 de gene de rezistenţă (gene r), de aproape 400 de tipuri diferite.
Dovezile susţin existenţa unui rezistom bacterian mare (totalitatea genelor de rezistenţă şi
a precursorilor lor atât în bacteriile patogene, cât şi în cele nepatogene) (2). Indiferent de
originea lor, genele de rezistenţă se pot deplasa rapid prin populaţiile bacteriene şi pot
apărea în bacteriile patogene. Înţelegerea proceselor care contribuie la evoluţia şi
selectarea rezistenţei este esenţială pentru gestionarea stocurilor actuale de antibiotice şi
pentru dezvoltarea unora noi.
Această problemă serioasă este recunoscută pe plan internaţional. În ciuda numeroaselor
rapoarte şi recomandări emise de diversele agenţii internaţionale şi naţionale, dezvoltarea
rezistenţei la antibiotice continuă. Se impun o serie de acţiuni agresive pentru a împiedica
apariţia de noi rezistenţe şi pentru a preveni răspândirea rezistenţelor deja existente.
Descoperirea antibioticelor şi mecanisme de acţiune
Înainte de anii 1930 este descrisă perioada preantibiotică, numită şi epoca întunecată, când
mortalitatea prin infecţii era uriaşă.
Era antibiotică a adus terapii adecvate pentru infecţii bacteriene şi a început cu
introducerea sulfonamidelor, în 1935 (descoperite anterior de Domagk), şi a penicilinelor,
în cursul celui de-al Doilea Război Mondial (descoperite anterior de Fleming)(3,4).
După cum se ştie, primul compus antimicrobian – penicilina – a fost descoperit de
Alexander Fleming în 1928, când a observat că ciuperca Penicillinium notatum a distrus
coloniile de S. aureus(5). Însă aceasta a fost introdusă în terapia infecţiilor abia în 1942,
când farmacologul Howard Florey şi biochimistul Ernst Boris Chain au purificat şi au
produs pe scară largă penicilina – considerată medicamentul-miracol al secolului XX.
Anii 1940-1960 sunt anii de glorie, când au fost descoperite cele mai multe dintre
antibioticele utilizate în prezent. În anii 1980-1990 au fost conduse studii genetice pentru
cunoaşterea genomului bacterian, a ţintelor de la nivelul bacteriilor asupra cărora
acţionează antibioticele.
În prezent sunt cunoscute numeroase clase de agenţi antimicrobieni, clasificate pe baza
mecanismelor lor de acţiune(6). Astfel, antibioticele pot acţiona împotriva agenţilor
bacterieni prin diverse mecanisme, precum: i) inhibarea sintezei proteinelor (ex.:
aminoglicozidele, cloramfenicolul, macrolidele, streptomicina şi tetraciclinele); ii)
interacţiunea cu sinteza ADN-ului şi ARN-ului (ex.: chinolonele şi rifampicina); iii)
inhibarea sintezei sau distrugerea peretelui celular bacterian (ex.: β-lactaminele şi
glicopeptidele); iv) modificarea metabolismului energetic al celulei microbiene (ex.:
sulfonamidele şi trimetoprimul).
O scurtă istorie a celor mai importante clase de antibiotice
Aminoglicozidele au fost descoperite în urmă cu peste 70 de ani (7). La începutul anilor
1940 a fost descoperit primul aminoglicozid – streptomicina –, din Streptomyces griseus(8).
În 1949 şi 1957, neomicina şi, respectiv, kanamicina au fost izolate din alte specii
de Streptomyces, iar în anii 1960 a fost descoperită gentamicina – din Micromonospora
purpurea. Primele derivate semisintetice au fost descoperite şi caracterizate în anii 1970
(netilmicina – derivată din sisomicină – şi amikacina – derivată din kanamicină) (7).
Aminoglicozidele sunt agenţi antimicrobieni cu spectru larg, care inhibă sinteza
proteinelor şi/sau alterează integritatea membranelor celulare bacteriene.
Beta-lactaminele. În ultimii 30 de ani au fost dezvoltate noi antibiotice β-lactamice.
Familia β-lactaminelor include peniciline şi derivaţi, cefalosporine, carbapeneme,
monobactame, inhibitori ai β-lactamazei(9).
Compusul de bază al penicilinei, acidul 6-aminopenicilanic, este utilizat ca punct de
plecare principal pentru prepararea numeroşilor derivaţi semisintetici. Deşi cefalosporinele
sunt adesea considerate derivate noi şi îmbunătăţite ale penicilinei, ele au fost descoperite
ca substanţe care apar în mod natural. Acestea pot fi grupate în cefalosporine de generaţia
I, a II-a, a III-a şi a IV-a, în funcţie de spectrul lor de activitate şi de momentul introducerii
agentului în terapia antimicrobiană. În general, cefalosporinele din prima generaţie au o
bună activitate pe bacteriile Gram-pozitive şi o acoperire modestă a microorganismelor
Gram-negative; a II-a generaţie de cefalosporine are o activitate bună asupra germenilor
Gram-negativi şi oarecum mai puţin bună asupra florei Gram-pozitive; cefalosporinele de
a III-a generaţie au o activitate îmbunătăţită asupra germenilor Gram-negativi şi variabilă
asupra germenilor Gram-pozitivi; iar a IV-a generaţie prezintă o activitate cu spectru larg,
cefalosporinele fiind active atât pe Gram-negativi, cât şi Gram-pozitivi.
Carbapenemele (imipenem şi meropenem) difuzează cu uşurinţă în celula bacteriană, fiind
considerate antibiotice β-lactamice cu spectru larg de acţiune.
Inhibitorii β-lactamazei, cum ar fi acidul clavulanic, nu conţin inelul β-lactamic, însă
prezintă activitate antimicrobiană neglijabilă şi sunt utilizaţi în combinaţie cu
antibiotice β-lactamice pentru a depăşi rezistenţa bacteriilor care secretă β-lactamază, care
altfel ar inactiva majoritatea penicilinelor.
Antibioticele β-lactamice inhibă sinteza peretelui celular prin legarea lor la proteinele
membranei citoplasmatice – proteinele care leagă penicilinele (PLP), acestea fiind
ţintele β-lactaminelor. Aceste PLP sunt de fapt enzime (transpeptidazele,
carboxipeptidazele şi transglicozilazele) implicate în sinteza peptidoglicanului; prin
legarea la PLP, β-lactaminele inhibă transpeptidarea peretelui celulei bacteriene, ceea ce
duce la formarea unui peptidoglican subţire, urmat de liza şi moartea celulei ca urmare a
presiunii(10).
În ceea ce priveşte penicilina (unul dintre cele mai vechi antibiotice), este important de
semnalat că este încă activă faţă de multe bacterii; este în continuare antibioticul de elecţie
pentru infecţiile cauzate de Streptococcus pyogenes (streptococul β-hemolitic de grup A =
SGA), până în momentul actual nefiind detectată nicio tulpină de SGA rezistentă la
penicilină(11). Tulpinile de Streptococcus pneumoniae au câştigat rezistenţă faţă de
penicilină într-o proporţie variabilă, în funcţie de regiunea geografică (12). Însă un semnal de
alarmă trebuie tras asupra diagnosticului fals, în cea mai mare proporţie, de alergie la
penicilină, în special la copii(13).
Dintre glicopeptide, vancomicina a fost izolată ca produs de fermentaţie de la o bacterie
din sol, Streptomyces orientalis, care prezintă activitate antimicrobiană, fiind introdusă în
terapia antimicrobiană la sfârşitul anilor 1950(14). Aproape 30 de ani mai târziu a urmat un
alt antibiotic glicopeptidic, teicoplanina(15).
Glicopeptidele se fixează pe partea peptidică a peptidoglicanului, legându-se de dipeptidul
terminal d-alanil-d-alanină (d-Ala-d-Ala) – ţinta moleculară a acestor antibiotice. După ce
glicopeptidele sunt legate de această ţintă, ele împiedică funcţionarea normală a
transpeptidazelor şi a transglicozilazelor, antrenând oprirea sintezei peptidoglicanului,
ducând la moartea celulei bacteriene(16).
Din clasa macrolidelor, eritromicina A a fost descoperită la începutul anilor 1950.
Principala componentă structurală a acestei molecule este un inel lactonic legat prin
legături glicozidice de structuri zaharidice şi/sau aminozaharidice. Pentru a depăşi
limitările eritromicinei, cum ar fi instabilitatea chimică, absorbţia slabă şi gustul amar, au
fost dezvoltate şi alte macrolide, care au inelul lactonic cu 14, 15 şi 16 atomi de carbon,
cum ar fi claritromicina şi azitromicina(17).
Macrolidele au un mod similar de acţiune antibacteriană cu al altor două clase de
antibiotice: lincosamidele şi streptograminele B. În consecinţă, aceste antibiotice, deşi
distincte din punct de vedere chimic, au fost grupate împreună ca antibiotice Macrolide-
Lincosamide-Streptogramine B (MLS). Macrolidele, lincosamidele şi streptograminele B
inhibă sinteza proteinelor prin legarea la subunitatea ribozomală 50S a bacteriilor (17). În
prezent, această clasă de antibiotice s-a extins datorită dezvoltării unor medicamente
sintetice. Astfel, ketolidele şi oxazolidinonele pot fi grupate împreună cu agenţii
antimicrobieni MLS, rezultând familia de antibiotice MLSKO(18).
Descoperirea chinolonelor. În 1962, în timpul procesului de sinteză şi purificare a
clorochinei (un agent antimalaric), a fost descoperit un derivat de chinolonă, acidul
nalidixic, cu activitate bactericidă împotriva germenilor Gram-negativi (19). Chinolonele de
generaţia a II-a s-au dezvoltat prin adăugarea unui atom de fluor în poziţia 6 a unei
molecule de chinolonă, creând o fluorochinolonă, şi a îmbunătăţit considerabil activitatea
biologică. În anii 1980 s-au dezvoltat diferite fluorochinolone, de exemplu ciprofloxacin,
norfloxacin şi ofloxacin. Aceste fluorochinolone au demonstrat un spectru antimicrobian
extins, incluzând şi unii germeni Gram-pozitivi. În decursul anilor 1990 au fost dezvoltate
fluorochinolonele de generaţia a III-a, levofloxacin şi sparfloxacin, care prezintă o
activitate puternică atât împotriva microbilor Gram-negativi, cât şi a celor Gram-pozitivi.
Chinolonele inhibă acţiunea ADN-girazei şi a topoizomerazei IV, două enzime esenţiale
pentru replicarea ADN-ului bacterian şi, ca urmare, microbii sunt ucişi(20,21).
Sulfonamidele aparţin celor mai vechi medicamente sintetice introduse. Ele au fost
folosite prima dată în 1935(22). Dintre sulfonamide, cel mai frecvent utilizat în zilele
noastre este sulfametoxazolul. Din 1968 a fost utilizată pe scară largă combinaţia dintre
trimetoprim şi sulfametoxazol (denumită şi cotrimoxazol); această combinaţie, la anumite
concentraţii, are un efect sinergic bactericid, reduce selecţia rezistenţei la aceste
medicamente, precum şi costurile asociate. Sulfonamidele interferează cu procesul de
sinteză al acidului folic, datorită asemănărilor structurale cu acidul paraaminobenzoic, pe
care îl antagonizează competitiv(17). Sulfonamidele sunt active pe mai mulţi germeni
Gram-pozitivi şi Gram-negativi şi protozoare, însă efectele adverse, alergia şi introducerea
de noi antibiotice au redus utilizarea lor. Trimetoprim/sulfametoxazol a reprezentat o
renaştere în cadrul terapiei antimicrobiene, datorită faptului că este un tratament de primă
linie pentru S. aureus rezistent la meticilină (MRSA), însă trebuie folosit cu atenţie la
vârstnici, din cauza riscului pentru hiperkalemie(23).
Dintre tetracicline, clortetraciclina a fost prima izolată în 1948 din Streptomyces
aureofaciens. În deceniile următoare au mai fost izolate oxitetraciclina şi tetraciclina din
alte specii de Streptomyces; de asemenea, au fost dezvoltate tetracicline semisintetice:
doxiciclina, minociclina. Tetraciclinele au constituit primul grup major de antibiotice la
care s-a utilizat termenul „antibiotice cu spectru larg“. Datorită spectrului larg de
activitate, siguranţei relative şi costului redus, tetraciclinele au fost utilizate pe scară largă
în toată lumea, ocupând locul al doilea în consumul mondial după penicilină. Mecanismul
de acţiune este bacteriostatic – tetraciclinele se leagă specific la subunităţile ribozomale
30S, cu împiedicarea sintezei proteice bacteriene. Deşi continuă să fie prescrise pentru
tratamentul infecţiilor cauzate de Chlamydia, spirochete, antrax, ciumă, tularemie şi alte
infecţii(24), răspândirea utilizării, în special în medicina veterinară, a condus la creşterea
ratei de rezistenţă(25). Cercetări recente s-au concentrat pe proprietăţile antiinflamatoare ale
tetraciclinelor, în particular minociclina, şi potenţialul neuroprotector faţă de boala
Alzheimer, accidentul vascular cerebral şi dezordini neuromusculare(26).
Rezistenţa la antibiotice şi evoluţia acesteia
Organizaţia Mondială a Sănătăţii a numit rezistenţa la antibiotice ca fiind una dintre cele
mai importante trei ameninţări la adresa sănătăţii publice ale secolului XX (27). După cum
am văzut, această ameninţare este, în mare parte, indusă de om.
Creşterea rezistenţei la medicamentele antimicrobiene este cauza a aproximativ 25000 de
decese anual în UE, a afirmat comisarul european pentru sănătate şi siguranţă alimentară,
Vytenis Andriukaitis: „Este o problemă globală, care are nevoie de o soluţie la scară
globală. Din păcate, acumularea de factori – în special utilizarea excesivă şi inadecvată a
antibioticelor şi practicile slabe de control al infecţiilor – a transformat progresiv rezistenţa
antimicrobiană într-o ameninţare masivă pentru omenire. Creşterea rezistenţei şi lipsa
măsurilor de prevenire pot determina o revenire la era preantibiotică, când oamenii au
murit din cauza unor infecţii comune şi a unor leziuni minore. Acest lucru ar avea
consecinţe majore asupra sănătăţii oamenilor şi asupra economiei, nu numai în Europa, ci
şi în întreaga lume“(28,29).
De menţionat faptul că rezistenţa antimicrobiană este un fenomen natural, care precede
presiunea selectivă modernă a utilizării clinice a antibioticelor. Antibioticele, înainte de a
fi folosite ca medicamente, erau produse naturale, fiind substanţe preparate de ciuperci,
alge şi bacterii pentru apărare. Această lume microbiană şi-a dezvoltat şi gene care
contracarează acţiunea antibioticelor. Astfel, o analiză a bacteriilor vechi de aproximativ
30000 de ani, ale căror ADN-uri au fost recuperate din permafrostul Yukon – Canada,
arată că acestea au fost capabile să reziste la antibiotice (prin analiza metagenomică a
acestor ADN-uri microbiene vechi s-a identificat o colecţie foarte diversă de gene care
codifică rezistenţa la antibiotice β-lactamice, tetracicline şi glicopeptide), dovedindu-se
faptul că rezistenţa antibacteriană este un fenomen vechi, încă dinainte de utilizarea
antibioticelor în terapia infecţiilor(30).
În cei peste 70 de ani de la introducerea primelor antibiotice, producţia a fost îmbunătăţită
prin crearea unei mari varietăţi de compuşi din ce în ce mai puţin costisitori, care au
încurajat utilizarea fără prescripţie sau utilizarea pentru o altă stare patologică decât cea
pentru care a fost aprobată oficial. Acest fapt a contribuit semnificativ la selecţia tulpinilor
rezistente. Dezvoltarea generaţiilor de microbi rezistenţi la antibiotice şi distribuţia lor în
populaţiile microbiene din întreaga biosferă sunt rezultatele multor ani de presiune de
selecţie neîncetată de la introducerea antibioticelor, prin utilizare necorespunzătoare, exces
de utilizare şi abuz. Antibioticele sunt, de asemenea, utilizate în exces în agricultură – nu
doar pentru a combate nişte infecţii, ci şi pentru a stimula creşterea unor animale, cum ar fi
puii, porcii şi bovinele, pentru a produce mai multă carne (31). Un studiu realizat în Center
for Outcomes Research and Evaluation in Charlotte, North Carolina, a evidenţiat şi un alt
aspect al prescrierii neadecvate a antibioticelor la pacienţii din ambulatoriu cu afecţiuni
uşoare ale tractului respirator superior: volumul antibioticelor utilizate în ambulatoriu este
mult mai mare decât la pacienţii internaţi în spital, până la 30% dintre toate prescripţiile
antibiotice ambulatorii fiind considerate inutile şi până la 50%, inadecvate pentru condiţia
patologică(32).
Astfel, circulaţia crescută a antibioticelor, atât la oameni, cât şi la animale, a determinat
apariţia unor mutaţii la nivelul genomului bacterian, mutaţii care au dus la câştigarea
rezistenţei la antibiotice, pentru aceasta fiind responsabilă o gamă largă de mecanisme
biochimice şi fiziologice.
De la introducerea în 1935 a primelor antimicrobiene – şi, anume, sulfonamidele –
dezvoltarea unor mecanisme specifice de rezistenţă a afectat utilizarea lor terapeutică.
Rezistenţa la sulfonamidă a fost raportată iniţial la sfârşitul anilor 1930, aceleaşi
mecanisme funcţionând şi după 70 de ani.
În 1940, câţiva ani înainte de introducerea penicilinei ca agent terapeutic, doi membri ai
echipei de descoperire a penicilinei au identificat o penicilinază bacteriană(33). Odată cu
utilizarea pe scară largă a penicilinei, tulpinile bacteriene rezistente, capabile să inactiveze
medicamentul, au devenit prevalente. S-au efectuat studii pentru a modifica chimic
penicilina în scopul prevenirii scindării de către penicilinaze (β-lactamaze). În lumina
recentelor descoperiri, un număr mare de gene r faţă de antibiotice sunt componente
naturale ale populaţiilor microbiene, ceea ce susţine existenţa unei penicilinaze bacteriene
înainte de utilizarea antibioticului.
Deja, la jumătatea anilor 1950, în Japonia fusese identificată şi descrisă rezistenţa la
antibiotice transferabilă genetic (iniţial întâmpinată cu scepticism în Vest)(34).
Încă din anii 1960, s-a observat creşterea rezistenţei la antibiotice. Astfel, au fost realizate
cercetări farmacologice şi biochimice ale antibioticelor pentru cunoaşterea mecanismelor
de acţiune, dar şi a mecanismelor de rezistenţă ale acestora, în scopul îmbunătăţirii
utilizării antibioticelor prin dozare şi administrare; totodată, au fost realizate studii de
modificare chimică a acestora pentru evitarea rezistenţei antimicrobiene.
După administrarea de antibiotice, mulţi dintre agenţii patogeni bacterieni, care au cauzat
epidemii în rândul populaţiei umane, au evoluat la forme rezistente faţă de mai multe clase
de antibiotice (MDR= multidrug resistant). De exemplu, Mycobacterium
tuberculosis MDR este un patogen major care circulă atât în ţările în curs de dezvoltare,
cât şi în cele industrializate. Alte infecţii grave includ infecţiile nosocomiale cauzate
de Acinetobacter baumannii, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Citrobacter
freundii, Clostridium difficile, Enterobacter spp., Enterococcus faecium, Enterococcus
faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Proteus
mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Serratia spp., Staphylococcus
aureus, Staphylococcus epidermidis, Stenotrophomonas maltophilia şi Streptococcus
pneumoniae.
Tot mai frecvent este utilizat termenul „superbugs“ („superbacterii“), care se referă la
agenţii microbieni care cauzează, ca urmare a mutaţiilor multiple, morbiditate şi
mortalitate crescute şi determină un nivel ridicat de rezistenţă la clasele de antibiotice
recomandate în mod special pentru tratamentul acestora. Opţiunile terapeutice pentru
aceşti microbi sunt reduse, cu perioade lungi de îngrijire în spital şi foarte costisitoare. În
unele cazuri, tulpinile superrezistente au obţinut, de asemenea, o virulenţă crescută şi o
transmisibilitate sporită, ceea ce poate permite ca rezistenţa la antibiotice să fie considerată
chiar un factor de virulenţă.
Mecanisme de rezistenţă
Inhibarea creşterii bacteriene de către un antibiotic este realizată când antibioticul
interacţionează eficient cu ţinta sa. Pentru ca această interacţiune să aibă loc, există două
elemente relevante: i) antibioticul trebuie să recunoască ţinta şi ii) concentraţia
antibioticului la nivelul ţintei trebuie să fie suficientă pentru a obţine o inhibare eficientă a
activităţii sale. Putem spune că toate mecanismele de rezistenţă se bazează pe: i)
modificarea ţintei sau ii) reducerea concentraţiei de antibiotic liber care poate accesa ţinta
– fie datorită modificării sale prin enzime de inactivare a antibioticelor, fie prin eliminarea
acestuia din celula bacteriană prin intermediul pompelor de eflux. Aceste mecanisme pot fi
considerate „mecanisme active de rezistenţă“. Pe de altă parte, sunt descrise mecanisme
care nu afectează antibioticul activ în sine şi pot fi considerate „mecanisme pasive de
rezistenţă“, precum mutaţiile la nivelul genelor care codifică transportorii, ţintele sau
proteinele care activează preantibioticul. În plus faţă de aceşti determinanţi clasici ai
rezistenţei la antibiotice, lucrări recente au arătat că mai multe elemente, implicate în
procesele de bază ale metabolismului bacterian, pot modula răspunsul la antimicrobiene,
cum ar fi, de exemplu, producerea de biofilm(35).
Astfel, bacteriile au devenit rezistente la antibiotice prin diverse mecanisme, cum ar fi:
Schimbarea permeabilităţii peretelui celulei bacteriene cu restricţionarea accesului
antibioticelor la nivelul situsurilor-ţintă. Exemplu: bacteriile Gram-negative au o
membrană exterioară care le protejează şi pe care o pot utiliza pentru a restricţiona selectiv
pătrunderea antibioticelor.
Eflux activ al antibioticelor din celula microbiană – bacteriile rezistente pot folosi
pompele din pereţii celulelor lor pentru a elimina antibioticele care intră în celulă.
Exemplu: Pseudomonas aeruginosa poate produce pompe pentru a elimina mai multe
antibiotice importante, inclusiv fluorochinolone, β-lactamine, cloramfenicol şi
trimetoprim.
Modificarea/inactivarea enzimatică a antibioticului – unele bacterii rezistente utilizează
enzime pentru a modifica antibioticele, astfel încât acestea să îşi piardă eficacitatea.
Exemplu: Staphylococcus aureus modifică enzimatic aminoglicozidele prin adăugarea
unor compuşi, schimbându-le astfel funcţia.
Degradarea agentului antimicrobian – unele bacterii rezistente utilizează enzime pentru a
descompune antibioticul şi a-l face ineficient. Exemplu: Klebsiella pneumoniae produce
enzime numite carbapenemaze, care descompun carbapenemele şi majoritatea β-
lactaminelor.
Achiziţionarea de căi metabolice alternative pentru a evita acţiunea inhibitorie a
antibioticului – unele bacterii rezistente au dezvoltat diferite şi noi procese pentru a evita
acţiunea antibioticului. Exemplu: Staphylococcus aureus poate ocoli efectele
trimetoprimului.
Modificarea ţintelor specifice antibioticelor – bacteriile rezistente pot modifica ţintele,
astfel încât antibioticul să nu le recunoască şi să nu se poată lega la acestea, permiţând
bacteriilor să supravieţuiască. Exemplu: Streptococcus pneumoniae îşi schimbă proteinele
de legare a penicilinei (PLP), împiedicând ataşarea penicilinei la celula bacteriană şi
distrugerea acesteia de către antibiotic.
Studiind diferitele clase de antibiotice, au fost recunoscute mecanisme variate de
rezistenţă, specifice acestora:
Rezistenţa la aminoglicozide(36,37,38). Au fost recunoscute mai multe mecanisme de
rezistenţă la aminoglicozide: i) efluxul activ, ii) permeabilitatea scăzută a peretelui celulei
bacteriene, iii) alterarea ribozomului, iv) inactivarea medicamentelor de către enzimele
care modifică aminoglicozidele. Inactivarea prin modificarea enzimatică este mecanismul
cel mai răspândit de rezistenţă la antibioticele aminoglicozidice. Creşterea şi difuzarea
enzimelor care modifică aminoglicozidele (nucleotidiltransferaze, fosfotransferaze sau
acetiltransferaze) au redus eficacitatea acestor antibiotice şi, în unele cazuri, le-au făcut
practic inutilizabile. Numărul mare şi capacitatea de a evolua a genelor care codifică
aceste enzime, precum şi numeroasele elemente mobile în care sunt localizate rezultă într-
o adaptabilitate ridicată a acestor enzime de a utiliza noi antibiotice ca substraturi şi de a
difuza eficient în rândul bacteriilor.
Rezistenţa la β-lactamine – în 1940 a fost raportată prima enzimă bacteriană care a
distrus penicilina – o β-lactamază AmpC la E. coli, iar în 1944 o altă specie bacteriană, S.
aureus, distruge penicilina cu ajutorul unei β-lactamaze, numită şi penicilinază, iar acum
peste 95% dintre tulpinile de S. aureus sunt rezistente la penicilină, ampicilină şi
peniciline antipseudomonas (carbenicilină, piperacilină, ticarcilină)(6). Din anii 1980,
rezistenţa S. aureus la meticilină (o penicilină semisintetică) devine o problemă, MRSA
fiind rezistent la toate β-lactaminele (peniciline, cefalosporine, carbapeneme şi peneme);
de acest fenomen este răspunzătoare gena mecA, care produce o nouă proteină de legare la
penicilină, (PLP) 2a, cu o afinitate scăzută pentru antibioticele beta-lactamice.
În zilele noastre, rezistenţa bacteriană la antibioticele β-lactamice creşte în proporţie
semnificativă şi a devenit o problemă obişnuită. Rezistenţa clinică la penicilină a unei
tulpini de Streptococcus pneumoniae a fost raportată prima dată în 1965 de cercetători din
Boston, apoi în 1967 în Australia şi în 1977 în Africa de Sud. Ulterior au fost izolate
tulpini de S. pneumoniae multirezistente la antibiotice (cele mai multe tulpini de S.
pneumoniae rezistente la penicilină sunt rezistente şi la cel puţin alte două clase de
antibiotice).
La antibioticele β-lactamice se descriu următoarele mecanisme de rezistenţă:
Cel mai frecvent şi mai important mecanism prin care bacteriile pot deveni rezistente la β-
lactamine este prin exprimarea β-lactamazelor, o clasă de enzime care hidrolizează
inelul β-lactamic. Pe baza activităţii lor de a hidroliza un număr mic sau o varietate de β-
lactamine, enzimele pot fi împărţite în β-lactamaze cu spectru îngust, moderat, larg şi
extins (ESBL). β-lactamazele cu spectru larg sunt capabile să ofere rezistenţă la peniciline
şi cefalosporine şi nu sunt inhibate de inhibitori cum ar fi acidul clavulanic şi tazobactam;
exemple de β-lactamaze cu spectru extins (ESBLs) sunt enzime AmpC mediate prin
plasmide şi β-lactamaze care hidrolizează carbapenemele (carbapenemaze) (39,40). În prezent
sunt cunoscute peste 1150 de β-lactamaze localizate pe cromozom, plasmid şi transpozon.
Un alt mecanism de rezistenţă la antibioticele β-lactamice este alterarea PLP-urilor; β-
lactaminele nu se pot lega la fel de eficient de aceste PLP-uri modificate şi devin mai puţin
eficiente în inhibarea sintezei peretelui celular. PLP-urile sunt considerate a fi strămoşii β-
lactamazelor, localizate pe cromozomul mai multor specii bacteriene.
Rezistenţa la glicopeptide. De-a lungul a aproape 30 de ani de la introducerea
vancomicinei în terapia infecţiilor, rezistenţa faţă de acest glicopeptid a fost raportată
foarte rar, vancomicina continuând să reprezinte tratamentul de rezervă în diferite infecţii
severe. Cu toate acestea, la sfârşitul anilor 1980 a fost recunoscută prima dată apariţia
rezistenţei dobândite la glicopeptide(41,42). Această rezistenţă la vancomicină a rezultat din
producerea de precursori modificaţi ai peptidoglicanului cu terminalul d-Ala-d-Lac
(fenotipurile de rezistenţă VanA, VanB şi VanD) sau d-Ala-d-Ser (fenotipurile VanC,
VanE şi VanG), la care glicopeptidele prezintă afinităţi de legare scăzute. Clasificarea
rezistenţei la glicopeptide se bazează pe secvenţa primară a genelor structurale pentru
ligazele care mediază rezistenţa. Operonii vanA şi vanB sunt localizaţi pe plasmid sau pe
cromozom, în timp ce vanC1, vanC2/3, vanD, vanE şi vanG au fost găsite, până acum,
exclusiv pe cromozom. În prezent, rezistenţa la glicopeptide (vancomicină, teicoplanină
sau ambele) a fost detectată în şase genuri bacteriene Gram-pozitive: Enterococcus,
Erysipelothrix, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus şi Staphylococcus(43).
Rezistenţa la macrolide. La scurt timp după introducerea eritromicinei în terapie, în anii
1950, a fost raportată rezistenţa bacteriană la acest antibiotic – prima dată la stafilococi (44).
De atunci, un număr mare de bacterii au prezentat o rezistenţă încrucişată la macrolide,
lincozamide şi streptogramine (fenotip MLS). Cel mai frecvent mecanism de rezistenţă la
MLS se datorează prezenţei rRNA-metilazelor, codificate de genele erm, responsabile de
rezistenţă prin modificare ribozomală. Mecanismele de rezistenţă mai includ pompa de
eflux şi genele de inactivare (codificate de genele mef, msr, ere)(18).
Rezistenţa la chinolone. De-a lungul deceniilor s-a crezut că mecanismele de rezistenţă la
chinolone sunt codificate doar în cromozom, totuşi au fost raportate recent trei mecanisme
de rezistenţă de origine plasmidică, fiind responsabile: i) genele qnr – codifică o proteină
care protejează ADN-giraza şi topoizomeraza de tip IV faţă de acţiunea inhibitoare a
chinolonelor; ii) genele responsabile de rezistenţa de nivel scăzut faţă de ciprofloxacin; iii)
gena qepA, responsabilă de pompa de eflux. Rezistenţa de origine cromozomială
determină fie o scădere a permeabilităţii membranei externe, împreună cu exprimarea
naturală a pompelor de eflux, fie mutaţii ale ţintelor moleculare ADN-girază şi
topoizomeraza IV (codificate de genele gyrA, gyrB, parC şi parE)(45).
Rezistenţa la sulfonamide în rândul bacteriilor patogene a apărut destul de curând după
introducerea lor în practica clinică, în anii 1930 (46). Rezistenţa de origine cromozomială
este, de cele mai multe ori, de nivel scăzut, determinată de mutaţii la nivelul
genei folP, care codifică enzimele bacteriene dihidropteroat-sintetază (DHPS). Rezistenţa
dobândită la sulfonamide a fost descoperită în 1960, dar genele plasmidice au fost
caracterizate mai târziu, în anii 1980, ca sul1 şi sul2. În prezent sunt cunoscute trei
variante de rezistenţă de origine plasmidică; în afară de cele două gene menţionate mai
sus, a fost identificată şi gena sul3(47).
Rezistenţa la tetracicline. Înainte de mijlocul anilor 1950, majoritatea germenilor
comensali şi patogeni au fost sensibili la tetraciclină. Însă din 1953 au fost izolate primele
bacterii rezistente la tetraciclină. Mecanismele de rezistenţă la tetracicline se încadrează în
trei categorii: i) pompe de eflux dependente de energie, ii) proteine de protecţie
ribozomală (PPR) sau iii) inactivare enzimatică. În prezent sunt recunoscute peste 40 de
gene de rezistenţă câştigată – tet, otr –, gene care codifică rezistenţa la tetraciclină (38 de
gene tet), rezistenţa la oxitetraciclină (3 gene otr) şi în ultima decadă a fost identificată şi
gena tcr(48).
Baze genetice ale rezistenţei antimicrobiene
Mecanismele moleculare de rezistenţă la antibiotice au fost studiate extensiv, implicând
cercetări de genetică şi biochimie ale funcţiei celulare bacteriene(49).
Genele de rezistenţă provin din bacteriile din mediu, unde au evoluat de milioane de ani
pentru a juca diferite funcţii care includ detoxificare, trafic de semnal sau funcţii
metabolice. Însă forţele selective care determină evoluţia acestor potenţiali factori de
rezistenţă s-au schimbat în ultimele decenii, ca o consecinţă a presiunii puternice
exercitate de utilizarea excesivă a substanţelor antimicrobiene, în special în unităţile
clinice şi în fermele de animale, dar şi de contaminarea cu antibiotice a ecosistemelor
naturale.
Ecosistemele naturale conţin un număr mare de gene de rezistenţă; totuşi, doar câteva
dintre ele sunt prezente şi diseminate printre agenţii patogeni umani. Diferitele lucrări
genomice şi metagenomice au arătat că, într-adevăr, genele care pot conferi rezistenţă la
antibiotice într-o gazdă heterologă se găsesc în orice microorganism şi ecosistem studiat.
Comparaţiile plasmidelor din epocile pre- şi postantibiotice au arătat că populaţiile
bacteriene au dobândit gene de rezistenţă care nu au fost prezente anterior în agenţii
patogeni umani(50). O ipoteză pentru a explica originea acestor gene a fost ridicată acum
câteva decenii de Julian Davies; majoritatea antimicrobienelor utilizate în prezent sunt
produse de microorganisme din mediu sau sunt derivaţi ai acestor antibiotice naturale (51).
Aceste microorganisme producătoare de antibiotice trebuie să posede sisteme pentru a
evita activitatea antibacterienelor pe care le produc; în cazul transferului lor la agenţii
patogeni umani, aceste sisteme pot deveni gene de rezistenţă. Studiul genomurilor acestor
microorganisme producătoare a arătat că acestea conţin gene care aparţin aceloraşi familii
ca genele de rezistenţă prezente în populaţiile de patogeni umani.
Din perspectivă evoluţionistă, bacteriile utilizează două strategii genetice majore pentru a
rezista la „atacul“ antibioticului: 1) mutaţii ale genelor care sunt asociate adesea cu
mecanismul de acţiune al antibioticului şi 2) achiziţia unui fragment de ADN străin, care
codifică determinanţii de rezistenţă, prin transferul orizontal de gene (HGT).
În ceea ce priveşte mutaţiile genelor care duc la rezistenţă antimicrobiană, acestea
modifică acţiunea antibioticului prin unul dintre următoarele mecanisme: i) modificări ale
ţintei antimicrobiene (scăderea afinităţii pentru medicament), ii) scăderea absorbţiei
antibioticului, iii) activarea mecanismelor de eflux pentru scoaterea din celula bacteriană a
antibioticului, iv) schimbări globale în căile metabolice importante.
Achiziţionarea de material ADN străin prin HGT este unul dintre cei mai importanţi
factori ai evoluţiei bacteriene şi este frecvent responsabilă pentru dezvoltarea rezistenţei
antimicrobiene. Aceasta se realizează prin trei strategii importante: i) transformarea:
transferul de material genetic de la o celulă donor la una receptor sub formă de ADN
eliberat de celula donor sau ADN extras chimic; ii) conjugarea: bacteriile transferă
material genetic direct în altă celulă bacteriană; prin conjugare se pot transmite gene
plasmidice, precum şi gene cromozomiale; iii) transducţia: mediată de bacteriofagi
(virusuri bacteriene), care transferă gene cromozomiale de la o celulă bacteriană la alta.
Bacteriile dezvoltă mecanisme de rezistenţă prin utilizarea instrucţiunilor furnizate de
ADN-ul lor sau de gene. O varietate de elemente genetice joacă un rol esenţial în
diseminarea genelor de rezistenţă antimicrobiană: transpozonii pot transfera genele de
rezistenţă intracelular, în timp ce plasmidele conjugative care poartă genele de rezistenţă
se pot deplasa de la o celulă bacteriană la alta, în cadrul speciilor bacteriene din aceeaşi
familie (de exemplu, între două Enterobacteriaceae, cum ar fi E. coli) şi uneori chiar şi
între familii bacteriene diferite (de exemplu, de la E. coli la o specie non-
Enterobacteriaceae, cum ar fi Pseudomonas aeruginosa). Plasmidele au un rol central – ca
vehicule pentru captarea genelor de rezistenţă şi diseminarea lor ulterioară. Integronii sunt
elemente genetice care pot colecta mai multe gene de rezistenţă sub formă de casete
genetice. Aceste elemente genetice coexistă uneori şi colaborează. De exemplu, integronii,
care nu sunt mobili singuri, pot obţine o capacitate de transfer când sunt încorporaţi în
transpozoni.
Exemplu: utilizarea pe scară largă a antibioticelor β-lactamice a dus la evoluţia şi
răspândirea multor mecanisme de rezistenţă cromozomiale, plasmidice şi transpozonice (52).
Printre aceste mecanisme, un rol predominant îl au β-lactamazele; TEM-1 β-lactamaza,
codificată de gena blaTEM-1, hidrolizează atât penicilinele, cât şi primele cefalosporine (53).
Genele care codifică β-lactamazele sunt vechi şi s-au găsit în medii îndepărtate şi pustii,
ceea ce implică faptul că noi β-lactamaze cu substraturi modificate se întâlnesc în mediul
înconjurător.
În momentul actual, disponibilitatea tehnicilor de mutageneză a întregului genom
bacterian şi secvenţializarea rapidă a acestuia au dezvăluit multe funcţii genetice potenţiale
la nivelul bacteriilor, care pot conduce la diverse fenotipuri de rezistenţă. Testele genetice
se pot folosi, de asemenea, şi în identificarea mai rapidă a rezistenţei la antibiotice, cum
este, de exemplu, identificarea rezistenţei la rifampicină în cazul Mycobacterium
tuberculosis folosind sistemul GenoType MTBDRplus(54), o metodă deosebit de utilă,
ţinând cont de particularităţile fiecărui pacient cu această infecţie şi, în acelaşi timp, de
posibilitatea crescută a rezistenţei la diferite antibiotice(55).
Un aspect important în ceea ce priveşte rezistenţa la antibiotice este reprezentat de
consumul iresponsabil al acestora, de multe ori din cauza lipsei de cunoştinţe (56). Trebuie
avută în vedere utilizarea corespunzătoare a antibioticelor, în funcţie de mecanismul lor de
acţiune, microorganismele-ţintă şi alte aspecte, precum absorbţia intestinală sau efectele
adverse(57). În unele patologii (ex.: în cazul diareii călătorului) sunt mai eficiente
antibioticele cu absorbţie intestinală scăzută (58,59), în timp ce în alte situaţii, cum sunt
leziunile cronice infectate, se poate apela la alte terapii, precum folosirea de nanoparticule
de argint sau altele(60). Ţinând cont de recomandările societăţilor din domeniu, utilizarea
corectă a antibioticelor şi a chimioterapicelor poate încetini creşterea rezistenţei la
antibiotice(61).
Concluzie
In concluzie pot spune ca datorita antibioticilor au fost si sunt salvate o
multime de vieti, consider ca in prezent viata noastra de pinde de efectul
acestor substante.