POSIBILITI DE TERAPIE N BOLILE

GENETICE

Se cunosc peste 5000 boli genetice,

Sunt identificate foarte multe dintre mutaiile care
determin afeciunile monogenice.
! Foarte important consultul genetic stabilete
diagnosticul, conduita terapeutic, informnd
familia asupra riscului recurenei bolii n
generaii.
! Foarte important - mbuntirea testelor pentru
diagnosticul prenatal o bun profilaxie genetic.
Un pas decisiv n corectarea bolilor genetice l va
reprezenta transferul de gene.

Ingineria genetic

Tehnicile de genetic molecular sunt aplicate n

tratamentul diferitelor afeciuni datorit
posibilitii sintezei unor proteine sau vaccinuri
prin inginerie genetic.
Metodele utilizate:

Exprimarea genelor cu structur normal, clonate, n

vederea sintezei unor cantiti mari de produi genici
Producerea de anticorpi care pot fi utilizai ca ageni
terapeutici
Producerea de vaccinuri, inclusiv vaccinuri noi pentru
anumite forme de cancere.

Ingineria genetic

Clasele majore de afeciuni care pot beneficia

de aceste modaliti terapeutice:

Bolile infecioase
Bolile neoplazice
Bolile ereditare monogenice
Bolile sistemului imunitar (inclusiv alergii,
inflamaii, boli autoimune)

TRATAMENTUL N BOLILE
MULTIFACTORIALE

n general, factorii cunoscui ca nocivi pot fi evitai.

Ex. evitarea fumatului la persoanele cu deficit de alfa1- antitripsin, scade riscul tulburrilor respiratorii i
al complicaiilor hepatice.
n unele anomalii congenitale multifactoriale:

defectele congenitale de cord,

despicturile labio-palatine,
stenoza piloric .a.,

tratamentul chirurgical rezolv defectul; n peste

50% din cazuri, corectarea chirurgical este salutar
printr-o unic intervenie.

TRATAMENTUL N BOLILE
MULTIFACTORIALE

n alte boli multifactoriale ca:

hipertensiunea arterial,
boala coronarian,
diabetul zaharat,
schizofrenia,
psihozele majore

exista doar terapii de ameliorare.

TRATAMENTUL N BOLILE
MONOGENICE

recuperarea integrala este posibil n aproximativ 15% din

totalul acestora.
adaptarea social - 6%.
Rezultate bune sunt consemnate ns n bolile n care defectul
biochimic este cunoscut.

Obiectivele tratamentului:

Identificarea mutaiei genice, pentru efectuarea

tratamentului etiologic:
n boli ca fibroza chistic i miodistrofia Duchenne, au
fost identificate genele patologice i proteinele deficiente
sunt necesare n continuare studii ample pentru corectarea lor.

TRATAMENTUL N BOLILE
MONOGENICE

Identificarea proteinelor deficiente i a

mecanismelor care determin instalarea
simptomatologiei clinice:
n fenilcetonurie - dei mutaia genic este
cunoscut, aciunea nociva a concentratiei de
fenilalanin asupra dezvoltrii encefalului este
incomplet elucidata.

Efectuarea tratamentului pe termen

lung, chiar permanent:

Ex.
n galactozemie, trebuie evitat acumularea
galactozei, pentru c aceasta poate duce
permanent la instalarea tulburrilor.
n cistinoz (acumularea de cistein n lizozomi),
lipsa tratamentului instalarea tulburrilor
renale.
n hemofilie e nevoie de substitutie permanenta
in talasemie sunt necesare transfuzii periodice de
snge; pacienii trebuie urmrii permanent
pentru a se evita suprancrcarea cu fier.

Diferenierea terapiei n raport cu heterogenitatea

genetic a bolii:
ex. dei n talasemie i anemia sicklic
(hemoglobinopatia S) mutaia intereseaz aceeai
pereche alelic, tratamentul este difereniat, n
funcie de tipul mutaiei i al expresiei genice.
Urmrirea n timp a pacienilor
ex. in retinoblastom, tratamentul chirurgical
este salutar, dar pacienii trebuie urmrii n timp,
existnd riscul dezvoltrii ulterioare a altor
tumori maligne.

Prevenirea instalrii bolii prin diagnostic

precoce i iniierea timpurie a terapiei
ex. in fenilcetonurie stabilirea
diagnosticului imediat dup natere previne
instalarea manifestrilor clinice severe. Dg.
precoce diet evitarea tulburrilor
(oligofrenia) instalate nc din prima lun de
via, ireversibile.

Conduite terapeutice
Dieta:

dieta restrictiv
dieta instituit imediat dup natere (fenilcetonurie)
n alte afeciuni poate fi necesar administrarea unui
anumit produs: administrarea de colesterol n
sindromul Smith-Lemli-Opitz previne
demielinizarea.

Conduite terapeutice

Administrarea unor vitamine poate mbunti

prognosticul unor bolnavi.
Ex. : n homocistinurie administrarea vit. B6
concentraia plasmatica a homocisteinei
Vitamina E este benefic n unele afeciuni
neurologice (ataxia pseudo-Friedrich).
Electrostimularea: se utilizeaz n bolile
neuromusculare cu scopul de a crete gradul de
mobilitate i de a reduce spasmele musculare i
durerea.

Administrarea produsului deficitar

Ex. in hipotiroidismul congenital (aproximativ 15% sunt
forme genetice) este necesar administrarea nc din
perioada neonatal a preparatelor de tiroid.
n hemofilie, administrarea periodic de perfuzii cu
fraciuni de plasm bogat n factorii VIII sau IX ai
coagulrii (n funcie de tipul hemofiliei) reduce starea
hemoragipar.

Administrarea produsului deficitar

n deficiena pentru alfa-1-antitripsin, administrarea

periodic a enzimei, mpiedic efectul distructiv al
elastazei asupra epiteliului alveolar pulmonar.

n deficiena enzimatic a adenozin diaminazei (ADA),

absena enzimei perturb limfocitele B i limfocitele T
imunodeficien grav. Administrarea de extract de
enzim ADA corecteaz deficitul imunitar.

n boala Gaucher - deficit enzimatic cu stocare de

cerebrozide n lizozomii SRE - se administreaz enzima
deficitar, mpiedicndu-se astfel stocarea lipidelor
complexe i consecinele acesteia.

Metodele farmacologice
convenionale au ca scop:

nlocuirea unei funcii:

administrarea de melatonin n sindroame cu
tulburri ale ritmului circadian

Protejarea unei funcii:

n ataxia Friedrich (boal mitocondrial
degenerativ care afecteaz SNC i inima)
administrarea de anti-oxidani (coenzima Q 10) a
ameliorat funcia cardiac, dar nu a avut efect
asupra SNC.

Metodele farmacologice
convenionale au ca scop:

Reexprimarea unei funcii: n Hb S se

administreaz hidroxiuree care stimuleaz
expresia genei pentru specificarea globinei gama n
scopul producerii HbF ca supleant al absenei
globinei beta; prin aceasta se amelioreaz simitor
procesul hemolitic.
Inhibarea unei funcii: biofosfonaii se
administreaz n OI
Rectificarea procesului de translaie: n fibroza
chistic administrarea unui anumit antibiotic
determin corectarea splicing-ului aberant

Administrarea unor medicamente care reduc

nivelul plasmatic al produsului nemetabolizat

Hipercolesterolemia familial (mai ales forma

heterozigot): administrarea unor medicamente
stimuleaz producerea de receptori pentru
lipoproteine, n scopul legrii colesterolului liber.
n paralel, se administreaz i medicamente care s
inhibe sinteza colesterolului hepatic (endogen).

Transplantul
Terapia genic

TERAPIA PRIN MODIFICAREA

GENOMULUI SOMATIC

Transplantul.

Celulele transplantate pstreaz genomul

donorului, astfel c transplantul poate fi socotit
drept o form de terapie prin transfer de gene.

TERAPIA PRIN MODIFICAREA

GENOMULUI SOMATIC

Pentru bolile genetice, metoda transplantului

se indic n scopul:

de a transfera gene funcionale n vederea sintezei

de proteine care sunt deficitare sau lipsesc; ex.
transplantul de celule hepatice, ectopic, n
hipercolesterolemie, forma homozigot;
de a nlocui un organ ntreg nefuncional; ex.
transplantul de ficat n stadiul de ciroz al
deficienei de alfa-1-antitripsin.

Transplantul de mduv hematopoetic are

efecte benefice i se efectueaz n
imunodeficiene (deficiene ale enzimei ADA),
boli de stocare a lipidelor complexe, talasemie

De civa ani s-a ncercat implementarea de

mioblaste n miodistrofia Duchenne, cu
rezultate ncurajatoare.

TERAPIA PRIN TRANSFER DE GENE

Metodele utilizate pentru terapia genic:
terapia genic clasic: const n introducerea genelor
n celulele int cu scopul de a obine o expresie
optim a genelor introduce.
Genele astfel exprimate vor determina:

sinteza unui produs care lipsete

distrugerea direct a celulelor afectate, de ex. prin
producerea unor toxine
activarea celulelor sistemului imunitar care vor ajuta la
distrugerea celulelor afectate

TERAPIA PRIN TRANSFER DE GENE

Metodele utilizate pentru terapia genic:

terapia genic non-clasic: cu scopul

de a inhiba expresia unor gene
asociate cu patogenia bolii, sau de a
restaura expresia normal a genei.

Modaliti de corectare a genelor cu

mutaii

Inserarea unei gene cu structur normal ntr-o

locaie nespecific
Gena defectiv poate fi nlocuit cu gena normal,
prin recombinare omoloag.
Gena defectiv poate fi reparat prin mutaie
invers selectiv, care ntoarce gena la funcia sa
normal.
Alterarea reglrii unei anumite gene (gradul n
care o gen este activat sau inhibat)

Strategia transferului de gene

locusul s fie identificat;

gena s fie cunoscut din punct de vedere
biochimic;
s fie posibil clonarea ADN-ului;
s se ia toate msurile de prevedere ca
introducerea genei n genomul bolnavului s
nu produc risc pentru o nou mutaie;

Strategia transferului de gene

s se poat pstra expresia genei transferate;

s se gseasc un vector adecvat i desigur,
nepatogen;
s se dezvolte i perfecioneze i tehnologia
pentru transfer de gene lung codante.

Genele pot fi transferate fie n celulele

germinale, fie n celulele somatice

Transferul n celulele liniei germinale

implic inserarea genei normale n aceste
celule, astfel nct defectul genic va fi corectat
i va fi transmis n manier mendelian de la o
generaie la alta.

Genele pot fi transferate fie n celulele

germinale, fie n celulele somatice

Terapia prin transfer de gene n celule

somatice se refer la inserarea genelor normale
numai n aceste celule, fr posibilitatea
transmiterii la generaiile viitoare, fiind
modificat astfel doar genomul pacientului
respectiv.

Terapia genic n celulele germinale la

oareci

terapia genic n celulele liniei germinale la om

este interzis
tehnica inserrii unei gene strine, sau a unui
fragment de ADN (de exemplu, o transgen) n
celulele germinale la oarece este efectuat n
mod curent:

Terapia genic n celulele germinale la

oareci
Imediat dup fecundare se colecteaz embrionul de
oarece care este format dintr-o singur celul.
n acest stadiu pronucleul masculin este nc vizibil, iar
ADN-ul strin poate fi inserat n nucleu printr-o
microinjecie.
Dup injectare, embrionii sunt plasai n uterul unei
femele pregtit hormonal (pseudonsrcinat).
Prezena transgenei poate fi determinat dup natere, la
oarecii nou-nscui, fie prin metoda Southern, fie prin
reacia de polimerizare a catenelor (PCR).
Deoarece aceti oareci pot exprima genele strine, ei au
fost denumii transgenici.

Un exemplu n acest sens l reprezint

transferul genei umane care specific lanul
beta-globinic, la oareci bolnavi cu betatalasemie (datorat unei deleii a genei care
specific acest lan globinic la oarece).

n urma acestui transfer s-a observat reglarea

expresiei moleculelor beta-globinice la oareci
i respectiv corectarea bolii.

Terapia genic n celulele somatice:

implic inserarea unei gene normale n celulele

somatice, transferul de gen determinnd
sinteza unei cantiti suficiente de proteine
terapeutice, pentru a se corecta defectul
metabolic.

Pentru introducerea genelor n celulele

somatice sunt utilizate dou modaliti:
ex vivo i in vivo

Terapia genic ex vivo

implic extragerea celulelor de la pacient,

introducerea genelor terapeutice folosind
anumii vectori virali sau nonvirali i
transplantul autolog al celulelor corectate din
punct de vedere genic, la pacientul respectiv.

Terapia genic in vivo

se realizeaz prin introducerea direct a genei

terapeutice la nivelul siturilor int pentru patologia
unui anumit individ (de exemplu, infuzii
intravenoase, intraarteriale etc.), fr a fi necesar
extragerea i cultivarea celulelor pentru a se realiza
inserarea genelor, ntr-un laborator.

Gena cu structur normal este inserat n genom,

pentru a nlocui gena cu mutaie.

Terapia genic in vivo

In vederea introducerii genei terapeutice n

celulele int ale pacientului este necesar
legarea acesteia de un vector.

Cel mai frecvent se utilizeaz ca vector un

virus care a fost modificat genetic pentru a
transporta ADN-ul uman normal.

Sistemele cele mai importante de vectori virali

i nonvirali care se utilizeaz la ora actual n
terapia genic sunt:
vectori virali:

retrovirusuri;
adenovirusuri;
virusuri adeno-asociate;
virusul herpetic

Sistemele de vectori virali

Vectorii retrovirali

Primul sistem de vectori folosit, dar i cel mai frecvent utilizat

pentru terapia genic.

Avantajul vectorilor virali este de a avea genom scurt i de a

ptrunde n genomul tuturor celulelor primitorului.

Oricum, vectorii trebuie s fie n prealabil prelucrai pentru a

deveni incapabili de replicare i s fie verificai pentru a nu
avea efecte toxice, patogene.

Sistemele de vectori virali

Vectorii adenovirali
Virusuri care au ca material genetic ADN dublu catenar
i infecteaz o mare varietate de tipuri de celule.
Virusul nu se integreaz n cromozomii umani, astfel
nct nu exist riscul mutagenezei sau activrii unor
oncogene n cazul folosirii lor.
Experimentele de transfer genic efectuate cu aceste
tipuri de vectori au demonstrat o expresie eficient,
dar de scurt durat, fie a produilor genei marker
(beta-galactozidaza n galactozemie), fie a proteinelor
reglatoare (n fibroza chistic).

Sistemele de vectori virali

Virusurile adeno-asociate

Clas de virusuri mici, cu ADN monocatenar, care i

inser materialul genetic ntr-un anumit loc de pe
cromozomul 19.
Virusul herpetic este un virus cu ADN dublu catenar
care infecteaz neuronii.
Aceste sisteme prezint unele dezavantaje: sunt
necesare mai multe injectri, deci administrare
repetat pentru meninerea efectului terapeutic.

Sistemele de vectori non-virali

Cea mai simpl metod este reprezentat de

introducerea direct a ADN-ului terapeutic
n celulele int.
Este ns limitat ca aplicabilitate, deoarece
poate fi folosit numai la anumite esuturi i
necesit cantiti mari de ADN.

Sistemele de vectori non-virali

Liposomii
vezicule compuse dintr-o membran lipidic ce
nconjoar un volum apos, avnd diametrul de
cteva zeci de microni.
prezint un avantaj asupra vectorilor virali
pentru terapia genic in vivo, deoarece sunt
relativ nontoxici i determin mai puine
reacii imunologice.

Plasmidele i vectorii conjugai

Plasmidul

reprezint o molecul circular,

extracromozomial de ADN care se replic
independent.
recent au fost puse la punct strategii pentru
injectarea unor plasmide direct n celule, fr
introducerea lor ntr-o particul viral sau
ntr-un liposom.

Plasmidele i vectorii conjugai

Vectorii conjugai

au fost utilizai pentru a se realiza transferul

genic la hepatocite i celulele epiteliului
respirator.
ADN-ul terapeutic poate fi introdus n
celulele int prin legarea chimic a ADNului de o molecul care se va lega de
receptori celulari speciali. Acetia vor
internaliza ADN-ul n celulele int.

Cromozomul artificial

La ora actual se fac cercetri pentru introducerea

celui de-al 47-lea cromozom uman artificial n
celulele int.
Acest cromozom ar exista n mod autonom, alturi de
cei 46 cromozomi standard, fr a afecta
funcionalitatea lor i fr a determina mutaii.
Dificultatea metodei const ns n introducerea unei
structuri att de mari n nucleul celulei int.

Limitele terapiei genice

Natura de scurt durat a terapiei genice

ADN-ul terapeutic introdus n celulele int trebuie s

rmn funcional i stabil, pentru ca terapia genic s
fie o modalitate eficient de tratament.
Problemele legate de introducerea ADN-ului terapeutic
n genom, precum i diviziunea rapid a unor celule
mpiedic obinerea efectului terapeutic pe durat
lung de timp.
De aceea este necesar introducerea ADN-ului
terapeutic de mai multe ori pe parcursul vieii.

Limitele terapiei genice

Rspunsul imun - ADN terapeutic introdus n

organism este perceput ca o structur non-self,
determinnd apariia unui rspuns imun.
Riscul stimulrii acestui rspuns reduce
eficacitatea terapiei genice.
Probleme legate de vectorii virali Utilizarea
virusurilor poate determina toxicitate, rspuns
imun i/sau inflamator, precum i probleme
legate de controlul genic.

n 1990

Prima terapie cu transplant de gene la 5 pacieni cu

melanom.
Metoda a constat n prelevarea de limfocite de la
bolnav, cultivarea acestora i introducerea prin
transfecie (prin intermediul retrovirusurilor) a
genelor antitumorale.
Dup aceast prelucrare, limfocitele au fost
infiltrate n tumor, observndu-se retrocedarea
tumorii pentru o perioad de cteva luni.

Dupa 1990

Tot limfocite au fost folosite pentru transfer de

gen n deficiena enzimatic ADA, cu
rezultate bune, efectul durnd cteva luni,
dup care operaiunea se poate repeta.

Lupta continua..

Pn n prezent majoritatea cercettorilor s-au

concentrat asupra transferului de gene cu
ajutorul retrovirusurilor n celulele stem
pluripotente din mduva hematogen.
Acestea sunt accesibile i ofer oportunitatea
generrii unei varieti de elemente sanguine
sau macrofage pulmonare, n care se exprim
genele transferate.

Lupta continua..

Celulele stem infectate pot fi reintroduse la

pacient prin transplant autolog.

Celulele transplantate vor migra de la locul

injectrii i vor exprima produii genei nou
introduse.

Alte experimente:
terapii genice la nivelul ficatului:

boli n care defectul metabolic primar se

gsete la nivel hepatic (de exemplu,
hipercolesterolemia, fenilcetonuria).
Hepatocitele pot fi obinute prin hepatectomie
parial, dup care sunt cultivate timp de
cteva sptmni, modificate genetic prin
intermediul vectorilor virali sau nonvirali i
apoi transplantate la animale.

Alte experimente:
terapii genice la nivelul ficatului:

n urma unui astfel de experiment s-a observat

c o parte din hepatocitele modificate i
introduse la oareci prin injectare intrasplenic, au migrat n parenchimul hepatic i
au continuat s exprime produi genici
specifici acestuia timp de un an.

Alte experimente:

n fibroza chistic s-a reuit cu succes

transferul de gen, prin intermediul unui
vector retroviral, n pereii unei artere.
Se sper ca n viitorul apropiat s se poat
introduce gena chiar n epiteliul alveolar
pulmonar, pentru a mpiedica tulburrile
pulmonare din cadrul bolii.

Alte experimente:

n miodistrofia Duchenne, transferul de

gene este deocamdat doar parial rezolvat,
pentru c gena pentru miodistrofin este foarte
lung i deci, greu, deocamdat, de inserat
ntr-un vector.

Ce va urma

E nevoie de
perfecionri
Rezultatele actuale
sunt ncurajatoare
Exista sperana c n
urmtorii ani s
putem asista la
corectarea bolilor
ereditare.

V
mulumesc!