INGINERIA GENIC Ingineria genic poate fi definit drept ansamblu de metode i tehnici prin care este posibil manipularea

materialului genetic la nivel celular i molecular pentru a obine pe ci netradiionale produi utili omului i genotipuri noi, avnd la baz tehnologia moleculelor recombinate (hibride) de AD ! Ingineria genic se profileaz ca direcie tiinific i tehnologic "n anii #$%! Apariia ei a fost determinat, "n primul rnd, de aprofundarea cunotinelor de genetic la nivel celular i molecular, de dezvoltarea cunotinelor privind materialul genetic al organismelor vii, i anume& descoperirea mecanismelor principale de transmitere a informaiei ereditare& transformaia (A.Avery, C.MacLeod, M.MacCarty, '())) * prin intermediul fragmentelor de AD + se,ducia (J.Lederberg, E.Tatum, '()-) * prin con.ugarea bacteriilor i transducia (J.Lederberg, '(/0) * cu a.utorul fagilor+ descoperirea structurii moleculei de AD (J.Watson, .Cr!c", '(/1)+ descoperirea i izolarea enzimelor de restricie i legare a fragmentelor de AD (#.$m!t%, '($%)+ descoperirea fenomenului transcripiei inverse a informaiei genetice de la A2 la AD (#.Tem!n, $.M!&utan!, '.(a)t!mor, '($%)+ descoperirea sintezei chimice a genelor (A.*ornberg, '(-$+ #.*%orana, '($%, '($-)! +. (A,ELE TE#NIC-.MATERIALE ALE INGINERIEI GENICE Datorit cercetrilor de genetic molecular, a fost posibil cunoaterea structurii de profunzime a unor gene i genomuri, fapt ce a condus la elaborarea tehnologiei AD 3ului recombinat i la transferul de gene peste barierele de specie! 4ehnica recombinrii genetice n vitro include trei etape principale& ') e,tragerea sau sinteza chimic a AD 3ului din diferite specii+ 0) construirea unei molecule hibride (recombinate) de AD + 1) reintroducerea moleculei recombinate de AD "ntr3o celul vie pentru reproducerea i e,presia ei (fig! ')!

Fig 1. Etapele principale ale ingineriei genice. 5,tragerea AD 3ului se produce utilizndu3se o serie de enzime specifice, "n primul rnd, cele de restricie, capabile s rup molecula de AD "n anumite locuri! 5nzima de restricie e,tras din Escherichia coli 5co 2I recunoate urmtoarea secven de nucleotide& 67 AA448 844AA96! 2estrictazele reprezint instrumentul de baz al ingineriei genice, deoarece au capacitatea unic de a tia molecula de AD "n anumite sectoare (loci)! :rima restrictaz a fost obinut din bacteriile Haemophillus influenzae serotipul ; i se folosea pentru fragmentarea AD 3ului virusului <=3)% i cartarea lui (*e))y, $m!t%, '($%)! u toate restrictazele se utilizeaz "n ingineria genic, ci doar acele care au urmtoarele proprieti&

'

 pot tia molecula de AD "n fragmente discrete+ posed o specificitate de aciune "nalt (taie molecula de AD "ntr3o anumit succesivitate 3 >site?3ul de recogniie)+ pot forma, "n rezultatul restriciei, >margini lipicioase? la capetele fragmentului de AD (aceast proprietate nu este caracteristic tuturor restrictazelor)+ pot fi izolate relativ uor "n stare pur din mediul incubaional! @a repartiia AD 3ului este implicat AD 3ligaza, care poate lega unele fragmente de restricie! Acestea i alte enzime stau la baza obinerii moleculelor recombinate de AD (fig!0)! :entru transferul genelor de la unele organisme la altele sunt utilizai vectorii (moleculele speciale de AD ce transfer informaia genetic dintr3o celul "n alta) reprezentai prin plasmide, virusuri, liposomi, AD mitocondrial i AD cloroplastic! <istemele vectoriale, utilizate pentru transferul informaiei strine "n celulele (organismele) 3 gazd, trebuie s corespund urmtoarelor cerine& inofensivitatea vectorului+ multiplicarea rapid "n celula3gazd i lipsa posibilitilor de multiplicare "n celulele altor organisme+ prezena unui numr restrns de situri de recogniie+ prezena genelor marAer pentru selectarea de clone dup moleculele recombinate de AD + izolarea relativ uoar, clonarea i e,presia "n celulele (organismele) strine! Bn calitate de vectori, plasmidele au cptat o rspndire deosebit! :lasmidele reprezint nite molecule inelare de AD specifice bacteriilor! 5le pot e,ista autonom i determin unele caractere ale bacteriilor, cum ar fi& capacitatea de con.ugare, rezistena la antibiotice, agresivitatea! :lasmidele necesare pentru transferul de gene trebuie s posede un numr restrns de regiuni sensibile la aciunea enzimelor de restricie! Bn acest caz, se poate realiza ruperea i apoi inseria de AD e,ogen "n plasmid! :rimul plasmid bacterian, folosit ca vector pentru transferul de gene, a fost cel notat p<8 '%', realizat de $.Co%en ('($1)!

Fig.2. Obinerea moleculelor recombinate de A !" A# $ metoda ligazic%& '# $ metoda terminal%. 8a vector plasmidic, la plante se folosete plasmidul 4i (4umour inducing) de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, care condiioneaz formarea tumorilor pe tulpinile a numeroase specii de plante dicotiledonate! A doua tehnic de introducere a unei gene "ntr3o bacterie folosete ca vector un bacteriofag (fagul leambda 3 C), al crui genom ('%3/% gene) integreaz gena strin! 5a se va sintetiza "ntocmai ca i celelalte gene ale virusului, dac acesta din urm se va replica "n celula bacterian! :entru celulele eucariote animale, vectorii virali care se folosesc sunt, de regul, virusul tumoral <=3)% i virusul papiloma bovin (D:=)! <e crede c vectorii virali vor putea fi utilizai i la plante! En tip particular de vectori reprezint liposomii, picturi foarte mici de lipide produse artificial, "n care pot fi incluse gene, precum i diferite medicamente, enzime etc! 6enomul mitocondriilor i cloroplastelor este similar celui bacterian i, ca urmare, se crede c el va putea fi utilizat pentru transferul unor gene la organismele eucariote! 8elulelor utilizate "n e,perimentele ingineriei genice le sunt "naintate o serie de cerine care au menirea de a asigura securitatea investigaiilor tiinifice! 8onform >2egulilor despre molecule recombinate de AD ? celulele3gazd trebuie s satisfac urmtoarele cerine& capacitatea sporit de implicare "n investigaiile tiinifice+ incapacitatea de sintez a anvelopei protectoare "n afara laboratorului+ capacitatea lizrii AD 3ului su "n afara laboratorului+

 imposibilatatea transferului informaiei ereditare altor organisme+ imposibilitaea polurii mediului "ncon.urtor "n rezultatul transformrii iFsau transfeciei! Bn prezent, de rnd cu E. coli, "n calitate de obiecte de studiu (celule gazd), se utilizeaz bacilul fnului ('acillus subtilis), celulele de dro.dii, culturile de celule i esuturi vegetale i animale, culturile de protoplati! Dup obinerea moleculelor recombinate de AD , ele trebuie transferate "n celulele (organismele) procariote sau eucariote pentru funcionarea lor ulterioar (replicarea i transmiterea informaiei ereditare)! De menionat c, "n cazul operrii cu genele organismelor eucariote, genele eucariotelor superioare, de regul, nu se manifest "n celulele procariote, iar genele eucariotelor inferioare se manifest doar parial! Iat de ce, "n aceste e,perimente se acord o deosebit atenie direciei transferului de informaie ereditar a moleculelor recombinate, adic& de la celula procariot "n celulele pro3 sau eucariote i invers, de la celula eucariot "n eu3 sau procariote! Goleculele recombinate ale procariotelor funcioneaz uor "n celulele procariote ("n calitate de repliconi)! <unt descrise i cazuri de funcionare a genelor procariotelor "n celulele eucariotelor! *.Merr!) i colab!('($'), In.#ors i colab!('($/) au demonstrat posibilitatea transferului genei H3galactozidazei din E. coli "n fibroblastele umane ale unui bolnav de galactozimie cu a.utorul fagului (galactozimia este o boal autozomial recesiv ce provoac dereglarea metabolismului ca rezultat al lipsei enzimei '3D3galactozo3'3fosfaturidiltransferazei)! 5,presia genelor eucariotelor "n celulele procariote, de asemenea, este posibil! 'ev!s ('($-) a transferat gena histidinei dro.diilor "n E. coli cu a.utorul fagilor! Astzi se obin pe scar larg produse ale organismelor eucariote "n baza bacteriilor (hormoni, interferoni etc!)! Informaia ereditar strin (a moleculei recombinate), care ptrunde "n celula (organismul) gazd, este prote.at pe diferite ci& metilarea AD 3ului (virusurile)+ transferul moleculei liniare de AD "n form circular (fagul C)+ blocarea sistemului de restricii al celulei3gazd (fagul 41)+ aciunea restrictazelor! Bn acelai timp, celula3gazd "i prote.eaz informaia ereditar prin diferite mecanisme& aciunea restrictazelor specifice+ metilarea AD + aciunea vecintii epigenetice+ aciunea nespecific a nucleazelor celulare+ protecia mecanic prin membranele celulare+ aciunea proteinelor histonice i nehistonice+ aciunea interferonului! /. REALI,RILE INGINERIEI GENICE. Datorit cercetrilor "n tehnologia AD 3ului recombinat, au fost elaborate metode de transfer de gene "n celulele procariote, care pot sintetiza multe proteine utile! Astfel, a devenit posibil producerea i chiar comercializarea pe scar larg a unor hormoni (insulina, somatostatina, somatotropina), a interferonului, a preparatelor de diagnosticare etc! a0 -b1!nerea !nsu)!ne! umane 2! a a)tor %ormon!. Din -% de milioane de diabetici, circa ) milioane necesit un tratament cu insulin! Bn '('-, E.$%ar3y.$c%a4er a descoperit c insulina este secretat de celule care alctuiesc insulele @angherhans din pancreas, ceea ce l3a determinat s numeasc hormonul insulin! Bn '(0', .(ant!ng i #.(est, la 4oronto, au izolat din pancreasul de cine hormonul insulin, demonstrnd aciunea lui antidiabetic! Bn '(01, firma farmaceutic american >5li @illI? pune

de.a "n vnzare prima insulin animal ("n prezent, pentru a obine circa '%% grame de insulin, este nevoie de J%% Ag de pancreas de bou (greutatea medie a unui pancreas de bou este de 0%%3 0/% grame))! Insulina uman este alctuit din dou catene polipeptidice A i D, compuse respectiv din 0' i 1% de aminoacizi, a cror secven a fost stabilit "n '(// de .$anger! Bn perioada '(-13'(-/, trei grupe de cercettori (americani, germani i chinezi) au reuit sinteza artificial a insulinei prin intermediul a '$% de reacii chimice, lucru ce fcea imposibil producerea insulinei pe cale industrial! oile tehnologii industriale de obinere a insulinei umane au fost posibile odat cu e,tragerea genei insulinei (W.G!))bert i colaboratorii si, '(J%) i crearea moleculelor recombinate de AD "n baza plasmidelor (fig!1)!

Fig.(. )chema obinerii insulinei umane. Goleculele recombinate de AD sunt transferate "n colibacili ( Escherichia coli), unde are loc realizarea informaiei genetice codificate "n molecula de AD ! :aralel cu proteinele specifice bacteriei, se sintetizeaz i insulina! :entru a prote.a insulina uman (ea nu este proprie colibacililor i este distrus de enzimele bacteriene), "n molecula recombinat de AD se "ncadreaz, pe lng gena insulinei, i o gen reglatoare care codific o protein specific colibacililor (de e,emplu galactozidaza)! 8a rezultat al manifestrii informaiei genetice a moleculei recombinate de AD , se obine o caten polipeptidic hibrid, din care mai apoi se separ insulina! Datorit utilizrii tehnologiei AD 3ului recombinat, se obin apro,imativ 0%% grame de insulin de pe ' m1 de mediu de cultur, adic tot atta ct se poate e,trage din aproape '-%% Ag de pancreas de bou sau porc! :robele clinice efectuate cu insulina uman, produs prin tehnici de inginerie genic, au demonstrat c ea nu are efecte secundare i c poate fi comercializat, adic folosit la tratarea bolnavilor de diabet (din '(J0 "n <EA, din '(J1 "n Garea Dritanie)!

En hormon de mare importan biologic este hormonul de cretere sau somatotropina (K6K * Kuman 6roLth Kormone), secretat de lobul anterior al hipofizei! Golecula hormonului cuprinde '(' de aminoacizi! Absena lui provoac nanismul hipofizar, ce are o frecven de $3 '%% per milion de persoane! 4ratamentul cu acest hormon se realizeaz "ncepnd cu vrsta de )3/ ani i pn la puberitate, "n doze de minimum - mg pe sptmn per persoan! <omatrotopina este un hormon cu o specificaie "nalt i nu poate fi utilizat de la animale! Din hipofiza unui cadavru se e,trag doar )3- mg de hormon, heterogen i impurificat! Iat de ce, producerea acestui hormon prin tehnici de inginerie genic prezint un interes deosebit! <inteza acestui hormon pe cale artificial s3a "nceput cu producerea de AD c (AD 3ul copie) cu a.utorul revers3transcriptazei, avnd ca matrice A2 m din hipofize (transcripie invers)! Acesta a fost clonat, apoi tiat cu enzime de restricie pentru obinerea secvenei nucleotidice corespunztoare somatotropinei, cu e,cepia fragmentului ce determin primii 01 de aminoacizi! Mragmentul "n cauz era clonat separat, ca rezultat al unei sinteze chimice, apoi cele dou segmente unite, la ele se adug segmente reglatoare i pe baza plasmidelor se obine plasmidiul recombinat cu gena K6K (a somatotropinei)! 8olibacilii, primind acest plasmid recombinat, sintetizau somatotropina (la ' litru de mediu de cultur se obine 0,%30,/ mg somatotropin)! Bn prezent, cu a.utorul bacteriilor recombinate sunt obinui i ali hormoni, de e,emplu, thimopoietina ce conine )( de aminoacizi i este secretat de timus! Bn ce privete hormonii cu molecule mai mici (sub 0% de aminoacizi), este preferabil sinteza lor pe cale chimic! b0 -b1!nerea !nter4eron!)or! Interferonii sunt produi de celule specializate pentru lupta "mpotriva infeciilor virale! 5i au fost descoperii "n '(/$ de .Isaacs i I.L!ndenmann la Institutul aional de 8ercetri Gedicale de lng @ondra! Interferonii reprezint nite substane proteice (din ')-3'-- de aminoacizi) i sunt produi "n cantiti infime de celula animal sau uman, cnd un virus ptrunde "n organism! 5,ist mai multe tipuri de interferoni& interferonul leucocitar (;), interferonul fibroblastelor (H) i interferonul limfocitelor 4 sau interferonul imun (N)! 5i pot fi obinui prin tehnici clasice (din celulele sanguine i din fibroblaste) i prin tehnici de recombinare genic! :entru a obine interferon din celulele sanguine sau din fibroblastele cultivate, acestea sunt infectate cu un virus, iar dup 0) de ore prin centrifugare i purificare se izoleaz din mediul de cultur! Dintr3un litru de snge se poate e,trage pn la ' mAg ('%31 grame) de interferon! Bn '(J%, savanii americani W.G!)bert i C.We!ssmann i .aponezul T.Tan!gu"! au produs interferonul uman cu a.utorul unor colibacili cu genomul modificat! 8elulele de E. coli nu pot transforma predecesorul interferonului "n interferon activ, de aceea, iniial, comple,ul de AD , format dintr3o regiune nucleotidic reglatoare i o regiune ce determin structura interferonului, este supus aciunii enzimelor de restricie, care taie molecula de AD apro,imativ la frontiera acestor dou catene (genei interferonului nu3i a.unge un triplet A46)! 8odonul omis (A46) este ane,at prin sintez chimic! 6ena interferonului se "ncadreaz "n continuare "ntr3un plasmid, care se transfer "n E. coli! Astfel, colibacilii sintetizeaz interferonul uman! Dintr3un litru de suspensie de E. coli (circa '%'' celule) se pot e,trage pn la / mg de interferon (adic de /%%% de ori mai mult dect din ' litru de snge)! 4ehnicile de inginerie genic permit obinerea preparatelor hibride de interferon cu un spectru larg de aciune! c0 Trans4eru) de gene 5n ce)u)e)e vegeta)e 2! an!ma)e. 4ehnicile de recombinare genetic permit transferul genelor importante "n celulele de plante i animale, iar "n rezultat se obin plante i animale transgenice! :entru transferul de gene la plante sunt utilizate bacteriile Agrobacterium tumerfaciens (descoperite "n '(%$ de E.$m!t% i

C.To6nsend), care provoac formarea unor tumori cancerogene (croLn gall) pe tulpinile unor plante (la speciile din (1 de familii de dicotiledonate)! :lasmidul 4i (tumor inducing) descoperit la A.tumefaciens cauzeaz tumori la plante prin transferul unui segment de AD (AD 34) din plasmid "n celulele vegetale! <trategia pentru transferul genelor cu a.utorul plasmidului 4i "n celula vegetal include& introducerea segmentului de AD 34 "ntr3un plasmid de E. coli+ introducerea "n plasmidul format a genei necesare i a genei marAer (gena pentru rezisten la canamicin)+ introducerea plasmidului recombinat "n Agrobacterium tumerfaciens+ infecia cu A.tumerfaciens a plantelor respective+ selectarea plantelor transformate (fig!))! :entru realizarea transferului de gene "n celula vegetal este utilizat metoda culturilor de celule i esuturi "n vitro! Mirma american >Gonsanto? comercializeaz de.a plante transgenice (transformate) de cartof, rezistente la gndacul de 8olorado! O realizare remarcabil "n domeniul transferului de gene "n celula animal o constituie oarecii transgenici! 6ena hormonului de cretere de la obolan a fost transferat prin microin.ecii "n cele dou nuclee ale ovulului proaspt fecundat de la oarece ("n fiecare nucleu cte circa -%% copii ale genei hormonului de cretere)! Ovulele fecundate ('$%) au fost implantate "n oviductul unei femele3receptor! Bn consecin, s3au obinut 0' de oricei! @a - dintre ei s3a constatat o cantitate mrit a hormonului de cretere (de '%% * J%% de ori)! Aceti oricei aveau o cretere mult mai rapid i prezentau greuti corporale superioare animalelor3martor!

Fig.*. +ransferul de gene cu a,utorul plasmidului +i n celula vegetal%.