CITOMETRIA

DE FLUX
 CE ESTE CITOMETRIA
DE FLUX?
 Metodă de măsurare a caracteristicilor fizice
şi/sau biochimice ale particulelor (celule,
nuclei, organite celulare):
 Mărimea
 Granularitatea
 Cantitatea de ADN
 Antigene de suprafaţă

 Metodă de sortare a celulelor

 ETAPE
1. Prepararea suspensiei de celule

2. Marcarea celulelor

3. Achiziţia datelor

4. Stocarea datelor

5. Interpretarea datelor
PRODUCEREA ANTICORPILOR
MONOCLONALI
Antigen

Fuzionarea
celulelor 
HIBRIDOM Mielom

Plasmocite
producatoare de Ac Testarea clonelor

Cultivarea
hibridoamelor

Hibridoamele se separa Clonele

si se cultiva dorite se
cultiva sau
se
Mentinerea congeleaza
hibridoamelor in
soareci
Anticorpii monoclonali
sunt purificati
 FLUOROCROMII
 AcM sunt conjugaţi cu fluorocromi
 Spectru de absorbţie (excitaţie)
 Spectru de emisie
 Pentru 2 parametri – 2 AcM cuplaţi cu 2
fluorocromi cu spectre de emisie diferite:
 Izotiocianat de fluoresceină (FITC)
 Phycoeritrină (PE)
IMUNOFLUORESCENŢA
Numar de evenimente

FITC FITC

FITC

FITC
FITC FITC

101 102 103 104

Intensitatea fluorescenţei
 COMPONENTELE
CITOMETRULUI DE FLUX
 Sistem fluidic

 Sistem optic

 Sistem electronic
 SISTEMUL FLUIDIC
 Celule aflate în suspensie:
 Sânge
 Lichid sinovial
 LCR
 Ganglioni limfatici
 Tumori solide
 Lichid de “înveliş”
 Curent intern unicelular – “şir indian”
 Intersectare cu un fascicul de lumină
 SISTEMUL FLUIDIC

Ac de injecţie

Lichid de
Cameră de “înveliş”
scurgere

Flux
laminar
 SISTEMUL OPTIC DE
EXCITAŢIE
 Sursa laser (Ar λ=488 nm)
 Fascicul luminos  dispersie şi stimularea
fluorocromilor
 Dispersia luminii:
 α=0  Forward Scatter (FS)  dimensiunea
 α=90° Side Scatter (SS)  granularitatea
 Emisia luminii fluorescente:
 ~ cantitatea de fluorocromi  info calitative şi
cantitative
 Elemente optice de focalizare (lentile)
 FS ŞI SS

Forward Scatter
LASER

LASER

Side Scatter
 SISTEMUL OPTIC DE
COLECTARE
 Conversie semnal optic  semnal electronic

 Detectori pentru:
 Lumina dispersată: în faţă, lateral
 Emisia de fluorescenţă
 Filtre optice
CITOMETRUL DE FLUX
 SISTEMUL ELECTRONIC
 Recepţionarea impulsurilor detectorilor
 Prelucrarea semnalului
 Prezentarea rezultatelor:
 Histograme – 1 parametru
 Grafice – 2 parametri: 1 punct = 1 particulă (dot-
plot)
ELEMENTE FIGURATE
 GRAFIC DOT-PLOT PENTRU
FITC ŞI PE

PE+ FITC+ / PE+

PE FL

FITC- / PE-

FITC FL FITC+
FITC / PE
 SORTAREA CELULELOR
 Separarea unei (sub)populaţii celulare dintr-
un amestec:
 Mărime
 Granularitate
 Antigene de suprafaţă
 SORTAREA CELULELOR -
ETAPE
1. Identificarea criteriului
2. Marcarea cu AcM+fluorocromi
3. Identificarea celulei – e de interes?
4. Încărcare cu sarcini pozitive/negative/fără
5. Câmp magnetic – deflectare spre tuburi
colectoare
6. Centrifugare
SORTAREA CELULELOR

LASER 488 nm Senzor FS

Detector de
fluorescenţă

Plăci încărcate - -
+
magnetic + -

Tuburi de colectare
 APLICAŢII
 Analiza subpopulaţiilor limfocitare
 Diagnosticul hemopatiilor maligne
 Biologie celulară
 Identificarea unor molecule HLA
 Determinarea unor autoanticorpi
 Studiul ciclului şi al funcţiilor celulare
 Diagnosticul, evoluţia, prognosticul tumorilor
maligne solide
 Microbiologie
 ANALIZA ADN

M G0
G2
G1
E G0G1
v
s e
n
i
m
e
n
t s G2 M
e
0 200 400 600 800 1000
2N 4N
Cantitatea de ADN
 ANALIZA ADN
300

E
225

v
e
n
i
150

m
e
n
75

t
e
0

0 200 400 600 800 1000

2N 4N
Fluorescenţă PE
 ANALIZA ADN
300

Index ADN 1,21

E
225

v
e
n
Peak aneuploid
150

i
m
e
n
75

t
e
0

0 200 400 600 800 1000

Fluorescenţă PE