1

ANALIZA
MEDICAMENTULUI
NOTE DE CURS (12)
21.12.2020 Prof. dr. Cristina Adela Iuga
 Ghiduri de validare
2

 ICH - International Conference on Harmonisation of Techical

Requirements for Registration of Pharmaceutical for Human Use;
www.ich.org
 ICH Q2 (R1) Validation of Analytical Procedures. Text and Methodology

 FDA - Foods and Drugs Administration; www.fda.gov

 Guidance for Industry - Bioanalytical Method Validation

 Sunt publice
 Nu au caracter obligatoriu
 Sunt considerate recomandări
3 Protocol de validare
ICH Q2 (R1) Validation of Analytical Procedures. Text and
Methodology

 Evaluarea statistică a rezultatelor

 Evaluarea statistică a rezultatelor
4

 Testul “t”Student şi limitele  Aceste teste sunt

de încredere (test t) dependente de:

 Testul Cochran (test C)   - probabilitatea de eroare

 k - numărul de grupe
 n = numărul de rezultate
 Testul Dixon (test Q) dintr-un grup
 N = numărul total de rezultate
 Testul Fisher (One-way
ANOVA, test F)
 Testul t Student & Limitele de incredere
5

 Noţiune statistice de bază:

 Media aritmetică
 Varianţă (s2)/Deviaţia standard (s)
 Intervalul de încredere al mediei (limite de încredere)
 Evaluarea distribuţiei normale a rezultatelor:
 minimum 15 valori/serie
 Testarea semnificaţiei
 t-test pentru două serii independente (independent two-sample t-test)
 Se aplică atunci când rezultatele se încadrează intr-o distribuţie normală
 Numărul de rezultate din cele doua serii este egal
 Se poate asuma că cele două distribuţii au aceeaşi varianţă

 Dacă t calculat < t teoretic – cu aceeaşi probabilitate de eroare şi în funcţie de numărul

de grade de libertate ale determinării nu există o diferenţă semnificativă între
seriile evaluate
 Testul Cochrane - C test
6

 Estimează varianţele dintr-un grup de rezultate

 Se calculează parametrul Ctest - dependent de , k si n

 Cteoretic (;k;n-1)

Ctest <Cteoretic (;k;n-1) - testul este adevarat (varianţe omogene)

Ctest >Cteoretic (;k;n-1) - testul este fals (varianţe neomogene)
 Testul Dixon - Q test
7

 Se aplică atunci cand testul C este fals

 detectează valorile aberante şi se aplică pe serii mici de
rezultate (n10)
 Se calculează parametrul Qtest - dependent de  si n
 Qteoretic(;n)

Qtest  Qteoretic (0.05;n) - rezultatele nu sunt suspecte

Qteoretic (0.05;n) < Qtest  Qteoretic (0.01;n) - rezultate suspecte
Qteoretic (0.01;n) < Qtest - rezultate eronate
 Testul Fisher - F test
8

 Se utilizează frecvent pentru grupuri mici de date, pentru a

evalua semnificația asocierii a două variabile,

Ftest  Fteoretic (;1, 2) - nu există o diferență semnificativă, cele

două varianțe sunt coerente

Ftest ≥ Fteoretic (;1, 2) - există o diferență semnificativă, cele două

varianțe nu sunt coerente
 Liniaritate - evaluare statistică
9

 Test de comparare a pantelor dreptelor de regresie (test t)

 ttest < t teoretic(0.05;26) = 2.056
 Liniaritate - evaluare statistică
10

 Compararea ordonatelor la origine (test t)

ttest < t teoretic(0.05;26) = 2.056
 Liniaritate - evaluare statistică
11

 Compararea ordonatelor la origine cu 0 (test t)

ttest < t teoretic(0.05;13) = 2.160
 Liniaritate - evaluare statistică
12

 Test de omogenitate a varianţelor (test C)

Ctest < C teoretic(0.05;5;2) = 0.68

 Test de existenţă a unei pante semnificative (test F) – panta

diferă semnificativ de zero?
Ftest > F teoretic (0.05;1;13) = 4.67

 Validitatea dreptei de regresie (test F) – este raspunsul

sistemului liniar?
Ftest < F teoretic(0.05;3;10) = 3.71
 Liniaritate - evaluare statistică
13

 Dreptele de
regresie D1 și D2
sunt aproape
superpozabile

 Metoda este
liniară
 Liniaritate - evaluare statistică
14
 Precizie - evaluarea statistică
15

 Test de omogenitate a varianţelor intra-grup (test C)

Cc alc< Cteoretic (0.05;3;6) =0.68
 Coeficientul de variaţie a repetabilităţii CVr
 Coeficientul de variaţie a reproductibilității CVR
 Exactitate - evaluare statistică
16

 Regăsirea se va aprecia față de:

 etalon 100% - dacă ordonatele la origine nu diferă semnificativ de zero

 dreapta de regresie D2 – dacă ordonatele la origine diferă semnificativ

de zero
 Exactitate - evaluare statistică
17

 Test de omogenitate a varianțelor intra-grup (test Cochran)

Ccalc < Cteoretic (0.05;5;2) =0.68
 Test de validitate a mediilor (test F)
Fcalc < Fteoretic (0.05;4;10) =3.48
 Când este necesară revalidarea?
18

 Modificarea procedeului de sinteză a substanţei active

 Modificarea compoziţiei produsului finit

 Modificări ale metodei analitice (tehnicii de lucru)

Gradul de revalidare este dependent de natura schimbărilor din proba de

analizat.
19
Validarea metodelor bioanalitice
 CC – metode cromatografice
LBA – metode imunoenzimatice (ligand

binding assay)
 Parametri de validare
20

 Specificitatea/ Selectivitatea
 Linearitatea
 Exactitatea
 Precizia
 Limita de detecție
 Limita de cuantificare
 Probele de control al calității
 Stabilitatea analitului în matrice
 Selectivitatea/ specificitatea
21

 Selectivitatea metodei este demonstrată prin analizarea unor blancuri de

matrice biologică, provenite din mai multe surse (minimum 6)
 Evaluarea efectului de matrice implică compararea curbelor de calibrare
preparate în matrice biologică provenită din mai multe surse pentru
paralelism și legare nespecifică
 Când se folosesc metode LC/MS, analistul trebuie să determine efectele
matricei asupra supresiei ionice, asupra încărcării ionice sau a eficienței
extracției
 Trebuie evaluate standardele interne pentru a evita interferența cu analiții
 In metodele analitice, poate să apară transferul de substanță între probe
(carryover);
 Selectivitatea/specificitatea
22

 CC
 Blancul si blancul cu SI nu trebuie să prezinte interferenți la timpii de retenție
ai analiților și ai SI.
 Concentrația determinată în probele de matrice marcate trebuie să prezinte o
abatere de maximum ± 20% pt LLOQ.
 În blanc, semnalul analitic pt SI nu trebuie să depășească 5% din semnalul
analitic mediu al SI în etaloane și probele de control al calității (QCs)

 LBA:
 Selectivitatea: Pentru ≥ 80% din determinari, semnalul generat de matricea
nemarcată trebuie să fie sub limita de cuantificare, iar probele marcate ± 25% în
cazul LLOQ, și ± 20% în cazul ULQC.
 Specificitatea: Probele de control al calității trebuie să se încadreze în intervalul
de ± 20% sau ±25% pentru LLOQ, respectiv ULOQ.
 Sensibilitatea
23

 Trebuie determinată în timpul dezvoltării metodei

 Metoda trebuie dezvoltată și validată în așa fel încat să se poată aplica
probelor luate în studiu
 Se evaluează separat sau simultan cu evaluarea preciziei și acurateții
pentru domeniul de calibrare
 se exprimă ca LLOQ
 Criterii pentru validarea metodei:
 CC: Semnalul analitului la LLOQ trebuie să fie de 5 ori ≥ decât răspunsul analitului în
martorul marcat cu SI; acuratețea la LLOQ trebuie să fie ± 20% din concentrația
teoretică, iar precizia ± 20% (coeficient de variatie procentual = CV) (3 cicluri de
injectare, 5 replicate / ciclu)
 LBA: acuratețea trebuie să fie ± 25% din concentrația teoretică; precizia trebuie să fie ±
25% CV; eroarea totală trebuie să fie ≤ 40%
 Liniaritatea
24

 Minimum 7 puncte pe curba de calibrare; primul punct de pe curbă LLOQ

(limita inferioară de cuantificare), iar ultimul punct de pe curbă ULOQ
(limita superioară de cuantificare)

 Domeniul concentrații se alege pe baza intervalului de concentrație

așteptat într-un anumit studiu

 Trebuie utilizat cel mai simplu model care descrie în mod corect relația
concentrație-semnal, precum și o ecuație de regresie corespunzătoare

 Etaloanele trebuie pregătite în aceeași matrice biologică cu cea care

urmează să fie analizată și pot conține unul sau mai mulți analiți, fiind
necesară o curbă de calibrare pentru fiecare analit
 Liniaritatea
25

 Condiții pentru validarea metodei:

 CC: Concentrațiile etaloanelor nu trebuie să prezinte abateri mai mari
de ±15% din concentrațiile teoretice (în cazul LLOQ ±20% din
concentrația teoretică) => 75% din etaloane (minim 5) să îndeplinească
acest criteriu în fiecare ciclu de validare

 LBA: Concentrațiile etaloanelor nu trebuie să prezinte abateri mai mari

de ± 20% din concentrațiile teoretice (în cazul LLOQ, ULOQ ±25% din
concentrațiile teoretice)=> 75% din etaloane (minim 6) să îndeplinească
acest criteriu în fiecare ciclu de validare;
 Exactitatea și precizia
26

 Evaluarea acurateții și preciziei implică analizarea de probe QC, la mai

multe niveluri de concentrație (min. 3/5 replicate/nivel), care să acopere
domeniul de calibrare:
 LLOQ
 QC inferior (de regulă, 3xLLOQ)
 QC mediu
 QC superior
 ULOQ -> este necesar doar în cazul metodelor LBA (ex: met. imunoanalitice)
 Sunt necesare mai multe cicluri de injectare independente (desfășurate pe
parcursul mai multor zile), minimum:
 3, pentru CC
 6, pentru LBA
 Exactitatea și precizia
27

 Exactitatea se masoară prin gradul de regăsire a analitului iar

precizia prin gradul de reproductibilitate
 Condiții pentru validarea metodei:
 Exactitate în același ciclu de injectare /inter-ciclu: abatere de max. ±
15% / ± 20% din concentrația teoretică, cu excepția LLOQ (± 20% /
±25%) (CC / LBA)

 Precizie în același ciclu de injectare / inter-ciclu: CV de max. ± 15% /

±20%, cu excepția LLOQ (± 20% / ±25%) (CC / LBA)
 Stabilitatea
28

 Se evaluează stabilitatea chimică pe termen lung a analitului în matricea de

interes sau in matrice reconstituită (pentru matrici rare)
 Se au în vedere toate elementele care ar putea afecta stabilitatea:
medicamente co-administrate, adsorbția (sânge integral), condițiile de
recoltare, transport și depozitare, matricea (vs curbe și QC-uri preparate
ex-temporae)
 Cel mai adesea se testează:
 Stabilitatea la temperatura de procesare a probelor (bench-top)
 Stabilitatea în injector
 Stabilitatea la cicluri de îngheț-dezgheț
 Stabilitatea probelor procesate (post-extracție)
 Stabilitatea pe termen lung (frigider / congelator)
 Stabilitatea soluțiilor stoc
 Stabilitatea
29

 Sunt analizate probe la 2 niveluri de concentrație (QC jos și

QC înalt), cu 3 replicate / nivel de concentrație
 Condiții pentru validare:
 CC: Exactitate ± 15% față de concentrația teoretică
 LBA: Exactitate ± 20% față de concentrația teoretică
 Efectul diluției
30

 Dacă se vor analiza probe care depășesc domeniul de calibrare

și necesită diluție, trebuie analizat efectul acesteia asupra
acurateții și preciziei.
 Sunt necesare QC-uri suplimentare pentru diluțiile respective,
5 replicate / nivel de concentrație (factor de diluție)
 Criterii de validare a metodei:
 Exactitate ±15% (CC) sau ±20% (LBA)
 Precizie: CV ±15% (CC) sau ±20% (LBA)
 În cazul LBA, este necesară și demonstrarea liniarității pentru aceste
QC-uri
 Probele de control al calității (QCs)
31

 evaluează precizia și acuratețea unei analize și stabilitatea

probelor
 trebuie preparate în aceeași matrice ca și aceea ce urmează să
fie analizată prin metoda validate
 trebuie preparate ex-temporae și din soluții stoc diferite pentru
a asigura acuratețea și precizia analizei în timpul dezvoltării
metodei, deoarece datele de stabilitate nu sunt disponibile în
acest moment al validării metodei
 în timpul validării metodei, QCs evaluează performanța
metodei și stabilitatea analitului
 Validarea parțială
32

 Validarea parțială se aplică în cazul metodelor deja validate,

atunci când apar:
 Transfer al metodei în alt laborator
 Schimbări ale protocolului de analiză (ex: schimbare detector)
 Schimbări ale protocolului de procesare a probelor
 Schimbarea volumului probei procesate
 Schimbarea programelor computerizate sau aparaturii utilizate
 Extinderea domeniului de calibrare
 Schimbarea modului de prelevare (anticoagulant)
 Modificarea matricii din care se face determinarea
 Necesitatea demonstrării selectivității în prezența altor medicamente co-
administrate
 Schimbarea reactivilor, în cazul LBA
 Validarea încrucișată
33

 Validarea încrucișată este necesară atunci când:

 Analizele din același studiu se desfășoară în laboratoare
diferite
 Analizele din același studiu se fac prin 2 sau mai multe
metode diferite
 Necesitatea confirmării obținerii de rezultate
comparabile
 Concluzii
34

 Scopul validării unei metode de analiza este acela de a dobândi certitudinea

calităţii datelor primare (rezultatelor) obţinute

 Parametrii supuși validării se selectează dependent de scopul pentru care

este dezvoltată metoda.

 Metoda este validată dacă în urma evaluării statistice a rezultatelor aceasta

poate fi considerată specifică, selectivă, sensibilă, liniară, exactă, precisă şi
robustă.
 Recomadări
35

 ICH Q2 (R1) Validation of Analytical Procedures. Text and Methodology

http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quali
ty/Q2_R1/Step4/Q2_R1__Guideline.pdf

 FDA - Bioanalytical Method Validation,

http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryI
nformation/Guidances/UCM070107.pdf
 **** - Guide de validation analitique, Rapport d’une commision SFSTP, S.T.P
Pharma Pratiques, 2(4), 205-226, 1992

 James E. De Muth – Basic statistics and Pharmaceutical statistical applications,

Marcel Dekker Inc., 1999

 Liviu Roman, Marius Bojiţă, Robert Săndulescu - Validarea metodelor de

analiză şi control. Bazele teoretice şi practice, Editura Medicală, 1998