Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Introducere in Virusologie
Introducere in Virusologie
Viorel
Alexandrescu
Medic Primar
Doctor n tiine medicale
Cercetator stiintific I
Institutul Cantacuzino
Director Centrul Naional de
Grip
VIRUSOLOGIE
CURS
PARTEA I GENERALA
1962 - Lwoff A., Home R, Tournier P.: elaboreaza criteriile unui sistem de clasificare a
virusurilor.
1962 - Burkitt D.: descrie limfomul Burkitt.
1962 - Parkman P.D. si colab.: izoleaza v. rubeolos.
1963 - Dulbecco R., Vogt M., Weil R. M., Vinograd J.: demonstreaza structura circulara
a ADN la v. polyoma
1964 - Epstein M.A., Achong B.C., Barr Y.M.: demonstreaza etiologia virala a limfomului Burkitt.
1966 - Meyer H.M. si colab.: prepara vaccinul antirubeolos viu atenuat (HPV-77).
1966 - Nirenberg M.V., Ochoa Khorana H.G.: descifreaza codul genetic.
1967 - Blumberg B.S. si colab.: detecteaza antigenul Australia
1968 - Bunyak E. si colab.: prepara vaccinul antiurlian viu atenuat.
1968 - Martini G.A., SchmidtH.: izoleaza v. Marburg.
1970 - Temin H.M., Mizutani S., Baltimore D.: descopera reverstranscriptaza.
1970 - Kates J. Beeson J.: evidentiaza poliadenilarea ARNm la Poxviridae.
1972 - Morrow J.F., Berg P., Mulder C, Delius H.: demonstreaza specificitatea enzimelor de restrictie.
1973 - Danna K.J. si colab.: construiesc prima harta genomica (SV40), cu ajutorul
enzimelor de restrictie.
1973 - Feinstone S.M. si colab.: evidentiaza v. hepatitei A.
1974 - Takahashi K. si colab.: prepara vaccinul viu atenuat varicelos (tulpina Oka).
1975 - Kohler G. si Milstein C.: prepara Ac monoclonal
1975 - Furuichi Y. si colab.: descopera structurile ,,cap ale ARNm la Reoviridae.
1976 - Steelin D. si colab.: evidentiaza pentru prima data oncogenele (v. Rous).
1977 - Chow L.T. si colab.: observa fenomenul de splicing al transcriptelor ARN la
adenovirusuri.
1977 - Eradicarea globala a variolei (s-a inregistrat ultimul caz de variola).
1978 - Lee H.W. si colab.: izoleaza v. Hantaan.
1979 - Liane D.P., Crawford L.V., LinzerD., Levine A.J.: descopera proteina
antioncogena p 53 si interrelatiile cu Ag tumorale (SV40).
1980 - Poiesz B. J. si colab.: izoleaza particule retrovirale C din limfoame de tip T,
cuta-nate, umane.
1980 - Fowlkes D.M., Schenk T.: evidentiaza mecanismele de reglare asociate, ale polimerazei III (adenovirusuri).
1981 - Jackson D.A., Symons R.H., Berg P.: construiesc primul vector de expresie al
unui virus animal (ADN SV40).
1981 - Wilson J., Wiley D., Skehel J.: descriu structura atomica la HA v. gripal.
1981 - Grass P., Dhar R., Khouri G,: evidentiaza structurile de tip promotor in transcriere (SV40).
1982 - Takatsuki K. si colab.: demonstreaza etiologia virala a leucemiei T a adultului.
1982 - Prusiner S .B.: descopera prionii (PrP).
VIRUSURI
DEFINITIE:
Caractere:
dimensiuni foarte mici (nm)
structura simpla
parazitism dezvoltat (multiplicare doar in celule
vii)
unitatea morfofunctionala infectioasa = virion
(corpuscul elementar)
IMPORTANTA:
determina boli aparente (sindroame
definite) si/sau inaparente la om si
animale
ORIGINEA VIRUSURILOR
gene
EVOLUTIA
VIRUSURILOR
Virusuri ARN
prima molecula vie a fost un ARN auto catalitic cu dubla actiune: codificare si
enzimatica
formele existente provin din ARN-ul primordial sau din interactiuni genetice
intre virusurile ARN
Mecanisme:
Virusuri ADN
Mecanisme:
- mutatii: rata mai mica, unele apar la presori de selectie (antivirale)
- recombinarea: acapararea de gene noi de la alte virusuri sau gene
celulare ( inclusiv de la plasmide sau epizomi)
EFECTELE EVOLUTIEI
Mecanisme:
mutatii cu acumulare lenta (drift antigenic)
recombinarile/reasortarile (shift antigenic)
FACTORI FAVORIZANTI:
CLASIFICAREA VIRUSURILOR
(Comitetul International de Taxonomie Virala)
CRITERII:
1. caracteristici virion: dimensiuni, forma, structura, +/- invelis, forma, simetrie
2. genom: tip (AND sau ARN), nr. catene, forma catene (liniara sau circulara), sens
catene (+ sau -), nr. segmente, dimensiune
3. mod multiplicare: transcriere, translatie, loc ansamblare/maturare
4. proteinele virale: nr., structura (secvente a.a), functii (transcriptaze,
reverstranscriptaze, hemaglutinine, neuraminidaze, factori de fuziune)
5. comportament la agentii fizici (temperaturi, radiatii) si chimici (ioni, solventi,
detergenti)
6. proprietati biologice: spectru de gazda (bacterii, plante, animale), mod transmitere
7. patogenitate/tropism tisular: neurotropism (virusul rabic, virusuri encefalitice);
v.dermatotrope (poxvirusuri); respiratorii (virusul gripal, virusuri paragripale);
limfotrope (HTLV I si II); hepatitice (HVB, HCV); enterotrope (enterovirusurile)
8. distributie geografica (virusul encefalitei japoneze, virusul encefalitei West-Nile)
ORDINE :
Caracter definitoriu:
inrudire
MONONEGAVIRALES cu FAMILIILE:
Bornaviridae
Paramyxoviridae
Filoviridae
Caractere:
NIDOVIRALES cu FAMILIILE:
Coronaviridae
Arteriviridae
Caractere:
infecteaza mamiferele
genom: ARN (liniar, monocatenar, sens +) cu
functie de ARNm
CAUDOVIRALES cu FAMILIILE:
Myoviridae
Siphaviridae
Podaviridae
Caractere:
infecteaza Bacteria (bacteriofagi) si Archea
FAMILIA
Caractere definitorii:
cuprind virusuri cu caractere comune
(morfologie virion, organizare genomica)
origine comuna a virusurilor
pot exista si subfamilii, denumire + virinae
(Alphherpesvirinae)
GENUL
Caractere:
grup de specii dintr-o familie cu
proprietati comune distincte
denumire = virus (Morbillivirus)
SPECIE
Caractere:
grup
denumire:
virus Ebola
NUMAR VIRUSURI
CUNOSCUTE/CLASIFICATE
4.000 specii cu
30.000 tipuri si subtipuri
VIRION
MORFOLOGIE
1.
2.
3.
4.
5.
6.
MARIMEA VIRUSURILOR
Sunt mai mici decat bacteriile (100-1000 ori),
cu dimensiuni care variaza intre 18-30 nm
(parvoviridae, picornaviridae), 450 nm
(poxviridae), 900 nm (forme filamentoase,
dar cu diametru mic 80 nm - filoviridae).
FORMA
sferica: virus cu invelis (virusuri gripale, virusuri
paragripale, virusuri herpetice), virusuri fara invelis (virusul
polio, adenovirus)
cilindrica (rigida/flexibila): virusul mozaicului tutunului,
fagi
paralelipidica: virusul variolic, virusul vaccinia
cartus: virusul rabic
filamentoasa: virusul Ebola
sferica cu prelungire (coada): b. fagi
STRUCTURA VIRION
genom
capsida
+/- nveli viral
Genom
1.
2.
3.
4.
Capsida virala
complexe proteice cu arhitectura si structura specifica care invelesc
acidul nucleic
protectie ac.nucleic
INVELISUL VIRAL
Structura:
1.
2.
codificata de virus:
a.spiculi (peplomere):
b. proteina M (matrix):
Functii invelis:
protectia
nucleocapsidei
atasare la receptori celulari
ansamblare virion prin proteina M
determina activitati ca:
hemaglutinare, hemadsortie,
hemoliza, fuziune
ENZIME VIRALE
1. ale invelisului
2. nestructurale, legate de nucleocapsida cu rol in replicarea
genomului si sinteza de proteine virale:
incomplete, virusuri
nefunctionale, acizi nucleici = formatiuni
independente neviabile inafara celulei
replicarea depinde de celula gazda cu
exceptia prionilor (autoreplicare)
pot determina boli la om si animale
Virusuri defective
Virusuri satelite
Viroizi
ARN
Prioni
agentii
ACTIUNEA
AGENTILOR
FIZICI, CHIMICI si
BIOLOGICI
asupra VIRUSURILOR
Mod de actiune:
distrugere/inactivare: atenuare, sterilizare
conservare: transport produse patologice, pastrare laborator, mentinere
vaccinuri cu virusuri vii
modificare: atenuarea patogenitatii
Efectele depind de:
natura agentului, concentratie, timp de actiune
tipul de virus: cele fara anvelopa mai rezistente
mediul cu virus: produse patologice (sange, plasma, excretii, secretii) au
rol protector
Sensibilitatea diferitelor structuri:
acidul nucleic: radiatii UV, substante chimice (formaldehida, hipocloritul
de Na), agenti mutageni (ac. nitros, hidroxilamina), substante radioactive
cu P, H
proteine virale: radiatii UV, enzime proteolitice, substante chimice (fenol,
formaldehida)
invelisul: solventi (eter, cloroform), detergentii anionici
Agenti fizici:
Temperatura:
caldura uscata:
- mediu ambiant : + 180C - +250C (viabilitate: 2-3 ore = v. gripal,
v. rujeolos; 7 ore = v. Ebola, v. Marburg; 24 ore = v. Epstein-Barr;
3 luni = v. coxsackie; >1 an = v. variolic
- temperaturi intre +560C si + 1000C pe durata de 30 min.
inactiveaza majoritatea virusurilor
- la +560C sunt inactivate: v. gripale (5 min.), v. urlian (20 min.),
adenov/ herpesv/poliov (30 min)
- sensibilitatea depinde de : tipul de virus (v. rujeolos = 3 minute
la +600C, v. Ebola = 1 ora la 600C, v. hepatitei = 1ora la +1600C),
substante protectoare (organice sau saruri ca Cl 2Ca si Cl2Mg )
caldura umeda :
FRIGUL
Conserva virusurile si mentine infectivitatea.
DESICATIA
pH-ul
RADIATIILE
Efectele depind de: tipul de radiatie (ionizanta, neionizanta) si durata de expunere
radiatii neionizante:
- lumina poate scadea viabilitatea si difuziunea virusurilor (v. aerogene determina
epidemii in sezoanele cu insolatie scazuta)
- radiatiile UV au actiune virulicida asupra unor virusuri prin alterarea bazelor ac
nucleici (v. polio, v. rabic, v. urlian = distruse instantaneu; v. hepatitei A si v.
rujeolos = distruse in 1-2 min.), exceptie fac v. hepatitei B si HIV care sunt
rezistente.
radiatii ionizante: au efect virulicid prin alterarea ac. nucleici si a proteinelor
virale
- radiatiile X, gamma, alfa si beta inactiveaza virusurile in functie de doza si tip
de virus (v. gripal rezista pina la 2400 R/RX, iar v. polio pina la 50.000 R timp de
40 min.)
- radiatiile ionizante nu afecteaza antigenitatea
- se folosesc la sterilizarea materialelor si a instrumentarului de unica folosinta
- pot avea efect mutagen in doze mici
ULTRASUNETELE
Efecte posibile la >20kHz/sec.:
1. pierderea infectivitatii prin disruperea
virionului
2. cresterea unor activitati prin desfacerea
invelisului (v. gripal cresterea titru HA)
3. fara afectare: v. rujeolos, v. aftos
AGENTI CHIMICI
Substante virulicide:
AGENTI CONSERVANTI
glicerol (50%) mentine infectivitatea timp
indelungat: v. polio (6 ani); v. herpetic (5
ani); v. febrei galbene (2 luni)
sarurile de Mg. si Na mentin infectivitatea
la temperaturi ridicate (Cl2Mg v. polio la
+500C)
AGENTI BIOLOGICI
CULTIVAREA VIRUSURILOR
Virusurile se replica numai in celule vii (eucariote
sau procariote).
Cultivarea virusurilor se poate face in urmatoarele
sisteme:
I. substraturi celulare
II. oua embrionate
III. animale de laborator
I. Substraturi celulare:
a) Celulele
- sursa :
Clasificare :
a. mod de cultivare:
cultura in monostrat = strat celular continuu obtinut prin aderare si multiplicare pe
sticla sau plastic (flacon, tub, placi cu godeuri). Ele pot fi: stationare (plan
orizontal), rotate (flacoane cilindrice cu o viteza de 14 - 16 rotatii/min.)
cultura in suspensie (fermentoare cu agitatie continua). Randament foarte mare.
cultura pe microsfere (sticla, colagen, polistiren cu dim. de 5 mm )
b. mod de obtinere si caractere cariotip:
culturi primare: se obtin prin trisinizare, cariotipul este similar cu cel de origine
(diploid), supravietuiesc 7-21zile, se mentine tipul de celule (epitelial sau
fibroblastic)
culturi secundare: se obtin prin tripsinizarea culturilor primare sau cu
EDTA/versen (chelatori), au caractere asemanatoare cu cele primare
culturi diploide: se obtin din tesuturi embrionare, se pot face 20-50 de subcultivari,
celule de tip fibroblastic, se folosesc la vaccinuri (MRC5)
culturi heteroploide (linii celulare continue): subcultivare nelimitata, se obtin din
tesuturi tumorale sau transformate (virusuri, radiatii, substante chimice). Cresc
rapid (2-3 zile), se folosesc in diagnosticul de laborator.
b) Medii nutritive
Asigura multiplicarea si viabilitatea celulara.
1. Medii biologice: plasma, extracte embrionare, lichid amniotic. Se folosesc
limitat.
2. Medii sintetice :
- compozitie:
MODIFICARILE CULTURII
CELULARE INDUSE DE VIRUSURI
1. Efect citopatic (perturbari celulare structurale si functionale):
- tip:
litic: celulele se rotunjesc, devin mai refringente si se desprind (enterov.)
sau se maresc si se grupeaza (ciorchine) urmate de o desprindere rapida
(adenov.)
formare de sincitii: fuziunea membranelor celulare cu aparitia de forme
gigante cu mai multi nuclei (v. sincitial repirator, HIV, v. rujeolos)
citotoxic: distrugeri masive cu desprindere rapida
- timp de aparitie si intensitate:
24-48 ore cu distrugere in 3-4 zile: v. polio
3-4 zile cu desprindere totala in 7-10 zile: v. Rujeolos
2. Formarea de plaje: reprezinta un efect citopatic limitat produs de o
singura particula virala; se foloseste la clonarea virusurilor
Culturi
celulare
folosite
curent in
virusologie
UTILIZAREA
CULTURILOR DE CELULE
diagnostic
(izolare si identificare)
obtinerea unor reactivi de diagnostic
prepararea de vaccinuri virale
2. Structura:
cochilie
camera de aer
membrana proprie
membrana chorio
1. Ou embrionat: a) cochilie; b) membrana proprie; c) membrana
corioalantoidiana; d) lichid alantoidian; e) sac vitelin; f) sac amniotic
continand lichid amniotic; g) camera de aer; h) sac albumen; i) embrion
3. Selectie:
oua embrionate de gaina de 10-11 zile cu coaja alba; incubare la 39 0C, umiditate
75-80%
4 . Inocularea:
pe membrana chorioalantoidiana: pentru virusuri care produc leziuni de tip pocks
(v. vaccinia, v. herpetic, v. oncogene, v. Rous)
in cavitatea alantoidiana : v.gripale A si B
in cavitatea amniotica : v. gripal C si v. urlian
in sacul vitelin : v.herpetic
5. Modificari determinate de virusuri:
leziuni ale mca: nodulare (pocks) date de poxvirusuri, v. herpetice, v. Rous
activitate hemaglutinanta a lichidelor amniotice si alantoice: v. gripale A, B,C si v.
urlian
moarte embrion: v. urlian, v. herpetic
6. Utilizare:
diagnostic (izolare, caracterizare): v. gripale
preparare reagenti de diagnostic: gripa
preparare de vaccinuri: gripal
1. Surse:
mamifere mici: soarece, hamster, sobolan, cobai maimuta, dihor
mamifere mari: oaie, capra, cal, vitel
pasari: gaina, rata, curcanul
2. Selectia:
a. susceptibilitatea la infectia virala:
3. Utilizarea animalelor:
Substrate celulare in vitro utilizate mai frecvent in laboratoarele de culturi celulare si diagnostic
virusologic
continuare