ENZIME.

SPECIFICITATEA ENZIMELOR. MECANISMUL REACŢIILOR ENZIMATICE.

CINETICA REACŢIILOR ENZIMATICE

1. CONSIDERAŢII GENERALE

Enzimele sunt compuşi cu structură proteinică, de provenienţă endogenă care au

rol de biocatalizatori în reacţiile anabolice şi catabolice din organism.
Enzimele sunt catalizatori de natură organică produşi de celula vie acţionând
asupra anumitor substanţe numite substraturi. În marea lor majoritate, enzimele
catalizează reacţia unei substanţe organice cu un compus anorganic liber sau cedat de alt
compus organic (apă, acid fosforic, hidrogen, oxigen, etc.). Reacţiile enzimatice prezintă
însă unele deosebiri caracteristice faţă de reacţiile catalitice obişnuite, omogene sau
eterogene.

2. STRUCTURA ŞI CONFORMAŢIA ENZIMELOR

Structura chimică a enzimelor condiţionează activitatea biologică a acestora.

Studiul structurii primare a enzimelor se bazează pe investigarea secvenţelor de
aminoacizi.
Definirea structurii secundare este foarte importantă pentru definirea
conformaţiei. Dintre conformaţiile specifice enzimelor amintim:
1. Conformaţii specifice
a) conformaţia α – helix caracterizată prin existenţa unor regiuni torsionate
sub forma unui helicoid.
b) Conformaţia β- pliată – evidenţiază existenţa succesivă a unior planuri
pliate care formează deschideri angulare de 90º.
2. Conformaţii dezordonate („random coil”) care pot fi specifice enzimei
carboxipeptidaza A.
Structura terţiară reprezintă o stare de organizare mai avansată, legăturile
chimice în acest caz fiind disulfidice, dipol-dipol, fosfodiesterice şi eterice. Acest
tip de structură reprezintă forma de stabilitate maximă.
Structura cuaternară reprezintă cel mai înalt nivel de organizare al
macromoleculelor, care a permis o mai clară definire a tipurilor de enzime.
Sub aspect structural enzimele aparţin la două clase de compuşi:
a) holoenzime – care au compoziţie exclusiv proteică
b) heteroenzime - au o componentă proteică (apoenzimă) şi o componentă
prostetică (coenzima).

3. SITUSURI ENZIMATICE: SITUSUL CATALITIC, SITUSUL

ALLOSTERIC

Se ştie că nu toate enzimele necesită colaborarea unei coenzime. Coenzimele

intervin mai ales în reacţiile de transfer: de hidrogen, de electroni, de grupe de fosfat, de
1
acetil, etc. Numeroase enzime, printre care şi hidrolazele îşi exercită acţiunea lor
enzimatică fără intervenţia unei coenzime. Enzima este activă numai în forma ei nativă,
căci prin denaturare activitatea specifică a enzimelor dispare. Activitatea enzimatică este
însă restabilită atunci când enzima poate fi regenerată, adică atunci când poate fi
reconstituită structura terţiară sau cuaternară a proteinei distrusă prin denaturare.
Se ştie însă că nu toată catena polipeptidică a enzimei participă la actul propriu-
zis al catalizei, ci numai o mică porţiune a ei, numai anumite grupe, dintr-o regiune bine
delimitată a catenei polipeptidice, aşa numitul situsactiv al enzimei. La această constatare
s-a ajuns prin experienţe de inhibare a activităţii enzimei blocând situsul activ cu anumiţi
reactivi cu care acesta se combină. Inhibitorii de acest fel acţionează în proporţie
stoechiometrică faţă de enzimă, ceea ce este un indiciu că ei reacţionează cu anumite
grupe ale catenei polipeptidice.
Enzimele sunt caracterizate prin anumite particularităţi structurale care le conferă
activitate catalitică. Aceste regiuni sunt denumite situsuri care au în compoziţia lor o
secvenţă caracteristică de aminoacizi.
Situsul catalitic reprezintă zona la care se leagă substratul, fiind important pentru
manifestarea activităţii biocatalitice. Acesta are o geometrie spaţială perfect ordonată, şi
asimetrică din punct de vedere structural, la nivelul căreia se exercită proprietatea
catalitică.
Situsul allosteric este destinat reglării unir secvenţe de reacţii biochimice.
Prezenţa acestuia explică mecanismele de reglare enzimatică specifice unor procese
metabolice. În urma interacţiunilor allosterice intervine un efector allosteric (activator sau
inhibitor) care se leagă la situsul allosteric. Acesta este dispus în vecinătatea situsului
catalitic.

4. ENZIME CU STRUCTURĂ HOLOPROTEIDICĂ

Enzimele cu structură holoproteidică sau holoenzimele sunt constituite exclusiv

dintr-o singură componentă de natură proteică – apoenzima, care are proărietăţi specifice
proteinelor: termolabilitate, catenă macromoleculară, masă moleculară mare.
Un exemplu de holoenzimă este ribonucleaza.
La enzimele holoproteidice activitatea catalitică este determinată de situsul
catalitic, care este centrul catalitic al acesteia. Prin intermediul acestuia macromolecula
participă la reacţia chimică.

5. ENZIME CU STRUCTURĂ HETEROPROTEIDICĂ

Această categorie de enzime se remarcă prin o structură complexă, având o

componentă proteică şi o componentă prostetică.
Activitatea catalitică a heteroenzimelor se manifestă prin intermediul ambelor
componete: apoenzima care reprezintă componenta proteică a enzimei care conţine
situsul catalitic şi coenima care este componenta neproteică şi în compoziţia căruia se
află un situs bioactiv.

2
 6. COFACTORII ENZIMATICI

În afară de enzimă şi substrat, mai este necesară de multe ori prezenţa altor
substanţe pentru ca reacţia enzimatică să se producă. În unele cazuri, s-a putut stabili
exact funcţiunea îndeplinită de coenzimă în procesul enzimatic.
Coenzimele îşi îndeplinesc funcţiunea catalitică asupra substratului numai în
prozenţa unei enzime. Aceasta din urmă este specific adaptată substratului; o coenzimă
poate cataliza uneori reacţiile unui număr mare de substraturi, asociată însă de fiecare
dată cu o altă enzimă. Coenzimele sunt, deci, mai puţin specifice decât enzimele.
În timp ce enzima fixează şi uneori activează substratul, coenzima participă la
reacţie, adică suferă o transformare chimică. În stadiul următor al procesului, coenzima
modificată revine la starea iniţială, fiind gata pentru o nouă reacţie. Cum reacţiile
respective sunt foarte rapide, sunt sufiente concentraţii mici de coenzimă.

7. METALOENZIMELE

Prezenţa ionilor metalelor grele (Cu, Pb, Hg, Ni) în mediu poate deteriora funcţia
biologică a unor enzime dar pot fi si activatori pentru unele enzime.
Multe enzime necesită prezenţa în mediu a ionilor de Ca2+ (α - amilaza), de Zn2+
(alcool dehidrogenaza) sau a altor ioni bivalenţi, ioni care sunt complexaţi de EDTA. În
astfel de situaţii, fie EDTA este introdus în mediu în cantităţi mici, fie mediul de extracţie
se suplimentează cu ionul metalic respectiv. Suplimentul de ion metalic trebuie realizat
cu reactivi foarte puri pentru a se evita o potenţială contaminare cu metale grele.
Unii ioni au acţiune toxică deoarece reacţionează cu grupările tiol din structura
proteinelor sau intensifică oxidarea acestora în prezenţa oxigenului. Metalele grele pot
proveni din ţesutul utilizat ca sursă biologică, din sticlărie sau din reactivi. Protecţia
contra efectelor induse de metalele grele se realizează prin introducerea în mediul de
extracţie a unor agenţi de chelatare ai acestora. Cel mai utilizat agent de chelatare este
EDTA, care la concentraţii ≤ 1 mM în mediul de extracţie minimalizează efectele
metalelor grele, capacitatea de chelatare a acestora crescând cu creşterea pH –ului. Având
în vedere că EDTA este un tampon, se recomandă adiţia sării disodice a acestuia înainte
de ajustarea pH – ului final al mediului.
Sistemele enzimatice care conţin un metal în grupa prostetică sau sub altă
formă, indispensabil activităţile lor sunt numite metaloenzime. Flavoproteinele conţin în
afară de proteină şi FAD (flavin-adenin-dinucleotidă), şi un metal, ca fier (succino-
dehidrogenază), molibden (xantin-oxidază) sau altele. Uneori ionii metalici joacă rolul de
activatori, de exemplu Mg2+ pentru multe enzime de fosforilare. Mecanismul acţiunii
specifice a acestor metale nu este cunoscut.

8. ORGANIZAREA STRUCTURALĂ A ENZIMELOR

La originea biogenezei diferitelor tiouri de enzime se află compoziţia chimică a

acestora şi modul de structurare sterică. În funcţie de organizarea structurală cuaternară a
moleculelor proteice se pot distinge mai multe tipuri de enzime:
a) enzime monomere

3
 b) enzime oligomere
c) izoenzime
d) sisteme multienzimatice.
Enzimele monomere sunt formate dintr-un singur lanţ peptidic în care se află
inclus situsul catalitic. Caracterizarea structurală a acestora se face prin secvenţializarea
catenelor polipeptidice cu definirea succesiunii aminoacizilor constituenţi. Din această
clasă fac parte: ribonucleza, lisosimul, tripsina, pepsina, carboxipeptidaza.
Enzimele oligomere sunt formate în urma asocierilor de lanţuri peptidice. Care
interacţionează ca urmare a formării unor legături chimice.
Izoenzimele sunt compuşi chimici de natură proteică care diferă prin secvenţa
aminoacizilor din moleculă, dar care catalizează aceeaşi reacţie chimică. În cazul acestora
se manifestă fenomenul de „polimorfism proteic” care atestă existenţa mai multor specii
moleculare la unele enzime. Izoenzimele au activitate catalitică identică, dar prorietăţi
fizico-chimice diferite. Din această clasă de enzime fac parte: lactat – dehoidrogenaza,
creatin-fosfokinaza, amilaza.
Sistemele multienzimatice sunt formate din mai multe catene de protein-enzime
stabilizate pron legături chimice non-covalente. În cadrul acestora fiecare enzimă
componentă are o anume localizare catalizânâd o anume reacţie specifică pentru un
anumit proces enzimatic. În funcţie de complexitatea lor, distingem: sisteme disociate, în
care enzimele participante acţionează ca entităţi distincte, sisteme asociate, care includ
enzime asociate într-un complex enzimatic, şi sisteme macroasociate care prezintă
particularităţi structurale incomplet elucidate.

9. SPECIFICITATEA ENZIMELOR

La originea specificităţii se află proprietăţile fizice, chimice şi biochimice ale

enzimelor. Prin această noţiune poate fi explicată modalitatea de realizare a interacţiilor
enzimatice.
Specificitatea enzimatică este condiţionată de configuraţia moleculei prin care
este posibilă interacţia cu substratul.
1) Specificitatea de substrat are în vedere următoarele aspecte: compoziţia
substratului, particularităţile sterice ale acestuia şi relaţia structură – activitate.
a. Specificitatea absolută este caracteristică acelor enzime care
acţionează strict asupra unui singur substrat (ex: ureaza acţionează
doar asupra ureei, în cadrul procesului de ureogeneză; anhidtaza
carbonică intervine în procesele de biogeneză şi biodegradare ale
acidului carbonic).
b. Specificitatea relativă prezintă posibilitatea ca unele enzime să aibe
un spectru biocatalitic mai larg. Din această categorie fac parte:
hexokinaza, fosfataza, alcool-dehidrogenaza, unele proteaze.
c. Specificitatea sterică este caracteristicvă compuşilor chimici care se
pot prezenta în mai multe forme izomere (ex: L-aminooxidaza şi D-
aminooxidaza).
2) Specificitatea de acţiune se remarcă la acele enzime care catalizează o
anumită categorie de reacţii chimice.

4
 Specificitatea enzimelor sugerează participarea enzimei la reacţia chimică, adică
la formarea unui complex între enzimă şi substrat.

10. MECANISMUL ŞI CINETICA REACŢIILOR ENZIMATICE

Există o reacţie între enzimă (E) şi substrat (S) cu formarea unui complex enzimă
– substrat (ES) şi în final formarea produsului de reacţie (P) şi eliberarea enzimei (E).
Teoretic cataliza enzimaticã corespunde urmãtoarei scheme de reactie:

unde S este substratul, E-enzima, P-produsul şi SE complexul substrat-enzimã.

Viteza de reacţie poate fi exprimatã prin relaţia:

Ţinând cont de faptul cã:

şi conform principiului stãrii stationare:

Constanta lui Michaelis este definitã prin constanta de echilibru a reacţiei:

si se poate exprima ţinând cont de relaţiile de mai sus prin:

.
Viteza de reactie este datã deci prin:

.
Ea depinde deci de valoarea constantei lui Michaelis, de concentraţia substratului
liber şi de concentraţia iniţialã a enzimei.
Reacţiile enzimatice prezintã o serie de deosebiri faţã de reacţiile catalitice
obişnuite, deosebiri determinate de activitatea enzimelor, temperaturã, pH, specificitatea
enzimelor, formarea unui complex intermediar între substrat si enzimã, coenzime.
În cazul reacţiilor enzimatice, pe măsură ce trece timpul cantitatea de substrat
transformată se micşorează, iar după un timp mai lung reacţia practic încetează.

5
Inactivarea enzimelor se explică prin denaturarea lor sau prin alte transformări datorită
caracterului lor proteic.
Anumite reacţii pot fi catalizate de enzime, iar reacţia enzimatică decurge cu
viteze diferite.
a) Influenţa concentraţiei enzimei
Este cunoscut faptul că reacţiile enzimatice se desfăşoară în condiţiile unui exces de
substrat NU există o linearitate între variaţia vitezei de reacţie şi concentraţia enzimei. La
concentraţii mici ale enzimei linearitatea poiate fi observată, dar la concentraţii crescute
se produce o modificare neliniară a vitezei de reacţie. La viteza iniţială, panta este
proporţională cu cantitatea de enzimă.
b) Influenţa concentraţiei substratului
Viteza de reacţie iniţială creşte din ce în ce mai încet cu concentraţia
substratului, până ce atinge o valoare constantă maximă, dincolo de care viteza nu mai
variază cu concentraţia. La concentraţii mici de substrat, reacţia este de ordinul I, iar la
concentraţii mari devine de ordinul zero faţă de substrat.
Teoria Michaelis–Menten se bazează pe următoarele premise:
1) concentraţia substratului – [S] este foarte mare comparativ cu concentraţia enzimei –
[E] => toată enzima este legată pentru a forma complexul enzim-substrat.
2) condiţiile sunt asfel incât se acumulează foarte puţin produs de reacţie; formarea
complexului enzimă-substrat este practic neglijabilă
3) viteza de formare a complexului enzimă-substrat este egală cu viteza de desfacere a
enzimsubstratului, deci practic concentraţia enzim-substratului – [ES] – este constantă.
Pe baza acestor premise se obţine ecuaţia Michaelis-Menten în care viteza de
reacţie este dată de:

V = Vmax[S]/Km + [S]
Vmax – viteza maxima reactiei
Km – constanta Michaelis-Menten
[S] – concentratia substratului

Din ecuaţia Michaelis-Menten rezultă că la valori mici ale concentraţiei

substratului viteza creşte direct proportional cu concentraţia substratului în timp ce la
valori mari ale concentraţiei substratului viteza de reacţie tinde să atingă viteza maximă şi
este independentă de concentraţia substratului. Teoria Michaelis-Menten introduce şi
parametrul cu care se pot caracteriza proprietăţile catalitice ale enzimei: eficienţa enzimei
prin Km şi puterea catalitică prin Vmax.
c) Influenţa temperaturii
Viteza reacţiilor enzimatice creşte ca a celor mai multe reacţii între molecule
covalente, cu temperatura, potrivit cunoscutei reguli a lui van’t Hoff, şi anume o urcare a
temperaturii cu 10˚ produce o creştere a vitezei de reacţie cu un coeficient 1.5 – 3.
Creşterea aceasta se observă însă numai la temperaturi joase. Odată depăşită o anumită
temperatură optimă, la care viteza este maximă, aceasta scade, iar la temperaturi mai
înalte, reacţia încetează. Fenomenul se explică prin faptul, semnalat mai sus, că la
temperaturi mai înalte, enzimele sunt inactivate prin denaturarea componentei proteice.
d) Influenţa pH-ului.

6
 Activitatea enzimelor depinde, într-o foarte mare măsură de concentraţia ionilor
de hidrogen din soluţie. Curbele reprezentând variaţia vitezei de reacţie cu pH-ul prezintă
de obicei un maxim pronunţat la un anumit pH, în timp ce la valori ale pH-ului diferind
cu 1 faţă de acest maxim, viteza de reacţie prezintă valori considerabil mai mici. Din
cauza acestei particularităţi este necesar ca în cursul reacţiilor enzimatice să se menţină
pH-ul optim constant, prin folosirea de tampoane.
e) Influenţa activatorilor şi inhibitorilor enzimatici
Modulatorii enzimatici pot mări sau micşora activitatea catalitică, influenţând
viteza de reacţie.
Inhibitorii enzimatici pot produce inhibarea reversibilă sau ireversibilă.
Inhibarea ireversibilă este produsă de substanţe chimice care se leagă covalent la
molecula de enzimă, ducând la formarea de complecşi stabili, inactivi. Din această
categorie de inhibitori fac parte unele metale grele: Cd, Sn, Pb. În cazul inhibării
reversibile substanţa se leagă la centrul activ al enzimei prin legături slabe.
Activatorii enzimatici prezintă interes din punctul de vedere al faptului că aceştia
cresc viteza reacţiilor enzimatice.Din categoria acestora fac parte ioni metalici: Mn2+,
Zn2+, Mg2+, Fe2+, şi nemetale Cl-.
În cazul ionilor metalici se face distincţia între: enzime activate de metale – când
ionul metalic are rolul de activator enzimatic şi enzime cu conţinut de metale în care
ionul este constituent al protein-enzimei.

Concepte şi noţiuni de reţinut

- în afară de enzimă şi substrat, mai este necesară de multe ori prezenţa
altor substanţe pentru ca reacţia enzimatică să se producă. În unele cazuri,
s-a putut stabili exact funcţiunea îndeplinită de coenzimă în procesul
enzimatic. Coenzimele îşi îndeplinesc funcţiunea catalitică asupra
substratului numai în prozenţa unei enzime. Aceasta din urmă este specific
adaptată substratului; o coenzimă poate cataliza uneori reacţiile unui
număr mare de substraturi, asociată însă de fiecare dată cu o altă enzimă.
- Coenzimele sunt mai puţin specifice decât enzimele. În timp ce enzima
fixează şi uneori activează substratul, coenzima participă la reacţie, adică
suferă o transformare chimică. În stadiul următor al procesului, coenzima
modificată revine la starea iniţială, fiind gata pentru o nouă reacţie. Cum
reacţiile respective sunt foarte rapide, sunt sufiente concentraţii mici de
coenzimă.

Întrebări de autoevaluare, aplicaţii, probleme

1. Holoenzime şi heteroenzime: definiţie, prezentare, exemple.

2. Care sunt centrele active ale enzimelor?
3. Care este modalitatea de realizare a interacţiilor enzimatice?
4. Definiţi noţiunea de specificitate de substrat.
5. Prezentaţi pe scurt ecuaţia Michaelis-Menten.