UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE I MEDICIN VETERINAR

ION IONESCU DE LA BRAD IAI

FACULTATEA DE ZOOTEHNIE

TNASE DUMITRU

NACU GHERASIM

BIOTEHNOLOGII
DE REPRODUCIE
ANUL III, SEMESTRUL I

MATERIAL DE STUDIU I.D.

IAI, 2011

CUPRINS
CAP.1 BIOTEHNOLOGIA NSMNRILOR ARTIFICIALE.........................3
1.1 Importana nsmnrilor artificiale ..........................................................................3
1.2 Aspecte organizatorice ale nsmnrilor artificiale n ara noastr..........................5
1.3 Principiii metode de recoltare a spermei...................................................................7
1.3.1 Bazele fiziologice ale recoltrii spermei ....................................................7
1.3.1.1 Comportamentul sexual al masculilor ........................................7
1.3.1.2 Specificul reflexelor sexuale la principalele specii
de animale .................................................................................10
1.3.1.2.1 Reflexele sexuale la taur.............................................10
1.3.1.2.2 Reflexele sexuale la berbec ........................................12
1.3.1.2.3 Reflexele sexuale la vier.............................................12
1.3.1.2.4 Reflexele sexuale la armsar ......................................13
1.3.2 Principiii metode generale de recoltare a spermei ....................................13
1.3.2.1 Recoltarea spermei la taur ..........................................................15
1.3.2.2 Recoltarea spermei la berbeci ap .............................................19
1.3.2.3 Recoltarea spermei la vier ..........................................................20
1.3.2.4 Recoltarea spermei la armsar....................................................22
1.3.2.5. Recoltarea spermei la psri ......................................................23
1.4 Examenul nsuirilor spermei .....................................................................................24
1.5 Diluarea spermei.........................................................................................................24
1.5.1 Consideraii generale ..................................................................................24
1.5.2 Principiile dilurii, nsuirile generale ale diluanilor
i clasificarea acestora ............................................................................25
1.5.3 Tehnica preparrii diluanilor .....................................................................26
1.5.4 Tehnica diluiei...........................................................................................27
1.5.4.1 Diluarea spermei de taur.............................................................27
1.5.4.2 Diluarea spermei de berbec ........................................................29
1.5.4.3 Diluarea spermei de vier.............................................................31
1.5.4.4 Diluarea spermei de armsar ......................................................33
1.5.4.5 Diluarea spermei de psri .........................................................33
1.6.Conservarea spermei ..................................................................................................34
1.6.1 Conservarea spermei de taur ......................................................................38
1.6.2 Conservarea spermei de berbeci ap..........................................................44
1.6.3 Conservarea spermei de vier .....................................................................46
1.6.4 Conservarea spermei de armsar ................................................................48
1.6.5 Conservarea spermei de psri ...................................................................49
1.7 Inocularea spermei......................................................................................................50
1.7.1 Inocularea spermei la vac .........................................................................50
1.7.1.1 Punctul de nsmnri artificiale la vaci (P.I.A.V.)...................50
1.7.1.2 Descoperirea femelelor n cldurii stabilirea
momentului optim al nsmnrii.............................................51
1.7.1.3 Pregtirea femelelor pentru nsmnare ....................................52
1.7.1.4 Reanimarea spermatozoizilor .....................................................53
1.7.1.5 Tehnica inoculrii spermei .........................................................64
1.8.2 Inocularea spermei la oaiei capr..............................................................56
1.8.2.1 Organizarea punctului de nsmnri artificiale
la ovine (P.I.A.O.) .....................................................................56
1.8.2.2 Depistarea oilori caprelor n clduri .........................................57
1.8.2.3 Inocularea materialului seminal .................................................59
1.7.3 Inocularea spermei la scroaf .....................................................................60
1.8.3.1 Organizareai dotarea punctului de nsmnare
artificial (P.I.A.S.) cu activitate complex ..............................60
1.7.3.2 Descoperirea scroafelor n clduri..............................................61
1

1.7.3.3 Stabilirea momentului optim de nsmnare .............................61

1.7.3.4 Aparaturai instrumentarul folosit pentru
nsmnarea artificial a scroafelor ..........................................62
1.7.3.5 Inocularea spermei......................................................................63
1.7.4 Inocularea spermei la iap ..........................................................................64
1.7.5 Inocularea spermei la psri .......................................................................65
CAP. 2 BIOTEHNOLOGIA TRANSFERULUI DE EMBRIONI LA ANIMALE ..67
2.1 Istoriculi importana transferului de embrioni ..........................................................67
2.2 Biotehnologia transferului de embrioni la vac..........................................................68
2.2.1 Seleciai pregtirea vacilor donatoare .......................................................69
2.2.2 Seleciai pregtirea vacilor primitoare (receptoare) ..................................70
2.2.3 Sincronizarea estruluii ovulaiei la vacile donatoare
i primitoare............................................................................................70
2.3.4 Inducerea poliovulaieii nsmnarea artificial
a vacilor donatoare..................................................................................71
2.3.5 Fecundarea ovocitelor.................................................................................74
2.2.6 Recoltarea embrionilor ...............................................................................74
2.2.7 Cutareai aprecierea calitii embrionilor .................................................76
2.2.8 Conservareai deconservarea .....................................................................78
2.2.9 Transferul embrionilor ...............................................................................81
2.3 Biotehnologia transferului de embrioni la rumegtoarele mici ..................................82
2.3.1 Alegerea donatoarelori receptoarelor ........................................................83
2.3.2 Sincronizarea estruluii ovulaiei la femelele donatoare
i receptoare............................................................................................84
2.3.2.1 Tratamente progestative de sincronizare ....................................85
2.3.2.2 Tratamente de stimulare ovarian...............................................85
2.3.2.3 Inducerea estruluii ovulaiei la receptoare ................................86
2.3.3 nsmnarea femelelor donatoare ..............................................................87
2.3.4 Recoltarea embrionilor ...............................................................................88
2.3.5 Examenuli aprecierea embrionilor ............................................................89
2.3.6 Congelarea-decongelarea embrionilor........................................................90
2.3.7 Transferul embrionilor la femelele receptoare............................................91
2.3.7.1 Transferul chirurgical .................................................................91
2.3.7.2 Transferul embrionilor sub control endoscopic ....................................................92
CAP. 3 BIOTEHNICI DERIVATE SAU FINALIZATE PRIN TRANSFERUL
DE EMBRIONI..................................................................................................94
3.1 Fecundaia ,,in vitro ..................................................................................................94
3.1.1 Obinerea ovocitelor ...................................................................................95
3.1.2 Maturarea ,,in vitro a ovocitelor ...............................................................95
3.1.3 Capacitarea spermatozoizilor......................................................................96
3.1.4 Fecundaiai cultura ,,in vitro a embrionilor .............................................97
3.1.5 Transferul embrionilor obinui ,,in vitro ..................................................98
3.1.6 Importana, perspectivelei aplicaiile fecundaiei ,,in vitro .....................99
3.2 Bisecia embrionilor................................................................................................ 100
3.3 Sexarea embrionilor................................................................................................ 102
3.4 Transplantarea nucleilori obinerea de clone ........................................................ 103
3.4.1 Pregtirea ovocitelor receptoare ............................................................. 103
3.4.2 Izolarea nucleilor embrionului donator .................................................. 104
3.4.3 Reconstituirea embrionilor ..................................................................... 104
3.5 Transgeneza ............................................................................................................ 105
BIBLIOGRAFIE107

CAPITOLUL 1
BIOTEHNOLOGIA NSMNRILOR ARTIFICIALE
1.1.

Importana nsmnrilor artificiale

Astzi, exist numeroase ri care nsmneaz artificial ntregul efectiv

de vaci realiznd astfel un progres rapid i substanial n ameliorarea raselor.
nsmnrile artificiale s-au extins n practic datorit avantajelor zooeconomice i sanitar-veterinare.
Din punct de vedere zoo-economic, nsmnrile artificiale sunt
importante pentru c folosesc intens reproductorii de valoare, cu poten
individual mare, ceea ce conduce la grbirea ritmului i gradului de ameliorare a
efectivelor de animale. La nsmnrile artificiale se folosesc masculi testai dup
descendeni, astfel nct, pe lng calitatea superioar a spermei, exist i testarea
real a valorii de ameliorare.
Prin congelarea materialului seminal, reproductorul valoros poate fi
folosit la reproducere mai muli ani, chiar dup moartea acestuia prin constituirea
depozitului cu sperma provenit de la acesta. Datorit congelrii materialului
seminal s-a creat posibilitatea schimbului internaional de material seminal
valoros din puct de vedere genetic, chiar la distane intercontinentale, fr
trasportul i aclimatizarea reproductorului.
Prin folosirea nsmnrilor artificiale, testarea dup descendeni a
reproductorilor se poate realiza mult mai repede, iar prin examenul complex,
zootehnic i sanitar-veterinar, se pot descoperi reproductorii cu diferite anomalii
congenitale ale aparatului genital sau cu tulburri ereditare ale spermatogenezei.
Se realizeaz, astfel, o profilaxie genetic a sterilitii.
Datorit evidenelor stricte care se in pentru toate operaiile ce se
efectueaz, se poate cunoate ntr-o mai mare msur paternitatea descendenilor.
Evidenele sunt completate cu determinarea grupei sanguine a prinilor i
descendenilor.
Reproductorii masculi fiind grupai separat de femele, se pot lua msuri
specifice de alimentaie raional i ngrijire corespunztoare i se poate institui un
regim de recoltare a spermei favorabil obinerii de produi la un pre de cost mai
sczut i ofer posibilitatea crerii unor nuclee de animale valoroase.
La reproductorii de elit, concentrai n uniti specializate, se practic i
determinarea genofondului, a structurii imunogenetice, ceea ce d posibilitatea
cunoaterii prezenei sau absenei echilibrului genetic n cadrul unei populaii
date.
n condiiile unor centre mari de nsmnri artificiale unde sunt
concentrai muli reproductori, este posibil stabilirea valorii de ameliorare n
selecia concomitent pentru mai multe caractere productive. Acest lucru se
realizeaz pentru c se obine un numr mare de produi contemporani, masculi i
femele, care pot fi repartizai n mai multe uniti.
De asemenea, numrul mare de reproductori de diferite vrste,
concentrai n uniti specializate, permite alegerea unui moment optim pentru
determinarea performanelor, respectiv a vrstei la care s-ar putea determina, cu
cea mai mare precizie, valoarea de ameliorare. Lucrrile efectuate pe ovine,

pentru determinarea valorii de ameliorare n direcia produciei de ln, au

demonstrat c selecia trebuie s se fac pe baza celei de-a doua tunsori.
Sub raport economic, reproductorii foarte valoroi din punct de vedere
zootehnic, sunt folosii cu mare eficien economic. ntr-un sezon sexual,
numrul femelelor nsmnate artificial cu sperma de la un taur, comparativ cu
monta, este , n medie, de 50-80 de ori mai mare, de 25 de ori mai mare la oi i de
3-4 ori mai mare la cabaline i suine. Astfel, n cazul practicrii montei, unui taur i
se repartizeaz anual 50-70 de femele. Dac se practic nsmnrile artificiale,
cu sperma conservat prin refrigerare se pot nsmna anual 1000-3000 de vaci.
n cazul n care se conserv sperma prin congelare, numrul vacilor nsmnate
cu sperma provenit de la un taur poate ajunge la 10000-30000. n cazul unor tauri
deosebit de valoroi s-au putut obine pn la 50000 de viei pe ntreaga perioad
de exploatare a taurului (6-7 ani). Literatura de specialitate citeaz cazuri n care
de la un taur, ntr-un an s-au obinut peste 120000 de doze de nsmnare, iar n
toat perioada de exploatare a acelui taur de peste o jumtate de milion de viei.
La taurine, pot fi nsmnate dintr-un singur ejaculat pn la 1000 de
vaci. La porcine, ovine i cabaline, dintr-un singur ejaculat se pot nsmna
numai 5-50 de femele. Acest numr mic de femele nsmnate artificial este
important din punct de vedere economic i genetic i a redus rspndirea
nsmnrilor artificiale la aceste specii. Economicitatea procedeului de
congelare a spermei este exemplificat cel mai bine de posibilitatea reducerii
numrului de spermatozoizi n doza de nsmnare fr a scdea rata de concepie
Dac aplicarea tehnicilor de nsmnare artificial cu material congelat a
progresat la taurine, nu acelai lucru se poate spune i despre celelalte specii.
Ratele de concepie i numrul de produi la o ftare realizate cu material seminal
congelat sunt mai sczute la porcine. La ovine i cabaline, ratele de concepie sunt
satisfctoare. Aceste rezultate demonstreaz diferene distincte de specie, n
cerinele pentru supravieuirea optim a spermatozoizilor n perioada congelrii i
decongelrii. La vier, esenial este modificarea compoziiei diluantului dup
decongelarea spermatozoizilor pentru a maximaliza rata de fecundare.
Organizarea reelei de nsmnri artificiale pe baza unor centre
puternice, cu un numr mare de reproductori, creeaz, prin concentrarea i
specializarea produciei, o eficien economic sporit n raport cu ntreinerea i
exploatarea reproductorilor masculi n fiecare ferm zootehnic.
Din punct de vedere sanitar-veterinar, prin practicarea nsmnrilor
artificiale a efectivelor de femele, se pot preveni i combate unele boli
transmisibile prin actul montei (iniial a constituit principala cauz a rspndirii
nsmnrilor artificiale). Totodat, se previn i combat boli cu etiologie
parazitar (trichomonoza la taurine, durina la cabaline) i cu etiologie infecioas
(bruceloza, campylobacterioza la taurine, ovine, porcine).
Prin practicarea acestei valoroase biotehnologii de reproducere devine
posibil continuarea reproducerii n unitile carantinizate. De asemenea, se pot
preveni i combate unele forme de infecunditate la femele, cum ar fi spasmul
vaginal i altele.
Metoda actual de inoculare a spermei permite efectuarea de observaii
asupra organelor genitale femele, ceea ce influeneaz favorabil rezultatul
nsmnrilor.
Concentrarea de reproductori n uniti specializate permite luarea unor
msuri riguroase i tiinifice de alimentaie, adpostire i ngrijire a animalelor
precum i de prevenire a bolilor, care i ele pot influena negativ sau chiar
compromite reproducerea animalelor pe o arie ntins, egal cu cea deservit de
centrul respectiv de nsmnri artificiale.
4

Materialul seminal recoltat trebuie s corespund tuturor criteriilor

zooigienice i a standardelor internaionale referitoare la ncrcarea cu flor
microbian, standarde respectate astzi de toate rile avansate.
nsmnrile artificiale prezint i numeroase avantaje tiinifice. Astfel,
aplicarea lor a permis dezvoltarea cercetrilor tiinifice asupra biochimiei,
histochimiei i imunologiei reproduciei n general i a spermei n special. Gameii
sunt studiai la nivel molecular i de microscopie electronic. Aceste cercetri au
constituit baza pentru progresul rapid n domeniul metodelor de laborator pentru
testarea capacitii fecundante a spermei, a congelrii materialului seminal i a
aplicrii practice a nsmnrilor artificiale.
Folosindu-se nsmnrile artificiale, a devenit posibil efectuarea unor
hibridri ntre reproductori din specii care nu se mperecheaz ntre ele n
condiii naturale, ca de exemplu ntre oaie i capr, iak i zebu, iap i mgar,
psri domestice i slbatice etc .
Toate aceste avantaje recomand nsmnrile artificiale ca una din cele
mai moderne i avantajoase metode de reproducere a animalelor domestice. Ea
permite nsemnate realizri n zootehnie i progresul rapid al acestui important
sector al economiei naionale.
1.2. Aspecte organizatorice ale smnrilor artificiale
n ara noastr
La nivel naional, procesul de ameliorare a populaiilor de animale din
diferite specii, organizarea i conducerea activitii pe linia nsmnrilor
artificiale este coordonat de Ministerul Agriculturii i Alimentaiei care stabilete
metodologia i msurile de lucru privind aplicarea nsmnrilor artificiale.
Primele Staiuni de nsmnri artificiale (S.I.A.V.) la vaci au fost nfiinate n
anul 1953. Cele 42 de S.I.A.V. au fost dotate cu reproductori valoroi, folosii la
nsmnarea artificial a vacilor cu sperm brut.
n perioada anilor 1956-1957 au nceput s fiineze primele Centre de
nsmnri artificiale, dotate cu reproductori (tauri, berbeci) a cror material
seminal -diluat i conservat prin refrigerare- era difuzat n teritoriu la punctele de
nsmnri atificiale (P.I.A.V.). n unitile de stat, erau concentrai reproductori
valoroi folosii la nsmnarea artificial a femelelor de la fiecare unitate
zootehnic, n aa-numitele ferme de ameliorare i reproducie (F.A.R.).
n anul 1965 a luat fiin Centrul Naional de Reproducie i Selecie la
Animale care a contribuit la introducerea metodelor unitare i practice pe ntregul
teritoriu al rii, excepie fcnd localitile din zonele greu accesibile. ncepnd
cu anul 1969 s-a introdus i n ara noastr conservarea spermei de taur prin
congelare, la nceput ntr-un numr restrns de centre de nsmnri artificiale,
apoi metoda s-a extins o dat cu nfiinarea, n anul 1976, a Intreprinderii pentru
Testarea Reproductorilor i Producerea Materialului Seminal Congelat
(SEMTEST). Pn n anul 1990, n conformitate cu prevederile programului de
ameliorare a taurinelor, activitile menionate cdeau n sarcina acestei
intreprinderi, care aparinea de Institutul de Cercetare i Producie pentru
Creterea Bovinelor Baloteti, avnd rolul de a coordona activitatea celor 6
complexe teritoriale. Principalele atribuii care reveneau acestei intreprinderi,
erau:
- organizarea creterii i testrii reproductorilor dup performanele
proprii i descendeni;
- livrarea produilor testai, disponibili;
5

producerea i livrarea de material seminal congelat pentru nsmnri

artificiale la animale;
- asigurarea i ntreinerea echipamentului criogenic, aprovizionarea cu
azot lichid a beneficiarilor de material seminal congelat;
- producerea de echipament i aparatur pentru nsmnrile artificiale
i selecia animalelor, a diluanilor pentru material seminal pe specii i
ai unor biostimulatori ai funciei de reproducie la animale.
Dup anul 1990, reeaua SEMTEST a fost reorganizat, cele 6 complexe
teritoriale (Bucureti, Iai, Craiova, Timioara, Trgu-Mure i Baia Mare), fiind
transformate n Societi Comerciale cu capital de stat, atribuiile lor rmnnd
aceleai. Teritoriul de activitate al celor ase societi tip SEMTEST este dictat
de zonarea celor trei rase principale de taurine care se cresc n ara noastr: Blat
romneasc, Brun de Maramure, Blat cu negru romneasc. n prezent,
denumirea Centrului Republican de Reproducie i Selecie a Animalelor este
Agenia Naional pentru Ameliorare i Reproducie n Zootehnie Prof. dr.
G.K.Constantinescu subordonat Ministerului Agriculturii i Alimentaiei.
Majoritatea vacilor se nsmneaz cu sperm congelat n paiete mijlocii
i mici, metod care, datorit avantajelor pe care le prezint, a nlocuit
conservarea n granule i fiole.
De la taurii n exploatare din unitile comerciale SEMTEST se
recolteaz, controleaz, prelucreaz, conserv i livreaz sperma ctre Unitile de
Ameliorare i Reproducie n Zootehnie (fostele Oficii Judeene de Reproducie i
Selecie la Animale) i altor uniti. Activitile legate de nsmnarea artificial
la animale revine Unitilor de Ameliorare i Reproducie n Zootehnie(U.A.R.Z.)
(fostele O.J.R.S.A.) subordonate direct Direciilor Agricole.
Unitile de Ameliorare i Reproducie n Zootehnie au, pe lng
activitatea de difuzare a materialului seminal congelat sau refrigerat i obligaia de
dirijare a ntregului proces de reproducie pe raza lor de difuzare. Fiecare
U.A.R.Z. are n subordonare 1-4 Centre Teritoriale de Ameliorare si Reproducie
n zootehnie care deservesc cresctorii n ceea ce privete asistena tehnic de
specialitate n domeniul reproduciei i seleciei animalelor. Pentru aceasta, fiecare
U.A.R.Z. colaboreaz cu unitile SEMTEST din zona respectiv i cu
Asociaia cresctorilor de animale (taurine, ovine, suine) din jude.
ndeplinirea propriu-zis a acestor atribuii se face de ctre Centrele de
selecie i reproducie la animale, iar subunitatea verig de baz a reelei naionale
de selecie i reproducie este Punctul de nsmnri artificiale (P.I.A.V.), ca
formaiune tehnico-organizatoric la nivelul fiecrei uniti zootehnice (de stat sau
particulare), a fiecrei comune, avnd sarcina s efectueze operaiunile de
nsmnare artificial a femelelor aparinnd diverselor specii (taurine, ovine,
suine), a supravegherii respectrii instruciunilor referitoare la activitatea de
ameliorare a animalelor etc. Punctul de nsmnare artificial este subunitatea de
baz a ntregii reele de reproducie i selecie a animalelor, prin a crei activitate
se materializeaz i finalizeaz ntregul proces de reproducie i ameliorare a
efectivelor din toate sectoarele zotehnice. Fiecare punct de nsmnare artificial
este dotat cu un minim de aparatur i instrumentar necesare desfurrii n
condiii normale a activitii specifice, iar persoanele ncadrate la aceste puncte
trebuie s participe nemijlocit la coordonarea procesului de reproducie a
efectivelor din ferma sau localitatea respectiv, s in corect evidena
evenimentelor de reproducie i s cunoasc perfect efectivul matc, produii i
destinaia acestora, contribuind la aplicarea msurilor de prevenire i combatere a
strilor de infecunditate. Pentru ndeplinirea acestor atribuii, punctul de
nsmnri artificiale trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii:

s fie amplasat n incinta fermelor atunci cnd asigur n exclusivitate

nsmnarea artificial a femelelor din unitatea respectiv sau la
periferia localitilor, ctre locul de punat al animalelor din
gospodriile individuale;
- s permit accesul uor al mijloacelor de transport;
- s dispun de ap curent i s fie conectat la reeaua electric;
- s dispun n interior de spaiul necesar pstrrii i conservrii
materialului seminal, a operaiilor pregtitoare nsmnrii artificiale a
femelelor, a documentelor necesare evidenelor minime, a efecturii
nsmnrii artificiale propriu-zise. De regul, n unitile zootehnice,
spaiul necesar punctului de nsmnare artificial se amenajeaz la
captul unui grajd.
n condiiile de stabulaie a animalelor n sistem de ntreinere legat,
nsmnarea femelelor se face, de regul, pe linia grajdului, cu respectarea
regulilor de igien corespunztoare. n acest caz, punctul de nsmnare artificial
este dotat cu un crucior special n care este amplasat containerul cu dozele de
nsmnare, vasul cu ap cald necesar pentru decongelarea paietelor cu
material seminal, mnuile de protecie necesare i pipetele de nsmnare,
meninute n condiii aseptice. n situaia ntreinerii femelelor la pune sau n
sistem dezlegat, este necesar un stand de contenie.
1.3. Principii i metode de recoltare a spermei
Recoltarea este operaia prin care se obine sperma de la reproductori prin
intermediul unei aparaturi speciale sau prin alte procedee. Este o operaie
important i dificil, succesul ei fiind determinat de cunoaterea fiziologiei
comportamentului sexual al masculilor n vederea adoptrii celor mai adecvate
metode de obinere a ejaculatului.
1.3.1. Bazele fiziologice ale recoltrii spermei
1.3.1.1. Comportamentul sexual al masculilor
Comportamentul sexual al mamiferelor se bazeaz pe un schimb reciproc
de semnale specifice care, n final se materializeaz n actul sexual propriu-zis. La
animalele crescute n libertate, ntreinute n padocuri sau boxe comune pentru
ambele sexe, comportamentul sexual se desfoar secvenional:
- cutarea reciproc a celor doi parteneri;
- sincronizarea comportamental;
- actul sexual propriu-zis.
La toate speciile, activitatea sexual ncepe printr-o cutare reciproc de
contact ntre mascul i femel. Schimburile de informaii senzoriale fac posibil
identificarea receptivitii sexuale a celor doi parteneri, apoi provoac
rspunsurile comportamentale care induc reaciile de atitudine necesare
mperecherii. Semnalele caracteristice emise de femel indic stadiul receptivitii
sexuale, femela neacceptnd saltul masculului dect n momentul impregnanei
estrogenice maxime. La toate mamiferele, femela se va imobiliza naintea
mperecherii, lund o poziie care s permit masculului intromiterea penisului.
Cunoaterea particularitilor fiziologice ale comportamentului sexual este
necesar n momentul obinuirii reproductorilor folosii la nsmnrile
7

artificiale, cu recoltarea materialului seminal. Obinuirea presupune rbdare i

tact, astfel nct, s se suprapun peste reflexele necondiionate, cele condiionate
pozitive, permind o bun recoltare a spermei, fr a stresa masculul respectiv.
Dup obinuirea masculului cu recoltarea spermei, datorit reflexelor condiionate
pozitive, ejaculatul poate fi recoltat uor, pe o femel n oricare stadiu al ciclului
sexual, pe un mascul sau pe un manechin adaptat ca form, mrime i aspect
speciei respective.
n desfurarea reflexelor sexuale necesare recoltrii spermei, un rol
deosebit revine corpusculilor senzitivi i terminaiilor nervoase existente la nivelul
penisului. Totodat, un rol deosebit revine i organelor de sim. Factorii mediului
extern (lumina, temperatura, mirosul specific al femelelor n clduri, efectuarea
montei ntre ali parteneri, mbriarea efectuat de mascul sau femel etc)
provoac excitaii, care ajunse la nivelul hipotalamusului, declaneaz
mecanismul neuro-endocrin care st la baza formrii reflexelor sexuale.
Fiziologia actului sexual const dintr-o succesiune de etape care se
manifest prin urmtoarele reflexe sexuale: reflexul de apropiere, reflexul de
erecie, reflexul de mbriare, reflexul de intromisiune i reflexul de ejaculare.
Reflexul de apropiere const ntr-o cutare reciproc de contact ntre
mascul i femel. Schimburile de informaii senzoriale, care au loc cu acest prilej,
provoac rspunsuri comportamentale care induc atitudinile caracteristice
desfurrii actului sexual. Un rol particular n realizarea contactului ntre mascul
i femel l au semnalele olfactive datorate feromonilor care declaneaz reacii
specifice, de stimulare sau inhibiie. Fonaia, audiia, contactul corporal ntre
parteneri, jocul, lupta care precede acceptarea masculului, ndeplinesc un rol
deosebit n apropierea partenerilor. Toi aceti factori induc excitaia
precopulatoare. La mamifere, sursa cea mai puternic de excitaii o constituie
stimularea tactil astfel nct este posibil declanarea excitaiei precopulatoare
chiar prin simple excitaii mecanice ale zonei genitale. Excitaia precopulatoare
se manifest prin libidou, care este datorat impregnrii structurilor necesare de
ctre hormonii androgeni.
Acest tip de excitare se caracterizeaz printr-un complex de manifestri
variate ca: accelerarea pulsului, creterea tensiunii arteriale, modificri ale
circulaiei periferice cu ridicarea temperaturii tegumentului, aflux sanguin,
creterea tensiunii nervoase etc.
Reflexul de erecie. Erecia const n schimbarea formei, volumului i
constituiei organului copulator. n repaus, penisul este adpostit n furou, i la
unele specii este flasc. Din aceast stare, penisul, prin erecie, este exteriorizat din
furou i devine rigid printr-o modificare special a esutului erectil.
Erecia este consecina fenomenelor dilatatoare care se produc la nivelul
corpului spongios i al corpilor cavernoi ai penisului, urmat de umplerea
acestora cu snge. n urma acumulrii intense a sngelui, are loc dilatarea
cavernelor, capsula fibroas se ntinde, muchiul se contract i penisul devine
rigid, se alungete la maxim i este propulsat din furou. }esutul erectil al corpului
spongios i al corpilor cavernoi reprezint un sistem spongios de spaii vasculare,
presrate cu artere i vene. n stare de repaus, aceste spaii sunt colabate i conin
cantiti mici de snge; o dat cu erecia ele devin caviti mari, umplute cu snge.
Creterea afluxului de snge este determinat pe cale neuro-hormonal i
asigurat de compresiunea cilor venoase de ntoarcere prin contracia muchilor
bulbo- i ischiocavernoi. Afluxul de snge la nivelul esutului cavernos se
produce treptat. La nceput se umplu cu snge cavernele care, datorit
vasodilataiei arteriale, se destind, urmat de erecia esutului spongios din jurul
uretrei. }esutul spongios se ncarc cu snge venos ca urmare a strii provocate de
8

stimularea nervilor splahnici pelvieni, iar stimularea inervaiei simpatice

determin constricia arterelor penisului i ncetarea ereciei. Erecia este un reflex
nnscut provocat pe cale reflex, centrul fiind situat n mduva sacral, la
nivelul neuromerelor S1-S2. Arcul reflex include nervii dorsali, ruinos i
hipogastric, centrul medular, nervii simpatici i parasimpatici. Senzaiile vizuale,
auditive, tactile i olfactive stimuleaz sistemul nervos central de la nivelul cruia
pornete impulsul excitator al centrului ereciei. Erecia este determinat i de
excitarea mecanic a receptorilor penieni, reflex care st la baza recoltrii spermei
prin masturbaie.
Erecia este nsoit de eliminarea la nivelul meatului a unei secreii
mucoase, clare, filante cu rol lubrifiant produs de glandele Littr i de glandele
bulbo-uretrale. Aceast secreie, mpreun cu cele ale glandelor Bartholin,
faciliteaz intromiterea penisului n conductul vestibulo-vaginal. Erecia este
nsoit de contracia tunicii externe a burselor testiculare, n urma creia
testiculele sunt apropiate de orificiul extern al canalului inghinal.
Durata ereciei depinde de specia i vrsta reproductorului. La masculii
tineri, erecia se poate menine un timp mai ndelungat (chiar o jumtate de or),
ns durata ereciei scade progresiv cu vrsta. Manifestarea ereciei este
determinat de nivelul hormonilor androgeni din organism, de tipul de sistem
nervos al masculului, de vrst, condiii de exploatare, ntreinere etc. Erecia
diminu consecutiv uzurii nervoase, a abuzului sexual, obinuinei, oboselii,
alimentaiei i ntreinerii necorespunztoare.
n caz de mbtrnire, erecia se produce intermitent, pn ce dispare
complet, stare ce se observ la taurii, berbecii i vierii btrni. n diversele boli ca
meningita, turbarea, tetanosul, erecia este mai pronunat dect la animalul
sntos. Toxina tetanic, avnd o elecie special pentru sistemul nervos, scade
centrul de excitabilitate a tuturor centrilor medulari, deci i a centrului ereciei.
Substanele afrodiziace (iohinibina, stricnina etc), cele parasimpatice comimetice
stimuleaz erecia penian, fie prin provocarea vasodilataiei locale (iohinibina),
fie prin scderea pragului de excitabilitate a centrului ereciei (stricnina).
Anafrodiziacele (opiumul, bromurile etc) intoxicaiile cu diverse sruri de mercur,
potasiu, arseniu etc, inhib erecia.
Sunt i numeroi centri nervoi superiori, localizai n bulb, hipotalamus i
centri corticali, ca sediu al reflexelor condiionate care, n urma excitaiei,
determin erecia.
Reflexul de mbriare. Excitaiile acumulate n timpul reflexelor de
apropiere i de erecie determin necesitatea reflexelor de mbriare i
intromisiune. Este un reflex nnscut, masculii tineri ncercnd s efectueze saltul
pe orice femel sau pe ali masculi. Executarea cu siguran a saltului se
transmite ereditar i este unul din semnele bunei fertiliti a taurului. mbriarea
poate fi normal, cnd se produce la scurt timp dup erecie, rapid, cnd se
produce naintea ereciei i tardiv, cnd apare mult dup erecie (masculii btrni,
bolnavi, subalimentai). Cunoaterea tipului de reactivitate a masculului este
important atunci cnd are loc pregtirea masculului pentru recoltare, de o corect
pregtire a acestuia depinznd volumul spermei.
Reflexul de mperechere (intromisiune, coit). Este un reflex nnscut i
const n intromiterea organului copulator n conductul vestibulo-vagino-cervical
al femelei n clduri. Intromiterea penisului este facilitat de secreiile glandelor
Littr, bulbo-uretrale (parial), glandelor Bartholin i de smegma prepuial.
Introducerea penisului are loc la nivelul vaginului la rumegtoare i carnivore,
pn la cervix la cabaline i pn n uter la suine.

Reflexul de ejaculare const n proiectarea, sacadat i sub presiune,

spermei n afara cilor genitale mascule.
Ejacularea se produce pe cale reflex, consecutiv excitaiilor acumulate n
timpul actului coital i transmise sistemului nervos. n primul rnd sunt excitate
terminaiile nervoase din penis, reprezentate n special prin corpusculii VaterPaccini, Meissner i genitali. Ejacularea este iniiat de stimulii genitali i mediat
de nervii care transmit impulsuri la creier. De la creier, n sens invers, sunt
elaborate impulsuri la nivelul sistemului simpatic lombar (L2-L4-centrul
ejaculator) de unde impulsurile eferente trec prin ganglionii simpatici, de-a lungul
nervului presacral i a celui pelvin, la toate organele din cavitatea pelvin. Ele dau
fibre motorii pentru muchii netezi ai tractusului genital (epididim, canale
deferente, canal ejaculator, prostat, glande seminale). Prin contracia fibrelor
musculare netede de la nivelul acestor organe, coninutul este mpins n uretra
penian, segmentul prostatic, unde, din amestecul fluidului testicular i epididimar
cu secreiile glandelor anexe, se formeaz sperma. Sperma, o dat format,
acioneaz reflex i determin nchiderea gtului vezicii urinare i contracia
fibrelor musculare netede de la nivelul uretrei pelvine, sporind pesiunea exercitat
de sperm i mpingnd-o spre baza penisului. n acest moment intervin i
muchii penisului, bulbo- i ischiocavernoi i contracia ritmic a uretrei,
nvingnd rezistena periferic i expulznd sperma n jeturi ritmice.
La producerea ejaculrii este necesar contracia sincron a muchilor
epididimului, canalelor deferente, canalului ejaculator, uretrei i penisului. Aceste
contracii determin ejacularea sacadat la armsar, vier i cine i spontan la
rumegtoare.
Prin excitaiile electrice produse la nivelul centrului ejaculator din mduva
lombar, se provoac eliminarea spermei. Acest principiu st la baza
electroejaculrii.
Modul de eliminare a spermei difer cu specia:
- la taur, berbec i ap toi componenii spermei se elimin simultan;
- la armsar, la nceput se elimin secreia glandelor Littr i a celor
bulbo-uretrale, lipsit de spermatozoizi, apoi sunt expulzai
spermatozoizii mpreun cu secreia prostatic, la urm fiind eliminat
secreia glandelor seminale;
- la vier, ejacularea este multifazic; prefaza, cu o durat de 1-2 minute,
n decursul creia se elimin secreiile glandelor uretrale lipsite de
spermatozoizi (2-5% din coninutul ejaculatului); faza principal, cu o
durat de 2-3 minute, reprezentat de secreiile epididimului,
veziculelor seminale, prostatei i glandelor bulbo-uretrale (30-50% din
coninutul ejaculatului); faza postspermatic, cu o durat de 4-5
minute, i un coninut de 50-60% din ejaculat, srac n spermatozoizi,
compus n cea mai mare parte din secreiile veziculelor seminale i
ale glandelor bulbo-uretrale.
1.3.1.2. Specificul reflexelor sexuale la principalele
specii de animale
1.3.1.2.1. Reflexele sexuale la taur
Reflexul de apropiere este puin exteriorizat i se bazeaz, n principal, pe
excitaiile vizuale, taurul apropiindu-se de femele, indiferent de stadiul ciclului
sexual n care se afl acestea. n cazul recoltrii spermei cu ajutorul vaginului
10

artificial, taurul se apropie de partenerul de recoltare, contenionat n stand

(femel, mascul) (foto 1).
Reflexul de erecie este
necondiionat, peste care se
suprapun reflexe condiionate,
prin interme-diul crora acest
reflex poate fi dirijat n sens
pozitiv. Erecia se produce
chiar din momentul intrrii n
sala de recoltare sau numai la
vederea vaginului artificial i a
operatorului recoltator cu care
s-a obinuit. Din aceast cauz,
vaginul artificial trebuie s fie
corect pregtit, n caz contrar
se
formeaz
reflexe
Foto 1 Reflexul de apropiere la taur
condiionate inhibitoare ale
acestui reflex.
Reflexul de mbriare (salt, cuprindere) (foto 2)
este bine evideniat la taurii
crescui n libertate, mpreun
cu femelele. n cazul practicrii montei, se formeaz un
reflex condiionat numai pentru
vacile n clduri. n cazul
recoltrii spermei cu ajutorul
vaginului artificial se creaz un
reflex
condiionat
pentru
masculul partener, recoltarea
Foto 2 Reflexul de mbriare i ejaculare la taur pe taur fiind practicat
n cvasitotalitatea unitilor
taur
care se ocup cu producerea de
material seminal conservat.
La taurii folosii la nsmnri artificiale se practic aa-numitul salt n gol cu
scopul mbuntirii volumului ejaculatului. n cazul unor afeciuni la nivelul
coloanei vertebrale, membrelor posterioare etc, acest reflex poate fi inhibat .
Reflexul de intromisiune (mperechere, coit) const n introducerea
penisului n conductul vestibulo-vaginal al femelei n cazul montei, sau n
lumenul vaginului artificial corect pregtit, n cazul practicrii nsmnrilor
artificiale. {i acest reflex poate fi inhibat n cazul pregtirii necorespunztoare a
vaginului artificial: tempera-tur, presiune i lubrifiere necorespunztoare, falduri
n spiral etc.
Reflexul de ejaculare se produce avnd la baz senzaiile termice, de
presiune i tactile recepionate de corpusculii dispui la nivelul penisului i
transformate n stimuli pe calea filetelor nervoase aferente pentru centrul
ejaculator lombar de la nivelul cruia, pe calea filetelor nervoase eferente, sunt
transmise la nivelul musculaturii netede a diverselor segmente ale aparatului
genital i, prin contracia acesteia, se produce expulzarea spermei. Reflexul de
ejaculare la taur este foarte rapid, suprapunndu-se intromisiunii. n cazul
recoltrii spermei cu vaginul artificial, dac acesta este corect pregtit, ejacularea
este rapid, fr a influena negativ i n timp desfurarea reflexelor sexuale la
11

taurii de reproducie. Tipul de sistem nervos influeneaz manifestarea i

desfurarea reflexelor sexuale.
1.3.1.2.2. Reflexele sexuale la berbec
Pentru animalele n libertate, comportamentul sexual, care se termin n
mod normal printr-o mperechere, se caracterizeaz printr-o secven specific a
reflexelor sexuale.
Reflexul de apropiere const n interesul berbecului pentru oaia n clduri
i cutarea acesteia. Masculul dirijeaz parada sexual (apropieri ritualizate
laterale, nsoite de micri ale unui membru anterior). Adulmec oaia n clduri,
urmnd ridicarea capului i manifestarea unui rictus al buzei superioare.
Abordarea oii n clduri se face prin lovirea acesteia cu capul n regiunea
abdomenului i apoi cu membrul anterior. Imobilizarea oii constituie semnul
vizual de identificare a strii de estru cu ajutorul unui berbec ncerctor.
Recunoaterea olfactiv a acestei stri joac rolul de declanator pentru
comportamentul sexual al berbecului. Un berbec tnr este mai puin apt s
identifice starea de estru a oilor. Atunci cnd contactul este stabilit, imobilizarea
femelei constituie semnalul desfurrii urmtoarelor reflexe sexuale.
Reflexul de erecie se realizeaz prin tergerea S-ului penian. Caracteristic
ereciei este ntinderea i ndeprtarea apendicelui uretral al glandului, urmat de
executarea unor micri ondulatorii ale acestuia.
Reflexul de mbriare const n cuprinderea oii sau a partenerului de
recoltare cu membrele anterioare. Ca i la taur i la berbec se formeaz reflexul
condiionat i pentru oile care nu sunt n clduri sau pentru masculi, recoltarea
fcndu-se i mascul pe mascul.
Reflexul de intromisiune const n introducerea penisului n conductul
vestibulo-vaginal al oii n clduri, n cazul montei, sau n lumenul vaginului
artificial, cnd se practic nsmnarea artificial. n situaia n care vaginul
artificial este corect pregtit, se produce imediat ejacularea.
Reflexul de ejaculare este foarte rapid i se evideniaz printr-o zvcnire
evident a ntregului corp i mai ales a trenului posterior. n cazul recoltrii
spermei, aceasta este proiectat n cea mai mare cantitate, direct n paharul
colector, adaptat la vaginul artificial. Cnd vaginul artificial nu este pregtit
corespunztor, actul sexual se ntrerupe la reflexul de intromisiune.
1.3.1.2.3. Reflexele sexuale la vier
Reflexul de apropiere se manifest prin cutarea reciproc dintre vier i
scroaf. Vierul caut scroafa folosind simul mirosului, vzului i auzului. Vierul,
introdus ntr-un lot de scroafe, cu ajutorul mirosului examineaz pe rnd aproape
toate scroafele, adoptnd poziia cap la cap, prin aplicarea unor lovituri uoare
n regiunea flancurilor i ncercri de salt. Prin acest comportament, vierul
depisteaz starea de estru a scroafelor, ns nu se oprete la cele n estru. n
apropierea celor doi parteneri, rolul principal revine scroafelor n clduri. n
prezena scroafei n clduri, vierul se plimb n jurul ei, grohie caracteristic, o
lovete n regiunea flancului, adulmec regiunea vulvar, aceast agitaie
permanent fiind determinat de reflexele olfacto-sexuale. Acest preludiu
sexual dureaz, n medie, 5-10 minute i este mai evident i de durat n timp mai
mare la vierii tineri. Se mai remarc micri caracteristice ale maxilarului inferior,
12

urmate de o secreie abundent de saliv i eliminarea ritmic a unor cantiti mici

de urin (Feredean T., 1969).
Reflexul de erecie const n exteriorizarea treptat a penisului prin
tergerea S-ului de la acest nivel, n urma iniierii jocurilor descrise.
Reflexul de mbriare const n fixarea crupei scroafei sau prii
posterioare a manechinului cu membrele anterioare, penisul intr n erecie
deplin, vierul modificndu-i permanent poziia, cutnd insistent fanta vulvar.
Penisul este introdus n conductul vestibulo-vaginal, poriunea spiralat ajungnd
la nivelul conductului cervical, unde st fixat pe toat durata ejaculrii.
Reflexul de ejaculare se caracterizeaz prin contracii ritmice ale
musculaturii din regiunea anal, apropierea testiculelor de orificiul extern al
canalului inghinal, concomitent cu retractarea burselor testiculare. Durata
ejaculrii este de 4-8 minute i se realizeaz fazial: prespermatic, spermatic i
postspermatic.
1.3.1.2.4. Reflexele sexuale la armsar
Reflexul de apropiere este evident la armsar, care, n prezena iepei
devine nelinitit.
Reflexul de erecie se manifest treptat, ncepnd cu preerecia la distan
de iap, penisul fiind evideniat circa jumtate, ntrindu-se i ngrondu-se
progresiv.
Reflexul de mbriare se manifest energic.
Reflexul de intromisiune, de regul se desfoar ajutat de o persoan
aezat lateral. Armsarul execut 5-10 micri de pistonare n urma crora
penisul ajunge la momentul maxim al ereciei. Glandul este puternic tumefiat, cu
diametrul de 10-12 cm, n form de ciuperc.
Reflexul de ejaculare se desfoar la cteva secunde de la intromisiune,
eliminarea spermei fcndu-se fazial.
1.3.2. Principii i metode de recoltare a spermei
Recoltarea este operaia prin care se obine sperma de la reproductor cu
ajutorul unei aparaturi speciale sau prin alte procedee.
Recoltarea spermei se bazeaz pe urmtoarele principii:
- realizarea, prin mijloace artificiale, a condiiilor existente n seciunea
copulatoare a femelei n clduri: temperatur, presiune, lubrifiere,
respectiv recoltarea spermei cu vaginul artificial;
- excitarea artificial a centrului ejaculator din mduva lombar prin
intermediul curentului electric de o anumit tensiune i intensitate,
respectiv recoltarea spermei prin electroejaculare;
- realizarea artificial a unor excitaii mecanice prin masaj local, efectuat
manual la diverse niveluri i anume: masajul penisului prin traversul
tecii furoului, respectiv recoltarea spermei prin masturbaie;
- recoltarea spermei prin masajul ampulelor canalelor deferente i ale
glandelor seminale;
- masajul regiunii abdominale la masculii psrilor, respectiv recoltarea
spermei prin masaj abdominal.

13

n prezent, metoda cea mai rspndit pentru recoltarea spermei este

metoda cu vaginul artificial, metod prin care cantitatea i calitile ejaculatului
nu sunt modificate.
Vaginul artificial este alctuit dintr-un tub cilindric, rigid sau semirigid,
confecionat din cauciuc pnzat, ebonit sau tabl (n raport cu specia) a crui
form i dimensiuni variaz de asemenea cu specia; o cma vaginal
confecionat din cauciuc subire; un pahar colector confecionat din sticl sau
cauciuc, de mrime i form difereniate cu specia, cu perei simpli sau dubli dup
cum spermatozoizii speciei sunt mai mult sau mai puin rezisteni la variaiile de
temperatur. Cmaa vaginal se fixeaz prin intermediul unor inele de cauciuc la
tubul vaginal, formndu-se n acest fel un spaiu virtual n care se introduce ap
cald i aer, n raport cu specia. n momentul recoltrii, temperatura interioar
trebuie s fie de 40-420C. Completarea spaiului virtual se poate face i cu ap
rece, ns vaginul artificial astfel pregtit trebuie s fie pstrat la termostat reglat
la temperatura de 40-420C. n momentul recoltrii se insufl aerul necesar
realizrii presiunii optime.
Presiunea se realizeaz att prin intermediul apei ct i a aerului introdus
n spaiul dintre tub i cmaa vaginal. Lubrifierea se face cu vaselin neutr
sterilizat. Recoltarea spermei prin folosirea vaginului artificial se face fie pe
femele care nu se gsesc n clduri, fie pe manechine, sau mascul pe mascul.
Recoltarea spermei se efectueaz n ncperi special amenajate. Operatorul
recoltator, aezat pe una din laturile partenerului de recoltare, ine vaginul
artificial pregtit pentru recoltare, nclinat la 35-450 fa de crupa femelei
(masculului). n momentul n care masculul execut saltul, operatorul prinde cu o
mn prin traversul furoului penisul acestuia i l dirijeaz ctre lumenul vaginului
artificial. Dac vaginul artificial este corect pregtit i manevrat, masculul
ejaculeaz, sperma fiind proiectat n paharul colector, care se trece n laborator,
unde se face controlul spermei. Timpul scurs ntre intromisiunea penisului n
lumenul vaginului i ejaculare este dependent de specie, de condiiile n care a fost
pregtit vaginul, de tipul de sistem nervos al masculului, de existena sau nu a
unor reflexe condiionate inhibitoare etc.
Recoltarea spermei prin electroejaculare a fost preconizat de Batelli
(1922) citat de I. Dumitrescu i colab., 1978, ulterior metoda fiind mbuntit de
cercettori din diverse ri. Metoda se bazeaz pe excitaiile produse cu ajutorul
curentului electric, de o anumit tensiune, intensitate i durat asupra centrului
ejaculator din mduva lombar. n urma excitaiilor se produc contracii ale
musculaturii netede din pereii cilor de eliminare a spermei. Aceast metod se
aplic la berbec, taur, psri. Sperma obinut nu difer, cantitativ i calitativ, de
cea obinut cu ajutorul vaginului artificial.
Recoltarea spermei prin masajul ampulelor canalelor deferente i a
glandelor seminale a fost experimentat n anul 1934 n S.U.A., la bovine de
ctre Miller i Evans. Metoda se bazeaz pe provocarea eliminrii spermei
consecutiv excitaiilor mecanice realizate prin masajul acestor formaiuni, n urma
contraciilor musculaturii netede.
Recoltarea spermei prin masajul abdominal a fost imaginat de Burrows
i Quinn n 1937 i d bune rezultate la psri.
Recoltarea spermei prin masturbaie a fost aplicat pentru prima dat de
Spallazani la cine. Ejacularea are loc n urma excitaiilor mecanice produse
asupra corpusculilor senzoriali de la nivelul glandului i prepuului. Prin acest
procedeu se poate recolta sperma de la cine, vier, vulpoi.

14

1.3.2.1. Recoltarea spermei la taur

Recoltarea spermei la taur se poate face prin trei metode:
- cu vaginul artificial;
- prin electroejaculare;
- prin masajul ampulelor canalelor deferente i al veziculelor seminale.
Recoltarea spermei cu vaginul artificial
Este cea mai rapid i comod posibilitate de recoltare a spermei a crei
reuit este condiionat de realizarea optim a celor trei factori de baz:
temperatur, presiune i lubrifiere.
Vaginul artificial este alctuit dintr-un tub rigid sau semirigid, o cma
vaginal i un pahar colector. Tubul (carcasa) este cilindric, confecionat din
cauciuc pnzat sau material plastic, prevzut cu un orificiu, nchis cu un dop.
Tubul are o lungime ce difer cu modelul i unitatea constructoare, care variaz
ntre 40 i 50 cm, cu un diametru de 5,56 cm.
Cmaa vaginal este cilindric, cu o lungime de 6575 cm, lime de 7
cm, confecionat din cauciuc subire. Dimensiunile cmii vaginale se coreleaz
cu cele ale tubului la care se adapteaz. Paharul colector este reprezentat de un
recipient din sticl cu pereii dubli (ntre care se gsete ap) sau dintr-o eprubet
gradat ce se fixeaz la vagin printr-un con prelungitor din cauciuc (fig. 1, foto 3).
Lungimea vaginului artificial este condiionat de necesitatea ca materialul
seminal s fie obinut direct n paharul colector, cu o trecere scurt prin cmaa
vaginal sau conul prelungitor din cauciuc spre a evita, pe ct posibil, pierderile
de sperm i eventualul efect negativ al acestor materiale asupra viabilitii
spermatozoizilor
Pregtirea
vaginului artificial pentru recoltare
const n introducerea cmii
vaginale n lumenul carcasei
vaginului i rsfrngerea capetelor
care depesc lungimea corpului
peste acesta, astfel nct cmaa
vaginal s fie moderat de ntins,
iar faldurile care le face n interior
s fie dispuse longitudinal. Fixarea Fig. 1 Modele de vagin artificial
pentru
capetelor cmii vaginale la tub se
recoltarea spermei de taur
face prin intermediul a dou inele
din cauciuc. ntre tub i cmaa
vaginal se formeaz un spaiu care
va fi umplut cu ap cald i aer
pentru realizarea temperaturii i a
presiunii. n momentul recoltrii,
temperatura din interiorul vaginului
artificial trebuie s fie de 4043oC.
Pentru realizarea presiunii normale,
cantitatea de ap introdus se
completeaz cu aer, care se insufl
cu o par din cauciuc pe la nivelul
robinetului ce obtureaz orificiul.
Se introduce aer pn cnd lumenul
vaginului este obturat de faldurile Foto 3 Aparatur de recoltare a spermei
cmii vaginale.
la armsar, taur, berbec
15

Paharul colector se adapteaz fie direct la unul din capetele vaginului

artificial i fixat cu ajutorul unui cpstru, fie prin intermediul unui tub
prelungitor, temperatura apei dintre cei doi perei trebuind s corespund
temperaturii vaginului artificial.
n cazul folosirii ca recipient de colectare a eprubetei gradate, aceasta se
adapteaz la vaginul artificial prin intermediul unui con prelungitor din cauciuc.
La captul opus paharului colector, cu ajutorul unei baghete de sticl se lubrifiaz
1/3 din lungimea vaginului artificial cu vaselin neutr hidrosolubil. Excesul de
vaselin neutr determin scurgerea acesteia n sperm, cu efecte negative asupra
mobilitii spermatozoizilor, insuficiena vaselinei neasigurnd condiia de
lubrifiere, de unde i insuccesul n recoltarea spermei prin aceast metod.
Crearea presiunii necesare n interiorul vaginului artificial se poate realiza numai
cu aer care se insufl naintea recoltrii propiuzise.
Tehnica recoltrii
n unitile specializate, recoltarea spermei se face ntr-o sal special
amenajat n acest scop, spaioas (80100 m2), luminoas, aerisit, prevzut cu
un stand de contenie i cu o anex n care se face splarea i dezinfecia
componentelor vaginului artificial i n care se gsete i termostatul electric la
temperatura de 4143oC.
Pardoseala slii de recoltare este din asfalt, care favorizeaz meninerea
cureniei i menajeaz ongloanele membrelor posterioare foarte solicitate n
timpul saltului. napoia standului de recoltare, pardoseala se acoper cu un covor
din cauciuc, rumegu sau nisip pentru a menaja i mai bine membrele posterioare. nainte de introducerea taurului n sala de recoltare ntr-un stand ce se
gsete ntr-o antecamer se efectueaz toaleta orificiuluii a regiunii
periprepuiale care se spal cu ap cald i spun, se terge cu un prosop curat,
individual, propriu fiecrui taur
i se dezinfecteaz orificiul
prepuial cu o soluie de
permanganat de potasiu 1o/oo sau
alt antiseptic uzual (foto 4).
Planificarea taurilor la
recoltare, n unitile specializate
se face dup un grafic lunar.
Pentru aceasta, taurii sunt lotizai
pe grupe de recoltare constituite
din 2030 de tauri (funcie de
efectivul n exploatare din fiecare
unitate) iar n cadrul grupelor de
recoltare, pe loturi formate din 4
Foto 4 Toaleta regiunii prepuiale la taur
6 tauri.
Planificarea la recoltare se face pe grupe ntr-o anumit succesiune (A, B, C, D), ntr-o zi urmnd a
se recolta de la toi taurii din grupa planificat. Taurii sunt scoi din grajd pe loturi i introdui pe
rnd n sala de recoltare, timp n care ceilali tauri din lot sunt plimbai. Frecvena recoltrilor
depinde de vrsta taurilor, de condiiile de alimentaie i ntreinere, de experiena practic a
unitilor productoare de material seminal, funcie de autori aceast frecven oscilnd de la 1 la 6
ejaculate pe sptmn. Experiena practic a artat c cea mai bun eficien n obinerea

unui numr optim de spermatozoizi/sptmn este atunci cnd se recolteaz 4

ejaculate pe sptmn, cte dou consecutiv pe ziua de recoltare, cu o pauz de
34 zile, sau dou ejaculate pe sptmn la interval de 34 zile dar cu o atent
pregtire a taurului nainte de recoltare. Pregtirea taurului const n gimnastica
funcional a acestuia naintea introducerii n sala de recoltare (foto 5), apoi
reinerea acestuia timp de 23 minute nainte de ejaculare, efectuarea a 23 salturi
n gol, n raport i cu vrsta taurului i tipul de sistem nervos al acestuia.
16

Foto 5 Gimnastica funcional a taurilor naintea recoltrii spermei

Pentru obinuirea taurilor la recoltare se folosete ca manechin o vac n
clduri sau n oricare stadiu al ciclului sexual, un mascul care este, de regul, unul
din taurii n exploatare, folosii prin rotaie sau un manechin confecionat din lemn
sau metal, mbrcat cu o piele de taurine, prevzut n partea posterioar cu un
dispozitiv n care se fixeaz vaginul artificial pregtit corespunztor. n unitile
specializate recoltarea se face taur pe taur, taurul manechin fcnd parte din
lotul de recoltare i se stabilete prin rotaie, la sfritul recoltrii spermei de la
lotul n cauz, urmnd a se recolta sperma i de la taurul folosit ca manechin.
Taurul manechin se contenioneaz
ntr-un stand, iar operatorul recoltator
se plaseaz pe una din laturile
manechinului, innd ntr-o mn, la o
nclinaie de 3545o fa de orizontal,
vaginul artificial (foto 6). Dup 2 3
salturi effectuate n gol, operatorul cu
una din mini, prin traversul furoului
orienteaz penisul spre lumenul
vaginului artificial. n cazul n care
vaginul artificial a fost pregtit
corespunztor, ejacularea se produce
la un interval de timp foarte scurt i
Foto 6 Recoltarea spermei la taur cu se evideniaz printr-o micare brusc
de pistonare spre nainte a trenului
vaginul artificial
posterior (zvcnire).
Sperma este proiectat direct n paharul colector. Se desprinde cu atenie
vaginul artificial i se orienteaz cu paharul colector n jos n vederea colectrii
ntregii cantiti de sperm ejaculat.
Oricare ar fi tipul de vagin artificial (lung sau scurt), pierderile de material
seminal se situeaz ntre 1020%, sperm care ader de pereii vaginului artificial.
Indiferent de durata perioadei de reinere de la sritur sau de numrul sriturilor
n gol, pregtirea sexual trebuie s precead fiecare ejaculare chiar dac se
recolteaz dou ejaculate consecutiv. Aceast pregtire menine capacitatea
sexual a taurului pe toat perioada de timp ct se afl n exploatare.
Dup recoltare, paharul colector cu sperm se transmite la laborator pentru
examinare, prelucrare i conservare.
Recoltarea spermei prin electroejaculare
Se bazeaz pe excitaiile produse de curentul electric asupra centrului
ejaculator din mduva lombar. Musculatura neted de la nivelul cilor de
17

eliminare a spermei se contract, sperma fiind eliminat la exterior. Se folosete

foarte rar, n condiii de laborator, atunci cnd eueaz ncercrile de recoltare cu
vaginul artificial. Se aplic taurilor cu inhibiii ale reflexului de mbriare i
ejaculare, celor fr apetit sexual i celor care au divesre defecte la nivelul
membrelor posterioare, tauri care au mare valoare de ameliorare.
Electroejaculatorul este constituit dintr-un electrod bipolar conectat la o
surs de curent, portabil, circuitele fiind tranzistorizate i miniaturizate.
Contenia taurului se face ntr-un stand sau travaliu.
Pregtirea taurului pentru recoltare const n nlturarea materiilor fecale
din rect, prin splarea acestuia cu civa litri de soluie NaCl 5%, care va uura
conductibilitatea electric i din splarea regiunii furoului i tunderea prului de la
nivelul orificiului prepuial.
Se introduce electrodul n rect, cu precauie, se ateapt 35 minute dup
care se ncepe declanarea impulsurilor electrice.
La nceput se folosesc 1520 de excitaii electrice, fiecare cu o durat de
23 secunde i desprite de pauze de 5060 secunde. Intensitatea curentului
crete treptat cu fiecare excitaie, pornindu-se de la 100 miliamperi, la 8001500
miliamperi i cu tensiunea de 2530 V, durata excitaiilor mrindu-se pn la 56
secunde. La fiecare excitare se obine ejaculat, format la nceput de secreiile
glandelor anexe i apoi fraciuni cu un coninut crescut de spermatozoizi. Durata
total a recoltrii este de 510 minute, cantitatea de sperm obinut fiind egal
sau uor mai mare dect volumul spermei recoltat cu ajutorul vaginului artificial.
Eliminarea spermei se produce fr ca penisul s intre n erecie.
Recoltarea spermei prin masajul ampulelor canalelor deferente i al
glandelor seminale
Metoda prezint interes numai n cazul taurilor care din diverse motive nu
pot efectua saltul i la care recoltarea cu vaginul artificial nu se poate aplica.
Taurul se contenioneaz ntr-un stand sau travaliu, se execut toaleta
furoului i splarea bursei prepuiale cu o soluie izotonic de NaCl, apoi se
videaz vezica urinar prin masaj transrectal pentru a se evita amestecul urinei cu
sperma. Cnd peretele rectal este destins se palpeaz cu precauie planeul
cavitii pelvine unde, sub forma unui cordon durcartilaginos, cu un diametru de
circa 23 cm, se identific uretra intrapelvin. Se palpeaz gtul vezicii urinare
apoi, de o parte i de alta a acesteia, dispuse n unghi ascuit, form alungit,
aspect boselat, se palpeaz glandele seminale. Deasupra vezicii urinare se gsesc
i dilataiile canalelor deferente sub forma a dou cordoane elastice, ce converg
spre gtul vezicii urinare n unghi ascuit, diametrul fiind de 0,81,2 cm. Tot la
acest nivel se gsete prostata. Masajul se face n sens cranio caudal, pe o distan
de 2030 cm, cu atenie, timp de 35 minute, dup care ncepe s se elimine
sperma, pictur cu pictur. Pe timpul masajului taurul este linitit, testiculele
sunt retrase spre inelul inghinal, glandul este parial exteriorizat din teaca furoului,
fr ca penisul s intre n erecie. La nceput se colecteaz un lichid albapos care
reprezint secreia veziculelor seminale, srac n spermatozoizi, care se
ndeprteaz. Urmeaz eliminarea unei fraciuni bogat n spermatozoizi, culoare
alb glbui, consisten cremoas. Unii tauri nu rspund favorabil la colectarea
spermei prin acest procedeu. n cazul n care sperma nu se elimin n decurs de 7
10 minute, se renun la masaj, operaiunea fiind reluat n ziua urmtoare.
Metoda prezint avantajul c nu necesit condiii speciale de contenie i
recoltare i dezavantajul obinerii unei sperme inferioare calitativ, n urma
amestecului cu urin i a venirii n contact cu aerul un timp mai ndelungat.

18

1.3.2.2. Recoltarea spermei la berbec i ap

Dou tehnici pot fi utilizate pentru colectarea spermei la masculii
rumegtoarelor mici: cu ajutorul vaginului artificial i prin electroejaculare.
Recoltarea spermei cu vaginul artificial este cea mai rspndit, uor
accesibil centrelor de reproducie, rezultatele obinute fiind bune sub aspectul
volumului ejaculatului i calitii spermei.
Obinuirea masculilor la recoltare necesit un anumit interval de timp i
mult rbdare. Se ncepe totdeauna n sezonul sexual (sfritul verii i toamna)
folosindu-se pentru obinuire o oaie n oricare stadiu a ciclului sexual.
Vaginul artificial este dimensionat pentru aceast specie: 2021 cm
lungime, 45 cm diametru, prevzut cu un orificiu astupat cu un dop, pe unde se
introduce apa cald sau apa cald i aer pentru a asigura condiiile de temperatur
i presiune. Paharul colector este confecionat din sticl cu perei simpli,
termoizolat cu un manon din burete, sau din sticl cu perei dubli, pentru a evita
efectul negativ al ocului termic (a frigore) asupra viabilitii spermatozoizilor.
Temperatura din interiorul lumenului n momentul recoltrii trebuie s fie de 40
43oC. Adaptarea paharului colector se face la unul din capetele deschise ale
vaginului artificial, cu ajutorul acestuia reglndu-se presiunea din interiorul
vaginului n funcie de distana pe care se introduce paharul colector. La captul
opus paharului colector se lubrifiaz cu vaselin neutr lumenul pe circa 1/3 din
lungime, evitndu-se folosirea n exces a vaselinei sau insuficiena lubrifierii.
Se consider bine pregtit vaginul artificial atunci cnd faldurile formate
de cmaa vaginal au o dispoziie longitudinal i optureaz complet lumenul.
Recoltarea se face ntr-o sal special amenajat n care se gsete un stand
de contenie a oii partener. Sala de recoltare trebuie s fie curat, luminoas, iar
pregtirea berbecului pentru recoltare se face ca i la taur. Lna din jurul
orificiului prepuial se tunde, se spal cu ap i spun i se cltete cu soluie
izotonic de NaCl 0,9% pentru ndeprtarea impuritilor.
Oaia manechin se contenioneaz ntr-un stand metalic fixat pe un podium
din lemn. Operatorul, cu vaginul artificial pregtit, se aaz n genunchi pe una
din laturile oii, n dreptul crupei, innd vaginul artificial nclinat la circa 45o fa
de orizontal, cu paharul colector n sus.
Dup efectuarea saltului, operatorul dirijeaz cu o mn, prin traversul
furoului, penisul spre lumenul vaginului artificial. n cazul n care vaginul
artificial a fost pregtit corespunztor (temperatur, presiune, lubrifiere)
ejacularea coincide cu intromisiunea i se evideniaz printr-o micare de
propulsie a trenului posterior. Dup ejaculare, berbecul coboar de pe femel, iar
vaginul artificial se desprinde cu atenie i se orienteaz cu paharul colectoer n
jos, apoi paharul se scoate i sperma se transmite la laborator pentru examinare i
prelucrare. Pentru masculii obinuii cu recoltarea, n sezonul sexual, se prelev
dou ejaculate succesiv la 25 minute.
Recoltarea spermei prin electroejaculare
Se bazeaz pe provocarea ejaculrii prin excitarea electric a ganglionilor
simpatici lombari care determin contracia musculaturii netede de la nivelul
ampulelor canalelor deferente i eliminarea spermei, fr ca penisul s intre n
erecie. Aceast tehnic necesit un volum mare de munc prin contenia
animalului, o sal cu dotare special, un electroejaculator identic cu cel utilizat la
taur, este dureroas pentru mascul, iar caracteristicile spermei difer de a celei
obinute prin folosirea vaginului artificial, motive pentru care aceast metod nu
este rspndit.

19

Se poate folosi n condiii de laborator, n cazul unor reproductori de

nalt valoare zootehnic i care din diverse motive nu pot efectua saltul.
n prezent se folosesc electroejaculatoare tranzistorizate, portabile care
asigur un curent de 258 V i 150 mA prevzut cu un electrod bipolar.
Pentru recoltare, berbecul se fixeaz n decubit lateral i se contenioneaz
pe o mas de lucru (sau pe o scar ntins). Se face o clism cu o soluie de NaCl
10% i toaleta furoului i apoi se fixeaz cu o me de tifon steril trecut pe la
baza poriunii terminale a glandului. Electrodul bipolar se introduce n rect pn
ce acesta ajunge n dreptul regiunii lombare.
Paharul colector, termoizolat i sterilizat, se menine n dreptul deschiderii
uretrei. Se stabilete contactul electric i se provoac cteva impulsuri cu o durat
de 25 secunde, cu pauze de 510 secunde. Dup 57 impulsuri se provoac
eliminarea spermei care se colecteaz n pahar. Impulsurile continu pn se
obine cantitatea normal de sperm.
1.3.2.3. Recoltarea spermei la vier
Se poate realiza prin trei metode: cu vaginul artificial; prin masturbare
(metoda manual); prin electroejaculare.
Recoltarea spermei cu vaginul artificial
Recoltarea spermei presupune obinuirea vierului cu partenerul si sala de
recoltare si cu operatorul recoltator.
Pentru recoltarea spermei se folosete un partener natural sau artificial.
Partenerul natural poate fi o scroaf n clduri sau alte categorii de porci:
scroafe care nu sunt n clduri, vieri, masculi castrai. Scroafa n clduri se
folosete pentru obinuirea vierilor. Scroafele care nu sunt n clduri se
contenioneaz sub un manechin special construit din bare metalice, iar vierul
partener se contenioneaz prin fixarea unei frnghii de maxilarul superior,
obinndu-se astfel starea de imobilitate. ntruct partenerul natural obosete, de
regul dup o recoltare, cel mai folosit este partenerul artificial.
Partenerul artificial, manechinul trebuie s imite conformaia scroafei,
motiv pentru care se nvelete cu pile de porc (foto 7).
Vaginul
artificial
se
compune dintr-un tub (carcas)
vaginal cu o lungime de circa 20
cm,
cmaa
vaginal,
confecionat din cauciuc subire,
prelungitorul vaginal confecionat
din material plastic i paharul
colector. Paharul colector este
reprezentat dintr-un borcan de
sticl cu capacitatea de 300500
ml termoizolat (cu pereii dubli
sau acoperit de un manon din
Foto 7 Manechin pentru recoltarea spermei burete fixat ntr-un recipient
metalic adecvat) (fig.7).
la vier
Pentru reinerea i ndeprtarea fraciunii gelatinoase a spermei, la gura
paharului se fixeaz un filtru confecionat din tifon steril. Paharul colector se
menine la termostat reglat la 4143oC pn n momentul recoltrii, astfel nct pe
20

toat durata recoltrii, temperatura din interiorul paharului colector s nu scad

sub 3536oC.
Aparatura,
sticlria
i
ustensilele igienizate i sterilizate se
menin la termostat, reglat la 40
42oC, pn la ntrebuinare.
Vierii de la care urmeaz s
se recolteze se pregtesc, ntr-o box
special amenajat n incinta slii de
recoltare, prin splarea cu ap cald
i spun a zonei prepuiale i
dezinfectarea cu o soluie de
permanganat de potasiu 1o/oo
Fig. 2 Schema vaginului artificial pentru
recoltarea spermei la vier
Tehnica recoltrii
Pregtirea vaginului pentru recoltare se face ca la rumegtoare, presiunea
i temperatura necesare realizndu-se cu ajutorul apei calde i a aerului.
Vaginul artificial se fixeaz ntr-un suport ce culiseaz n interiorul
manechinului. Dup ce vierul a efectuat saltul pe manechin, penisul va fi dirijat
spre lumenul vaginului. Ejacularea la vier dureaz 510 minute, timp n care
presiunea din interiorul vaginului se ridic prin insuflarea aerului sau prin presarea
manual la nivelul conului prelungitor, n funcie de tipul de vagin artificial
folosit.
Dup recoltare, paharul colector se detaeaz de vagin i se trece la
laborator pentru examinare i prelucrare. Materialul seminal obinut prin acest
procedeu de recoltare este de bun calitate ns se impune o bun cunoatere a
exigenelor fiecrui vier, funcie de care se pregtete corect vaginul artificial.
Recoltarea spermei prin metoda manual (masturbare)
n prezent este cea mai rspndit, fiind un procedeu de recoltare simplu i
care nu necesit aparatur complicat, calitatea materialului seminal obinut fiind
foarte bun.
Vierul este condus n boxa de recoltare, este lsat s efectueze saltul pe
manechinul artificial, apoi operatorul plasat de regul pe partea dreapt a
manechinului, prinde cu mna stng penisul exteriorizat din teaca furoului i-l
trage lateral i n jos. Aceast extensie a penisului i presiunea exercitat cu mna
la nivelul poriunii spiralate declaneaz reflexul de ejaculare.
Fraciunea presperma-tic lipsit de spermatozoizi i cu un coninut ridicat
n micro-organisme se nltur. Cu cealalt mn se menine paharul colector
termoizolat i prevzut cu un filtru de tifon, la nivelul orificiului extremitii libere
a penisului, pentru recoltarea spermei (foto 8 ).
Primele jeturi de sperm care au un aspect lptos se colecteaz n pahar,
recoltarea continund pn la terminarea eliminrii spermei. Fraciunea
gelatinoas a spermei reinut pe filtru se nltur, iar paharul colector se trimite la
laborator pentru evaluare I prelucrare. Pentru evitarea apariiei unor reflexe
negative se recomand ca vierul s fie scos din box de acelai operator
recoltator, s urmeze acelai traseu pn n boxa de recoltare iar boxa s fie
ntotdeauna aceeai, fr schimbri n interior.

21

Foto 8 Recoltarea spermei la vier prin metoda

manual (masturbare)

Recoltarea
spermei
prin electroejaculare
Ofer
posibilitatea
examinrii spermei unui vier de
la care nu se obine ejacularea pe
manechin sau n caz de
impoten. Se poate folosi n
lucrrile de cercetare pentru
examinarea secreiilor glandelor
anexe la vierii nematuri sexual.
Se folosete un electroejaculator
prevzut cu un electrod bipolar
i cu o surs de curent alternativ
care s asigure o tensiune de 10
30 V i o intensitate de 100
1000 mA. Se contenioneaz
vierul, se igienizeaz prepuul cu
o soluie izotonic de NaCl
0,9%, se face o clism rectal cu
o soluie de NaCl 10% pentru
eliminarea
coninutului.
Electrodul bipolar se
introduce n rect astfel nct
electrozii s ajung pn n
dreptul
regiunii
lombare,
vertebrele L2 L4.

La nceput se produc ocuri electrice cu o tensiune de 5 V i o intensitate

de 50100 mA, apoi tensiunea i intensitatea cresc progresiv cu fiecare impuls.
Dup fiecare impuls electric se face pauz de 510 secunde. Eliminarea spermei
se produce cnd tensiunea curentului este de 1520 V i intensitatea de 5001000
mA.
1.3.2.4 Recoltarea spermei la armsar
nsmnarea artificial la cabaline nu constituie o practic curent de
reproducie, att la noi n ar ct i pe plan mondial.
Recoltarea spermei se face cu ajutorul vaginului artificial. Tubul vaginului
este confecionat din tabl zincat, material plastic sau aluminiu, avnd o lungime
de 55 cm, diametrul interior la un capt, de 12 cm, iar la cellalt de 8,5 cm.
Cmaa vaginal este confecionat din cauciuc, cu lungimea de circa 70 cm i un
diametru de 1517 cm.
Recipientul pentru sperm, confecionat din material plastic, este cilindric
i se fixeaz la tubul vaginal la extremitatea cu diametrul mai mic, prin
intermediul unui con prelungitor. Paharul colector este termoizolat.
Pregtirea vaginului se face n mod asemntor ca pentru taur. Pentru
recoltare, iapa se contenioneaz cu platlonje, se nfoar coada iepei cu tifon
pentru a se evita lezionarea penisului. Armsarul se contenioneaz cu dou pene
de cpstru, inut lateral de ngrijitori.
n momentul efecturii saltului, operatorul recoltator orienteaz penisul
armsarului spre lumenul vaginului artificial, vagin inut oblic, la 45o fa de
22

orizontal i alturat de crupa iepei. Dup executarea unor micri de pistonare,

ejacularea se produce dup 1517 secunde i se evideniaz prin micri ritmice la
baza cozii. La ncheierea ejaculrii, armsarul coboar de pe iap, iar operatorul
desprinde cu atenie vaginul artificial de pe organul copulator. Dup recoltare se
spal penisul armsarului cu ap cald i se dezinfecteaz cu o soluie de
permanganat de potasiu 1o/oo.
1.3.2.5. Recoltarea spermei la psri
n perioada anilor 19021937 s-au ncercat diverse metode de recoltare a
spermei la psri: interpunerea unei canule din sticl ntre cloaca cocoului i a
ginii n timpul clcatului, folosirea unui spermocaptator fixat prin intermediul
unor curelue la cloaca ginii, folosirea ca spermocaptator a unui prezervativ fixat
la cloaca cocoului, recoltarea prin electroejaculare, recoltarea prin masaj
abdominal.
Dintre toate aceste variante, cea mai avantajoas sub aspect practic este
recoltarea spermei prin masaj abdominal i se poate aplica la toate speciile de
psri de ferm fiind astzi cea mai utilizat metod de recoltare pe plan mondial.
Recoltarea spermei la coco
Operatorul se aaz pe un taburet i menine cocoul n decubit sterno
abdominal imobilizand membrele acestuia prin prinderea intre picioarele
operatorului. Cu mna stng se maseaz uor regiunea sacral n direcie cranio
caudal iar cu mna dreapt regiunea abdominal dinspre apendicele xifoid spre
apofizele pubiene. Cocoul prolabeaz cloaca n care se observ cele dou papile
mai congestionate (culoare roz-roietic). Operatorul, cu mna stng preseaz
zona pericloacal, iar cu mna dreapt colecteaz sperma n paharul colector.
Colectarea spermei se mai poate face i prin aspiraie ntr-o fiol cu capacitatea de
2 ml astupat cu un dop de plut sau cauciuc. Prin dop este trecut un tub din sticl
ndoit, puin mai larg la un capt cu care se va colecta sperma i un al doilea tub
tot din sticl, la care se adapteaz un prelungitor din cauciuc sau material plastic
pe unde se creaz depresiunea prin aspirare. Sperma aspirat va cdea n fiola
respectiv.
Contenia cocoului se poate face i sub braul drept al unui ajutor, cu
coada nainte i cu mna se imobilizeaz ambele picioare. Operatorul efectueaza
masajul abdominal si recoltarea spermei. n unitile mari n care cocoii sunt
ntreinui n cuti, contenia cocoului se face direct la ua cutii de un ajutor,
operatorul efectund masajul abdonimal i apoi colecteaz sperma. n acest fel,
productivitatea muncii crete foarte mult.
Recoltarea spermei la curcan
Se face cu bune rezultate de o echip constituit din dou persoane. Pentru
aceasta se folosete un scaun dublu cu sptar, n care este practicat un orificiu.
Curcanul se contenioneaz n decubit sterno-abdominal, cu capul introdus n
orificiul practicat n sptar. Ajutorul se aaz n partea stng a curcanului i cu
spatele imobilizeaz aripa stng a acestuia, iar cu piciorul stng, prin intermediul
unei fee de tifon imobilizeaz piciorul stng al curcanului. Imobilizeaz aripa
dreapt a curcanului cu mna stng ntre cotul i sptarul scaunului imobiliznd
totodat i piciorul drept al curcanului. Cu mna dreapt ridic coada i
evideniaz orificiul cloacal. Operatorul execut masajul abdominal cu ambele
mini i cnd curcanul este excitat execut pericloacal compresiuni cu degetele
mari de la ambele mini. Sperma se evideniaz la nivelul cloacei de unde se
recolteaz ntr-un pahar sterilizat.
23

1.4. Examenul nsuirilor spermei

Examenul nsuirilor spermei are ca necesitate legat att de cunoaterea
fertilitii reproductorului ct I de tehnica dilurii I aprecierii spermei 1n
diferite faze de prelucrare I conservare.
Compoziia spermei, variaz n funcie de specie i chiar reproductor,
calitatea spermei difer n decursul aceleiai zile, funcia spermatogenetic fiind
dependent de numeroi factori exogeni i endogeni. Metodele care se folosesc
pentru aprecierea calitii spermei se pot mpri n urmtoarele categorii:
examenul nsuirilor fizice; examenul nsuirilor biologice; examenul citologic;
examenul biochimic; examenul bacteriologic i micotic. Rezultatele obinute se
consemneaz ntr-un formular oficial denumit spermogram, hotrtoare pentru
aprecierea unui reproductor.
1.5. Diluarea spermei
1.5.1. Consideraii generale
Rspndirea nsmnrilor artificiale s-a datorat posibilitilor de diluare
i conservare a spermei. Diluarea spermei reprezint o etap premergtoare i
obligatorie pentru conservarea spermei; n rare situaii sperma se nsmneaz
sub form brut sau imediat dup diluare, fr a fi conservat. Pstrarea spermei
presupune diluarea i conservarea ei, dou etape interdependente ce se aplic
succesiv i corelat. Diluarea permite:
- creterea volumului total al masei spermatice;
- posibilitatea fracionrii ejaculatului n mai multe doze i, deci,
nsmnarea unui numr mult mai mare de femele;
- asigurarea unui mediu favorabil prelungirii viabilitii i capacitii
fecundante a spermatozoizilor, etc.
n cazul n care nu exist dotarea tehnic necesar conservrii, se poate
folosi sperma diluat, dar numai dup scurgerea intervalelor de timp necesare
echilibrrii (3-4 ore). Sperma diluat trebuie s fie inoculat femelelor n clduri,
ntr-un interval de timp ct mai scurt, imediat dup echilibrare.
Indiferent de metoda de conservare a spermei, pentru prelungirea
viabilitii i a capacitii fecundante a spermatozoizilor in vivo, sunt necesare:
- reducerea formrii i acumulrii produilor rezultai din metabolismul
celulelor seminale;
- neutralizarea substanelor toxice rezultate din metabolism;
- trecerea parial sau definitiv a spermatozoizilor n anabioz.
Aceste deziderate se realizeaz prin diluarea spermei, realizarea unui
mediu cu un pH uor acid (6,2 - 6,4) sau scderea temperaturii n timpul dilurii,
cu meninerea temperaturii sczute pe toat durata conservrii.
1.5.2. Principiile dilurii spermei, nsuirile generale
ale diluanilor i clasificarea acestora
Diluia spermei se bazeaz pe faptul c din numrul total de spermatozoizi
depui prin mont, numai o fraciune redus (circa 5%) ajung pn la nivelul
treimii anterioare a oviductului, locul unde urmeaz s se desfoare fecundaia.
24

n acest fel, marea majoritate a spermatozoizilor devin disponibili pentru a fi

inoculai altor femele. Experienele ntreprinse au demonstrat faptul c numrul de
spermatozoizi necesari pentru nsmnarea unei vaci este de 10-12 miliioane,
numr care poate fi redus pn la 5 milioane, fr a fi diminuat nivelul ratei
fecundaiei. La ovine, numrul de spermatozoizi mobili pe doz poate fi redus
pn la 150- 200 de milioane, la suine, la 2-5 miliarde, iar la cabaline, pn la o,51,0 miliarde.
Principiile care stau la baza dilurii spermei sunt:
- se dilueaz numai sperma corespunztoare calitativ;
- diluantul trebuie s conin substane care s protejeze i s ajute la
activarea i meninerea metabolismului spermatozoizilor;
- materialul seminal diluat trebuie s fie aseptizat prin ncorporarea unui
antibiotic cu spectru larg de aciune.
Pentru ndeplinirea condiiilor create prin diluarea spermei, mediul de
diluie trebuie s aib mai multe nsuiri:
- s conin substane care s favorizeze metabolismul, vitalitatea i
capacitatea fecundant a spermatozoizilor (fructoz, glucoz,
galactoz);
- s conin substane care s menin un timp mai ndelungat pH-ul
spermei n limite fiziologice, numite substane tampon, cum ar fi:
citraii, fosfaii, tartraii i sulfaii de sodiu i potasiu (necesare mai ales
pentru diluia spermei cu concentraie mare n spermatozoizi);
- s fie izotonic, izotermic i s aib acelai pH cu sperma;
- s conin substane coloidale care s protejeze spermatozoizii
(glbenu de ou, lipoproteine, lecitin etc);
- s aib ncorporate antibiotice cu efect bacteriostatic sau bactericid
ntr-un spectru ct mai larg;
- s posede nsuiri antioxidante;
- s fie ieftin i uor de preparat;
- s se pstreze, nealterat, un timp ct mai ndelungat.
Diluanii se pot clasifica dup compoziie, scop i specia la care se
folosesc.
Dup compoziie diluanii se mpart n salini, pe baz de lapte i sintetici.
Diluanii salini constau n soluii de concentraii diverse n sruri de
fosfai, citrai, sulfai, tartrai de sodiu i potasiu, care au rol de substane tampon.
Soluiile mai conin zaharuri (glucoz, fructoz, zaharoz etc) i glbenu de ou,
difereniat cu specia la care se folosesc.
Diluanii pe baz de lapte conin: lapte proaspt de vac ecremat sau lapte
praf degresat, cu sau fr adaos de glbenu de ou.
Diluanii pe baz de medii sintetice sunt, n prezent, cei mai rspndii,
sunt produi de firme specializate, avnd n compoziia lor diferite combinaii de
sruri, lapte, cu adaosuri de vitamine, hormoni, extracte tisulare etc, funcie de
unitatea productoare, pentru fiecare specie n parte, purtnd diferite denumiri
comerciale: Laiciphos, Spermasol, Diploten, Triladyl, Seminan etc.
Dup scopul lor diluanii se folosesc pentru sperma conservat prin
refrigerare, congelare sau la temperatura camerei.
Dup specia de animale la care se folosesc, diluanii se pot prepara dup
aceleai formule, pentru o singur specie sau pentru mai multe specii (taur,
berbec, ap).

25

1.5.3. Tehnica preparrii diluanilor

Prepararea diluanilor difer n funcie de compoziia acestora. Diluanii
salini cu adaos de glbenu de ou se pregtesc n doi timpi.
Timpul 1. Se prepar soluia salin prin adugarea n apa bidistilat a
cantitilor de sruri prevzute prin receptura diluantului respectiv. Apa bidistilat
se obine n distilatoare de sticl pentru a nu duna viabilitii spermatozoizilor.
Distilatoarele metalice modific pH-ul apei distilate prin ionii de metal ce se
formeaz. Soluia salin se prepar zilnic,n funcie de necesar sau pentru mai
multe zile, cand se pstreaz n sticle sterilizate la ntuneric, la temperatura de
refrigerare. Diluantul salin se prepar la nivelul unor laboratoare zonale sau
naionale de unde este expediat unitilor specializate n flacoane nchise ermetic
care se pstreaz la frigider o perioad de circa 6 luni.
Timpul 2. nainte de folosirea diluantului se adaug glbenuul de ou n
cantitile prevzute n formulele de preparare a acestora. Se folosesc ou de gin
proaspete (1-3 zile) provenite de la un efectiv sntos. Oule se spal cu ap
cald, se dezinfecteaz coaja cu alcool sanitar, se sparg i se separ glbenuul de
albu, albuul netrebuind s ajung n diluant deoarece are o reacie acid i
modific pH-ul mediului.
Dup obinerea cantitii necesare de glbenu de ou se omogenizeaz cu o
baghet din sticl sau cu un agitator mecanic timp de 5-10 minute, apoi,
glbenuul bine omogenizat, se adaug peste soluia salin, sub o omogenizare
continu, fr a se forma spum. Omogenizarea face globulele de grsme din
glbenu s fie dispersate, evitndu-se aglomerarea acestora, ceea ce ar mpiedeca
micarea spematozoizilor.
Pentru aseptizarea materialului seminal diluat, se adaug n diluant
antibiotice cu spectru de aciune ct mai larg, conform reetelor de preparare.
n ara noastr, cele mai folosite antibiotice sunt: penicilina, streptomicina
n cantiti de 500 U.I. i respectiv 250-500 g/ml diluant. Se folosesc cele mai
eficiente antibiotice conform antibiogramei. Prepararea diluantului cu glbenu de
ou i antibiotice se face, de regul, cu 1-2 ore naintea folosirii, timp necesar ca
srurile de Na sau K s clarifice sau s fac transparente particulele de globuline
din glbenu.
Substanele care se introduc n diluant trebuie s fie proaspete, nealterate,
chimic pure i s nu conin impuriti toxice pentru spermatozoizi. Sticlria i
ustensilele folosite la prepararea diluantului s fie sterilizate.
Diluanii pe baz de lapte se prepar astfel: laptele de vac proaspt,
integral sau ecremat, se fierbe sau se pasteurizeaz la 90-92oC, se rcete i
filtreaz printr-o hrtie de filtru, steril. Cnd temperatura laptelui ajunge la 20oC
se adaug proporia de glbenu de ou, stabilit prin receptur, dup tehnica
descris.
Laptele praf degresat se prepar cu ap bidistilat n raport de 1/9, apoi se
pasteurizeaz, se filtreaz, se rcete i se amestec cu cantitatea necesar de
glbenu de ou (5-10%).
Diluanii sintetici sunt cei mai ntrebuinai n prezent. Ei sunt produi de
diferite uniti specializate i sunt livrai sub form de pulberi sau granule. Sunt
nsoii de instruciunile de folosire. n prezent, aceste medii de diluie se prepar
pe scar industrial, ceea ce conduce la uniformizarea i simplificarea tehnicilor
de lucru, obinerea unor rezultate bune, n condiiile scderii preului de cost.

26

1.5.4. Tehnica diluiei

Diluia propriu-zis difer cu specia i cu modul de conservare a spermei.

1.5.4.1. Diluarea spermei de taur

Pentru conservarea spermei prin refrigerare se folosesc medii pe baz
de soluii saline cu adaos de glbenu de ou, glucoz, sau diluanii pe baz de
lapte. Cel mai frecvent sunt ntrebuinai diluanii sintetici, livrai de diverse firme,
cu diferite denumiri, funcie de ara i unitatea productoare.
Diluantul sintetic este un mediu uscat, pe baz de lapte ecremat, echilibrat
i sterilizat, la care se adaug n final 10% glbenu de ou i 7% glicerin cu
densitate 1,25 (de exemplu Laiciphos). Nivelul relativ sczut de glbenu de ou
faciliteaz examinarea microscopic, fr s influeneze negativ fecunditatea.
Indiferent de natura diluantului, se adaug cantitile necesare de
antibiotice (preferabil n funcie de antibiogram), se pasteurizeaz, se filtreaz i
se rcesc.
Diluarea spermei pentru conservare prin refrigerare se face n dou etape:
- diluia iniial (prediluia), la 37oC, n raport de 1/1 i n condiii de
izotermie;
- diluia final (definitiv), la 18-20oC, tot n condiii de izotermie,
conform raportului final de diluie, calculat n funcie de concentraia
spermei brute i a celei diluate n spermatozoizi/mm3 sau pe ml.
Formula de calcul este:
G.D.F. =

C1
C2

xMx V

n care:

- G.D.F = gradul de diluie final;

- C1 = concentraia spermei brute n spermatozoizi/ml;
- C2 = numrul de spermatozoizi vii pe care dorim s-i avem n
doz;
- M = mobilitatea spermatozoizilor dup decongelare, exprimat n
sistemul zecimal;
- V = volumul dozei de sperm exprimat n ml.
Exemplu: C1=109; C2=12x106; M=0,6; V=1,0ml.
G.F.D.=109x0,6x1,0/12x106=50, sau cnd V=0,5ml rezult
G.DF.=109x0,6x0,5/12x106=25.
n aceast situaie, la un volum de sperm se adaug 49 volume de diluant
n primul caz, i respectiv 24 de volume, n cazul al doilea. Precizm c
mobilitatea spermatozoizilor dup deconservare se calculeaz pentru fiecare taur
n parte pe baza mediei mai multor determinri.
n acest caz, raportul de diluie final va fi: R.D.F=1/49; R.D.F=1/24.
Pentru calcularea numrului de doze pe care le putem obine dintr-un ejaculat, se
nmulete volumul ejaculatului cu gradul de diluie final obinut i se mparte la
volumul dozei.
27

n exemplul dat, dac volumul ejaculatului este de 5 ml, numrul de doze

va fi; Nr. doze=50x5/1=250; sau N=5x25/0,5=250
Gradul de diluie pentru sperma de taur, oscileaz n medie ntre 20 i 40,
astfel nct ntr-o doz de nsmnare s se asigure 10-12 milioane de
spermatozoizi mobili. Mobilitatea minim admis pentru sperma de taur
conservat prin refrigerare este de 60% sau de 0,6, determinat nainte de a fi
nsmnat. Dup diluare, se apreciaz mobilitatea spermatozoizilor i dac
aceasta nu a sczut cu mai mult de 10% fa de mobilitatea spermei brute, diluia
se consider c a fost efectuat n condiii bune i se trece la repartizarea n doze a
spermei. Repartizarea spermei n doze se face cu ajutorul unor seringi
semiautomate, n fiole de sticl care se nchid apoi la flacr oxiacetilenic, sau n
fiole care se nchid cu dop de plut sau din material plastic.
Pentru conservarea spermei de taur prin congelare se folosesc dou
medii de diluie care se deosebesc numai prin aceea c unul conine, n plus,
glicerin, substan crioprotectoare.
{i n acest caz se pot folosi diluani salini, pe baz de lapte sau sintetici (de
exemplu Laiciphos, Tryladil, Seminan etc.) care se prepar dup tehnicile
descrise. Cantitatea de diluant necesar se separ n dou pri egale (A i B).
Diluantul B conine n plus fa de diluantul A 14-16% glicerin chimic pur,
astfel nct concentraia de glicerin, n final, s fie de 7-8%.
Diluantul A se mparte n dou pri inegale: o parte (A1) mai redus (510%) se pstreaz la termostat reglat la 37oC, iar cealalt parte, (A2) se las la
temperatura camerei. Diluantul B se pstreaz la frigider sau ntr-o vitrin
frigorific la 2-4oC.
Diluia comport 3 etape: iniial, intermediar i final.
Diluia iniial se face la temperatura de 37oC, n condiii de izotermie, n
raport de 1/1, cu diluantul A1, direct n paharul sau eprubeta colectoare. Dup
efectuarea acestei prime diluii, paharul sau eprubeta cu sperma astfel diluat se
scot de la termostat i se aaz alturi de fraciunea A2 a diluantului, la
temperatura laboratorului (18-20oC).
Diluia intermediar se face dup circa 20-30 de minute, cnd cele dou
componente ating aceeai temperatur, la temperatura laboratorului, adugndu-se
diluantul A2 ntr-un raport care s asigure jumtate din cantitatea total de diluant
calculat prin raportul final de diluie.
Dup diluia intermediar, paharul cu sperma se introduce ntr-o vitrin
frigorific sau la frigider, alturi de fraciunea B a diluantului.
Diluia final se face la temperatura de 2-4oC, tot n condiii de izotermie,
dup 50-60 de minute de la efectuarea diluiei intermediare. ntruct glicerina este
o substan toxic pentru spermatozoizi, diluantul glicerinat se adaug treptat,
pictur cu pictur, sub o permanent agitare a recipien-tului cu sperm (foto 12).
Congelarea spermei sub form de granule se bazeaz pe rcirea rapid a
acesteia, n alveolele unei plci de zpad carbonic rezultnd pastile cu un
volum de 0,1 ml.
Dup recoltarea spermei se examineaz nsuirile ejaculatului, n funcie
de care se determin gradul final de diluie i volumul total al spermei diluate. n
acest interval de timp, sperma se dilueaz n proporie de 1/1 la temperatura de
37oC, n condiii de izotermie ntre diluant i sperm.
Cel mai frecvent se folosete diluant pe baz de lactoz: lactoz 11% n
ap bidistilat - 75,3 ml, glbenu de ou - 20 ml, glicerin anhidr - 4,7 ml. Dup
15 minute de la diluia iniial, se adaug volumul total de diluant glicerinat, cu
ajutorul unui dozator automat, cuplat la un omogenizator. Adugarea se face la
temperatura laboratorului, raportul de diluie fiind foarte strns (1/2, 1/4), datorat
28

volumului redus al granulei i mobilitii mai reduse a spermatozoizilor,

comparativ cu alte metode de congelare.
Compoziia diluanilor utilizai n aciunea de nsmnri artificiale este
foarte diferit, ns se poate afirma c cea mai mare parte, aparine diluanilor
salini, pe baz de lapte sau sintetici.
Fiecare ar i unitate specializat n practica nsmnrilor artificiale au
reete specifice pentru prepararea diluanilor. Din multitudinea de reete de
preparare a diluanilor redm pe cele mai simple i mai frecvent folosite:
13,6 g
1) Sulfat de sodiu anhidru (Na2SO4)
Glucoz anhidr
12,0 g
Pepton
5,0 g
Ap distilat (nclzit)
1000 ml
2) Citrat de sodiu (Na3C6H5O5)
Ap bidistilat
Glbenu de ou

2,9 g
100 ml
20%

3) Diluant pe baz de lapte praf

ntr-un litru de ap bidistilat se adaug 100 g lapte degresat apoi se
fierbe 10 minute ntr-un vas conic. Dup rcire se completeaz apa
pierdut prin evaporare, apoi se adaug antibioticele menionate la
reeta 10.
n prezent, pentru diluarea spermei de taur se folosesc diluani sintetici,
preparai de diverse firme i care ncorporeaz toate substanele chimice necesare,
n laborator urmnd s se adauge, eventual, glbenuul de ou proaspt preparat i
apa bidistilat. Funcie de firma care-i comercializeaz, diluanii poart diverse
denumiri: Laiciphos, Spermasol, Dilapten, Triladyl, Seminan etc.
1.5.4.2. Diluarea spermei de berbec I ap
Un mare numr de nsmnri artificiale la ovine, att pe plan mondial ct
i n ara noastr se realizeaz cu sperm nediluat, imediat dup recoltare i
examinare. Aceast metod asigur o fertilitate ridicat, ns necesit prezena
masculilor n aceeai unitate cu femelele care urmeaz a fi nsmnate.
Proprietile biochimice ale spermei de berbec i ap impun anumite precauii n
folosirea spermei pentru nsmnrile artificiale. Astfel, plasma seminal nu
creeaz un mediu optim pentru supravieuirea spermatozoizilor in vivo.
Cercetrile au evideniat, spre exemplu, la ap, atunci cnd sperma a fost recoltat
din epididim ( care nu a venit n contact cu secreiile glandelor anexe), a fost
diluat i congelat, c proporia de spermatozoizi vii i mobilitatea lor dup
decongelare sunt mult superioare celor din sperma ejaculat, ceea ce indic faptul
c venirea n contact a spermatozoizilor cu secreiile glandelor anexe reduce
supravieuirea in vitro a acestora. La berbec, adugarea plasmei seminale la
spermatozoizii provenii din epididim, stimuleaz mobilitatea acestora timp de 3-7
ore, apoi mobilitatea se reduce brusc, comparativ cu spermatozoizii care nu vin n
contact cu plasma seminal i care i menin mobilitatea peste 22 de ore. La ap,
plasma seminal pare nefast meninerii calitii spermatozoizilor, pe durata
stocrii ndelungate n azot lichid (G. Baril i colab., 1993).
29

La aceste dou specii (ovine, caprine), glandele bulbouretrale au

capacitatea de a secreta n cantiti nsemnate o enzim numit fosfolipaza A, sau
a coagulrii glbenuului de ou. Aceast enzim catalizeaz hidroliza lecitinelor
din glbenuul oului n acizi grai i lizolecitin. Lizolecitina, n concentraie mai
ridicat, este toxic pentru supravieuirea in vitro a spermatozoizilor. Aceast
particularitate de specie mpiedic folosirea unei cantiti importante de glbenu
de ou sau a unui mediu cu coninut ridicat n lecitine pentru diluarea spermei.
Totui, n cazul aplicrii nsmnrilor artificiale la ovine, pe scar mai larg,
diluia spermei este necesar. Compoziia diluanilor i tehnica dilurii spermei de
berbec i ap difer n funcie de modul n care se face conservarea: sub form
lichid (refrigerare) sau solid (congelare).
Diluia spermei pentru conservare sub form lichid presupune
parcurgerea a dou etape principale: prepararea diluantului i diluia propriu-zis.
Diluantul se prepar pe baz de lapte praf, cu o zi naintea ntrebuinrii
(Baril G i colab.,1993).
Se iau 100 ml de ap bidistilat, sterilizat i nclzit la 60oC, n care se
dizolv 0,33 g de sulfamide. Se rcete amestecul pn la 20-25oC, apoi, n acest
amestec se dizolv 11,1 g lapte praf de vac, ecremat. Se fierbe ntr-o baie-marie,
timp de 15 minute, se rcete la temperatura laboratorului, se adaug 0,11 g
streptomicin i 100000 U.I. penicilin. Diluantul astfel preparat se pstreaz la 24oC, timp de maxim 2-3 zile. n practica nsmnrilor artificiale din ara noastr
i din lume se folosesc multe reete de preparare a diluanilor, cel mai frecvent
ntrebuinai fiind diluanii sintetici, produi de diverse firme specializate.
Dup recoltarea ejaculatului, acesta se examineaz cantitativ i calitativ,
apreciindu-se cel puin mobilitatea i concentraia spermatozoizilor, pe baza
crora se determin gradul final de diluie (raportul final de diluie - RDF) funcie
de concentraia iniial i dup diluie a spermei n spermatozoizi/ml.
Diluarea spermei se face n dou etape: iniial i final.
Diluia iniial se face imediat dup recoltare, la temperatura de 32oC, n
raport de 1/1, n condiii de izotermie, direct n paharul colector meninut ntr-un
termostat la 32oC. Paharul colector mpreun cu sperma prediluat, se scoate de la
termostat i se menine 10-15 minute la temperatura laboratorului, alturi de restul
diluantului.
Diluia final se face la temperatura ambiant, n condiii de izotermie,
adugndu-se restul cantitii de diluant, calculat prin raportul final de diluie.
n cazul n care raportul de diluie este mai larg (1/5-1/7), pentru mrirea
vscozitii materialului seminal, se poate aduga la compoziia diluantului 2-3%
gelatin sau polivinil pirolidon etc.
Diluarea spermei pentru conservare sub form solid (congelare)
Pentru congelare se folosesc numai ejaculate cu mobilitate de cel puin 0,8.
Aprecierea volumului i concentraiei spermei permite calculul gradului diluiei
finale. Diluantul se prepar cu o zi nainte sau n aceeai zi, puin timp nainte de
folosire. Se folosesc doi diluani. Primul poate fi: 100 ml ap bidistilat, 10,3 g
lactoz, 20% glbenu de ou. Cel de-al doilea conine diluantul 1 la care se adaug
4,0 g de lapte praf ecremat pentru fiecare 100 ml, astfel nct, n final presiunea
osmotic s ating 450 miliosmoli. Se adaug la acest diluant glicerol, astfel nct,
n sperma diluat, proporia de glicerol s fie de 4%.
Tehnica diluiei include dou etape principale:
- diluia iniial (prediluia) care se face cu diluantul 1 la 32oC, n
condiii de izotermie, direct n paharul colector, meninut la termostat.
Imediat dup prediluie paharul cu sperma respectiv se menine la

30

temperatura laboratorului timp de 10-15 minute apoi se introduce ntrun frigider (2-4oC) unde este meninut timp de 2,0-2,5 ore;
- diluia final se face la temperatura de 2-4oC, n condiii de izotermie,
adugndu-se cantitatea necesar din diluantul 2 (conform R.D.F)
astfel nct n final, concentraia spermei n glicerol s fie de 4%.
Exemple de diluani folosii pentru sperma de berbec:
1) Ap bidistilat
Glucoz anhidr
Citrat de sodiu
Streptomicin
Penicilin
Glbenu de ou

100 ml
0,8 g
2,8 g
50000 mcg
50000 U.I.
20%

2) Ap bidistilat
80 ml
Glicocol
0,34 g
Citrat trisodic (cu 2 moli de ap)
2,71 g
Glbenu de ou
20%
Cnd se lucreaz cu un raport de diluie mai larg (1/5-1/7) n vederea
mririi vscozitii spermei se mai poate aduga, de exemplu, 25%
polivinil pirolidon.

1.5.4.3. Diluarea spermei de vier

Pentru sperma de vier, cele mai bune rezultate s-au dovedit a fi date de
mediile de diluie sintetice. Mediul de diluie trebuie s conin neelectrolii
(zaharuri), substane ce conin i o surs exogen de energie. Pentru meninerea
pH-ului n limite normale, n mediul de diluie sunt ncorporai anioni polivaleni
(citratul de sodiu), glbenu de ou sau lecitin. Pentru a proteja spermatozoizii de
efectul nefavorabil al ocului termic n mediul de diluie se introduc substane
chelatoare (complexon III). Bune rezultate se obin cu medii pe baz de glucozcitrat-bicarbonat-complexon III - cu adaos de antibiotice cu rol bacteriostatic sau
bactericid.
O alt grup important o formeaz diluanii pe baz de lapte de vac,
proaspt sau preparat din lapte praf, sau din lapte+soluie glucoz 6%+glbenu
de ou 3% i antibiotice (Feredean i colab., 1964). Ali autori recomand ca
mediul de diluie pentru sperma de vier, laptele integral cu adaos de soluie de
glucoz 3,5% i 2% glbenu de ou, iar cercettori din China au obinut rezultate
satisfctoare prin folosirea unui mediu alctuit din pri egale de lapte degresat,
soluie de citrat de sodiu 2,9%, soluie de glucoz 5%, la care se adaug 10-20%
glbenu de ou i antibiotice.
De reinut c laptele poate constitui singur sau n amestec cu alte
substane, un bun diluant pentru sperma de vier, fiind un mediu biologic complex,
cu coninut favorabil de lipide (lecitin, cefalin), proteine (cazein, lactalbumin,
lactoglobulin) i aminoacizi eseniali (metionin, treonin, lizin, triptofan),
glucide (lactoza), substane minerale, acid citric, enzime i vitamine. Acest diluant
este foarte uor de preparat, laptele trebuind s provin de la vaci sntoase, s fie
proaspt i s se nclzeasc nainte de folosire, la 85-90oC, timp de 10-15 minute.
Pentru congelarea spermei de vier, mediile de diluie trebuie s includ
glucoz, citrat de sodiu cu tampon format din soluie tricin- tris, la care se adaug
31

glbenu de ou, glicerin 3-4% i antibiotice (Crabo i colab., 1971; Nouk,

B.A.,1971).
Mediile sintetice produse de uniti specializate i care se prezint sub
form de pulbere, ambalat n pungi din material plastic, prevzute i cu
instruciuni de folosire, sunt cele mai folosite n prezent n practica nsmnrilor
artificiale la suine. Mediile sintetice se prepar numai din substane chimic pure,
iar apa n care se dizolv aceste substane trebuie s fie bidistilat, fiart n
prealabil.
Diluanii pe baz de lapte se prepar numai nainte de recoltarea spermei,
conform celor menionate anterior.
Tehnica dilurii spermei este ct se poate de simpl. Diluia trebuie s se
fac ct mai repede de la recoltare, la temperatura de 33oC, prin adugarea treptat
a diluantului peste sperm, n condiii de izotermie, ntr-o baie de ap a crei
temperatur este reglat la acest nivel.
Gradul de diluie se stabilete pe baza concentraiei, mobilitii
spermatozoizilor i a numrului de spermatozoizi mobili pe doza de nsmnare
(3-5 miliarde), folosindu-se formula:
Vt =

C x M x10
n

9
1,

n care:

Vt=volumul total al spermei diluate;

C= concentraia spermei/ml;
M= mobilitatea spermatozoizilor;
n= numrul de spermatozoizi de dorit ntr-o doz de sperm.
Dup efectuarea diluiei iniiale n raport de 1/1, paharul cu sperm se
menine 20-30 minute la temperatura laboratorului, apoi se adaug treptat, n
condiii de izotermie, restul cantitii de diluant calculat prin gradul final de
diluie, apoi sperma se repartizeaz n doze, constituite din recipiente din material
plastic, avnd o capacitate de 100 ml, de form oval sau cilindric.
Cteva exemple de formule de diluani pentru sperma de vier:
1) Ap bidistilat
Glucoz
Bicarbonat de Na
Glbenu de ou
Streptomicin
Penicilin

1000 ml
30,0 g
1,0 g
300 ml
0,5 g
500000 U.I.

2) Ap bidistilat
Glucoz
Bicarbonat de Na
Glbenu de ou
Streptomicin
Penicilin

1000 ml
40,0 g
2,0 g
250 ml
0,4 g
240000 U.I.

3) Ap bidistilat
Citrat de Na
Glbenu de ou
Penicilin
Streptomicin

1000 ml
30,0 g
200 ml
500000 U.I.
0,5 g
32

1.5.4.4. Diluarea spermei de armsar

Sperma de armsar, dup recoltare, oricare ar fi temperatura la care se
pstreaz, nu conine nici un spermatozoid viu dup circa o or. Deci
nsmnarea cu sperm brut trebuie s se fac n primele 5 minute de la
recoltare. Dac nu este posibil, sperma trebuie s fie diluat n primele dou
minute dup recoltare, rolul diluantului fiind acela de a neutraliza efectele nefaste
ale plasmei seminale (E. Palmer i colab., 1984).
Pentru diluarea spermei de armsar se folosesc mai multe formule de
medii de diluie: pe baz de tartrat de sodiu i potasiu, glucoz, pepton, glbenu
de ou i antibiotice:
Cel mai simplu i ieftin diluant l constituie laptele semiecremat, sterilizat,
la care se adaug penicilin (50000 U.I./l) i gentamicin(5 mg/l).
Indiferent de mediul de diluie folosit, la 100 ml se adaug 500000
U.I.penicilin i 0,5 g streptomicin.
Sperma se recolteaz cu ajutorul vaginului artificial la interval de 48 de
ore, se filtreaz, apoi se dilueaz imediat la 32oC n condiii de izotermie, astfel
nct dup diluie s se asigure 20 milioane spermatozoizi/ml.
1.5.4.5. Diluarea spermei de psri
Dozele de sperm pentru nsmnarea artificial a psrilor trebuie s
conin 100-120 milioane de spermatozoizi mobili, raportul de diluie cel mai
frecvent fiind de 1/2-1/3, fr a depi 1/5. n cazul practicrii nsmnrilor
artificiale n unitile cu flux tehnologic industrial, nu se recomand diluarea
spermei, dac sperma brut se nsmneaz ntr-un interval maxim de 30-45 de
minute dup recoltare. n cazul n care acest interval este depit, devine util i
necesar diluarea spermei i conservarea acesteia. ntruct, spermatozoizii i
pierd repede capacitatea fecundant, diluia spermei trebuie s se fac pe msur
ce se recolteaz. Indiferent de specie, diluia spermei nu permite nsmnarea
unui numr prea mare de femele dintr-un ejaculat ntruct, factorul cel mai
important este numrul de spermatozoizi pe doza de nsmnare. De aceea, apare
necesitatea creterii volumului dozei de sperm diluat n raport invers cu nivelul
de diluie, pentru a menine constant numrul de spermatozoizi inseminai.
Diluarea spermei la psri se face cu diluani care s prezerve nu numai
mobilitatea spermatozoizilor ci i fecundana acestora. Pentru psri, un diluant
bun este acela care diminu de o manier reversibil mobilitatea spermatozoizilor,
tamponeaz tendina de acidifiere a mediului consecutiv metabolismului acestora,
chiar la un nivel sczut de temperatur i conine nutrieni esenialmente
energetici.
Cnd sperma diluat nu se congeleaz, diluanii pot fi constituii din
simple soluii tampon. Aceste soluii sunt alctuite din ap bidistilat la care se
adaug fosfai de sodiu i potasiu (65 g/l) pentru a asigura o presiune osmotic de
380-400 mosm/l.
Formulele de diluani mai cunoscute sunt cele menionate de Lake i
colab.(1981) sau Sexton (1977), care au aceleai condiii de osmolaritate i conin
unul sau mai multe sisteme tampon (citrat, fosfat, acetat, BES sau TES) i se
caracterizeaz prin concentraii precise n anumii electrolii (Na+, K+, Mg++) i
chelatani (aminoacizi de tip glicin sau glutamat). Aceti diluani mai conin
glucoz sau fructoz. Gradul de dilutie este cuprins intre 1/2 i 1/3.
33

1.6. Conservarea spermei

n prezent, extinderea nsmnrilor artificiale este condiionat ntr-o
proporie nsemnat de conservarea spermei. A conserva spermatozoizii animali
nseamn a conserva celule nu numai n stare vie ci i funcional. De aceea
cercettorii au cutat s pun la punct metode care s fie ct mai adaptate
fiziologic spermatozoidului, n sensul c acesta s-i reduc metabolismul fr a fi
afectat capacitatea fecundant.
Tehnicile de conservare a spermei se pot clasifica n trei grupe:
a).- conservarea spermei la temperatura ambiant (18-20oC);
b).- conservarea spermei la temperatura de refrigerare (2-4oC);
c).- conservarea spermei la temperatura de congelare (-79;-196oC).
a). Conservarea spermei la temperatura ambiant (18-20oC)
n acest caz, conservarea se bazeaz pe aciunea inhibitoare a substanelor
chimice incluse n diluant i care pot fi uor eliminate pentru a reanima
spermatozoizii. n acest scop se folosete acidul carbonic, provenit din barbotarea
bioxidului de carbon n masa spermatic cu apa (CO2+H2O=H2CO3).
Spermatozoizii au un metabolism ncetinit att timp ct concentraia n bioxid de
carbon se menine la saturaie. Cnd bioxidul de carbon este eliminat,
spermatozoizii i recapt micarea i capacitatea lor funcional.
Rezultatele obinute prin aceasta tehnica sunt nesatisfctoare pentru
conservarea spermei de taur, berbec i vier. Tehnica nu permite meninerea puterii
fecundante a spermatozoizilor dect pentru un interval de timp de circa 3-4 zile.
Este necesar ca fiecare doz s fie pus ntr-un ambalaj etan i separat (fiol
saturat cu gaz carbonic).
n deceniul apte s-a propus ca metod de conservare a spermei la
temperatura camerei, prin folosirea laptelui de nuc de cocos. Experienele au
artat c acest mediu permite supravieuirea i prelungirea puterii fecundante a
celulelor sexuale mascule de taur timp de circa 3-4 zile la temperatura de 15-20oC,
metoda fiind depit tehnologic de conservarea spermei prin refrigerare i
congelare. Sperma este diluat normal ntr-un mediu cu lapte de cocos i
repartizat n tuburi pstrate la temperatura de 15-20oC.
b). Conservarea spermei prin refrigerare (2-4oC)
Aceast tehnic a fost cea mai folosit pn n deceniul opt pentru
conservarea spermei la toate speciile i se mai folosete n prezent pentru
conservarea spermei de vier, armsar i psri cu rezultate mulumitoare.
Mobilitatea spermatozoizilor i activitatea lor metabolic descresc
progresiv pe msur ce temperatura mediului n care se gsesc scade. La un nivel
de temperatur care oscileaz ntre 2oCi 4oC, ntr-un mediu de diluie adecvat,
mobilitatea aproape a ncetat. Dac se nclzete mediul, micarea
spermatozoizilor reapare, sperma regsindu-i activitatea i puterea de fecundaie.
n general, pentru conservarea la acest nivel de temperatur, se folosesc diluani
salini pe baz de citrat, tartrat de Na i K sau de lapte ecremat, sau cel mai
eficient, diluani sintetici n asociaie cu glbenuul de ou, a crei principal
funcie este de a proteja spermatozoizii mpotriva ocului a frigore.
La ap i armsar se evit includerea n diluant a glbenuului de ou care
este nefavorabil pentru supravieuirea spermatozoizilor.
Pe parcursul conservrii, la temperatura de refrigerare, spermatozoidul
mbtrnete progresiv, mbtrnire care se manifest printr-o reducere a
capacitii fecundante. Astfel, dac se consider capacitatea fecundant c este
100 n primele 24 de ore de conservare, se reduce la circa 80 n a doua zi, la 65 n
a treia zi i la 50 n a patra zi (Parez M.,1969). n acest caz, centrele de
34

reproducie sunt obligate s renoiasc stocul de sperm la 2-3 zile pentru fiecare
reproductor.
n sperma conservat prin refrigerare, meninerea i prelungirea mobilitii
spermatozoizilor se datorete:
- mediului de diluie, care conine substane nutritive i protectoare;
- reducerii metabolismului spermatozoizilor, datorit scderii
temperaturii ntre 2oC i 4oC.
Conservarea spermei prin refrigerare prezint, totui, unele avantaje:
- permite difuzarea materialului seminal la punctele de nsmnri
artificiale situate la o oarecare distan fa de unitatea productoare;
- se pot constitui rezerve de sperm pentru dou-trei zile care pot fi
expediate la solicitarea beneficiarilor, n caz de necesitate;
- contribuie la intensivizarea progresului genetic, prin folosirea pe o
scar mai larg a reproductorilor valoroi.
Conservarea spermei prin refrigerare prezint i urmtoarele principale
dezavantaje:
- sperma este conservat pe o perioad limitat de timp (dou-trei zile);
- dificulti n asigurarea temperaturii sczute pe timpul transportului i
pe durata conservrii;
- sunt pierderi apreciabile de material seminal, prin nlturarea dozelor
care nu au fost inoculate n intervalul de timp de dou-trei zile;
- cheltuielile mari cu transportul dozelor, care trebuie s se fac n
permanen la un interval de dou-trei zile, pentru toate punctele de
nsmnri artificiale deservite de centrul respectiv;
- consum crescut de energie pentru meninerea unei temperaturi sczute,
constante (2-4oC).
c).Conservarea spermei prin congelare
La temperaturi sub -15oC, modificrile biologice pe care le sufer celulele
sexuale mascule n cursul timpului sunt abolite. Conservarea spermatozoizilor se
face cu scopul de a opri metabolismul lor de o manier reversibil, ceea ce
permite conservarea acestora pe o durat de timp practic indefinit.
nsmnarea femelelor cu sperma conservat prin congelare reprezint un
procedeu cu maxim eficacitate. Aceast tehnic se bazeaz pe meninerea sub
form solid a spermei, spermatozoizii fiind adui ntr-o stare de via extrem de
ncetinit, nivel la care reaciile chimice sunt aproape inexistente, motiv pentru
care conservarea mobilitii i capacitii fecundante a spermatozoizilor se poate
face n condiii optime, timp de zeci sau chiar sute de ani.
Spermatozoizii i recapt mobilitatea i capacitatea fecundant n
momentul revenirii la temperatura corporal.
Agenii criogeni sunt reprezentai de zpada carbonic ce asigur o
temperatur medie sczut (-79oC), de aerul lichid (-183oC) i azotul lichid
(-196oC). Cel mai rspndit agent criogen n congelarea spermei este azotul lichid
Pentru congelarea spermei la temperaturi foarte joase s-a mai folosit i
aerul lichid, un amestec de oxigen i azot lichid, care asigur o temperatur de 183oC, care, n contact cu impuriti organice, prezint pericol de explozie, motiv
pentru care n prezent nu se mai folosete.
Pstrarea azotului lichid la unitile de producere a materialului seminal, la
unitile beneficiare ct i pe timpul transportului se realizeaz n recipiente
speciale numite containere. Dup modul de folosire sau destinaie, containerele
pot fi clasificate astfel:
- containere de punct, cu capacitatea de 5-35 litri;
- containere de stocaj i transport, cu capacitatea de 35-50 de litri;
35

containere de depozit (stocaj), cu capaciti cuprinse ntre 100 i 750

de litri.
Containerele sunt confecionate din material inoxidabil sau dintr-un aliaj
special pe baz de aluminiu. La marea majoritate a containerelor, construcia se
realizeaz dup aceleai principii tehnice: vas n vas cu perei multipli izolatori
n vid (fig 3).
Partea din dop care
ptrunde pe gura sau gtul
containerului,
este
confecionat din material
plastic rigid, care nu optureaz
ieirea vaporilor de azot,
vapori ce rezult din fierberea
lent, dar continu a azotului
lichid.
Containerele cu care
sunt dotate punctele de
nsmnri artificiale sunt de
capacitate mic, numrul de
doze ce pot fi depozitate
depinznd de forma de
ambalare
a
materialului
seminal (fiol, paiet, granul).
De regul, aceste, containere
sunt prevzute cu 6 canistre
Fig. 3 Schema interioar a containerului de
cilindrice confecionate din
punct (dup Gh. Liciu i O. Roca, 1998)
1 dop container; 2 - an prin care trece tija tabl inoxidabil, aliaj de
canistrei; 3 capac; 4 loj; 5 cma aluminiu sau din material
Pentru
uurina
interioar; 6 cma extern; 7 izolaie i plastic.
vacuum; canistre; 9 tij; 10 limitator manipulrii, canistrele sunt
prevzute cu o tij a crei
canistre.
extremitate sub form de
mner, se sprijin n locauri speciale practicate la gura containerului. Autonomia
containerelor este dat de timpul scurs din momentul efecturii plinului i pn n
momentul cnd nivelul azotului lichid (cantitatea msurat n container) nu mai
poate asigura conservarea n condiii bune a materialului seminal depozitat.
Autonomia containerului este condiionat de tipul constructiv, frecvena
manipulrilor, mod de exploatare i ntreinere etc i oscileaz ntre 21 i 180 de
zile. Pentru determinarea ritmului zilnic de evaporare a azotului lichid, periodic se
efectueaz cotarea azotului lichid din container.
Fiecare punct de nsmnri artificiale este dotat cu un container n care
se gsesc dozele de material seminal necesar, repartizat conform planului de
potrivire a perechilor, aprovizionarea cu azot lichid fcndu-se de ctre Unitatile
de Ameliorare si Reproductie in Zootehnie la intervale de timp corespunztoare
gradului de autonomie a containerelor.
Congelarea spermei prezint numeroase avantaje:
- testarea reproductorilor dup descendeni;
- exploatarea intensiv a celor mai valoroi reproductori;
- depozitarea i folosirea spermei pentru un interval mare de timp;
- se asigur n permanen sperma necesar pentru nsmnarea
femelelor, la momentul optim, existnd n acest fel posibilitatea
formrii de linii i familii cu un potenial productiv ridicat;
36

realizarea unor importante economii, prin folosirea raional,

nelimitat n timp, a spermei congelate, comparativ cu sperma
conservat prin refrigerare;
- se poate transporta la puncte de nsmnare situate la distane mari,
fiind nevoie doar de reaprovizionarea periodic cu azot lichid;
- se reduc cheltuielile datorate transportului spermei;
- se reduce preul de cost pe doza de material seminal;
- permite nsmnarea femelelor la pune, n taberele de var i n
zonele greu accesibile mijloacelor de transport;
- favorizeaz schimburile internaionale de sperm.
Primele ncercri de conservare a spermei au fost fcute n anul 1949 de
Parkes, Smith i Polge. Stewart (1951) a nsmnat o vac cu sperma congelat la
-79oC i a obinut un produs (I. Dumitrescu i colab.,1978). n anul 1952, Polge i
L.E.A. Rowson au introdus n mediul de diluie glicerin i au constatat c aceast
substan are rolul de a proteja, la temperaturi foarte sczute, spermatozoizii.
Succesul acestei realizri a fost comunicat de Polge i colab. n 1952, la al II-lea
Congres Internaional de Reproducie de la Copenhaga. Schema congelrii
spermei propus de Polge i colab. n anul 1952, astzi este mult simplificat,
fiind pstrate totui aceleai principii:
- congelarea cu un diluant cu glicerol;
- scderea rapid a temperaturii pn la -196oC;
- meninerea spermei congelate la aceast temperatur (-196oC), pn n
momentul folosirii;
- decongelarea spermei, n vederea inoculrii, se face prin imersiunea
brusc a dozei ntr-o baie la 320C, chiar n momentul ntrebuinrii.
Pn n 1964, metoda congelrii spermei nu a suferit dect mici modificri
cu privire la compoziia diluantului, cronologia diferitelor operaiuni i viteza de
rcire. Erau atunci propuse dou soluii: congelarea n fiole de sticl de 1-2 ml,
congelarea n paiete cu capacitatea de 1,0, 0,5 i 0,25 ml, ultimul tip de ambalaj
fiind propus de R. Cassou. Extrema simplicitate, rapiditate i rezultatele foarte
favorabile oferite de aceast metod au condus la introducerea congelrii spermei
n paiete din material plastic de ctre numeroase ri, fiind adoptat congelarea
spermei n azot lichid la temperatura de -196oC, mai uor de obinut i mai eficace
dect temperatura de -79oC, asigurat de zpada carbonic, folosit pn atunci.
n 1964, comunicrile lui Nagase i Niva au repus n discuie congelarea
spermei bazate pe urmtoarele principii:
- folosirea diluanilor pe baz de glucoz i fructoz, uor glicerolai
(5%);
- congelarea spermei diluat ntr-un raport strns (1/3-1/4);
- congelarea rapid prin simpla depunere de picturi de sperm cu
volum redus (0,1-0,2 ml) pe un bloc de ghea carbonic (-79oC);
- rediluarea n momentul decongelrii ntr-o simpl soluie fiziologic de
diluant.
Rolul substanelor crioprotectoare
Prezena glicerinei n mediul de diluie a spermei, creeaz condiiile
congelrii spermei, fr modificri majore, care s afecteze viabilitatea i
capacitatea fecundant a spermatozoizilor. Prin introducerea glicerinei n diluant,
punctul de congelare a spermei coboar de la 0,53oC la -3oC, iar formarea
cristalelor de ghea are loc la -10oC, comparativ cu 1,7oC n sperma brut. Cnd
ncepe formarea cristalelor de ghea, temperatura tinde ctre punctul real de
congelare, care se menine pn cnd congelarea devine complet. n acel moment
37

se stabilete un echilibru ntre sperm i agentul de rcire. O proporie de circa 7%

glicerin n lichidul de diluie, determin coborrea punctului de congelare pn la
-3oC, iar punctul de formare al cristalelor de ghea la -10oC. Cnd se congeleaz
sperma ntr-un mediu lichid, cristalizarea ncepe n acea parte a lichidului care
este cea mai apropiat de agentul de rcire i se continu n masa lichidului
(Dumitrescu I. i colab., 1978).
Cnd coborrea se face ncet, cristalizarea se desfoar lent, cristalele
care se formeaz sunt mari, ceea ce antreneaz o cretere a concentraiei n sruri
a fraciunii necristalizate i provoac ieirea unei pri din apa intracelular,
diminund astfel formarea gheii intracelulare. n cazul n care coborrea
temperaturii se face ntr-un ritm rapid, cristalele de ghea care se formeaz sunt
mici, rezultnd o substan destul de omogen, n care cristalele sunt constituite
numai din ap, fapt ce determin o concentraie de electrolii crescut, att intract i extracelular. n aceast situaie apa intracelular nu poate iei n cantitate
suficient, cristalele de ghea se formeaz n cantitate crescut intracelular, iar
aceste cristale i vor mri volumul n momentul congelrii i decongelrii, fapt
care conduce la alterarea structurii spermatozoizilor.
La un moment dat, aceast concentraie n sruri este att de ridicat nct
lipoproteinele din structura spermatozoidului devin solubile, iar n timpul
decongelrii permeabilitatea celular se altereaz n aa msur nct
spermatozoidul moare. Acest efect se evideniaz n reducerea cu circa 50% a
proporiei de spermatozoizi vii din sperma decongelat, astfel mobilitatea
spermatozoizilor se reduce de la 70-80% nainte de congelare, la 30-40% dup
decongelare.
n concluzie, compuii hidrofili reprezentai de diveri polialcooli,
(glicerol), ptrund uor n celula seminal prin simpla osmoz, ntrziind formarea
cristalelor de ghea, prin coborrea punctului de congelare. Pe de alt parte,
glicerina limiteaz efectele soluiei, nlocuind o parte din apa intracelular, atras
de creterea presiunii osmotice extracelulare. Ali compui pot avea rol protector
fa de membranele celulare (hidraii de carbon, polivinil, pirolidon etc).
1.6.1. Conservarea spermei de taur
A) Conservarea spermei la temperatura ambiant (laborator)
La temperatura camerei (laboratorului) sperma de taur se poate conserva
pentru o perioad scurt de timp (3-6 ore) i pentru o perioad mai ndelungat (34 zile).
Conservarea de scurt durat se poate face fie sub form brut, fie sub
form diluat. Sperma brut s-a folosit n perioada de nceput a introducerii
nsmnrilor artificiale i const n inocularea imediat dup recoltare a spermei,
fracionat n mai multe doze, n condiii de asepsie. Sperma diluat, pstrat la
temperatura camerei, se poate folosi la nsmnare artificial ntr-un interval de
maxim 6-8 ore.
Conservarea pentru o perioad mai ndelungat a fost consemnat sub
numele de anabioz acid (anabiosis = nviere, revenire la via).
Diluantul preparat, se barboteaz timp de circa 10 minute cu un curent de
CO2, n prealabil purificat prin trecerea succesiv printr-o soluie de bicarbonat de
sodiu 15% i de permanganat de potasiu 3%, pn cnd pH-ul ajunge la 6,2-6,3.
Acidifierea mediului se datoreaz formrii acidului carbonic: CO2+H2=H2CO3. Se
dilueaz sperma care se pstreaz n ambalaje nchise ermetic la temperatura
de18-20oC, timp de 3-4 zile. Datorit dezavantajelor pe care le prezint, aceast
metod de conservare a spermei nu se mai aplic la taur.
38

B) Conservarea spermei de taur prin refrigerare (2-4oC)

Aceast tehnic a fost folosit n perioada anilor 50-70, la taur, cu
rezultate satisfctoare, nivelul sczut de temperatur fiind asigurat fie de zpada
hidric, fie n refrigeratoarele obinuite.
Tennica de conservare a spermei de taur prin refrigerare este suficient de
simpl. Dup efectuarea diluiei finale, cu ajutorul unei seringi semiautomate,
sperma se repartizeaz, cte 1ml, n fiole cu capacitatea de 1,5-2,0 ml care se
nchid la flacr oxiacetilenic. Fiolele se grupeaz pe tije port-fiole, sau n
recipiente din material plastic, pe ejaculate, care se introduc la frigider n vederea
echilibrrii. Dup 3-4 ore se pot folosi la nsmnarea artificial a femelelor n
clduri, iar pentru transport se folosesc fie frigidere tip, auto, fie termosuri
zootehnice, n care se gsete ghea hidric, ce trebuie s nconjoare din toate
prile dozele de sperm. La punctele de nsmnri artificiale, dozele cu sperm
se transfer n frigidere. Expedierea dozelor cu material seminal se face mpreun
cu un buletin i fi de utilizare.
C) Conservarea spermei de taur prin congelare
Cronologic vorbind, congelarea spermei de taur s-a fcut n dou variante,
dup ritmul n care se trece peste punctul crioscopic: lent i rapid.
Congelarea lent s-a fcut la nceput i se caracterizeaz printr-o coborre
lent a temperaturii spermei, n special de la 35-37oC la -30oC.
Fiolele cu sperm se introduc ntr-o baie de alcool etilic, plasat, la rndul
ei, la o temperatur de 2-4oC. n baia de alcool se adugau la nceput cantiti
predeterminate de zpad carbonic n scopul reducerii temperaturii dup un
anumit ritm. Astfel, rcirea spermei ntre 5oC i -15oC se fcea cu un grad pe
minut, iar de la -15oC la -30oC, scderea temperaturii se fcea cu dou grade pe
minut. De la -30oC pn la -79oC sau -196oC (funcie de agentul criogen
ntrebuinat) trecerea fiolelor cu sperm se fcea brusc. n prezent sunt aparate
moderne, numite frizere, care n funcie de program, asigur un control electronic
al ritmului coborrii temperaturii. n momentul de fa aceast metod nu se mai
folosete datorit dezavantajelor pe care le prezint.
Congelarea rapid a spermei este folosit n exclusivitate n prezent, fiind
rspndit n cvasitotalitatea rilor dezvoltate economic i n curs de dezvoltare.
n funcie de repartizarea n doze, congelarea rapid se poate face n fiole,
paiete i granule.
a) Congelarea spermei n fiole s-a practicat la nceputul folosirii spermei
congelate de taur i constituie un procedeu care se mai folosete cu rezultate bune.
Fiolele sunt fabricate din sticl neutr, rezistent la variaii foarte mari de
temperatur, iar pe corpul lor se imprim datele necesare identificrii
reproductorului sau codificrii necesare n practica de reproducie.
Volumul util al materialului seminal diluat este de 1 ml, rezervndu-se un
spaiu de dilatare a lichidului n timpul congelrii. Acest spaiu are rolul de a
evita, dup decongelare, pierderea de material seminal prin refulare n momentul
introducerii n fiol a pipetei de nsmnare.
Congelarea spermei
Dup diluia final a spermei se calculeaz necesarul de fiole pentru
fiecare ejaculat n parte.
Cu ajutorul unui dispozitiv automat sau a unei seringi semiautomate,
sperma se repartizeaz, cte 1ml, n fiecare fiol. Fiolele se nchid la flacr
oxiacetilenic, apoi se fixeaz n tije port-fiole, confecionate din aluminiu, fiecare
tij fiind prevzut cu cte 6 locauri.
Tijele se grupeaz pe ejaculate apoi se introduc ntr-un refrigerator, n
vederea ehilibrrii, unde se menin 3-4 ore, funcie de specificul fiecrei uniti
productoare. n acest interval de timp, spermatozoizii se adapteaz cu diluantul
39

folosit i noul nivel de temperatur, iar antibioticele incluse n diluant i fac

efectul specific. Dup echilibrare, tijele port-fiole se introduc n plan orizontal, n
vapori de azot lichid, care se formeaz deasupra azotului lichid stocat ntr-un
container cu gura larg. La circa 3 cm sub nivelul azotului se gsete o sit
confecionat din srm cu ochiurile mici sau dintr-un capac prevzut pe toat
suprafaa cu orificii. Pe acest capac grilant se aaz tijele port-fiole, vaporii de
azot lichid avnd o temperatur de -120oC pn la -130oC, unde se menin 8-10
minute, operaiunea fiind denumit precongelare. Dup acest interval de timp,
tijele port-fiole, grupate pe ejaculate, se introduc n canistre metalice care se
fixeaza in containerele c uazot lichid.. n aceste containere numite de prestocaj,
dozele se menin pn a doua zi, cnd se verifica mobilitatea spermatozoizilor.
Dac mobilitatea este de cel puin 30%, tijele port-fiole se transfer n containere
depozit, cu capacitate de 200-500 l, unde se pstreaz, n azot lichid, pn n
momentul livrrii ctre diverii beneficiari. In caz contrar, dozele ejaculatului in
cauza se arunca.
Ambalarea spermei n fiole prezint trei dezavantaje majore: pot exploda
n timpul decongelrii, ocup un spaiu de depozitare prea mare, necesit o
tehnologie de umplere cu o productivitate mai sczut. Din aceste motive,
congelarea spermei n fiole este, n prezent, abandonat n aproape toate rile.
b) Congelarea spermei de taur n paiete
A fost elaborat n anul 1965 de ctre R. Cassou, n Frana i constituie
una dintre cele mai moderne i practice forme de ambalare a materialului diluat,
care confer eficacitate i productivitate sporite. Paieta este confecionat din
clorur de polivinil care nu reacioneaz chimic cu mediul de diluie. Paieta are
forma unui tub cilindric i este confecionat n dou variante:
- paieta mijlocie, cu lungimea de 133 mm, diametrul de 2,5-2,8 mm,
grosimea paietei de 0,14-0,20 mm i volumul util de 0,54 ml;
- paieta fin, cu lungimea de 133 mm, diametrul de 1,7-2,0 mm i un
volum util de 0,25 ml.
Indiferent de tip, paietele au un capt deschis, iar cellalt astupat cu un dop
uzinal constituit din dou straturi de bumbac ntre care s-a pus un strat de pudr
polivinilic preparat cu alcool. Lungimea paietelor este aceeai (133 mm) i
ntruct n timpul umplerii se las o bul de aer de 10 mm lungime, lungimea
coloanei de sperm este de 103 mm. Pudra de alcool polivinilic, n contact cu un
lichid polimerizeaz i se transform ntr-un gel care obtureaz complet lumenul,
ceea ce-i confer garania unei protecii absolute a spermei congelate fa de
germenii florei banale sau patogene prezente eventual n containerul de
depozitare.
Pentru
imprimarea
paietelor se folosete o main
semiauto-mat, prevzut cu un
bloc compostor i un set de
litere i cifre (foto 9).
Imprimarea se face cu cerneal
special, rezistent la azot lichid
i cu uscare rapid. Se folosete
cerneal de diferite culori n
funcie de culoarea paietelor
care urmeaz a fi imprimate,
astfel nct, contrastul s fie ct
mai evident.
Pe fiecare paiet se
Foto 9 Main semiautomat
imprim datele necesare pentru
pentru imprimarea paietelor
identificarea exact a probei de
40

sperm congelat, ntocmai ca pentru fiole. Dup umplere, captul deschis al

paietelor se astup cu pudr de alcool polivi-nilic (dop de laborator) sau se nchide
prin sudarea cu ultrasunete. La ambele tipuri de paiete, se asigur o bul de aer cu
o lungime de circa 10 mm, absolut necesar pentru a compensa dilatarea coloanei
de material seminal n timpul congelrii i pentru a favoriza omogenizarea
coloanei de sperm dup decongelare.
Tehnica de congelare a spermei n paiete
Dup efectuarea diluiei spermei, conform raportului final de diluie, se
calculeaz necesarul de paiete, care se imprim cu ajutorul mainii semiautomate.
Fracionarea ejaculatului n doze de nsmnare se face, de regul, la
temperatura de 2-4oC, manual sau automat.
Umplerea manual a paietelor. Paietele, imprimate i uscate se prind n
brri metalice cptuite cu cauciuc striat, dimensionate s cuprind exact 15
paiete mijlocii. Sperma este aspirat n paiete cu ajutorul unei pompe de vid cu
presiunea coloanei de mercur de 30-50 cm. La cordonul de cauciuc al pompei de
vid se racordeaz un pieptene de aspirare prevzut cu 15 locuri, corespunztoare
numrului de paiete prinse n brar. La pieptenele de aspirare se ataeaz brara
cu paiete, astfel nct, prinderea acestora s se fac cu captul prevzut cu dopul
uzinal. La partea superioar a pieptenului se gsete un orificiu de admisie a
aerului care se obtureaz cu degetul atunci cnd paietele sunt introduse cu captul
deschis n sperm. Umplerea paietelor se face complet, fr a se lsa bula de aer.
Dup umplere, paietele se scutur energic, ceea ce ndeprteaz surplusul de
sperm pe o lungime de circa 10 mm.
nchiderea paietelor se face prin apsarea lor cu captul deschis ntr-un vas
care conine pudr de alcool polivinilic. Pudra ptrunde pe lumenul paietelor,
astupndu-l. Apoi, paietele se introduc cu captul astupat de pudra de alcool
polivinilic ntr-un recipient cu ap distilat, astfel nct pudra polimerizeaz i
astup complet i acest capt al paietei. n
acest fel, coloana de sperm este izolat
etan de mediul exterior, protejnd-o de
eventualele contaminri. Paietele se
desprind din brara metalic, se terg cu
un prosop uscat, apoi se aaz pe nite
rame metalice speciale, cu capacitatea de
40-100 de paiete. Stativele cu paietele
respective se introduc pentru echilibrare
ntr-un dulap frigorific, la temperatura de
Foto 10 Echilibrarea spermei ntr-o 2-4oC, unde se menin circa 3-4 ore (foto
vitrin frigorific
10).
Dup echilibrare, ramele cu paiete se introduc n vapori de azot lichid
pentru precongelare, unde sunt meninute 7-8 minute (foto 11). Apoi se adun, se
introduc n nite pahare din material plastic cu dimensiuni corespunztoare
canistrelor, numite goblete, acestea se introduc etajat n canistre, care la rndul
lor, se scufund n azot lichid n containerele de prestocaj (foto 12). Verificarea
materialului seminal i depozitarea paietelor cu sperm se face ntocmai ca n
cazul fiolelor (foto 13, 14 si 15).

41

Foto 11 Precongelarea spermei n

vapori de azot lichid

Foto 12 Containere de prestocaj

Foto 13 Verificarea calitii materialului Foto 14 Depozitarea dozelor cu sperma

seminal din containerele de prestocaj
O variant mbuntit a umplerii manuale a paietelor este reprezentat de
umplerea sub clopot de vid. Paietele sunt nchise ermetic pri sudare cu
ultrasunete la unul din capete. Sunt apoi individualizate cu toate datele necesare.
Se calculeaz strict necesarul de paiete, funcie de capacitatea acestora i de
volumul total de sperm diluat. Cu captul deschis, paietele se introduc n
paharul cu sperm diluat. La rndul lui, paharul se plaseaz sub un clopot de vid.
Se pornete pompa de vacuum n vederea scoaterii aerului din paiete, (aspect ce se
verific echinivelmetric cu ajutorul unei paiete introdus ntr-un pahar cu lichid
colorat). Apoi se d drumul la aer, care, datorit presiunii mpinge sperma n
paiete (foto 16). Paietele se nchid la captul liber cu ajutorul pulberii de alcool
polivinilic. Urmtoarele etape ale congelrii sunt asemntoare celor menionate
mai sus. Folosirea acestei metode impune efectuarea unui calcul precis al
necesarului de paiete pentru fiecare ejaculat. n caz contrar, fie c paietele nu se
umplu, fie c rmne material seminal neabsorbit n paiete.

Foto 15 Diferite tipuri de containere

pentru depozitarea dozelor cu sperm

Foto 16 Umplerea paietelor sub un

clopot de vid
42

 Umplerea automat a paietelor se face cu ajutorul unor maini semiautomate

a cror productivitate se situeaz la un nivel de 4000-13000 paiete pe or.
Paietele imprimate cu toate datele necesare, sunt aezate pe un rastel
adaptat la conveiorul mainii care transport paietele pn n dreptul orificiilor de
umplere. La acest nivel se gsesc nite ace (1-3) racordate prin tuburi de material
plastic, la recipientul cu sperm, iar pe partea opus exist acelai numr de ace,
mai scurte, racordate la o pomp de vid. Dup umplere, paietele trec pe rnd prin
dreptul unui emitor (Bronson) de ultrasunete, cu acionare vertical, care nchide
etan captul paietelor. Pentru nchiderea paietelor se mai pot folosi bile mici,
metalice sau din material plastic care se introduc forat pe lumenul acestora,
nchizndu-se etan.
Echilibrarea, precongelarea, congelarea, verificarea materialului seminal i
stocarea sunt urmtoarele etape ale congelrii identice celor menionate la
umplerea manual.
Ambalarea spermei n paiete prezint avantajele:
- permite o bun individualizare a dozelor;
- se evit contaminarea spermei cu flora microbian existent n azotul
lichid;
- permite folosirea economic a containerului (maxim de doze n minim
de spaiu), aplicabil mai ales n cazul ambalrii spermei n paiete fine;
- necesit o tehnic de conservare i inoculare a spermei, simpl.
c) Congelarea spermei n granule (pastile)
A fost propus i experimentat de Nagase i Niva, n anul 1964 i
reprezint singura form concentrat sub care se conserv materialul seminal, n
contact direct cu agentul criogen (azotul lichid). Se bazeaz pe congelarea
ultrarapid a spermei diluate ntr-un raport de diluie strns, n alveolele unui bloc
de ghea carbonic, rezultnd granule de sperm congelate, cu volum de circa 0,1
ml.
Sperma se dilueaz ntr-un raport de 1/2-1/4, apoi este lsat s se rceasc
pe parcursul a 90 de minute la temperatura de 1-3oC. Echilibrarea spermei se face
n frigider, timp de 4-5 ore. Materialul seminal diluat se depune, cu ajutorul unei
seringi semiautomate, cte 0,1ml, n alveolele practicate n nite blocuri de zpad
carbonic, la temperatura de -79oC.
Placa de zpad carbonic se acoper cu vat steril i se las circa 7
minute, timp necesar congelrii.. La expirarea timpului de congelare, granulele
sunt scuturate de pe placa de zpad carbonic (sunt suflate cu un curent de aer) i
colectate ntr-un recipient cu azot lichid. Granulele care provin de la acelai
reproductor, se ambaleaz mpreun n recipieni din material plastic, pe care
sunt trecute toate datele necesare identificrii, apoi se aaz suprapus, pe o tij
care se suspend n azot lichid. Se depoziteaz numai granulele provenite din
probe care dup decongelare prezint cel puin 30% mobilitate i conin cel puin
10 milioane de spermatozoizi vii cu micri rectilinii/doz. Recipienii au o
capacitate de 50-100 de granule.
Acest procedeu de ambalare a materialului seminal are i unele
dezavantaje legate de imposibilitatea individualizrii sigure a granulelor i a
existenei riscului de contaminare cu ageni microbieni provenii din azotul lichid
n timpul conservrii.

43

1.6.2. Conservarea spermei de berbec i ap

La ovine i caprine se poate folosi cu bune rezultate pentru nsmnare
sperma brut fracionat n mai multe doze (circa 10/ejaculat). n acest caz,
nsmnarea femelelor trebuie s se fac imediat dup colectarea spermei care nu
se mai dilueaz. Metoda d bune rezultate n ceea ce privete procentul de
fecunditate al femelelor nsmnate.
Sperma de berbec se conserv sub form lichid sau solid, asemntor
spermei de taur, ns rezultatele obinute, prin nsmnarea femelelor cu sperm
congelat, sunt mult mai slabe dect la taurine.
Conservarea spermei sub form lichid este destul de rspndit,
rezultatele obinute fiind bune. Temperatura de conservare a spermei diluate este
de +15oC (Baril i colab.,1993) sau la 2-4oC. n cazul conservrii spermei la
aceste niveluri de temperatur, sperma diluat se repartizeaz n fiole (1 ml), n
flacoane sau n paiete.
Pe timpul efecturii controlului i dilurii spermei, coborrea temperaturii
trebuie s se fac progresiv ntre +32oC i +15oC, deoarece spermatozoizii sunt
foarte sensibili la ocul termic, motiv pentru care trebuie evitate fluctuaiile rapide
ale nivelului de temperatur.
Conservarea i transportul materialului seminal ambalat n fiole i flacoane
se fac ca la taur, iar distribuirea la fiecare punct de nsmnare se face la interval
de dou zile.
Sperma conservat n stare lichid poate fi ambalat i n paiete. Dup
omogenizarea spermei diluate, umplerea paietelor se face fie manual, fie
semiautomat (dac numrul de doze este mare), fie prin simpla aspirare bucal
prin traversul dopului uzinal care permite trecerea aerului. Inchiderea paietelor se
face ca la taur. Dozele se pstreaz la termostat reglat fie la +15oC, fie la 2-4oC. n
cazul conservrii spermei la temperatura de +15oC, sperma trebuie s fie inoculat
la intervalul a maximum 8-10 ore de la recoltare.
Congelarea spermei de berbec pn n prezent nu a dat rezultate
mulumitoare, datorit faptului c nivelul de fecunditate este mai sczut cu 20%
fa de folosirea spermei brute, numrul de spermatozoizi necesari este foarte
mare, iar tehnica procesului de congelare este costisitoare i complicat.
Dup diluia final a spermei, calculndu-se un nivel de 4% glicerin,
temperatura se reduce progresiv pn la 4oC, temperatur la care condiionarea se
face n paiete i practic ncepe procesul de congelare a spermei.
Imediat dup recoltare, se face diluia iniial n raport de 1/1 la
temperatura de 28-30oC, care apoi se plaseaz n partea de jos a unui refrigerator
(6oC). Dup 30 de minute, temperatura spermei scade pn la 13-15oC i dup
circa dou ore ajunge la +6oC.
n acest stadiu, sperma se scoate din vasul cu ap i se plaseaz direct n
refrigerator sau camera frigorific, apoi la +4oC se adaug diluantul cu glicerin,
astfel nct, n final, concentraia acesteia s fie de 4% (G. Baril i colab., 1993).
Repartizarea spermei n paiete mijlocii (0,5 ml) se poate face manual,
semiautomat sau chiar prin simpla aspirare bucal. Dup nchiderea paietelor i
echilibrarea spermei, congelarea se poate realiza fie folosind o main automat,
fie meninnd paietele circa 8 minute la 20 cm deasupra nivelului azotului lichid,
n vaporii acestuia (-75oC) apoi prin imersarea direct n azot lichid.
Congelarea spermei n pastile s-a dezvoltat n Australia printr-un procedeu
asemntor congelrii spermei de taur. Dup diluia final a spermei, se coboar
temperatura acesteia pn la un nivel de +4oC (asemntor celor mai sus
precizate), apoi, picturi de 0,1-0,2 ml de sperm la +4oC sunt depuse direct n
44

alveolele practicate pe blocul de zpad carbonic (-79oC). Dup 3-4 minute,

pastilele sunt colectate, introduse ntr-un recipient de plastic i apoi se scufund
direct n azot lichid.
La caprine, existena enzimelor n plasma seminal, care acioneaz
asupra fosfolipidelor din diluant, cu liberarea de compui toxici pentru
spermatozoizi, antreneaz etape diferite de conservare a spermei, comparativ cu
ovinele. La ap, este recomandat de a se separa plasma seminal ct mai repede
posibil dup recoltare. Pentru folosirea spermei proaspete, diluia direct a
ejaculatului ntr-un diluant pe baz de lapte ecremat de vac este posibil, ns se
interzice prezena glbenuului de ou n mediul de diluie. Dac diluantul conine
glbenu de ou este absolut necesar s se fac splarea spermei nainte de diluie.
Splarea spermei de ap se face prin folosirea unei soluii Krebs-Ringer-Fosfate
(soluie de splare) care conine glucoz, apoi se centrifugheaz amestecul pentru
a elimina plasma seminal. Sunt posibile dou splri succesive.
Reducerea temperaturii se face astfel: dup recoltare, paharul colector se
plaseaz ntr-o baie-marie la 28-30oC, imediat adugndu-se soluia de splare;
centrifugare 15 minute, eliminarea supernatantului, adugarea celei de-a doua
soluii de splare i iari centrifugare timp de 15 minute.
n cazul conservrii spermei sub form lichid, dup circa 35-40 de minute
de la recoltare, urmat de cele dou splri, se face diluia final la 20oC. Se
omogenizeaz, apoi paharul cu sperm se introduce ntr-un vas plin cu ap (20oC)
n refrigerator (+6oC). Dup circa 65 de minute, sperma se condiioneaz n paiete
ca i sperma de berbec, ns trebuie s fie ntrebuinat n primele 8 ore de la
recoltare, ceea ce limiteaz conservarea spermei de ap prin refrigerare la 13-15oC.
n cazul congelrii spermei de ap, dup a doua splare i dou ore de la
recoltare se adaug prima parte a diluantului glicerol (+4oC), dup 10 minute se
adaug a doua parte a diluantului glicerol, iar dup alte 10 minute se adaug i a
treia parte a diluantului glicerol tot la temperatura de +4oC. Dup 30 de minute,
sperma se condiioneaz n paiete de 0,25 ml, se precongeleaz n vapori de azot
(ca i sperma de berbec) i apoi se congeleaz n azot lichid (-196oC). Sperma de
ap se poate conserva i n pastile, ntocmai ca sperma de berbec.

1.6.3. Conservarea spermei de vier

Sperma de vier are unele particulariti, n raport cu cea a rumegtoarelor:
volum mare, concentraie sczut n spermatozoizi, sensibilitate crescut la
schimbrile de temperatur, plasma seminal bogat n electrolii, ceea ce
ngreuneaz posibilitile tehnice de conservare (Feredean i colab., 1964).
Dac sperma corespunde calitativ, imediat dup recoltare se dilueaz, la
temperatura de 33-35oC, n raport de 1/1 i n condiii de izotermie. Se pstreaz
la 18-20oC, 15-20 de minute pentru echilibrare.
La diluarea spermei de vier, gradul de diluie variaz n limite mai
restrnse dect la rumegtoare, 1/2-1/8.
Sperma de vier diluat, se ambaleaz n recipiente de sticl sau de material
plastic, cu capacitatea de 80-100 ml. Dac sperma se folosete imediat dup
diluare, aceasta se repartizeaz direct n recipientul adaptat cateterului de
nsmnare. Dac sperma diluat se conserv mai multe zile, ambalarea se poate
face pentru cantitatea total (n sticle cu perei dubli) sau n doze a cte 100 ml,
direct n recipiente de material plastic.
n practica nsmnrilor artificiale la porcine, metodele de conservare a
spermei sunt:
45

conservarea la temperatura de 15-20oC;

conservarea n medii uor acide;
conservarea la temperatura de 4-5oC;
conservarea prin congelare.

A) Conservarea spermei la temperatura camerei (15-20oC)

Sperma de vier, diluat i ambalat se poate pstra una-dou zile dac
temperatura de pstrare este constant, conine substane saline, energetice i
antibiotice. Ritmul de coborre a temperaturii spermei diluate va fi lent, fr
variaii brute, atingerea temperaturii de conservare trebuind s se realizeze n 90120 de minute. La aceast temperatur sperma se pstreaz pn n momentul
inoculrii, cnd trebuie renclzit pn la o temperatur apropiat de cea a
corpului (37-40oC) (Feredean T. i colab., 1961). Conservarea spermei la
temperatura de 15-20oC timp de 48 de ore, asigur un nivel de fecunditate al
scroafelor nsmnate de circa 75% (Feredean T., 1977)
Conservarea spermei n medii uor acide se bazeaz pe crearea anabiozei
acide. Diluantul folosit conine bicarbonat de sodiu la care se adaug bioxid de
carbon, cu rol n acidifierea mediului, prin formarea acidului carbonic. Aceast
metod a fost adoptat pentru conservarea spermei de vier de ctre du Mesnill, du
Buisson i Dauzier n anul 1959. Reactivarea spermatozoizilor se face prin simpla
nclzire a spermei ce urmeaz a fi folosit sau prin adugarea unei substane
chimice alcaline, ambele condiii regsindu-se n uterul scroafei.
Diluarea se realizeaz la temperatura de 31-33oC, n final adugndu-se
circa dou-trei volume de diluant la un volum de sperm, astfel nct s se obin
3-4 miliarde de spermatozoizi ntr-o doz de 40-50 ml. Sperma diluat se
barboteaz cu un curent de CO2, timp de 10 minute, pn cnd pH-ul coboar la
6,2-6,4. Din recipientul n care s-a fcut barbotarea spermei diluate, aceasta se
repartizeaz n fiole de sticl de circa 50 ml, care se nchid la flacr
oxiacetilenic i se pstreaz la o temperatur constant de 15oC. n momentul
folosirii, fiecare doz se dilueaz din nou cu acelai diluant inut la 30oC, pn la
un volum final de 100 ml i apoi se folosete la nsmnarea scroafelor n clduri.
Conservai astfel, spermatozoizii i prezerv capacitatea fecundant timp de 4-5
zile. Totui, datorit laboriozitii metodei i a promovrii n prezent a altor
procedee de conservare a spermei nu se mai practic sau se aplic n mod cu totul
sporadic.
B) Conservarea spermei de vier la temperatura de 4-5oC
La noi n ar, din anii 90, pe lng diluantul salin de tip SEMTEST
Baloteti folosit pentru conservarea spermei timp de 48 de ore la temperatura de
15-20oC, se mai utilizeaz, cu rezultate bune, un mediu de diluie propus de
Institutul de Biologie i Nutriie Animal Baloteti, pe baz de glbenu de ou.
n cazul folosirii acestor medii de diluie, sperma diluat poate fi folosit la
nsmnarea artificial a scroafelor timp de 4-5 zile de la data diluiei, cu condiia
ca sperma s fie pstrat la frigider (+4oC). nainte de nsmnare, dozele de
sperm se nclzesc pn la temperatura de 37oC.
C) Conservarea spermei de vier prin congelare
Congelarea spermei de vier a preocupat cercettorii n ultimele patru
decenii, ns numai din anii 70 aceste cercetri s-au amplificat. Primele rezultate
obinute cu sperm congelat, dup nsmnarea transcervical sunt ale lui Crabo
i Grinarsson, n 1971, care au folosit ca lichid pentru decongelare plasma
seminal de vier (Dumitrescu I. i colab., 1978). Crioconservarea spermei are
drept consecin un anumit grad de distrugere a biomembranelor spermatozoizilor,
prin trecerea n plasm a lipidelor, albuminelor, fermenilor, grupelor sulfhidrice,
46

afectarea echilibrului ionic etc (Nauk B.A., 1991). Gradul de stabilitate a spermei
animalelor domestice la temperaturi foarte sczute este dependent, n mare
msur, de comportarea albuminelor. Coninutul n aminaz a membranelor
plasmatice ale spermatozoizilor de vier este mai sczut comparativ cu
spermatozoizii rumegtoarelor. Experienele au demonstrat faptul c substanele
albuminice i complexele acestora sunt mai stabile la temperaturi sczute dect
lipidele. Spermatozoizii de vier conin mai multe fosfolipide comparativ cu
spermatozoizii rumegtoarelor. Experienele ntreprinse au evideniat faptul c la
temperaturi ultrasczute crete procesul de oxidare peroxidic a lipidelor din
spermatozoizi.
n ceea ce privete participarea glicerinei n mediul de diluie, cele mai
bune rezultate, referitoare la nivelul fecunditii scroafelor nsmnate, s-au
obinut atunci cnd concentraia crioprotectorului n sperm a fost de circa 2-3%.
O alt problem care reduce rspndirea nsmnrilor artificiale cu
sperm congelat const n randamentul slab al acestei metode, supravieuirea
spermatozoizilor se situeaz, n medie, ntre 30% i 40%, ceea ce nseamn c
dintr-un ejaculat nu se pot face mai mult de 3-4 nsmnri. De asemenea,
prolificitatea scroafelor nsmnate cu sperm congelat este mai sczut.
Crioconservarea spermei de vier se practic n mai multe variante,
neconcentrat sau concentrat, fie sub form de granule, fie sub form de paiete
mari cu volum de 2,0-2,5 ml etc. Fiecare centru de recoltare, examinare i
prelucrare i are propria metod de congelare, ns trebuie s precizm faptul c,
datorit dezavantajelor menionate, la care se adaug i laboriozitatea accentuat a
tehnologiei de congelare a spermei, crioconservarea spermei de vier nu d
ntodeauna rezultate bune i de aceea nu cunoate o rspndire larg.
Dintre metodele folosite n prezent, menionm pe cea care este rspndit
n unele centre de nsmnri artificiale din SUA, Canada, Anglia, Germania,
unde se congeleaz sperm de vier n scopuri comerciale (Dumitrescu I. i
colab.,1978).
Se folosete un diluant constituit din TES, TRIS, glucoz i glbenu de ou
(20%), preparat cu 24 de ore nainte de folosire i meninut la frigider. nainte de
folosire, diluantul se centrifugheaz, iar supernatantul se folosete ca diluant, fiind
mprit n dou pri egale: o parte este folosit la temperatura camerei pentru
prima diluie, dup ce i s-a adugat 2% glicerin, iar a doua parte se menine la
frigider pentru a se realiza cea de a doua diluie.
Mediul n care se face decongelarea este constituit din glucoz, citrat
trisodic, bicarbonat de sodiu, sare disodic de EDTA, clorur de potasiu.
Sperma, dup recoltare i examinarea calitativ, este lsat s se rceasc
2-3 ore la temperatura laboratorului, timp n care se adaug antibioticele necesare.
Sperma se transfer n fiole de centrifug, apoi se centrifugheaz 10 minute la
1500 rotaii /minut pn cnd sperma se separ de plasma seminal. Supernatantul
este eliminat apoi se adaug n eprubete o cantitate mic de diluant fr glicerin,
la 200C. Spermatozoizii sedimentai sunt amestecai uor cu o baghet de sticl i
sperma n suspensie se transfer ntr-un cilindru gradat de 100 ml. Se adaug din
nou o cantitate de diluant fr glicerin, n aa fel nct s se ajung la jumtate
din volumul final.
Cilindrul gradat cu sperm diluat se plaseaz ntr-un vas de 250 ml care
conine circa 50 ml de mediu lichid la 20oC i amndou se introduc la frigider
timp de dou ore, astfel nct temperatura amestecului de sperm s scad la 8oC.
Se face a doua diluie cu diluant ce conine 2% glicerin, adugndu-se diluantul
pn ce se ajunge la volumul final, diluia fcndu-se n condiii de izotermie.

47

Sperma se depune n excavaiile practicate n blocul de zpad carbonic,

formndu-se pastile de 0,1-0,2 ml fiecare. Dup 3-5 minute, pastilele din sperm
se colecteaz ntr-o plnie cu azot lichid, se apreciaz calitatea spermei i dac
mobilitatea spermatozoizilor este de minimum 20% pastilele se transfer n
eprubete (150/16 mm) marcate cu datele necesare identificrii vierului, apoi
fiolele se trec ntr-un container cu azot lichid. Fiecare fiol conine 10 pastile cu
sperm.
La noi n ar, un colectiv de specialiti de la SEMTEST Baloteti, a
folosit congelarea spermei de vier n paiete din plastic cu capacitatea de 2,5 ml, cu
2,5 miliarde de spermatozoizi/paiet, care s-a precongelat n vapori de azot lichid.
n ara noastr nc nu este elaborat o tehnologie specific de lucru care s
garanteze o fecunditate corespunztoare a femelelor nsmnate.
1.6.4. Conservarea spermei de armsar
La armsar, sperma se recolteaz la interval de dou zile, se examineaz i
cea care corespunde calitativ se dilueaz imediat la +32oC, astfel nct s se
asigure o concentraie de 20X106 spermatozoizi/ml, doza fiind format din 20 ml,
ceea ce nseamn c se asigur circa 400 de milioane de spermatozoizi
mobili/doz. Cele mai eficiente antibiotice folosite sunt penicilina i gentamicina.
Dintr-un ejaculat pot rezulta n medie 30 de doze. Scderea temperaturii trebuie s
se fac treptat. Astfel, sperma diluat la +32oC se menine 20-30 de minute la
temperatura laboratorului i apoi dozele cu sperm se introduc la frigider. Sperma
este distribuit n fiole sau cel mai frecvent n tuburi cu volum de 20 ml. Fiolele
sau tuburile se nchid ermetic i se menin la frigider, capacitatea fecundant fiind
asigurat doar pe un interval de 24 de ore (conservarea prin refrigerare).
Conservarea spermei prin congelare
Oricare ar fi mediul de diluie, se constat o mortalitate ridicat a
spermatozoizilor la congelare, dar i o reducere a capacitii fecundante a
spermatozoizilor mobili (Palmer E. i colab., 1984).
Rezistena spermatozoizilor la congelare variaz mult cu particularitile
individuale ale armsarilor. Cel mai ridicat procent de supravieuire a
spermatozoizilor la congelare s-a observat la armsarii care dau o sperm
concentrat i cu volum redus.
Congelarea spermei se realizeaz prin diluare i scderea temperaturii.
Sperma diluat pentru congelare se ambaleaz n tuburi metalice sau din material
plastic, pstrate n azot lichid. Tuburile metalice sunt confecionate din aluminiu,
au o lungime de 12 cm, diametrul de 2,5 cm, nchise ermetic.
Mediul de diluie preconizat de Busch i colab.,1982 are urmtoarea
compoziie: ap bidistilat 10 ml, glucoz 11 g, EDTA (sare de etilen-diamintetraacetil- bisodic) 100 mg, hidrocarbonat de sodiu (soluie apoas 2%) 0,2 ml,
soluie de citrat de sodiu 0,25 ml, glbenu de ou 2 ml, glicerin 3,5 ml, 500000
U.I. penicilin i 0,5 g streptomicin. Sperma este lsat s sedimenteze, iar
fraciunea bogat n spermatozoizi meninut n baia-marie la 32oC, se amestec
cu diluantul meninut la aceeai temperatur. Sperma se pstreaz la temperatura
camerei timp de 30 minute, apoi se introduce n tuburile de aluminiu cu o
capacitate de 20 ml. Dup umplere, tuburile se nchid ermetic, se in la frigider (24o) dou ore pentru echilibrare. Sperma se dilueaz la aceast temperatur n
raport de 1/3-1/4. Tuburile se introduc n vapori de azot lichid (precongelare) la
temperatura de -120oC, unde se menin 3-6 minute, apoi sunt scufundate direct n
azot lichid (-196oC).
48

a) Congelarea spermei n tuburi de material plastic

Martin i Klug (1979) au folosit tuburi cu o capacitate de 4 ml.
Diluarea se face n doi timpi: n prima etap se face diluia n raport de 1/1,
la temperatura de 30-32oC, apoi amestecul se centrifugheaz 5 minute (1000
rotaii/minut). Supernatantul se nltur, apoi sperma rmas se amestec cu un alt
diluant la temperatura de 2-4oC, urmeaz echilibrarea 3-4 ore la acest nivel de
temperatur, apoi sperma se repartizeaz n tuburi din material plastic care se
nchid i la cellalt capt cu pudr de alcool polivinilic sau prin alt procedeu.
Congelarea se face n acelai fel ca pentru tuburile de aluminiu.
b) Congelarea spermei n granule (pastile) nu a dat rezultate
satisfctoare pn n prezent, fecunditatea iepelor nsmnate cu sperm
congelat n granule oscilnd ntre limite foarte largi (11-60%, Oshida i colab.,
1966; Knoop, 1976), fapt ce a dus la aplicarea din ce n ce mai redus a acestui
procedeu. Tehnologia prevede diluia i centrifugarea spermei, nlturarea
supernatantului, iar sperma rmas se repartizeaz n alveole practicate pe un bloc
de zpad carbonic i apoi introducerea n tuburi i scufundarea n azot lichid
unde se pstreaz.
1.6.5. Conservarea spermei de psri
Sperma diluat i poate menine capacitatea fecundant circa 24 de ore
dac temperatura de pstrare se situeaz la un nivel de 12-15oC, la coco i
curcan, cu condiia ca oxigenarea spermei s fie meninut tot timpul pstrrii.
Congelarea spermei la psri ntmpin unele dificulti:
- degradarea membranei spermatozoizilor cauzat de apariia de
microcristale i deshidratarea care intervine n momentul congelrii spermei;
- fenomene de toxicitate datorate creterii concentraiei intracelulare a soluiilor.
Sperma se dilueaz n raport de 1/1, se rcete progresiv pn la 4oC cnd
se adaug restul cantitii de diluant care conine substan crioprotectoare
(glicerol, DMSO-dimetil sulfat oxid, dimetil acetamid 4%).
Congelarea propriu-zis se face n azot lichid, sperma fiind ambalat n
fiole, paiete sau pastile. Cele mai bune rezultate s-au obinut cu sperma conservat
n paiete. Stocajul are loc n azot lichid.
Lake, respectnd aceste condiii, a obinut o fecunditate de 93%, ns a
efectuat 4 nsmnri artificiale n 10 zile, ceea ce a totalizat 1,2 miliarde de
spermatozoizi, cam de 6-10 ori mai mult dect atunci cnd se folosete sperma
brut. Rezultatele lui Sexton, care a folosit DMSO se situeaz la un nivel mai
sczut (40-60%), cu variaii mari de la un mascul la altul.
1.7. Inocularea spermei
Constituie ultima etap n biotehnologia nsmnrilor artificiale i const
n depunerea materialului seminal, n prealabil recoltat, examinat, prelucrat i
conservat sau brut, pe traiectul cilor genitale ale femelelor n estru. Inocularea
prin mijloace artificiale trebuie s in seama de particularitile fiziologice ale
locului de depunere a spermei prin mont, sperma urmnd a fi depus cel puin la
nivelul segmentului genital femel unde este depus fiziologic.
Prin nsmnare artificial se ntrebuineaz numai sperma care a
corespuns unor parametri minimi de calitate i care provine de la reproductori
valoroi.
49

Funcie de locul unde se depune, inocularea poate fi:

- vaginal, care se aplic la mioare i viele;
- cervical, aplicabil la oi si vaci;
- uterin, practicat la iap i scroaf;
- tubar, se aplic la psri.
1.7.1. Inocularea spermei la vac
Indiferent de forma de proprietate a efectivelor de taurine, nsmnarea
artificial presupune existena unei scheme organizatorice adecvate, structura
organizatoricsi atributiile institutiilor fiind prezentate n primul capitol.
1.7.1.1 Punctul de nsmnri artificiale la vaci (P.I.A.V.)
Punctul de nsmnare artificial a vacilor este subunitatea-verig a
ntregii reele de reproducie a animalelor, prin a crei activitate se concretizeaz
ntregul proces de reproducie la taurine din sectorul de stat, asociativ sau
individual. Punctul de nsmnare artificial a vacilor este amenajat la nivelul
fiecrei comune sau ferme de vaci, este ncadrat cu un tehnician sau operator
nsmntor cruia i revin sarcinile pe linia reproduciei i seleciei efectivelor de
animale arondate punctului de nsmnri artificiale.
n condiiile extinderii iniiativei particulare n creterea i exploatarea
efectivelor de taurine, funcioneaz i operatori nsmntori, autorizai de
instituiile abilitate n acest sens, care s efectueaza pe cont propriu aciunile de
nsmnare a animalelor.
De regul, punctul de nsmnare artificial este amplasat ntr-un adpost
al fermei sau pe lng circumscripiile sanitar-veterinare, fiind dotat cu
instrumentarul si aparatura necesare aplicarii insamantarii artificiale.
Aprovizionarea cu material seminal congelat la nivelul punctelor de
nsmnare artificial se face prin serviciul specializat la nivelul UARZ sau a
Centrelor de Reproducie i Selecie a Animalelor.
1.7.1.2. Descoperirea femelelor n clduri i stabilirea
momentului optim al nsmnrii
Identificarea femelelor n clduri constituie o aciune important pentru
succesul nsmnrii artificiale. Modificarile morfofiziologice ale segmentelor
aparatului genital si de comportament au fost descrise in cadrul disciplinei de
Reproductie, capitolul Ciclul sexual.
Semnul concludent al strii de estru se consider atunci cnd femela
respectiv accept, fr tendina de a fugi, saltul altor femele sau masculi cu care
st mpreun, acest moment considerndu-se a fi optim pentru nsmnarea
artificial. Vulva, vestibulul vaginal i vaginul sunt congestionate, labiile vulvare
sunt edemaiate, dispar pliurile vulvare, clitorisul se evideniaz. Printre labiile
vulvare se scurge un mucus translucid, filant, care poate s se ntind de la
comisura inferioar a vulvei pn la pmnt. La mijlocul perioadei de estru,
cantitatea de mucus crete i are o elasticitate maxim, ceea ce constituie alt semn
specific de clduri (fig. 4).
Descoperirea vacilor n clduri trebuie s se fac cu mult profesionalism
pentru a se evita pierderile de cicluri, care se pot ridica la 20-30%. Depistarea trebuie
50

Fig. 4 Perioada optim pentru nsmnarea artificial a vacilor

s se fac de dou ori pe zi , dimineaa i seara.n complexele de vaci, depistarea

cldurilor ridic unele probleme nu numai datorit efectivului mare de animale care
trebuie urmrite zilnic, dar i datorit semnelor clinice, deseori mai terse. Pentru
creterea eficienei n descoperirea vacilor n clduri se pot folosi n astfel de uniti,
masculi biostimulatori (epididimotomizai, deferotomizai sau cu deviere de penis).n
acest caz se consider suficient un taur biostimulator pentru 100-200 de vaci.n
majoritatea cazurilor, descoperirea femelelor n clduri se face numai pe baza
modificrilor morfo-fiziologice i de comportament din stadiul de estru.
De asemenea, n alegerea momentului optim al nsmnrii, este necesar
s se urmreasc cu atenie evoluia perioadei puerperale, astfel nct s se previn
mbolnvirile, care sunt frecvente n aceast etap, iar puerperiumul s se
desfoare fiziologic. Majoritatea autorilor recomand ca nsmnarea artificial
s se fac cel mai devreme ntre 45-50 de zile de la ftare, n funcie de modul
cum decurge perioada puerperal, de nivelul produciei de lapte etc, tiut fiind c
femelele care dau o producie mare de lapte se nsmneaz prima dat dup un
interval de cel puin 60 de zile de la parturiie.
nsmnarea vacilor descoperite n estru trebuie s se fac imediat dup
depistarea cldurilor i apoi s se repete dup 8-10 ore, avnd n vedere durata
estrului, momentul ovulaiei, viabilitatea gameilor pe traiectul cilor genitale femele.

51

1.7.1.3. Pregtirea femelelor pentru nsmnare

Const n notarea de ctre operatorul nsmntor a numrului matricol,
grajdul i lotul din care fac parte vacile ce urmeaz a fi nsmnate. Identitatea
femelei este cutat n registru, cu care ocazie este analizat i interpretat starea
ginecologic a femelei. Cu aceast ocazie se nscrie nsmnarea n registru i se
face i programarea urmririi peste 18-23 de zile a eventualei reintrri a femelei n
clduri.
Pregtirea instrumentarului pentru nsmnare ine seama de tehnica de
nsmnare folosit i de modul n care este ambalat materialul seminal
(refrigerat, congelat n paiete, fiole sau granule).
n cazul n care se practic metoda colposcopic de nsmnare, speculul
va fi sterilizat prin fierbere, timp de 10-15 minute, se verific funcionarea sursei
de lumin, se asigur lubrifierea cu vaselin neutr. Pentru nsmnare, speculul
vaginal se nclzete pn la aproximativ 45-50oC, apoi se lubrifiaz cu vaselin
neutr. Se pregtete pipeta de nsmnare si registrul de nsmnare, ap cald,
o soluie aseptizant, mnuile de plastic, etc.
n instituia n care se practic nsmnarea tactil-recto-cervical (rectovaginal) se pregtesc evidenele, soluiile i substanele aseptizante,
mbrcmintea de lucru i mnuile de plastic pentru exploraie.n funcie de
materialul seminal folosit, se va pregti o pipet din sticl sau din material plastic,
un pistolet Cassau sau o pipet universal de tip SEMTEST.
1.7.1.4. Reanimarea spermatozoizilor
Presupune scoaterea dozei de nsmnare din cutia care se gsete n
termosul cu ghea i lsarea ei la temperatura camerei timp de cteva minute,
ntr-un stativ de lemn pregtit special n acest scop (n cazul n care se folosete
sperma conservat prin refrigerare).
n cazul folosirii spermei conservate prin congelare se recomand:
- decongelarea ct mai rapid a dozei cu material seminal;
- ntre decongelare i nsmnare curba de temperatur a spermei s fie n
continu cretere;
- un interval de timp ntre decongelare i nsmnare ct mai scurt (maximum 15
minute);
- instrumentarul folosit pentru nsmnare s aib aceeai temperatur ca sperma;
- canistrele din containere s nu fie ridicate la o nlime mai mare de 3-4 cm sub
nivelul superior al containerului. Extragerea dozei trebuie fcut foarte rapid, prin
intermediul unei pense.
Indiferent de prelucrarea iniial a spermei congelate i forma sub care se
gsete, pentru decongelare este nevoie de un termos cu o baie marin de 36-40oC
i un termometru.
n funcie de modul de prezentare a spermei congelate, pentru reanimarea
spermatozoizilor este necesar parcurgerea unor etape de lucru specifice.
n cazul conservrii spermei n fiole, se parcurg etapele:
- pregtirea bii marine la 38oC;
- deschiderea containerului, ridicarea canistrei pn la gtul containerului,
extragerea fiolei, cufundarea ei n baia marin;
- decongelarea materialului din fiole dureaz 2 minute;
- tergerea i uscarea fiolei;
52

- deschiderea fiolei prin secionarea gtului acesteia;

- aspirarea spermei n pipet;
- nu se decongeleaz n acelai timp mai multe fiole, iar absorbia
materialului seminal decongelat se face cu instrumentarul nclzit.
n cazul conservrii spermei n paiete se au n vedere urmtoarele etape de
lucru:
- pregtirea bii marine la temperatura de 34-37oC;
- deschiderea containerului, ridicarea canistrei pn la cel mult 3-4 cm sub
nivelul superior al containerului, scoaterea paietei, scuturarea ei de eventualele
resturi de azot i cufundarea n baia marin; decongelarea dureaz 13 secunde
pentru paieta mijlocie i 8 secunde pentru paieta fin;
- reaezarea canistrei i nchiderea containerului;
- nclzirea, prin frecare cu hrtie sau vat, a pipetei sau pistoletului de
nsmnare;
- scoaterea paietei din baie, uscarea ei prin tergere cu tifon sau prosop;
- transferarea bulei de aer ctre captul astupat cu dopul de laborator prin
lovirea uoar a corpului paietei;
- introducerea paietei n pistoletul sau pipeta de nsmnare;
- tierea captului paietei cu o seciune perpendicular pe axul
longitudinal, la mijlocul bulei de aer. Se recomand s nu se decongeleze mai
multe paiete n acelai timp.
n cazul conservrii spermei n granule se parcurg etapele:
-pregtirea bii marine la temperatura de 38-40oC;
aezarea pe stative, n baia marin a unor fiole goale deschise cu o capacitate de
2,0-2,5 ml, asemntoare celor folosite la ambalarea materialului seminal
refrigerat;
-introducerea n fiecare fiol a cte 1,0 ml soluie de citrat de sodiu 2,9%
steril (soluie extender) n care se decongeleaz granulele; att fiolele cu soluia
extender, ct i fiolele goale trebuie s fie introduse n baia marin la jumtatea
nlimilor;
-deschiderea containerului, ridicarea canistrei pn la gtul containerului;
ridicarea ambalajului cu granule pn la nivelul de unde se extrage cu pensa dopul
de pnz-tifon (granulele se gsesc tot timpul sub nivelul azotului din container);
-rcirea vrfului pensei sau tijei linguri, timp de 10-15 secunde, n azot
lichid;
extragerea cu ajutorul pensei rcite a unei singure granule i plasarea rapid a
acesteia n fiola cu soluie-extender;
-agitarea uoar a fiolei pentru omogenizarea spermei cu diluantul.
1.7.1.5. Tehnica inoculrii spermei
Inocularea materialului seminal se realizeaz prin dou metode:
metoda colposcopic (sau cu speculul vaginal);
metoda tactil-recto-cervical (sau recto-vaginal).
Metoda colposcopic
Inocularea materialului seminal prin aceast metod se bazeaz pe
introducerea pipetei de nsmnare pe lumenul cervical, prin conductul vestibulovaginal tunelizat cu ajutorul unui specul bivalv, trivalv sau tubar. Unele modele de
specul tubar sunt prevzute cu surse propri de lumin. La celelalte modele, pentru
53

iluminarea conductului vaginal i a zonei pericervicale se ntrebuineaz o lamp

frontal sau lantern.
La inocularea spermei prin aceast metod se va proceda astfel:
- vaca n clduri se contenioneaz ntr-un stand i se execut toaleta
organelor genitale externe cu ap i spun;
- speculul vaginal, dezinfectat, nclzit i lubrifiat cu vaselin neutr
sterilizat, se introduce cu partea lit n fanta vulvar. Introducerea se face din
jos n sus, ntr-un unghi de aproximativ 35-40oC, prin micri uoare i repetate n
plan vertical, asociat cu mpingerea prudent ctre nainte. Dup introducerea
complet a speculului, se efectueaz o rotire de 90oC (pentru speculul trivalv)
dup care se ndeprteaz valvele;
- se lumineaz conductul vestibulo-vaginal cu ajutorul lmpii frontale sau
a sursei proprii de lumin;
- se examineaz conductul vestibulo-vaginal, floarea involt i se
localizeaz deschiderea cervical, dup care se introduce pipeta de nsmnare n
conductul cervical;
- depunerea spermei se face n partea anterioar a cervixului prin presarea
ntre degete a suzetei sau prin apsarea tijei piston urmat de un uor masaj
clitoridian.
Avantaje:
- posibilitatea examinrii mucoasei vestibulo-vaginale i cervicale i buna
observare a caracteristicilor mucusului cervical;
- permite localizarea cu uurin a cervixului;
permite depistarea unor eventuale anomalii sau afeciuni ale vaginului i
cervixului;
- este mai estetic i mai comod pentru operator.
Dezavantaje:
- necesit contenionarea femelelor ntr-un stand special pentru
nsmnare;
- impune dezinfecia speculului pentru a se evita transmiterea germenilor
patogeni de la un animal la altul;
- prin aplicarea acestei metode nu se obin informaii privind starea
uterului i a ovarelor, stadiul de evoluie al foliculilor ovarieni etc;
- introducerea speculului cu brutalitate creaz reflexe de inhibiie sau poate
stresa animalul. Datorit acestor dezavantaje, aceast metod este mai puin
folosit n prezent.
Metoda tactil-recto-cervical (recto vaginal)
Impropriu denumit i bimanual, aceast metod este aproape
generalizat n practica nsmnrilor artificiale la taurine. Aceast metod,
sigur i eficace, permite executarea nsmnrii la animalele legate la iesle, n
grajd, n adposturi cu stabulaie liber sau n padocuri. Se deosebete de metoda
colposcopic prin aceea c depunerea materialului seminal n organele genitale
femele se realizeaz numai cu ajutorul pipetei (pistoletului) de nsmnare, fr a
folosi speculul vaginal.
Metoda tactil-recto-cervical necesit ns o pregtire corespunztoare a
personalului autorizat s efectueze nsmnarea, care trebuie s cunoasc
topografia i modificrile morfofiziologice ale organelor genitale. Persoanele
neinstruite n acest scop pot cauza, prin manipulri brutale, rupturi, lezionri sau
perforri ale conductului genital, iar datorit necunoaterii topografiei organelor

54

genitale, materialul seminal poate fi depus ntr-un fald al mucoasei vaginale sau
pericervicale, ratndu-se n acest fel nsmnarea.
Inoculara materialului seminal prin aceast metod necesit efectuarea
urmtoarelor operaiuni:
- vidarea rectului, cu un uor masaj pentru eliminarea contraciilor rectale,
operaiuni care se efectueaz cu mna protejat de o mnu de polietilen;
- se apreciaz forma, topografia, dimensiunile, sensibilitatea i consistena
coarnelor i corpului uterin;
- se ndeprteaz labiile vulvare i se deschide vestibulul vaginal prin
compresiunea exercitat prin traversul rectului;
- se introduce pipeta printre labiile vulvare sub un unghi de 30-40oC n
conductul vaginal;
- se urmrete, cu mna introdus n rect, micarea de naintare a pipetei
pn la nivelul orificiului vaginal al cervixului, pentru a se preveni introducerea
vrfului pipetei ntr-un fald al mucoasei vaginale;
- dac uterul este normal, se continu naintarea pipetei prin cervix, dup
ce anterior, a fost localizat deschiderea acestuia cu ajutorul degetului mic de la
mna introdus n rect;
- se fixeaz cervixul, urmrind cu degetele trecerea vrfului pipetei pn
ce ptrunde n corpul uterin pe o distan de 2-3 cm;
- materialul seminal se depune la extremitatea anterioar a cervixului i n
corpul uterin prin compresarea suzetei ntre degete sau mpingerea tijei-piston;
- inocularea spermei prin
aceast metod se ncheie prin
efectuarea unui uor masaj
clitoridian pentru a se preveni
spasmul uterin i a facilita
descrcrile hormonale necesare
ascensiunii spermatozoizilor pe
traiectul cilor genitale femele
(foto. 17).
n unele cazuri se poate
practica
nsmnarea
tactilcervical,
care
const
n
introducerea unei mini protejate
de o mnu n conductul
Foto 17 Inocularea spermei la vac
vestibulo - vaginal, reperarea
prin metoda tactil recto cervical
cervixului, iar cu cealalt mn
se introduce cu precauie, pipeta de nsmnare pn la nivelul orificiului
cervical.
1.7.2. Inocularea spermei la oaie i capr
1.7.2.1.Organizarea punctului de nsmnare artificial
la ovine (P.I.A.O.)
Organizarea i desfurarea aciunii de nsmnare artificial la ovine i
caprine se realizeaz sub coordonarea i ndrumarea Direciilor Judeene de
Ameliorare i Reproducie i a Centrelor teritoriale de profil, care asigur dotarea
i funcionarea laboratorului de recoltare, prelucrare i difuzare a materialului
seminal i a punctelor de nsmnare artificial. (P.I.A.O. i P.I.A.C.). Punctele
de nsmnri artificiale sunt amplasate astfel nct efectivele de oi pe care le
55

deservesc s nu se deplaseze la punat pe o raz mai mare de 1,0-1,5 Km. De

altfel, aciunea de nsmnare artificial se pregtete temeinic cu cel puin 1,52,0 luni de zile nainte de a fi declanat campania i se va desfura pe durata a
cel puin dou-trei cicluri de clduri (45-50 de zile).
n ara noastr, este rspndit nsmnarea artificial cu sperm brut sau
diluat, motiv pentru care, n aceeai unitate trebuie s se gsesc, pe lng
efectivul de femele i efectivul de berbeci pepinieri, donatori de material seminal
pentru efectuarea nsmnrii oilor. Berbecii folosii la nsmnri artificiale
sunt alei dintre:
- cei provenii din import, cu certificat de origine i productivitate;
- cei testai ca amelioratori aparinnd raselor importate i indigene zonate,
precum i exemplarele cu performane proprii superioare din efectivul valoros,
apreciate la bonitare.
Perioada de pregtire a berbecilor pepinieri dureaz circa ase sptmni i
const n asigurarea unei raii de hran adecvate cerinelor nutritive pentru
reproducie, aprecierea comportamentului sexual i a calitii spermei. Se asigura
cte un reproductor adult pentru 100 de femele n cazul nsmnrii cu sperm
brut i 300 de femele n cazul folosirii spermei diluate i conservat prin
refrigerare.
Pregtirea oilor i caprelor pentru campania de nsmnri artificiale
const n asigurarea unei furajri stimulative i difereniate, n funcie cu starea lor
de ntreinere.nrcarea oilor i caprelor mulgtoare se practic cu circa o lun
naintea declanrii campaniei de nsmnri artificiale prin ntreruperea treptat
a mulsului. Se verific i individualizarea femelelor, acolo unde este cazul
completndu-se crotaliile pierdute. Pe baza examenului individual, zootehnic i
sanitar-veterinar, se constituie loturile (turmele) pentru nsmnarea artificial,
avndu-se n vedere rasa, vrsta, starea de ntreinere. Mrimea unei turme trebuie
s fie de 300-400 oi.
Cu circa o lun naintea campaniei de nsmnri artificiale, oile i
caprele vor fi ntreinute pe puni bune, raia de baz fiind suplimentat cu
nutreuri concentrate, aa-numitul flushing care influeneaz pozitiv nivelul
indicilor de reproducie.
Efectivul mediu deservit de un P.I.A.O. este de 1000-1200 de femele, cu
durata aciunii pe perioada a 50-60 de zile. Pentru o bun activitate, P.I.A.O. sau
P.I.A.C. trebuie s dispun de urmtoarele spaii i utiliti: o camer pentru
laborator, un spaiu pentru recoltarea spermei i nsmnarea artificial a
femelelor descoperite n clduri, padocuri pentru berbeci ncerctori, oile depistate
n clduri, oile nsmnate artificial, berbecii pepinieri i arcurile n care se face
depistarea oilor i caprelor n clduri.
Laboratorul va fi dotat cu un minim necesar de aparatur pentru examenul
prelucrarea i refrigerarea spermei.
Camera de recoltare-nsmnare este dotat cu: un stand pentru contenia
oilor ce urmeaz a fi nsmnate, cu dimensiuni i tipuri constructive adaptate
acestei specii, vaginuri artificiale, autoclave pentru sterilizarea aparaturii folosite,
speculum vaginal, surs de lumin, materiale consumabile necesare.
1.7.2.2. Depistarea oilor i caprelor n clduri
Depistarea oilor n clduri constituie o activitate destul de complicat n
aplicarea biotehnologiei nsmnrilor artificiale.
56

Dificultile sunt datorate faptului c oile triesc n crduri mari, n care

sunt greu de urmrit individual. Semnele de estru sunt greu observabile pentru
om, comparativ cu semnele mult mai evidente manifestate la taurine i cabaline.
Izolarea oilor n clduri i recunoaterea lor pentru nsmnare artificial necesit
un mare volum de munc, dereglri ale activitii curente din ferm, fapt ce a
ngreunat, n multe ri, extinderea nsmnrilor artificiale la aceast specie.
nsmnarea artificial se bazeaz pe descoperirea oilor n clduri prin
intermediul berbecilor ncerctori.
Berbecii i apii ncerctori trebuie s aparin aceleiai rase cu femelele
care urmeaz a fi nsmnate. Acetia sunt autorizai i verificai sub raportul
calitii materialului seminal pentru a putea fi folosii i la monta, dup ncheierea
campaniei de nsmnri
artificiale, oilor care nu au rmas gestante i manifest estrul n afara intervalului
de timp alocat aa-numitei campanii de nsmnri artificiale. Alegerea oilor i
caprelor n clduri se face de dou ori/zi, dimineaa i seara, perioade din zi cnd
manifestarea cldurilor este mai intens, iar berbecii i apii sunt mai activi n
cutarea femelelor.
ncerctorul este un mascul cu reflexe sexuale bine exprimate, care este
introdus printre oile care urmeaz a fi nsmnate, ns este mpiedicat s
efectueze depunerea spermatozoizilor pe traiectul cilor genitale femele. Se
consider c femela este n clduri i este reinut pentru nsmnare artificial,
atunci cnd accept saltul berbecului sau apului, stnd linitit.
Se folosesc trei feluri de berbeci ncerctori i anume:
- berbeci normali, ns echipai cu un or care acoper furoul, mpiedicnd
ptrunderea penisului n vaginul oilor pe care execut saltul (fig. 5);
- berbeci cu penis deviat, la care, printro intervenie chirurgical, s-a schimbat
direcia penisului spre partea lateral a
corpului, astfel nct, s nu mai
ptrund n conductul vestibulovaginal; acetia s-au dovedit a fi mai
puin eficieni, deoarece imposibilitatea
ejaculrii le confer un anumit grad de
nervozitate I o mai slab eficien a
descoperirii oilor n clduri;
Fig. 5 Berbec ncerctor prevzut cu
ort
- berbeci vasectomizai, la care, tot chirurgical, s-a secionat epididimul sau
canalul deferent, blocndu-se astfel eliminarea spermatozoizilor din testicul, nct
pot monta, sperma fiind lipsit de spermatozoizi.
Pentru a asigura o rat optim de depistare a oilor n clduri, ncrctura
medie va fi de 30-40 de femele pentru un mascul.n vederea unei descoperiri cu
un volum mai redus de munc, berbecul ncerctor se echipeaz, n zona
pectoral, cu un cartu marcator special ce conine o vopsea lavabil, cartu, care,
n momentul saltului, vine n contact cu crupa femelei, iar la coborre vopsete
lna.n lipsa cartuului, oile depistate n clduri vor fi marcate cu ovisemn de
ctre personalul muncitor.
Femela se consider n clduri atunci cnd la apropierea berbecului sau
apului ia poziie campat, urineaz des i ntoarce capul spre flanc, se
imobilizeaz cnd masculul face saltul i caut berbecul sau apul.
Pentru descoperirea oilor in calduri, acestea se introduc in padoc impreuna
cu berbecii incercatori, modul de identificare fiind prezentat anterior. Dup ce
berbecii ncerctori nu mai sunt activi n descoperirea oilor n clduri, se retrag
din crd, se nchid separat i oile pornesc la punat.
57

Oile alese n clduri sunt inute ntr-un lot separat pn sunt nsmnate,
inclusiv pn se repet nsmnarea.
Un mijloc mai modern pentru provocarea i evidenierea estrului este
reprezentat de sincronizarea cldurilor prin diverse procedee prin intermediul
crora se poate determina inducerea cldurilor la un moment prestabilit (vezi
capitolul Sincronizarea estrului).
Aceasta nseamn c nsmnarea artificial se poate face, la oile supuse
tratamentului de sincronizare, fr a se mai efectua alegerea celor n clduri.n
funcie de tratamentul de sincronizare aplicat, nsmnarea tuturor oilor
sincronizate, se face dup un anumit interval de timp, de la ncheierea
tratamentului, strict prestabilit, cu rezultate satisfctoare.
1.7.2.3. Inocularea materialului seminal
Inocularea spermei brute, diluat i consevat prin refrigerare sau
congelare, se face prin trei metode:
- colposcopic (specul vaginal);
- vaginal (pericervical, fr specul);
- tactil cervical.
Lucrrile pregtitoare se refer la pregtirea aparaturii de inoculare,
inclusiv sterilizarea instrumentarului necesar, pregtirea locului de lucru.
Contenia oilor se poate realiza ntr-un stand cu orientare rabatabil ce permite
ridicarea trenului posterior al oii i la parapet sau gard, fixarea oii fcndu-se
cu/pe genunchiul unui ngrijitor. Mai rspndit este standul orizontal, aezat la sol
iar pentru mai mult comoditate, operatorul se poate aeza ntr-un an practicat n
spatele standului de contenie.
Pentru inoculare avem nevoie de o sering, alctuit dintr-un corp metalic,
piston i canul din sticl, pistonul fiind prevzut cu un cursor cu ajutorul cruia
se regleaz volumul dozei. Se mai folosesc i alte pipete de nsmnare, cu canula
schimbabil, semiautomat, cu o singur ncrctur putndu-se nsmna 20-30
de oi.n cazul folosirii paietelor cu material seminal congelat, dup decongelarea
acestora, paietele se introduc n pistoletul special construit, asemntor celui
folosit pentru taurine. Aparatura auxiliar const dintr-un specul vaginal, tri- sau
bivalv i o surs de lumin.
nsmnarea oilor se face imediat dup descoperirea n clduri i se repet
la interval de 7-12 ore.
Metoda colposcopic
Dup pregtirea instrumentarului,
femela n clduri se introduce n camera
de nsmnare i se contenioneaz n
stand. Se efectueaz toaleta regiunii perii vulvare i se aspir sperm n sering.
Speculul, sterilizat si nclzit la
temperatura de 38-39oC, se lubrifiaz cu
vaselin neutr, se introduce n conductul
vestibulo vaginal cu limea pe direcia
fantei vulvare. Dup introducerea cu
atenie, speculul se rotete cu 90o, se
deschide i se repereaz orificiul cervica
Fig. 6 Inocularea spermei la oaie
(fig. 6).
prin metoda colposcopic
58

n cazul folosirii spermei diluate, doza de nsmnare este de 0,2 ml, iar
cnd se face nsmnarea cu sperm brut, doza este de 0,1 ml pentru oi i capre
i de 0,2 ml pentru mioare. Numrul de spermatozoizi mobili/doz trebuie s
oscileze ntre 200-250 de milioane.
Femelele depistate n clduri se nsmneaz imediat cu repetare la 8-12
ore. Femelele cu cicluri prelungite (dou-trei zile) se nsmneaz n fiecare zi,
pe toat durata cldurilor.
Metoda vaginal (pericervical, fr specul) const n urmtoarea
tehnic:
-contenia femelei se face n
standul cu orientare rabatabil sau prin
simpla prindere a femelei de ctre
personalul ajuttor i ridicarea trenului
posterior;
- toaleta regiunii vulvare i
perivulvare;
-introducerea
pipetei
de
nsmnare intravaginal i prin
micri de tunelizare, rotire i
naintare pn la nivelul orificiului
cervical,
sperma
depunndu-se
pericervical (fig. 7).
Metoda tactil-cervical, n
Fig. 7 Inocularea spermei la oaie
care dirijarea canulei seringii de
prin metoda vaginal
inoculare spre orificiul cervical se face
cu ajutorul degetului arttor al operatorului, femela fiind ridicat de trenul
posterior.
Cnd se face nsmnarea artificial cu sperm brut, se folosete sperma
cu mobilitate de cel puin 70%, cu un volum minim al ejaculatului de 0,6 ml i o
concentraie de peste un miliard de spermatozoizi/ml.
nsmnarea artificial cu material seminal congelat se practic foarte
puin la aceste specii, ntruct rezultatele obinute sunt slabe. Pentru nsmnarea
artificial a oilor cu material seminal congelat, n prealabil trebuie s se fac
decongelarea, dup aceeai tehnic descris la taurine i apoi s se
inoculeze.nainte de nsmnare se face controlul mobilitii spermei, care trebuie
s fie de minim 35%.
Tehnica de inoculare a spermei decongelate este identic cu cea aplicat la
nsmnarea artificial cu sperm brut sau cu sperm refrigerat.
O paiet conine 0,5 ml sperm, respectiv dou doze de nsmnare, o
fiol conine circa 1 ml sperm (4-6 doze) iar o granul 0,1 ml (o doz).
1.7.3. Inocularea spermei la scroaf
1.7.3.1. Organizarea i dotarea punctului de nsmnare
artificial (P.I.A.S.) cu activitate complex
Optimizarea procesului de reproducie la porcine prin nsmnare
artificial presupune urmtoarea structur organizatoric:
- centrul de recoltare, prelucrare, conservare i difuzare a spermei,
organizat n cadrul Centrului de Reproducie i Selecie a Animalelor, atunci cnd
femelele sunt dispersate pe o zon mai extins, ceea ce necesit transportul
dozelor de sperm pn la proprietarul scroafelor;
59

- punctul de nsmnare artificial cu activitate complex: recoltare,

prelucrare i nsmnare artificial, n complexele de creterea suinelor, n uniti
i ferme familiale cu un efectiv de 300-400 de scroafe i scrofie de reproducie.
n ambele cazuri trebuie s existe spaii i utiliti necesare unei bune
activiti:
- compartimente comune pentru vierii tineri, candidai pepinieri i cu boxe
individuale pentru vierii folosii la reproducie (pepinieri);
- sala de recoltare, prevzut cu una sau mai multe boxe de recoltare,
instalaii cu duuri de mn cu ap cald, pentru toaleta general i local a
vierilor;
- laboratorul, dotat cu minim de aparatur i instrumentar, necesare pentru
operaiunea de recoltare, examenul, prelucrarea, ambalarea i conservarea
spermei;
- compartimente comune pentru scroafele n ateptare i individuale pentru
cele care trebuie nsmnate i nsmnate recent (dou-trei sptmni dup
nsmnare).
Sperma recoltat se examineaz n laborator, se dilueaz, repartizeaz n
doze (100 ml) i se conserv la temperatura de 15oC sau la 4-5oC. Sperma brut
proaspt, diluat sau diluat-refrigerat, se distribuie beneficiarilor, fiind
transportat n termosuri zootehnice, care menin o temperatur constant pn la
beneficiar (15oC sau 4-5oC).
1.7.3.2. Descoperirea scroafelor n clduri
Depistarea femelelor n estru se face pe baza semnelor clinice, a
manifestrii reflexului de imobilitate n prezena vierului ncerctor sau la
apsarea pe spate de ctre om i prin mijloace electronice bazate pe modificarea
caracteristicilor secreiilor vestibulo-vaginale (pH-ul i rezistena electric a
mucoasei vestibulo-vaginale).
Metoda cea mai simpl i cu bune rezultate const n prezentarea zilnic a
femelelor cu modificri ale organelor genitale externe i de comportament,
vierului ncerctor.n cazul n care scroafa accept saltul vierului, este sigur n
perioada de estru. Dac accept acest salt de la prima ncercare, momentul
declanrii estrului se stabilete prin media intervalului scurs de la controlul
anterior. Dac accept saltul vierului dup a doua sau a treia ncercare, debutul
estrului corespunde acestui moment. Cele mai bune rezultate se obin atunci cnd
sunt deplasate scroafele (5-10) n boxa vierului i nu invers.
n absena vierului ncerctor, starea de estru se poate stabili pe baza
modificrilor de comportament ale scroafelor (nelinite, grohituri caracteristice,
poft de mncare capricioas etc.) i ale organelor genitale externe (edemaierea i
congestia vulvei).
Un indiciu sigur al strii de estru este reprezentat de reflexul de imobilitate
al scroafei la presiunea exercitat de ngrijitor n regiunea lombo-sacral sau a
flancurilor, o proporie nsemnat (20-30%) nemanifestnd, totui, starea de
imobilitate n absena vierului.
1.7.3.3. Stabilirea momentului optim de nsmnare
nsmnarea scroafelor trebuie s se fac n momentul cel mai prielnic,
nct spermatozoizii s ajung la locul fecundaiei naintea descinderii ovocitelor
n urma dehiscenei foliculilor maturi. Cum ovulaia la scroaf are loc, n medie,
60

ntre 36 i 44 de ore de la debutul estrului, evideniat prin apariia reflexului de

imobilitate la saltul vierului, nsmnarea cea mai eficace se consider c trebuie
fcut dup un interval de 20-24 de ore de la manifestarea reflexului de
imobilitate. Acest aspect presupune ca aciunea de descoperire a scroafelor n
clduri s se desfoare cel puin de dou ori/zi, dimineaa i seara. Repetarea
nsmnrii se face cu scopul de a prinde ovulaiile i la scroafele cu o durat mai
mare a estrului. Cnd se fac dou nsmnri ntr-un ciclu de clduri, cel mai bine
este ca prima inoculare s se fac la 15-20 de ore de la depistare, iar a doua la
interval de 10-12 ore de la prima.n cazul depistrilor fcute de dou ori/zi (aa
cum se practic cel mai frecvent) scroafele la care s-a stabilit starea de estru
dimineaa, se nsmneaz n seara aceleiai zile, iar scroafele care au fost
depistate seara, prima nsmnare se face n dimineaa zilei urmtoare. Repetarea
nsmnrii se face, aa cum am menionat mai sus, dup 8-12 ore de la prima.
Dac se face o singur depistare/zi (dimineaa), prima nsmnare artificial
se face imediat dup stabilirea reflexului de imobilitate pentru vier i se repet dup
alte 24 de ore de la prima nsmnare (Feredean T.,1978). A treia nsmnare
artificial nu se recomand dect n cazul scroafelor cu clduri prelungite pn la 45 zile precum i pentru scroafele la care s-a constatat refularea spermei inoculat n
nsmnrile anterioare. Scroafele cu estru prelungit (superestru) se recunosc prin
prelungirea peste limita fiziologic a modificrilor organelor genitale externe i de
comportament specifice strii estrale, ct i prin prezena reflexului de imobilitate la
vier.n asemenea cazuri, a treia nsmnare artificial se poate face la interval de
10-12 ore de la a doua inoculare a spermei.
1.7.3.4. Aparatura i instrumentarul folosite pentru
nsmnarea artificial a scroafelor
Acestea sunt relativ simple.
La noi n ar, n marea practic, se
folosete instrumentar confecionat
din material plastic compus dintr-un
rezervor cu capacitate de 100 de ml si
un racord flexibil, care face legtura
cu un cateter (sond) semirigid, lung
de 35-40 cm, prevzut cu o oliv, sau
un adaptor tirbuonat la extremitatea
care se introduce n lumenul cervical.
Acest tip de cateter poate fi
substituit cu unul confecionat din
cauciuc,
cu
vrful
tirbuonat
refolosibil dup sterilizare (fig.8).
Rezultate bune se obin i cu
instrumentarul
de
provenien
japonez, compus dintr-o sering de
sticl cu o garnitur metalic i cu
piston din cauciuc semirigid cu
capacitate de 80 ml. La seringi se
ataeaz un cateter de cauciuc (40cm
lungime, 0,7-1,0 cm diametru). Tija
Fig. 8 Instrumentar pentru nsmnarea cateterului este confecionat dintrun cauciuc semirigid, prevzut la
scroafelor (dup O. Roca, 1994)
vrf cu o poriune mult mai elastic.
61

1.7.3.5. Inocularea spermei

Pentru nsmnarea artificial a scroafelor nu este necesar ca acestea s fie
contenionate, mai ales pentru prima inoculare, care, de regul, corespunde cu
reflexul de imobilitate .n unitile cu flux tehnologic industrial, dup depistare,
scroafele sunt meninute n boxe individuale, unde se nsmneaz i rmn pn la
un eventual ciclu de clduri (21 de zile). n cazul n care se folosete sperma brut,
dup examinarea mobilitii spermatozoizilor, se repartizeaz (prin simpla aspirare)
n recipientele din material plastic, ntr-un volum de 50 ml, iar recipientul, printr-un
tub de legtur din material plastic se adapteaz la un cateter.
Cnd se folosete sperma diluat, dup diluie este aspirat n recipientele
din material plastic, sau n cazul seringilor, aspirat cu ajutorul acestora.
Recipientul cu sperm se pstreaz o perioad scurt de timp, ntr-un
termos sau ntr-o etuv reglat la 35-37oC. Pentru fiecare scroaf, se folosete
sperma dintr-un recipient, care se scoate din termos sau etuv numai n momentul
inoculrii.n cazul folosirii spermei diluate i conservate la temperatura de 15oC
sau la 4-5oC, dozele cu material seminal se renclzesc la 35-37oC i se menin n
termos sau n vas cu ap cald pn n momentul inoculrii. Operaiunea se face
cu puin timp nainte de inoculare, iar dozele se extrag din termos numai n
momentul nsmnrii. Se execut toaleta vulvei i a regiunii perivulvare cu un
tampon de vat mbibat ntr-o soluie
dezinfectant, cateterul se lubrifiaz
cu vaselin neutr i se introduce n
conductul vestibulo-vaginal, uor
orientat n sus, pentru a nu fi introdus
n meatul urinar (fig. 9). Cnd vrful
cateterului
ajunge
la
nivelul
cervixului, se rotete uor spre stnga
n vederea fixrii ct mai bine n
conductul cervical (mai ales cateterele
tirbuonate). Recipientul cu sperm
se adapteaz la cateter, prin
intermediul tubului de plastic, apoi se
preseaz uor pereii acestuia,
sincronizat cu timpii de relaxare a
Fig. 9 Schema inoculrii spermei la
musculaturii cervicale, eliminarea
scroaf (dup O. Roca, 1994)
ntregii doze de sperm durnd unudou minute. Doza de material seminal este de 100 ml sperm diluat sau de
50 ml sperm brut i un numr de 3-5 miliarde de spermatozoizi/doz.
n cazul folosirii spermei conservate prin congelare, dozele cu sperm
trebuie decongelate la o temperatur de 37-40oC, asemntor dozelor cu sperm
de la rumegtoare, apoi se inoculeaz ca atare sau completate cu un diluant nainte
sau imediat dup inoculare, funcie de recomandrile care nsoesc dozele de
sperm congelate (paiete, tuburi, granule).
1.7.4. Inocularea spermei la iap
Sperma de armsar poate fi inoculat sub form brut (imediat dup
recoltare), diluat, proaspata sau conservat prin refrigerare sau congelare.
Decongelarea tuburilor de sperm se face prin scoaterea lor din container
i trecerea ntr-o baie-marie, la temperatura de 40oC, timp de 45-50 de secunde.
62

Dup deschiderea tubului la unul din capete, se introduce vrful canulei sau
sondei n tub i se aspir sperma, care se inoculeaz ntr-un interval de timp ct
mai scurt.
Decongelarea granulelor se face prin introducerea lor ntr-un diluant,
meninut la temperatura de 40oC. Dup diluare, se aspir sperma ntr-o sering
special de nsmnare i se depune pe traiectul cilor genitale ale iepelor n
clduri.
Instrumentarul pentru inoculare este constituit din sonde, confecionate din
material plastic i conectate la seringi sau recipieni din material plastic. Se mai
pot folosi diverse pipete din sticl, lungi de 50cm i cu un diametru de 4cm,
catetere sau canule din cauciuc. Ca instrumentar ajuttor este necesar un specul
vaginal i o surs de lumin
Inocularea spermei la iap ridic probleme legate de momentul inoculrii
n perioada de clduri, moment care se stabilete cu mult greutate n practic.
Exist numeroase oscilaii ale duratei ciclului sexual la iap, funcie de
ras, clim, tehnologie de cretere, exploatare, alimentaie, zooigien etc.
Iapa n clduri adopt frecvent poziia campat (specific montei),
urineaz puin i des, deschide i nchide succesiv vulva, cu proiectarea
clitorisului n afar, este nelinitit, foarte sensibil, uneori devenind retiv.
n herghelii, depistarea iepelor n clduri se face prin intermediul
armsarilor ncerctori la bara sau peretele de ncercare. Aici, se aduce armsarul
i dac iapa este n clduri, va manifesta comportamentul sexual menionat i nu
va ncerca lovirea armsarului. Msurile de protecie a muncii i a armsarului
impun obligatoriu verificarea iepelor n clduri la bara sau peretele de ncercare,
altfel, iapa poate lovi armsarul cu membrele posterioare, provocnd leziuni grave
sau chiar fracturi ale membrelor care impun sacrificarea animalelor.
Iapa care urmeaz a fi nsmnat, se contenioneaz cu ajutorul
platlonjelor i iavaalei sau se introduce ntr-un stand special (travaliu).
Inocularea materialului seminal presupune introducerea extremitii libere
a sondei cateterului sau pipetei prin canalul cervical pn la nivelul cavitii
uterine unde urmeaz a fi depus. Inocularea spermei se face prin dou metode:
colposcopic sau cu speculul vaginal;
manual sau tactil cervical.
Metoda colposcopic pentru depunerea spermei la nivelul cavitii uterine
a iepei n clduri, necesit folosirea canulei sau cateterului adaptat la sering,
speculum vaginal, surs de lumin.
n prealabil, se face toaleta vulvei i a regiunii perivulvare cu ajutorul unui
tampon de vat sau tifon mbibat n soluie dezinfectant. Operatorul nsmntor
deprteaz pereii vaginului cu ajutorul specului vaginal i apoi intruduce cateterul
sau vrful sondei printre valvele speculului vaginal, prin canalul cervical, 10-12
cm i apoi se depune sperma.
Metoda manual (tactil-cervical) presupune dirijarea vrfului sondei sau
canulei n canalul cervical, cu ajutorul minii introdus n vagin, mna fiind
protejat de o mnu din material plastic i lubrifiat cu vaselin neutr. Dup
reperarea orificiului vaginal al cervixului, vrful sondei este dirijat n lungul
degetului arttor, pe o lungime de 10-12 cm prin canalul cervical n cavitatea
uterin. Prin apsarea recipientului cu sperm sau pe pistonul seringii, sperma se
depune n uter. Prin aplicarea acestei metode exist riscul infectrii mucoaselor
vaginale i cervicale cu flora microbian introdus n timpul explorrii vaginale.
Doza de material seminal brut conine minim 0,5 miliarde spermatozoizi
mobili iar volumul spermei brute este de 20 ml, iar a celei diluate 40-50 ml.
Inocularea spermei se face imediat ce iapa a fost depistat n clduri cu
repetare din dou n dou zile pn la ncheierea perioadei estrale, avnd n vedere
63

c durata medie a estrului este de 4-5 zile cu variaii cuprinse ntre 4 i 9 zile.ntro perioad estral, de regul se fac dou-trei nsmnri, la intervalul de timp
menionat.
Sperma proaspt ca i cea conservat prin refrigerare se admite pentru
nsmnare artificial numai atunci cnd are o mobilitate minim de 60%, iar
sperma congelat, o mobilitate minim de 35-40%.
Avnd n vedere scopul creterii cabalinelor, mai ales pentru curse, n
unele ri, nsmnarea artificial la aceast specie este interzis, fiind acceptat
numai n cazul experienelor ntreprinse n centrele de cercetare (Frana).
1.7.5. Inocularea spermei la psri
Inocularea spermei se face cu scop de cercetare, selecie, ameliorare i
practic. Psrile pot fi nsmnate artificial numai n perioada de ouat, n afara
acesteia, cloaca i oviductul neputnd fi exteriorizate.
La gini i curci, nsmnrile artificiale pot fi utilizate singure sau
combinate cu mperecherea natural.
Organizatoric, activitatea de nsmnare artificial la gini, parcurge trei
etape (Sauveur B. i colab., 1988).
Etapa I-a const n recoltarea, condiionarea i inocularea spermei.
Etapa a II-a necesit mai multe mii de femele i efectivul de masculi
necesar nsmnrilor artificiale. Prin aceasta se urmrete intrarea ntr-un anumit
program i ritm de munc suficient de rapid pentru a nsmna 250-300 de
femele/or/persoan, ceea ce presupune o bun organizare a muncii.
Etapa a III-a se refer la extinderea nsmnrilor artificiale la o scar
mai mare cu asigurarea unui ridicat nivel de fecunditate i permanentizarea
personalului care deja s-a specializat n efectuarea nsmnrilor artificiale.
Dac se practic nsmnarea cu sperm brut, aceasta se pstreaz n
tubul, fiola colectoare iar atunci cnd se dilueaz, soluia cea mai simpl este cea
de a recolta sperma direct n fiolele care conin cantitatea necesar de diluant.
Inocularea spermei presupune folosirea unei aparaturi extrem de simple,
format n principiu, dintr-o sering din material plastic, cu capacitatea de 1 ml,
divizat n 100 de pri, la care se ataeaz o canul din material plastic, cu o
lungime de 6-8 cm.nsmnarea artificial poate fi executat i cu ajutorul unei
seringi gradate, tip insulin i echipat cu o canul adecvat, sau sperma poate fi
ambalat n paiete din material plastic care conin ntre 10 i 50 de doze.
Cantitatea de sperm brut care se inoculeaz este de 0,05-0,1 ml la gini i de
0,03 ml la curci. Se mai folosete i inocularea cu material seminal diluat i
congelat, aa cum s-a specificat la diluarea i conservarea spermei.
Timpul optim de nsmnare la psri se refer la perioada sau chiar ora
din zi, n funcie de ovulaie i formarea oului pe traiectul oviductului. Cele mai
bune rezultate la curc se obin n cazul nsmnrii efectuate n a doua parte a
zilei (orele11-17). La rae, n schimb, cele mai bune rezultate s-au obinut n urma
nsmnrii efectuate ntre orele 9-11 dimineaa (Besulin, 1974; Davtian i
colab., 1974 citat de I. Dumitrescu i colab.). Printre factorii care influeneaz
rezultatele inoculrii spermei la psri, cei legai de organismul femelei au o
importan deosebit, n specificul activitii zilnice i rolul complex al cilor
genitale la psri. Rezerva de spermatozoizi n oviductul ginii este util pentru
aproximativ o sptmn.

64

Tehnica inoculrii spermei

La gini, inocularea spermei necesit aportul a dou persoane: una
contenioneaz, iar cealalt efectueaz nsmnarea propriu-zis. Gina este
prins cu mna stng de fluiere i ridicat la nivelul pieptului. Cu mna dreapt
se rsfrnge coada pe spate i prin apropierea psrii de pieptul operatorului,
coapsele ginii preseaz abdomenul i provoac deschiderea cloacei. Cu degetul
mare al minii drepte se faciliteaz deschiderea oviductului pe partea stng a
cloacei (G. Bltan i colab., 1969).
Dup evidenierea oviductului, operatorul nsmntor introduce canula
de la seringa de nsmnare pe o adncime de 2-3 cm i inoculeaz ntreaga
cantitate de sperm, dup care presiunea asupra abdomenului nceteaz.
Evidenierea oviductului se mai poate realiza i prin contenia ginii sub
braul stng i apsnd abdomenul psrii spre cloac. Presarea se face pn la
ieirea oviductului afar sub forma unui deget de mnu ntors spre vrf. Cel de
al doilea operator execut nsmnarea la 1-3 cm de deschiderea oviductului (M.
Pop, 1963).
Pentru ginile crescute n baterii, ngrijitorul prinde pasrea de picioare i
o contenioneaz cu partea posterioar spre deschiderea cutii sprijinind pieptul
acesteia spre marginea bateriei. Cu mna stng ndoaie uor coada pe spate.
Operatorul nsmntor apas cu mna la baza cloacei, provocnd prolabarea
oviductului, iar cu mna dreapt introduce canula n oviduct i inoculeaz doza de
sperm la o distan de 5-6 cm (tefnescu i colab.,1974).
La curci, tehnica de inoculare, n general, este asemntoare cu cea
folosit la nsmnarea ginilor. Dup contenionarea curcii i evidenierea
deschiderii oviductului, sperma se depune pe lumenul oviductului la 4-5 cm de la
deschiderea posterioar.

65

NTREBRI RECAPITULATIVE
1. Care sunt principalele avantaje ale aplicrii nsmnrilor artificiale la
animale?
2. n ce const organizarea i conducerea activitii pe linia nsmnrilor
artificiale n ara noastr?
3. Care sunt etapele seleciei masculilor de reproducie?
4. Ce semnific spermograma?
5. Enunai principiile dilurii spermei i detaliai tehnicile de diluare a spermei
animalelor.
6. Care sunt avantajele i dezavantajele conservrii spermei la diferite niveluri de
temperatur?
7. Care sunt metodele de inoculare a spermei la animalele domestice?
TEME
1.
2.
3.
4.
5.

Studiul aparaturii de recoltare a materialului seminal la rumegtoare,

cabaline, suine i psri
Principiile i tehnicile controlului spermei. ntocmirea spermogramei
Diluia materialului seminal n vederea conservrii la temperatura
laboratorului, prin refrigerare i congelare
Modaliti de conservare a spermei la rumegtoare, cabaline, suine i
psri
Inocularea spermei

REFERATE
1.
2.
3.
4.
5.

Biotehnologia nsmnrii artificiale la vac

Biotehnologia nsmnrii artificiale la oaie i capr
Biotehnologia nsmnrii artificiale la scroaf
Biotehnologia nsmnrii artificiale la iap
Biotehnologia nsmnrii artificiale la psri

66

CAPITOLUL II
BIOTEHNOLOGIA TRANSFERULUI DE EMBRIONI LA ANIMALE

2.1. Importana transferului de embrioni

Importana transferului de embrioni poate fi zooeconomic i tiinific.
Importana zooeconomic. Lucrrile de selecie i ameliorare a
efectivelor de animale sunt limitate de numrul redus de produi care se obin de
la o femel n cursul vieii sexuale i de intervalul dintre generaii. Transferul de
embrioni d posibilitatea folosirii cu eficien crescut a rezervelor de ovocite de
la animalele de nalt valoare zootehnic numite donatoare, prin provocarea
maturrii i eliberrii mai multor gamei femeli (poliovulaie) cu obinerea unui
numr mai mare de produi de la aceeai femel prin transferul embrionilor n
uterul femelelor receptoare. Astfel, n decursul vieii sexuale este valorificat doar
o infim parte din rezerva de ovocite cu care femela ajunge la maturitatea sexual.
De exemplu, vaca ncepe perioada genital cu o rezerv de circa 150000 de
ovocite ( n ambele ovare), rezerv care diminu la circa 21000 la vrsta de 2-3
ani i la circa 2500 la 12-14 ani. Numrul de ovocite eliberate n ntreaga via
sexual nu depete 50, din care n condiii normale rezult maxim 10-12 viei.
Prin asigurarea numrului corespunztor de animale primitoare, de la vacile
donatoare se pot obine, n medie 3-4 viei pe an, fiind cunoscute cazuri cnd n
condiii de supraovulaie, de la o vac donatoare s-au obinut 30-35 viei.
Transferul de embrioni se practic i pentru scurtarea intervalului dintre
generaii. Prin instalarea gestaiei, femela intr n repaus productiv (sub raportul
procreerii) pe ntreaga durat a gestaiei. n cazul practicrii transferului de
embrioni, produii de concepie sunt transferai n alte organisme, ceea ce d
posibilitatea obinerii de noi produi de la aceeai femel n intervalul de timp n
care n mod normal, ar fi trebuit s fie gestant.
Mai mult, n prezent se pot obine gamei i de la tineretul femel prepuber
prin provocarea prin mijloace hormonale a maturrii i expulzrii ovocitelor, care
vor fi apoi transferate n uterul femelelor receptoare. Scurtndu-se mult intervalul
dintre generaii, se accelereaz ameliorarea efectivelor de animale.
Transferul de embrioni reduce considerabil costurile de transport, carantin
i eventualele restricii sanitar-veterinare n comerul cu animale, prin conservarea
prin congelare a embrionilor. Totodat, prin practicarea transferului de embrioni,
se pot obine produi de la femelele valoroase dar cu diverse afeciuni genitale
incompatibile cu meninerea gestaiei sau cu parturiia.
De asemenea, prin transferul de embrioni se reduce intervalul de timp
necesar crerii de noi rase de animale cu nsuiri morfo-productive performante
care pot forma linii de femele consangvine n vederea folosirii lor la ncruciri
industriale.
n sintez, n practica de producie, transferul de embrioni se aplic pentru
rezolvarea urmtoarelor probleme:
- reproducerea accelerat a animalelor de prsil, de calitate superioar, a raselor
rare, a animalelor din rezerva genetic a purttoarelor unor nsuiri valoroase

67

(producii ridicate, capacitate de utilizare intens a furajelor, prolificitate mare,

longevitate productiv, rezisten la anumii factori nefavorabili etc.);
- obinerea unui numr mare de descendeni de la femelele cu producii ridicate i
cu durat prelungit de exploatare, n vederea crerii de familii cu aceste nsuiri;
- raionalizarea importului i exportului animalelor valoroase, ca urmare a
transportului embrionilor congelai, nlturndu-se astfel barierele sanitarveterinare i nlesnirea aclimatizrii materialului importat, dezvoltarea lui
embrionar avnd loc n organismul primitoarelor;
- obinerea de embrioni liberi de leucoz cu posibilitatea transferului acestora
femelelor leuco-negative;
- crearea unor bnci de embrioni n vederea pstrrii raionale a rezervelor
genetice, ceea ce este mai economic dect ntreinerea unor efective numeroase
din rezerva genetic.
Importana tiinific
Transferul de embrioni reprezint o biotehnologie prin intermediul creia
se poate efectua, n condiii optime, un aprofundat studiu tiinific al proceselor
intime legate de fecundaie i de influenele matern i patern asupra produsului
de concepie. Totodat, poate fi studiat dezvoltarea embrionar la animale,
diversele abateri de la dezvoltarea normal, cauzele i factorii care genereaz
mortalitatea embrionar.
Produii obinui prin transferul de embrioni permit studierea influenelor
factorilor genetici i ai mediului extern asupra dezvoltrii embrionilor, ereditatea
grupelor sanguine, obinerea de animale mozaic de gene, a concentrrii mai
multor caractere pe acelai individ, a instituirii unei profilaxii i terapeutici
genetice pentru unele boli de metabolism. Pe aceeai linie, transferul de embrioni
reprezint baza unei noi generaii de biotehnici care deriv din aceasta sau i sunt
asociate: bisecia embrionilor, sexajul, fecundaia in vitro clonarea, transferul de
gene, iar ingineria genetic folosete ca verig important, n metodologie, aceast
biotehnologie.
Micromanipularea i microchirurgia ovocitelor i a embrionilor permit
desfurarea unei cercetri tiinifice interesante, i obinerea din punct de vedere
practic a unor nalte performane n reuita transferului de embrioni, prin
transferul jumtilor de embrioni.
Sexul embrionului poate fi precizat cu mult acuratee, baza investigaiei
fiind dat de transferul embrionilor.
Reproducerea, fr contribuia genetic a partenerului, se poate realiza prin
ginogenez, fiind deja obinui primii oareci homozigoi, (Groza I., 1996).
Aspecte similare ridic androgeneza n care se poate induce bispermia, adic
ptrunderea n ovul a doi spermatozoizi, cu retragerea ulterioar a pronucleului
femel i n consecin diviziunea va continua numai n zona masculin (Groza I.,
1996).
2.2. Biotehnologia transferului de embrioni la vac
La bovine, transferul de embrioni a devenit o biotehnologie de reproducie
larg rspndit n lume. Tehnicile de lucru sunt foarte bine stpnite, astfel nct
aceast modern biotehnologie poate fi extins la aproape toate fermele de
creterea vacilor din lume. Astfel, n Europa se obin anual circa 100000 de

68

produi prin transfer de embrioni, iar pe plan mondial circa 300000 de produi,
extinderea biotehnologiei fiind limitat de costurile destul de ridicate.
Transferul de embrioni constituie, totodat, baza unei noi generaii de
biotehnici, care deriv din aceasta sau i sunt asociate, cum ar fi: bisecia
embrionilor, sexajul, fecundaia ,,in vitro, clonarea, transferul de gene.
Transferul de embrioni presupune parcurgerea urmtoarelor etape (fig. 10):
selecia i pregtirea vacilor donatoare; selecia i pregtirea vacilor primitoare
(receptoare); sincronizarea estrului i ovulaiei la vacile donatoare i primitoare;
inducerea poliovulaiei i nsmnarea artificial a vacilor donatoare; recoltarea
embrionilor; conservarea embrionilor; transferul embrionilor.
SELECIA DONATOARELOR

SELECIA RECEPTOARELOR

TRATAMENTUL DE SUPEROVULARE
PMSG
-

tipul

FSH-p
doza
schema de administrare
SINCRONIZAREA CICLULUI
SEXUAL CU AL
DONATOARELOR
I.A. A DONATOARELOR

RECOLTAREA EMBRIONILOR

CONSERVAREA EMBRIONILOR

TRANSFERUL EMBRIONILOR

Fig. 10 Schema transferului de embrioni la animale

2.2.1. Selecia i pregtirea vacilor donatoare
Vacile donatoare de embrioni trebuie s ntruneasc la cel mai nalt nivel
caracterele zootehnice care intereseaz. De aceea, cnd se face selecia
donatoarelor, se are n vedere evaluarea urmtoarelor criterii: performana
reproductiv, superioritatea genetic i valoarea produsului obinut prin transfer
embrionar.
Vaca donatoare va fi mai performant reproductiv atunci cnd vrsta se
situeaz ntre 3 i 10 ani, a nscut anual cte un viel, a rmas gestant n maxim
dou cicluri sexuale, ciclurile de clduri au o succesiune fiziologic i nu a avut
antecedente ginecologice (distocii, retenii placentare, infecii genitale etc.).
Practic, criteriile care se au n vedere sunt: o stare ginecologic perfect, intervalul
dintre parturiie i primul estru s fie mai mic de 60 de zile, intervalul parturiie-

69

nsmnarea fecund s fie mai redus de 80 zile iar indicele de gestaie s fie mai
mic de 1,5.
Superioritatea genetic const ntr-un ritm superior de cretere, nainte i
dup nrcare i un randament ridicat la sacrificare. n cazul vacilor de lapte,
nsuirile cu heritabilitate ridicat se refer la producia de lapte, procentul de
grsime din lapte i conformaia corporal.
Vacile donatoare trebuie s fie sntoase, ele suportnd mai multe
intervenii de supraovulare i recoltare de embrioni. O atenie deosebit trebuie s
se acorde alimentaiei raionale a acestei categorii de vaci.
2.2.2. Selecia i pregtirea vacilor primitoare (receptoare)
Vacile receptoare de embrioni trebuie s fie sntoase, fr afeciuni
ginecologice, s aib aceeai talie cu donatoarele, s fie apte s nasc descendeni
cu aceeai greutate la natere ca donatoarele, avndu-se n vedere c gestaia
constituie un fenomen morfo-fiziologic complex ce presupune eforturi
suplimentare deosebite din partea organismului matern.
Cele mai bune rezultate se obin atunci cnd transferul de embrioni se face
la tineretul femel n vrst de 18-20 de luni.
2.2.3. Sincronizarea estrului i ovulaiei la vacile donatoare i
primitoare
Sincronizarea ciclului sexual la vacile donatoare i receptoare de embrioni
se poate realiza pe cale natural sau medicamentoas.
n cazul sincronizrii femelelor prin mijloace naturale se urmresc, n lotul
receptoarelor femelele care n mod spontan manifest estrul n acelai timp cu
donatoarele. Principalul dezavantaj const n fapul c sunt necesare multe animale
receptoare n ateptare. Aceast modalitate de sincronizare s-a practicat n
perioada de nceput a transferului de embrioni, cnd s-au folosit pentru transfer
embrionii proaspt recoltai. n aceast situaie, n aceeai unitate trebuia s fie i
vaci donatoare i receptoare, iar transferul embrionilor trebuia s se realizeze ntrun timp relativ scurt (4-6 ore de la recoltare).
Sincronizarea estrului prin mijloace medicamentoase se bazeaz pe faptul
c se urmresc succesiv dou-trei cicluri de clduri la vacile donatoare i se
stabilete durata ciclului. n acest fel se poate calcula data apariiei ciclului care
intereseaz n transferul de embrioni. n funcie de data previzibil, se acioneaz
prin tratamente hormonale asupra unui grup de femele primitoare n vederea
inducerii cldurilor, sincronizate cu cldurile naturale ale donatoarei. n acest caz
se acioneaz asupra donatoarei numai n ceea ce privete inducerea poliovulaiei.
Sincronizarea medicamentoas a ciclului estral al femelelor donatoare i
receptoare de embrioni se realizeaz pe dou ci: blocarea eliberrii hormonilor
gonadotropi sau prin inducerea luteolizei.
Prima cale presupune folosirea progesteronului, sau a progestinelor
sintetice care prin retroaciune i exercit efectul negativ asupra hipotalamusului,
diminund nivelul hormonilor gonadotropi. (Vezi capitolul Sincronizarea
estrului).

70

2.2.4 Inducerea poliovulaiei i nsmnarea artificial

a vacilor donatoare
Provocarea eliberrii concomitente la aceeai perioad de clduri a unui
numr sporit de ovocite dect cel caracteristic speciei se numete poliovulaie
(supraovulaie, superovulaie) si este asigurata prin multiple scheme de tratament.
Tratamentele actuale aplicabile in vitro se sprijin pe cunoaterea
mecanismelor foliculogenezei, a efectului tonic al hormonilor gonadotropi (FSH,
LH) care intervin ndeosebi n ultima faz a creterii i maturrii foliculare.
Potenialul ovarian de foliculi teriari (cu antrum) rmne relativ constant (ns
variabil cu individul) de la vrsta de dou luni pn la 12 ani (Nibart M., 1991).
Fiziologic, la vac, un singur folicul ajunge la maturitate n preajma ovulaiei, n
timp ce, n timpul unui ciclu sexual, 10-20 de foliculi degenereaz. Injecia unui
hormon cu activitate de FSH mpiedic atrezia unor foliculi i stimuleaz
dezvoltarea i maturarea simultan a mai multor foliculi teriari, n cursul aceluiai
ciclu estral.
n prezent, dou scheme clasice de tratament poliovulator sunt aplicate,
ambele bazate pe efectul foliculo stimulant al hormonilor gonadotropi: serul
gonadotrop de iap gestant, liofilizat i standardizat - PMSG (Pregnant Mare
Serum Gonadotropin) denumit i Ecvin Chorionic Gonadotropin (ECG), produs
de celulele corionice ale iepei gestante si hormonul de stimulare folicular (FSH)
extras din hipofiza anterioar.
PMSG se extrage din serul sanguin al iepei gestante i are o dubl
activitate: de tip FSH i LH, raportul FSH/LH variaz de la 1/1 la 1/5 (Saumande
J., 1987). Perioada de njumtire destul de lung - 120 ore - a acestui hormon
determin o uurin n folosire, o singur injecie de 2000-2500 U.I. i.m. fiind
eficient n provocarea poliovulaiei. La dou-trei zile de la injectarea PMSG se
administreaz i.m. o doz de 500-750 g prostaglandin F2, cldurile aprnd la
circa 48-60 de ore de la injectarea prostaglandinei. Folosirea PMSG antreneaz i
unele efecte negative traduse prin creterea folicular i secreia ridicat de
estradiol i dup descrcarea preovulatorie de LH. Acest efect negativ poate fi
contracarat prin injectarea i.v. a unui anticorp anti PMSG concomitent cu prima
sau cea de a doua nsmnare artificial (de ex. Neutra -PMSG intervet).
Fecundarea ovocitelor se face, de regul, prin nsmnarea artificial a
vacilor la un interval de 12 ore de la nceputul estrului cu repetare la 8-12 ore
interval.
FSH se prepar din extractele purificate parial, provenite din hipofiza
mamiferelor - n principal de suine - care conine FSH i LH. Coninutul n cei doi
hormoni i raportul dintre acetia variaz cu lotul. Perioada de njumtire foarte
scurt (circa 70 minute a acestui hormon necesit injectarea lui bicotidian timp de
4 zile, n vederea meninerii unui nivel sanguin suficient de ridicat. Funcie de
preparatul comercial, raportul dintre FSH i LH, de regul variaz de la 1 la 0,5.
Dozele totale care se administreaz, n vederea producerii poliovulaiei, variaz de
la 28 mg la vielele de lapte, la 40 mg pentru vaci, injeciile fcndu-se n ritm
descresctor, intramuscular sau subcutanat.
Preparatele care conin aceti hormoni au denumiri care difer cu unitatea
productoare: FSH-p, Stimufol, Ovaset, Follitropin, Superov, Ovagen, Pluset etc.
Ca i cealalt schem de tratament, injectarea prostaglandinei F2, n doz
de 500-750 g se face la 48-72 de ore de la nceperea tratamentului, estrul
aprnd la circa 50-60 ore de la injectarea prostaglandinei. Fecundarea ovocitelor
se face prin nsmnarea artificial a femelelor supraovulate de dou ori, la 12 i
24 ore de la apariia estrului.
71

Scheme de tratament pentru inducerea poliovulaiei

Preparatele medicamentoase care conin hormoni gonadotropi sunt
injectate n faza luteal a unui ciclu natural sau indus, cel mai frecvent ntre ziua a
9-a i a 13-a. Dou zile dup injecia de PMSG sau concomitent cu a 5-a injecie
de FSH, se injecteaz un analog de PGF2 (de ex. 0,5-1 mg Cloprostenol) care are
efect luteolitic permind ovulaiile (fig. 11 i 12).
POLIOVULA}IE
FSH p

ANTILUTEOTROP

IMPLANT
NORGESTOMET
9 zile

POLIOVULA}IE
PMSG
ANTI-PMSG

ANTILUTEOTROP

IMPLANT
NORGESTOMET
9 zile

Fig. 11 Scheme de inducere a poliovulaiei la vacile donatoare de

embrioni (dup M. Thibier i M. Nibart, 1991)
O alt schem de tratament const n utilizarea progestinelor pe cale oral,
parenteral, intravaginal sau implant subcutanat timp de 9-12 zile. Progestinele
blocheaz axul hipotalamo-hipofizo-ovarian, prin neeliberarea de FSH dar mai
ales de LH. Ct timp receptorii axului hipotalamo-hipofizar se gsesc sub aciunea
temporar a progestinelor, femela nu va manifesta estru i nici nu va ovula. Dup
suprimarea terapiei cu progestine, se produce o descrcare rapid, compensatoare
de Gn-RH, ceea ce va determina, n decurs de 5-7 zile, intrarea n clduri
ovulatorii a femelelor tratate. n cursul unui astfel de tratament de blocare a
ciclului se poate injecta hormonul de stimulare (FSH-p) bicotidian, n ritm
descresctor ncepnd cu a 6-a zi de la blocarea ciclului, concomitent cu o injecie
intramuscular de PGF2.

72

PMSG
PGF2

PMSG
PGF2
Gn-RH

PMSG
PGF2
HCG

FSH
PGF2

Fig. 12 Scheme de inducere a poliovulaiei la vacile donatoare de embrioni

(dup I.C.P.C.B. Baloteti)
n cazul ntrebuinrii preparatelor hormonale pe baz de PMSG, acestea
se injecteaz, mpreun cu o doz de prostaglandin F2, n a 6-a - a 7-a zi de la
introducerea implantelor, pesariilor etc., urmat de injectarea unei doze de anti
PMSG concomitent cu a 2-a nsmnare artificial (fig. 11 i fig. 12).
O schem mai simpl de provocare a poliovulaiei const n nceperea
tratamentului cu hormoni gonadotropi n a 15-a, a 16-a zi a ciclului estral la viele
i n a 16-a, a 17-a zi a ciclului sexual la vaci, ns numrul de embrioni obinui
este mult mai redus.
Rezultate bune n provocarea poliovulaiei s-au obinut prin injectarea unei
doze de Gn-RH la vacile poliovulate nainte de prima nsmnare artificial sau
concomitent cu aceasta, n vederea gruprii ovulaiilor.
Prin provocarea poliovulaiei se pot obine de circa 8-10 ori mai muli
embrioni, dect n cazul recuperrii unui singur ou de la femelele nesupuse
tratamentului poliovulator (foto 18).

73

Exist o variaie
mare n ceea ce privete
rspunsul la tratamentul
poliovulator, din partea
vacilor. Aceast variaie
pronunat se datoreaz
hormonului
utilizat,
puritii acestuia i de
specificul individual al
femelelor. Cercetrile au
relevat faptul c circa 1020% dintre vaci nu
rspund la tratamentul
poliovulator, alte 20-25%
rspund slab la un astfelde
Foto 18 Ovare superovulate
tratament (1-3 embrioni
transferabili pe vac tratat) i doar 30-40% dintre vaci au un rspuns ideal la
tratamentul de superovulaie furniznd 7-12 embrioni/vac/tratament iar 5-10%
dintre femelele tratate furnizeaz mai mult de 20 de embrioni. n prezent,
stimularea ovarian pare a fi atins un anumit plafon ntruct, se colecteaz, n
medie 9-10 embrioni (limite ntre 0-50), iar cel al embrionilor viabili este de 5-6
(limite ntre 0-30), din care 3 congelabili (Nibart, Thibier, Chouke 1988).
n ceea ce privete repetarea tratamentelor de superovulaie la aceeai
donatoare, s-a constatat c tratamentele pot fi repetate pe intervalul a mai multor
luni sau a mai multor ani. Producia total de embrioni de la aceeai donatoare
depinde de aceasta i de ritmul de colectare .
Este necesar un interval de cel puin 60 de zile dup ftare n vederea
nceperii tratamentului poliovulator. Unii cercettori constat o reducere a
numrului de embrioni transferabili o dat cu repetarea tratamentului cu PMSG,
fapt ce se explic prin formarea n organismul femelei tratate a anticorpilor antiPMSG i reducerea categoriilor de foliculi sensibili la stimulare. Pentru a se evita
acest efect negativ, repetarea tratamentului trebuie s se fac la un interval de 5460 de zile i s se intercaleze tratamentele pe baz de PMSG i FSH-p.
Rezultatele tratamentelor de superovulare sunt influenate de vrsta
femelelor, ras, mascul, sezon, nivelul produciei de lapte, starea general, etc. De
regul, vielele produc un embrion viabil mai puin dect vacile adulte.
2.2.5. Fecundarea ovocitelor
Ovocitele sunt fecundate n urma nsmnrii naturale sau artificiale. De
regul, se efectueaz dou nsmnri artificiale la interval de 12-24 de ore de la
nceputul cldurilor observate clinic sau, sistematic, dup 56 i 72 de ore de la
injecia cu PGF2, sau dup 36 i 48 de ore de la retragerea implantelor sau
pesariilor.
2.2.6. Recoltarea embrionilor
Embrionii sunt colectai atunci cnd se gsesc n cornul uterin, dup
ieirea lor din oviduct (ntre zilele 4-5). Din motive sanitare i de congelare se
prefer colectarea embrionilor nc inclui n zona lor pelucid (ies n a 9-a zi).
74

Cel mai frecvent, colectarea se realizeaz ntre zilele 6-8 dup fecundaie, de
regul n ziua a 7-a.
Recoltarea embrionilor se face chirurgical i nechirurgical. Mult timp,
metoda chirurgical a fost singura utilizat. Tehnica operatorie presupunea
parcurgerea a dou etape: laparotomia, cu exteriorizarea aparatului genital n
plag i recoltarea propriu-zis a embrionilor prin splarea cu un lichid cu o
compoziie special, a oviductelor (dup un interval de timp mai mic de 3 zile
dup nsmnare) sau a coarnelor uterine (dup un interval de timp mai mare de 4
zile de la nsmnare). n prezent, metoda chirurgical de recuperare a
embrionilor la vac este abandonat, datorit inconvenientelor pe care le prezint.
Astzi, este generalizat metoda nechirurgical de prelevare a embrionilor, a crei
principiu const n splarea coarnelor uterine cu un mediu special preparat,
splare care se realizeaz n condiii de asepsie n a 7-a zi de la nsmnare.
Tehnica nechirurgical de colectare a embrionilor s-a perfecionat continuu, firme
specializate produc pe scar industrial mediul de recoltare, congelare,
decongelare i ntreaga aparatur necesar recoltrii i transferului embrionilor.
Tehnicile nechirurgicale de recoltare a embrionilor presupun mai multe
operaii: contenia femelei, anestezia, vidarea rectului, toaleta vulvei i a regiunii
perivulvare, identificarea prezenei corpilor galbeni pe ovar, introducerea
lichidului de splare n lumenul coarnelor uterine, splarea acestora, recuperarea
lichidului mpreun cu embrionii, identificarea i recuperarea embrionilor din
lichidul recuperat i supus decantrii i aprecierea morfologic a acestora.
n condiii de ferm, recoltarea embrionilor se face la locul unde se gsete
femela donatoare,dupa contentia adecvata. Pentru a suprima durerea, se practic
anestezia epidural cu 4-6 ml procain 2% sau cu 10 ml ludocain 1%, care
blocheaz nervii coccidieni i ultimele perechi de nervi sacrali (S3, S4, S5). Acul se
introduce ntre prima i a doua vertebr coccigian sau ntre ultima vertebr
sacral i prima vertebr coccigian, anestezia instalndu-se dup circa 10-15
minute i dureaz n jur de 90 de minute, zonele insensibilizate fiind: coada,
anusul, rectul, vulva, vaginul i uterul.
Se introduce, cu precauiile de rigoare, mna n rect, acesta se videaz de
coninut, apoi se apreciaz rspunsul femelei la tratamentul poliovulator,
palpndu-se cu atenie ambele ovare i numrdu-se corpii galbeni (foto 19). n
cazul n care rspunsul la tratamentul de superovulare este pozitiv, se procedeaz
cu precauie la introducerea cateterului de tip Folley cu dou sau trei ci, prin
conductul cervical pn n cornul uterin. Pentru rigidizarea cateterului, se
introduce pe lumenul acestuia un mandren (tij metalic), care se menine pn se
ajunge n lumenul cornului uterin, apoi se retrage. Cateterul este introdus circa 5-8
cm de la bifurcaia coarnelor uterine, pe unul dintre acestea, apoi se introduce de
la exterior, cu seringa, 8-15 ml de aer n scopul fixrii cateterului i pentru a
mpiedica refularea din cervix a lichidului de splare. Vasul din sticl, ce conine
lichidul de splare se suspend la 1,5 m de la sol i, prin cdere, acesta ajunge prin
calea de admisie a cateterului n coarnele uterine. Irigarea acestora se face
continuu, calea de evacuare a lichidului este conectat, printr-un tub de plastic, la
vasul de colectare a mediului recuperat (de splare).
Recuperarea lichidului de splare se face prin calea de admisie (n cazul
cateterului cu dou ci la care s-a adaptat o pies n forma literei y) prevzut cu
canal de admisie i evacuare al lichidului, ramura de evacuare a lichidului fiind
conectat la un filtru de colectare a crui orificii au un diametru de 75 m, care
are rolul de reinere a embrionilor, lichidul ce traverseaz filtrul fiind colectat
ntr-un recipient situat sub filtru.

75

Mediul folosit la splarea unui corn

uterin se folosete la splarea, n
acelai mod, a celui de-al doilea corn
uterin. Cantitatea de mediu care se
folosete pentru splarea unui corn
uterin este de 300-500 ml, efectunduse irigri repetate i un masaj
transrectal permanent al cornului
uterin perfuzat. Exist diverse sonde
de
recuperare
a
embrionilor,
imaginate de diveri cercettori, care
se bazeaz pe acelai principiu
constructiv .
ntre momentul recuperrii
embrionilor i cel al inoculri lor n
uterul receptoarelor, zigoii trebuie s
fie meninui n via n condiii
speciale i s fie manipulai n cele
mai bune condiii tehnice i igienice.
n ultimii ani s-a generalizat folosirea
unei soluii tampon fosfat - PBS
(Fosfat bufferet salin) pentru splarea Foto 19 Recoltarea embrionilor prin
coarnelor uterine i pentru pstrarea
metoda nechirurgical
embrionilor recuperai.
Acest lichid are un pH de 7,2, o presiune osmotic de 290 miliosmoli i
conine multe sruri minerale, glucoz i protein (albumin bovin seric, 2-4 g/l,
sau ser de viel fetal decomplementat 10%.
Toate mediile, soluiile, serurile, enzimele i substanele crioprotectoare
care vin n contact cu embrionii trebuie s fie sterile. Tot materialul care nu se
arunc (sonde colectoare, filtre, recipieni din sticl, sonde de transfer, etc.) care
necesit a fi sterilizate, se spal cu o soluie de detergent netoxic, se cltete n ap
distilat, se usuc i se nvelete n hrtie n vederea sterilizrii. Alegerea metodei
de sterilizare depinde de natura materialului (cldur uscat, cldur umed,
substane antiseptice, vapori de formol etc.). Rezultatele recuperrii embrionilor
depind n cea mai mare msur de abilitatea i antrenamentul operatorului.
Proporia embrionilor recuperai, oscileaz n medie, ntre 60-70% comparativ cu
numrul de corpi galbeni identificai pe ambele ovare. Dup colectarea
embrionilor se injecteaz donatoarei o doz de PGF2, care are rolul de a liza
corpii galbeni, evitndu-se astfel gestaia multipl.
2.2.7. Cutarea i aprecierea calitii embrionilor
Dup prelevarea embrionilor, vasul cu lichidul recoltat (100-150 ml) este
lsat timp de 20-30 minute pentru decantare. Se ndeprteaz supernatantul iar
stratul inferior n care se regsesc i embrionii recoltai, se transfer ntr-o plac
Petri cadrilat cu diametrul de 10 cm, (foto 20) sau se agit n mediu din filtrul
colector i se toarn n placa Petri. Recipientele de recoltare a mediului ca i filtrul
folosit la recuperarea embrionilor se cltesc de dou trei ori.
Examenul embrionilor n lichidul recoltat trebuie s se fac n cele mai
bune condiii de asepsie, curenie i la o temperatur constant a laboratorului
76

(20o-25o). Embrionii bovinelor au un diametru de 150-190 microni, zona pelucid

avnd o grosime de 12-15 m. Pentru identificarea embrionilor, se examineaz la
o stereolup (grosisment 30-60 uneori 80-200) fiecare ptrat de la nivelul plcii
Petri. (foto 21).

Foto 20 Placa PETRI cadrilat

folosit la cutarea embrionilor

Foto 21 Cutarea embrionilor n lichidul

de splare cu ajutorul stereolupelor

O dat identificai, embrionii sunt transferai cu ajutorul unei seringi de

aspirare, la care s-a adaptat, printr-un tub de plastic, o micropipet, n plci Petri
mai mici, cu diametrul de 5 cm n care se gsete mediul de splare la care s-a
adugat 20% albumin seric bovin (BSA). Operaiunea se repet de 3-5 ori,
embrionii fiind transferai dintr-o plcu n alta, schimbndu-se de fiecare dat
pipeta de aspirare. n cazul n care embrionii sunt destinai exportului, acetia sunt
trecui prin zece astfel de bi de splare. Amestecul crioprotectorului cu mediul de
conservare (PBS 40% BSA sau 10-20% ser de viel fetal) provoac o cretere a
presiunii osmotice. Pentru a reduce ocul osmotic, embrionii sunt trecui succesiv
i pe cte o durat de 5 - 10 minute n dou-trei bi cu mediu de conservare cu o
concentraie crescnd n crioprotector: glicerol 0,7 M i apoi 1,4 M, DMSO sau
etilen glicol 0,5 M, 1,0 M apoi 1,5 M. Aceast trecere a embrionilor n mediul de
conservare cu adaos de crioprotector se face la o temperatur cuprins ntre+20oC
i +30oC.
Dup ultima baie, adic n momentul n care este atins concentraia final
n crioprotector (de exemplu: etilen-glicol 1,5 M), embrionii sunt condiionai
pentru congelare, fie n fiole de sticl de 1,2 ml, fie n paiete de polipropilen de
0,25 ml (de tip paiete fine folosite la conservarea spermei). Paietele sunt
identificate individual. Exist bancuri de identificare ce permit pe de o parte
nchiderea ermetic a paietei i care poart (sunt inscripionate) toate informaiile
necesare.
Pentru fiecare paiet trebuie s se menioneze: identificarea donatoarei,
rasa, data colectrii, numrul de embrioni, centrul de producie.
Procedura de umplere a paietelor comport trei compartimente lichide
separate de bulele de aer. Aceasta limiteaz orice risc de pierdere a embrionilor n
momentul manipulrilor efectuate cu umplerea sau evacuarea coninutului
paietelor.
Embrionii sunt ncadrai n mai multe categorii calitative: excelent, bun,
acceptabil, inferior, degenerat, ovocit nefecundat.
n cursul examenului sub stereolup la un grosisment mai mic de 80,
embrionul este ntors cu ajutorul unei micropipete de sticl n vederea aprecierii
morfologiei sale din toate unghiurile, unele imperfeciuni putnd scpa observaiei
n anumite poziii ale embrionului.
Zona pelucid garanteaz protecia embrionului, motiv pentru care ea
trebuie s fie perfect integr, fr fisuri i perfect sferic. Gradul de dezvoltare
embrionar n raport cu ziua colectrii este principalul factor luat n considerare.
77

Embrionii care prezint o ntrziere n dezvoltare mai mare de 48 de ore sunt

eliminai. Embrionii colectai n a aptea zi de la debutul estrului trebuie s se
gseasc n stadiul de morul compact/blastocist. Embrionii care conin 16 celule
sau mai puin, nu se rein pentru transfer sau congelare, fiind ntr-o ntrziere mare
a dezvoltrii.
n stadiul de morul compact, limitele celulare sunt mai puin distincte
ntruct blastomerele sunt strns legate ntre ele i dau un aspect de mure.
Prezena ctorva celule detaate, n spaiul perivitelin nu constituie un motiv de
eliminare ntruct majoritatea blastomerelor formeaz o mas sferic fr
opacitate marcant.
n stadiul de blastocist, diversele structuri (blastocel, butonul embrionar,
trofoblastul) trebuie s fie vizibile i s prezinte contururi bine delimitate.
Prezena blastomerelor n spaiul perivitelin i a unor granulaii la
suprafaa celulelor pot fi observate. Aceste anomalii asociate unei ntrzieri n
dezvoltare, absenei contururilor celulare sau unei opaciti marcante ale
blastomerelor constituie criteriu de eliminare a embrionilor. Embrionii a cror
aspect este ndoielnic sunt conservai una-dou ore apoi vor fi examinai din nou.
Excelent
este
considerat
embrionul perfect ca aspect morfologic
i corespunztor vrstei (foto 22).
Embrionul bun calitativ prezint unele
imperfeciuni: zona pelucid oval,
dimensiuni mai mici ale embrionului,
ntrziere n dezvoltare cu o zi, puine
celule extrudate, mici. Embrionul
acceptabil este cel care este bine
conturat,
ns
prezint
unele
anormaliti: un numr moderat de
Foto 22 Embrioni buni pentru
celule excluse, dimensiuni mai mici,
congelare
unele degenerri i ntrzierea cu o zi. Embrionul inferior prezint diverse
degradri considerabile: celule veziculate, variabilitate mare n ceea ce privete
dimensiunile celulelor, ntrzierea n dezvoltare cu dou zile, absena compactrii.
Embrionul degenerat prezint degenerri evidente, iar ovocitele nefecundate sunt
cele care prezint structur simpl a gametului femel, fr celulele rezultate din
segmentare (Seidel F.G. i colab.,1991).
2.2.8. Conservarea i deconservarea embrionilor
Embrionii pot fi conservai cteva ore in vitro la 20oC ntr-un mediu de
conservare: PBS adiionat cu 4 g/l albumin seric bovin, sau cu 10% ser de viel
fetal decomplementat. n acest mediu, embrionii sunt meninui pn cnd sunt
transferai la receptoare. n cazul n care transferul nu se realizeaz n 6-8 ore de la
recoltare, se recomand congelarea prin refrigerare a embrionilor, la o
temperatur de 0o-4oC ntr-un mediu de conservare identic. n acest fel embrionii
pot fi conservai una-dou zile fr ca viabilitatea s fie afectat.
Conservarea de lung durat a embrionilor congelarea - rmne cea mai
avantajoas metod de meninere pentru un interval de timp practic nelimitat a
viabilitii embrionilor. Pentru aceasta, embrionii, trebuie s fie meninui n stare
solid, n azot lichid, la temperatura de circa -196oC. La temperaturi mai sczute
de -100oC, metabolismul celular este complet blocat, singura problem mai
dificil constnd n atingerea acestor temperaturi fr a omor embrionii. n timpul
78

congelrii, intervin doi factori letali pentru embrioni: formarea gheii intracelulare
i concentraia salin ridicat. Pentru a prentmpina efectul negativ al acestor doi
factori, metoda de rcire const n deshidratarea parial a celulelor i evitarea
ocului produs de concentraiile ridicate n sruri prin utilizarea unui Crioprotector,
n general glicerol cu o
concentraie de 1,5 M (sau 10%
n volum) n mediul de congelare.
Ca ageni criopro-tectori se mai
pot
folosi:
dimetilsulfoxid
(DMSO), etilen-glicol, glicerol,
propilen-glicol. n prezent sunt
numeroase aparate programabile
(freezere) care permit realizarea
unei curbe optimale de rcire (foto
23). Substanele crioprotectoare (n
general polialcooli) sunt capabile
s ptrund uor n celule printr-o
simpl
difuziune
(osmoz),
Foto 23 Model de freezer
ntrziind formarea cristalelor de
ghea prin coborrea punctului de nghe. Totodat, substanele crioprotectoare
limiteaz efectele negative ale concentraiei saline ridicate, nlocuind o parte din
apa intracelular atras prin creterea presiunii osmotice extracelulare. Ali
compui pot avea un rol protector fa de membranele celulare (hidrai de carbon,
polivinilpirolidon), (Baril i colab., 1993).
Viteza de coborre a temperaturii are importan mare n protejarea
viabilitii embrionilor. Mediul care conine embrionii (extracelular) este mai
bogat n ap dect mediul celular. Prin coborrea temperaturii, primele cristale de
ghea se produc mai nti n mediul extracelular, ceea ce va antrena o ridicare a
concentraiei n soluie a fraciunii necristalizate. Aceast concentraie salin
ridicat va provoca ieirea unei pri din apa celular, reducnd n acest fel
formarea gheii intracelulare. Dac ritmul de rcire este prea rapid, apa
intracelular nu poate iei n cantitate suficient, cristalele de ghea se formeaz
n cantitate mare n interiorul celulelor i aceste cristale i mresc talia lor n
timpul congelrii i decongelrii distrugnd structurile celulare. n cazul n care
ritmul de rcire este lent, deshidratarea progresiv a celulelor antreneaz o
cretere important a concentraiei n electrolii, n mediul celular, modificnd
proprietile fizico-chimice (efectul soluiei), consecina fiind totdeauna pierderea
viabilitii celulelor.
Astfel, integritatea celulelor vii dup congelare este strns legat de
dinamica apei intracelulare n timpul rcirii i deci de viteza de congelare. n cazul
embrionilor, ritmul de rcire trebuie s corespund pentru toate tipurile de celule
care-l compun. Rezultatele cercetrilor ntreprinse pentru clarificarea aspectelor
referitoare la ritmul de congelare confirm faptul c acesta trebuie s se
desfoare n dou etape diferite: o congelare lent, n dou trepte: la nceput
4oC/min pn la 6 7oC i 0,3-0,6oC/min ntre 7oC i 30 35oC, apoi o
congelare rapid (brusc) de la -35oC pn la temperatura de pstrare -196oC.
Timpul de ateptare al embrionilor din momentul recoltrii i pn la
nceperea congelrii, nu trebuie s depeasc dou-trei ore.
Protocolul de congelare a embrionilor bovini prevede urmtoarele:
- alegerea embrionilor - calitate excelent sau bun;
- timp de la recoltare pn la nceperea congelrii: dou-trei ore;

79

introducerea embrionilor n mediul de congelare la temperatura

laboratorului (20oC);
- introducerea embrionilor n paiete identificate (mediu, bul de aer,
embrioni +mediu, bul de aer, mediu);
- rcirea pn la -6oC sau -7oC cu o vitez de 4oC/minut;
- inducerea cristalizrii (palier 5-10 minute);
- rcirea pn la 30oC sau 35oC cu o vitez de 0,3 - 0,6oC/minut;
- introducerea paietelor ce conin embrionii, direct n azot lichid i
stocarea lor (-196oC).
Paietele se vor pstra n permanen n azot lichid pn n momentul
transferului la femelele receptoare. Durata stocrii embrionilor n azot lichid nu
influeneaz supravieuirea ulterioar a acestora.
Decongelarea embrionilor i nlturarea crioprotectorului
Embrionii congelai la -35oC nu sunt dect parial deshidratai, o anumit
cantitate de ghea se formeaz inevitabil n celule, n momentul imersiei n azot
lichid (-196oC). Pentru a se evita ca prin decongelare s se produc o cretere a
acestor mici cristale de ghea care s distrug celulele, decongelarea trebuie s se
fac n timp, ct mai repede posibil (circa 2000oC/minut). Pentru aceasta, paietele
se scot repede din containerul cu azot lichid i se introduc direct ntr-o baie de ap
la 37oC, unde se menin circa 30 de secunde. Imediat dup decongelare,
nlturarea rapid a crioprotectorului este indispensabil supravieuirii
embrionilor. Totui, celulele care conin o concentraie ridicat de crioprotector nu
trebuie s fie introduse direct ntr-un mediu izotonic, ntruct diferena mare de
presiune osmotic va provoca ptrunderea prea rapid a apei n celul, ceea ce va
risca s explodeze. De aceea, este necesar o ndeprtare progresiv a
crioprotectorului astfel nct ieirea acestuia i ptrunderea apei n celul s fie
compatibile cu permeabilitatea membranei celulare.
Pentru aceasta sunt mai multe metode care realizeaz o rehidratare lent a
celulelor embrionare.
Diluia crioprotectorului pe etape const n trecerea succesiv a
embrionilor prin bi cu concentraii descrescnde n crioprotector (de ex: etilen
glicol 1,5 M, apoi 1,0 M, 0,5 M i 0 M). Meninerea embrionilor n fiecare baie
este de 5-10 minute. n acest caz concentraia mediului n crioprotector este
invers celei din perioada congelrii. Dup nlturarea lichidului de rcire,
calitatea embrionilor poate fi apreciat printr-un examen morfologic efectuat cu
ajutorul unei stereolupe (grosisment x80). n urma examenului morfologic, de
regul sunt eliminai ca necorespunztori calitativ, 10-30% dintre embrionii
decongelai.
Diluia crioprotectorului prin folosirea unui mediu care conine sucroz are
la baz accelerarea ieirii acestuia din celule. Molecula de sucroz avnd o
greutate molecular mare (344) nu ptrunde n celule prin simpl difuziune;
prezena sa n mediu creaz o mrire a presiunii osmotice din mediul extracelular,
ceea ce va determina o difuziune accelerat a crioprotectorului din celule. Pentru
aceasta, embrionii decongelai sunt introdui direct ntr-o soluie de PBS care
conine 0,25-0,5 M sucroz, apoi n dou-trei bi succesive de PBS nainte de
examinare i transfer. Se poate realiza retragerea crioprotectorului prin
intermediul sucrozei, direct n interiorul paietei. Pentru aceasta, n momentul
introducerii embrionilor n paiete pentru congelare, alternana diverselor medii din
paiet este: la mijloc embrionul n mediu PBS+ etilenglicol 1,5 M, nconjurat de
bule de aer i apoi la exterior PBS+sucroz 0,25 M. Dup decongelare paieta se
80

scutur n vederea amestecrii mediilor pe baz de etilen glicol i cele pe baz de

manoz, ceea ce va permite difuzia crioprotectorului n afara celulei n cteva
minute. Embrionii sunt transferai fr selecie prealabil, mpreun cu coninutul
paietei direct n uterul femelelor receptoare. Aceast metod mai necesit unele
verificri.
Nivelul supravieuirii embrionilor dup decongelare este condiionat de
mai muli factori: stadiul de dezvoltare a embrionilor, calitatea embrionilor nainte
de congelare, femela donatoare etc.
Embrionii transferai n stadiul de morul realizeaz o proporie de
supravieuire in vitro mai redus (64%), comparativ cu cei transferai n stadiul
de blastocist (81%), (Martinez i colab., 1985).
Congelarea nu trebuie aplicat dect embrionilor de bun calitate, caz n
care procentul de supravieuire dup transfer fiind uor inferior (10%) fa de
nivelul supravieuirii obinut dup transfer direct, fr congelare.
Originea genetic a donatoarei pare a avea un rol nsemnat asupra
aptitudinii embrionului de a fi congelat. Acelai efect denumit i efectul
donatoarei a fost demonstrat prin faptul c procentul de supravieuire a
embrionilor congelai n aceleai condiii poate varia de la 0 la 78% n raport cu
donatoarea.
2.2.9. Transferul embrionilor
O atenie deosebit va fi acordat seleciei femelelor receptoare, ntruct
condiioneaz n mare parte rezultatele dup transfer. Aa cum s-a menionat n
capitolul anterior, receptoarele trebuie s aib o activitate sexual ciclic, s fie
bine dezvoltate corporal, fr afeciuni ale tractusului genital. Alegerea
receptoarelor poate porni de la viele n vrst de 18 luni cu condiia atingerii a cel
puin 2/3 din greutatea corporal a adultului. Transferul embrionilor se face cu
foarte bune rezultate i la vaci adulte n vrst de 3-6 ani dac funcia de
reproducie s-a desfurat normal.
Examenul femelelor receptoare se completeaz cu aprecierea ultimului
estru, care trebuie s aib loc ntre parametrii fiziologici (comportament sexual,
calitatea mucusului cervical, starea de sntate a conductului vestibulo-vaginal i
al orificiului vaginal al cervixului).
Pregtirea receptoarelor const ntr-o sincronizare ct mai perfect a
ciclului sexual cu cel al femelei donatoare. Se pot folosi femele receptoare, fie n
clduri naturale fie n clduri induse printr-un tratament de control al ciclurilor
sexuale (vezi cele menionate anterior). O atenie special se va acorda depistrii
ciclurilor (dimineaa, prnz, seara) apoi se determin momentul exact al
nceputului estrului. naintea transferului propriu-zis se face un examen transrectal
al ovarelor pentru a identifica corpul galben pe unul din ovare. Transferul
embrionului se va face n vrful cornului uterin adiacent ovarului pe suprafaa
cruia este prezent corpul galben. Rezultate bune s-au obinut i prin depunerea
embrionului la circa 10 cm de la bifurcaia coarnelor uterine n lumenul cornului
uterin ipsilateral ovarului cu corp galben. nainte i imediat dup transfer se va
evita orice stres: vaccinri, tratamente antiparazitare, ecornri, lotizri,
tuberculinri, recoltri de snge etc. Se va evita schimbarea brusc a regimului
alimentar: de exemplu introducerea masei verzi primvara 4 sptmni dup
transfer. Variaiile climatice determin o cretere a mortalitii embrionilor dup
transfer. n cazul folosirii embrionilor proaspei, receptoarele se in ntr-un grajd
curat i ct mai aproape de donatoare.
Transferul propriu-zis al embrionilor la femelele receptoare se realizeaz
prin dou metode: chirurgical i nechirurgical.
81

Transferul chirurgical s-a aplicat n perioada de nceput i a constat n

deschiderea cavitii abdominale (pe linia alb sau n flanc), exteriorizarea
cornului uterin i depunerea embrionului pe cornul uterin corespunztor ovarului
cu corp galben prin puncionarea peretelui acestuia. Este o metod laborioas,
costisitoare, traumatizant pentru femele, ceea ce a condus la abandonarea ei.
Metoda actual care d cele mai concludente rezultate este cea
nechirurgical. Aceast metod folosete calea vagin-cervix, asemntor
nsmnrii artificiale. Pentru transfer se folosete un pistolet tip Cassou n care
se introduce paieta cu embrionul deconservat sau proaspt recoltat. Pentru a se
evita contaminarea nveliului din material plastic al pistoletului Cassou pe timpul
traversrii conductului vestibulo-vaginal, se fixeaz un al doilea nveli din
material plastic care este secionat pe toat lungimea sa. Dup ce pistoletul ajunge
n lumenul cervical, acest nveli protector se retrage. Pentru a nvinge rezisteana
cervixului (n aceast faz cervixul fiind nchis) se folosesc uneori dilatatoare. La
circa 10 cm de bifurcaie, pe cornul uterin corespunztor ovarului ce conine
corpul galben, se depune embrionul, asemntor nsmnrii artificiale. Aceast
metod este exclusiv folosit n present. Traversarea cervixului trebuie s se
realizeze cu mare precauie n vederea evitrii lezionrii mucoasei acestuia. n
vederea relaxrii cervixului, a evitrii contraciilor organelor genitale se
efectueaz anestezia epidural cu 4-6 ml procain 2%, sau alte preparate
medicamentoase cu efect similar.
2.3. Biotehnologia transferului de embrioni
la rumegtoarele mici
Ca i la rumegtoarele mari, folosirea transferului de embrioni la
rumegtoarele mici se practic cu scopul multiplicrii descendenei femelelor cu
nalt potenial genetic, introducerii de noi genotipuri prin importul de embrioni
congelai i asigurrii bazei morfo-fiziologice ale unui model modern de cercetri
fundamentale n reproducia animalelor i biologia celular.
Reglarea i controlul funciei de reproducie la rumegtoarele mici sunt
influenate considerabil de factorii de mediu. La latitudini mai mari de 35o,
rumegtoarele mici au un sezon de reproducere limitat, care ncepe ctre sfritul
verii i se ncheie ctre finele sezonului de toamn. n decursul unui an, funcia
sexual la oaie se caracterizeaz prin alternarea a dou perioade:o perioad de
anestru fiziologic, cuprins ntre sfritul iernii i nceputul verii;o perioad de
activitate sexual, cu derularea mai multor cicluri sexuale, cuprins ntre sfritul
verii i nceputul iernii (10-14 sptmni dup cea mai lung zi).
Anestrul fiziologic se datoreaz att factorilor materni (anestru de lactaie),
ct i factorilor climatici (anestru sezonier), efectul acestor factori suprapunnduse.
Periodicitatea sexual sezonier este atribuit influenei modulatoare a
fotoperiodismului, temperaturii, umiditii i alimentaiei asupra unui ritm ciclic
anual de baz, condiionat genetic.
Factorul principal n stimularea funciei sexuale la oi este reprezentat de
reducerea progresiv a numrului de ore lumin, iar cel subordonat este scderea
temperaturii i schimbarea alimentaiei.
Din punct de vedere reproductiv oile sunt considerate ca animalele zilelor
scurte. Fotoperiodismul regleaz funcia de reproducie la oi prin intermediul
melatoninei, hormon secretat de glanda epifiz. Epifiza controleaz momentul
apariiei maturitii sexuale i sezonul de reproducie. Melatonina regleaz funcia
de reproducie prin schimbarea secreiei hormonilor gonadotropi. O dat cu
micorarea zilei lumin, secreia melatoninei crete i activeaz funcia sexual.
82

Factorii de mediu trebuie s aib un anumit nivel pentru a influena pozitiv

funcia de reproducie: temperatura aerului 8-18oC, umiditatea relativ 65-85%,
durata zilei lumin - 4-7 ore. Ali factori ai mediului ambiant (relaiile dintre
indivizi, masculi/femele, femele/miei, nivelul alimentar) au un rol modulator n
blocarea sau declanarea activitii reproductive. Utilizarea acestor factori (de ex.
efectul mascul) permite s se controleze mai bine perioadele de reproducie.
Gradul de ovulaie variaz n timpul sezonului de reproducie. Nivelul
acestui indice este maxim la mijlocul perioadei sexuale. Oile inute la temperaturi
sczute, n timpul verii, ncep sezonul de reproducie mai devreme dect cele care
n sezonul estival, au fost inute la temperaturi obinuite acestui anotimp.
Oile expuse stresului termic n orele de dinainte sau de dup estru, prezint
tulburri de fecunditate. Variaiile raiei de hran (date de variaiile
disponibilitilor alimentare) determin oscilaii ale nivelului de fertilitate.
La latitudini medii, variaiile fotoperioadei rmn factorul principal care
declaneaz activitatea reproduciei la oi (Thimonier J. i colab., 1986).
2.3.1. Alegerea donatoarelor i receptoarelor
Femelele care intr ntr-un protocol al transferului de embrioni trebuie s
fie selecionate naintea nceperii operaiilor propriu-zise.
Prima selecie a donatoarelor se face dup valoarea lor genetic pa baza
unor criterii apropiate aptitudinilor zootehnice cercetate la rasa respectiv. n
general, n alegerea donatoarelor se are n vedere ca acestea s se fi nscut n
sezonul de reproducie precedent, fr tulburri ginecologice, s nu fie gestante,
cu ovare normale, capabile s rspund la tratamentul superovulator (examen
fcut prin ecografie sau endoscopie) (laparoscopie).
n cazul repetrii tratamentelor de superovulare, se investigheaz, prin
probe de laborator, prezena sau absena anticorpilor contra hormonilor folosii la
tratamentul de superovulare. Femelele tratate de mai multe ori se pot imuniza
contra gonadotropinelor heterospecifice i nu mai rspund la administrarea
preparatelor hormonale de acest tip.
n cazul folosirii nuliparelor, acestea trebuie s aib o greutate corporal
de cel puin 60% din greutatea femelei adulte i s fie n vrst de cel puin 8-10
luni.
naintea lotizrii, donatoarele (ca i receptoarele) se supun mai multor teste
serologice pentru depistarea maladiilor contagioase, susceptibile a le afecta
(bruceloza, febra Q, clamidioza etc.). Acest criteriu este impus i de legislaia
sanitar-veterinar din mai multe ri, care prevede pentru femelele donatoare s fie
indemne de boli contagioase. Lotizarea femelelor donatoare i receptoare se va
face cu cel puin dou luni naintea tratamentului, pentru a se evita efectele
negative ale stresului de adaptare la un nou mediu i pentru a se instala o nou
ierarhie n interiorul lotului reconstituit.
Donatoarele i receptoarele trebuie s fie supuse unui tratament
antiparazitar cu spectru larg cu cel puin o lun naintea nceperii tratamentului. n
cazul examenului coprologic pozitiv, tratamentul va fi n special dirijat contra
infestaiei constatate.
Alimentaia donatoarelor i receptoarelor se va face dup norme tiinifice.
Creterea nivelului energetic alimentar pe durata a trei sptmni care
precede folosirea la reproducie (flushing) provoac, la ovine, o cretere a
nivelului ovulaiei pentru femelele supuse tratamentului de inducere a ovulaiei i
83

o diminuare a luteolizei premature pentru oile supuse superovulrii. Practica

flushing-ului este recomandabil att pentru donatoare ct i pentru receptoare
i n special cnd alimentaia nu acoper n totalitate nevoile energetice.
La receptoare, nevoile nutriionale suplimentare datorate gestaiei, nu sunt
diferite de cele legate de o gestaie natural, dar ele trebuie luate n consideraie
pentru a se evita avortul consecutiv subalimentaiei.
n preajma ftrii, o supraveghere atent a femelelor previne mortalitatea
perinatal i erorile de descenden (filiaie).
Alegerea donatoarelor se face pe baza performanelor genetice, starea
fiziologic i sanitar. Donatoarele, n general, trebuie s fie de vrst medie, s
aib o carier de reproducie fr tulburri notabile, s fie sntoase n urma
examenului clinic general i ginecologic, fcut la trei luni naintea transferului de
embrioni. Se respect un interval de cel puin 5 luni ntre ultima ftare i nceputul
tratamentului.
Alegerea receptoarelor se face, n general, dup aceleai criterii ca
donatoarele, valoarea genetic nefiind luat n consideraie. Nuliparele sunt cele
mai recomandate. n momentul transferului, receptoarele trebuie s fie n vrst de
8-10 luni i cu o greutate de cel puin 60% din greutatea medie a femelei adulte
din rasa respectiv (30-35 Kg). n cazul n care receptoarele sunt achiziionate,
acestea se integreaz cresctoriei cu cel puin trei luni naintea nceperii
tratamentului, pentru a se adapta la noile condiii, dup ce au fost alese pe baza
unor criterii stricte, ntruct femelele destinate reformei prezint adeseori
probleme de reproducie i sanitare.
Cu trei luni naintea transferului embrionar i pn la ftare se evit orice
tip de stres: alimentar, traumatic, profilactic, sanitar, social etc.
2.3.2. Sincronizarea estrului i ovulaiei la femelele donatoare
i receptoare
Tratamentele hormonale specifice donatoarelor i receptoarelor se fac
pentru a induce estrul i superovularea (donatoarelor) sau ovulaia (receptoarelor)
la un moment predeterminat. Aceste tratamente urmresc de fapt un control
temporar al activitii ovariene, prin mimarea, mai mult sau mai puin, a
mecanismelor endocrine care controleaz ciclul sexual.
Donatoarele i receptoarele sunt supuse unei serii de intervenii,
cronologic precise. nainte de provocarea hormonal a superovulaiei se impune
stabilirea cu exactitate a momentului apariiei ciclului estral. Depistarea
manifestrii cldurilor se face de dou ori pe zi (dimineaa i seara) prin folosirea
berbecilor ncerctori de calitate. Pentru provocarea superovulaiei, se folosesc oi
cu ciclu natural sau sincronizat.
Pentru standardizarea strii fiziologice a donatoarelor la nceputul
stimulrii i mai ales sincronizarea intrrii n estru la terminarea tratamentului
stimulativ, acestea sunt supuse unui tratament progestativ. La sfritul
tratamentului progestativ, stimularea creterii foliculare se face prin administrarea
hormonilor gonadotropi cu scopul creterii numrului de ovulaii/femel
(superovulaie). Att pentru sincronizare (tratamente progestative) ct i pentru
stimularea ovarin (tratament gonadotrop) se folosesc mai multe variante.

84

2.3.2.1. Tratamente progestative de sincronizare

Difer prin substanele progestagene folosite i prin calea de administrare:
a) injecii zilnice a cte 12 mg de progesteron intramuscular timp de 17-21
de zile la capr sau 12-14 zile la oaie;
b) implante vaginale, reprezentate de burei de poliuretan impregnai cu
60 mg acetat de medroxiprogesteron (MAP) sau 30-40 mg acetat de fluorogeston
(FGA) sunt n prezent cele mai folosite;
c) implante cu synchro-mat B (norgestomet-6 mg) care sunt inserate sub
pielea de la nivelul suprafeei externe a urechii. Eficacitatea acestei ci de
administrare a progesteronului este asemntoare celei a pesariilor vaginale.
Cel mai folosit tratament de sincronizare este cel care apeleaz la pesariile
vaginale impregnate cu FGA.
Durata tratamentului difer n raport cu specia i cu sezonul.
La ovine, oricare ar fi sistemul de impregnare folosit, durata recomandat
a tratamentului variaz n funcie de perioada anului: 14 zile n timpul sezonului
sexual i 12 zile nafara sezonului sexual.
La caprine, durata tratamentului trebuie s fie de 17-21 zile (tratament
lung), fie 10-12 zile (tratament scurt) n asociere cu prostaglandinele.
n cazul tratamentului scurt, la caprele donatoare, durata acestuia este mai
scurt dect cea a unui corp galben ciclic, de aceeea se intervine cu o injecie de
PGF2 (50 g Cloprostenol, Estrumate, Flavoliz etc), 48 ore naintea tratamentului
progestativ pentru a liza corpii galbeni ce pot fi nc activi n momentul retragerii
suportului de progestagen.
d) sincronizarea estrului poate fi fcut fr a se realiza impregnarea
printr-un progestagen. Se poate induce luteoliza sincron prin dou injecii, la
interval de 10-14 zile, de prostaglandin F2, (50-100 g de Cloprostenol etc).
Aceast metod nu d rezultate la femelele neciclice (n afara sezonului sexual),
iar pe de alt parte, procentul oulor divizate este mai slab la femelele donatoare
dect n cazul unui tratament progestativ.
2.3.2.2. Tratamentele de stimulare ovarian
Stimularea creterii foliculare pentru inducerea superovulaiei donatoarelor
sau ovulaiei receptoarelor survine cel mai adesea la sfritul tratamentului
progestativ, i este realizat prin injecii intramusculare de gonadotropine
hipofizare sau extrahipofizare.
Tratamentul gonadotrop pentru inducerea superovulaiei poate fi efectuat
n cursul unui ciclu natural, prin nceperea stimulrii cu 48 de ore naintea
momentului prezumat al luteolizei spontane, ns aceast metod este ineficace n
perioada anovulatorie i dificil de aplicat n cazul tratamentului mai multor femele
nesincronizate n prealabil.
Administrarea gonadotropinelor are loc, n general, la finele tratamentului
progestativ (ceea ce corespunde fazei foliculare a ciclului sexual), care va
determina o cretere a numrului de foliculi preovulatori i la ovulaia mai multor
foliculi.
Stimularea cu ajutorul PMSG const ntr-o injecie de 750-1500 U.I.
PMSG efectuat 48 de ore naintea terminrii tratamentului progestativ. Durata
relativ lung a activitii biologice (circa 4-5 zile), nivelul ridicat de PMSG nc n
circulaie n preajma estrului provoac o activitate folicular anormal n acest
85

stadiu care perturb mediul hormonal n timpul fecundaiei i a primelor faze ale
dezvoltrii oulor. Aceste efecte au drept consecin general o slab producie de
embrioni de bun calitate i ca urmare, acest hormon este din ce n ce mai puin
folosit pentru inducerea poliovulaiei. Repetarea tratamentului superovulator cu
PMSG determin o reducere accentuat a rspunsului ovulator.
Stimularea cu ajutorul FSH-ului este cea mai frecvent metod folosit
pentru provocarea superovulaiei la rumegtoarele mici.
Cantitile de FSH care se administreaz pentru a obine superovularea sunt
adesea exprimate n mg standard Armour (1 mg Armour este o unitate a activitii
unui test biologic ce corespunde a circa 10-14 g de hormon FSH pur).
Administrarea FSH-p se face n zilele 2, 3 sau 4 dup tratamentul
progestativ, n doz de 12-24 mg/femel. Perioada scurt de njumtire (3-4
ore), face ca doza s fie repartizat n mai multe injecii pentru a determina
superovularea. n intervalul de dou-patru zile de la ncheierea tratamentului
progestativ se injecteaz FSH-p, 4-8 injecii, de dou ori/zi, la interval de 10-12
ore, n doze descrescnde (trei zile de tratament).
Tratamentul de superovulare se poate face i cu extracte hipofizare de
cabaline - HAP (horse anterior pituitary) - sau HMG (human menupausal
gonadotropin) care determin un rspuns ovulator i o producie de embrioni
similare celor observate dup tratamentul cu FSH-p la caprine i ovine, ns aceste
preparate sunt puin disponibile.
Pentru provocarea superovulaiei se poate asocia tratamentul pe baz de
PMSG cu cel pe baz de FSH-p. Pentru aceasta, se asociaz 48 de ore naintea
retragerii spongiilor vaginale cu o injecie de 12-18 mg de FSH-p ce se
administreaz n 6 injecii sau ntr-o singur injecie concomitent cu administrarea
de PMSG.
Rspunsul superovulator este condiionat de mai muli fatori, ntre care
menionm: rasa, individul, apariia anticorpilor n cazul repetrii tratamentului,
tipul de hormon folosit etc.
2.3.2.3. Inducerea estrului i ovulaiei la receptoare
Programarea estrului la femelele receptoare se face printr-un tratament
progestativ identic celui folosit la donatoare. Atunci cnd transferul se face fr
interval (imediat), tratamentul progestativ al donatoarelor i receptoarelor ncepe
n acelai moment, astfel nct s se gseasc n acelai stadiu fiziologic n
momentul transferului embrionar.
O injecie de PMSG se face ctre sfritul tratamentului progestativ:
injecia cu PMSG se face cu 48 ore naintea retragerii spongiilor vaginale la capr
i n momentul retragerii acestora la oaie. Pentru caprele receptoare, injecia se
face cu 48 ore naintea retragerii bureilor vaginali impregnai cu progestagene, iar
ovulaia se produce cu circa 12 ore mai trziu dect la donatoarele supuse
aceluiai tratament asociat cu FSH-p. n acest caz, pentru receptoare se ntrzie
terminarea tratamentului progestativ cu circa 12 ore n raport cu donatoarele care
au fost tratate cu progesteron asociat cu FSH-p.
La oile receptoare, injecia de PMSG se face n momentul retragerii
spongiilor vaginale. Oile intr n clduri dup circa 36 de ore, cu o ntrziere de 12
ore, n raport cu donatoarele tratate cu FSH-p.
Costul total al tratamentului este de circa 150-225 ff.
Dozele de PMSG variaz cu sezonul, vrsta i nivelul produciei de lapte
(caprine).
86

La donatoare, variabilitatea momentului ovulaiei este un factor limitant al

nivelului de fecunditate, mai ales critic n cazul folosirii spermei congelate.
Principalul criteriu folosit pentru depistarea nceputului estrului este
manifestarea reflexului de acceptare a saltului masculului. Pentru a determina
practic debutul estrului, se folosete un mascul vasectomizat sau prevzut cu or,
care este pus n prezena femelei la interval de 4-6 ore, ntre 20 i 60 de ore dup
terminarea tratamentului progestativ. Insuficiena libidoului la mascul poate fi un
factor limitant al eficacitii deteciei estrului.
2.3.3. nsmnarea femelelor donatoare
Fecundarea donatoarelor poate fi fcut fie pe cale natural, practicndu-se
monta liber sau dirijat, fie prin nsmnare artificial, cnd se poate ntrebuina
sperma proaspt sau congelat care poate fi depus fie pe cale cervical sau
direct n uter sub controlul endoscopic.
n toate cazurile este important s folosim masculii cu o fertilitate ridicat.
Monta a fost cea mai ntrebuinat metod de nsmnare a femelelor
donatoare n cursul sezonului sexual att la ovine ct i la caprine, ns nu permite
folosirea raional a masculilor valoroi, repartiia geografic a acestora fiind
neuniform, acetia fiind concentrai n centrele n care se practic nsmnarea
artificial (depozite ORSA), cnd se practic monta liber, masculii i femelele
sunt lsai mpreun pe perioada estimat a cldurilor, pentru fiecare mascul
repartizndu-se 3-4 femele. n cazul practicrii montei dirijate, fiecare femel
descoperit n clduri trebuie s fie dat la mont de cel puin dou ori la interval
de 10-12 ore. Momentul nsmnrii artificiale cea mai eficace este ntre 12 i 24
de ore de la nceputul estrului.
Cnd se practic monta n contrasezon, absena sau slaba manifestare a
libidoului masculilor sunt cauzele nerealizrii procentului de fecunditate normal la
femelele donatoare, la care se adaug i puterea fecundant foarte sczut a
spermei n aceast perioad.
nsmnarea artificial permite valorificarea spermei masculilor a cror
valoare genetic este cunoscut. Cercetrile au demonstrat faptul c transportul i
supravieuirea spermatozoizilor n cile genitale femele sunt perturbate dup
tratamentul progestativ i/sau cu prostaglandine asociate i a induciei ovulaiei
(Evans i colab., 1984).
Eficacitatea nsmnrii artificiale endo- sau exocervicale la
rumegtoarele mici superovulate este sensibil redus comparativ cu animalele
martor nesuperovulate. Nivelul oulor divizate obinute prin aceast metod este
adeseori insuficient i inferior celui obinut dup mont.
Mai mult, nivelul fecundaiilor este strns dependent de nivelul rspunsului
ovulator la tratamentul de stimulare.
La ovine, se folosete pentru nsmnare numai sperma proaspt.
Conservarea spermei de berbec reduce sub 40% procentul de fecunditate a oilor
nsmnate pe cale cervical. Doza de sperm este de 2x400x106 spermatozoizi
total n sperma proaspt, sperma depunndu-se la intrarea n cervix. Anatomia
cervixului nu permite trecerea instrumentelor clasice de nsmnare.
La caprine, conservarea spermei prin congelare este o practic curent.
Sperma se depune pe canalul cervical la 48 i 54 de ore (dou nsmnri
artificiale) sau la 30, 48 i 54 de ore (trei nsmnri artificiale) dup sfritul
tratamentului progestativ. Totui, procentul oulor fertilizate este sczut, datorit
87

faptului c nivelul ridicat de estrogeni dup un rspuns bun la tratamentul

progestativ, inhib transportul spermatozoizilor pe cile genitale femele.
nsmnarea artificial intrauterin, sub controlul endoscopic, este destul
de rspndit la rumegtoarele mici. Aceast tehnic permite folosirea spermei
congelate i obinerea unui procent de fecunditate ridicat pentru ovocite. Numrul
de spermatozoizi mobili/doz prin practicarea acestei tehnici poate fi redus la
circa 80-100 milioane i se face o singur nsmnare artificial.
nsmnarea artificial intrauterin se face la 48-60 de ore dup sfritul
tratamentului progestativ sau la 20-24 de ore dup nceputul estrului la capre sau
la 32 de ore dup nceputul cldurilor la oi (87% embrioni viabili).
2.3.4. Recoltarea embrionilor
Operaiile de colectare i transfer a embrionilor sunt eficiente sub
anestezie general, femelele fiind supuse, n prealabil, unei diete alimentare i
hidrice n cursul a 24 de ore care premerg intervenia chirurgical.
Embrionii sunt recoltai prin splri succesive a celor dou coarne
uterine n a 6-a sau a 7-a zi dup nceputul estrului.
Acest interval de timp relativ scurt n care embrionii pot fi recoltai, este
condiionat de mai muli factori:
- trecerea embrionilor din lumenul oviductului n cel al coarnelor uterine
se produce ncepnd cu a 4-a zi;
- pentru raiuni sanitare, legislaia prevede ca embrionul s fie transferat
nainte de a iei din zona pelucid, care poate surveni ncepnd cu a 8-a
zi;
- congelarea embrionilor se poate face cel mai bine cnd acetia se gsesc
n stadiile de morul compact i blastocist (a 6-a sau a 7-a zi de la
nceputul estrului).
Mediul de colectare este PBS (phosphate buffered saline) cu adaos de 2%
albumin seric bovin sau de 10% ser de viel fetal meninut la 37oC.
Embrionii sunt recoltai aproape n exclusivitate, fie prin laparotomie
abdominal (metoda chirurgical), fie sub control endoscopic (colectare prin
endoscopie sau laparoscopie).
S-a ncercat colectarea embrionilor i prin mijloace nechirurgicale, pe cale
cervical, asemntor ca la rumegtoarele mari sau la cabaline, ns rezultatele
sunt foarte slabe, datorit traversrii dificile a conductului cervical i a
imposibilitii manipulrii coarnelor uterine prin palpare rectal.
Recoltarea prin metoda chirurgical se face pe femela sub anestezie
general, contenionat pe o mas n decubit dorsal, cu o nclinare antero
posterioar de 35-45o.
Se face o incizie lung de 8-10 cm pe linia alb naintea atarii mamelei.
Se exteriorizeaz coarnele uterine, se numr corpii galbeni de pe ambele ovare,
pentru a se aprecia rspunsul la tratamentul de superovulare (foto 29). n cazul n
care recoltarea se face dup dou-patru zile de la debutul estrului, majoritatea
embrionilor se regsesc n lumenul oviductului. Un cateter cu un diametru de 1
mm se introduce circa 2 cm pe lumenul oviductului prin pavilion, apoi 4 ml de
PBS sunt injectai cu scopul de a-i antrena n coarnele uterine. Apoi se spal
coarnele uterine sau se recupereaz la nivelul pavilionului oviduc-tului perfuzatul
injectat la baza coarnelor uterine .
n cazul n care recoltarea embrionilor se face n zilele 6-7, se spal fiecare
corn uterin cu ajutorul lichidului special introdus la acest nivel. Se face o puncie
88

la baza coarnelor uterine, la nivelul ligamentului intercornual. Pe la nivelul

punciei se introduce o sond Folley. Lumenul uterin la baza coarnelor uterine este
obturat, prin umflarea balonaului situat la extremitatea sondei. Printr-un cateter
introdus la nivelul jonciunii utero-tubare se injecteaz 40-50 ml de PBS,
recuperarea lichidului care antreneaz i embrionii fcndu-se prin sonda Folley.
Mediul de splare poate fi injectat la nivelul sondei Folley i recuperat prin
cateterul introdus anterior (perfuzie anterograd ) legat cu un tub steril plasat ntro baie marin la 37oC. Se procedeaz la splarea succesiv i separat a celor dou
coarne uterine apoi se introduce un antibiotic n cavitatea abdominal i se nchide
plaga de la nivelul coarnelor uterine i al peretelui abdominal.
Aceast metod este cea mai rspndit la rumegtoarele mici. Nivelul de
recuperare a embrionilor oscileaz ntre 70 i 90%, ns diminu mult atunci cnd
se fac recoltri repetate de la acelai animal (52-24%) la ovine i 65-42% la
caprine n cazul colectrilor 2 i 3.
Recoltarea prin endoscopie (laparoscopie). Femela anesteziat se
contenioneaz pe o mas de operaie, n decubit dorsal, cu o nclinare anteroposterioar de 30-45oC. O prim puncie se face la 4-5 cm naintea glandei
mamare i la 10-15 cm la stnga liniei albe. Se introduce o canul cu un diametru
de 7 mm, care poart endoscopul. Se insufl aer filtrat n cavitatea abdominal
pentru a separa viscerele de organele genitale. A doua canul, cu un diametru de 5
mm, se introduce n partea opus primei, n raport cu linia alb i prin care se
introduce o pens atraumatic pentru a manipula tractusul genital. Cu ajutorul
pensei, corpii galbeni de pe fiecare ovar pot fi numrai. Un corn uterin se prinde
la nivelul ligamentului intercornual i se puncioneaz cu un ac avnd diametru de
2,5 mm.
A treia canul, cu diametru de 5 mm, se plaseaz pe linia alb, la 15 cm de
prinderea glandei mamare. Prin aceast canul se introduce o sond cu trei ci
pn n lumenul uterului. Balonaul fixat la sond este umflat cu aer prin
intermediul unei seringi cu scopul de a obstrua lumenul uterin la baza coarnelor
uterine. Extremitatea cateterului este deplasat ct mai aproape posibil de
jonciunea utero-tubar. Pensa se fixeaz la nivelul istmului pentru a se evita
refularea mediului de colectare n oviduct.
Mediul de colectare se injecteaz prin corpul sondei (40-50 ml pentru
fiecare corn). Presiunea creat de lichidul introdus permite returul acestuia prin
cateter. Se poate folosi i o sond cu dou ci. n acest caz, a doua puncie se face
la vrful cornului uterin pe unde se inser un cateter de injecie, fixat la pensa
atraumatic. Mediul de colectare injectat prin cateter este recuperat prin sonda
plasat la baza coarnelor uterine. Proporia de embrioni recuperai prin endoscopie
este inferioar cu 10-15% celei obinute prin chirurgie, ns repetarea colectrilor
de la aceeai femel prin endoscopie nu provoac reducerea proporiei de
embrioni colectai.
2.3.5. Examenul i aprecierea embrionilor
Mediul de colectare recuperat dup cltirea coarnelor uterine este turnat
ntr-o plac Petri cu fundul cadrilat care s uureze cercetarea embrionilor la o
lup binocular. Embrionii depistai sunt aspirai cu ajutorul unei pipete fine sau a
unei seringi racordat la un tub transparent din plastic i introdui ntr-o cutie Petri
mai mic ce conine PBS filtrat i suplimentat cu 4% albumin seric bovin sau
10% ser de oaie sau de capr. Se apreciaz calitatea embrionilor recuperai.

89

Mediul de colectare i examen a embrionilor este meninut la o

temperatur de +25+27oC, clasificarea embrionilor fcndu-se n urmtoarele
categorii: nefecundai, degenerai, retardai sau morul compact, blastociti
tineri, blastociti extini sau blastociti ieii din zona pelucid. Viabili se
consider embrionii care au o form regulat, sferic, cu citoplasma omogen,
nveli transparent, blastomere de dimensiuni identice distribuite uniform. Foarte
important este i stabilirea nivelului de segmentare, dat fiind c ncetinirea
ritmului de diviziune constituie, n majoritatea cazurilor, dovada unui nceput de
degenerare a embrionilor.
Embrionii sunt clasai n exceleni, buni, de calitate medie sau
necorespunztori. Numrul de embrioni degenerai crete considerabil cu vrsta
acestora, ncepnd cu a 5-a zi de la nsmnarea artificial. Abaterile de la
morfologia normal survin la animalele donatoare sub aciunea nefavorabil a
unor concentraii ridicate de steroizi ovarieni. Majoritatea embrionilor
degenereaz n stadiul de morul pn n ziua a 8-a. n practic se poate asigura
un procent ridicat de ftri alegndu-se embrioni dup atingerea stadiului de
blastocist.
n momentul colectrii - n ziua a 7-a - unii embrioni de oaie i capr pot
prezenta o uoar ntrziere n dezvoltare (morul compact) pe cnd alii sunt
ntr-un stadiu de dezvoltare mai avansat (blastocist ieit din zona pelucid). La
capre, dezvoltarea embrionar precoce apare cu o ntrziere de 12-24 de ore n
raport cu cea observat la oi. n ziua a 7-a dup debutul estrului, proporia
embrionilor n stadiul de blastocist ieit din zona pelucid este mai ridicat la oi
dect la capre (oaie: 95%; capr: 63%) (Meineche-Tillman, 1990 citat de G. Baril
i colab., 1993).
Embrionii care au o ntrziere n dezvoltare mai mare de 48 de ore sunt
eliminai.
n stadiul de blastocist, diversele structuri (blastocel, trofoblast, buton
embrionar) trebuie s fie vizibile i s prezinte un contur bine delimitat. Prezena
blastomerelor n spaiul perivitelin, a granulaiilor la suprafaa celulelor, absena
contururilor celulare vizibile sau prezena unei opaciti evidente a blastomerelor,
constituie criterii de eliminare a embrionilor.
Dup aprecierea calitii embrionilor, embrionii transferabili sunt trecui
prin 10 bi succesive de PBS n vederea nlturrii eventualelor bacterii sau virui.
Aceast practic este recomandat de Societatea Internaional de Transfer
Embrionar i confer o siguran sanitar pentru stocarea sau folosirea unui
embrion sntos.
2.3.6. Congelarea-decongelarea embrionilor
ntr-un interval de timp care nu depete dou ore de la colectare, dup
cltire, embrionii sunt trecui prin mai multe bi succesive de PBS adiionat cu
glicerol: 0,7 M (10 minute), apoi 1,4 M (10 minute) sau etilen glicol 0,5 M (5
minute), 1 M (5 minute), 1,5 M (5 minute), asemntor celor precizate la bovine.
Embrionii sunt condiionai n paiete mici (0,25 ml) i congelai treptat, scderea
temperaturii mediului fcndu-se cu circa 1oC/minut pn la -7oC. n acest stadiu,
cristalizarea este indus (vezi cele menionate la congelarea embrionilor bovini),
apoi scderea temperaturii se face cu cte 0,3oC/minut pn la -35oC, dup care
paietele sunt introduse direct n azot lichid.
90

Decongelarea se face, ca i la embrionii bovini, prin imersia paietelor cu

embrioni, timp de 30 secunde, ntr-o baie-marie la 37oC. Apoi embrionii sunt
trecui succesiv prin 3-4 bi de PBS, la care s-a adugat crioprotector n
concentraie descrescnd (invers dect la congelare): glicerol (1,0 M, 0,7 M, 0,3
M, 0,0 M); etilen-glicol (1,0 M, 0,5 M, 0,0 M). Aceasta permite o rehidratare
progresiv a celulelor embrionare.
Se apreciaz iari calitatea embrionilor, cei care au suferit n timpul
acestor operaii fiind eliminai.
2.3.7. Transferul embrionilor la femelele receptoare
Transferul embrionilor trebuie s se fac ntr-un interval ct mai scurt de
timp de la recoltare (sub 4 ore) sau decongelare (30-40 de minute). Transferul se
realizeaz aproape n exclusivitate chirurgical, laparoscopic.
2.3.7.1. Transferul chirurgical
Dup anestezia femelei receptoare, se face o incizie de 7-8 cm n lungul
liniei albe, 3-4 cm naintea atarii glandei mamare. Se exteriorizeaz coarnele
uterine, se examineaz ovarele pentru a se alege cornul uterin pe care urmeaz s
se fac transferul. Embrionii sunt aspirai ntr-un volum mic de PBS (30-50 l),
aplicnd principiul celor trei compartimente (vezi transferul de embrioni la
bovine), de regul ntr-un cateter adaptat la o sering de 1 ml. Diametrul extern al
capilarului-cateter trebuie s fie de circa 1 mm. Se puncioneaz cornul cu un ac
cu vrful conic, apoi se introduce 2-3 cm capilarul fr a leza mucoasa i se
expulzeaz uor embrionii ctre treimea superioar a cornului uterin ipsilateral
ovarului care prezint un corp galben funcional.
De regul, se transfer doi embrioni n acelai corn uterin. Dup transfer se
instil n cavitatea abdominal 1000000 U.I. penicilin, peritoneul i pielea fiind
apoi suturate (foto 24).

Foto 24 Transferul embrionilor la oile receptoare

(I.C.P.C.O.C. Palas-Constana)

91

2.3.7.2. Transferul embrionilor sub controlul endoscopic

Receptoarea anesteziat este fixat n decubit dorsal pe o mas de
contenie nclinat la 30-35oC. Se pregtete i dezinfecteaz cmpul operator,
naintea glandei mamare. Se face o puncie n abdomen pe unde se introduce
canula endoscopului. Se insufl puin aer prin canul pentru a se uura
vizualizarea tractusului genital.
O a doua canul este inserat n partea opus primei, n apropierea liniei
albe, prin care se introduce o pens de manipulare atraumatic. Cu ajutorul acestei
pense se controleaz rspunsul ovulator pe fiecare ovar i se alege cornul uterin pe
care urmeaz s fie transferai embrionii, corespunztor ovarului care are corpul
galben funcional. Cornul uterin ales pentru transferul embrionilor este prins n
apropierea jonciunii utero-tubare i puncionat cu un ac lung de 30 cm i cu un
diametru de 1,5 mm, n prealabil inserat sub linia alb. Embrionii sunt cundiionai
ntr-un volum de 30-50 l (sistem cu 3 compartimente: lichid, aer,
lichid+embrion) ntr-un capilar lung de 70 mm, cu diametrul de 1 mm, adaptat la
o sering de 1ml printr-un tub lung de 20 de cm. Capilarul i furtunul sunt
introduse ntr-un tub metalic care asigur rigiditatea i maniabilitatea ansamblului.
Printr-o a 3-a canul plasat pe linia alb la 15 cm de la ataarea glandei mamare,
capilarul de transfer este introdus n cavitatea abdominal, apoi, prin punctul de
jonciune n lumenul uterin unde cei doi embrioni sunt depui cu atenie. Dup
retragerea instrumentelor, se pulverizeaz un antibiotic la nivelul celor trei locuri
de puncie a peretelui abdominal. Dup cptarea dexteritii necesare, transferul
prin endoscopie se poate face n 5-10 minute, iar traumatismul provocat este mult
mai redus dect n cazul transferului pe cale chirurgical.
Procentajul de reuit a transferului de embrioni prin cele dou metode
variaz ntre 70,5% i 75,6% la caprine i ntre 69% i 74% la ovine.
Pentru reuita transferului de embrioni la rumegtoarele mici, o condiie
important const n sincronizarea ct mai bun a ciclurilor estrale la donatoare i
receptoare, astfel nct, s existe concordan ntre particularitile dezvoltrii
embrionului i modificrile mediului uterin.

92

NTREBRI RECAPITULATIVE
1. Definii i detaliai importana transferului de embrioni la animale.
2. Care sunt etapele transferului de embrioni?
3. Prin ce mijloace se poate realiza sincronizarea estrului i ovulaiei la femelele
donatoare i receptoare de embrioni?
4. Care sunt schemele de tratament poliovulator la vaci?
5. Care sunt schemele de tratament poliovulator la oi?
6. Care sunt particularitile recoltrii embrionilor la vac?
7. Care sunt particularitile recoltrii embrionilor la oaie?
8. Care sunt criteriile dup care sunt evaluai calitativ embrionii recoltai de la
femelele donatoare?
9. n ce constau tehnicile de conservare a embrionior?
10. Care sunt tehnicile transferului de embrioni la vac i oaie?
TEME
1. Folosirea preparatelor hormonale pentru sincronizarea estrului si inducerea
poliovulatiei la rumegatoare
2. Recoltarea embrionilor la taurine
3. Evaluarea embrionilor la rumegatoare
4. Congelarea embrionilor
5. Transferul embrionilor la receptoare
REFERATE
1. Biotehnologia transferului de embrioni la taurine
2. Biotehnologia transferului de embrioni la ovine si caprine

93

CAPITOLUL III
BIOTEHNICI DERIVATE SAU FINALIZATE PRIN TRANSFER
DE EMBRIONI

3.1. Fecundaia in vitro

Este o biotehnic de actualitate, prin intermediul creia procesele
fiziologice de maturare a gameilor femeli i de capacitare a spermatozoizilor,
fecundaie i cultur a embrionilor pn la stadiul transferului acestora n
organismul femelelor receptoare, sunt dirijate i se produc, parial sau total, n
afara organismului femelei (in vitro) n diferite medii de cultur. Aceast
biotehnic, dei bazele teoretice i practice au fost puse cu circa 4-5 decenii mai
nainte, a cptat un interes mai deosebit n ultimele dou decenii. Cu toate
preocuprile destul de intense n acest domeniu, succesul nregistrat la mamiferele
domestice este destul de limitat.
La mamifere, fecundaia fiind intern, analiza intim a mecanismelor
implicate n acest proces biologic este delicat i costisitoare. Fecundaia in
vitro constituie o biotehnic ce permite studierea in vitro a interaciunilor
dintre cei doi gamei sub rezerva reproducerii artificiale a condiiilor identice
existente ,,in vivo. Dup cum s-a studiat la capitolul Fecundaie, elementele
eseniale ale acestui interesant i complex proces, constau dintr-o serie de
interaciuni ntre cei doi gamei care, n final, conduc la unirea lor i la
combinarea genotipurilor.
Principalele secvene ale fecundaiei se refer la:
- fixarea spermatozoizilor de zona pelucid, urmat de strbaterea
acestei membrane;
- fuzionarea membranelor plasmatice ale celor doi gamei;
- ncorporarea spermatozoidului n ooplasm i activarea ovocitului;
- singamia.
n momentul ovulaiei, ovocitul este captat de pavilion i descinde de-a
lungul oviductului. La majoritatea animalelor de ferm, celulele coroanei radiata
sunt eliminate rapid dup ovulaie. Spermatozoizii dobndesc puterea lor
fecundant n cursul naintrii prin tractusul genital femel. Numrul gameilor
masculi care ajung la nivelul oviductului, n momentul ovulaiei, este foarte
restrns, astfel nct raportul dintre spermatozoizi i ovocite la rumegtoare
variaz de la 1 la 10. De asemenea, reacia acrozomului spermatozoidului se
produce la nivelul zonei pelucide. n consecin, rolul oviductului este de a
asigura dezvoltarea embrionului pn la stadiul de 8-16 celule, apoi acesta trece n
vrful cornului uterin.
Cercetrile efectuate au relevat faptul c fluidul oviductului (sau lichidul
tubar) nu este un simplu transsudat sanguin, ci este un mediu cu unele nsuiri
fizico-chimice speciale: concentraie mai ridicat a ionilor de K+ i un nivel mai
sczut al concentraiei ionilor de Mg++, comparativ cu serul sanguin. Volumul
secreiei tubare este hormono dependent. Lichidul tubar poate suferi unele
schimburi cu lichidul peritoneal.
n condiii naturale, embrionul prsete oviductul, n general, dup al 3lea clivaj, iar dezvoltarea zigotului la nivelul oviductului nu este strict specific.
94

Astfel, embrionii bovini se dezvolt n oviductul ligaturat de oaie sau iepuroaic.

Aceast dezvoltare a embrionului pn la stadiul de blastocist la nivelul
oviductului chiar provenind de la alt specie, constituie un fenomen remarcabil.
Primele rezultate obinute cu ovocite maturate in vivo au fost obinute n
anul 1954 la iepuroaic, n 1969 la oarece i n 1980 la bovine (Marquant B. i
colab.,1991). Primul produs obinut printr-o astfel de biotehnic este consemnat n
anul 1959 la iepure, 1978 la om i n 1982 la bovine. n ceea ce privete produii
rezultai prin fecundaia cu ovocite maturate in vitro, n 1972 s-au obinut primii
zigoi de oarece prin fecundarea ovocitelor cu spermatozoizi recoltai de la
nivelul epididimului; n anul 1973 s-au obinut produi la iepure prin fecundarea
ovocitelor cu spermatozoizi capacitai n uter; n anul 1986 s-au obinut primii
miei, prin folosirea la fecundarea ovocitelor a spermatozoizilor ejaculai; n 1986
s-au obinut primii viei folosindu-se pentru fecundarea ovocitelor spermatozoizi
conservai prin congelare (Marquant B. i colab.,1991).
Dup aceste prime succese nregistrate, fecundaia in vitro s-a
generalizat, dup cum s-a vzut, la toate mamiferele de interes zootehnic, ns
obinerea unui nivel ridicat de fecundaie in vitro s-a nregistrat mult mai trziu.
Nivelul relativ sczut de fecundaie nregistrat n perioada de nceput a aplicrii
fecundaiei in vitros-a datorat n special, folosirii unei temperaturi inadecvate
acestei etape. S-a demonstrat c temperatura central la mamifere este de 39oC
ceea ce face ca nivelul procentului de fecundaie nregistrat la incubarea gameilor
la 37oC s fie extrem de sczut.
Etapele fecundaiei in vitro sunt:
- obinerea ovocitelor;
- maturarea in vitro a ovocitelor;
- capacitarea spermatozoizilor;
- fecundarea i cultura in vitro;
- transferul embrionilor rezultai.
3.1.1. Obinerea ovocitelor
Sursele posibile pentru ovocite sunt:
- ovocite provenite prin puncia foliculilor maturi de la femele cu estru
spontan sau superovulat, recoltate nainte sau imediat dup ovulaie;
- ovocite obinute din foliculi imaturi, recoltate din ovarele femelelor
sacrificate sau ovariectomizate;
- ovocite rezultate din oviducte, imediat dup ovulaie. Prima i a treia
surs de ovocite sunt limitate, deoarece numai un numr mic de foliculi se
matureaz i ovuleaz spontan, sau numai un numr relativ restrns de foliculi pot
fi activai prin injectarea hormonilor gonadotropi. Ovocitele mature pot fi
recoltate din foliculi maturi sau din oviduct n primele 6 ore de la ovulaie, plasate
ntr-un mediu Krebs-Ringer i incubate la 38oC, umiditatea relativ de 100% i
5% atmosfer de CO2.
Ovocitele obinute prin puncia ovarelor provenite de la animalele
sacrificate la abator sau a ovarelor obinute prin ablaia acestora, constituie o surs
important de gamei femeli, ns aceste ovocite necesit a fi maturate ,,in vitro.
Puncia foliculilor pe animalul viu permite folosirea donatoarelor de ovocite cu
potenial genetic cunoscut. Pentru recoltarea ovocitelor n astfel de condiii se mai
poate folosi un endoscop, cuplat la un sistem de aspirare, n vederea prelevrii
lichidelor foliculilor cu un diametru de 2-6 mm, de la vaci stimulate sau nu cu
95

hormoni gonadotropi exogeni. De asemenea, puncia foliculilor, ghidat prin

ecografie transvaginal permite colectarea fluidului folicular i a complexelor
ovocite-cumulus. Aceast tehnic poate fi repetat de mai multe ori n cursul
aceluiai ciclu, fr a afecta fertilitatea ulterioar a femelei donatoare.
3.1.2. Maturarea in vitro a ovocitelor
Ovocitele prelevate din foliculii antrali, prin laparotomie sau sacrificarea
femelelor, reiau spontan meioza dac sunt plasate ntr-un mediu special de cultur,
la 38oC, incubate ntr-o atmosfer de 5% CO2. Prezena unui cumulus compact i
intact n momentul cultivrii ovocitelor favorizeaz reluarea meiozei pentru
majoritatea ovocitelor. Studii de microscopie electronic au artat c celulele
cumulus-ului emit numeroase prelungiri ce traverseaz zona pelucid i stabilesc
legturi funcionale complexe cu citoplasma ovocitului. Aceste legturi, parial
sunt ntrerupte, dup 3 ore de cultur a ovocitului n mediul special, pentru ca
dup 16-18 ore de cultur, contactele dintre celulele cumulus-ului i ovocit s
dispar complet. Ruperea membranei nucleare se produce dup 6-12 ore de
cultur i emiterea primului globul polar dup 24 de ore. Aceste transformri
nucleare, ce deosebesc maturarea in vitro a ovocitelor, modificri observabile
prin tehnici histologice, sunt nsoite de modificri citoplasmatice mult mai greu
de decelat prin mijloace actuale de investigare. S-a dovedit, prin multiple
experiene, c ovocitele cultivate n foliculul lor se matureaz asemntor celei
observate ,,in vitro.
La oaie, Staigmiller i Moor, 1984 (citai de Marquant B., 1991) au artat
c adugarea unei suspensii de celule obinute din granuloasa foliculilor ovarieni
n mediul de cultur, permite o maturare normal a ovocitelor. La vac, nivelul
maturrii ovocitelor n medii cu sau fr adaos de celule din granuloas, nu
variaz mult, ns prezena acestor celule permite restabilirea potenialului de
dezvoltare a ovocitelor dup fecundaia in vitro.
Ovocitele obinute prin puncia foliculilor dispui mai n profunzimea
cortexului ovarian au un potenial de maturare i dezvoltare ulterioar mult mai
slabe, comparativ cu ovocitele obinute prin puncia foliculilor mari, maturi,
situai la suprafaa ovarului.

3.1.3. Capacitarea spermatozoizilor

Spermatozoizii mamiferelor nu sunt capabili de fecundare a ovocitelor, din
momentul ejaculrii. Spermatozoizii trebuie s parcurg o perioad de pregtire,
numit capacitare, care are loc in vivo, n tractusul genital femel. Capacitarea
este o etap pregtitoare necesar, n urma creia spermatozoizii dobndesc
capacitatea de a se fixa pe zona pelucid a ovocitului i sufer, apoi, reacia
acrozomului.
Studiile de microscopie electronic au artat c n decursul etapei de
capacitare au loc dou fenomene mai importante:
- modificri la nivelul membranelor spermatozoidului i acrozomic
extern, precum, migrarea proteinelor de acoperire cu formarea de zone libere de
proteine, ceea ce permite fuziunea membranelor plasmatice i acrozomic extern,
n momentul reaciei acrozomului. Prin orificiile create, se elimin o cantitate din
96

colesterolul care antreneaz o diminuare a raportului colesterol/fosfolipide,

asociate unei permeabiliti membranare crescute pentru ionii de calciu. Pe baza
acestei constatri, toate mediile de capacitare folosite au n comun prezena
serului albuminic, care este un acceptor de colesterol;
- modificarea micrii spermatozoidului care, din liniar (prin nurubare)
traiectoria devine, mai mult sau mai puin circular, micare ce se datoreaz
creterii permeabilitii pentru ionii de calciu. Amplitudinea micrilor cozii se
mrete, spermatozoidul fiind calificat ca hipermobil.
Diversele medii i tehnici ntrebuinate pentru capacitarea spermatozoizilor
,,in vitro au n vedere faptul de a permite spermatozoizilor s sufere toate aceste
modificri i mai ales s le menin o mobilitate ridicat.
Capacitarea spermatozoizilor s-a obinut prin incubarea acestora la 37oC,
timp de una-dou ore, ntr-un mediu cu o for ionic crescut, ceea ce a dus la
detaarea proteinelor de acoperire. Aplicarea acestei tehnici la sperma recoltat
prin ejaculare de la taur, a permis obinerea unui procent de fecundaie ridicat i
naterea de viei normali, dup transferul embrionilor obinui prin fecundarea
gameilor n astfel de medii. Diversele studii ntreprinse pe aceast problem, au
artat c fenomenul de capacitare a spermatozoizilor ,,in vitro este mult diferit de
cea realizat in vivo. n oviduct, n condiii naturale, fecundaia are loc n
absena celulelor din cumulus, pe cnd in vitro ovocitele nude, n momentul
contactului cu spermatozoizii sunt fecundate ntr-o proporie foarte sczut
comparativ cu ovocitele nconjurate de celule din cumulus. Aceasta presupune c
celulele din cumulus au probabil un rol n capacitarea in vitro a
spermatozoizilor.
Majoritatea cercettorilor care se ocup de aspectele fecundaei in vitro
folosesc sperma congelat, cu rezultate bune. Alte medii capacitante pentru
spermatozoizi sunt cele care conin ionoforul calcic, asociat sau nu cu cafeina.
Totodat, cafeina pare a fi un agent capacitant mai apropiat de condiiile naturale,
deoarece aceast substan se gsete pe traiectul cilor genitale dup ovulaie. S-a
dovedit c spermatozoizii de taur posed receptori pentru heparin, acetia
acionnd n funcie de doz i uureaz ptrunderea calciului n spermatozoid. Se
mai folosete, n mediile capacitante, lichidul folicular, care, ntre altele, conine i
heparin.
Un nivel de capacitare satisfctor se obine atunci cnd se practic o
concentraie ridicat de spermatozoizi n mediu, care trebuie s fie de 3-4 miliarde
spermatozoizi/ml, cnd nivelul fecundaiei atinge 87% dintre ovocite.
3.1.4. Fecundaia i cultura in vitro a embrionilor
Fecundarea se realizeaz prin cultura timp de o zi ntr-un mediu special a
0,1ml suspensie de spermatozoizi, cu concentraie ridicat, mpreun cu ovocite
mature, n atmosfer de 5%CO2, 5%O2 i 90%N2.
Dup 24 de ore de cultur mpreun cu spermatozoizii, ovocitele fecundate
sunt transferate ntr-un mediu special n vederea dezvoltrii ulterioare. Ovocitele
se examineaz la stereolup i sunt considerate ca fecundate atunci cnd se
constat:
- prezena spermatozoizilor n spaiul perivitelin;
- prezena spermatozoizilor n ovoplasm;
- prezena pronucleilor i apariia segmentaiei.
In vivo, dup fecundaie, embrionul ncepe dezvoltarea sa n oviduct,
nainte de a ajunge n uter (ziua 4-5 la rumegtoare), n stadiul de morul tnr.
97

In vitro, oricare este mediul de cultur folosit, zigoii se blocheaz n

stadiul de 8 celule. Pentru mult timp, singurul mijloc de a asigura depirea
stadiului de blocaj evolutiv l-a constituit transferul tinerilor zigoi n oviductul
unei gazde intermediare (iepuroaic) i apoi transferul lor n uterul femelelor
receptoare. Experienele au dovedit c cultura zigoilor de rumegtoare pe un strat
de celule tubare a permis obinerea blastocitilor i a nou-nscuilor, dup
transferul la femelele receptoare. Totodat s-a demonstrat c prin co-cultura
zigoilor cu vezicule trofoblastice permitea la circa 40% dintre acetia s
depeasc stadiul de 8 celule (Marquant B. i colab.,1991).
Oule fecundate in vivo, apoi cultivate in vitro pe un strat de celule
prelevate din oviduct, unde evolueaz pn la stadiul de blastocist, au un aspect
morfologic normal. Totui, studiul histologic atent a relevat faptul c aceti
blastociti, comparativ cu cei prelevai in vivo sunt alctuii dintr-un numr
redus de celule, multe dintre ele pe cale de degenerare. ns cultura embrionilor pe
un strat de celule tubare, apoi uterine i adiionarea unui factor de cretere n
mediul de cultur a permis realizarea unui nivel important de dezvoltare pn la
stadiul de blastocist ca i a unui nivel de ecloziune, comparabil cu cel realizat in
vivo. Aceste experiene demonstreaz faptul c oviductul nu ndeplinete un rol
specific n trecerea de la starea de blocaj spre stadiile ulterioare evolutive,
deoarece blastocitii pot fi obinui i prin co-cultura cu celule trofoblastice, din
cumulus, ca i cu celule prelevate din oviduct.
3.1.5. Transferul embrionilor obinui in vitro
Se face n uterul femelelor receptoare, din aceeai specie, a crei ciclu
sexual a fost sincronizat cu vrsta embrionilor obinui in vitro.
Nivelul gestaiei n urma transferului sincron i asincron a embrionilor bovini
cultivai in vitro arat c nivelul cel mai ridicat de gestaii s-a obinut atunci
cnd femelele receptoare se gsesc n ceea ce privete ciclul sexual, n ntrziere
cu una-dou zile, fa de vrsta teoretic a embrionilor (tab. 1).
Embrionii obinui conin un numr mai redus de celule, cu toate c
morfologic apar normali, de aceea nivelul gestaiei este mai ridicat atunci cnd
receptoarele sunt din punct de vedere al ciclului sexual n ntrziere, n raport cu
vrsta teoretic a embrionului. Aceasta evideniaz faptul c mediile de cultur
folosite nu sunt adecvate integral. Nivelurile de dezvoltare a embrionilor obinui
in vitro transferai receptoarelor i a gestaiei sunt mai sczute comparativ cu cei
obinui dup transferul de embrioni in vivo.
Tabelul 1
Nivelul gestaiei dup transferul sincron al embrionilor bovini dup
maturare, fecundare i cultur in vivo n condiiile transferului a cte 2
embrioni/receptoare (Kajihira i colab.,1990 cit. de Marquant B. i colab.,
1991)
Sincronism ntre stadiul de
dezvoltare al embrionilor i stadiul
ciclului sexual al receptoarelor
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
0 la +1
98

Numr de
receptoare

Gestaii
(%)

8
22
17
27
13

63
82
59
59
46

Pe ansamblul aplicrii acestei biotehnici, nivelurile gestaiei sunt mai slabe

n raport cu numrul ovocitelor folosite, chiar atunci cnd zigoii sunt cultivai n
oviductul unei gazde intermediare.
3.1.6. Importana, perspectivele i aplicaiile fecundaiei
in vitro
Contrar ameliorrilor tehnice aduse n ultimii ani acestei biotehnici,
randamentul global rmnea relativ sczut, fapt ce a ncetinit ritmul aplicrii n
practic pe o scar mult mai mare. Cercetrile ulterioare trebuie s fie orientate,
mai ales, spre creterea randamentului diverselor etape, n particular cea a culturii
embrionilor.
Cu toate dificultile ntmpinate, fecundarea in vitro rmne un necesar
i indispensabil stadiu pentru nelegerea diferitelor fenomene, ndeosebi a
stadiilor dezvoltrii iniiale a embrionului.
La bovine, folosirea pentru fecundaia in vitro a ovocitelor provenite de
la femele fr valoare genetic (recoltate de la abator) permite stabilirea unui
diagnostic precoce a fertilitii taurilor folosii la nsmnri artificiale. ntradevr, s-a pus n eviden o corelaie ntre nivelul dezvoltrii globale in vitro
(numrul de blastociti/numr ovocite supuse fecundrii) i fertilitatea taurilor in
vivo (nivelul NR% la dou-trei luni).
Tehnica maturrii in vitro permite producerea la preuri sczute a unui
numr mare de ovocite care pot fi utilizate ca receptoare de nuclei ai embrionilor
provenii de la vacile cu nalt potenial genetic, n cursul clonrii. Acest aspect
este valorificat comercial de unele firme americane.
Puncia foliculilor antrali, pe animalul n picioare, prin folosirea metodelor
endoscopice sau ecografice transvaginale permite folosirea femelelor donatoare de
ovocite de un nalt potenial genetic, ntr-un numr ridicat. Acest tip de colectare
i maturare in vitro a ovocitelor va deveni rentabil numai atunci cnd
randamentele realizate vor permite producerea, pe donatoare, a unui numr de
embrioni superior celui obinut n prezent prin superovulare, fecundaie in vivo
i colectare transcervical a zigoilor.
Prin practicarea acestei biotehnici exist posibilitatea reducerii numrului
necesar de spermatozoizi pentru a obine o fecundaie, i n consecin, folosirea
cu intensitate sporit a spermei provenit de la animale valoroase pentru
fecundarea unui numr crescut de ovocite, comparativ cu celelalte biotehnici
(nsmnri artificiale i transfer de embrioni).
Totodat, fecundaia in vitro va permite n viitorul apropiat
intensivizarea procesului de ameliorare genetic a efectivelor de animale.
Prin aceast biotehnic, se pot obine mai multe ovocite de la aceeai
femel, ovocite care pot fi fecundate cu spermatozoizi provenii de la mai muli
reproductori, fapt ce ar constitui un mare avantaj pentru testarea reproductorilor
masculi i femeli.
Microinjecia de spermatozoizi n ovocitele maturate in vitro reprezint
o alt cale de obinere de embrioni normali. Dup activarea ovocitei, oule au fost
cultivate pn la stadiul de morul-blastocist i transferate la femele receptoare,
obinndu-se, deja, unele rezultate.
Posibilitatea de a avea, dup fecundaia in vitro, un numr crescut de
embrioni ntr-un stadiu precis de dezvoltare prezint un mare avantaj pentru o alt
biotehnic de reproducie, transgeneza. ntr-adevr, microinjecia artificial a unei
gene se efectueaz n stadii precise de dezvoltare, n general n stadiul de doi
pronuclei sau de dou blastomere. Deja, unele echipe de cercettori i-au propus
99

s foloseasc spermatozoidul ca vector al genei ce urmeaz a fi transferat, n

cazul fecundaiei in vitro, rezultate ncurajatoare obinndu-se pe oareci.
Oricare ar fi biotehnicile utilizate (clonaj transgenez), rezultatul este
totdeauna un ou n stadiul de una-dou celule pe care trebuie testat dezvoltarea
ulterioar prin tehnici mai puin costisitoare, comparativ cu transferul pe cale
chirurgical n oviductul unei femele receptoare.
Maturarea ovocitelor, fecundaia in vitro i cultura embrionilor obinui
sunt etape de mare interes pentru mamiferele domestice, ns dirijarea acestor trei
etape prezint importan pentru dezvoltarea tehnicilor de clonare i transgenez.
3.2. Bisecia embrionilor
Tehnicile de micromanipulare perfecionate i simplificate n ultimul timp,
au fcut posibil microchirurgia embrionar. Micromanipulrile sunt facilitate de
faptul c oule (zigoii) majoritii speciilor de mamifere sunt circumscrise de o
zon pelucid acelular. Zona pelucid ndeplinete mai mult atribuii referitoare
la protecia fizic a zigotului. Rezistena acestei membrane permite meninerea
oului
n depresiunea extremitii unei micropipete fr a afecta structura intern a oului.
Aceast nsuire uureaz mult intervenia microinstrumentelor. Prin practicarea
tehnicilor de micromanipulare, n prezent se poate interveni pe zigot pentru:
- obinerea jumtilor monozigote, prin bisecie;
- sexarea embrionului;
- producerea de himere;
- obinerea de indivizi transgenici;
- producerea clonelor.
Bisecia
embrionilor
const n secionarea n dou
jumti a zigoilor aflai n
stadiul de morul trzie sau de
blastocist tnr (6-8 zile) (foto
25). Aceast biotehnic are ca
baz fiziologic constatarea c la
mamifere, n mod natural, apar
jumti i uneori chiar triplete
monozigote. Primele studii
fcute pe embrioni de oareci i
iepure au artat c un blastomer
protejat de propria zon pelucid
este capabil de a se dezvolta i
Foto 25 Bisecia embrionilor
de a produce un
individ normal. ns, un blastomer izolat, transferat fr zona pelucid sau
reintrodus ntr-o zon pelucid larg deschis este incapabil de evoluie (Nibart M.,
1991).
Ozil, 1982 (cit de Nibart M.,1991) a propus secionarea n dou pri egale
a embrionilor de 6-8 zile, stadiu n care rolul zonei pelucide nu mai prezint
importan. El a dezvoltat un sistem de microchirurgie cu ajutorul mai multor
instrumente, folosite n aa fel nct s lezioneze ct mai puin posibil zona
pelucid i repunerea fiecrui demiembrion n cte o zon pelucid. Rezultatele
obinute, exprimate n G% dup transfer, au fost considerate ca excelente: 27 de
produi pentru 25 de embrioni secionai. Numeroi autori au continuat bisecia
100

embrionilor bovini simplificnd tehnica, ce este format numai din dou

microinstrumente.
Voelkel i colab., (1948), Baker i Shea (1985), Picard i colab. (1985, cit.
de Nibart M., 1991) .a. au demonstrat c nu mai este necesar repunerea
embrionului ntr-o zon pelucid naintea transferului, ceea ce a simplificat mult
metoda.
Cu ajutorul a dou micromanipulatoare, unul purtnd micropipeta, cellalt
microcuitul, un operator antrenat poate obine n cteva minute doi
demiembrioni, viabili, n condiiile biseciei unice a embrionilor de bun calitate,
apreciai n stadiul de morul compact-blastocist tnr.
Dup transferul celor dou jumti la femelele receptoare, nivelurile
gestaiei se situeaz ntre 50% i 65%, ns pentru majoritatea autorilor, nivelurile
gemelaritii au fost de 50%. Nu s-au nregistrat diferene n nivelul obinerii de
gemeni, indiferent dac acetia au fost repui amndoi n cornul uterin ipsilateral
ovarului cu corp galben sau repus fiecare n cte un corn uterin al aceleiai
receptoare.
S-au obinut unele rezultate (50% gestaii) dup transferul jumtilor de
embrion conservate prin refrigerare timp de 24 de ore la 2-4oC. Congelarea n azot
lichid a jumtilor de embrion repuse n zona pelucid, a condus la obinerea unui
nivel sczut de gestaii (20%). Dac nainte de congelare embrionii sunt meninui
ntr-un mediu de cultur (2-24 de ore), nivelul gestaiilor obinute este mult mai
ridicat.
Rezultatele obinute arat c embrionii buni de 40-80 de celule, sunt
capabili, prin bisecie, s dea doi demiembrioni care, transferai n uterul
receptoarelor, s evolueze normal, cu toate c au de recuperat circa jumtate din
celulele embrionului iniial. Rezultate n obinerea gemenilor monozigoi, sunt
superioare cnd se lucreaz cu blastociti tineri, comparativ cu stadiul de morul
tnr.
ncercarea de a obine gemeni tripli sau cvadrupli, prin secionarea
embrionilor n stadiul de 40-80 de celule nu s-a soldat cu rezultate satisfctoare,
ceea ce arat c aceast biotehnic este limitat de numrul restrns de gemeni (2)
ce pot fi obinui dintr-un singur embrion. Dac, de exemplu, considerm n medie
pe donatoare 5 embrioni viabili (trei buni i doi medii), dup transferul acestora se
obin n principiu trei viei. Prin bisecia celor trei embrioni buni i transferul
fiecrei jumti la cte o receptoare, este posibil s se obin tot trei viei (50%
gestaie) sau, per total 4 viei. Ctigul de un viel presupune existena a 8
receptoare, n loc de 5. Dac nivelurile gestaiei sunt mai sczute (50%-30%)
sporul de un viel obinut pe o donatoare superovulat este anulat. n condiiile
atingerii unor rezultate normale, prin practicarea biseciei embrionilor se pot
obine, n medie, 4 viei pe donatoare n loc de trei viei, ceea ce presupune un
ctig de 33% a numrului descendenilor provenii de la fiecare femel
superovulat. n aceste condiii, o selecie bine dirijat, accept cu rezerve
pstrarea a mai mult de un singur exemplar al unei familii clonate, din cauza
reduciilor majore survenite n variana genetic i n sporirea consangvinitii. n
aceste circumstane, producerea unor familii biclonate pentru toi indivizii
distinci genetic se poate face numai prin reducerea la jumtate a numrului unor
astfel de indivizi, prin aceasta scznd nsi intensitatea seleciei. Continuarea
bisecionrii embrionilor (clonrii) erodeaz intensitatea seleciei prin reducerea
progresului genetic, mrete consangvinitatea, scderea intensitii seleciei
nefiind compensat prin ctigurile obinute n precizia seleciei sau exactitii
rezultatelor ei (Woolliams G.A., 1989).
101

Biotehnica biseciei embrionilor este totui bun pentru producerea

adevrailor gemeni, necesari testrii unor preparate farmaceutice sau a furajelor,
factorul genetic fiind nlturat.
Obinerea himerelor s-a realizat prin microchirurgie, la rumegtoare i
suine, constnd n amestecul de celule embrionare de la specii diferite.
3.3. Sexarea embrionilor
Determinarea sexului embrionului nu este realizabil dect la vrsta la care
se face transferul acestuia (6-8 zile). Este considerat ca o descoperire economic
de mare importan i const n prelevarea ctorva celule care sunt investigate
citogenetic, imunologic, enzimologic etc. n vederea determinrii sexului
produsului de concepie nc din acest stadiu incipient de dezvoltare.
Metoda genetic (cariotipic) se bazeaz pe recunoaterea citologic a
cromozomului y, specific masculilor. Este vorba de o tehnic ce permite
efectuarea sexrii zigoilor, pornind de la un numr mic de celule prelevate de la
zigoi i care s nu compromit dezvoltarea ulterioar a embrionului. Recent,
folosirea unei sonde moleculare specifice cromozomului y la bovine, pare s
rspund tuturor ateptrilor. Unele echipe de cercetare acioneaz n direcia
trierii spermatozoizilor purttori ai cromozomului x i y, pe baza diferenei
acestora n ce privete coninutul n ADN. Aceast metod, mpreun cu
fecundaia in vitro ar furniza un procedeu ideal care s rspund necesitilor
zootehnice moderne.
Metoda imunologic const n cutarea pe suprafaa celulelor masculine a
antigenului de citocompatibilitate, prin folosirea unor anticorpi monoclonali
specifici pentru acest tip de antigen.
Metoda enzimologic se bazeaz pe faptul c unele enzime celulare sunt
codificate de ctre gene aparinnd cromozomului x. Cantitatea acestor enzime
este , deci, de dou ori mai mare n celulele femele dect n celulele mascule.
Determinarea activitii acestor enzime ntr-un blastomer izolat a permis sexarea
embrionilor ntr-o proporie ridicat.
Tehnica amplificrii ADN (PCR). Dup descoperirea posibilitilor de
amplificare enzimatic dirijate de ADN-ul celular, unii cercettori au dezvoltat o
tehnic de sexare prin amplificarea enzimatic (PCR-Polimerase Chaine Reaction)
a secvenei lor specifice. Sexajul este efectuat pe 5-10 celule prelevate prin
biopsia embrionilor de bun calitate. Plecnd de la aceste celule, determinarea
sexului se sprijin pe detectarea unei secvene specifice a ADN-ului
cromozomului y printr-o sond molecular complementar. Aceast secven este
amplificat de PCR. ADN-ul amplificat este separat prin electroforez i
vizualizat prin fluorescen.
Avnd n vedere tehnicile pentru sexare (evidenierea ADN specific) i
sensibilitatea specific (amplificarea ADN de ordinul a 105), biopsia trebuie s fie
realizat n cele mai bune condiii igienice i tehnice.
Sexarea embrionilor nainte de implantare, ofer posibilitatea stabilirii
raportului de sexe ntr-o populaie, n sensul dorit de cresctori funcie de
necesarul de animale de reproducie, carne, lapte etc.

102

3.4. Transplantarea nucleilor i obinerea de clone

Clonajul embrionar const n producerea mai multor animale pornind de la
un singur embrion. Acestea pot fi obinute prin simpla seciune sau disociere a
unui embrion, n stadiul de preimplantare (bisecia embrionilor). Prin aceast
metod s-au produs numeroase perechi de viei gemeni, ns foarte rar s-au putut
obine triplete sau gemeni cvadrupli. Teoretic, tehnica transferului nucleului
permite obinerea unui numr mare de indivizi plecnd de la un singur embrion,
avnd n vedere faptul c patrimoniul genetic al tuturor nucleilor unui embrion
tnr este identic, n sensul c poart aceeai informaie genetic. Transferul
nucleilor celulelor provenite de la acelai embrion n mai multe ovocite enucleate
i activate, este urmat de evoluia ovocitelor spre indivizi genetic identici.
Posibilitatea obinerii de serii de animale identice genetic prezint interese
multiple pentru zootehnie. Astfel, n activitatea de selecie, folosirea unor clone,
chiar limitate numeric, ofer posibilitatea evalurii cu nalt precizie a valorii
reproductorilor. Animale cu acelai genotip, ntreinute n ferme diferite, sunt
exceleni subieci de studiere a influenei factorilor de mediu asupra
performanelor acestora. Totodat, obinerea mai multor copii a reproductorilor
foarte valoroi va contribui la creterea i difuzabilitatea progresului genetic, ns
cu reversul micorrii patrimoniului genetic al efectivelor de animale.
Pentru producie, plecnd de la rasele de carne, embrionii provenii de la
un genitor cu o excelent conformaie (caracter cu coeficient mare de
heritabilitate) vor putea fi multiplicai prin clonare i transplantai, cu producerea
unor loturi de animale cu carcase omogene i de calitate superioar.
De asemenea, pe termen lung, obinerea i comercializarea embrionilor
clonai n mari serii, asociat cu maturarea in vitro vor permite scderea
considerabil a transferului embrionar.
Briggsi i King (1952) au artat c nucleii prelevai, n stadiul de blastul,
la broasc i grefai n ovocite, pot s-i continue dezvoltarea pn la stadiul de
blastul, iar n 1962 Mc Kinnel a obinut, prin aceeai metod, broate adulte.
Pentru embrionul de mamifere, n 1986 Willadsen S., la Cambridge a
obinut pentru prima dat trei miei dup transfer de nuclei, provenii de la un
embrion n stadiul de 8 celule (Heyman Y. i colab., 1991).
La taurine, s-au obinut de ctre diferite echipe de cercettori clone
constituite din 8-9 viei, iar la iepure s-a obinut o clon de 6 indivizi, plecnd de
la un embrion congelat n stadiul de morul.
Transferul de nuclei parcurge trei etape (Heyman Y. i colab., 1991):
- obinerea de ovocite enucleate destinate de a primi nucleii;
- izolarea nucleilor embrionului donator;
- reconstituirea de serii de embrioni monocelulari.
3.4.1. Pregtirea ovocitelor receptoare
Prima operaie const n extragerea genomului maternal al ovocitei
receptoare. Pentru aceasta, se folosesc ovocite mature care, n absena
fecundaiei sau a activrii, se gsesc blocate n stadiul de metafaz II a meiozei.
Retragerea nucleului poate fi realizat prin micromanipulare, ptrunznd cu vrful
unei micropipete n interiorul celulei i aspirnd uor cromozomii. Pentru a se
evita ruperea membranei viteline a ovocitului, cum se ntmpl cel mai adesea,
ovocitele sunt pretratate cu droguri care inhib polimerizarea microfilamentelor i
microfibrilelor scheletului celular.
103

Ovocitele prelevate in vivo, imediat dup ovulaie sau obinute prin

maturare in vitro sunt debarasate de celulele lor periovocitare printr-un
tratament enzimatic cu hialuronidaz i apoi incubate n prezena cytochalasinei B
(5-7 g/ml). Dup denudare, fiecare ovocit este enucleat, prin imobilizare n
depresiunea unei micropipete, apoi cu cea de-a doua micropipet se puncioneaz
zona pelucid, se aspir globulul polar mpreun cu o fraciune de citoplasm
adiacent, coninnd cromozomii metafazici.
3.4.2. Izolarea nucleilor embrionului donator
Embrionul, selecionat ca donator de nuclei, este prelevat n stadiul de
morul, cnd posed 16-64 de celule, funcie de specie i vrsta acestuia. n acest
stadiu evolutiv, punerea n micare a genomului embrionar deja s-a produs. Se
folosesc i embrioni congelai i care se gsesc n stadiul de morul.
Embrionul donator este debarasat cu mult atenie de zona pelucid,
folosind o soluie de tyrode acid. n acest stadiu, celulele au nceput deja s
stabileasc ntre ele relaii funcionale (de exemplu gap-joncion). Pentru
disociere, embrionul este incubat timp de treizeci de minute, ntr-un mediu lipsit
de ioni de calciu, dup care blastomerele pot fi separate, fr leziuni, prin
intermediul unor micropipete.
3.4.3. Reconstituirea embrionilor
Dup separarea blastomerelor, n cel mai scurt timp se introduce fiecare
blastomer n interiorul zonei pelucide a ovocitei receptoare, enucleate n
prealabil.
Dup introducerea blastomerului sub zona pelucid, fuziunea
membranelor celulei donatoare i ovocitul receptor se realizeaz prin
electrofuziune. Pentru aceasta, ovocitul se plaseaz ntre doi electrozi i este supus
la unul sau mai multe impulsuri foarte scurte de curent continuu. Stimulii electrici
provoac pori membranari, destabiliznd straturile de fosfolipide juxtapuse, iar
membranele fuzionate permit astfel nucleului donator s ptrund n noul su
mediu citoplasmatic. Pe de alt parte, stimularea electric activeaz ovocitul
receptor, prin declanarea mecanismelor de reprogramare a nucleului transplantat.
Electrofuziunea se realizeaz ntr-un mediu izotonic i se observ n urmtoarele
treizeci de minute de la stimulare i estimat, fie prin umflarea nucleului donator
n noul su mediu citoplasmatic, fie prin terminarea diviziunii celulare i apariia
stadiului de dou celule.
n prezent, unul din factorii limitani n aplicarea acestei biotehnici l
reprezint numrul relativ redus de ovocite receptoare. Creterea numrului de
ovocite ,,receptoare se poate obine prin maturarea in vitro a acestora, pornind
de la ovarele recuperate n abator de la femelele sacrificate. Tot n plan practic,
este de mare interes posibilitatea congelrii acestor ovocite, astfel nct s se
dispun n orice moment de necesarul de ovocite receptoare. Un alt factor limitant
este reprezentat de numrul relativ redus de celule ale embrionilor de la care
urmeaz s se transfere nucleii.
Cu toate dificultile pe care le ridic, clonajul embrionilor creeaz o nou
cale n optimizarea reproducerii animalelor.

104

3.5. Transgeneza
Ameliorarea efectivelor de animale s-a bazat, tradiional, pe progresele
nregistrate n selecia genetic, dirijarea reproduciei, echilibrul raiilor de hran,
etc. Tehnicile geneticii moleculare ofer, n prezent, noi posibiliti care ncep a fi
exploatate eficient. Astfel, sondele moleculare vor permite cunoaterea
patrimoniului genetic al animalelor iar multiplele combinaii rezultate din mutaie
i asocierea secvenelor de ADN ofer multe posibiliti de reprogramare a unei
celule sau a unui organism ntreg. Astfel, dac o gen izolat este introdus ntr-o
celul, aceasta va sintetiza o nou protein i caracteristicile acestei celule vor
putea fi astfel modificate. De asemenea, dac o gen izolat este introdus ntr-un
organism ntreg, nsuirile genetice ale acestuia vor fi modificate. Aceast operaie
poart numele de transgenez. Gena strin, introdus n noul organism, va fi
transmis la descendeni obinndu-se n acest fel o linie de animale care au
nsuiri biologice noi.
Primele observaii n acest domeniu s-au fcut n 1981 pe oareci. Este
posibil, prin transgenez, obinerea de noi animale, perspectivele deschise de
aceast nou biotehnic fiind considerabile.
Obinerea de animale transgenice include mai multe etape:
- izolarea sau construcia genei de transferat;
- colectarea embrionilor;
- introducerea genei n embrioni;
- transferul embrionului la o femel receptoare;
- identificarea transgenei la nou-nscui;
- msurarea expresiei transgenei;
- stabilirea de linii homozigote, pornind de la animale transgenice
fondatoare.
Izolarea sau construcia genelor se face prin tehnici genetice adecvate
care permit att izolarea ct i mutarea dup voin a oricrei gene. O gen
funcional material sau reconstruit conine totdeauna aceleai elemente:
regiunea regulatore, regiunea codant i terminatorul. Astfel, regiunile care
particip la reglarea transcripiei genei se situeaz n amonte de zona codant.
Colecia de embrioni. Transgeneza fiind o operaie cu randament sczut,
sunt necesari mai muli embrioni pentru a economisi la maximum femele
donatoare. Embrionii pot fi obinui n mai multe moduri:
- prelevnd ovare de la femelele sacrificate la abator;
- prin maturarea ovocitelor in vitro;
- prin practicarea fecundaiei in vitro.
Introducerea genei n embrion se poate realiza prin microinjecie, prin
folosirea de vectori retrovirali sau prin folosirea celulelor ES (Embryo stem cels).
Microinjecia const n injectarea direct a soluiei de ADN n pronucleul
mascul, care este mai mare, mai apropiat de periferia zigotului n momentul
injeciei. Un obstacol important la injectare este dat de opacitatea oulor, ceea ce
face dificil vizualizarea celor doi pronuclei.
Virusurile, nainte de a folosi mecanismul celular pentru replicarea lor,
sunt ,,a priori exceleni vectori pentru a introduce gene strine ntr-o celul.
Retrovirusurile se ncorporeaz n genomul gazd, n general, ntr-o singur copie
i fr rearanjare, deci sunt extrem de utile pentru introducerea genei strine n
celulele somatice n cultur i apoi se reintroduc aceste celule n individ.
Utilizarea celulelor ES, const n izolarea celulelor unui embrion precoce
i cultivarea lor n condiii n care celulele nu se difereniaz. Cnd aceste celule
ES sunt reintroduse ntr-un embrion precoce particip la dezvoltarea embrionului,
dnd natere la animale himere. O gen strin poate fi introdus, prin procedee
105

clasice de transfer, n celule ES, n cultur. Aceste celule reintroduse n embrion

constituie vectorul transgenei. Animalele himere transgenice care rezult sunt
mozaicate. Descendenii lor motenesc sau nu transgena numai dac celulele
germinale parentale conin sau nu transgena.
Transgenele introduse, prin una din aceste metode, se inser n genomul
gazd n poziii imprevizibile.
Introducerea transgenelor se mai poate realiza i prin alte mijloace. Unul
dintre aceste mijloace const n a pune n contact ADN-ul i spermatozoizii i a
proceda apoi la o fecundaie in vitrosau in vivo. O alt cale prin care gena
strin poate fi transferat n celule n cultur, cu o eficacitate nalt, este
electroporaia. Tehnica aceasta const n a supune celulele incubate n prezena
ADN, la cmpuri electrice care destabilizeaz membrana i creeaz pori prin care
ADN-ul ptrunde n celule. Aceast tehnic se folosete i pentru spermatozoizii
i embrionii de mamifere.
Detectarea transgenelor se face prin metode clasice ale geneticii
moleculare. Ele constau n a hibrida un fragment de ADN complementar genei,
radioactivat, cu ADN-ul celular total.
Detecia produilor transgenici const n a evalua expresia transgenelor
prin msurarea cantitii de ARN corespondent. Proteinele derivate din transgene
pot fi msurate n snge, dac sunt secretate, cu ajutorul testului RIA
(radioimunoanaliz). Aceste metode permit s se determine n care organ, tip
celular i moment al dezvoltrii, transgena se exprim.
Tansgeneza a fost ncercat pe multe specii de animale, cu anumite
succese. Randamentul biotehnicii, evaluat n numr de celule transgenice obinute,
raportat la numrul embrionilor microinjectai, variaz mult cu colectivele de
cercettori. O evaluare sumar a acestui randament arat c este nevoie de circa
10 oareci aduli pentru a spera obinerea unuia transgenic, 40 de oi pentru un miel
transgenic i 40 de vaci pentru un viel transgenic. Aceste rezultate arat c preul
de cost al unui produs transgenic este foarte ridicat.
Prin transgenez s-a ncercat obinerea de animale cu un ritm de cretere
accelerat, cu o producie de lapte mai mare i cu un coninut n protein mai
ridicat, cu o producie de carne mai bun, cantitativ i calitativ, rezistente la
diverse maladii etc. Cu toate rezultatele ncurajatoare obinute la diverse specii,
aceast biotehnic se gsete doar la perioada de nceput, necesitnd multe
ajustri, astfel nct randamentul obinut s micoreze preul de cost al produsului
transgenic i care s fie conform cu normele sanitare i sanitar-veterinare
internaionale etc.
NTREBRI RECAPITULATIVE
1.
2.
3.
4.
5.

Care sunt etapele fecundaiei in vitro?

Care sunt importana i tehnica biseciei embrionilor?
Care sunt metodele prin intermediul crora se pot sexa embrionii?
Care sunt importana i etapele transferului de nuclei?
Care este rolul transgenezei?

TEME
1. Biotehnici moderne de reproductie
REFERAT
1. Realizri moderne n domeniul fecundaiei in vitro
2. Situaia actual i perspectivele clonrii i transgenezei
106

BIBLIOGRAFIE SELECTIV

1. Aughtry, S.D., 1987 - Embryo Transfer, 2, 3, p 3-4

2. Baril, G. i colab., 1993 - Manuel de formation pour l'insmination artificielle
ches les ovins et les caprins. Etude FAO, Roma.
3. Baril, G. i colab, 1993 - Manuel de formation practique pour la
transplantation embryonnaire chez la brebis et la chevre. Etude FAO,
Roma.
4. Bogdan, Al. i colab., 1981 - Reproducia animalelor de ferm. Edit.Scrisul
romnesc, Craiova
5. Bogdan, Al. i colab.,1984,1985 - Fertilitatea, natalitatea i prolificitatea n
zootehnie, vol I i II, Edit Dacia, Cluj-Napoca
6. Boitor, I., 1979 - Endocrinologia reproduciei la animalele de ferm. Edit.
Ceres, Bucureti
7. Bunaciu, P., 1977 - nsmnarea artificial a ginilor de reproducie ntreinute
n baterii. Rev. de cretere a animalelor, nr. 10
8. Crlan, M., 1982 - Sincronizarea cldurilor i ovulaiei la taurine. Redacia de
propagand tehnic agricol, Bucureti
9. Confederat Margareta, 1998 - Cercetri cu privire la influena alimentaiei
asupra supravieuirii embrionilor la caprine n condiiile efecturii
transferului de embrioni. Tez de doctorat, Univ. Agron. i de Med. Vet.,
Iai
10. Drugociu, G. i colab., 1977 - Patologia reproduciei i clinic obstetrical.
Edit. Did. i Ped., Bucureti
11. Dumitrescu, I. i colab., 1976 - Reproducia la bovine. Edit Ceres, Bucureti
12. Dumitrescu, I. i colab., 1978 - nsmnrile artificiale la animale. Edit.
Ceres, Bucureti
13. Dumitrescu, I., 1987 - Reproducia la cabaline. Edit. Ceres, Bucureti
14. Elsden Peter, R., 1987 - Manual for embryo transfer, 6599 Country Rd. 29C,
Bellvue, , USA
15. Feredean, T., 1974 - Reproducia la porcine. Edit. Ceres, Bucureti
16. Feredean, T., Drume, Ch., 1977 - Transferul de embrioni la animale. Edit.
Ceres, Bucureti
17. Gluhovschi, N. i colab., 1972 - Biologia i patologia reproduciei. Edit. Did.
i Ped.,Bucureti
18. Groza, {t. I., 1996 - Actualiti i perspective n biotehnologia transferului de
embrioni la specia ovin. Edit. Ceres, Bucureti
19. Halga, P. i colab., 1999 Alimentaia i reproducia la erbivore domestice.
Edit. Dosoftei, Iai
20. Hansel, W. i colab.,1983 - Fiziologia ciclului estral. Rev. Soc. de Med. Vet.,
Bucureti
21. Haubebine, L. M., 1991 - Rec. Med. Vet., 167(314), 323-333
22. Heyman, Y., Chesne, Renard, J.P.,1991 - Rec. Med. Vet., 167(314), 315322
23. Liciu, Gh., Roca, O., 1988 - Ghid tehnic privind nsmnarea la ovine i
caprine. Edit. Ceres, Bucureti

107

24. Liciu, GH.,Roca, O., 1998 Tehnica nsmnrii artificiale la bovine

Ghid practic. Edit. Ceres, Bucureti.
25. Liciu, GH., Roca, O., 1999 - Tehnica nsmnrii artificiale la suine - Ghid
practic. Edit. Ceres, Bucureti.
26. Mantea, {t., 1998 - Contribuii la biotehnologia transferului de embrioni la
suine. Tez de doctorat, Fac. de Med. Vet., Bucureti
27. Mapletoft, R. J., 1987 - Embryo Transfer, 2, 3, p. 4-6
28. Marquant, Le Guienne, 1991 Rec. de Med. Vet., Ian. 167, nr. 314, p. 303312
29. Nibart, M., 1991 - Rec. de Med. Vet., 167(314), 261-290
30. Paraipan, V., 1982 - Hormonoterapia n reproducia animalelor. Edit. Ceres,
Bucureti
31. Paraschivescu, M., 1969 - Reproducia la ovine. Edit. Agro-Silvic, Bucureti
32. Peyraud, J. C., 1986 - La transplantion embryonnaire s'implante, Elevage
2000, nr. 1, p. 47-49
33. Roca, O ., 1994 - Biotehnica reproduciei la porcine prin nsmnare
artificial. Edit. Ceres, Bucureti
34. Runceanu, L.,1995 - Reproducia i patologia reproduciei. Lito., Univ.
Agron. Iai
35. Sauveur, B., Reviers, M., 1988 - Reproduction des volailles et production
d'oeufs. INRA, Station de Recharches Avicoles, Paris
36. Seiciu, Fl. i colab.,1989 - Reproducia normal i patologic la animalele
domestice, vol. I i II, Edit. Ceres, Bucureti
37. Tnase, D.,1993 - Biologia reproducerii animalelor i transferul de embrioni .
Lito., Univ. Agron. Iai
38. Tnase, D.,1995 - Biologia i patologia reproducerii animalelor. Curs, Lito.,
Univ. Agron. Iai
39. Vallet, J. Ch. i colab., 1991 - Rec. Med. Vet., 167(314), 293-301
40. Woolliams, G. A., 1989 - Animal Production, t 48, partea I, p.31-36, Anglia

108