Citologie Animala LP nr.

Obinerea omogenatelor celulare i fracionarea lor prin centrifugare

n Biologia Celular prin metode de omogenizare se neleg metodele de disociere a celulelor n elementele lor componente. Omogenizarea esuturilor i celulelor - orice tehnic de omogenizare trebuie s acioneze asupra celulelor ntr-o manier care s provoace ruperea suprafeei celulare i s elibereze citosolul i organitele. Principalul scop este acela de a gsi condiiile n care ruperea celulelor s se produc cu eficien maxim, dar utiliznd un minimum de fore distructive, astfel nct s nu provoace leziuni ale organitelor de interes i s se evite denaturarea proteinelor.

Omogenat celular
Pentru obinere omogenatului celular se
pornete de la 2 componente:
Materialul biologic (organul, esutul sau suspensia de celule) care este supus omogenizrii; Mediul de omogenizare ce reprezint soluia apoas ce urmeaz a realiza dispersia efectiv a elementelor subcelulare.

MATERIALUL BIOLOGIC
Criterii pentru alegerea materialului biologic S conin organitele ce urmeaz a fi investigate n cantitate mare; S poat fi prelucrat cu un minim de dificulti tehnice, n condiii controlate, reproductibile, care s evite apariia de erori; S fie bine delimitat din punct de vedere anatomic i relativ uor accesibil pentru a scurta timpul de prelevare i pentru a evita pericolul confuziei cu alte esuturi sau organe.

Omogenizator POTTER-ELVEHJEM
Omogenizatorul Potter-Elvehjem este format din: - piston de sticl sau teflon; - eprubet din sticl sau teflon, ntre care exist un spaiu foarte mic (~0,2mm). Pistonul este antrenat de un motor electric pentru a efectua o micare de rotaie (circa 1000 ture/min) i n acelai timp se realizeaz i o micare n sus i n jos a eprubetei ce conine mediul de omogenizare i esutul. Acesta din urm este forat s treac prin spaiul dintre piston i peretele interior al eprubetei, spaiu n care se dezvolt fore de forfecare extrem de mari, ce produc la nceput mrunirea esutului i apoi ruperea membranelor celulare.

 Omogenizarea cu ajutorul omogenizatorului cu cuite (blender)

se utilizeaz pentru prelucrarea esuturilor dure (miocard, esut cartilaginos, placent, etc.); 10.00040.000 rotaii/minut, un interval de timp foarte scurt (cteva secunde);

Omogenizarea prin ultrasonicare (sonicator) se realizeaz prin aplicarea de

ultrasunete (18-50 kHz) ce conduce la producerea local a unor presiuni de ordinul miilor de atmosfere adecvat pentru omogenizarea organismelor unicelulare (drojdii).

MEDIUL n care se realizeaz omogenizarea

Meninerea unor condiii ct mai apropiate mediului intern al organismului (soluii tampon, ageni osmotici). Limitarea, pe ct posibil, a aciunii enzimelor autolitice, pentru a reduce gradul n care acestea afecteaz structura i funcionalitatea particulelor subcelulare (substane cu efect de complexare a ionilor divaleni, inhibitori ai proteazelor intracelulare).

RAPORTUL DE OMOGENIZARE
n mod tradiional, se folosete un raport de omogenizare
1:10 (g/v) ntre cantitatea de esut i volumul de mediu de
omogenizare utilizat (soluia apoas), ns este posibil varierea acestui raport n funcie de necesiti.

Centrifugarea: este cea mai comod i mai

Prin rotirea centrifugii cu viteza unghiular , se constat c se produce o deplasare a unei particule, cu o vitez dat de expresia:
2 dx (V p V m ) x v dt Ff

frecvent utilizat metod de fracionare a omogenatelor celulare.

Relaia lui Svedberg

2 R 2 ( p m) 2 x v 9
Din relaia lui Svedberg se deduce c diferena de densitate dintre mediu i particul decide direcia deplasrii particulei, iar viteza deplasrii acesteia depinde preponderent de dimensiunea sa.

Coeficientul de sedimentare
Coeficientul de sedimentare al unei particule S reprezint viteza de sedimentare a unei particule ntr-un cmp centrifugal de valoare unitar (2x =1). Coeficientul de sedimentare depinde exclusiv de mediul de centrifugare i de caracteristicile particulei i are drept unitate de msur svedbergul [S].

2R2 ( p m ) S 2 x 9 v
Acceleraia centrifugal creia i este supus o particul depinde de parametrii funcionali ai aparatului n care se realizeaz procesul: raza rotorului = r; viteza de rotire = fiind posibil utilizarea unor combinaii diferite ale celor 2 parametri pentru generarea unei valori unice a acceleraiei centrifugale (2r). Pentru a se descrie n mod univoc condiiile de centrifugare, se obinuiete s se specifice acceleraia centrifugal sub forma de multiplii de g (acceleraia gravitaional - 9,81 m/s2). Exista 2 tipuri de conditii de realizare a separarii centifugale a particulelor dintr-un omogenat celular: - separarea lor in functie de dimensiune si forma, mediul in care sunt suspendate avand densitatea mai mica decat a lor si constanta in tot tubul de centrifuga, situatie denumita centrifugare diferentiala (se realizeaza prin aplicarea unor campuri gravitationale succesiv crescatoare); - separarea pe baza diferentelor de densitate, intr-un mediu a carui densitate variaza continuu sau in trepte de-a lungul tubului de centrifuga spre valori din ce in ce mai mari, fiecare particula deplasandu-se pana in zona de izodensitate, unde se stabilizeaza, ceea ce corespunde centrifugarii izopicnice, denumita si centrifugare in gradient de densitate.

Schema de fracionare celular prin centrifugare diferenial

Centifugarea n gradient de densitate