INSTITUTUL NATIONAL DE CERECETARE DEZVOLTARE PENTRU FIZICA SI INGINERIE NUCLEARA HORIA HULUBEI

Sistem de manegement al calitatii certificat

LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE
Aleea Reactorului nr.2, Com. Magurele, jud. Ilfov, RO 19617 CP MG-6 tel. 021-404.23.20 fax 021-404.23.19 e-mail: cponta@ifin.nipne.ro

ISO 9001:2000

Bun

venit

la

Laboratorul de Microbiologie IRASM

INSTITUTUL NATIONAL DE CERECETARE DEZVOLTARE PENTRU FIZICA SI INGINERIE NUCLEARA HORIA HULUBEI

Sistem de manegement al calitatii certificat

LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE
Aleea Reactorului nr.2, Com. Magurele, jud. Ilfov, RO 19617 CP MG-6 tel. 021-404.23.20 fax 021-404.23.19 e-mail: cponta@ifin.nipne.ro

ISO 9001:2000

Cine suntem ?

Cu ce ne ocupam ?

Laborator de Microbiologie independent Analize pentru produse farmaceutice (medicamente, suplimente alimentare) si dispozitive medicale Document de referinta: European Pharmacopoeia, ed. a V-a Clienti: producatori de farmaceutice si dispozitive medicale, in deosebi interni

Oferta actuala cuprinde:

Teste de Sterilitate (metoda filtrarii si inocularii directe) Analize de Contaminare Microbiana:

- Numarare Total Germeni Aerobi Mezofili (TAVC) si - Detectia prezentei: Salmonella sp., E. coli, St. arureus si Ps. Aeruginosa - Detectie si cuantificare: Enterobacterii totale si alte bacterii gram negative

Analize de Contaminarea a mediului de productie (TAVC):

aer, suprafete de lucru, apa, amprenta manusii

Am testat pana acum

Comprimate (filmate sau nu ..) Materii prime (lactoza, celuloza, talc ..) Capsule gelatinoase (goale, pline, moi, uscate ..) Geluri (unguente) Supozitoare Rasini farmaceutice Materii prime de origine vegetala (tutun, ghiara diavolului ..) Siropuri Comprese de tifon si netesut simple sau impregnate cu geluri / unguiente Seringi, ace seringa, perfuzoare .. Pansament toracic (tifon + vata)

Si chiar

Flacoane goale (plastic, metal, su sau fara capac ..) Spray cu antibiotic Mojarat din insecte Carti vechi ale Bibliotecii Nationale Var razuit de pe pereti ...

In total > 100 de tipuri de probe diferite

Identificarea microrganismelor patogene prin analiza secventelor genice conservate metoda PCR: principiu, procedura standard de operare, metoda de laborator, avantaje, limitari

Laboratorul de Microbiologie

Detectia microorganismelor patogene prin Metoda PCR

Proiect CEEX 78 / 2005 (BIOM)
Implementarea analizelor de identificare a microorganismelor patogene prin metode de biologie moleculara si extinderea acreditarii laboratorului IRASM

PCR = Polymerase Chain Reaction

Reactia de polimerizare in lant a Acidului Dezoxiribonucleic (ADN) Este o tehnica prin care se genereaza multiple cpii identice, pornind de la (ipotetic) 1 singura molecula de ADN - template. Mai multe molecule sunt mai usor de detectat / analizat si de prelucrat ulterior (transfer pe membrana, hibridizare, secventiere etc) Copiaza in vitro procesul biologic de Replicare a ADN

Reactia PCR a fost descoperita in 1983 de catre Kary B. Mullis

(1993- Premiul Nobel) si, dupa 1988 a cunoscut o dezvoltare exploziva si o rafinare extraordinara, fiind reactia care a revolutionat Biologia Moleculara a Acizilor Nucleici.

Dezvoltarea tehnicii are la baza descoperirea Taq-Polimerazei, enzima-cheie a reactiei, o polimeraza stabila la temperaturi inalte (~94o C), la care moleculele de ADN, in mod normal dublu catenare, disociaza si astfel fiecare catena poate fi copiata.

Licenta de utilizare a reactieie PCR este detinuta de compania Hoffman La Roche

Principiul tehnicii PCR:

- Instrument: termocycler

- Program de incalziri / raciri repetate, la to C bine precizate

moleculele de ADN se separa in prezenta enzimei Taq-polimeraza + primeri + amestec de dNTP-uri (monomerii) + MgCl2 .

fiecare catena se lasa copiata, dand nastere unei catene-surori, complet noua si identica

La randul lor, noile catene se vor separa si vor servi drept matrite Astfel, din 1 molecula initiala dublu catenara 2 molecule dublucatenare identice 4 molecule

dupa 32 de cicluri: > 1 milion de catene identice

Denaturarea moleculei de ADN-matrita

ADN-ul este o macromolecula polimerica, alcatuita din 2 catene complementare, antiparalele

5 3 5 3 3 5

3 5

La 94o C, cele 2 catene se separa Deanaturarea

Alinierea primerilor
Primerii = oligonucleotide (15-20 pb), complementare cu capetele fragmentului de amplificat; folosite ca amorsa pentru polimerizarea dNTP-urilor

Primerii se aliniaza la ~52o C

5 5 3 3 3 5 5 3

Taq extends at 72oC

Taq polymeraza recunoaste capatul 3 al primer-ului atast la catena-matrita si incepe elongarea lui

5 5 3 3 3 5

Elongarea
Nucleotidele (caramizile) se asaza pe baza de complementaritate la matrita si vor fi legate intre ele de catre Taqpolimeraza

Cycle 1

Cycle 2

Denaturare / aliniere / elongare repetate in cateva zeci de cicluri succesive

Cycle 3

Detectarea / recunoasterea ampliconilor

Ulterior, ampliconii (fragmentele ADN obtinute) se detecteaza prin electroforeza in gel de agaroza avand aceeasi dimensiune, toate moleculele vor avea acceasi mobilitate electroforetica si vor genera benzi la aceeasi distanta; greutatea moleculara a ampliconilor se poate afla prin compararea cu un marker de greutate care migreaza in paralel.

Reactia de polimerizare in lant a ADN, monitorizata in timp real

In PCR-ul in timp real (Real-Time PCR), produsul de amplificare este detectat prin intermediul colorantilor fluorescenti (probe). In chimia reactiei sunt incluse diferite tipuri de sonde oligonucleotidice care, intr-o anumita etapa a amplificarii, se prind specific fie de produsul amplificarii, fie de fragmentul-tinta ce urmeaza a fi copiat. FRET = Fluorescence Resonance Energy Transfer; fenomenul are loc numai cand fluorescent-ul si quencer-ul sunt apropiati Fluorescenta emisa se cumuleaza si creste in intensitate pe masura ce cantitatea de ampliconi creste

Real-Time PCR

 Monitorizarea intensitatii fluorescentei chiar in timpul reactiei PCR permite detectia si cuantificarea produsului acumulat, fara a fi nevoie de a mai deschide tuburile dupa terminarea reactiei. Asadar, un instrument de Real-Time PCR este in acelasi timp si un analizor in sine (spre deosebire, un PCR simplu realizeaza doar etapa de amplificare, urmand ca analiza si detectia produsilor sa fie facuta intr-o etapa post PCR)

real-time real-time real-time PCR

real-time
hardware

5700
Applied Biosystems

iCycler
BioRad

7700
Applied Biosystems

FluorTracker LightCycler
Roche

6000 Rotor Gene Corbett Research

Stratagene

real-time real-time
Model sonde de adiacente Model de de actiune actiune folosind folosind sonde de hibridizare hibridizare adiacente

FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)

real-time FRET

Reporter Quencher
Excitation FRET Emission P Amplicon Alinierea
P

Phosphate

95oC

Denaturarea

Tm 55oC
Citirea Fluorometrica

Excitation

FRET

Emission

Alinierea primer-ilor si a sondelor

real-time real-time LightCycler

real-time

Operation

72oC

Elongarea

(extensia primerilor)

Aplicatii ale tehnicii PCR

(conventional)

Prin detectarea prezentei unui fragment de ADN, considerat drept marker, intr-un genom
Prezenta unei anumite specii sau tulpini bacteriene intr-o populatie mixta (ex. confirmare diagnostic bacteriologic) Caracterizarea si deosebirea unor taxoni infraspecifici (ex. tulpina) cu aplicatii in epidemiologie Diferite moduri de utilizare a tehnicii pot da combinatii de markeri genomici ce pot constitui un pasaport genetic pentru respectiva varietate (licenta pentru tulpini de interes, soiuri si hibrizi in agricultura) Diagnostic uman pentru maladii non-infectioase (gena mutanta exista sau nu, individul este homo- sau heterozigot)

Aplicatii ale tehnicii Real-Time PCR

Detectia calitativa (prezent / absent) si cantitativa (cuantificare absoluta) a unor agenti infectiosi (microorganisme si virusuri) Caracterizarea unei gene de interes intr-un genom (nivel de expresie) = cuantificare relativa
Confirmarea unor maladii metabolice de supra- sau sub-exprimare a unei gene (fata de un nivel normal) Efectele unui tratament-pilot asupra exprimarii unei gene-tinta (fata de o gena housekeeping - al carei nivel de transcriere nu se modifica in urma tratamentului)

Discriminarea alelelor Detectia SNP-urilor (Single Nucleotide Polymorphism)

Aplicarea tehnicii PCR in Microbiologie

Detectia microorganismelor prin reactia PCR clasic se bazeaza pe amplificarea unor regiuni specifice din genomul acestora.
Permite confirmarea sau infirmarea prezentei microorganismului suspectat Rezultatul este de tip Microorganism X PREZENT / ABSENT in Y grame (ml) proba Exista pe piata truse de diagnostic PCR (kit-uri) - sisteme ready to use. Ele includ moleculelecheie pentru asigurarea specificitatii reactiei: primerii precum si celelalte componente (Taq, buffer etc.) care asigura amplificarea unei regiuni din genomul tinta

Etapele analizei folosind tehnica PCR (clasic):

Precultivarea esantionului de proba (5-10 h) - optional dar recomandabil,
in functie de natura probei

Extractia ADN Verificarea calitatii ADN-ului extras (spectrofotometric si / sau electroforetic) Reactia PCR Electroforeza pentru revelarea ampliconilor Rezultat: prezent / absent Timp de realizare: ~ 24-48 h de la primirea probei (cu comanda anticipata !!)

Controale asociate unei analize prin PCR (clasic)

Un ADN - Control Pozitiv (CP) Un Control Negativ (CN) Un Control Intern (CI) Marker de greutate moleculara pentru confirmarea identitatii fragmentului obtinut

Aplicarea tehnicii Real-Time PCR in microbiologie

Permite in plus cuantificarea (nr. de genoame / gram proba) Analiza este mai rapida (nu este nevoie de electroforeza)

Etapele analizei calitative prin Real-Time PCR

Precultivarea esantionului de proba (5-10 h)
optional dar recomandabil, in functie de natura probei -

Extractia ADN Verificarea calitatii ADN-ului extras Reactia PCR Rezultat: prezent / absent

Etapele analizei cantitative prin Real-Time PCR

Extractia ADN Verificarea calitatii ADN-ului extras (spectrofotometric si / sau electroforetic) Reactia PCR Rezultat: Nr. Cpii/ g (ml)
Analiza foloseste strategia Absolute quantification: cu ajutorul unei curbe standard se genereaza un rezultat = o valoare absoluta

real-time real-time real-time

Incarcatura microbiana
2.5

real-time

PCR quantitation

Threshold Cycle

NEG 10 100

F2 / F1

1.5

1000 10000 100000 1000000

0.5 0 10 20 30 40 50 60 70

Cycles

Threshold Cycle

50 40 30 20 10 0 1 2 3 4 5 6

Threshold Cycle = 35 Load = 103.8 copies/ml

Concentration

log 10
2.5

Test Sample
F2 /F1

Threshold
1.5

Threshold Cycle
0.5 0 10 20 30 40 50 60 70

Cycles

Controale asociate unei analize prin Real-Time PCR

Internal control (IC) un ADN diferit de cel tinta, cu primerii specifici lui, care se amplifica in paralel cu proba de testat, in fiecare tub probeaza buna desfasurare a reactiei (surprinde posibilele inhibari); Metoda devine de fapt un multiplex PCR Unul sau mai multe Controale Pozitive (CP). La analizele cantitative minim 3 CP, diferite concentratii curba standard Cel putin un Control Negativ per sesiune surprinde posibile contaminari incrucisate

Rezultatele proiectului CEEX 78/2005 (BIOM) modul IV

Implementarea urmatoarelor analize:

Detectie si cuantificare Salmonella sp. prin Real Time PCR folosind kit-ul: Artus Salmonella sp. RG (Qiagen) Detectie si cuantificare Listeria monocytogenes Prin real Time PCR folosind kit-ul: Artus L. monocytogenes RG (Qiagen) Detectie si cuantificare Legionella pneumophilla din apa, prin Real Time PCR folosind kit-ul: Aqua Screen L. pneumophilla Detection Kit for Real Time PCR (Minerva) Detectie si cuantificare Legionella sp. din apa, prin Real Time PCR folosind kit-ul: Aqua Screen Legionella sp. Detection Kit for Real Time PCR (Minerva) Detectie Legionella pneumophila din apa, prin PCR clasic folosind kit-ul: Aqua Screen Legionella pneumophilla PCR Detection Kit (Minerva)

Incercarile de mai sus sunt un inceput de drum

Procedura standard de operare pentru analizele efectuate prin tehnica PCR si real-Time PCR (IRASM-SOP-T05):
- Definirea fluxului:
Camera de reactivi (portionare reactivi pentru a evita dezghetari repetate si pipetarea mixului de PCR, fara ADN) Camera de ADN (izolari si adaugare ADN in mix PCR: proba si CP Camera de amplificare si Post-amplificare
-

Precautii si reguli de buna practica de lucru in Laboratorul de Biologie Moleculara Fisa de urmarire a probei, asociata analizei prin tehnica PCR (de la primirea probei efectuarea analizei eliberarea rezultatului) Interpretarea controalelor si criterii de acceptare/respingere asociate fiecarei etape a analizei

CP CP10-1 CN

Electroforeza in gel de agaroza 2% a ampliconilor de Legionella pneumophila (Aqua Screen L. pneumophilla PCR Detection Kit - Minerva)

Graficul de fluorescenta al reactiei Real-Time PCR analiza pe probe de Listeria monocytogenes (suspensie din cultura de 24 h), folosind kit-ul Artus L. monocytogenes RG
L. monocitogenes undiluted L. monocitogenes dilution 10-1

Treshlod QS1 QS2 QS3 QS4

Curba standard in 4 puncte (Quantitation Standards )

QS4 QS3 QS2 QS1 L. monocitogenes nediluat L. monocitogenes -1 diluat 10

Graficul de fluorescenta al reactiei Real-Time PCR - analiza pe 2 izolate din probe farmaceutice, folosind kit-ul Artus Salmonella sp. RG

Treshold
Quantitaive Standards QS1, QS2, QS3, QS4

Izolat din cultura Albendazol - tablete

CN
Izolat din cultura Fish Gelatine Materie prima

Curba standard in 4 puncte (Quantitation Standards)

QS4 QS3 QS2 QS1

Cultured isolate from Fish Gelatine Materie prima

Avantajele Detectiei microorganismelor prin PCR:

Materialul genetic (ADN-ul) este componenta celulara cea mai stabila (nu se modifica cu starea fiziologica, mediul de cultura sau varsta celulei) si definitorie pentru caracterul de specie. Secventa codificata in ADN sta la baza tuturor reactiilor metabolice si a celorlalte trasaturi fenotipice (caractere de cultura, forma si aranjamentul celulelor dupa diviziune etc) care se constituie in criterii taxonomice si au condus la cheile de identificare actuale. De aceea, verificarea prezentei unei anumite secvente de ADN tipica pentru o specie/tulpina de microorganism este dovada cea mai obiectiva a prezentei lui, metoda detectand practic baza fizica (biologica) a criteriilor taxonomice. Detectarea prezentei unui fragment tipic urmarit constituie dovada inechivoca a prezentei acelui microorganism.

Tehnica este inalt sensibila, putand detecta (intro reactie optimizata) chiar 1 singura molecula de ADN-tinta / tub Detecteaza si formele viabile dar necultivabile, precum si celulele moarte dar intacte (Poate surprinde aplicarea unui tratament de decontaminare a unui material care a fost initial infectat cu microorganismul respectiv conditii de igiena - AVANTAJ ?)

Avantajele metodei PCR fata de metodele clasice

este foarte specifica (nu lasa loc de interpretari subiective), cu conditia ca primerii sa fie proprii doar unor anumite specii sau grupuri de microorganisme tehnica este rapida, evitand timpii mari de incubare permite analiza simultana a tuturor izolate lor suspecte prezente intr-o proba (prin metodele conventionale, inclusiv prin testele biochimice tip API, izolatele suspecte se repica si se testeaza separat)

Limitarile metodei

Esantionul de proba din care se face extractia ADN este (prin specificul tehnicii) mic si, in unele cazuri, poate deveni nereprezentativ: este dificil de concentrat 10 g proba solida (ex. pulbere pentru Salmonella) in ~ 100200 l de solutie ADN care va intra in reactie De aceea este recomandabila o etapa de pre-cultivare (ex. peste noapte) a intregului esantion de proba pentru a imbogati populatia tinta si a usura detectia

Abia luand in consideratie si aceste date, tehnica devine Metoda (Method)

Adunand si timpul pentru EF, analiza va dura ~ 24-48 h (desi tehnica in sine se poate efectua in ~4-5 ore) Sensibilitatea metodei este puternic dependenta de etapa de extractie ADN si anume de cat de eficient ADN-ul din masa probei de testat poate fi in final concentrat in cateva sute de l de extract. In cazul abordarilor cantitative, factorul eficienta extractiei trebuie introdus in calcule la ajustarea rezultatelor

Prezenta inhibitorilor procesului enzimatic poate conduce la rezultate fals negative (situatie care se surprinde cu ajutorul unei reactii paralele cu rol de Control Intern). Situatia este critica daca se doreste izolarea ADN direct din proba (pentru cuantificare). Fiind inalt sensibila, tehnica este predispusa la contaminari incrucisate de la amplificarile anterioare, putand conduce la rezultate fals pozitive (situatii surprinse prin asocierea unui Control Negativ, prevenite prin regulile de buna practica de laborator si reduse ca sansa prin folosirea Real-Time PCR la care tuburile cu amplicon raman inchise) Analiza cantitativa este considerabil limitata de matricea probei (mai ales pentru ca metoda nu permite preincubare) in cazul unora dintre matrici, ea este practic inaplicabila (ex. pulberi insolubile in apa) Necesesita personal cu pregatire de specialitate si experienta

Definirea domeniului de rezultate

Analiza prin tehnici PCR este din start (prin conceptie) directionata spre un anumit microorganism. Un rezultat negativ infirma prezenta acelui microorganism, fara a spune ceva despre microorganismul prezent de fapt in proba. Consecutiv, un rezultat pozitiv insotit de o valoare indica numarul de cpii genomice (care se echivaleaza cu numarul de indivizi prezenti in unitatea de proba). Metoda nu poate identifica / cuantifica alte microorganisme decat cele pentru care a fost proiectata. Proiectarea se face in mod primar, din alegerea primerilor si a conditiilor de reactie si nu poate fi ulterior ajustata in sensul modificarii domeniului de detectie. De aceea, rezultatele generate de metoda sunt absent / prezent, respectiv prezent in numar de ... / unitatea de proba Analizele posibile prin tehnica PCR se incadreaza deci la Detectarea prezentei si respectiv Cuantificare sau Detectie cantitativa In ambele cazuri, Laboratorul va stabili pentru fiecare microorganism in parte domeniul pe care metoda se poate aplica: limita minima si maxima de detectie.

Alte conditii pentru efectuare analizelor prin tehnica PCR si Real-Time PCR

Timp de realizare pentru fiecare tip de analiza: 24-48 h, in functie de data comenzii si de alte analize solicitate la acea proba Analiza pentru respectiva proba a fost anterior validata la laboratorul nostru pentru metodele conventionale (nu este la prima analiza)

Pharmacopoeia Europeana utilizarea metodelor de biologie moleculara in controlul calitatii microbiologice (Eur. Ph., ed. a V-a, Metode alternative cap.5.1.6)

Cerinte privind validarea metodei

Metoda introdusa pentru prima data in ed. a V-a (2006), la cap. 5.1.6. Metode alternative (versus Conventionale) Validarea metodei este o necesitate Fiecare tip de Incercare (Masuratoare) necesita validarea a diferiti parametri Validarea vizeaza analiza in ansamblul sau (include toate etapele procesului) Toate rezultatele parametrilor validati sunt raportate la metodele conventionale (care sunt luate drept referinta)

Validarea Analizelor de Detectie (calitative)

Acuratetea si precizia = rata relativa de aparitie a rezultatelor fals-negative si fals pozitive prin comparatie cu metodele conventionale, atunci cand se foloseste un inocul standardizat (referinta) de densitate mica Specificitatea = abilitatea metodei alternative de a detecta in proba intrega gama de microorganisme pentru care a fost conceputa si numai pe acestea (asuma si demonstrarea selectivitatii; este opusul reactivitatii incrucisate) Limita minima de detectie = cel mai mic numar de microorganisme prezent intr-o proba, ce poate fi detectat urmand un anumit protocol (se iau in considerare decat microorganismele din proba originala, nesupusa diluarii sau incubarii) Robustetea = masura capacitatii metodei de a ramane neafectata de modificari mici si intentionate in parametrii de testare; da indicatii despre corectitudinea metodei atunci cand se modifica conditii precum diferiti operatori (analisti), instrumente, loturi de reactivi si laboratoare

Validarea analizelor de Cuantificare (Detectie cantitativa)

Acuratetea = cel mai apropiat rezultat al metodei alternative de o valoare obtinuta prin metoda conventionala. Trebuie demonstrata pe tot domeniul de lucru al testului (atat in termeni de specie detectata cat si in termeni de numar de indivizi cuantificati). Se exprima ca % de recuperare a microorganismului dupa aplicarea metodei Precizia = grad de potrivire intre diferite incercari (diferenta intre rezultate) atunci cand procedura este aplicata repetat la mai multe esantioane dintr-o suspensie omogena de microorganisme in conditiile de testare. Se exprima de obicei ca variatie, deviatie standard sau coeficint de variatie al unei serii de masuratori Specificitatea = abilitatea metodei alternative de a detecta in proba intrega gama de microorganisme pentru care a fost conceputa si numai pe acestea (asuma si demonstrarea selectivitatii; este opusul reactivitatii incrucisate)

Linearitatea = abilitatea metodei alternative de a genera rezultate propotionale ca valoare cu concentratia microorganismelor prezente in proba, pe un domeniu definit de concentratii; se determina pe domeniul corespunzator scopului Domeniul = intervalui intre nivelul inferior si cel superior de microorganisme ce pot fi detectate cu precizie, acuratete si linearitate, folosind metoda alternativa; se determina prin studii de precizie, acuratete si linearitate Robustetea = masura capacitatii sale de a ramane neafectata de variatii mici dar voite ale parametrilor. Ea ofera o indicatie asupra increderii in rezultate, in diferite conditii de lucru considerate normale, precum: operatorul, instrumentele, diferite loturi de reactivi, diferite labpratoare; se poate defini ca rezistenta intrinseca a metodei la diferite influente exercitate de variabile din mediul operational sau inconjurator, asupra rezultatelor. Robustetea este un parametru ce trebuie determinat de producatorul metodei, insa daca utilizatorul modifica parametri considerati critici, acesta trebuie sa evalueze efectele acestei modificari asupra robustetii metodei. Robustetea unei metode cantitative se judeca drept abilitatea de a cuantifica, cu o relevanta statistica, diferite microorganisme-test in concentratii cunoscute, in urma varierii a diferiti parametri

Bibliografie
European Pharmacopoeia, ed. a V-a (2006), cap. 5.1.6 Alternative Methods Quality Assurance / Quality Control Guidance for Laboratories Performing PCR Analyses on Environmental Samples EPA (United States Environmental Protection Agency), October 2004 Guidelines for Acreditation of Swiss Medical Laboratories performing Nucleic Acid-based Diagnostic Procedures Doc. Nr. 323.e / 2004, rev. 00, Schweizerische Akkreditierungsstelle (SAS)