Metode de analiz molecular a genelor partea a II-a

Analiza mutatiilor genice. Tehnici de diagnostic molecular. Secventarea ADN Secventarea ADN Utilitatea secventarii ADN Tehnicile PCR-RFLP si ARMS-PCR sunt relativ ieftine si rapide, insa nu sunt utilizabile decat atunci cand se cunoaste exact tipul, structura si localizarea unei anu ite utatii sau poli orfis ! "n restul cazurilor, este nevoie de o etoda care sa per ita detectia oricarei utatii, cunoscute sau necunoscute! "n acest sens, tehnica #$old-standard% este reprezentata de catre secventarea A&'! Tipurile de tehnici de secventare a ADN Tehnica secventarii a fost pusa la punct independent de catre doi cercetatori, in anii ()*, +alter ,ilbert -tehnica de$radarii enzi atice. si Fred San$er -tehnica sintezei A&'.! A bii cercetatori au fost laureati ai pre iului 'obel in anul /01*, pentru punerea la punct a etodelor de secventare A&'! Secventarea ADN prin metoda Sanger &atorita inconvenientelor pe care le prezinta tehnica de$radarii enzi atice, secventarea se bazeaza in zilele noastre pe tehnica lui San$er i bunatatita, perfectionata si auto atizata, care va fi prezentata in cele ce ur eaza! rincipiul tehnicilor de secventare a ADN "ntr-o pri a etapa, fra$ entul A&' a carui secventa nucleotidica se doreste a afla se a plifica printr-o reactie PCR obisnuita, astfel incat sa rezulte un disponibil suficient de fra$ ent A&' pentru secventare! 2lterior, pentru verificarea calitatii a plificarii, a pliconii se i$reaza electroforetic in $el de a$aroza! "ntr-o etapa ur atoare, a pliconii se purifica fie direct din solutie, fie prin decupare din $elul de a$aroza -in special atunci cand exista produsi secundari de a plificare.! Secventarea propriu-zisa este un proces auto atizat, care se desfasoara in aparate specializate si destul de costisitoare! Necesarul si etapele tehnicii de secventare prin metoda automata Ingredientele secventarii sunt urmatoarele! - atrita - a pliconii obtinuti prin PCR in acest caz - un pri er, care frecvent poate sa fie unul din pri erii folositi si in reactia PCR prin care sau obtinut a pliconii - Ta3 poli eraza - deoxinucleotide trifosforilate - dideoxinucleotide trifosforilate, arcate fiecare cu cate un fluorocro diferit Mare parte din #in$redientele% necesare pentru secventare sunt co une cu reactia PCR! Totusi, exista deosebiri funda entale4 este necesar un sin$ur pri er, asadar se va obtine secventa unei sin$ure catene din olecula de A&', iar pe lan$a deoxinucleotidele obisnuite, se folosesc si dideoxinucleotidele corespunzatoare celor 5 tipuri de baze azotate! Ta3poli eraza adau$a nucleotidele obisnuite, dar, prin sansa, la un o ent dat adau$a si un dideoxinucleotid, punct in care elon$area se opreste! &eorece, pe de o parte, cantitatea de atrita folosita este are, iar pe de alta parte, incorporarea dideoxinucleotidelor este un proces aleator, se obtine o colectie de fra$ ente A&' care difera intre ele ca lun$i e printrun sin$ur nucleotid, ulti ul nucleotid al acestor fra$ ente fiind dideoxinucleotidul corespunzator nucleotidului din atrita, unde elon$area a fost blocata -Ta3-poli eraza nu poate adau$a deoxinucleotide obisnuite in continuarea unui dideoxinucleotid.! Fra$ entele /

A&' astfel obtinute sunt i$rate intr-un $el special bazat pe poliacrila ida, care are capacitatea de a discri ina fra$ ente A&' care difera ca lun$i e chiar si printr-un nucleotid! Interpretarea si analiza de secventa prin analiza cromatogramelor o"tinute prin tehnica de secventare automata a ADN. "n ti p ce i$reaza, ulti ul nucleotid al fiecarui fra$ ent este detectat, fiind arcat cu un fluorocro -specific pentru fiecare din cele 5 baze azotate 6 A, ,, T si C., iar se nalul lu inos este tradus intr-unul $rafic, sub for a de pea7-uri colorate diferit -cate o culoare pentru fiecare baza azotata.! Secventa astfel obtinuta -sub for a de pea7-uri. este co parata cu secventele A&' din diverse baze de date, existand soft-uri dedicate pentru aceasta operatiune! Avanta#ele si dezavanta#ele secventarii ADN. 8eneficiul a9or al secventarii reiese clar ai ales in situatiile in care exista hetero$enitate alelica si : sau de locus arcata, cu frecvent se inta pla de altfel in patolo$ia $enetica! &e ase enea, secventarea este tehnica prin care se pot verifica rezultate obtinute prin alte tehnici de $enetica oleculara! "nsa, costul destul de ridicat al aparatului dedicat secventarii, precu si al reactivilor aferenti, depaseste posibilitatile ultor laboratoare, ceea ce face secventarea o tehnica ai putin accesibila! Alte tehnici de diagnostic molecular Tehnica SS$ %single strand con&ormation pol'morphism( rincipiul tehnicii SS$ si utilitate "n afara de cele descrise ai sus, ai exista o serie de tehnici de $enetica oleculara, insa acestea sunt destul de putin utilizate! &intre acestea, ar putea fi entionata SSCP -Sin$le Strand Confor ational Pol; orphis ., tehnica bazata pe proprietatea A&'-ului onocatenar de a for a punti de hidro$en intra oleculare si i plicit de a adopta structuri secundare particulare! Mobilitatea electroforetica a oleculelor A&' depinde si de confor atia lor< astfel, doua olecule de A&' onocatenar, care difera printr-un sin$ur nucleotid, vor i$ra electroforetic diferit! Avanta9ul acestei tehnici rezida in posibilitatea de a detecta aproape orice utatie, fara a preciza insa natura ei, otiv pentru care unii cercetatori folosesc SSCP ca test screenin$ inainte de secventare! Tehnici cantitative de analiza a acizilor nucleici Tehnicile cantitative reprezinta o achizitie relativ recenta in $enetica oleculara! Acestea sunt utilizate in special in situatiile cand nu este suficienta doar a plificarea unui fra$ ent A&', ci este necesara si cuantificarea lui! Tehnica )ealTime- $)! principiu si aplicatii in analiza acizilor nucleici in diagnosticul molecular. Cea ai utilizata tehnica de cuantificare a aterialului $enetic este Real-Ti e PCR< in principiu, este vorba de o a plificare obisnuita PCR, cantitatea de a plicon insa fiind asurata dupa fiecare ciclu PCR! Acest lucru este posibil prin folosirea unor pri eri arcati fluorescent, care elibereaza o cantitate de fluorescenta proportionala cu cantitatea de A&' tinta a plificat! Fluorescenta respectiva este detectata, asurata si convertita $rafic intr-o curba de a plificare, care reflecta cantitatea de a plicon, prin raportarea la un standard! Cel ai frecvent, tehnica Real-Ti e PCR este folosita in oncohe atolo$ie -pentru onitorizarea clonei tu orale care poarta diverse utatii. si in icrobiolo$ie -pentru asurarea incarcaturii =

bacteriene, respectiv virale.! &e ase enea, studiile de expresie $enica beneficiaza din plin de aportul acestei! Analizele moleculare pornind de la moleculele de A)N mesager. Tehnica de revers-transcriptie! principiu si aplicatii. &esi do$ a centrala a $eneticii arata ca infor atia circula de la A&' la AR' esa$er prin transcriptie si ai departe de la AR' esa$er la proteine prin traducere, practica a de onstrat faptul ca infor atia poate sa circule si de la AR' la A&', prin inter ediul revers-transcriptiei, observata initial la virusurile AR' care reusesc sa se insere in $eno ul celulei-$azda, prin inter ediul unei enzi e care a pri it nu ele de revers-transcriptaza! 2lterior, revers-transcriptaza a inceput sa fie folosita si in aplicatii de $enetica oleculara! "n acest caz, punctul de plecare este reprezentat fie de AR'-ul celualr total, fie de catre diverse specii de AR', in special AR' esa$er, pentru obtinerea caruia exista 7it-uri co erciale specializate! Ingredientele &olosite pentru reverstranscriptie sunt! - pri eri nespecifici, care vor hibridiza aleator cu diversele olecule AR' -atunci cand a fost extras AR' total dintr-o proba. - pri eri poli-T, care hibridizeaza specific doar cu speciile de AR' esa$er, in re$iunea co ple entara poli-A a acestora -atunci cand s-a extras doar AR'-ul esa$er. - revers-trnascriptaza, prototipul fiind Molone; Murine Leu7e ia >irus Reverstranscriptase - dideoxinucleotide fosforilate - inhibitor de R'-aza "n acest fel, se obtine A&' co ple entar, care poate fi folosit ulterior ca atrita obisnuita pentru reactia PCR! 2n do eniu vast de aplicatii ale tehnicii RT-PCR este reprezentat de catre studiul expresiei $enice pentru o $ena sau o baterie de $ene< asadar, in aceste cazuri, punctul de plecare este reprezentat de catre speciile de AR' esa$er, care vor fi reverstranscrise in cA&'! &atorita faptului ca AR'-ul este o olecula onocatenara, fiind foarte susceptibila la de$radare rapida, probele recoltate in vederea extractiei AR' trebuie prelucrate in cel ai scurt ti p posibil, spre deosebire de cele prelevate in vederea extractiei A&', care pot fi pastrate o perioada ult ai lun$a de ti p! Mutatiile genice si polimor&ismele genice. Mutatiile $enice reprezinta odificari ale secventei nucleotidice a A&'-ului! Mutatiile $enice pot sa apara spontan, in ti pul replicarii A&', sau pot fi induse de diversi a$enti uta$eni! Mutatiile $enice pot fi constitutionale -prezente in toate celulele or$anis ului. sau so atice -prezente doar in anu ite celule ale or$anis ului., acestea din ur a caracterizand procesele tu orale -veritabile boli $enetice so atice.! Ma9oritatea utatiilor sunt stabile, in sensul in care odata aparute se trans it ne odificate la descendenti, dar exista si utatii instabile, dina ice, produse prin expansiunea unor repetitii nucleotidice! Mutatiile $enice pot fi clasificate in functie de odificarea produsa in secventa de nucleotide a A&'-ului in trei ari cate$orii4 *. Su"stitutiile nucleotidice! Substitutiile nucleotidice, care i plica de re$ula inlocuirea unei sin$ure perechi de baze azotate - utatie punctifor a.! Acestea reprezinta cel ai frecvent tip de utatii $enice intalnit la o ! ?xista doua tipuri de substitutii nucleotidice4 tranzitii -inlocuirea unei baze purinice sau piri idinice cu o baza de acelasi tip. si transversii -inlocuirea unei baze purinice @

cu o baza piri idinica sau a unei baze piri idinice cu o baza purinica.! &esi probabilistic transversiile ar trebui sa fie ai frecvente decat tranzitiile, in realitate acestea din ur a sunt ai frecvente, deoarece acestea nu odifica se nificativ arhitectura locala a oleculei de A&', fiind ai $reu de recunoscut de catre siste ele de reparatie a leziunilor A&'! Peste @*A dintre substitutiile nucleotidice afecteaza insulele Cp,, frecvente ai ales la nivelul pro oterilor $enelor! 2na din explicatii ar fi reprezentata de faptul ca frecvent citozina etilata din aceste insule sufera o deza inare spontana la ti ina -baza nor ala din A&', $reu de recunoscut si reparat de catre siste ele de reparatie ale leziunilor A&'., conducand la aparitia unei tranzitii citozina - ti ina! "n functie de consecintele substitutiilor asupra infor atiei $enetice, acestea pot fi4 Tipuri de su"stitutii nucleotidice! a. daca afecteaza secvente codante -exonii.4 - utatii silentioase -sinoni e., ducand la inlocuirea cu un codon sens sinoni < in acest fel, consecinta asupra proteinei codificate de $ena respectiva este nula - utatii cu sens $resit - issens utations., care la randul lor pot fi4 conservative, care duc la substitutia cu un a inoacid inrudit chi ic si functional si neconservative, care duc la susbtitutia cu un a inoacid diferit chi ic si functional! Mutatiile issens neconservative sunt frecvente in patolo$ia $enetica u ana! - utatii nonsens, care duc la substitutia unui codon sens cu unul stop, rezultand un AR' esa$er ai scurt, si i plicit o proteina anor ala, trunchiata! Si acest tip de utatie este relativ frecvent intalnit in patolo$ia $enetica u ana! - ai exista ai rar si substitutii care transfor a un codon stop intr-unul sens, in acest caz rezultand un AR' esa$er si i plicit o proteina ai lun$a b. daca afecteaza secventele necodante -in special intronii. - splice site utations, care afecteaza situsurile de decupare a intronilor, conduc fie la incorporarea unui intron in AR' esa$er atur, fie la pierderea unui exon -exon s7ippin$.! - ai rar pot fi afectate secventele B(-2TR sau @(-2TR, caz in care poate fi odificata rata transcriptiei si i plicit a sintezei proteice c. daca afecteaza secventele re$latoare - aceste substitutii pot odifica rata transcriptiei sau stabilitatea oleculei de AR' esa$er, odificand i plicit rata sintezei proteice +. Deletiile si insertiile nucleotidice! deletiile si insertiile nucleotidice, care apar cel ai adesea la nivelul unor secvente nucleotidice repetate in tande , printr-un ecanis de $lisare inapoi -insertii. sau inainte -deletii., survenit in ti pul replicarii! - daca deletiile sau insertiile sunt ultiplu de trei, se produce aditia sau deletia unui codon, asadar aditia sau deletia unui a inoacid in proteina codificata de $ena respectiva! - daca deletiile sau insertiile nu sunt ultiplu de trei, se produce o decalare a cadrului de lectura -fra eshift utations., evident cu consecinte nefavorabile i portante asupra proteinei codifcate de $ena respectiva! ,. -.pansiunea tripletelor de nucleotide. Mutatiile dinamice! Mutatii produse prin expansiunea instabila a unor repetitii trinucleotidice - ai rar a unor repetitii care contin un nu ar ai are de nucleotide., reprezinta un capitol aparte din patolo$ia $enetica, descris dupa anii (0*, in care utatia se valideaza in plan fenotipic doar de la un nu ar anu e de repetitii! Mai ult, cu cat e ai are nu arul de repetitii, cu atat este ai precoce varsta de debut a anifestarilor bolilor $enetice aparute prin acest ecansi -anticipatie.!