UNIVERSITATEA POLITEHNICA DIN BUCURETI

FACULTATEA DE CHIMIE APLICAT I TIINA

MATERIALELOR
CONTROLUL ANALITIC AL CALITII MEDIULUI
I TEHNICI DE DEPOLUARE

Tehnologia de obinere a unor produse

organice de sintez-medicamente:
fabricarea antibioticelor

LEOVEANU OANA-NICOLETA

Tehnologia de obinere a unor produse organice de sintez-medicamente:

fabricarea antibioticelor
Antibioticele formeaza un grup de substane chimice de structuri
diferite, provenite din metabolismul celulelor vii, de la structuri foarte
simple ce se pot reproduce prin sinteze chimice (cicloserina), pn la
structuri foarte complexe (macrolidele) care se pot obine prin biosinteza i
se extrag din mediile de cultur. Unele antibiotice se obin industrial pe
cale sintetic, n schimb, foarte puine se obin economic prin sinteza
chimic total. Procedeul fundamental de obinere rmane cel fermentativ,
biosenteza efectuandu-se cu ajutorul unor organisme simpe din familia
mucegaiurilor i bacteriilor.
I.

Istoric

Descoperirea lui Luis Pasteur i Robert Koch a jucat un rol important

n descoperirea teoriei germenilor ce cauzeaz bolile, pentru aceasta ambii
au fost premiati cu premiul Nobel. n 1892, postulatele lui Koch precizau
criteriile pentru a dovedi c o anumit bacterie este responsabil pentru o
anumit afeciune.
Prima substan antibacterian care poate fi considerat ca antibiotic
cu spectru restrans a fost salvarsanul descoperit n anul 1910 de chimistul i
medicul german Paul Ehrlich (1854-1915), medicament cu care s-a tratat
sifilisul, care era foarte rspndit. A fost urmat n anul 1928 de descoperirea
epocal a penicilinei de ctre Alexander Fleming, care observa c secreia
mucegaiului verde Penicillium notatum (Penicillium chrysogenum)
distruge colonia de bacterii din laborator.
Fleming i-a publicat lucrarea n 1929, artnd c extractul din
mucegai este capabil s omoare un anumit numr de bacterii. n urmtorii
zece ani, Fleming a ncercat s mbunteasc penicilina, dar munca i-a
fost ingreunat de imposibilitatea de a o izola i purifica.
ntre timp, Ernst Chain, cercetator la Oxford, n echipa lui Howard
Florey a ncercat s izoleze penicilina i s-i stabileasc structura. Primele
rezultate ale acestuia au fost publicate n 1940 i pn n 1945, s-a
demonstrat c penicilina are proprieti curative deosebite, fiind produs i
folosit pe o scar larg. Pentru descoperirile lor, Florey, Chain si Fleming,
au obtinut premiul Nobel in 1945.

Dac descoperirea penicilinei se datoreaz ntr-o oarecare msur

activitii lui Fleming i Florey, celelalte antibiotice s-au descoperit printr-o
activitate tenace si sistematic a sute de cercetatori.
n descoperirea noilor antibiotice s-a plecat de la constatarea simpl
ca n sol, cu mici exceptii, nu se gasesc agenti patogeni. Deci, mucegaiurile
din sol produc antibiotice capabile s-i distrug. S-au recoltat probe de sol
din ntreaga lume i s-au verificat proprietile antibiotice ale culturilor de
mucegai gsite.
n ara noastr fabricarea industrial a antibioticelor a nceput n anul
1955, iar n prezent se fabric o gam destul de larg de antibiotice a cror
productie se cifreaz la aproximativ 100 t anual. Astazi, n cadrul industriei
chimice, industria antibioticelor de biosintez reprezint o ramur
productiv deosebit de importante, iar dezvoltarea, modernizarea,
automatizarea i optimizarea tehnologiilor de fabricatie asigur integral
nevoile interne de antibiotice i ofer pentru export aproape o treime din
productia realizat.
II.

Definiia i sursele de antibiotice

Prima definiie a antibioticelor a fost dat n 1944 de Waksam, dup

care, orice substan chimic produs de microorganisme i care distruge
sau inhib nmulirea bacteriilor i a altor organisme, este denumit
antibiotic. Aceast definiie a fost considerabil modificat, deoarece
cloramfenicolul izolat mai nti (1947) din Streptomyces Venezuelae se
obine acum prin sintez, iar penicilinele noi se obin prin semisintez.
Astzi, prin antibiotic se nelege un compus chimic elaborat de un
microorganism sau obinut prin sintez care, n doze foarte mici, inhib
dezvoltarea microorganismelor patogene.
Din numrul total de antibiotice naturale i substane asemntoare
descrise pn n prezent, 98% sunt produse de plante i microorganisme i
numai 2% sunt produse de tulpini animale ca protozoare, molute, insecte
sau forme superioare ale organismelor animale. Dintre antibioticele
adevrate 68% sunt produse de microorganisme aparinnd
actinomicetaceelor, 12% de schizomicete i 20% de diferite specii de
eumicete. n clasa schizomicetelor 85% din antibiotice sunt produse de
actinomicetale i 15% de eurobacteriale. Din clasa ascomicetelor familia

aspergilaceelor este cea mai important, ea producnd 78% din cantitatea

total de antibiotice provenite din fungi.
Cercetrile asupra antibioticelor din fungi, au ocupat un loc
important ntre anii 1945 - 1950 i aceasta ca rezultat al valorii terapeutice
ridicate a penicilinei, iar dup 1950 s-au intensificat cercetrile asupra
antibioticelor produse de actinomicete. n ultimul timp numrul
antibioticelor a crescut i este de ateptat o cretere i mai mare n viitorul
apropiat,datorit extinderii cercetrilor asupra ascomicetelor,
bazidiomicetelor i adelomicetelor, insuficient studiate pn n prezent.
Antibioticele se aplic n medicina uman i veterinar ca mijloace
antiinfectioase, bacteriene, n combaterea bolilor virale i canceroase,
precum i n unele afeciuni de natur neinfecioas. n afara de aceasta,
antibioticele i-au gsit utilizarea n zootehnie, agricultur i pomicultura.
III.

Clasificarea antibioticelor

S-au propus mai multe criterii de clasificare funcie de originea

microorganismului productor, structura chimic a antibioticelor i aciunea
antibacterian. Cu toate c fiecare metod folosit la clasificare este
susceptibil la anumite critici, clasificarea antibioticelor se va face funcie
de originea microorganismelor productoare, structura chimic a
antibioticelor, biogeneza i aciunea lor farmacologic.
a) Dup originea microorganismului productor, antibioticele se
clasific n urmtoarele grupe:
- antibiotice produse de bacterii: gramicidina, gramidina S, bacitracina,
polimixinele etc.;
- antibiotice produse de actinomicete: streptomicina, cloromicetina,
tetraciclina, neomicina, kanamicina, nistatina, actinomicina etc.;
- antibiotice produse din fungi: penicilina, grizeofulvina.
Clasificarea n funcie de originea microorganismului productor nu
este concludent, deoarece este cunoscut faptul c acelai microorganism

poate produce mai multe antibiotice diferite ca structur i proprieti

fiziologice.
b) Dup constituia chimic, antibioticele se clasific n urmtoarele
grupe:
- antibiotice cu structur alifatic: alicina;
- antibiotice cu structur aromatic: acidul gladiolic,
(cloromicetina);

cloramfenicolul

- antibiotice cu structur chinonic: fumigatina, ftiocolul;

- antibiotice cu cicluri de furan i piran: acidul penicilic;
- antibiotice heterociclice cu azot n molecul: acidul aspergilic, acidul
hidroaspergilic;
- antibiotice heterociclice cu azot i sulf n molecul: penicilinele;
- antibiotice cu structur polipeptidic: gramicidina;
- antibiotice cu structur complex: macrolidele;
- antibiotice cu structur nedeterminat: viomicina.
Clasificarea dup structura chimic ofer posibilitatea formrii unor
grupe, care elucideaz legtura dintre constituia chimic i proprietile
antibacteriene.
c) Dup biogenez, antibioticele se clasific n urmtoarele grupe:
- antibiotice derivate din aminoacizi sau din uniti asemntoare:
oxamicina, azaserina, cloramfenicolul, penicilinele, bacitracinele,
actinomicinele;
- antibiotice derivate parial sau total din acetat: grizeofulvina,
tetraciclinele, grupul macrolidelor, antibiotice polienice;
- antibiotice derivate din glucide simple: streptomicina, kanamicina,
neomicina;
- antibiotice diverse: novobiocina, vancomicina.

Clasificarea dup genez permite explicarea mai uoar a

mecanismului biochimic de formare a antibioticelor.
d) Dup aciunea farmacologic, antibioticele
urmtoarele grupe:

se clasific n

- antibiotice cu aciune antibacterian;

- antibiotice cu aciune antituberculoas;
- antibiotice cu aciune antivirotic;
- antibiotice cu aciune anticanceroas;
- antibiotice cu aciune antifungic;
- antibiotice cu aciune antiprotozoarian.
Prin urmare, antibioticele nu exercit aceeai aciune antimicrobian
asupra tuturor germenilor patogeni; ele au spectru antibacterian
caracteristic, determinat de rezistena specific a microorganismelor
patogene.
IV.

Biotehnologia producerii antibioticelor

Tehnologiile de obinere a produselor de biosintez au comun

procesele de pregtire i sterilizare a mediului, sterilizarea aerului,
fermentaia i filtrarea biomasei.
Mediile de cultur se prepar, conform reetelor de fabricaie, n
instalaii special destinate acestui scop sau direct n fermentator. Dac
cantitatea de mediu este mic, ca n cazul mediului nutritiv din
fermentatorul de inoculare, atunci prepararea i sterilizarea lui pot fi
realizate direct n fermentator.
Sterilizarea fermentatorului, a rcitorului, a liniei de inoculare i
transvazarea biomasei, precum i sterilizarea filtrelor de aer se face cu abur
la 5 ata, timp de 1 or, la 125 - 130C.
Sterilizarea lichidului antispumant din vasul 4 (fig. 1) se face prin nclzire cu abur, care circul prin serpentina interioar, timp de 3 - 4 ore.
Umplutura filtrelor (vat de sticl) trebuie schimbat lunar, pentru a
avea garania unei sterilizri perfecte a aerului tehnologic. De asemenea,
umplutura filtrelor se schimb ori de cte ori apar infecii repetate.

Dup schimbarea ncrcturii, filtrele se sterilizeaz cu abur direct la

1,5 - 2 at, timp de 1 - 2 ore, apoi se sufl aer steril pn la ndeprtarea
total a umiditii.
n instalaia de fermentaie astfel sterilizat, se introduce inoculul
dup care este pus n funciune sistemul de agitare i aerare. Fermentaia se
realizeaz n trei stadii (inoculator, intermediar, regim), iar transvazarea
biomasei dintr-un fermentator n altul se face printr-un sistem steril.

Fig. 1. Schem de principiu a instalaiei de fermentaie:

1 - inoculator; 2 - filtru de aer; 3 - fermentator intermediar; 4 - vas cu
lichid antispumant; 5 - fermentator de regim; 6 - pomp
Pentru majoritatea tehnologiilor de biosintez temperatura, aeraia,
agitarea i pH-ul au valori foarte apropiate. Astfel, temperatura optim a
proceselor de biosintez este de 26 - 28C i se menine prin rcire n
manta i serpentin. Deoarece procesele de fermentaie sunt exoterme, problema grea care apare n proiectarea i construcia fermentatoarelor este
asigurarea unui regim uniform de rcire n toat biomasa.
Aeraia este un alt parametru comun tuturor tehnologiilor de
biosintez aerob i care influeneaz hotrtor asupra randamentelor n
faza de fermentaie. Asigurarea unui regim optim de aeraie pe toat durata
procesului se realizeaz prin folosirea unui debit de aer de un litru pentru
un litru mediu pe minut. Acest coeficient de aerare este aproximativ acelai
att n fermentatoarele de mare capacitate, ct i n cele de inoculare i este
nsoit de un intens regim de agitare la un pH cuprins ntre 6 i 6,5 pentru
faza de cretere a masei celulare i ntre 6,8 - 7,5 pentru faza de biosintez
a principiilor active.
7

O problem important n dirijarea procesului de biosintez este

reglarea spumrii. Administrarea unei cantiti mari de aer n lichidul de
cultur, prezena n mediu a unor substane tensioactive, a particulelor
coloidale i a suspensiilor, mresc rezistena bulelor de aer i prin aceasta
favorizeaz producerea spumrii. Adeseori procesul de formare a spumei
este att de intens nct stnjenete desfurarea normal a fermentaiei,
favoriznd apariia infeciilor n lichidele de cultur.
Pentru distrugerea spumei se folosesc substane chimice i
dispozitive mecanice. Dintre substanele chimice se remarc efectul
antispumant deosebit al uleiului vegetal, al grsimii de caalot, al uleiului
de silicon i al polimerului oxipropilenic. n fermentaie se folosete curent
uleiul vegetal care ofer rezultate acceptabile.
Intensificarea procesului de distrugere a spumei se poate realiza prin
utilizarea unor separatoare mecanice de spum cu talere rotative (fig. 2).

Figura 2.. Separator mecanic de spum tip CHEMAP

1 tu ieire aer; 2 presetup; 3 dispozitiv de fixare; 4
garnitur de etanare; 5 presetup; 6 canale de separare centrifugal a
8

aerului din spum (canale de spargere a spumei); 7 intrarea spumei n

separator; 8 talere rotative de spargere a spumei; 9 orificii de ieire a
aerului; 10 axul separatorulu; 11 fermentator; 12 rotor cu diferenial;
13 motor electric.
Acest dispozitiv const dintr-o serie de talere conice de absorbie a
spumei, montate pe un rotor tubular acionat mecanic. Efectul de distrugere
a spumei este mrit de prezena unor icane radiale n talere. Gazele sunt
evacuate prin axul rotorului, iar soluia apoas returnat n zona de
fermentaie.
Numrul mare de parametri i limitele de variaie foarte restrnse
impun automatizarea complet a controlului i reglrii lor.
Pentru realizarea procesului de fermentaie discontinuu au fost
propuse diferite tipuri constructive de fermentatoare, printre care
fermentatorul cilindric vertical cu agitator turbin, serpentine de rcire i
barbotor de aer (figura 3.), utilizat curent n tehnologiile de biosintez.

Figura 3. Schema fermentatorului discontinuu

1 fermentator; 2 manta de rcire; 3 serpentine de rcire; 4
barbator; 5 agitator turbin; 6, 9 tu de admisie a agentului de rcire; 7,
8 tu de ieire a agentului de rcire; 10 tu de admisie a aerului
Pentru fermentaiile n flux continuu se experimenteaz n faz de
laborator sistemul de fermentatoare tubulare cu agitare prezentat n figura
4.

Figura 4. Schema fermentaiei continue pe dou fermentatoare

tubulare
cu agitare legate n serie:
1 sterilizator; 2 rcitor; 3, 4 fermentator tubular cu agitare; 5, 6
separator parial de mas celular; 7 sistem de pompe pentru
recircularea sterila masei celulare
Fermentatorul tubular cu agitator orizontal (figura 5.) este considerat
cel mai convenabil pentru procesele aerobe, deoarece ofer o eficacitate
deosebit a aeraiei.
n procesul de fermentaie discontinu se recomand ca nainte de
transvazare din inoculator n intermediar i de aici n regim, biomasa s se
menin cteva ore la parametrii procesului din faza urmtoare, pentru a
evita unele stagnri n procesul de cretere sau biosintez.

10

Figura 5. Schema fementatorului tubular cu agitare:

A rotorul agitatorului; B fermentatorul tubular; C spaiu tubular
pentru rcire; D dispozitiv de etanare i ghidare a axului agitatorului; E
axul agitatorului;
1 tu intrare mediu; 2 tu intrare aer; 3 - tu intrare lichid
antispumant; 4 tu ieire mediu fermentat; 6 - tu de recirculare a
mediului fermentat; 7 - tu pentru aparate de msur (T, pH etc.).
Schema simplificat a unui proces de fermentaie este exemplificat
prin fluxul tehnologic de fabricaie a penicilinei G reprezentat n figura 6.

11

Figura 6. Schema instalaiei de biosintez i separare a penicilinei

G sare de potasiu:
1 vas depozitare extract de plumb; 2 pomp cu roi dinate; 3
vas depozit extract de porumb; 4 cad pentru cntrire; 5 vas pregtire
mediu pentru inoculator; 6 vas soluie NaOH; 7 vas de msur NaOH; 8
vas de pregtire a mediului pentru intermediar; 9 vas pentru zahr; 10
vas pregtire mediu pentru regim; 11 pomp centrifug; 12a coloan de
sterilizare a mediului pentru fermentatorul de regim; 12b coloan de
sterilizare a mediului pentru fermentator intermediar; 13, 13a - menintor;
14, 14a rcitor; 15 inoculator; 16a, 16b, 16c filtru pentru aer; 17
fermentator intermediar; 18 fermentator de regim; 19 vas cu lichid
antispumant; 20 pomp centrifug; 21 filtru tambur cu vid; 22 vas
pentru lichid filtrant; 23 pomp centrifug; 24 rcitor tubular; 25 vas
colector soluie nativ; 26 pomp; 27 vas colector soluie nativ; 28
vas reintor de picturi; 29 vas tampon de vid; 30 pomp de vid; 31
pomp; 32 vas msur H2SO4; 33 vas acetat de butil; 34 vas msur
cetazol; 35a, 35b, 35c extractor Podbielniak; 36 vas neutralizare ape; 37
vas acetat de butil; 38 vas de soluie fosfat-carbonat; 39 vas cu soluie
de fosfat-monopotasic; 40 vas de msur H2SO4; 41 vas acetat de butil;
42 vas acetat de butil concentrat; 43 vas ngheare decolorare; 44
filtru; 45 vas colector concentrat; 46 druk filtru; 47 filtu Seitz; 48
vas de precipitare; 49 vas soluie alcoolic de acetat de potasiu; 50 filtru
nuce; 51 vas culegere soluie mum; 52 vas msur butanol; 53 vas
msur cloroform; 54 vas de splare penicilin; 55 filtru nuce; 56 vas
culegere butanol; 57 vas culegere cloroform; 58 usctor cu pat fluidizat.

V.

Biotehnologia de obinere a penicilinelor G i V

Penicilinele constituie un grup de antibiotice, obinute prin

biosintez sau semisintez, caracterizate printr-un larg spectru
bacteriostatic i bactericid n faza de multiplicare logaritmic a germenilor
patogeni.
Aciunea penicilinelor este complex; ele mpiedic ncorporarea
unor factori n membrana bacterian, ducnd la multiple tulburri de
nutriie i metabolism bacterian.
Deoarece majoritatea penicilinelor, mai ales cele naturale, sunt
inactivate de penicilinaz i acilaz, se impune gsirea unor peniciline cu
12

rezisten i aciune ridicat. Penicilinele ideale" ar trebui s posede un

larg spectru antibacterian, stabilitate n mediu acid, rezisten la
penicilinaz, stabilitate n soluie, absorbie rapid i s nu produc
hipersensibilitate la administrare. Cu toate c nu se cunosc, deocamdat,
peniciline care s satisfac toate exigenele, ele dein totui supremaia n
practica medical, datorit att proprietilor terapeutice nsoite de
toxicitate redus, ct i apariiei penicilinelor de semisintez, despre care se
poate spune c au deschis epoca de aur a penicilinelor.
1. Peniciline de biosintez
Penicilinele de biosintez sunt substane chimice produse de diferite
specii de microorganisme, din clasa Penicillium i Aspergillus printre care:
P. crysogenum, P. notatum, P. crustosum, A. niger, A. giganteus, A. flavus
etc. Aceste substane sunt neomogene din punct de vedere chimic, fiind
formate din cteva peniciline care au comun sistemul biciclic tiazolidin- lactamic i care difer ntre ele prin structura catenei laterale i activitate
anti-bacterian.
Penicilinele sunt acizi monobazici puternici (pK = 2,72,76) cu
urmtoarea structur general:
S
1

CO

NH
O

CH

CH
5

CH

CH3
CH3
COOH

Denumirea tipurilor de peniciline separate din lichidul de cultur,

activitate antibacterian i structura catenei laterale sunt prezentate n
tabelul 1.
Tabelul 1. Denumirea, structura i activitatea penicilinelor naturale
Nr.
crt.

Denumirea
penicilinei

Structura
radicalului

Denumirea
radicalului

Activitatea
UI/mg sare
Na

1.

Penicilina F

CH3-CH2-CH =
CH-CH2 -

2-pentenil

1500

CH3-CH2-CHCH2-CH2 -

n-amil

1670

C6H5 - CH2 -

benzil

1667

2.
3.

Penicilina
dihidro
F (Acid
gigantic)
Penicilina G

13

4.
5.
6.
7.

Penicilina X
Penicilina K
Penicilina V

HO-C6H4 -CH2 p-hidroxibenzil

CH3-(CH2)5-CH2n - heptil
C6H5-O-CH2fenoximetil
CH2 = CH-CH2-S- alilmercaptometi
Penicilina O
CH2l

900
2 300
1630
-

n terapeutic se folosesc numai penicilinele G i V sub form de

sruri de sodiu, potasiu, calciu, trietilamin i novocain (procainpeniciline). Fenoximetilpenicilina (penicilina V) se utilizeaz i sub form
de acid liber.
1.1.

Proprietile fizice ale penicilinelor G i V

Benzilpenicilina (penicilina G) este o substan alb, cristalin care

se topete la 80C i se descompune la 87oC, solubil n ap i solveni
organici. Avnd 3 atomi de carbon asimetrici (3,5,6) benzilpenicilina este
optic activ cu D 23 = + 241.
Principalele proprieti fizice ale srurilor benzilpenicilinei sunt
prezentate n tabelul 2.
Tabelul 2. Proprietile fizice ale srurilor benzilpenicilinei
Condiiile determinrii
Metalul sau
Temperatura
amina din
D
Temperatura,
Concentraii,
de topire, C
Solvent
sare
C
%
Sodiu
215 (cu desc.) +301
24,8
ap
2,0
214-217 (cu
+
Potasiu
22
ap
0,784
desc.)
285
tampon
145 147 (cu
+
Trietilamin
21,5
fosfat
0,22
desc.)
214
1%
129 130 (cu
+
aceton
Novocain
25
0,1
desc.)
173
50%
N.
167 168 (cu
+
etilpiperidin
25
ap

desc.)
238

Dintre srurile prezentate cele mai importante sunt srurile de sodiu

i potasiu caracterizate printr-o bun solubilitate n ap, metanol i etanol;
mai greu solubile n izo-propanol, butanol normal i teriar, cetone, dioxan
i piridin. Solubilitatea srii de sodiu i potasiu n solveni organici crete
14

foarte mult atunci cnd solventul conine mici cantiti de ap. Dependena
dintre solubilitatea srii de sodiu sau potasiu i cantitatea de ap din solvent
este utilizat n recristalizare; sarea solvit n solvent cu 10% ap este
recristalizat prin adugare de solvent anhidru. Solubilitatea srii de sodiu
n solveni coninnd diferite cantiti de ap este redat n tabelul 3.
Tabelul 3. Solubilitatea benzilpeniciline sodice n amestec ap solvent
Solvent
Aceton
Aceton
Aceton
Aceton
Metiletilceton

Dioxan
Alcool n butilic

Coninutul
de ap n
solvent %
0
0,5
1,0
2,0

Solubilitatea,
Temperatura,
mg la 100 ml
o
C
solvent
0
6,0
0
15,6
0
31,0
0
100,0

2,4

14

15.0

81,0

Este interesant de remarcat c ntre +25 i -78C solubilitatea n aceton a srurilor benzilpenicilinei cu sodiu, potasiu i amoniu crete o dat
cu scderea temperaturii.
Fenoximetilpenicilina (penicilina V), spre deosebire de
benzilpenicilina, fiind stabil n mediu acid se poate obine fie sub form de
acid, fie sub form de sare. Sub form acid, fenoximetilpenicilina este o
substan incolor, cristalizat n diverse forme, avnd p.t. 118 - 120oC i
D 20 = + 193.
Principalele proprieti fizice ale srurilor fenoximetilpenicilinei sunt
prezentate n tabelul 4.

Tabelul 4. Principalele proprieti fizice ale srurilor

fenoximetilpenicilinei
Metalul
Temperatura
sau
de topire (cu
amina din
desc.), C
sare

Condiiile determinrii

D 20 Temperatura, Solvent Concentraii,

C
%
15

Sodiu

220 228

Potasiu

256 260

Amoniu

115 125

Novocain

70 - 72

1.2.

+
222
+
223
+
236
+
140

20

ap

20

ap

20

ap

20

ap

Structura penicilinelor

Din studiile ntreprinse cu metode chimice i fizico-chimice,

ndeosebi cu ajutorul razelor X, s-a demonstrat c penicilinele au comun un
sistem biciclic tiazolidin- -lactamic, care rezult prin nlnuirea
biogenetic a 2 aminoacizi i anume l-cistein i d valin. Structura
molecular a penicilinelor este:
1 - Cistein
d - Valin

S
6

NH
H

H
4

2C

CH3
CH3
COOH

Ciclu
lactamic
Grupa catenei
laterale

Ciclu
tiazolidinic

Nucleu de penicilin (acid 6 - amino - penicilanic)

Structura bicliclic tiazolidin- -lactamic este mai sensibil dect

structura - lactamic simpl la aciunea agenilor nucleofili, electrofili i
oxidani.
Faptul c penicilamina se formeaz la hidroliza oricrui tip de
penicilin demonstreaz c aceasta reprezint un element structural comun
tuturor penicilinelor. Al doilea component al degradrii avansate a
penicilinelor este peniloaldehida care cuprinde catena lateral i este
specific tipului de penicilin supus hidrolizei.

16

Multe din proprietile fizice, chimice i biologice sunt influenate de

structura catenei laterale.
Dac n catena lateral a penicilinelor se introduce o grupare
electron-atrgtoare se constat o cretere a stabilitii n mediu acid. S-au
obinut corelaii liniare ntre stabilitatea n mediu acid a penicilinelor i
aciditatea catenei laterale. Astfel, prin nlocuirea unui hidrogen din poziia
a benzil-penicilinei sau a unui hidrogen din ciclul benzenic al meticilinei
i fenil-penicilinei cu o grupare aminic sau cu un halogen, crete foarte
mult stabilitatea n mediu acid.
Confirmarea structurii penicilinelor s-a fcut i prin sinteza acestora.
Greutatea mare care apare n sinteza penicilinelor este nchiderea ciclului
- lactamic. O serie de ncercri se bazeaz pe condensarea D-penicilaminei
cu 4-alcoximetilen-5-oxazolon, dar randamentul reaciei nu depete
0,1%.
Identificarea i dozarea penicilinelor se poate face prin
cromatografiere, analize spectrale n U.V., I.R. i RMN, analize titrimetrice
i analize colorimetrice.
Penicilina G, ca i alte peniciline monoaromatice, prezint n
spectrele U.V. o absorbie slab n ap la 264; 257,5; 252 i 257 nm. Aceste
benzi sunt benzi tipice pentru absorbia grupei benzilice. Prezena unor
produi de degradare acid a penicilinelor este indicat de apariia unui
maxim la 320 nm, a crui intensitate este proporional cu gradul de
descompunere.
Datorit ciclului -lactamic condensat, penicilinele prezint n spectrul I.R. o band de absorbie intens la 5,62 , atribuit vibraiei grupei
C=O. Aceast band dispare dac ciclul -lactamic este scindat prin hidroliza enzimatic sau chimic i apare o band nou la 5,75 caracteristic
absorbiei peniciloil esterului sau amidei. Restul benzilor de absorbie
caracterizeaz celelalte grupri din peniciline: COOH (5,69 ), vibraia de
alungire a legturii NH (3 - 3,5 ), amid I (6 - 6,1 ) i amid II (6,5 6,7 ).
O alt tehnic util pentru caracterizarea medicamentelor lactamice este spectroscopia RMN. n mod normal spectrele RMN ale
srurilor solubile de penicilin pot fi determinate n D 2O. Penicilinele
prezint, de obicei, un semnal pentru 2 protoni la - 4,42 ppm ai atomilor
de hidrogen -lactamici, un semnal net monoprotonic la - 5,71 ppm
pentru protonul apropiat gruprii carboxil i semnale nete de 2 sau 3
protoni la = 8,38 ppm i = 8,47 ppm pentru gruparea dimetilic.
Pentru dozarea cantitativ a penicilinelor se poate utiliza cu succes
metoda iodometric sau colorimetric descrise detaliat n literatur.

17

1.3.

Tehnologia obinerii penicilinelor de biosintez

Penicilinele de biosintez se obin printr-o tehnologie comun care

cuprinde urmtoarele faze:
1) pregtirea mediilor de cultur i sterilizarea lor;
2) fermentaia biochimic;
3) filtrarea soluiilor native;
4) separarea i purificarea penicilinelor.
Pregtirea mediilor
Aceast faz const n dizolvarea n ap a componenilor mediului
conform reetei pentru fiecare faz a procesului de fermentaie.
Compoziia calitativ a mediilor de cultur pe faze este prezentat n
tabelul 6.9, iar compoziia cantitativ se ncadreaz n limitele valorilor din
tabel. Valorile exacte pentru compoziia mediilor de cultur depinde de
natura suei productoare i constituie secretul de fabricaie al fiecrei
uzine productoare de peniciline.
Tabelul 5. Compoziia mediului de cultur pe faze de fermentaie
Componenii
mediului de Inoculator Intermediar Regim
cultur
Extract de
2,52
2-3
porumb
2,8
Lactoz
0,5-0,6
3-3,5
6-7
Glucoz
3-3,5
1,2
2-3
Fin de soia
0,3
1,2CaCO3
0,7-0,8
0,7
1,3
0,5KH2PO4
0,1
0,2-0,3
0,6
NH4NO3
0,12
0,3
Na2SO4
0,06
0,06
ZnSO4
0,002
MnSO4
0,002
Fenilacetamid
0,2
0,4
Tiosulfat de
0,016
0,8
sodiu
18

Ap pn la
100 %
Pregtirea i sterilizarea mediilor de cultur pentru inoculator i
intermediar se poate realiza direct n fermentatoarele respective, sau n
aparate destinate acestui scop. Pregtirea mediului de cultur pentru
fermentatorul de regim are loc ntr-un aparat prevzut cu agitator, conduct
pentru abur viu necesar nclzirii i serpentin de rcire. n acest aparat se
introduce apa conform reetei, se nclzete la 60 - 70C, se adaug
extractul de porumb i se fierbe timp de 0,5 1 h. Dup aceasta, soluia se
rcete la 50-60C i se adaug restul componenilor mediului n
urmtoarea ordine: CaCO3, NH4NO3, Na2SO4, MgSO4, MnSO4, KH2PO4,
ZnSO4, lactoz, glucoz.
Mediul, astfel preparat, este sterilizat n instalaia de sterilizare cu
coloan i menintor, prin nclzire cu abur direct la 124 - 126C i
meninere la aceast temperatur timp de 10 - 12 min. n continuare,
mediul este rcit la 60 - 65C i trimis cu aceast temperatur n
fermentatorul de regim, unde se rcete n continuare pn la 27C.
Fermentaia penicilinelor
Fermentaia este faza fundamental a procesului de biosintez i se
realizeaz n trei trepte - inoculator, intermediar, regim - care corespund
anumitor stadii de dezvoltare a microorganismelor. Astfel, n inoculator se
petrece procesul de aclimatizare a microorganismelor productoare de antibiotic la noile condiii de dezvoltare, n intermediar ncepe creterea
exponenial a numrului de microorganisme, iar n regim se desvrete
procesul de cretere a microorganismelor i de elaborare a penicilinelor.
Aceast etapizare reprezint o imagine general i puin idealizat a
procesului de biosintez, deoarece chiar n intermediar ncepe procesul de
elaborare a penicilinelor ca rezultat al distribuiei vrstelor
microorganismului. Acumularea unor cantiti mari de mas celular face
ca volumele fermentatoarelor, n care se realizeaz cele trei etape, s
creasc n raport zecimal.
Eficacitatea procesului de biosintez este determinat de conformaia
genetic a tulpinii productoare. Tulpina utilizat curent n fabricarea penicilinelor este P. crysogenum Q 176 a crei poten a fost ridicat foarte mult
prin procese de mutaie. O tulpin bun se caracterizeaz prin capacitate
mare de nmulire, utilizare rapid a azotului i a precursorului, lipsa
pigmenilor n biomas i miceliu fibros.

19

Procesul de fermentaie a penicilinelor cuprinde trei faze metabolice

distincte: faza de cretere, faza de producere i faza autolitic. Faza de
cretere se caracterizeaz prin acumulare de mas micelian i utilizarea
intensiv a componentelor mediului de cultur. Glucoza este asimilat
foarte rapid att pentru formarea materialului celular, ct i pentru
furnizarea energiei necesare. Cerinele de oxigen sunt maxime n aceast
perioad, iar activitatea respiratorie, caracterizat prin degajare de CO 2,
este ridicat.
Faza de producere a penicilinelor se caracterizeaz prin ncetinirea
creterii miceliului - fie datorit epuizrii constituienilor uor asimilabili,
fie altor condiii existente - scderea consumului de oxigen, meninerea pHului, la 6,8 - 7,5 i acumularea de penicilin. n aceast faz lactoza este
folosit lent de ctre miceliu i furnizeaz energia necesar proceselor de
biosintez sau pentru formarea constituienilor celulari.
Faza autolitic corespunde stadiului n care microorganismul se epuizeaz ca urmare a activitii metabolice prelungite, iar sursele de carbon
din mediu sunt consumate. Coninutul n azot al miceliului descrete
considerabil i ncepe procesul de autoliz al acestuia cu eliberarea de
amoniac i creterea pH-ului peste 8. Producerea penicilinelor nceteaz i
apare un proces de hidroliz alcalin a penicilinelor formate. n practica
industrial nu este permis prelungirea fermentaiei pn la apariia
autolizei.
Cantitatea de peniciline formate ntr-o fermentaie biochimic
normal este rezultatul mbinrii raionale a urmtorilor factori:
conformaia genetic a tulpinii care decide capacitatea de producere
a penicilinelor;
folosirea unor constituieni adecvai n mediu i un echilibru corect
n proporiile acestora;
meninerea pH-ului optim n mediul de fermentaie;
dozarea corect a raportului ntre hidraii de carbon;
adugarea de precursori care vor decide natura catenei laterale i
tipul de penicilin produs;
asigurarea necesitilor de substane minerale;
meninerea temperaturii optime.
Din datele existente n literatur se poate conchide c pH-ul afecteaz vitezele reaciilor enzimatice, permeabilitatea membranelor celulare
i gradul de ionizare a srurilor.
Pentru faza de cretere a masei celulare pH-ul optim este de 4,5 5,0, iar pentru faza de producere a penicilinelor este de 7,0 - 7,5. Prin
urmare procesul va trebui condus n cele dou etape n regim diferit. Nu se
recomand depirea pH-ului de 7,5, deoarece ncepe procesul de autoliz
20

nsoit de degradarea penicilinelor formate. Dac fermentaia penicilinei se

realizeaz prin proces continuu, atunci, realizarea regimului optim de pH
pentru faza de cretere a microorganismelor i pentru fazade elaborare a
produsului este uor de realizat. Pentru procese discontinui pH-ul este
cuprins ntre 6,4 - 7,0. Brown i Peterson, studiind faza de producere a
penicilinei de ctre microorganism, demonstreaz c meninerea pH-ului la
valoarea 7 n ultima parte a ciclului de fermentaie asigur valori ridicate
pentru vitezele de respiraie i elaborare de peniciline.
Regimul optim de temperatur este de 25 1C, iar necesarul de aer,
deoarece procesul este aerob, este de 1 - 1,5 l aer/l mediu min, la o turaie
a agitatorului elicoidal de 110 - 140 rot./min.
Compoziia mediului de cultur are un rol hotrtor n procesul de
biosintez deoarece, n dezvoltarea sa, microorganismele au nevoie de
surse de hidrai de carbon, azot, substane minerale i precursori. Sursele de
hidrai de carbon sunt necesare pentru dezvoltarea microorganismelor i
pentru producerea antibioticului. Este necesar s se menioneze c
biosinteza unei molecule aa de complexe, ca penicilina, necesit un flux
de energie din exterior, procesul fiind endoterm. Prin urmare, biosinteza
penicilinelor se poate realiza numai dac se desfoar simultan cu procese
de oxidare ale hidrailor de carbon care constituie sursa principal de
energie. Oxidarea lent a lactozei elibereaz o energie ce depete cu 66
kJ/l mediu de cultur energia necesar sistemului; din aceast cauz
procesul de biosintez n ansamblu este exoterm.
Viteza de utilizare a hidrailor de carbon se nscrie n urmtoarea
schem: glucoz > acid lactic > lactoz, care confirm faptul c n faza de
cretere a microorganismelor se consum glucoza, iar n faza de producere
a penicilinelor se consum lactoza. Introducerea fructozei sau lactozei n
locul glucozei are ca efect imediat scderea brusc a vitezei de cretere a
masei celulare.
Sursele de azot sunt necesare pentru formarea grupelor aminice i
obinerea acizilor aminici. Se utilizeaz azot mineral din sruri de amoniu
i azot organic furnizat de aminoacizii i peptidele din extractul de porumb.
Prezena substanelor minerale este vital n procesul de cretere
deoarece ele afecteaz direct permeabilitatea membranei celulare i
echilibrul ionic, activeaz sistemele enzimatice sau intr n sisteme
enzimatice. Astfel, KH2PO4 ofer K3- pentru activarea unor sisteme
enzimatice i PO+ pentru fosforilare.
Jarvis i Johnson au determinat experimental, pentru tulpina P.
crysogenum Q 174, necesarul de substane minerale pentru fazele de
cretere a masei celulare i elaborarea de peniciline.

21

Tabelul 6. Necesarul de substane la producerea penicilinelor

Valori exprimate n mg/l
mediu
Element
Creterea Producerea
ciupercii
penicilinei
Potasiu
40
40
Magneziu
8
8
Fosfor
80
200
Fier
0,2
7
Sulf
70
100
Dirijarea procesului de biosintez spre o anumit penicilin se face
cu ajutorul unor substane care sunt nglobate n catena lateral a
penicilinelor i poart numele de precursori. Pentru penicilina G se
utilizeaz ca prescursor fenilacetamida, iar pentru penicilina V acidul
fenoxiacetic. Precursorii se adaug n poriuni, deoarece n concentraii mai
mari de 0,1 - 0,2% sunt toxici pentru microorganisme.
Dinamica procesului de fermentaie este redat n figura 7.
Procesul de fermentaie a penicilinelor fiind aseptic, sterilizarea
aparaturii i a mediului se face cu abur viu la 124 - 125C, iar meninerea
sterilitii n timpul procesului este asigurat de suprapresiunea creat prin
barbotarea aerului steril necesar biosintezei.

22

Figura 7. Dinamica procesului de fermentaie a penicilinelor

Procesul de fermentaie se realizeaz n fermentatoare cilindrice
verticale construite din oel inoxidabil, echipate cu agitator elice sau
turbin, serpentin pentru rcire, conduct pentru aerare, dispozitive
sparge-val, teac termocuplu, filtru individual de aer i rezervor cu
antispumant. Fundurile fermentatoarelor sunt sudate pentru a asigura un
grad sporit de securitate mpotriva infeciilor, iar tuurile au garnitur
metalic pe toat suprafaa flanelor de legtur.
Parametrii principali ai procesului de fermentaie sunt prezentai grupat n tabelul 7.
Tabelul 7. Parametri procesului de fermentaie biochimic a
penicilinei
Etapa de
fermentaie
Inoculator
Intermediar
Regim

tc
26
1
26
1
26
1

Agitarea,
rot/min

Debit aer,
Durata
Presiunea,
l/l mediu
procesului,
ata
min
h

270

1,0

1,2-1,3

30 - 40

170

1 -1,2

1,2-1,3

20 - 40

120

0,6-1

1,2-1,3

90 - 120

23

Controlul procesului de fermentaie se realizeaz prin determinarea

sterilitii mediului, a gradului de dezvoltare morfologic a ciupercii, a pHului mediului, a activitii lichidului de cultur i a consumului de zahr.
Probele se iau la interval de 4 - 6 ore, iar procesul se consider terminat
atunci cnd coninutul de zahr al biomasei ajunge la 0,2 - 0,6%, iar
concentraia soluiei rmne aproape constant ntre dou determinri.
Concentraia penicilinelor n soluia nativ la terminarea procesului
de fermentaie este cuprins ntre 1 i 1,8%. Valoarea exact depinde de
potena suei folosite i condiiile de realizare a procesului de fermentaie.
Filtrarea soluiilor native
Lichidul de cultur obinut la fermentaie se separ de miceliu pe
filtru tambur cu vid. Soluia rezultat se trece printr-un rcitor tubular unde
se rcete pn la 3 5oC i se depoziteaz n rezervorul de ateptare, unde
este trimis la extracie. Rcirea este absolut necesar pentru a reduce
viteza reaciilor de degradare a penicilinelor. n unele tehnologii de
fabricaie soluia rcit se trateaz cu cetazol 10% pentru coagularea
albuminelor, se filtreaz i se trimite la extracie.
Separarea i purificarea penicilinelor
Datorit diluiilor foarte mari, separarea penicilinelor se poate face,
rentabil, numai prin extracii repetate cu solveni, conform schemei din
figura 8.
Pentru separarea penicilinei prin extracie lichid-lichid au fost
studiai muli solveni organici, determinndu-se valorile coeficienilor de
repartiie ntre ap i solvent, funcie de temperatur i pH (tabelele 8 i 9).
Dintre solvenii studiai pentru extracia penicilinelor cel mai
economic este acetatul de butil.

24

Figura 8. Schema de principiu a procesului de extracie a penicilinelor

Tabelul 8. Coeficienii de repartiie a penicilinei la 0C funcie de pH

Coef. repartiie
Solvent
pH =
pH = 0
4,0
Metiletilcetona
180
19
Dimetilciclohexan
160
15
Metilciclohexan
80
7
Ciclohexan
62
4
Furfuriacetat
44
4
Metilizobutil
33
3
ceton
Dimetilftalat
30
2,7
Acetat de amil
20
1,8
Dietiloxalat
20
1,8
Tabelul 9. Coeficienii de repartiie a penicilinei G la 0 i pH 2,5

Solvent
Acetat de izobutil
Acetat de butil
Acetat de amil
Cloroform
Eter etilic
Dicloretan
Diizopropil eter
Toluen
Tetraclorur de
carbon

Coef. repartiie
determinat
Prin
microbiologie
titrare
63
67
30
35
27
39
24
37
14
14
7,8
8,6
0,12
0,11
0,1
0,06
0,03

0,015

Echilibrul de faz la extracia penicilinelor i stabilirea condiiilor

optime de extracie a constituit obiectul multor cercetri.
Studiindu-se procesul de extracie a penicilinelor cu acetat de butil,
s-a observat c:
25

a) n solvent organic trec numai moleculele de penicilin acid

nedisociate;
b) ntre moleculele de penicilin nu au loc asociaii n condiiile de
extracie;
c) n solvent organic penicilinele nu disociaz n ioni.

26