UNIVERSITATEA OVIDIUS CONSTANTA FACULTATEA DE: FARMACIE SPECIALIZAREA:FARMACIE

ELECTROFOREZA CAPILARA DE INALTA PERFORMANTA

Coordonator Professor:

Absolventa: Stoichici Gabriela

CAPITOLUL 1 -NOTIUNI INTRODUCTIVE DESPRE ELECTROFOREZA-

Electroforeza este o metoda ce se bazeaza pe migrarea componentilor dintr-o proba,supusa unei diferente de potential,intr-o solutie(ex: molecule mari de proteine intr-un electrolit tampon) sau printr-un suport solid poros(hartie cromatografica,gel,etc),separarea explicandu-se prin vitezele de migrare diferite ale componentilor incarcati electric pozitiv sau negativ(purtatori de sarcini),care sunt atrasi de polii opusi ai campului electric,proportional cu natura,marimea si sarcina lor.

Aceasta metoda de analiza se aplica ionilor metalici macroionilor coloidali,cum sunt proteinele a caror masa moleculara este de ordinul 105 106 , dar si altor componente care pot fi transformati(prin derivatizare) in particule incarcate electric,prin formare de complecsi chelate etc.Trebuie precizat ca electroforeza aplicata ionilor relativ mici se numesteionoforeza, termenul de electroforeza pastrandu-se si utilizandu-se pentru

deplasarea in camp electric a particulelor coloidale,micelelor sau a unor macromolecule.

Sarcinile particulelor care se pot separa provin din procesele de ionizare ale compusilor metalici(deci a sarcinilor simple) care in solutie sunt electroliti tari,deci practic total disociati.De asemenea,complecsii cationici si cei anionici sunt purtatori de sarcini ,ca si ionii proveniti din electrolitii slabi,cum sunt acizii carboxilici,bazele organice si moleculele organice amfotere,cazuri in care ionizarea este un proces mai complicat.

Spre ex: aminoacizii pot exista in functie de pH-ul mediului ca si cationic,anioni sau zwitterioni,acestia din urma fiind amfiioni,care au o sarcina pozitiva si una negativa(amfiionii se gasesc la punctulizoionic sauizoelectric,stare definita de Michaelis,stare in care acest tip de ioni nu migreaza,deoarece migrarea electroforetica este nula.

In cazul mediilor chimice mai simple,pH-ul la punctual izoionic este egal cu pH-ul la punctual izoelectric,asa cum este in cazul solutiilor continand amfiioni,numiti si switterioni.In cazu mediilor complexe,cum sunt cele care contin proteine,de care sunt legate grupari carboxilice,in afara de efectul amfiionilor interni au loc si interactii intre grupele carboxilice si unii

cationici minerali prezenti,cum sunt ionii Na+ ,K+ ,Ca2+ etc.In astfel de cazuri,punctul izoionic nu mai corespunde cu pH-ul la care migrararea electroforetica este egala cu zero.De aceea a fost necesara introducerea conceptuui de punct izoelectric care este egal cu pH-ul la care,indifferent de ionii prezenti,migrararea eletroforetica este egala cu zero.Intre cele doua valori ale pH-ului exista o diferenta ce depinde de natura solutiei si de concentratia sa in electroliti,deci de conditiile mediului chimic. Spre ex:, in cazul albuminei serice punctual izoionic in apa pura este la pH=5,37, iar punctual izoelectric in apa pura este la pH=4,4. Deplasarea particulelor purtatoare de sarcini electrice,in camp electric,se face cu o viteza caracteristica fiecarei specii,in conditii experimentale date.Aceasta viteza se numestemobilitatea electroforeticasi se exprima in m/secunda,dar intr-un camp electric exprima in m2/volt/secunda(sau m2xV-1xS1 ).Se mai utilizeaza si un submultiplu exprimat in cm2/V/s.

Pentru determinari electroforetice se pot utiliza doua tipuri de metode si anume eletroforeza de frontiera si eletroforeza zonala sau pe suport.

1)Electroforeza de frontiera,mai putin importanta,dar utilizata inca pentru unele studii fundamentale privitoare la natura si puritatea proteinelor,consta in migrarea proteinelor intr-o solutie tampon de electroliti,utilizand un aparat simplu format dintr-o celula in forma de U, cu sectiunea patrata,construita din sticla transparenta ,astfel incat sa se poata observa migrarea proteinelor cu un spectrometru sau cu un spectrofotometru,

Se introduce in celula cele trei proteine existente intr-o solutie apoasa de electroliti si apoi, cu multa atentie,se umplu bratele celulei in mod egal cu solutie de electrolit suport,astfel incat sa nu se amestece fazele(a), dupa care se inchid cele doua brate perfect etans,observandu-se cele doua frontiere foarte nete intre solutia de proteine si solutiile de electroliti din cele doua brate(in fapt,frontierele sunt cele doua suprafete-intefete de separare a fazelor)

Apoi se leaga cei doi electrozi ai celulei la o sursa de current continuu(generator sau redresor)si se aplica o diferenta de potential de 100-150 volti.

Se constata ca are loc o migrare a proteinelor spre polul pozitiv,dar cu viteze diferite,determinate de natura lor(marime,forma,sarcina etc).Se observa ca proteinele A si C care au mobilitati net diferite(extreme) se gasesc in stare aproape pura,fiind separate de zone intermediare,desigur ca in fiecare zona se stabileste un gradient de concentratie.Asa cum s-a spus,trebuie sa se lucreze extreme de atent,deoarece frontierele greu de localizat tind sa se extinda sub actiunea difuziei si a convectiei.Daca se asigura stabilitatea termica a continutului celulei si a intregului aparat se pot limita aceste fenomene.Evident ca separarile prin eletroforeza de frontiera au o durata mai mare,separarile fiind cu atat mai fine si deci mai fragile,cu cat mobilitatile particulelor au valori mai apropiate.Totusi masuratorile facute prin aceasta tehnica sunt foarte precise.

2)Electroforeza zonala In aceasta metoda migrarea componentilor de separate este stabilizata de faptul ca lichidul in care se produce,se gaseste intr-un suport sau mediu poros cum sunt acetatul de celuloza sub forma de folii,hartia de filtru

special preparata pentru electroforeza sau un gel(ex. De agaroza,agar etc).Pe astfel de suporturi se pot localiza mai usor diferitele zone de migrare sau zone de concentratie,fiecare zona continand un anumit component de analizat.Cu ajutorul acestei tehnici se pot obtine separari foarte bune,din cantitati foarte mici de probe,daca se lucreaza atent si cu substante pure(apa,eletroliti etc).De remarcat ca hartia se utilizeaza mai putin desi separarile pe acetat de celuloza,care are o structura mai omogena,sunt mai rapide si de buna calitate.

3)Factorii care influenteaza electroforeza a) Natura moleculelor separate In primul rand influenteaza marimea moleculelor,stiut fiind ca,la sarcini egale migreaza mai repede moleculele mai mici,insa ionii cu diametre mici sunt de regula solvatati,iar deplasarea ansamblului molecula-solvent depinde se de celelalte substante dizolvate in solutie.Asa se explica faptul ca unii metalici mici,solvatati,au practic o mobilitate de acelasi ordin de marime cu proteinele incarcate electric.

Influenteaza de asemenea mobilitatea,natura si sarcina speciilor implicate,mediul chimic in care se gasesc si care prin pH-ul lui influenteaza gradul de ionizare al analitilor,forta ionica etc.La aceasta se mai

adauga posibilitatea formarii unor complecsi de asociatie ionica.

Spre ex:,prezenta in solutie a ionului clorura poate conduce la formarea HgCl2 neionizata,dar si a FeCl2+ ,FeCl2+ ,FeCl3 si FeCl4- ,deci complecsi cationici si anionici,sau moleculele neuter de FeCl3 care insa pot hidroliza.

b)Aparatura,respectiv suportul,poate influenta migrarea,deoarece acesta are o putere adsorbanta,ceea ce poate incetini migrarea si poate largi zonele,ceea ce se traduce prin aparitia cozilor(trenelor) pe electroforegrama.Puterea adsorbata a suportului se poate datora prezentei la suprafata lui a unor grupari functionale capabile sa formeze legaturi(ionice, de hydrogen,van der Waals) cu moleculele solventului si ale substantelor de separate.De altfel se stie ca suprafetele solide dobandesc o sarcina negativa,fata de care dispun(orienteaza) sarcinile pozitive ale solventului si ale particulelor incarcate pozitiv,astfel ca acestea pot fi retinute,sau cel putin intarziate.Astfel de efecte au loc mai ales pe hartie ca suport si intr-o masura mult mai mica pe acetat de celuloza.

c)Curentul electric Deplasarea eletroforetica a unei specii care se separa este proportional cu mobilitatea,cu campul electric si cu timpul de trecere a campului electric.

d)Influenta pH-ului

In cazul acizilor si a bazelor tari si in cazul sarurilor,deci electrolitilor tari,pH-ul nu influenteaza migrarea lor. In schimb,influenta pH-ului este mai mare in cazul compusilor organici,cum sunt acizii carboxilici si bazele animate si chiar a substantelor amfotere.In acest ultim caz,migrarea este posibila numai daca pH-ul solutiei de electroliti are o valoare diferita de punctual(pHul)izoionic.

e)Natura solutiei

Natura solutiei este determinate de natura sarurilor,acizilor,bazelor si a altor substante existente in aceasta,toate aceste substante influentand mult mobilitatea.Compozitia chimica a solutiei influenteaza

mibilitatea speciilor de analiti care trebuie separate,chiar si in cazul in care pH-ul si forta ionica sunt aceleasi.

4)Imunoeletroforeza

Separarile electroforetice pot fi imbunatatite substantial prin asocierea eletroforezei cu diferite alte tehnici intre care cromatografia pe gel,pe hartie,pe strat subtire,rezultand tehnici noi cunoscute sub denumirea de cromatoelectroforeza Imunoeletroforeza este o astfel de metoda in care se imbina migrarea eletroforetica cu precipitarea antigen_anticorp in mediu de geloza.Aceasta tehnica este utilizata la fractionarea si identificarea proteinelor serice,in acest scop se utilizeaza un suport de masa plastic(polimer) acoperit cu geloza praparata cu ajutorul unui tampon potrivit.Suportul se uneste(se leaga) la cele doua compartimente anodic si catodic,utilizand punti de hartie cromatografica(eletroforetica)

In masa de geloza se scobesc doua godeuri(adancituri) pentru primirea sarurilor de analizat si un sant central in care se introduce serul unui animal imunizat cu antigene umane.In prima etapa se pun serurile de analizat in godeuri si anume intr-unul se introduce serul bolnav,iar in al doilea serul etalon si apoi se face separarea eletroforetica.Apoi,se pune serul

imunizat in santul central,lasandu-se in repaus 24 h ,timp in care se produce difuzia in geloza a proteinelor separate din serurile initiale si proteinele serului imunizat.La contactul anticorpilor din serul imunizat cu proteinele serice antigene,acestea din urma formeaza arcuri caracteristice de precipitare.

5)Electroforeza prin izofocalizare

Electroforeza prin izofocalizare,numita si electrofocalizare (EF),consta in migrarea substantelor cu puncte izoelectrice diferite intr-un mediu gelificat,care are intre cele doua extremitati ale sale un gradient continuu de pH.Cele mai mari valori ale pH-ului se gasesc in partea catodului,iar cele mai mici in partea anodului.Aceasta tehnica se aplica amfolitilor care migreaza in gel pana in momentul in care ating o zona cu pH corespunzator punctului lor izoelectric.Ca urmare,sarcina lor devine nula si ei se imobilizeaza prin focalizare(concentrare) intr-o banda ingusta.In astfel de cazuri fenomenele de difuzie sunt reduse.Gradientul de pH se poate obtine in doua moduri:

Cu un amestec de amfoliti(ex:acizi policarboxilici cu polyamine),sub actiunea unui camp electric ce se exercita intre doi electrozi,pozitionati la extremitatile suprafetei gelificate,deci in zonele de pH extreme(cu

pH mai mare la catod si mai mic la anod)care se ordoneaza in gel dupa migrarea lor in functie de punctul lor izoelectric. - Prin grefarea acestor amfoliti pe moleculele de acrilamida prin legatura de natura covalenta.

6)Electroforeza bidimensionala

Electroforeza prin izofocalizare,eficienta pentru separarea izoformelor proteinelor,se poate imbunatati cupland-o cu eletroforeza practicata prin migrare intr-o directie perpendicular cu prima(analogie cu alutia cromatografica bidimensionala pe strat subtire).A doua migrare se poate face in laurisulfat de sodiu (SDS, care este dodecilsulfat de sodiu), care este un detergent anionic,care poate rupe legaturile in care sunt implicate grupari amino protonate ale moleculelor.Acest detergent confera moleculelor o structura discoidala,aducand numeroase sarcini negative. O astfel de migrare pe un gel de poliacrilamida tratata ca mai sus permite o adevarata cernere si separare a moleculelor,in functie de marimea

lor,deoarece mibilitatea asociatilor proteina-SDS este invers proportional cu logaritmul masei lor.

CAPITOLUL 2 - ELECTROFOREZA CAPILARA-

ELECTROFOREZA CAPILARA Electroforeza capilara este o familie de tehnici relationate care utilizeaza capilarele inguste de bor (20200 m i.d.) pentru a separa cu inalta eficienta atat moleculele mari cat si cele mici. Aceste separari sunt facilitate de utilizarea unei tensiuni inalte care poate genera EOF si EPF in solutia tampon si intre speciile ionice respectiv in interiorul capilarului . Proprietatile separarii si electroferograma corespunzatoare au caracteristicile asemanatoare cu legatura dintre traditionala electroforeza cu gel din poliacrilamid (PAGE) si moderna cromatografie lichida de inalta performanta(HPLC). CE ofera un format nou pentru cromatografie lichid i electroforez pentru ca:

 folosete tuburi capilare n care se produce separarea electroforetica; utilizeaza intensitati foarte mari ale cmpului electric, de multe ori mai mari de 500 V/cm; foloseste tehnologia detectoarelor moderne, astfel nct electroferograma seamn adesea o cromatogram; are eficien aproape ca cea a cromatografiei n faz gazoas n coloan capilar sau chiar mai mare; necesit minute pentru cantitati destul de substantiale de prob; este uor de automatizat pentru analiza cantitativ precis i uurina de utilizare; consum cantiti limitate de reactivi; se aplic la o selecie mai larg de analiti comparativ cu alte tehnici analitice de separare. Configurarea instrumentalului de baza pentru CE este relativ simpla. Tot ce se cere este un capilar din siliciu topit cu o fereastra pentru vizionare optica, un generator reglabil pentru tensiunea de alimentare, doua ansambluri de electrozi, doua rezervoare de solutie tampon, si un detector UV. Capetele capilarului sunt introduse in rezervoarele cu solutia tampon si fereastra pentru vizionare optica este aliniata cu detectorul. Dupa umplerea capilarului cu solutia tampon proba se poate introduce prin scufundarea unui capat al capilarului in solutia proba si ridicarea capilarului scufundat cu un picior (unitate de masura a distantei 1 ft = 0.305 m) sau cam asa ceva mai sus de lateralele detectorului rezervorului cu solutie tampon. Aproape toate lucrrile facute inainte de 1988 n CE au fost efectuate pe

dispozitivele facute in casa n urma acestei configuraii de baz. Desi relativ uor de utilizat pentru experimentare, aceste sisteme timpurii au fost incomode pentru analize de rutin i prea imprecise pentru analiza cantitativ. O diagrama a unui instrument modern P/ACE 2000 Series este ilustrata in figura 1. Comparativ cu nceputul dezvoltarii acestor instrumente, cel prezentat ofer un control complet automatizat,pe calculator, al tuturor operaiunilor,presiune i injectare electrocinetica, un colector de fractiune i un autosampler (sampler=aparat pentru luarea probelor, analizor), metode de dezvoltare automatizate, control precis al temperaturii, precum i un sistem avansat de disipare a cldurii. Automatizarea este critic pentru CE, deoarece operaiunile repetabile sunt necesare pentru o analiz cantitativ precis.

Configuraia de baz a sistemului de electroforeza capilara P/ACE.

TERMINOLOGIA FOLOSITA PENTRU ELECTROFOREZA

Exist cteva diferene semnificative ntre nomenclatura cromatografiei i electroforeza capilar. De exemplu, un termen fundamental n cromatografie este timpul de retenie. n electroforez, n conditii ideale, nimic nu este pstrat, astfel nct termenul analog devine timpul migraiei. Timpul de migrare (tm) este timpul de care are nevoie o substanta dizolvata pentru a trece de la nceputul capilarului la fereastra detectorului. Ali termeni fundamentali sunt definiti mai jos. Acestia includ mobilitatea electroforetica,ep (cm2/Vs), viteza electroforetica vep (cm/s) , intensitatea cmpului electric, E (V/cm).

1)

Mai multe caracteristici importante pot fi vzute din aceast ecuaie: 1) vitezele sunt termeni masurati. Acestea sunt calculate prin impartirea timpului de migrare la lungimea capilarelor pana la detector, Ld. 2) Mobilitile sunt determinate prin mprirea vitezei la intensitatea campului. Mobilitatea este independent de tensiune i lungimea capilarelor dar este foarte dependent de tipul pH-ului precum i de temperatura solutiei tampon.

3) Dou lungimi ale capilarului sunt importante: lungimea pana la detector, , si lungimea total, . n timp ce separarea msurabila are loc n segmentul capilar, , intensitatea cmpului este calculat prin mprirea tensiunii la lungimea ntregului capilar . Diferenta de lungime Lt - Ld, este necesara pentru realizarea conexiunii la rezervorul tampon. Pentru sistemul P/ACE, aceast lungime este de 7cm. Prin inversarea configuraiei sistemului, aceast lungime de 7cm de capilar poate fi utilizata pentru efectuarea separrilor foarte rapide. Ecuaia 1 este folositoare doar pentru determinarea mobilitatii aparente. Pentru a calcula mobilitatea real, fenomenul de curgere electroosmotica trebuie s s fie contabilizat. Pentru a efectua electroforeze reproductibile , fluxul electroosmotic trebuie s fie atent controlat.

ELECTROOSMOZA Unul din procesele fundamentale care conduce CE este electroosmoza. Acest fenomen este o consecinta a

sarcinei de pe suprafata peretelui capilarului. Capilarele din siliciu topit (cuart) care sunt de obicei folosite pentru separari au grupuri silanol ionizabile in contact cu solutia tompon continuta de capilar. Acest pI=1.5 este pentru siliciul topit. Gradul de ionizare este controlat in principal de pH-ul solutiei tampon. Fluxul electroosmotic se defineste astfel:

(2)

unde este constanta dielectrica, este vascozitatea solutiei tampon si este potentialul zeta masurat la planul de forfecare aproape de interfata lichid-solid. Peretele incarcat negativ atrage ionii incarcati pozitiv aflati in solutia tampon creand un dublu strat electric. Atunci cnd este aplicat o tensiune capilarului, cationii din poriunea difuzata a stratului dublu migreaza n direcia catodului si transport apa cu ei. Rezultatul este un flux net al soluiei tampon n direcia electrodului negativ. Acest flux electroosmotic poate fi destul de robust, cu o viteza liniar n jur de 2 mm/s la un pH de 9 n 20 mm borat. Pentru un capilar de 50 m, aceasta se traduce ntr-un volum al fluxului de aproximativ 4 NL/s. La pH=3 EOF este mult mai mic, de aproximativ 0,5 NL/s. Potenialul zeta este legat de inversul sarcinii pe unitatea de suprafa, numrul electronilor de valen, si de

rdcina ptrat a concentratiei electrolitului. Deoarece aceasta este o relaie invers, creterea concentraiei electrolitului scade EOF. Aa cum vom vedea mai trziu, fluxul electroosmotic trebuie s fie controlat sau chiar suprimat pentru a rula anumite moduri de CE. Pe de alt parte, EOF face posibila analiza simultan de cationi, anionii, i specii neutre ntro analiz unic. La pH neutru spre alcalin, EOF este suficient de puternic , mai puternic dect migraia electroforetic, astfel nct toate speciile sunt atrase spre electrodul negativ. Ordinea migraiei este: cationii,speciile neutre, i anionii. Efectul pH-ului asupra EOF este ilustrat n figura 2. Imaginai-v c un ion amfoter cum ar fi un peptid este separat n fiecare din cele dou situatii descrise n figur. La pH ridicat, EOF este mare i peptida este incarcata negativ. n ciuda migraiei electroforetice a peptidei spre electrodul pozitiv (anod), EOF este copleitor, i peptida migreaz spre electrodul negativ (catod). La pH sczut, peptida este ncrcat pozitiv i EOF este foarte mic. Astfel, migraia electroforetic a peptidei i EOF se indreapta spre electrodul negativ. n capilarele de siliciu topit netratate majoritatea substanelor dizolvate migreaz spre electrodul negativ indiferent de sarcina atunci cnd pH-ul solutiei tampon este mai mare de 7,0. La solutiile tampon cu pH acid cei mai multi ioni amfoteri i cationii vor migra, de asemenea, spre electrodul negativ.

efectul pH-ului asupra fluxului electroosmotic

Pentru a asigura c un sistem este controlat n mod corespunztor, este adesea necesar s se msoare EOF. Acest lucru este realizat prin injectarea unei substante dizolvate neutre i msurarea timpului necesar pentru a ajunge la detector. Substantele dizolvate, cum ar fi metanol, aceton i oxid de mesityl sunt frecvent utilizate. n cromatografia capilar electrocinetica micelara (MECC) ,tehnica despre care urmeaz s discutam mai trziu, o cerin ar fi ca marcatorii solutiei dizolvate nepartitionate in micele se impun de asemenea.

Pentru a efectua tehnici, cum ar fi focalizarea izoelectrica (IEF) sau izotacoforeza(PTI), EOF trebuie s fie suprimat. Acest lucru este posibil dac este folosit un capilar fara sarcina de exemplu teflonul sau alt capilar corespunzator filmat . Aditivi ,cum ar fi metilceluloz ,sunt, de asemenea, eficienti n suprimarea EOF. Suprimarea EOF va fi discutata mai trziu. ( teflon este o marc de E.I. Du Pont de Nemours & Co)

MODURI ALE ELECTROFOREZEI CAPILARE

Electroforeza capilar cuprinde o familie de tehnici care au caracteristici diferite de operare si separare. Tehnicile sunt: zona de electroforez capilar focalizare izoelectrica electroforez capilar cu gel izotacoforeza cromatografie capilar electrocinetica micelara Fiecare dintre aceste moduri de CE vor fi analizate n urmtoarele seciuni. Zona de electroforeza capilara Zona de electroforez capilar (CZE), cunoscuta i ca soluie libera de electroforeza capilar, este cea mai

simpl form de CE. Mecanismul de separare se bazeaz pe diferenele n raportul sarcina-mas. Sunt fundamentale pentru CZE omogenitatea soluiei tampon i intensitatea cmpului constant pe tot parcursul lungimii capilarului. Dup administrarea i aplicarea de tensiune, componentele unui amestec de probe individuale, n zone discrete aa cum se arat n figura 5., pot fi aproximate. Parametrul fundamental, mobilitatea electroforetic poate fi aproximat cu teoria de la Debeye-Huckel-Henry

Zona electroforezei capilare

Sarcina neta este de obicei dependenta de pH. De exemplu, cu pH-ul din gama de 4-10, sarcina neta a sodiului este constant cum este si mobilitatea sa. Alte specii, cum ar fi acetat sau glutamat sunt incrcate negativ cu pH-ul din gama de mai sus au mobiliti negative (migreaz spre electrodul pozitiv). La pH alcalin, migraia lor neta va fi n continuare spre electrodul

negativ din cauza EOF. Ionii amfoteri cum ar fi aminoacizii, proteinele si peptidele care prezint inversarea sarcinii lor,a pI-ului, de asemenea, schimbri n direcia de mobilitate electroforetic. Separrile de molecule mari i mici se poate realiza prin CZE. Chiar i moleculele mici, n cazul n care diferenele raportului sarcina-mas poate sa nu fie mare, pot fi nc separabile. Capilarele. Capilarele cu un diametru intern de 25-75m sunt cele folosite de obicei. Siliciul topit(cuart) este materialul ales datorita transparentei UV, durabilitatii, (cand este imbracat cu poliamida), si a potentialului zeta. Functionalizate si umplute cu gel capilarele devin disponibile si pot fi acoperite in alte sectiuni. Un nou capilar trebuie sa fie conditionat nainte de a putea fi folosit. Se trateaza capilarul timp de 10 minute cu 0,1 M de hidroxid de sodiu, 5 min cu ap, i 10 min cu solutia tampon. Aceast procedur pentru condiionat este importanta pentru a se asigura c suprafaa capilarului este completa i uniform ncrcata. Pentru unele metode este necesar a regenera aceast suprafa , astfel ca intre timp se clateste cu 0,1 M de hidroxid de sodiu i, n cazuri extreme, 1 M de hidroxid de sodiu. Procedura de regenerare este frecvent necesar n cazul n care timpul de migraie se schimba frecvent. Acest lucru este cel mai des intalnit atunci cnd se utilizeaz solutii tampon cu pH-ul intre 2-6. Regenerarea

este rareori necesara, atunci cnd se lucreaz cu pH 9, cu excepia procedurii de pornire zilnica, sau a cazului n care proba sau componentele matricei ader la peretii capilarelor. Nu toate ncercrile de a stoca o capilar din silice topit sunt de succes, de ex cu cat sunt mai mici capilarele,cu atat sunt mai predispuse la colmatari. n timp ce acest lucru nu este foarte grav pentru tevile din dioxid de siliciu goale, deteriorarea capilarelor poate fi costisitoare atunci cnd se utilizeaz capilare modificate chimic. Urmtoarea procedur va maximiza ansele de a stoca cu succes un capilar. 1) Se cltete capilarul cu 0,1 M de NaOH pentru cteva minute. (Nu face acest lucru cu capilare-chimic modificate.) 2) Se spal timp de 5 minute cu ap distilat. 3) Se pune un flacon gol, descpcite la captul de ieire i se sufla N2 prin capilare timp de 5 minute. 4) Scoatei cartuul capilarului de la instrument.

Efectul pH-ului. La un pH ridicat n cazul n care EOF este substanial, ordinea de migraiei va fi cationi, specii neutre i anioni. Nici una dintre moleculele neutre nu va fi separata, deoarece sarcina net este zero. Anionii vor migra n continuare spre catod, deoarece EOF este mai mare dect migratia electroforetic.

La pH mai mic n cazul n care EOF este redus foarte mult, att cationi i anioni pot fi nc msurati, dei nu ntr-un termen unic. Pentru a msura anioni, anodul trebuie s fie dincolo de fereastra detectorului. De asemenea, pentru a msura cationi, catodul trebuie s se afle dincolo de fereastra detectorului. Configurarea electrica optima este realizata pur i simplu prin inversarea polaritii a electrozilor. Impactul pH-ului asupra analitului poate fi, de asemenea, substantial, mai ales pentru compui compleci, cum ar fi ionii amfoteri (peptidele). Sarcina acestor compui este dependent de pH, precum i selectivitatea de separare este afectat n mod substanial de modificarea pH-ului. Ca o regul, selectai un pH care este cu cel puin dou uniti mai mare sau mai mic fata de p a analitului pentru a asigura ionizarea complet. La un pH extrem de alcalin, EOF poate fi att de rapid incat pot sa apara separari incomplete. Anumite proteine pot fi separate la pH acid. In aceste condiii, peretele capilar este neacoperit. Proteinele n aceste condiii vor fi ncrcate pozitiv i nu vor interaciona electrostatic cu peretele, dei interaciunile hidrofobe pot aprea n continuare. Limitarea acestei tehnici este precipitarea proteinelor. La pI din proteine, simetria benzii tinde s fie slaba. Solutiile tampon. O mare varietate de solutii tampon (tabelul 1) pot fi folosite n CZE. O solutie

tampon este cea mai eficient daca pH-ul are o unitate sau doua diferenta fata de pI-ul sau. De exemplu, pH-ul fosfatului este utilizat la aproximativ pH 2,5 i pH 7, i boratul la pH-ul 9. Concentratia solutiei tampon tipice este 50-100 mM. Solutiile tampon cu ioni amfoteri cum ar fi bicina(2(bi(2-hidroxietil)amino)acetic acid), tricina(N-(2-hidroxi1,1-bi(hidroximetil)etil)glicina), CAPS(N-ciclohexil-3aminopropanesulfonic acid), MES(2-(Nmorpholino)etanosulfonic acid), i Tris((HOCH2)3CNH2.) sunt de asemenea, frecvente, n special pentru separarea proteinelor si peptidelor. Avantajul solutiilor tampon cu ioni amfoteri este conductivitatea sczuta atunci cnd solutia tampon este utilizata n jurul pI-ului. Avantajul aceasta este fluxul mic curent i astfel reducerea caldurii Joule. n anumite preparate tampon, n special cele destinate separarii de proteine, saruri cum ar fi clorura, fosfatul i sulfatul se adaug la mediul tampon. Aceste sruri adaugate afecteaza structura proteinei, care, la rndul su, poate avea un impact asupra separarii. Concentraia de sare are ,de asemenea, efecte asupra EOF datorate n parte unei perturbari a sarcinii dublului strat al peretilor capilarelor. Limitarea major a cantitii de sare care poate fi adugata la un preparat tampon este cldura prin efectul Joule.

Diversi aditivi tampon (tabelul 2) pot fi utilizati pentru a schimba selectivitatea de separare. Aditivii tampon pot modifica, printre altele,mobilitatea electroforetic. Cu alte cuvinte, doi compui care au mobiliti identice ntr-un sistem tampon simplu pot fi difereniati cu un aditiv. Ali aditivi, cum ar fi agenii tensioactivi sau ciclodextrinele, formeaz un mediu eterogen care definete noi clase de CE, despre care vom discuta mai trziu. Toate solutiile tampon trebuie s fie filtrate prin filtre de 0.45- m nainte de utilizare.

Tabelul 2. Aditivii tampon pentru CZE ADITIVI Saruri anorganice proteinelor FUNCTIE Schimbari in conformatia

Solventi organici electroosmotic

Dizolvant, modifica fluxul

Uree Dizolva proteinele si denatureaza oligonucleotidele Acizi sulfonici Agenti de asociere ionica, agenti de interactiune hidrofobica Acizi tensioactivi capilar Derivati de celuloza mediu de sortare Amine Inverseaza sarcina peretelui Reduce EOF, asigura un acopera grupurile silanol libere

Legatura cu peretele capilar. O problem cu CZE este lipirea electrostatic a substantelor cationice pe pereii tubulaturii. Acest efect este observat la proteine atunci cnd opereaz ntr-o solutie tampon care are un pH mai mic decat al analitului. Aceast problem poate fi depit functionand cu cel puin dou uniti ale pH-ului mai mult decat pH -ul proteinei, dar n unele cazuri, pH-ul mai mare nu poate fi optim pentru separare. n ciuda acestor probleme, proteinele, n special cele de dimensiuni similare, pot fi cel mai bine separate n soluie libera. Utilizarea

capilarelor tratate este unul din modurile, care pot servi la reducerea lipirii de perete. O alt procedur recent dezvoltata implic utilizarea unei concentratii mari de fosfat a solutiei tampon pentru a ecrana sarcina pe interiorul peretelui capilarului i capilare scurte (20 cm), cu teava mica(25m) manevrate in campuri electrice de intensitate mare care permit separarea rapida , astfel minimizand timpul de edere a proteinelor n capilar. Aceast abordare are nevoie de un excelent sistem de control al temperaturii capilarului, n vederea eliminarii cldurii generat de tensiuni i cureni mari. Acoperirea capilarului. Reducerea sau eliminarea EOF poate fi utila pentru a permite separrile electroforetice directe care trebuie efectuate. Mai convingtoare este capacitatea de a elimina adsorbia substantei dizolvate. O varietate a invelisurilor este posibil inclusiv unele faze utilizate pentru o cromatografie n faz gazoas n coloan capilar. Utilizarea acoperiri hidrofile poate fi utila n suprimarea adsorbiei compusilor hidrofobi. De asemenea poate fi suprimata si lipirea electrostatica. Acoperirea hidofobica, coroborata cu surfactanti neionici, ca aditivii tampon, pare promitoare, de asemenea, multe companii au nceput s introduc capilare cu faza combinata. Aceste capilare ar trebui s extind n continuare gama de compui pentru care separarea prin CZE este aplicabila.

Focalizare izoelectrica Premisa fundamental a focalizarii izoelectrice (IEF) este c o molecul va migra att timp ct este incarcata cu sarcina electrica. Cand devine neutra, se va opri din migratia n cmpul electric. IEF este condusa ntrun gradient al pH-ului n cazul n care pH-ul este mic la anod i ridicat la catod (Figura 7). Gradientul pH-ului este generat cu o serie de substane chimice cunoscute sub numele de transportatori amfoliti de amfoteri. Atunci cnd este aplicat o tensiune, amestecul amfolit se separ n capilare. Amfolitii care sunt ncrcai pozitiv, vor migra spre catod n timp ce cei incarcati negativ migreaz spre anod.PH-ul, apoi va scdea la sectiunea anodica i va crete la sectiunea catodic. n cele din urm, migraia amfolitului va nceta atunci cnd fiecare amfolit ajunge la punctul su izoelectric i nu mai este incarcat electric. Iniial, o substanta dizolvata cu o sarcina negativa va migra spre anod, n cazul n care ntmpin o scdere a pH-ului solutiei tampon. n cele din urm, substanta dizolvata intalneste o zona cu un pH unde sarcina sa electrica devine zero , punctul izoelectric (pI), si migratia se opreste. Cu cat este mai mare numarul de amfoliti din solutie cu atat mai lina este panta pH-ului.

Focalizarea izoelectrica

PH-ul solutiei tampon trebuie s fie mai mic dect pI-ul celor mai multi amfoliti acizi pentru a preveni migraia n interiorul analitului. De asemenea, catolitul trebuie s aib un pH mai mare dect amfolitul cel mai de baz. Este evident c EOF i alte fore convective trebuie s fie suprimate pentru ca IEF s fie eficient. Peretii capilarelor pot fi acoperiti cu metilceluloza sau poliacrilamida pentru a suprima EOF. Acoperirea tinde s suprime absorbtia proteinelor, de asemenea. IEF este n general utilizata pentru separari de nalt rezoluie a proteinelor i polipeptidelor, dar ar putea fi folosita pentru orice substan amfoterica, cu condiia ca o serie de amfoliti sa faca parte din gama pI-ului utilizat.

Electroforez capilar cu gel Electroforeza tradiional cu gel este efectuata ntr-un mediu anticonvectiv cum ar fi poliacrilamida sau agaroza. Compoziia mediului poate, de asemenea,servi ca o sit molecular pentru a efectua separrile dupa dimensiuni (figura 9). n plus, gelul suprima EOF. Din cauza unei lungi istorii a acestei tehnici, adaptarea la CE este foarte de dorit. Acest lucru este deosebit de valoros pentru separrile ADN deoarece nici o alta tehnica pn n prezent nu a furnizat astfel de separri dramatice. Coloanele capilare cu gel , au nceput s fie introduse pe piata din numeroase surse pentru comercializare. Capilarele din poliacrilamida umplute cu gel sunt de obicei folosite, dei noi formule polimer cu o mai mare stabilitate in cmpul electric aplicat vor fi introduse n scurt timp. Gelurile de agaroz nu sunt n msur s reziste incalzirii produse de nalt tensiune utilizata n electroforeza capilar cu gel(CGE).

Electroforeza capilara cu gel. Exist dou clase fundamentale de geluri care pot fi utilizate n CGE. Acestea sunt ilustrate n figura 10. Gelurile fizice obin structura lor poroasa datorita legturii de polimeri i sunt destul de brute fata de schimbrile din mediului. Hidroxipropilmetilceluloza si polimerii similari pot fi folositi pentru a forma geluri fizice. Gelurile chimice utilizeaza legaturi covalente pentru a forma structura poroasa. Aceste geluri sunt mai puin brute, i este dificil de a schimba solutiile tampon odata ce se formeaz geluri. n CZE i alte forme de "deschideri-tubulare" ale CE, capilarul este umplut cu un tampon de presurizare. Pentru capilarele cu umplute cu gel, aceasta tehnica ar duce la extrudarea gelului.Ureea i de ali ageni, cum ar fi un tampon Tris-borat-EDTA, se adaug nainte de polimerizare. Poliacrilamida reticular este, de obicei selectata ca agent formator de gel.

Geluri fizice si chimice.

CGE se efectueaza de obicei in capilare de 50 100m cu lungime de la 10cm la 1 m. O mai bun rezoluie este gsita pentru capilarele mai lungi, dar timpul de desfasurare este uneori excesiv. Compoziia gelului din capilar este mai bine manipulata pentru a optimiza rezoluia. De exemplu , creterea concentraiei de gel mbuntete rezoluia dar scade intervalul masei moleculare accesibile. Tensiunea este oarecum limita, deoarece intensitatea cmpului peste 500 V/cm poate provoca nclzirea capilarelor i, n final, goluri. Proteine.- Proteinele denaturate cu 2mercaptoetanol functioneaza, de obicei, cu un sistem de prindere SDS-PAGE. n aceste condiii, toate proteinele au aceleai raport sarcina-mas, deoarece sarcina initiala este eclipsata de legatura SDS.ntr-adevr, o cantitate constanta de SDS, 1,4 g, este adsorbit pe fiecare gram de proteine. SDS este anionic; prin urmare, toate proteinele devin ncrcate negativ i migreaz spre anod. Proteinele se desfasoara (cu condiia ca legturile disulfit sa fie rupte) i devin ca un stalp de referinta in structura permitand cernerea uniforma pentru separarea molecular dupa dimensiune. Un tampon tipic este de 90 mM Tris-fosfat,pH-ul 8.6, 0.1 SDS%. O diagrama de calibrare a mobilitatii in functie de greutatea molecular permit misiuni in functie de dimensiune ale diferitelor fragmente. Injectarile electrocinetice sunt utilizate n CGE, deoarece injectarea sub presiuni-mediate ar duce la extrudarea gelului. Capilarele scurte de 10-20 cm sunt folosite iar intensitatea cmpului se apropie de 400 V/cm.

n aceste condiii, exist o corelaie liniar ntre mobilitate i greutate molecular. Jurnalul de mobilitate functie de procentul compoziiei monomer (T%) al gelului este, de asemenea liniar. Proteinele sunt de obicei denaturate n SDS 1% i 2% -mercaptoetanol pentru 30 min la 90 C. Ca i n electroforez convenionala placa-gel, migraia scade pe msur ce crete dimensiunea porilor (mai mic % T). Timpul de separare poate fi, de asemenea, redus prin utilizarea unei tensiuni mai mari, cu condiia ca disiparea cldurii sa fie optima. Capilarele scurte pot fi folosite i la aceeasi intensitate a campului electric pentru a accelera n continuare separarea.

ADN-ul. Separarea oligonucleotidelor i a produselor secven de ADN a fost realizat n geluri de poliacrilamid. Pentru restricionarea fragmentelor i a oligonucleotidelor mai mari, geluri cu foarte putine valente (crosslinker, cross-link = legatura ce leaga un polimer de altul) sau deloc par a fi cele mai eficiente datorit dimensiunii mai mari a porilor de gel. Separarea deoxioligonucleotidelor, cum ar fi poli( este uor de realizat ntr-un 8% T gel cu un tampon constnd in 100 mM Tris-borat, pH 8.3 cu 2 mM EDTA i 7 M uree, n 35 min cu unitatea de baza a rezolutiei. Determinarea puritii sintetice a oligonucleotidelor este o aplicaie important a CGE. Figura 11 prezinta separarea unui

homopolimer sintetic 50-mer timidin cu o intensificare de modulo 5. Secvenele de eec sunt bine separate, cu unitatea de baz ca rezolutie.

CGE a timidinei sintetice homopolimer cu modulo 5 amplificare. Solutia tampon,25mMTris, 25mMacid boric, 7M uree; gelul, poliacrilamida, 7.5%T, 3.3%C. Prin amabilitatea A.Paulus si J.Ohms, Beckman Instruments,Inc.

ADN-ul dublu catenar poate fi separat fizic cu geluri. Capilarele cu suprafata modificata sunt cele mai bine utilizate, deoarece fluxul de electroosmotic este complet suprimat. n aceste condiii, timpul de migrare al fragmentelor este direct legat de numrul de baze prezente. Figura 12 prezinta separarea unei restricii digestive Hae III de X174 ADN. Aceste separri sunt foarte eficiente, deoarece randamentele de vrf reprezinta 118 perechi de baz produce 2.000.000 placi teoretice pe metru. Utilizarea de bromur de etidiu ca un aditiv tampon mbunatateste separarea, permitand o buna rezoluie a vrfurilor care reprezint 261 i 271 de perechi de baze. Rezoluia acestui sistem este de 3 perechi de baze. Printre alte aplicaii utile pentru acest sistem sunt separrile al PCR-ADN amplificat, precum i lichidele de restrictie digestiva.

Separarea restrictiei digestive Hae III cu X174 DNA prin CGE cu un gel fizic..Solutia tampon, 89 mM Trisborat, 2 mM EDTA, pH 8.5, 0.5% hidroxipropilmetilceluloza, 10 M bromura de etidiu; capilarul, DB-17invelis, 100 m x50 cm (lungimea pana la detector); intensitatea campului, 175 V/cm; detectarea, 260 nm; concentratia probei, 10 g/mL.

Electroforez capilara cu gel este nc n faz incipient. n timp ce majoritatea laboratoarelor academic isi produc propriile capilare fie cu legatura covalenta a poliacrilamidei cu peretele capilarului sau prin invelirea capilarelor cu geluri, este de ateptat ca majoritatea utilizatorilor vor achiziiona de la furnizori capilarele comerciale. De asemenea, soluiile tampon optimizate pentru separarea ADN-ului n formatul unui gel fizic sunt, de asemenea, furnizate de ctre productori. Una dintre multe fore care dirijeaza dezvoltarea capilarelor umplute cu gel este secvenierea ADN-ului. Speranta este ca un instrument CE multiplex cu geluri va forma baza unui instrument la scar genomica

Izotacoforeza nainte de 1981, izotacoforeza (PTI) a fost folosit cel mai des folosita tehnica din electroforezele capilare, dei capilarele au fost destul de mari (250-500 m), fata de standardele de azi. Un instrument comercial, LKB Tachophor, a fost introdus la mijlocul anilor 1970. Ca IEF, ITP se bazeaz pe fluxul de electroosmotic zero, i pe un sistem tampon eterogen. Capilarul este umplut cu un electrolit de conducere, care are o

mobilitate mai mare dect oricare dintre componentele probei care urmeaz s fie determinata. Apoi proba este injectata. Un electrolit de ncheiere ocup rezervorul opus, i mobilitatea ionica a acelui electrolit este mai mic dect oricare dintre componentele eantionului. Separarea va avea loc n diferena dintre electroliii de conducere i cei de ncheiere in baza mobiliti individuale ale analitilor. Aa cum se arat n figura 13, limitele zonei stabile se formeaza ntre componentele individuale, care rezult din separari extrem de eficiente. Ambele specii, anionii i cationii ar putea fi determinati, dar nu n acelai timp.

Izotacoforeza anionica.

n instrumentele timpurii, detectarea se facea prin conductibilitate sau cu conductibilitate difereniala. Detectarea datorita conductibilitatii a dat un model scarapas dupa fiecare ion individual trecut de electrozi. Conductivitatea diferentiala ar putea restaura izotacoferograma la o serie de vrfuri convenionale. Detectarea direct UV , de asemenea, ofer un aspect familiar electroferogramei n prezena distanierelor. Un distantier este un o substanta dizolvata neabsorbanta cu o valoare a mobilitatii care se ncadreaz ntre mobiliti de dou vrfuri, care trebuie rezolvate. Dezavantajul ITP este c dac nu se folosesc distanierele, benzile adiacente sunt n contact intre ele. O a doua problem este c, n comparaie cu CZE, selecia i optimizarea solutiei tampon sunt mai complicate. De exemplu, pentru a determina cationii, electrolitul catodic de conducere ar putea conine un acid extrem de mobil (H +), n timp ce electrolitul anodic de ncheiere s-ar putea conina un acid slab, cum ar fi acidul propionic. Cele mai multe dintre aceste puncte sunt ilustrate n figura 14 pentru ITP unor anioni. Graficul de jos este urmarirea conductivitatii directe (reprezentat ca rezistenta) n timp ce graficul superior reprezint conductivitatea diferentiala.

ITP-ul unui amestec de anioni cu detectarea folosind conductivitatea Capilarul, 105 m de ex:fluorurat cu copolimer etilenpropilen;conducator, 10 mM acid hidrocloric titrat la pH6.0 cu histidina, 2 mM hidroxietilceluloza;terminal(de incheiere), 5 mM MES; curentul, 10 A. Cheie: R, semnal pe aparatu de masura al conductivitatii (rezistenta n cretere); L, clorur; 1, sulfat; 2, cloratul;3, cromat; 4, malonat; 5, adipat; 6, benzoat;7, impuritate; 8, acetat; 9, -bromopropionat; 10, naftalin-2-sulfonat; 11, glutamat;12, enantat; T, MES. Reprodus n parte din J. Chromatogr., 267, 67 (1983) (fig. 3).

Izotacoforeza are dou caracteristici, a cror combinaie duce la metodele electroforetice unice: toate benzile se misca cu aceeasi viteza i benzile sunt focalizate. De exemplu, benzile foarte mobile au conductivitate mare si, ca rezultat al acestui lucru, au o cdere de tensiune joasa de-a lungul benzii. Avnd n vedere c mobilitatea este produsul conductibilitatii i cderii de tensiune, i conductibilitatea i cderea de tensiune sunt invers proporionale, benzile de viteza individuale sunt auto-normalizatoare. Focalizarea este, de asemenea, o consecin a normalizarii vitezei. De exemplu, dac o banda difuzeaz ntr-o zona vecina, aceasta va accelera sau va frana datorita campului electric intalnit i va reveni in locul initial. Lucrand cu instrumentele moderne a fost un succes, att cu capilare tratate cat i netratate din siliciu topit. EOF poate fi suprimata cu 0,25% hidroxipropilmetilceluloz. Un electrolit conducator bun este de 5 mM acid fosforic. Valin (100 mm, ajustata la pH apropiat cu amina primara) este un electrolit util de ncheiere. La nceputul unei separri, curentul poate fi destul de mare, deoarece electrolitul extrem de mobil umple complet capilarele. Pe masura ce separarea progreseaza, curentul ntotdeauna scade la cel mai puin mobil analit de incheiere care intr n capilare. Au existat unele publicaii recente care folosesc ITP ca un pas de preconcentrare pentru CZE. Pentru c ITP este o tehnica de focalizare, utilizarea capilarelor cu

diametru mare nu provoac deteriorarea rezoluiei asa cum se intampla pentru CZE.

CROMATOGRAFIA CAPILARA ELECTROCINETICA MICELARA

Poate cel mai intrigant mod al CE pentru determinarea moleculelor mici este MECC. Utilizarea soluiilor tensioactive care formeaz micele poate da natere la separari care seamana cu faza inversa a LC , cu beneficiile CE. Spre deosebire de IEF sau ITP, MECC se bazeaza pe o EOF robust i controlabila. Micelele. Micelele sunt agregate amfifile ale moleculelor cunoscute sub numele de tensioactivi. Acestea sunt molecule cu lan lung (10-50 de uniti de carbon) i sunt caracterizate ca avnd o coada lunga hidrofoba i cap un grup hidrofil. Micelele normale sunt formate n soluie apoas cu cozi hidrofobe indreptate spre interior i cap hidrofilic indreptat spre exteriorul soluiei apoase. O schema este prezentata n Figura 15. Forma micelei este o consecin a efectului hidrofob, anume, acestea se

formeaza pentru a reduce energia libera a sistemului. Coada hidrofoba a tensioactivului nu poate fi dizolvata n soluie apoas. Pe langa concentratia tensioactivului cunoscuta si sub numele de concentraia critic a micelei (CMC), agregatul este pe deplin format.

Modificrile fizice, cum ar fi tensiunea superficial, vscozitatea, i capacitatea de a difuza lumina nsoesc formarea micelei. Micelele inverse, care formeaza solventi organici, nu au fost studiate n MECC.

Cromatografia capilara electrocinetica micelara

Exista patru mari clase de tensioactivi: anionici, cationici, amfoteri si nonionici, exemple care se regasesc in tabelul 4. Din acestea patru primele doua sunt cele mai folosite in MECC. Ambi compusi sintetic si natural care apar au fost folosite pentru MECC. Varietatile sintetice includ SDS anionic i bromura de cetiltrimetilamoniu cationica(CTAB). Compusii naturali, cum ar fi srurile biliare (taurocolat de sodiu, etc) sunt de asemenea utili. Tabelul 4. Tensioactivi, Clase si Proprietati Tensioactiv Agregarea SDS CTAB Brij-35 Sulfobetaina Tipul 8.1x 9.2x 1.0x 3.3x 40 55 CMC 62 170

anionic cationic nonionic amfoter

SDS=sulfat de sodiu dodecil; CTAB=bromura de cetiltrimetilamoniu; Brij-35=polioxietilena-23eter lauril; Sulfobetaina=N-dodecil-N, N-dimetilamoniu-3-propan-1 acid sulfonic.

SDS este cel mai utilizat de agent tensioactiv n MECC. Este disponibil n forme extrem de purificate i este ieftin.

Greutatea sa moleculara este de 288 i CMC este de 8 mM. Numrul de agregare (numrul de molecule/micelle) este 62. Micelele au capacitatea de a organiza analiii la nivel molecular bazandu-se pe interaciunile hidrofobe i electrostatice. Chiar i moleculele neutre se pot lega la micele, deoarece nucleul hidrofob are o mare putere de dizolvare. Solutiile tensioactive au fost folosite n spectroscopie i cromatografie pentru a profita de aceste proprietati unice micelare. De exemplu, fosforescenta la temperatura camerei este uor observabila n mediile micelare deoarece mediul micelar previne multe dintre mecanisme de clire normale de la operare. Cu mai multa insemnatate n ceea ce privete MECC, aceste aceleai soluii tensioactive pot servi drept modificatori ai fazei mobile cromatografice. Cromatografia micelara poate sa mimeze o faza invers a LC n care creterea concentraiei tensioactivului crete puterea de eluie a fazei mobile. Analitul se poate partiiona ntre micele si faza compacta, micele i faza staionar, sau n faza compacta i faz staionar. Astfel, "pseudo-faza" sau LC micelara are mai mult echilibru al complexului dect LC convenionala. Acest echilibru cu trei faze poate fi asemnat cu cromatografia ionilorpereche n multe cazuri. n anumite aspecte, mecanismul MECC, din cauzaca este doar un echilibru cu dou faze, este mai simplu decat cromatografia micelara. Factorul complicator n MECC este c mobilitatea electroforetic a analitului contribuie adesea la separarea intregului.

Selectarea modului de electroforeza capilara

Tabelul 6 poate fi utilizat pentru a ajuta la modul de selectare al celei mai avantajoase metode de electroforez ca punct de plecare n metodele de dezvoltare. Cota cea mai nalt n fiecare categorie din diagram este de natur s produc rezultate acceptabile n cel mai scurt interval de timp.

Tabelul 6.Selectarea modului de electroforeza capilara Ioni mici Molecule mici Peptide CZE MECC CZE ITP CZE MECC ITP IEF CGE ITP

Proteine CZE CGE IEF ITP

Oligonucleotide CGE MECC

ADN CGE

Abordri ale metodelor de dezvoltare ale CZE i MECC

nainte de a ncerca o noua separare, culegerea de informaii este foarte utila. Este compusul solubil n ap la concentraii de pn la1 mg/mL? Este solubil la toate pHurile lui? n cazul n care solubilitatea apoas este o problema, vor rezolva problema cantitile mici (pn la 25%) din metanol sau acetonitril-l? Se vor dizolva moleculele mici folosind 100 SDS mm? Pentru proteine, va fi de ajutor 7 M uree sau un agent de dispersie, cum ar fi etilen glicol? Este instabil analitul la anumite pH-uri ale lui? Este compusul labil termic? Care este lungimea de und maxim de absorbie UV? Ct de multe componente sunt ateptate n amestec? Care este concentraia preconizat a fiecrui component?

Dezvoltarea unei metode cu ajutorul CZE

Un numr mare de opiuni i instrumente pentru dezvoltarea metodelor sunt disponibile pentru CZE. In

acest exercitiu, procesul de separare a unei proteine noi va fi revizuit. Pentru condiiile de pornire, utilizai un capilar de 75 de cm incalzit la 25 C conectat la 20 kV cu detectorul stabilit la 214 nm. Se injecteaza prima transa de 1 mg/ml din soluie. Folosii un tampon de 100 mm la pH-ul adecvat. 1)acid stabil- se va utiliza un tampon cu pH-ul de mai mic pI; acid labil - selectai un pH de cel puin 1 unitate de mai mare decat pI. 2)problema solubilitatii se aduga un modificator cum ar fi ureea sau etilen glicol. 3) problema adsorbiei - utilizarea un aditiv, cum ar fi un acid sulfonic, de sare, sau trecerea la tratamentul capilarului. 4) eficien bun, proast separare - ajustarea pH-ului. 5) slaba eficien - creterea rezistentei ionice a solutiei tampon, se adaug o sare n care proteina este stabil. n majoritatea cazurilor, se va putea obine o bun separare ntr-un interval de timp relativ scurt. Unele probe pot fi destul de dificile i va trebui acordam o perioad considerabil de timp pentru selectarea cu atenie a solutiilor tampon i a aditivilor tampon.

Dezvoltarea unei metode cu ajutorul MECC

MECC este un mecanism de separare bun pentru moleculele mici. Greutate molecular maxima nu a fost nc stabilita. Proteinele nu sunt bine separate prin aceast tehnic. Condiiile bune de pornire sunt 100 mM SDS n pH 7, 50 mm fosfatoborat ca solutie tampon, dup care ajustrile concentraiei SDS, a pH-ului, i modificatori organici pot fi necesari. Unele linii directoare sunt: 1) timp mare al separarii, o buna rezoluie - creterea pH-ului, scderea SDS. 2) timp mare al separarii, o proast rezoluie - utilizarea modificatorilor organici. 3) timp de separare scurt rezolutie slaba cresterea SDS. 4) timp de separare scurt,rezolutie moderata scaderea a ph-ului, cretere a SDS. Utilizarea modificatorilor organici este deosebit de puternica n MECC. Acetonitril este solventul ales n primul rnd, deoarece are un impact redus asupra EOF. Alcooli pot fi de asemenea utili, dar timpul de separare poate deveni foarte lung. n condiiile corespunztoare, puterea optima i capacitatea de vrf depesc cu mult HPLC. Este nevoie de nu mai mult de cteva zile pentru a dezvolta cele mai multe separri.

Metode de dezvoltare automatizate Sistemele P/ACE 2050 i 2100 au capacitatea de a efectua separri multiple cu o varietate de soluii tampon. Aceast caracteristic ofer posibilitatea de dezvoltare automata, dezvoltarea metodelor cu procese nesupravegheate, deoarece noile solutii tampon pot fi folosite pentru fiecare proces n ambele rezervoare, anod i catod. n acest mod, parametrii cum ar fi pH-ul, concentraia solutiei tampon, tipul de aditiv, i concentraia tensioactivilor, printre ali factori, pot fi optimizati ntr-un mod logic i sistematic. Exista cateva indicatii care se vor dovedi utile pentru a asigura eficienta generaiei de aplicaii informatice: 1) Efectuai cteva separri preliminare pentru a obine in general o nelegere a problemei. 2) Setai timpul de functionare pentru timpul maxim de separare la care va puteti atepta. De exemplu, cu MECC, acest lucru ar corespunde cu cea mai mare concentraie a tensioactivului utilizat. 3) Unele solutii tampon, cum ar fi fosfatul, modifica permanent chimica peretelui; folositi aceste solutii la sfarsit. 4) Atunci cnd se face trecerea de la CZE la MECC, lasati suficient timp (cel puin 0,5 h) pentru capilar s se echilibreze cu soluia tensioactiva.

5) Programati clatiri cu 0,1 M de hidroxid de sodiu ntre fiecare dintre procese. 6) La stabilirea temperaturii optime, acordati timp suficient pentru a permite echilibrarea termica. 7) Modificati pe rand cate o singur variabil experimentala. CAPITOLUL 3

APLICATIILE ELECTROFOREZEI CAPILARE(EC) IN ANALIZELE FARMACEUTICE

In cea mai simpla forma a sa electroforeza este denumita electroforeza zonei capilare. Conditiile folosite in acest tip de analiza sunt relativ simple iar faza mobila utilizata consta intr-un tampon cu diferiti aditivi. Multe aplicatii se concentreaza pe separarea critica care este dificil de obtinut cu HPLC. In multe cazuri este greu de explicat in totalitate tipurile de efecte produse de aditivii din tampon. Separarea atenololului si a impuritatilor legate de acesta in special datorita sarcinilor electrice -blocant-ul atenolol este aratat in figura 14.6 cu principalele lui impuritati cunoscute. Aceste impuritati nu sunt usor separate de atenolol cu ajutorul HPLC datorita similaritatii structurilor lor.

Separarea are loc folosind capilare de 0.05mm x 50cm la 15kV cu un tampon de fosfat/borat. Figura 14.6 evidentiaza separarea, la un pH optim de 9.7 al atenololului(50g/ml) , de impuritatile sale tintuite in solutie la concentratia de 5g/ml. Pentru elutie se intampla asa cum se poate prezice dinspre grupurile ionizabile catre molecule. Atenololul (AT) elueaza primul deoarece este incarcat pozitiv pe grupul de amine secundare de baza(pKa 9.6). Dimerul (TA) este si el incarcat cu sarcina pozitiva dar este amina tertiara si are valoare pKa mai mica decat a atenololului. Este si un ion mai mare astfel mobilitatea va fi mai mica decat a atenololului. (marimea era suficienta pentru producerea separarii acestor doua molecule la un pH de 6.5 cand amandoua, si atenololul si dimerul ar fi complet incarcati electric ).

Diolul (D) este un compus neutru si astfel ar trebui sa elueze in acelasi ritm cu EOF care va creste odata cu pHul. Totusi, in lucrarea din discutie timpul de elutie al diolului creste odata cu pH-ul; aceasta se datoreaza combinatiei complexe cu boratul din zona tampon care tinde sa formeze un complex incarcat negativ cu un diol. Acidul blocant (BA)este incarcat atat pozitiv cat si negativ , care mai mult sau mai putin se neutralizeaza reciproc intr-o variatie a pH-ului destul de mare, cum creste pH-ul spre valoarea pKa a grupului de amine(cca 9.5) sarcina

negativa a grupului acidic devine predominanta; desi moleculele vor avea in continuare o oarecare sarcina pozitiva, sarcina negativa globala va determina moleculele sa ramana in urma EOF. In cele din urma fenolul(PPA) este neutru pana cand valoarea sa pKa(cca 9.7 - 10) este atinsa si la valori mai mari ale pH-ului va dezvolta o sarcina negativa incetinind ritmul migrarii; acestea sunt conform figurii 14.6.

Separarea in special datorita razei ionice Schimbari foarte mici in structura moleculara pot duce la diferente remarcabile ale timpului de retentie in CE. O separare impresionanta a unui medicament anti-depresiv experimental GR50360 de o parte a impuritatilor s-a realizat folosind izopropanol/0.01 M tampon de fosfat cu pH 7.0 . In acest caz separarea se datoreaza marimilor si formelor mari moleculare odata cu pH=7.0 medicamentul si impuritatile acestuia vor fi incarcate intr-o masura similara.

Figura 14.7 eidentiaza separarea tuturor celor 6 componente prin CE. Izomerul cis al GR50360 are o forma moleculara complet diferita de izomerul trans, rezultand intr-o raza ionica mai mica si astfel ruleaza mai devreme decat izomerul trans. Altfel compusii eluteaza in ordinea marimii moleculare compusii perfluorati (desfluorocompound) fiind primii dintre derivatii lui GR50360 care se eluteaza. Prezenta izopropanolului in faza mobila incetineste EOF suficient pentru ca separarea sa aiba loc fara probleme.

Analiza medicamentelor non-steroidiene si antiinflamatoare (AINS) cu electroforeza capilara si separarea anionilor pe baza razelor ionice

AINS contine in general grupuri de acid carboxilic care ionizate devin anioni. In CE folosind un capilar nemodificat EOF are directia indreptata spre catod si mobilitatea globala a ionilor este data de EOF mobilitatea anionilor care se indreapta spre anod. In acest exemplu tamponul folosit in in analiza este proiectat cu grija pentru continutul sau ionic spre a evita electro- difuzia. Glicina a fost considerata ca fiind potrivita din punct de vedere al mobilitatii pentru analiza compusilor din aceasta clasa deoarece, desi este o molecula mica cu un grup de acid carboxilic care este complet ionizat la pH-ul analizei (9.1) poarta totusi o sarcina partial pozitiva reducand mobilitatea globala spre anod, iprimand o mobilitate asemanatoare acelei unor mari acizi AINS lipofili.Componenta cationica din tampon are un efect important in rezolutia componentelor unui amestec care contine patru AINS. Trietanolamina a fost desemnata ca fiind cea mai buna componenta cationica deoarece a redus EOF din cauza mobilitatii ionilor sai relativ scazuta si de asemenea prin cresterea vascozitatii in solutia tampon. Figura 14.8 arata separarea unui amestec care contine cinci AINS, anume: sulindac(S), indometacin (I), piroxicam (P), acid tiaprofenic ( T), si aclofenac (A). Toate medicamentele sunt incarcate

complet la un pH de 9.1 si separarea s-a obtinut mai mult sau mai putin in concordanta cu marimea moleculara, aclofenac-ul, cea mai mica molecula, este cea care migreaza cel mai repede in directia opusa EOF.

Separarea peptidelor Un punct forte al CE este acela ca poate separa peptidele . Folosirea peptidelor in scop terapeutic creste rapid si dimensiunile mari ale acestora si polaritatea creeaza probleme in incercarea de a le separa. Pentru ca peptidele poarta de obicei doua sau mai multe sarcini cei mai importanti factori care trebuie optimizati pentru separarea peptidelor sunt pH-ul si concentratia solutiei tampon. Valoarea pl a peptidelor este pH-ul cand sarcinile pozitive si negative sunt perfect echilibrate. Un exemplu este dat de separarea hormonului adrenocorticotrofic (ACTH) de trei dintre fragmentele sale. Tabelul 14.2 arata valorile maselor moleculare si valorile pl ale ACTH si ale celor trei fragmente . Valoarea pl da cateva indicatii referitoare la numarul relativ al grupuriloe acide si bazice din peptide. O valoare pl mare indica o peptida cu un numar mare de reziduri bazice cum ar fi lizina si arginina, pe cand o valoare scazuta a pl inclina balanta in favoarea reziduurilor acide cum sunt acizi glutamic si aspartic. In acest exemplu dat, conditiile (pH 3.8)au fost alese pentru a fi predominante reziduurile bazice desi la acest pH reziduurile acide poarta inca o cantitate apreciabila de sarcina negativa inhiband migratia spre catod. In acest exemplu separarea este conforma cu echilibrul intre caracterele bazice si acide ale peptidelor. Peptida cea mai bazica eluteaza prima intrucat cea mai putin bazica peptida eluteaza ultima. Astfel, in acest caz, gradul de incarcare pozitiva a peptidei predomina in detrimentul razei ionice pentru determinarea vitezei de

migrare deci ACTH migreaza mai rapid decat fragmentul 3 in ciuda faptului ca are o masa moleculara mai mare. Separarea a fost optimizata crescand rezistenta solutiei tampon cum se poate vedea din figura 14.9 si cresterea rezistentei solutiei tampon a dat un timp de migratie marit prin efectele sale in reducerea

EOF. Alt efect important datorat cresterii rezistentei solutiei tampon in acest caz este reducerea interactiunii acestor predominant bazice peptide(in special fragmentele 1,2 si ACTH) cu grupurile silanol de pe peretele capilarului astfel rezultand un varf mai bine conturat.

In acest studiu elegant s-a ajuns la concluzia ca pentru toate peptidele studiate cea mai buna separare este aceea realizata in solutii tampon cu rezistenta mare(0.050.1M), permitand astfel manipularea EOF fara a schimba pH-ul potrivit pentru zona tampon. S-a concluzionat si ca valorile pH-ului acid intre 2.2 3.8 au fost cele mai bune pentru analiza peptidelor bazice si neutre pe cata vreme peptidele acide se separa cel mai bine la un pH de 7.0. Folosirea aditivilor in solutiile tampon Aditivi folositi in zona tampon pot produce o selectivitate mai mare cand separarea in solutii simple nu este posibila.

Aplicarea ciclodextrinelor pentru imbunatatirea separarii Ciclodextrinele sunt compusi neutri care migreaza cu acelasi ritm ca EOF. Acestea au mari cavitati hidrofobe in structura lor , cavitati in care se potrivesc moleculele. Usurinta cu care se potrivesc moleculele in cavitatile ciclodextrinelor este dependenta de stereochimia acestora, ciclodextrinele au fost folosite ca aditivi atat in separarile chiral , unde enantiomerii opusi formeaza complexe tranzitorii de diastereomeri cu ciclodextrinele active optic, cat si in separarile non-chiral unde ciclodextrinele afecteaza diastereoizomerii intr-o masura diferita.

Separarea pilocarpinei de epimerul sau Pilocarpina(P), un medicamet folosit in tratamentul glaucomului, poate contine epimerul sau, izopilocarpina(I) ca impuritate. Intr-un studiu nu a fost posibila separarea completa a pilocarpinei de izopilocarpina variind pH-ul solutiei tampon. PH-ul optim pentru separare trebuie sa fie 6.9 si ambi compusi trebuie sa fie cca 50% ionizati dar chiar si la acest pH separarea nu este completa.

Introducerea a 0.01M -ciclodextrina in tamponul utilizat a dus la separarea de baza a diastereoizomerilor. Figura

14.10 A arata separarea celor doi epimeri obtinuta in urma adaosului de ciclodextrina in tamponul utilizat. In acest exemplu au fost folosite capilare pe peretele carora grupurile silanol au fost partial blocate de un invelis, reducand sarcina negativa de pe perete reducand astfel EOF lasand mai mult timp pentru desfasurarea separarii. In exemplul de fata separarea are loc datorita diferitelor grade de complexare a aditivilor ciclodextrine cu cei doi diastereoizomeri.

Separarea anestezicelor locale chirale

Ciclodextrinele sunt folosite in GC si HPLC pentru a efectua separarea enantiomerilor si sunt de asemenea foarte eficienti in aplicatiile CE. Aplicatiile CE separarilor chirale vor suferi o crestere rapida in urmatorii ani pentru ca inalta eficienta care poate fi obtinuta in separarile pentru care se foloseste aceasta tehnica si datorita costului scazut al aditivilor chirali comparat cu costul coloanelor folosite in GC si HPLC . O serie de enantiomeri ai anestezicelor locale au fost separati folosind CE utilizand o solutie tampon de fosfat cu pH de 3.0 care contine trietanolamina ca aditiv cationic si 10mM de dimetil -ciclodextrina. Adaugarea aditivilor cationici

inverseaza EOF (vezi tabelul 14.1) spre anod , totusi anaitii inca migreaza spre catod, avand o mobilitate globala in aceasta directie mai mare decat a EOF spre anod. Acest lucru a permis o crestere a timpului de interactiune a analitilor cu ciclodextrina care migreaza spre anodcu EOF. Utilizarea -ciclodextrinei metilice creste interactiunea analitilor lipofili cu acest selector chiral comparat chiar cu -ciclodextrina.

Separarea izomerilor R si S a unei serii de anestezici locali relationati structural. Separari considerabile au fost obtinute pentru compusii din aceasta serie unde s-a propus ca pentru potrivirea poriunii hidrofobe de analit n ciclodextrin sa fie optima cand unul dintre substituenti de la centrul chiral este capabil sa interactioneze cu grupurile de hidroxid chiral in ritmul cavitatilor ciclodextrinei. Tabelul 14.3arata asocierea constantelor calculate pentru interactiunea perechilor enantiometrice

cu dimetilciclodextrina. Cu cat mai mare valoare lui K, cu atat mai multi enantiomeri sunt retrasi de ctre selector, care in acest caz migreaza spre anod. Valorile din 69alcu evidentiaza si mobilitatea 69alculate pentru fiecare analit in solutie libera cu cea mai mare parte a substituentului N-alchil.

Cromatografie electrocinetica micelara(MECC) Extinderea tehnicii de baza a CE permite separarea componentelor neutre , dar a fost si larg folosit in obtinerea separarii speciilor de ioni. In MECC, un tensioactiv(detergent) este adaugat fazei mobile la o concentratie mai mare decat concentratia critica a micelei. Detergentii folositi pot fi anionici, cationici sau neutri. Micelele actioneaza intr-un mod analog fazei

stationare din HPLC. Micelele anionice migreaza in directia opuse celei obisnuite a EOF , adica spre catod. Micelele cationice migreaza cu EOF si micelele neutre migreaza la aceeasi viteza cu EOF. Prezenta detergentului in zona tampon are un efect asupra ritmului si asupra directiei EOF prin interactiunea cu peretele capilarului astfel incat baza finala pentru separare prin MECC poate fi datorata unui numar de mecanisme. Interactiunea analitului cu micelele poate fi modificata folosind detergenti organici in zona tampon care va reduce partitionarea analitului in micele; in acelasi timp asemenea modificatori organici tind sa reduca EOF.

Separarea cefotaxim-ului de impuritatile relationate Penicilinele si cefalosporinele sunt compusi reactivi si pot contine un numar de degradanti.Selectivitatea inalta

a CE poate fi foarte avantajoasa acolo unde se cere separarea unei mixturi complexe. Unele impuritati pot fi neutre si separarea impuritatilor neutre una de cealalta necesita partitionarea in micele incarcate cu sarcina care migreaza la viteze diferite de EOF . la aceasta aplicatie in special sodiu dodecil sulfat(SDS), un detergent anionica fost folosit pentru functionarea MECC. PH-ul zonei tampon e de 7.2, adica destul de scazut pentru a evita promovarea degradarii cefotaxim-ului care este inutilizabil ca baza. Figura arata urma MECC obtinuta de la C care contine 0.2% w/w din fiecare impuritate iar figura 14.14B arata o proba din C necompromisa. Compusul care migreaza cel mai lent este compusul neutru L , lactona , care ar trebui sa aiba o mare afinitate pentru sarcinile negative si SDS hidrofob. Celelalte impuritati sunt reprezentate de acizii carboxilicicare sunt comple incarcati cu sarcina la pH de 7.2, astfel purtand o sarcina negativa care va provoca un anumit grad de respingere intre analiti s micelele incarcate cu sarcina negativa. Anti-izomerul lui C eluteaza tarziu datorita stereochimiei proprii, prin urmare raza sa ionica si coeficientul de separare sunt foarte diferite de cele ale lui C(aceasta este in concordanta cu lipsa efectului antibiotic pentru anti-izomer ). Metoda MECC este capabila sa produca separarea a tuturor celor 7 impuritati la nivelul de 0.2%. A demonstrat o precizie comparabila cu cea a metodei HPLC dezbatute mai sus dar este mai rapida decat metoda HPLC.

Analiza flavonoidelor prin MECC Flavonoidele sut produse naturale care pot fi gasite in anumite ierburi medicinale populare cum ar fi Ginkgo biloba. Ele sunt fenoli care nu sunt incarcati cu sarcini electrice pana cand pH-ul zonei tampon nu ajunge la o valoare mare. Separarea prin MECC are loc folosind 0.04M SDS in 0.02M solutie tampon de borat cu un pH de 8.2. La acest pH flavonoidele studiate sunt mai mult sau mai putin fara sarcina si in absenta partitionarii diferentiale migreaza in acelasi ritm cu EOF. Prezenta lui SDS in zona tampon incetineste viteza de migratie a acestor compusi conform cu peterea de a se fragmenta in micele SDS , care se deplaseaza spre anod in timp ce EOF

se indreapta spre catod. Figura 14.15 arata structurile strans legate de flavonoide in timp ce figura 14.16 arata separarea obtinuta pentru un model de amestec din acesti compusi. Metoda da o buna precizie si o separare rapida a amestecului . Cromatografia acestor tipuri de compusi cere in mod normal utilizarea gradientului HPLC cu un timp de elutie indelungat.