Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian

Note de curs i tehnici de laborator

3.4. OBINERE de SONDE de ACIZI NUCLEICI

1. Principiile hibridizrii acizilor nucleici
Hibridizarea acizilor nucleici reprezint procesul prin care 2 monocatene ADN sau ARN din
surse biologice diferite reformeaz configuraia dublu catenar (Fig.3.44.). Din punct de vedere
chimic, procesul de hibridizare se bazeaz pe :
- principiul complementaritii dintre cele 2 catene ale unui duplex ADN sau ARN
- eventuala omologie de secven dintre cele 2 surse ADN
Pe aceleai principii se pot forma hibrizi ADN : ADN, hibrizi ARN : ARN sau hibrizi ADN : ARN.
In majoritatea cazurilor, scopul tehnicilor de hibridizare este identificarea sau localizarea
anumitor fragmente de acizi nucleici.

ADN sursa 1

ADN sursa 2

DENATURARE

HIBRIDIZARE

Fig.3.42. Principiul hibridizrii acizilor nucleici

In procesele de hibridizare a acizilor nucleici se definesc noiunile :
molecula INT = fragmentul de ADN, ARN sau de protein de identificat sau de localizat;
molecula SOND = fragmentul de ADN,ARN sau de protein cu ajutorul cruia, prin hibridizare,
este identificat sau localizat INTA
In foarte multe variante tehnice, hibridizarea acizilor nucleici se realizeaz pe suport solid
(presupunnd transferul moleculelor de acizi nucleici pe suportul solid), purtnd denumirea de
BLOTTING. Exista 3 categorii principale de blotting :
SOUTHERN BLOTTING (dupa numele autorului Southern, 1975) tehnic molecular ce
identific fragmente de ADN folosind sonde ADN sau ARN
NORTHERN BLOTTING - tehnic molecular ce identific fragmente ARN folosind sonde
ARN sau ADN
WESTERN BLOTTING - tehnic molecular ce identific fragmente proteice folosind anticorpi
specifici
1

Cap. 3-4Sintez de sonde oligonucleotidice

2. Caracteristicile generale ale sondelor

O sond molecular de acizi nucleici reprezint o secven de nucleotide, scurt, monocatenar,
alctuit din ADN sau din ARN, ce se va lega specific de o secven int; cu ajutorul sondei va fi
identificat sau localizat molecula int. Gradul de omologie de secven dintre sond i int va
determina stabilitatea hibridului. Sondele moleculare de acizi nucleici se construiesc astfel nct s
prezinte urmtoarele caracterisitici:
a) s prezinte un marcaj chimic care s permit vizualizarea hibridului molecular sond:int
b) s aib dimensiune cuprins ntre 10 i 10.000 nucleotide; de regul ns, se folosesc sonde de
14 40 nucleotide. Sondele prea scurte hibridizeaz foarte rapid (n cteva minute), dar prezint
i hibridizri nespecifice i sunt i mai greu de marcat; sondele prea lungi hibridizeaz foarte ncet
(n cteva ore), dar hibrizii sunt mai stabili i mai specifici
c) specificitatea de reacie a sondei este dat de secvena acesteia; sonda nu trebuie s hibridizeze
cu ea nsi, deci s nu conin complementaritate intracatenar; totodat, sonda trebuie s nu
hibridizeze cu non-inte

3. Modaliti de sintez a sondelor moleculare de acizi nucleici

Sondele moleculare de acizi nucleici pot fi marcate uniform (prin nick-translation, primeri randomizai,
ADNc total, transcriere in vitro) sau doar la capete.
3.1. Sinteza de sonde prin nick-translation
In aceast tehnic se pornete de la o molecul de ADN d.c., de obicei o copie a moleculei int :
a) n prima etap, aceast molecul este supus unei digestii cu DNaza I, care este o endonucleaz
situs-nespecific, ce n prezena ionilor de Mg++ produce ruperi monocatenare randomizate
(denumite nicks);
b) n a 2-a etap, acioneaz ADN polimeraza I de E.coli, care prin activitatea sa exonucleazic 5-3
lrgete ruperile monocatenare;
c) aceast activitate are loc aproape simultan cu activitatea de polimerizare a ADN polimerazei I (n
direcie 5-3) folosind molecule dNTP marcate. Ceea ce se obine este o deplasare a ruperii
monocatenare, de unde i denumirea de nick-translation ;
d) ultima etap este reprezentat de denaturarea termic a moleculelor, pentru obinerea unor
monocatene marcate uniform.
ADN d.c.
3
3

Incubare in prezenta Dnazei I

(endonucleaza care, in
prezenta de Mg2+ induce formarea
de ruperi mono-catenare - nickuri)
3

3
3

ADN pol I
(functie exonucleazica
5-3)
3
3

ADN pol I
(functie polimerazica 5-3)
pozitia finala a nick-ului
dNTP marcati
3
3
catena marcata

Denaturare - obtinere de sonde marcate

Fig.3.43. Sinteza de sonde prin nick-translation

Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian

Note de curs i tehnici de laborator

3.2. Sinteza de sonde marcate uniform folosind primeri randomizai

In aceast variant tehnic se folosesc ca primeri oligonucleotide cu secven heterogen, astfel nct
ei vor hibridiza n multe poziii ale matriei. Asemenea primeri poart denumirea de primeri randomizai
i pot fi fie cumprai, fie obinui astfel:
a) prin digestia ADN din sperm de somon sau din timus de viel cu DNaza I, astfel nct se obine o
populaie mare de fragmente de ADN m.c., cu dimensiuni ntre 6 i 12 nucleotide;
b) prin sintez cu ajutorul unui sintetizator automat de oligonucleotide (octameri ce conin toate cele
4 baze azotate n toate poziiile);
In ceea ce privete enzimele utilizate, n aceast tehnic se folosesc o ADN polimeraz ADNdependent (revers-transcriptaz) i Klenow-ADN pol I (care nu are activitate exonucleazic 5-3).
Pentru a obine sonde marcate se recomand utilizarea, n amestecul de dNTP, a unui nucleotid
marcat i 3 nemarcai.

Matrita

denaturare

atasare de primeri
randomizati

adaugare - ADN polI (fragment Klenow)

- dNTP (unul marcat)
amplificare

Denaturare - obtinere de sonde marcate

Fig.3.44. Sinteza de sonde marcate uniform folosind primeri randomizai
3.3. Sinteza de sonde ADNc total
Pentru obinerea unei populaii de molecule de ADNc (complementar cu o populaie de ARN m.c.) se
pot folosi urmtoarele tehnici:
a) ntr-o prim variant tehnic, se izoleaz ARNm total din celule i se desfac structurile secundare
ale acestor molecule prin nclzire 5 min la 70oC. Se ataeaz apoi primeri randomizai (de ex.
octameri sintetici). Pornind de la acetia va fi iniiat reacie de polimerizare a dNTP-urilor
introduse n reacie cu ajutorul unei revers-transcriptaze (rTth sau revers-transcriptaze din MLV

Cap. 3-4Sintez de sonde oligonucleotidice

(Murine Leukaemia Virus) sau din AMV (Avian Mieloblastosis Virus). Intr-o etap urmtoare,
pentru a obine denaturarea moleculelor hibride, amestecul de reacie se trateaz cu NaOH la
peste 70oC, iar rezultatul final este reprezentat de o populaie de molecule scurte de ADNc
pariale.
b) ntr-o a doua variant tehnic, dup izolarea ARNm total i desfacerea structurilor secundare, se
folosesc primeri oligo (dT) care se ataeaz la cozile poli(A) de la captul 3 al majoritii
moleculelor ARNm mamaliene. i n aceast situaie se folosete tot o revers-transcriptaz,
urmat de tratament cu NaOH la 70oC. Spre deosebire de prima variant tehnic, aici rezultatul
este reprezentat de o populaie de molecule ADNc ntregi.
3.4. Sinteza de sonde ARN prin transcriere in vitro
Pentru sinteza de sonde ARN prin transcriere in vitro este recomandabil ca ADN heterolog s fie n
prealabil clonat ntr-un vector plasmidial sau ntr-un fagimid, care s conin promotori puternici, aa
cum sunt promotorii din fagii T3 i, respectiv, T7. Aceti promotori au fost alei pentru c sunt
recunoscui extrem de specific de ARN polimeraza din fagii respectivi. Astfel, enzima are o
specificitate distinct pentru promotorul cognat i nu folosete promotorii recunoscui de alte ARN
polimeraze (aceste dou ARN polimeraze nu recunosc nici promotori bacterieni cromozomali sau
plasmidiali i nici promotori de la eucariote).
Principalele etape ale acestei tehnici sunt (Fig.3.45.):
a) vectorul recombinat (ce conine i ADN heterolog) este linearizat cu ajutorul unor endonucleaze
de restricie ce produc capete netede i care taie n afara celor 2 promotori (de T3 i T7); de ex.,
n cazul clonrii unei secvene de ADN n vectorul pBluescript SK+, ntreaga caset se scoate prin
digestie cu endonucleaza de restricie BssH II;
b) fragmentul ADN linear ce conine ADN heterolog mrginit de cei 2 promotori se introduce n
amestec cu ARN polimeraz de fag T3 sau de fag T7 (funcie de catena ce urmeaz a fi
transcris), spermidin sau albumina seric bovin (ce activeaz transcrierea de 2 2.5 ori) i
rNTP (dintre care unul marcat radioactiv sau neradioactiv); ntreg amestecul de reacie se ine 1
o
2 h la 37 C, timp n care are loc un proces de transcriere in vitro, ce conduce la acumularea de
molecule ARN marcate;
c) n ultima etap, moleculele ADN folosite ca matri sunt transformate n fragmente foarte mici prin
tratatment cu DNaza I, dup care moleculele de ARN sunt precipitate cu etanol 100% n prezen
de acetat de amoniu 2.5 M.

Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian

Note de curs i tehnici de laborator

T7
ADN heterolog clonat in MCS
vector plasmidial
sau phagemid
linearizare cu enzime
de restrictie care produc
capete drepte

T3

T7

T3

5
adaugare:
- rNTP (unul marcat)
- spermidina sau BSA*
(amplifica transcrierea de 2-2,5 ori)
- ARN polimeraza fagica (T3 sau T7)

transcript ARN
3

molecule ARN
5
3

T3

T7

3
5

Tratare cu DNazaI

Fig.3.45. Sinteza de sonde prin transcriere in vitro

Cap. 3-4Sintez de sonde oligonucleotidice

Marcarea capetelor 3 i 5 ale ADN

a) Marcarea capetelor 3 ale ADN d.c.
Pentru a realiza marcarea radioactiv a unor molecule de ADN d.c., ntr-o prim etap se folosesc
endonucleaze de restricie, fie ce produc capete coezive, fie ce produc capete netede:
- n cazul digestiei ADN cu enzime de restricie ce produc capete coezive, ADN-ul restrictat se
amestec apoi cu un dNTP marcat (funcie de enzima cu care a fost n prealabil digerat ADN) i cu
Klenow-ADN polimeraz I de E.coli (aceast enzim va aduga dNTP-ul introdus in reacie pe baz
de complementaritate); de ex., n cazul digestiei ADN cu EcoR I, se adaug [32P]-dATP, iar KlenowADN polimeraza I va aduga resturi de adenine marcate complementare cu cele 2 resturi de timine
(Fig.3.46.);

EcoRI
CTTAA P5

+32 PdATP

CTTAA P5

+Klenow ADN
polimeraza
Fig.3.46. Marcarea capetelor 3 ale ADN prin umplerea capetelor coezive
- n cazul digestiei ADN cu enzime de restricie ce produc capete netede, acestea pot fi marcate
prin nlocuirea nucleotidei de la capul 3OH n amestecul de reacie se introduce nucleotida de
nlocuit ca [32P]-dNTP;
- n cazul marcrii capetelor 3 monocatenare, se folosete enzima terminal-deoxinucleotidil
transferaza din timus de viel; aceast enzim este o ADN polimeraz neobinuit, gsit numai n
prelimfocite i n stadii timpurii ale diferenierii limfoide; n prezena unui cation divalent, enzima
produce adiia de dNTP-uri la capetele 3OH, preferabil monocatenare: n prezen de Mg++, se
adiioneaz o purin, iar n prezen de Co++, se adiioneaz o pirimidin (Fig.3.47.)

CGCG OH3
dGTP
+Mg

CGC OH3

++

dATP

CGCA OH3

Terminal
transferaza
3

CGCT OH
+Co ++

dTTP
3

dCTP

CGCC OH

Fig.3.47. Marcarea capetelor 3 monocatenare

Sisteme de marcare a sondelor moleculare

1. Marcare radioactiv In marea majoritate a cazurilor, n marcarea radioactiv a moleculelor de
acizi nucleici se folosesc [32P] sau [35S]. Avantajul marcrii radioactive a acizilor nucleici l reprezint
faptul c au o sensibilitate foarte mare, putnd detecta cantiti foarte mici de acizi nucleici.
Principalele deazavantaje ale marcrii radioactive sunt reprezentate de riscul manipulrii unor
materiale radioactive, de instabilitatea isotopilor, precum i de timpii lungi de expunere.
2. Marcare neradioactiva
In marcarea neradioactiv se folosesc molecule reporter ce sunt detectabile direct sau indirect.
2.a. metode directe de marcare neradioactiv : molecula reporter este detectabil direct i se leag
direct de sond, astfel c hibrizii pot fi vizualizai direct; n asemenea situaii, moleculele reporter sunt
de obicei reprezentate de fluorocromi.

Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian

Note de curs i tehnici de laborator

In cazul marcrii fluorescente a sondelor de acizi nucleici se folosesc analogi ai nucleotidelor cuplai
cu fluorescein (de ex. fluorescein-dUTP), ce se incorporeaz n acizii nucleici prin tehnici enzimatice
standard (de ex. prin reacie PCR). Marcajul cu fluorescein poate fi folosit i ca metod indirect, caz
n care fluoresceina este folosit ca hapten.
2.b. metode indirecte de marcare radioactiv: sonda conine o molecul reporter introdus chimic
sau enzimatic, care va deveni detectabil prin citochimie de afinitate; n aceste situaii, se folosete,
fie biotina cuplat cu avidin sau cu streptavidin, fie digoxigenina cuplat cu anticorpiantidigoxigenin.
Biotina (sau vitamina H) poate fi incorporat n acizii nucleici ca biotin-dUTP (Fig.) prin tehnici
enzimatice standard (de ex. PCR). Dup folosirea sondei biotinilate ntr-o reacie de hibridizare
molecular, hibrizii de acizi nucleici sunt detectai prin cuplarea biotinei cu avidina din complexul
avidin-fosfataz alcalin (sau avidin-peroxidaz din hrean).
Avidina este o glicoprotein din albuul de ou, care are 4 subuniti, fiecare coninnd un
situs de legare cu biotina (n utlimii ani, n loc de avidin se folosete streptavidin, care
nu conine reziduuri glicozilate ce dau un fond ridicat al reaciilor nespecifice, reducnd
contrastul de culoare)
Enzima va degrada un compus cromogen, obinndu-se n final o reacie de culoare. Astfel, fosfataza
alcalin va degrada substratul cromogen NBT (nitro-blue-tetrazolium) sau BCIP (5-Br-4-Cl-3indolilfosfat), obinndu-se un precipitat de culoare albastr. In locul fosfatazei alcaline se poate folosi
peroxidaza din hrean (HPOX), care va degrada substratul cromogen DAB (3,3-diaminobenzidin
tertahidroclorid), obinndu-se un precipitat rou-brun.
O alt variant de marcare din acelai sistem, folosete digoxigenina n loc de biotin. In acest caz, n
sond este incorporat enzimatic, fie digoxigenin-dUTP, fie digoxigenin-dTTP. Dup realizarea
reaciei de hibridizare molecular, se adaug anticorpi-anti-digoxigenin cuplai cu fosfataz alcalin i
apoi substratul cromogen (NBT sau BCIP), iar hibrizii sunt detectai ca spot/band albastr.

Principalele etape ale unui proces de hibridizare molecular pe suport solid

1. Sinteza sondei marcate Funcie de molecula de ADN int, de lungimea sondei dorite, precum i
de tipul de marcare, se sintetizeaz (prin tehnicile prezentate mai sus) o specie molecular de sond
ADN sau ARN complementar cu molecula int.
2. Procesarea ADN int Moleculele de ADN surs n care se gsete i secvena de ADN int,
trebuie izolate i purificate. Ulterior, ADN surs se digera cu o endonucleaz de restricie, astfel nct
secvena de ADN int s fie obinut ca molecul d.c. linear.
Amestecul de digestie se supune unei electroforeze n gel de agaroz, n care se separ diversele
fragmente obinute n reacia de restricie.
3. Denaturarea ADN int Gelul de agaroz n care se afl i moleculele de ADN se introduce n
soluii de NaOH, n care va avea loc denaturarea acestora, rezultnd molecule monocatenare.
4. Transferul ADN int pe suport solid Fragmentele de ADN d.c. lineare separate n gelul de
electroforez se transfer pe un suport solid (hrtie de nitroceluloz sau membran de nylon), dup ce
n prealabil se realizeaz o denaturare a moleculelor de ADN prin imersarea gelului n NaOH 0.5N.
Transferul poate fi realizat prin 3 variante tehnice:
- transfer prin capilaritate, n sistem sandwich: fragmentele de ADN sunt transportate din gel de
ctre un lichid (de obicei, tampon SSC) i depozitate pe suportul solid; micarea lichidului se
realizeaz prin capilaritate i se datoreaz unui teanc de hrtie prosop aezat n sistem sandwich; rata
transferului depinde de dimensiunea fragmentelor i de concentraia agarozei.
- transfer electroforetic: se folosete numai pe membrane de nylon ncrcate electric i reprezint o
metod eficient chiar pentru transferul unor fragmente mici: 56 bp.
- transfer prin vacuum: este mult mai eficient i mai rapid dect celelalte 2 variante tehnice; n
acest caz, gelul de agaroz se gsete n contact direct cu suportul solid (nitroceluloza sau membrana
de nylon), amndou aezate pe un suport poros deasupra unei camere de vacuum; tamponul este
aezat n camera superioar a dispozitivului i este tras prin vacuum, elund acizii nucleici din gel i
depozitndu-i pe suportul solid.
Suportul solid cu acizii nucleici depozitai pe el este apoi expus la radiaii UV, ceea ce creeaz o serie
de legturi de tip cross-links ntre moleculele de acizi nucleici i structura suportului; astfel,
fragmentele de acizi nucleici (inclusiv ADN int) sunt fixate de suportul solid.
5. Hibridizarea molecular In aceast etap, suportul solid pe care se afl fixat inta se imerseaz
n tampon 5xSSC care conine i sonda marcat, i se las n agitare uoar 14-16h. Dup
hibridizare, sonda nehibridizat se ndeprteaz prin splri succesive cu tampon SSC.