FRACIONAREA CELULAR Definiie Este o tehnic bazat pe caracteristicile structurilor subcelulare (form, dimensiune, densitate) care reuete s le diferenieze

astfel permind separarea lor. Celulele pot fi dezmembrate prin: - oc osmotic - ultrasonicare - filtrare prin site mici Dac celula este dezmembrat ntr-o manier delicat, fiecare din organitele sale poate fi izolat. Procesul de dezmembrare celular se numete omogenizare iar procesul ulterior de izolare a organitelor se numete fracionare. Izolarea organitelor necesit tehnici de chimie fizic mergnd de la strecurare prin site simple, la sedimentarea gravitaional sau precipitare diferenial sau la ultracentrifugare sau marcare fluorescent a fragmentelor n gradiente de densitate generate pe computer. Scop Izolarea componentelor celulare sau subcelulare, a complexelor macromoleculare acizilor nucleici sau enzimelor n scopul definirii rolului lor individual n celule. Individualizarea componentelor celulare permite meninerea lor ntr-o stare de funcionare, n condiii prestabilite, fr a necesita prezena unei celule sau a unui grup de celule. Aceste sisteme de studiu, acelulare, sunt utilizate n toate sistemele experimentale de investigare a rolului organitelor celulare. Omogenizarea Primul pas n vederea fracionrii este izolarea celulelor i obinerea unui eantion pur. Celulele izolate (cele din snge sau din culturi de celule) pot fi separate pe baza formei sau a unor markeri de suprafa (ncrcare electric, antigene sau enzime de suprafa). Celulele din context tisular trebuie separate de celulele vecine, eliberate din jonciuni prin activitate mecanic sau enzimatic. Dezagregarea jonciunilor de tip desmosomal sau jonciunilor strnse se poate realiza cu chelatori (eliminatori) de Ca, Mg alturi de fore mecanice. Tehnicile de omogenizare cuprind: - tehnici bazate pe alterarea osmotic a mediului n care sunt celulele - tehnici bazate pe fore mecanice mojarare, blender, compresiune/expansiune, ultrasonicare Aceste tehnici determin ruperea majoritii membranelor celulare cu formarea ulterioar de microvezicule nchise. Dac tehnica este bine executat, organite ca mitocondriile, nucleul, complexul Golgi sau lizozomii rmn intacte. Disrupia reticolului endoplasmatic rugos determin formarea unor microvezicule cu coninut variabil, numite microsomi. Suspensia celular este redus la un omogenat (sau extract) care conine diferite compartimente veziculare cu coninut variabil, ncrcare i densitate diferite. Fracionarea Reprezint tehnica de separare a elementelor dintr-un omogenat. Dup omogenizarea celulelor, diferitele componente pot fi separate. Pentru unele materiale (snge integral, celule n suspensie) aceasta se poate realiza prin sedimentare gravitaional. n aceast tehnic, separarea are loc prin diferenele naturale de form i dimensiune (densitate) dintre celule. Hematiile sunt mai dense dect leucocitele, astfel nct separarea determin depunerea unui strat de hematii la fundul eprubetei de sedimentare, urmat superior de un strat de leucocite

Centrifugarea reprezint cea mai folosit tehnic de fracionare a componentelor celulare utiliznd fora centrifug. Tehnicile care folosesc recipiente de centrifugare de volum mai mare i incinte frigorifice sunt tehnici preparative; tehnicile care folosesc viteze de centrifugare mari n recipiente mici sunt tehnici analitice. O centrifug de peste 20.000RPM este o ultracentrifug. Organitele pot fi separate ntr-o centrifug prin variate metode. Particulele se comport diferit sub aciunea forei centrifuge: particulele n suspensie pot fi separate fie prin sedimentare de vitez fie prin sedimentare de echilibru. Sedimentarea de vitez se mai numete i centrifugare zonal i are avantajul unei centrifugri la vitez redus pentru o perioad scurt de timp dar confer separri incomplete. Sedimentarea de echilibru se mai numete izopicnic sau de echilibru la densitate i necesit viteze mari de centrifugare pentru perioade mai lungi de timp, avnd avantajul unei separri complete. Sedimentarea gravitaional Reprezint o metod de separare grosier a componentelor unui omogenat. Separarea are loc n funcie de criteriile dimensiune i densitate. Componentele mai mari se mic cel mai repede sub aciunea forei centrifuge i se vor depune primele la nivelul fundului eprubetei de centrifugare. La viteze relativ mici, componentele mari ca nucleii sau fragmentele celulare formeaz un depozit (pelet). O vitez superioar de centrifugare determin formarea unui pelet din mitocondrii. Ultimele componente care sedimenteaz la viteze foarte mari sunt elementele reticulului endoplasmatic i ribozomii. Peletul poate fi extras dup fiecare treapt de centrifugare. Deoarece separarea nu este de mare finee, peletul extras poate fi resuspendat i recentrifugat de cteva ori pentru a obine un eantion pur Sedimentarea de vitez Este o metod de rafinare a sedimentrii gravitaionale. Se bazeaz pe criteriile dimensiune i form a particulelor de separat. Particulele din soluia centrifugat sunt accelerate i ating o vitez final; aceast vitez final este determinat n parte de dimensiuni, greutate, densitate i forma particulelor ca i de viscozitatea mediului n care se desfoar procedura i de fora centrifug generat. Viteza final este denumit viteza de sedimentare a particulei i poate fi utilizat pentru msurarea dimensiunii, greutii sau densitii particulei. Practic, separarea are loc prin centrifugarea unui omogenat dispus ca un strat la suprafaa unei soluii saline din tubul de centrifugare. Deoarece un preparat mai dens (omogenatul) are tendina de a se amesteca n soluia de sedimentare, aceast soluie este amplasat ntr-o soluie de sucroz care este astfel preparat nct concentraia acesteia descrete de la fundul spre gtul tubului de centrifugare. Se creeaz un gradient de densitate care rafineaz sedimentarea de vitez i permite separarea diferitelor componente ale omogenatului sub form de benzi. Aceste benzi se menin datorit gradientului de densitate. Din aceste benzi de sedimentare se pot extrage individual componentele celulare. Rata de sedimentare (poziia final a fiecrui component) depinde de forma i dimensiunile particulelor i este caracterizat de un coeficient de sedimentare (s). Centrifugele moderne care ating viteze de rotaie de 80.000 rpm (rotaii pe minut) dezvolt fore de 500.000G, fore care pot determina separarea unor molecule minuscule, cum ar fi ARNt sau enzimele.

Addenda Coeficientul de difuziune Cnd o particul atinge viteza final, este afectat de difuziune, de obicei n direcia opus deplasrii sale determinat de fora centrifug. Este o micare de tip brownian i poate fi statutat matematic ca o constant coeficientul de difuziune reprezentnd gradul de mprtiere a moleculei n timp. Este exprimat n uniti Fick. 1 Fick = 10 -7 cm2/sec. Exist o relaie direct ntre coeficientul de difuziune a unei particule i diametrul su. Ambele sunt raportate la coeficientul de sedimentare al particulei. Coeficientul de sedimentare este determinat de formula S = 1/ 2r x dr/dt unde - este viteza angular a rotorului exprimat n radiani/sec i este egal cu 0,10472 x RPM - r = distana dintre particul i centru de rotaie (mm) - dr/dt = rata deplasrii particulelor (cm/sec) Valoarea coeficientului de sedimentare pentru o particul poate fi determinat prin msurarea timpului de deplasare (vitez i distan) a unei particule ntr-un mediu de viscozitate cunoscut. Cel mai simplu este s calculm distana de deplasare a particulelor pentru o centrifug cu o for cunoscut. Sedimentarea la echilibru Este o tehnic de separare a componentelor dintr-un omogenat pe baza densitii de flotare. n acest caz, nu mai conteaz parametrii dimensiune i form. Dac o prob conine mai multe particule diferite, cu diferite densiti i dimensiuni, ele vor fi separate pe baza acestor parametri. Particulele mai mari vor ajunge la baza tubului de centrifugare mai repede dect cele mai mici. Dac fora centrifug este crescut progresiv, timpul de separare poate scdea. Gradientul de concentraie din tubul de centrifugare (gradient de sucroz sau clorur de cesiu) este mult mai accentuat dect pentru sedimentarea de vitez. Prin centrifugare, componentele celulare se deplaseaz spre fundul tubului de centrifugare i se opresc i floteaz n momentul n care ajung ntr-un strat unde densitatea este echivalent cu densitatea proprie. La finalul centrifugrii se formeaz benzi din care cea mai apropiat de fundul centrifugii este compus din elemente cu densitatea de flotare cea mai mare. Metoda este util pentru separarea unor componente asemntoare care incorporeaz sau nu (experimental) izotopi grei.