1
ANALIZA
MEDICAMENTULUI
NOTE DE CURS (12)
21.12.2020 Prof. dr. Cristina Adela Iuga
Ghiduri de validare
2
ICH - International Conference on Harmonisation of Techical
Requirements for Registration of Pharmaceutical for Human Use;
[Link]
ICH Q2 (R1) Validation of Analytical Procedures. Text and Methodology
FDA - Foods and Drugs Administration; [Link]
Guidance for Industry - Bioanalytical Method Validation
Sunt publice
Nu au caracter obligatoriu
Sunt considerate recomandări
3 Protocol de validare
ICH Q2 (R1) Validation of Analytical Procedures. Text and
Methodology
Evaluarea statistică a rezultatelor
Evaluarea statistică a rezultatelor
4
Testul “t”Student şi limitele Aceste teste sunt
de încredere (test t) dependente de:
Testul Cochran (test C) - probabilitatea de eroare
k - numărul de grupe
n = numărul de rezultate
Testul Dixon (test Q) dintr-un grup
N = numărul total de rezultate
Testul Fisher (One-way
ANOVA, test F)
Testul t Student & Limitele de incredere
5
Noţiune statistice de bază:
Media aritmetică
Varianţă (s2)/Deviaţia standard (s)
Intervalul de încredere al mediei (limite de încredere)
Evaluarea distribuţiei normale a rezultatelor:
minimum 15 valori/serie
Testarea semnificaţiei
t-test pentru două serii independente (independent two-sample t-test)
Se aplică atunci când rezultatele se încadrează intr-o distribuţie normală
Numărul de rezultate din cele doua serii este egal
Se poate asuma că cele două distribuţii au aceeaşi varianţă
Dacă t calculat < t teoretic – cu aceeaşi probabilitate de eroare şi în funcţie de numărul
de grade de libertate ale determinării nu există o diferenţă semnificativă între
seriile evaluate
Testul Cochrane - C test
6
Estimează varianţele dintr-un grup de rezultate
Se calculează parametrul Ctest - dependent de , k si n
Cteoretic (;k;n-1)
Ctest <Cteoretic (;k;n-1) - testul este adevarat (varianţe omogene)
Ctest >Cteoretic (;k;n-1) - testul este fals (varianţe neomogene)
Testul Dixon - Q test
7
Se aplică atunci cand testul C este fals
detectează valorile aberante şi se aplică pe serii mici de
rezultate (n10)
Se calculează parametrul Qtest - dependent de si n
Qteoretic(;n)
Qtest Qteoretic (0.05;n) - rezultatele nu sunt suspecte
Qteoretic (0.05;n) < Qtest Qteoretic (0.01;n) - rezultate suspecte
Qteoretic (0.01;n) < Qtest - rezultate eronate
Testul Fisher - F test
8
Se utilizează frecvent pentru grupuri mici de date, pentru a
evalua semnificația asocierii a două variabile,
Ftest Fteoretic (;1, 2) - nu există o diferență semnificativă, cele
două varianțe sunt coerente
Ftest ≥ Fteoretic (;1, 2) - există o diferență semnificativă, cele două
varianțe nu sunt coerente
Liniaritate - evaluare statistică
9
Test de comparare a pantelor dreptelor de regresie (test t)
ttest < t teoretic(0.05;26) = 2.056
Liniaritate - evaluare statistică
10
Compararea ordonatelor la origine (test t)
ttest < t teoretic(0.05;26) = 2.056
Liniaritate - evaluare statistică
11
Compararea ordonatelor la origine cu 0 (test t)
ttest < t teoretic(0.05;13) = 2.160
Liniaritate - evaluare statistică
12
Test de omogenitate a varianţelor (test C)
Ctest < C teoretic(0.05;5;2) = 0.68
Test de existenţă a unei pante semnificative (test F) – panta
diferă semnificativ de zero?
Ftest > F teoretic (0.05;1;13) = 4.67
Validitatea dreptei de regresie (test F) – este raspunsul
sistemului liniar?
Ftest < F teoretic(0.05;3;10) = 3.71
Liniaritate - evaluare statistică
13
Dreptele de
regresie D1 și D2
sunt aproape
superpozabile
Metoda este
liniară
Liniaritate - evaluare statistică
14
Precizie - evaluarea statistică
15
Test de omogenitate a varianţelor intra-grup (test C)
Cc alc< Cteoretic (0.05;3;6) =0.68
Coeficientul de variaţie a repetabilităţii CVr
Coeficientul de variaţie a reproductibilității CVR
Exactitate - evaluare statistică
16
Regăsirea se va aprecia față de:
etalon 100% - dacă ordonatele la origine nu diferă semnificativ de zero
dreapta de regresie D2 – dacă ordonatele la origine diferă semnificativ
de zero
Exactitate - evaluare statistică
17
Test de omogenitate a varianțelor intra-grup (test Cochran)
Ccalc < Cteoretic (0.05;5;2) =0.68
Test de validitate a mediilor (test F)
Fcalc < Fteoretic (0.05;4;10) =3.48
Când este necesară revalidarea?
18
Modificarea procedeului de sinteză a substanţei active
Modificarea compoziţiei produsului finit
Modificări ale metodei analitice (tehnicii de lucru)
Gradul de revalidare este dependent de natura schimbărilor din proba de
analizat.
19
Validarea metodelor bioanalitice
CC – metode cromatografice
LBA – metode imunoenzimatice (ligand
binding assay)
Parametri de validare
20
Specificitatea/ Selectivitatea
Linearitatea
Exactitatea
Precizia
Limita de detecție
Limita de cuantificare
Probele de control al calității
Stabilitatea analitului în matrice
Selectivitatea/ specificitatea
21
Selectivitatea metodei este demonstrată prin analizarea unor blancuri de
matrice biologică, provenite din mai multe surse (minimum 6)
Evaluarea efectului de matrice implică compararea curbelor de calibrare
preparate în matrice biologică provenită din mai multe surse pentru
paralelism și legare nespecifică
Când se folosesc metode LC/MS, analistul trebuie să determine efectele
matricei asupra supresiei ionice, asupra încărcării ionice sau a eficienței
extracției
Trebuie evaluate standardele interne pentru a evita interferența cu analiții
In metodele analitice, poate să apară transferul de substanță între probe
(carryover);
Selectivitatea/specificitatea
22
CC
Blancul si blancul cu SI nu trebuie să prezinte interferenți la timpii de retenție
ai analiților și ai SI.
Concentrația determinată în probele de matrice marcate trebuie să prezinte o
abatere de maximum ± 20% pt LLOQ.
În blanc, semnalul analitic pt SI nu trebuie să depășească 5% din semnalul
analitic mediu al SI în etaloane și probele de control al calității (QCs)
LBA:
Selectivitatea: Pentru ≥ 80% din determinari, semnalul generat de matricea
nemarcată trebuie să fie sub limita de cuantificare, iar probele marcate ± 25% în
cazul LLOQ, și ± 20% în cazul ULQC.
Specificitatea: Probele de control al calității trebuie să se încadreze în intervalul
de ± 20% sau ±25% pentru LLOQ, respectiv ULOQ.
Sensibilitatea
23
Trebuie determinată în timpul dezvoltării metodei
Metoda trebuie dezvoltată și validată în așa fel încat să se poată aplica
probelor luate în studiu
Se evaluează separat sau simultan cu evaluarea preciziei și acurateții
pentru domeniul de calibrare
se exprimă ca LLOQ
Criterii pentru validarea metodei:
CC: Semnalul analitului la LLOQ trebuie să fie de 5 ori ≥ decât răspunsul analitului în
martorul marcat cu SI; acuratețea la LLOQ trebuie să fie ± 20% din concentrația
teoretică, iar precizia ± 20% (coeficient de variatie procentual = CV) (3 cicluri de
injectare, 5 replicate / ciclu)
LBA: acuratețea trebuie să fie ± 25% din concentrația teoretică; precizia trebuie să fie ±
25% CV; eroarea totală trebuie să fie ≤ 40%
Liniaritatea
24
Minimum 7 puncte pe curba de calibrare; primul punct de pe curbă LLOQ
(limita inferioară de cuantificare), iar ultimul punct de pe curbă ULOQ
(limita superioară de cuantificare)
Domeniul concentrații se alege pe baza intervalului de concentrație
așteptat într-un anumit studiu
Trebuie utilizat cel mai simplu model care descrie în mod corect relația
concentrație-semnal, precum și o ecuație de regresie corespunzătoare
Etaloanele trebuie pregătite în aceeași matrice biologică cu cea care
urmează să fie analizată și pot conține unul sau mai mulți analiți, fiind
necesară o curbă de calibrare pentru fiecare analit
Liniaritatea
25
Condiții pentru validarea metodei:
CC: Concentrațiile etaloanelor nu trebuie să prezinte abateri mai mari
de ±15% din concentrațiile teoretice (în cazul LLOQ ±20% din
concentrația teoretică) => 75% din etaloane (minim 5) să îndeplinească
acest criteriu în fiecare ciclu de validare
LBA: Concentrațiile etaloanelor nu trebuie să prezinte abateri mai mari
de ± 20% din concentrațiile teoretice (în cazul LLOQ, ULOQ ±25% din
concentrațiile teoretice)=> 75% din etaloane (minim 6) să îndeplinească
acest criteriu în fiecare ciclu de validare;
Exactitatea și precizia
26
Evaluarea acurateții și preciziei implică analizarea de probe QC, la mai
multe niveluri de concentrație (min. 3/5 replicate/nivel), care să acopere
domeniul de calibrare:
LLOQ
QC inferior (de regulă, 3xLLOQ)
QC mediu
QC superior
ULOQ -> este necesar doar în cazul metodelor LBA (ex: met. imunoanalitice)
Sunt necesare mai multe cicluri de injectare independente (desfășurate pe
parcursul mai multor zile), minimum:
3, pentru CC
6, pentru LBA
Exactitatea și precizia
27
Exactitatea se masoară prin gradul de regăsire a analitului iar
precizia prin gradul de reproductibilitate
Condiții pentru validarea metodei:
Exactitate în același ciclu de injectare /inter-ciclu: abatere de max. ±
15% / ± 20% din concentrația teoretică, cu excepția LLOQ (± 20% /
±25%) (CC / LBA)
Precizie în același ciclu de injectare / inter-ciclu: CV de max. ± 15% /
±20%, cu excepția LLOQ (± 20% / ±25%) (CC / LBA)
Stabilitatea
28
Se evaluează stabilitatea chimică pe termen lung a analitului în matricea de
interes sau in matrice reconstituită (pentru matrici rare)
Se au în vedere toate elementele care ar putea afecta stabilitatea:
medicamente co-administrate, adsorbția (sânge integral), condițiile de
recoltare, transport și depozitare, matricea (vs curbe și QC-uri preparate
ex-temporae)
Cel mai adesea se testează:
Stabilitatea la temperatura de procesare a probelor (bench-top)
Stabilitatea în injector
Stabilitatea la cicluri de îngheț-dezgheț
Stabilitatea probelor procesate (post-extracție)
Stabilitatea pe termen lung (frigider / congelator)
Stabilitatea soluțiilor stoc
Stabilitatea
29
Sunt analizate probe la 2 niveluri de concentrație (QC jos și
QC înalt), cu 3 replicate / nivel de concentrație
Condiții pentru validare:
CC: Exactitate ± 15% față de concentrația teoretică
LBA: Exactitate ± 20% față de concentrația teoretică
Efectul diluției
30
Dacă se vor analiza probe care depășesc domeniul de calibrare
și necesită diluție, trebuie analizat efectul acesteia asupra
acurateții și preciziei.
Sunt necesare QC-uri suplimentare pentru diluțiile respective,
5 replicate / nivel de concentrație (factor de diluție)
Criterii de validare a metodei:
Exactitate ±15% (CC) sau ±20% (LBA)
Precizie: CV ±15% (CC) sau ±20% (LBA)
În cazul LBA, este necesară și demonstrarea liniarității pentru aceste
QC-uri
Probele de control al calității (QCs)
31
evaluează precizia și acuratețea unei analize și stabilitatea
probelor
trebuie preparate în aceeași matrice ca și aceea ce urmează să
fie analizată prin metoda validate
trebuie preparate ex-temporae și din soluții stoc diferite pentru
a asigura acuratețea și precizia analizei în timpul dezvoltării
metodei, deoarece datele de stabilitate nu sunt disponibile în
acest moment al validării metodei
în timpul validării metodei, QCs evaluează performanța
metodei și stabilitatea analitului
Validarea parțială
32
Validarea parțială se aplică în cazul metodelor deja validate,
atunci când apar:
Transfer al metodei în alt laborator
Schimbări ale protocolului de analiză (ex: schimbare detector)
Schimbări ale protocolului de procesare a probelor
Schimbarea volumului probei procesate
Schimbarea programelor computerizate sau aparaturii utilizate
Extinderea domeniului de calibrare
Schimbarea modului de prelevare (anticoagulant)
Modificarea matricii din care se face determinarea
Necesitatea demonstrării selectivității în prezența altor medicamente co-
administrate
Schimbarea reactivilor, în cazul LBA
Validarea încrucișată
33
Validarea încrucișată este necesară atunci când:
Analizele din același studiu se desfășoară în laboratoare
diferite
Analizele din același studiu se fac prin 2 sau mai multe
metode diferite
Necesitatea confirmării obținerii de rezultate
comparabile
Concluzii
34
Scopul validării unei metode de analiza este acela de a dobândi certitudinea
calităţii datelor primare (rezultatelor) obţinute
Parametrii supuși validării se selectează dependent de scopul pentru care
este dezvoltată metoda.
Metoda este validată dacă în urma evaluării statistice a rezultatelor aceasta
poate fi considerată specifică, selectivă, sensibilă, liniară, exactă, precisă şi
robustă.
Recomadări
35
ICH Q2 (R1) Validation of Analytical Procedures. Text and Methodology
[Link]
ty/Q2_R1/Step4/Q2_R1__Guideline.pdf
FDA - Bioanalytical Method Validation,
[Link]
nformation/Guidances/[Link]
**** - Guide de validation analitique, Rapport d’une commision SFSTP, S.T.P
Pharma Pratiques, 2(4), 205-226, 1992
James E. De Muth – Basic statistics and Pharmaceutical statistical applications,
Marcel Dekker Inc., 1999
Liviu Roman, Marius Bojiţă, Robert Săndulescu - Validarea metodelor de
analiză şi control. Bazele teoretice şi practice, Editura Medicală, 1998
