Sunteți pe pagina 1din 278

ISBN electronic: 978-606-8236-26-1

Coordonator:
Simona Ivana
Autori:
Alexandru T. Bogdan
Iulian ogoe
Gheorghe Cmpeanu
Simona Ivana
Traian Enache
Stelian Britreanu
Ipate Iudith
Alexandru Popescu

MicrobiologiA ALIMENTELOR
- volumul III
Patogeni alimentari
Ediie mbunatit i revizuit

Editura Asclepius
Bucureti, 2011

Toate drepturile sunt rezervate editurii. Tiprit n Romnia. Nici o


parte din aceast lucrare nu poate fi reprodus sub nici o form, prin nici un
mijloc, mecanic sau electronic sau stocat ntr-o baz de date, fr acordul
prealabil, n scris, al editurii.
All rights reserved. Printed in Romania. No part of this publication
may be reproduced or distributed in any form, by any means or stored in
a data base or retrieval system without the prior, written, permission of the
editor.

ISBN electronic: 978-606-8236-26-1

Editura Asclepius, Bucureti


Tel: 072.44.66.481, tel/fax: 021/242.11.01
Website: www.asclepius.ro, e-mail: editura@aslcepius.ro
2

Cuprins
CAPITOLUL 1
Implicaiile bacteriilor din genul Shigella n producerea toxiinfeciilor alimentare 7
1.1. Caractere generale 7
1.2. Taxonomie
10
1.3. Ci de transmitere 12
1.4. Caractere de cultivare 13
Medii uzuale i medii selective de cultivare.
13
1.5. Structura antigenic 13
1.6. Patogenitate
15
1.7. Epidemiologie 22
1.8. Manifestri clinice 24
1.9. Sensibilitatea fa de factorii de mediu 25
1.10. Izolarea i identificarea shigelelor
36
CAPITOLUL 2
Implicaiile bacteriilor din genul Escherichia n producerea toxiinfeciilor alimentare 70
2.1. Caractere generale
70
2.2. Istoric 71
2.3. Taxonomie
72
2.4. Morfologie
73
2.5. Condiii de cultivare i caractere culturale
73
2.6. Proprieti biochimice 74
2.7. Proprieti antigenice 75
2.8. Sensibilitatea fa de factorii de mediu 77
2.9. Patogenitatea
78
2.10. Epidemiologie 87
2.11. Detectarea EPEC, ETEC i EIEC n alimente i materiale patologice 91
2.12. Detectarea Escherichia coli O157:H7 din fecale i alimente 93
2.13. Infeciile naturale la animale 98
Colibaciloza vieilor 99
Colibaciloza purceilor 99
Colibaciloza psrilor 100
2.14. Infecii cu Escherichia coli la om
100
3

2.15. Toxiinfecii alimentare produse de Escherichia coli 101


2.16. Strategii de prevenire i combatere
103
2.17. Metode de izolare i identificare a lui E. coli din alimente

106

CAPITOLUL 3
Implicaiile bacteriilor din genul Yersinia n producerea toxiinfeciilor alimentare 124
3.1. Caractere generale
124
3.3. Specii ale genului Yersinia implicate n toxiinfeciile alimentare 127
3.3.1. Yersinia pseudotuberculosis subsp. pseudotuberculosis
(Pasteurella pseudotuberculosis)
127
3.3.2. Yersinia enterocolitica
131
3.4. Specii zoonotice din genul Yersinia
132
3.4.1. Yersinia enterocolitica cu serotipurile 03, 05, 27, 08, 09 i Yersinia pseudotuberculosis
132
3.4.2. Yersinia pestis
133
CAPITOLUL 4
Implicaiile bacteriilor din genul Vibrio n producerea toxiinfeciilor alimentare 143
4.1. Caractere generale
143
4.2. Taxonomie
144
4.3. Istoric 145
4.4. Morfologie
146
4.5. Condiii de cultivare i caractere culturale
147
4.7. Ecologie 150
4.8. Factorii de patogenitate 150
4.9. Specii mai importante de vibrioni
150
4.10. Metode de izolare i identificare
154
a speciilor din genul Vibrio din alimente
154
4.11. Izolarea i identificarea vibrionilor din produsele acvatice 163
Bibliografie 170
CAPITOLUL 5
Implicaiile campylobacteriilor n toxiinfeciile alimentare 173
5.1. Caractere generale
173
5.2. Taxonomie
174
5.3. Specii ale genului Campylobacter implicate n producerea
4

toxiinfeciilor alimentare
174
5.3.1. Campylobacter jejuni
174
5.4. Epidemiologie 176
5.4.1. Distribuia campylobacteriozelor la om dup vrst i sex 177
5.4.2. Sezonalitatea
178
5.4.3. Cazurile importate 178
5.6. Metode de izolare i identificare a genului Campylobacter
181
din alimente 181
5.6.1. Prepararea probelor
181
5.6.2. Izolarea speciilor de Campylobacter
183
5.6.3. Identificarea speciilor de Campylobacter 183
5.6.4. Confirmarea campilobacteriilor 183
CAPITOLUL 6
Toxiinfecii alimentare de origine bacterian cu
inciden redus
194
6.1. Genul Aeromonas
194
6.1.1. Taxonomie 194
6.1.2. Morfologie 195
6.1.3. Condiii de cultivare i caractere culturale
195
6.1.4. Ecologie 196
6.1.5. Diagnostic 197
6.2. Genul Plesiomonas
199
6.3. Genul Photobacterium 200
6.4. Genul Brucella 200
6.5. Genul Enterobacter
205
6.6. Genul Bacteroides
205
6.6.1. Bacteroides fragilis
205
6.7. Genul Klebsiella 205
6.7.1. Klebsiella pneumoniae 206
6.8. Genul Streptococcus
208
6.9. Genul Erysipelothrix
211
6.9.1. Erysipelothrix rhusiopatiae
211
Capitolul 7
Principalele micotoxine implicate n producerea
toxiinfeciilor alimentare
226
7.1. Aflatoxinele
228
7.2. Toxinele produse de Alternaria 234
5

7.3. Citrinin 235


7.4. Ochratoxinele 237
7.5. Patulina 239
7.6. Acidul penicilic 241
7.7. Sterigmatocistina 241
7.8. Fumonizinele 242
7.9. Sambutoxina
244
7.10. Zearalenonele 245
Capitolul 8
Scurt prezentare a principlalelor virusuri ce se
transmit prin alimente
254
8.1. Virusurile hepatice enterice
257
8.1.1. Virusul hepatitei A 257
8.1.2. Virusul hepatitei E (HEV) 260
8.1.3. Virusul hepatitei F (HFV) 260
8.2. Norovirusurile
261
CAPITOLUL 9
Principalii prioni ce se transmit prin alimente
266
9.1. Encefalopatia spongiform bovin (BSE)
266
9.2. Boala Creutzfeldt-Jakob (CJD, vCJD)
269
9.3. Boala cahectizant cronic (Chronic Wasting Disease - CWD) 270

CAPITOLUL 1
Implicaiile bacteriilor din genul
Shigella n producerea toxiinfeciilor
alimentare
1.1. Caractere generale
Multiplicarea shigelelor pe suport alimentar, chiar la temperaturi de
10-19C, explic implicarea n declanarea toxiinfeciilor alimentare a unor
alimente contaminate iniial cu un numr subinfectant de germeni.
Produsele lactate au fost cauza unor focare familiale, ns controlul
curent al materiei prime n fabricile de lapte i a produsului finit nainte
de comercializare reduce posibilitatea contaminrilor acestei categorii de
produse.
Alte produse alimentare de origine animal (oule, carnea i derivatele
lor) pot fi contaminate cu germeni din genul Shigella spp. prin manipulare
i procesare neigienic.
La nceputurile investigaiilor tiinifice despre cauza mbolnvirilor
produse la om prin consumul alimentelor de origine animal, Paul Riegler a
publicat, n anul 1906, o valoroas lucrare despre Otrvirile cu carne, care
reprezint prima expunere tiinific din ara noastr asupra toxiinfeciilor
alimentare la om, datorate consumului de carne contaminat cu germeni
patogeni din genul Salmonella (Enache T., i col., 2002).
Paul Riegler mpreun cu Victor Babe cerceteaz un episod grav de
mbolnviri (27 persoane din care 3 au murit), ca urmare a consumului de
carne de miel (infectat cu Salmonella Gartner) din care a izolat germenul,
identificat apoi i la persoanele decedate.
Medicii legiti suspectau iniial o otrvire colectiv. Din analiza
chimic a probelor recoltate de la cadavre nu s-a descoperit ns nici o
substan toxic, dar serul bolnavilor din acest episod a aglutinat germenul
izolat, la un titru de 1/50 - 1/100, chiar i dup o lun de la debutul bolii.
Din punct de vedere juridic, acest episod a beneficiat de un diagnostic
corect care a nlturat cu argumente tiinifice prezumia de atentat criminal
7

prin otrvire, dezlegnd totodat o obscur problem a vremii: aa-zisele


otrviri cu carne.
Datorit relaiilor comerciale, specificului i tradiiilor culinare,
modului de preparare a alimentelor sau utilizrii mai frecvente a unor
produse disponibile n anunite zone geografice, alimentele se pot constituii
n verigi majore de diseminare a germenilor patogeni sau potenial patogeni
pentru oameni i animale.
Globalizarea industriei alimentare, comerul i transportul, implic
desfacerea i utilizarea alimentelor la distane mari fa de locul producerii
lor, ceea ce subliniaz posibilitatea diseminrii patogenilor care le
contamineaz la un moment dat. n acest context, bolile transmise prin
alimente dobndesc tot mai mult un caracter epidemiologic universal.
Riscul epidemiologic este mare i pentru faptul c alimentele nu
reprezint doar un vehicul, ele sunt i substrat nutritiv pentru multiplicarea
germenilor, producnd simultan toxiinfecii alimentare la mai muli
indivizi.
De la ogor pn la consumator, lanul producerii, procesrii i preparrii
alimentelor este foarte lung, greu de controlat i, cu ct alimentul trece prin
mai multe etape, cu att crete riscul de contaminare, ntruct orice etap
este susceptibil de a fi contaminat.
n general produsele alimentare de origine animal (carne i derivate,
lapte i derivate, ou, pete, fructe de mare etc.) se pot contamina cu germeni
enteropatogeni dac:
animalele de mcelrie sunt purttoare de germeni enteropatogeni;
animalele de mcelrie sntoase sunt stresate naintea tierii, iar
manoperele de abator se fac neigienic;
nu sunt respectate condiiile de igien la procesare, depozitare i
transport, dar i n buctrii i la servire.
Prin urmare, contaminarea poate fi primar (origine) sau secundar
(manipulare, prelucrare, depozitare etc).
Metoda cea mai sigur de prevenire a mbolnvirilor la om rmne
prelucrarea termic (fierbere, etuvare, cuptor), cu condiia ca temperatura
de peste 100C s fie activ uniform, n profunzimea alimentului.
Alimentele de origine vegetal nu constituie substrat de supravieuire
i multiplicare a germenilor, dar se pot contamina prin praf, ape de irigaie,
sol, fertilizante organice. Riscul epidemiologic major l constituie faptul c
unele din aceste produse se consum crude (exemplu: salatele).
Alimentele mixte (de origine animal i vegetal), care de obicei
nu se prelucreaz termic i se consum ca atare (salate, creme, maioneze,
ngheat etc) se pot contamina, fie ca materii prime, fie n cursul preparrii,
8

depozitrii, servirii.
Riscul de contaminare a minilor persoanelor care manipuleaz
aceste alimente este corelat cu exercitarea profesiilor care asigur asisten
medical, paramedical, prim-ajutor, personalul din sectorul sanitar i sanitarveterinar, personalul care lucreaz la salubritate (att pentru ndeprtarea
reziduurilor solide, ct i la ntreinerea reelei de canalizare).
Importana minilor murdare n transmiterea bolilor infecioase este
influenat de intensitatea contaminrii, de anumite deprinderi neigienice
individuale, de nivelul cultural i igienico-sanitar, ct i de condiiile de
supravieuire ale patogenilor pe suprafaa tegumentului.
Insectele joac rolul de vectori activi sau pasivi n transmiterea
patogenilor, dup cum germenii se nmulesc sau nu pe organismul insectei
vector.
Vectorii mecanici (biologic-pasivi) vehiculeaz doar microorganisme
care supravieuiesc pasiv pe suprafaa corpului lor sau n tubul digestiv, fr
a se multiplica.
Musca domestic prin habitatul ei peridomestic, mobilitate, voracitate,
preferine coprofage, poate vehicula infecia la mari distane de locul
contaminrii iniiale.
Gndacii de buctrie (Blatella germanicus i Blatella orientalis) pot
vehicula pasiv enterobacterii, enterovirusuri, stafilococi, ou i larve de
helmini etc.
Furnicile pot transmite mecanic germenii Gram negativi.
Aceti factori biologici au rol important n transmiterea infeciilor n
locuine, colectiviti umane, sector alimentar, medical etc.
Cel de-al treilea element constitutiv al focarului epidemiologic
este reprezentat de organismul uman i de receptivitatea indivizilor care
alctuiesc o populaie.
Rezistena antiifecioas reprezint capacitatea natural a organismului
de a mpiedica ptrunderea patogenilor n organism, de a asigura distrugerea
i eliminarea lor din organism i de a neutraliza produii toxici care induc
boala.
Pentru om, riscul reprezentat de consumul crnii animalelor acvatice
este condiionat de mediul din care provin aceste vieuitoare. Literatura
de specialitate cuprinde date relativ puine despre microbiologia acestor
produse.
Riscurile sunt mai mari la carnea animalelor acvatice provenite din
zonele tropicale unde bolile digestive evolueaz sub form endemic.
Molutele sunt frecvent purttoare de germeni patogeni enterici, n
organismul lor concentrndu-se cele mai diverse bacterii i virusuri luate
9

din ap n timpul hrnirii. Pericolul pentru om l reprezint consumul n


stare crud sau numai dup o superficial tratare termic a acestora.
Animalele acvatice crescute n condiii artificiale prezint un pericol
i mai mare pentru consumator, ntruct este frecvent contaminarea lor cu
microorganisme provenite din dejeciile umane deversate n cursurile de
ap.
n timpul hrnirii, molutele filtreaz i concentreaz n tubul digestiv
microorganismele din apa n care triesc. De aceea se impune controlul
microbiologic periodic al apelor n care triesc i din care se recolteaz
molute pentru consum uman (Brzoi D., Apostu S., 2002).
Produsele alimentare de origine animal se pot contamina cu flora
microbian prezent n mediul n care ele se prelucreaz, manipuleaz,
depoziteaz i se transport pn ajung la consumatori.
Izolarea i identificarea microorganismelor patogene din alimente,
prezint, nc, unele dificulti datorit posibilitilor de contaminare
simultan cu mai multe specii de germeni, dintre care numai unii au
capacitate patogen.
Dintre agenii patogeni cunoscui i descrii care produc toxiinfeciile
alimentare, germenii aparinnd genului Shigella spp. au ocupat pn n
prezent un loc mai puin important, shigelozele fiind considerate aproape
exclusiv, infecii bacteriene, fr ca iniial s fie recunoscut rolul alimentelor
n transmiterea infeciei.
Datele recente din literatura internaional de specialitate demonstreaz
ns implicarea frecvent a germenilor din genul Shigella spp. n declanarea
unor episoade grave de toxiinfecii alimentare la om, care, n afar de ap,
numeroase alte alimente de origine animal, dein o pondere crescnd.
Dup datele statistice ale Organizaiei Mondiale a Sntii (OMS)
boala diareic este considerat a doua cauz de deces la scar global dup
bolile cardiovasculare, fiind cel mai frecvent sindrom ntlnit n patologia
infecioas, caracterizat printr-o simptomatologie polimorf cu evoluie
foarte grav.
Este demonstrat faptul c Shigella spp. provoac sindromul diareeic
infecios denumit dizenterie bacilar, al crui diagnostic presupune mai
multe etape succesive foarte laborioase.

1.2. Taxonomie
Genul Shigella este component al familiei Enterobacteriaceae i
prezint multiple nrudiri cu genul Escherichia, ns nu face parte din flora
saprofit a intestinului.
10

Datorit numeroaselor asemnri metabolice i antigenice,


mecanismelor patogenice i nrudirilor antigenice cu speciile din genul
Escherichia, muli autori au propus ca aceste grupuri s fie reunite i s
constituie o grup unic: Escherichia-Shigella (Farmer J.J. III, 1995).
Avndu-se n vedere i unele considerente practice, ambele grupe sunt
tratate separat, chiar dac taxonomic au suficiente elemente comune pentru
constituirea unui gen unic.
Tehnici mai noi, cum ar fi hibridarea acizilor nucleici, secvenierea
acizilor nucleici i proporia dintre bazele purinice i pirimidinice, au
demonstrat c ntre speciile genurilor Shigella i Escherichia exist deosebiri
foarte mari, ceea ce a impus descrierea lor ca genuri complet diferite.
Coninutul n guanin + citozin, exprimat n moli % difer semnificativ la
cele dou specii (Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, ed. IX,
1999; J.P. Euzby, List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature,
2009).
Genul Shigella cuprinde specii de bacterii Gram negative, imobile,
facultativ anaerobe, chemoorganotrope cu metabolism respirator i
fermentativ, care se deosebesc de restul enterobacteriaceelor prin
incapacitatea de a produce fenilalanindeaminaz, ureaze, hidrogen sulfurat,
lizindecarboxilaz, acetil-metil-carbinol i de a nu hidroliza malonatul i
esculina.
Conform Taxonomic outline of the Procariotic Genera, din
Bergeys manual of systematic bacteriology ediia a II-a (2001), ncadrarea
taxonomic a genului este urmtoarea:
Domeniul
Familia
Clasa III
Ordinul XIII
Familia
Genul

- Bacteria;
- B XII Proteobacteria;
- Gammaproteobacteria;
- Enterobacteriales;
- Enterobacteriaceae;
- Shigella.

n prezent Genul Shigella spp. este caracterizat ca o grupare de


Enterobacteriaceae, constituit din bacili imobili care fermenteaz glucoza
fr gaz, nu produc hidrogen sulfurat, ureaz, lizindecarboxilaz i fenilanindeaminaz, nu cresc pe medii cu citrat ca unic surs de carbon.
Producerea de indol, betagalactoxidaz i ornitindecarboxilaz sunt
teste ce difereniaz ntre ele speciile de Shigella.
Astzi sunt recunoscute speciile: Shigella dysenteriae (grupa A), Shi.
flexneri (grupa B), Shigella boydii (grupa C) i Shigella sonnei (grupa D).
11

Shigella sonnei, denumit de unii autori n trecut ca S. pseudodysenteriae, are activitatea metabolic cea mai bogat, fiind spre deosebire de
celelalte specii lactozo-pozitiv (tardiv), betagalactoxidaz prompt pozitiv
i constant productoare de ornitindecarboxilaz (Negu M, 1998).
La nivel mondial se estimeaz c numrul anual al toxiinfeciilor
alimentare umane, cu Shigella este de 6,5-8 milioane (Mahon C, Manuselis
G, 1995).
1.3. Ci de transmitere
Enterobacteriile din genul Shigella spp. sunt patogene numai pentru
om i primate non-umane, iar rspndirea lor este realizat exclusiv prin
aceste surse.
Contaminarea fecaloid intereseaz frecvent solul i apele de suprafa,
de unde se poate dispersa direct (irigaii) sau indirect (prin vectori: vegetale,
fructe, ape de suprafa, pete, fructe de mare i alte alimente), de unde
germenii pot ajunge la om (Adams M. R., Moss M. D., 1995).
Alimentele de origine animal sunt contaminate n timpul procesri
(surse umane) sau prin transportul i manipularea neigienic (vectori i alte
surse).
n funcie de anumite condiii, Shigella se poate izola din ap, alimente
sau chiar de pe obiecte (Ballows A et al, 1992).
Shigella alturi de Salmonella, Escherichia coli i Yersinia spp. au
fost n mod clar demonstrate ca patogeni enterici (Cunin P et al. 1999; Gray
DL, 1995).
Legumele i fructele se pot contamina cu Shigella n urma irigrii cu
ape poluate i prin manopere de recoltare, pstrare i distribuire neigienic
(Beuchat L R, 1996).
Shigella poate fi izolat din legumele contaminate, att n stare crud,
ct i din cele gtite (Frost J A et al., 1995).
ntruct acvacultura are o mare dezvoltare, contaminarea cu fecale a
apelor poate cauza infectarea cu Shigella a petilor i crustaceelor i apoi a
oamenilor prin consumul acestor vieuitoare (Bryan F. I. 1985).
Petii i alte animale marine pescuite/recoltate din ape de suprafa
contaminate consecutiv deversrilor de ape reziduale provenite din
canalizrile urbane, constituie o surs tot mai frecvent de contaminare a
oamenilor cu Shigella (Gessner BD i Beller M, 1994).
12

1.4. Caractere de cultivare


Medii uzuale i medii selective de cultivare.
Cultivarea pe astfel de medii permite o identificare preliminar.
Pe agar nutritiv Shigella se dezvolt n 24-48 ore de incubare i
formeaz colonii:
de tip S, de 2-3 milimetri n diametru, rotunde, circulare, nepigmentate,
netede;
de tip R, de 2-3 milimetri n diametru, rotunde, plate, cu suprafa
rugoas i margini neregulate.
n bulion simplu tulpinile se comport astfel:
cele de tip S tulbur mediul uniform fr depozit;
cele de tip R cu sau fr turbiditate, prezint inel i depozit.
Pe agar cu snge Shigella crete la fel ca i pe agarul nutritiv.
Pe agar MC Shigella formeaz colonii incolore, transparente, uor
opace.
Pe ADCL, Shigella dysenteriae tip 1 formeaz colonii mici cu nuane
roz, Shigella sonnei formeaz colonii iniial incolore, ns dup cteva zile
apar nuane roz deschis, datorit fermentaiei tardive a lactozei.
Pe HE, Shigella formeaz colonii verzi.
Pe EMB, Shigella formeaz colonii semitransparente, incolore sau
roz pal.
Morfologia coloniilor se observ prin iluminatul direct al plcilor.
Mediile selective nu permit dezvoltarea florei Gram pozitive;
Mediul MC permite dezvoltarea difereniat i a altor grupe de bacili
Gram negativi.
1.5. Structura antigenic
Grupele (sau speciile) de Shigella au fost extinse considerabil prin
identificarea mai multor tipuri diferite din punct de vedere antigenic.
Genul Shigella spp. cuprinde patru specii (serogrupe) cu 34
serotipuri:
Shigella dysenteriae (grup A);
Shigella flexneri (grup B);
Shigella boydii (grup C);
13

Shigella sonnei (grup D), denumit de unii autori n trecut S.


pseudodysenteriae (Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, ediia
a IX-a, 1999; Negu M., 1998).
Speciile acestui gen sunt bacterii Gram negative ce se dezvolt bine pe
agar MacConkey. Toate tulpinile de Shigella spp. sunt imobile.
Prin analiza de hibridare DNA-RNA, speciile de Escherichia coli i
Shigella spp. sunt similare fenotipic, cu excepia S. boydii.
Shigella sonnei are activitatea metabolic cea mai bogat, fiind spre
deosebire de celelalte specii, lactoz pozitiv (tardiv), betagalactoxidaz
prompt pozitiv i constant productoare de ornitindecarboxilaz.
Specia tip a genului este Shigella dysenteriae (Bergeys Manual of
Determinative Bacteriology, ediia a IX-a, 1999).
Shigelele fermenteaz glucoza fr formarea de gaz, nu produc
hidrogen sulfurat, ureaz, lizin decarboxilaz i fenilalanindeaminaz
(Jay M. J., 1988). Legturile evolutive a 46 tulpini de Shigella spp., care
reprezint fiecare dintre serotipurile aparinnd celor patru specii de Shigella
(subgrupele Dysenteriae, Flexneri, Boydii, Sonnei) au fost determinate prin
secvenionarea a opt gene (gene housekeeping), din patru zone cromozomale.
Au fost identificate trei grupe de tulpini, fiecare incluznd tulpini de la
diferite subgrupe.
Grupul 1 conine majoritatea tulpinilor de Shigella boydii i Shigella
dysenteriae (Bl-4, B6, B10, B14, B18, D3-7, D-9, D3-11), precum i de la
Shigella flexneri 6 i 6A.
Grupul 2 cuprinde ase tulpini de Shigella boydii (B5, B7, B9, B11,
B15,B16 i Bl7) i tulpini de Shigella dysenteriae 2.
Grupul 3 cuprinde o tulpin de Shigella boydii (B12) i tulpini de Shi.
flexneri, serotipurile 1-5.
Tulpinile de Shigella sonnei i trei tulpini de Shigella dysenteriae (D1,
D8 i D10) sunt n afara celor trei grupuri principale de gene. Shigella boydii
13 se pare c are legturi cu Escherichia coli (nrudite, dar mai ndeprtat).
Tulpinile de Shigella spp., ct i unele tulpini patogene de Escherichia coli
nu au avut o evoluie singular, ci convergent, aa cum arat proprietile
fenotipice ale Shigella (Picking W. L., Coye L., Osiescki J.C., Barnoski
Serfis A., Schaper E., Picking W.D. 2001).
Se estimeaz c cele trei grupuri principale de tulpini de Shigella sunt
cauza prezumtiv a celei mai timpurii boli diareice descrise la om nc din
antichitate.
Shigella fiind lipsit de cili (imobil) expune antigene somatice (O)
lipopolizaharidice care stau la baza identificrii serologice. Avnd specificiti
de grup sau de tip, acestea sunt folosite n scheme corespunztoare fiecrei
14

specii, ori serogrup, respectiv Shi. dysenteriae (grup A) 13 serotipuri, Shi.


flexneri (grup B) 6 serotipuri, Shi. boydii (grup C) 18 serotipuri i Shi. sonnei
(grup D) un singur serotip. Serurile destinate acestei tipizri sunt accesibile
i sunt utilizate mai frecvent n bacteriologia epidemiologic.
Majoritatea antigenelor O de la Shigella sunt identice sau nrudite
cu cele O de Escherichia. Din aceste motive identificarea biochimic,
respectiv ncadrarea n gen, trebuie s precead obligatoriu tipizarea
serologic.
Inconstant, la Shi. dysenteriae, Shi. flexneri i Shi. sonnei pot fi prezente
antigene de suprafa K, termolabile, ce pot include inaglutinabilitatea
O unor tulpini. Inactivarea timp de o or la 100C determin redobndirea
aglutinabilitii O.

1.6. Patogenitate
Elementele de patogenitate induse de Shigella spp., ca i cele produse
de Escherichia coli enteroinvaziv (EIEC) se datoreaz capacitii acestor
microorganisme de a invada epiteliul intestinal, de a se multiplica intracelular
i de a se rspndi de la o un enterocit la altul (Morris J. G. Jr. Ferreccio C.,
Garcia J., Lobos H., Black R. E., Rodriguez H., Levine M.M., 1984, Page
A. L., Ohayon H., Sansonett, P. J., Parsot C., 1999).
Capacitatea de a invada celulele epiteliale a fost demonstrat deopotriv
i pe modele experimentale pe animale i in vitro. Aceast capacitate se
poate verifica pe culturi celulare HeLa, prin numrarea coloniilor dezvoltate
n monostrat. Variantele de Shi. flexneri care nu au fost capabile s invadeze
culturile celulare, nu au determinat mbolnviri experimentale la maimu.
Hibrizii de Shi. flexneri 2a i Escherichia coli K12, capabili de a adera
i invada celulele epiteliale i incapabili de se multiplica intracelular s-au
dovedit nepatogeni la maimuta Rhesus (Kumene N F et al., 1999).
Nu este ns suficient ca Shigella s invadeze i s se multiplice
intracelular pentru a aprea leziunile caracteristice i pentru a declana
fenomenele clinice.
Mutante de Shigella, capabile de a invada i a se multiplica intracelular,
s-au dovedit nepatogene, ntruct nu aveau capacitatea de a se transmite de
la o celul la alta (Sandlin R. C., Maurelli A. T., 1999).
Aceste capaciti, care reprezint totodat markeri de virulen, sunt
expresia capabilitilor bacteriei, reglate genetic n succesiunea actului
patogenic. Controlul genetic al invazivitii este multifactorial, necesitnd
participarea ambilor determinani: plasmidic i cromozomal.
n ansamblu acest control este reglat de temperatura ambiental. La
15

temperaturi sub 30C mecanismele genetice ale invazivitii sunt inactive


(Maguire HC et al., 1998).
O gen cromozomal vir R (hus) codific un represor al exprimrii
virulenei, n timp ce alte dou gene (vir F i vir B) codific activatorii
virulenei. Reglarea termic acioneaz la nivel transcripional, categoria de
gene activatoare devenind funcional numai la 37C.
Participarea determinanilor plasmidici este dominant n reglarea
invazivitii. Dou plasmide mari de 180 Kb la Shi. sonnei i 220 Kb la Shi.
flexneri sunt indispensabile invaziei (Mc Cormick B H et al., 1999).
Un grup de gene Ipa B, C, D, A (invasion plasmid antigens) sunt
eseniale pentru invadarea celulelor epiteliale de mamifere.
Produsele acestor gene sunt proteine asociate membranei externe
a celulei bacteriene i au rol n transmiterea semnalului ce precede
internalizarea shigelelor n celula gazd.
O alt gen Ipg C (invasion plasmid gene) este necesar n invazie,
prevenind ca Ipa B i Ipa C s formeze complexe n citoplasm bacterian.
Proteinele Ipa sunt secretate continuu n mediu. Cantitatea lor crete la
contactul bacteriei cu celula gazd i probabil ele joac un rol n generarea
semnalelor necesare ncorporrii de ctre enterocit. Produsul genei Ipa B
se consider c ar fi responsabil de liza vacuolei ce conine bacteria dup
internalizarea acesteia.
Aceeai protein litic produs de Ipa B induce i apoptoza n
macrofagele infectate.
Un grup de gene Mxi/spa (membrane expression of invasion plasmid
antigens) secret peste 20 proteine care controleaz secreia proteinelor Ipa
i alte proteine de virulen asemntoare celor de la Salmonella sau Yops
de la Yersinia. Acest tip de virulen protein-dependent este recunoscut
astzi ca elementul esenial al patogenezei bacteriene la animale i plante
(Edwards B H, 1999).
Un alt grup de gene desemnat Ies A (intracellular spread) nu are
relaie cu invazia ns este esenial pentru motilitatea intra i intercelular
(Makino i col, citat de Mahon C, Manuselis G., 1995). Proteinele Ies A sunt
aezate la un singur pol al bacteriei. Polimerizarea monomerilor de actin sub
influena lor reprezint fora care mpinge bacteria prin citoplasm. Sinteza
unui lipopozaharid (LPS) complet n peretele bacterian este responsabil
pentru localizarea unipolar a proteinelor Ies A. LPS necesit locusuri
specifice active (respectiv rfa i rfb) pe cromozomul bacterian.
De asemenea alte locusuri cromozomale codific aerobactina, protein
esenial pentru multiplicarea intracelular a shigelelor i superoxid
dismutaza ce inactiveaz radicalii superoxid, protejnd astfel bacteria de
16

mecanismele celulare de aprare.


Temperatura poate influena desfurarea mecanismului invaziv. La
temperaturi mai mici de 30C, mecanismele genetice ale invazivitii devin
inactive. Reglarea termic acioneaz la nivel transcripional, categoria de
gene activatoare devenind funcional numai la 37C.
O gen cromozomal vir R (hus) codific un represor al exprimrii
virulenei, n timp ce alte dou gene (vir F i vir B) codific activatorii
virulenei.
n reglarea invazivitii, un rol dominant l dein determinanii
plasmidici. Pentru invazie, plasmidele de 180 Kb, la Shigella sonnei i la
220 Kb, la Shi. flexneri (plasmide mari) sunt indispensabile.
Eseniale pentru invadarea epiteliului intestinal al mamiferelor sunt
genele Ipa, A, B, C, D (Invasion Plasmid Antigens). Aceste gene produc
proteine asociate membranei externe a celulei bacteriene i ndeplinesc
rolul de transmitere a semnalului care precede ptrunderea shigelelor n
celula gazd.
n invazie, un rol important l are i gena Ipg C (Invasion Plasmid
Gene), aceasta prevenind ca genele Ipa B i Ipa C s formeze complexe n
citoplasma bacterian.
Gena Ipa D este responsabil de ataarea unui receptor, specific la
celula gazd. Genele Ipa D i Ipa C induc endocitarea bacteriei. Genele Ies
A i Ies B (Intracellular Spread) favorizeaz rspndirea intracelular.
Capacitatea de invadare a fost demonstrat pe modele experimentale
pe animale i in vitro.
Shigelloza este considerat boal autolimitant la aduli, dar poate fi
fatal la copiii malnutrii.
Alturi de particularitile reactive ale gazdei, severitatea bolii depinde
esenial de virulena tulpinii infectate.
Unele shigele exprim n bulion CYE (Casamino Acids Yeast Extract)
o hemaglutinin celular de suprafa. Microscopia electronic a Shigella
dysenteriae 1, Shi. flexneri 2a, Shigella boydii 12 i a Shigella sonnei 1,
crescute n bulion CYE a evideniat acest strat celular care provoac
aglutinarea eritrocitelor. Subcultivarea repetat a Shi. boydii, Shi. sonnei i
a tulpinilor hemaglutinante negative de Shi. dysenteriae i de Shi. flexneri,
pe buliuonul CYE, induce proprieti adezive i hemaglutinante. Acestea
pot fi inhibate de sodiul periodat, de acidul N-acetilneuraminic i de alfaglicoproteine, dar nu i de proteaze. Acest strat extracelular extras de pe
suprafaa celulelor de Shigella spp. are proprieti hemaglutinante ca i
lipopolizaharidul obinut de la aceleai tulpini, cu excepia Shi. dysenteriae
1 (Hale T.L., 1991).
17

Studii funcionale au artat rolul potenial dual al funciilor miozinei


i modulului GAP al Myr 5 pentru internalizarea bacteriei.
Myr 5 este fixat n punctele de intrare a bacteriei. Modul de fixare
seamn cu cel al Rho C sau al ezerinei, dar nu cu cel al Rho A, Rac sau
CDC 42, pe cnd, in vitro, activitatea GAP a Myr 5 este asemntoare cu
Rho A, B sau C.
n procesul de internalizare bacterian, n celulele epiteliale intestinale
este implicat o miozin din clasa IX i un antagonist Rho, i anume o
protein activatoare a GTP-azei (GAP), adic Myr 5.
Analiza unor mutante de Myr 5 a artat c activitatea de cuplare a
GTP-azei i a ATP-ului nu sunt necesare pentru fixarea acestei miozine
atipice induse de Shigella la locul de internalizare a bacteriei. Aadar,
Shigella induce rearanjri citoscheletale, asociate internalizrii (Graf B. et
al., 2000).
La locul de interaciune bacterie - celul gazd, Shigella induce
reorganizarea citoscheletal. Aparatul secretor de tip III al shigelelor
permite inseria unui por care conine proteinele Ipa B i Ipa C n membrana
celulei, inserie care permite translocarea captului terminus carboxi al Ipa
C, dar i al altor efectori ai shigelelor, cum ar fi Ipa A n citosolul celulei.
Ipa C declaneaz polimerizarea actinei i formarea extensiei filopodiale
i lamelipodiale dependente de GTP-azele CDC 42 i Rac. Ipa A, pe de
alt parte, induce depolimerizarea filamentelor de actin. Ipa A i GTPaza Rho nu sunt necesare pentru polimerizarea actinei la locul de contact
bacterie-celul gazd, dar permite transformarea extensiilor induse de
Ipa C ntr-o structur necesar internalizrii ei. Rho este necesar pentru
fixarea la locurile de intrare a ezerinei, un liant citoscheletal necesar pentru
internalizare, dar i pentru tirozinkinaza Src. Activitatea tirozinkinazei Src,
necesar inducerii de ctre Shigella a polimerizrii actinei, este implicat
de asemenea i n rspunsul regulator, care coordoneaza activitatea Rho la
locul de intrare (Tjoa WS et al., 1997).
Sistemul secretor de tip III Mxi-Spa este necesar i pentru evadarea
bacteriilor din formaiunile de protrusie. Vacuolele cu membran dubl
(double-membrane-bound vacuoles) Ipa secretate via Mxi-Spa sunt
necesare n protrusia vacuolei, servind la liza dublei membrane (Sansonetti
PJ, 1992).
Sistemul regulator format din dou componente PhoP/PhoQ controleaz transcripia mai multor gene virulente eseniale pentru supravieuirea
Shi. flexneri n fagozomul din celula gazd, chiar i atunci cnd acest agent
patogen scap din fagozom n citoplasma celulei gazd.
O mutant PhoP de Shigella a determinat infecia i a indus un rspuns
18

inflamator acut pe dou modele experimentale pe animale diferite. Aceast


infecie s-a stins mult mai repede dect o infecie cu tipul slbatic de Shigella.
Gena mutant a fost mai sensibil la aciunea leucocitelor polimorfonucleare
(PMNs) i la alte peptide antimicrobiene extrase de la animale. Mutanta
PhoP se rspndete intracelular, induce apoptoza macrofagelor i tolereaz
pH-urile acide extreme, ca i tulpina slbatic. Se consider c ea regleaz
susceptibilitatea bacteriei la moleculele antimicrobiene i la celule
polimorfonucleare, aspect important pentru stadiile trzii ale infeciei.
Shigelele ataate la celulele epiteliale foliculare i folosesc proprietile
endocitolitice pentru a intra n celule, unde o dat ajunse i lizeaz vacuola
endocitar i coopteaz actina i miozina pentru a forma o elice, care s
le propulseze pentru a putea penetra n continuare epiteliul prin suprafaa
bazolateral (Sayeed S et al., 2000).
Cei mai cunoscui determinani ai virulenei shigelelor sunt codificai,
n majoritate, ntr-o plasmid mare, unic, la tulpinile virulente de Shigella
spp. i de Escherichia coli enteroinvaziv, aceste gene ocupnd 30-35% din
plasmida de virulen (Tsinzerling VA et al., 1997; Summary of Notifiable
Diseases in USA, 1994).
Pentru Shi. flexneri 5a prin analiza secvenial complet a fost
determinat mrimea plasmidei de virulen: 210 Kb. S-au descoperit
286 locusuri de inserie (ORFs open reading frames). 53% dintre ele au
legtura cu secvenele de inserie (IS). Nu se cunoate nici o alt plasmid
care s aib o asemenea proporie de elemente IS. 50 de proteine putative
nu au artat o asemnare semnificativ cu proteinele cu funcie cunoscut.
Dintre acestea 18 au un coninut n guanin / citozin mai mic de 40%, tipic
pentru genele virulente cunoscute din plasmid. Cele 18 proteine constituie
gene potenial virulente necunoscute. Dou alele ale Shet 2 i cinci alele ale
Ipa H au fost i ele determinate n plasmid. Astfel, o analiz secvenial
complet permite o caracterizare mai exact a noi poteniali determinani ai
virulenei bacteriilor genului Shigella spp. (Vaida T et al., 1996).
Shi. flexneri invadeaz celulele epiteliului intestinal prin internalizare
i diseminare. Principalii efectori ai intrrii, Ipa B i Ipa C, sunt necesari
i pentru activitatea hemolitic i eliberarea din fagozomi n macrofagele
infectate. Aceste proteine sunt stocate n citoplasm n asociaie cu Ipg C,
nainte de producerea lor de ctre un aparat secretor de tip III activat de
ctre celulele gazd. Astfel, pentru o diseminare eficient, alturi de Ipa B
i Ipa C, un rol important l are i Ipg C (operon citoplasmatic). Analizele
de microscopie electronic a celulelor infectate au artat c aceste proteine
au fost necesare pentru liza membranei (protruzie) i pentru rspndirea de
la o celul la alta (Ollinger-Snyder R i Matthews ME, 1996).
19

Studii recente au artat c migraia transepitelial indus de Shi.


flexneri leucocitelor polimorfonucleare este inhibat de cadaverin, care
este activat prin decarboxilarea lizinei. Shigella spp. devine patogen prin
achiziionarea genelor de virulen i prin tergerea celor de nevirulen.
Folosind monostrat de celule T84 care imit epiteliul intestinal uman s-a
indus nglobarea Cad A (protein care encodeaz lizindecarboxilazei) n Shi.
flexneri, iar exprimarea acesteia a atenuat capacitatea bacteriei de a induce
influxul de polimorfonucleare n epiteliul model, pe cnd asupra aceleiai
proprieti de a induce migrarea polimorfonuclearelor la Salmonella i
la Escherichia coli enteropatogeni nu a avut nici un efect. Toate acestea
sugereaz folosirea potenial a cadaverinei n tratamentul dizenteriei
(Matsumoto M., Suzuki Y., Saito M., Yshikawa N., Ohta M, 1998).
Dei capacitatea de invazie a Shigella spp. este limitat pe traiectul
tubului digestiv, colitele cauzate de bacterie sunt relativ rare.
Penetrarea celulelor epiteliale de ctre shigele este caracterizat de o
reorganizare temporar a citoscheletului la locul interaciunii cu bacteria,
ceea ce conduce la nglobarea bacteriei prin procesul de macropinocitoz.
S-au efectuat studii care au artat c receptorul hialuronic CD44 se asociaz
cu Ipa B, protein secretat dup contactul cu celula. Studiul a folosit
afinitatea cromatografic pe extracte de celule He La i a demonstrat c Ipa
se leag direct la domeniul extracelular al CD44.
Experimentele de imunoprecipitare au artat i ele asocierea Ipa B
cu CD44 n timpul internalizrii shigelelor. CD44 este fixat la locurile de
intrare ale bacteriei i se localizeaz pe membrana plasmatic a extensiilor
celulare induse de Shigella spp. Efectul CD44 de cretere a vitezei formrii
legturilor bacterie-celul i de internalizare sunt mult diminuate prin
pretratarea celulelor cu anticorpi monoclonali; acetia inhib i reorganizarea
citoscheletal indus de Shigella spp. Aadar, interaciunea Ipa B-CD44
este necesar desfurrii mecanismului invaziv prin iniierea primilor pai
ai procesului de intrare n celula gazd (Sears and Kaper, 1996).
Ipa B (factor plasmidial de virulen, invazional) este necesar tuturor
evenimentelor eseniale din cursul patogenezei infeciilor produse de Shigella
spp.: invazia celulelor, eliberarea din fagozomi i inducerea apoptozei
macrofagelor. Inducerea apoptozei este dependent de cuplarea Ipa B cu
cystein - proteozo-caspase 1 (Casp 1). Activarea acestei enzime induce att
apoptoza, ct i eliberarea citokinei proinflamatorii inter-leukin l-beta. S-a
demonstrat c poriunea N-terminal a Ipa B este necesar pentru stabilirea
expresiei Ipa B. Un domeniu putativ alfahelicoidal se pare c ar conserva
structurile Ipa B. S-au gsit 10 terminaii consecutive, cu terminaie aminic
a regiunii hidrofobe, care joac un rol n invazie, eliberarea din fagozomi i
20

citotoxicitate. Studiile au artat c asocierea Ipa B-Casp 1 este doar un pas


n declanarea apoptozei macrofagelor (Guichon A et al., 1997).
Se consider c o protein de virulen este responsabil de
glomerulonefrita indus de Shi. flexneri (Mugochi T et al., 1999).
Sistemul secretor Mxi Spa de tip III al Shi. flexneri direcioneaz de
la locul de contact o serie de invazine (Ipa s). S-a artat c Spa 33 este un
element mobil din cadrul Mxi Spa care exercit un control al translocrii Ipa
n interiorul i n afara poziiilor membranei externe (OM-outer membrane)
ale structurii secretorii. Spa 33 este un substrat al Mxi Spa care este translocat
pe suprafaa celulei bacteriene dup inducerea secreiei de Ipa.
Dintre proteinele efectoare (Ipa) ale Shi. flexneri, numai C are activiti
cuantificabile in vitro care au legturi cu invazivitatea (Thurston F L et al.,
1998).
S-au efectuat studii genetice ale aparatului secretor de tip III, Mxi Spa
i ale proteinelor Ipa A-D, care sunt encodate ntr-o plasmid de virulen.
Studii secveniale ale plasmidei de virulen pWR 100 a Shi. flexneri, tulpina
M90T (serotipul 5) au permis identificarea genelor care encodeaz aceste
proteine i au artat c acest aparat secret circa 25 de proteine.
Analiza coninutului n guanin i citozin, mpreun cu alte informaii
despre localizarea i funciile acestor proteine au artat pWR100 conine
blocuri de gene cu origini variate, dintre care unele au fost iniial purtate de
patru plasmide diferite (Buchrieser C et al., 2000).
Dintre componentele mecanismului secretor de tip III al shigelelor
compus dintr-o parte bazal i un vrf, care conine Mxi D, Mxi G, Mxi
J, Mxi H Spa 47, s-a demonstrat c MxiH este componenta de vrf cea
mai important, fiind esenial n eliberarea proteinelor efectoare cu un rol
deosebit n creterea invazivitii. n translocaia invazinei un rol important
l deine i Mxi M, o lipoprotein extramembran (Skoudy A et al., 2000).
Shi. flexneri are i ea o plasmid de virulen mare, pMYSH 6000, care
encodeaz un sistem killing postsegregaional (PSK) eficient (Sansonetti PJ
et al, 1982).
Studii recente au ntrit ipoteza conform creia concentraia vir F
(virulence-related-transcriptional-regulator) este factorul critic al reglrii
virulenei la Shigella spp., precum i faptul c rolul sistemului translaional
bacterian n reglarea exprimrii genelor de virulen este la fel de important
ca i reglarea n bune condiii a nivelului transcripional. Modificarea RNA t,
temperatura i superhelicitatea au aceeai int - expresia vir F - influeneaz
exprimarea genei regulatoare centrale vir B i astfel a virulenei bacteriei.
Date recente arat c exprimarea citocromului bd, unul dintre cele dou
oxidaze terminale ale lanului respirator microbian care reduce oxigenul
21

molecular la ap, este absolut necesar pentru supravieuirea intracelular i


pentru exprimarea virulenei la Shi. flexneri (Durand JM et al., 2000).
Localizarea unipolar a Ies A pe suprafaa Shi. flexneri este necesar
pentru formarea eficient a cozilor de actin i pentru protrusia n celulele
eucariote infectate. S-a demonstrat c localizarea unipolar a Ies A n Shi.
flexneri 2a nu depinde de determinanii plasmidici ai virulenei (Rducnescu
FL i Bica Popii V., 1986).
n exprimarea patogenitii bacteriilor enteroinvazive, un rol important
l joac i apy-aza, apy fiind un locus din plasmid de virulen a crui
expresie poate fi controlat de temperatur (induce sinteza la 37C i o
represeaz la 30C) i de cascada vir F, vir B. Produsul genei apy este apyaza (ATP-difosfohidrolaza), (Berlutti R et al., 1988).

1.7. Epidemiologie
n 2006, au fost raportate 6.513 cazuri de shigeloz de ctre 26 state
membre ale UE i state EEA/EFTA (Danemarca, Frana, Italia i Liechtenstein
nu au raportat). Dintre acestea 6.410 au fost confirmate i rata notificrii
medii la nivelul UE a fost de 1,7 la 100.000 locuitori. Aceste date sunt cu
24% mai mici dect raportrile din 2005 ale acelorai ri. Cea mai mare
rat a notificrilor a fost realizat de Bulgaria (11,4 la 100.000 locuitori),
Slovacia (8,1 la 100.000 locuitori), Lituania (5,9 la 100.000 locuitori) i
Suedia (4,7 la 100.000 locuitori). Raportul cazurilor de shigeloz importate
versus domestice variaz substanial de la o ar la alta. n Finlanda, Suedia,
Norvegia, Olanda, Irlanda, Germania i Regatul Unit, 63%-92% din cazurile
de schigeloz sunt considerate de import sau asociate cltoriilor. Aceasta
este n contrast cu ri precum Grecia, Slovenia, Slovacia i Ungaria, unde
87-100% din cazuri sunt domestice.
Tabelul 1.1.
Numrul i rata notificrilor cazurilor de shigeloz uman n UE i EEA/
EFTA, n 2006 (Centrul European Pentru Prevenirea i Controlul Bolilor, 2008)
ara

Tipul de raportare

Total cazuri

Cazuri confirmate

Nr. cazuri per


populaii de
100.000 de oameni

Austria
Belgia
Bulgaria
Cipru
Republica Ceh
Danemarca
Estonia

C
U
A
C
C
U
A

77
305
879
2
289
53

77
305
879
0
276
53

0,93
2,9
11,4
0,26
2,7
3,9

22

ara

Tipul de raportare

Total cazuri

Cazuri confirmate

Finlanda
Frana
Germania
Grecia
Ungaria
Irlanda
Italia
Latvia
Lituania
Luxembourg
Malta
Olanda
Polonia
Portugalia
Romnia
Slovacia
Slovenia
Spania
Suedia
Marea Britanie
Total UE
Islanda
Liechtenstein
Norvegia
Total

C
U
C
C
C
C
U
C
A
C
U
C
A
C
C
C
C
C
C
C

74
814
30
93
54
87
203
13
0
256
35
2
559
465
43
148
429
1425
6375
0
138
6513

74
814
26
73
53
73
203
13
0
248
30
1
559
436
36
148
429
1425

C
N
C

Nr. cazuri per


populaii de
100.000 de oameni

0
138
6410

1,4
0,99
0,23
0,72
1,3
3,2
5,9
2,8
0,0
1,5
0,08
0,1
2,6
8,1
1,8
0,34
4,7
2,4
1,71
0,0
3,0
1,73

Sursa: Raportri naionale. A = Raportri de date agregate; C = Raportri bazate pe cazuri; - = fr raportare; U = nespecificat

Distribuia shigelozelor pe grupe de vrst i sex


Rata notificrilor a fost cea mai mare la grupa copiilor cu vrsta ntre
0 i 4 ani, cu 7,1 cazuri la 100.000 locuitori. Bulgaria i Slovacia au avut
rate ale notificrilor mult mai mari, de 148,7 i respectiv 90,0 la 100.000
locuitori la grupa de vrst 0-4 ani.
Numai cteva state, cum ar fi Finlanda, Olanda i Germania au avut
cele mai mari rate ale notificrilor la grupa de vrst 25-44 ani.
Nu au fost semnalate diferene semnificative ale ratelor de notificare
n funcie de sex: din 4.514 cazuri cercetate brbaii au avut rata medie
a notificrii de 1,3 la 100.000 locuitori, iar la femei de 1,4 la 100.000
locuitori.
23

Cazuri/100.000

Figura 1.1.
Distribuia pe grupe de vrst a cazurilor de shigeloz uman n EU i EEA/
EFTA n 2006 (n=142325 cazuri)
(Centrul European Pentru Prevenirea i Controlul Bolilor, 2008)

Sursa: Raportri naionale. Austria, Belgia, Bulgaria, Cipru, Republica Ceh, Estonia, Finlanda, Germania,
Grecia, Ungaria, Irlanda, Latvia, Luxembourg, Olanda, Portugalia, Slovacia, Slovenia, Spania, Suedia, M.B., i
Norvegia. Malta i Islanda au raportat 0 cazuri

Sezonalitatea
Un vrf al numrului total de cazuri raportate a fost observat spre
finalul verii i n lunile de toamn.
Shigeloza nc are un impact major asupra copiilor de vrst foarte
mic, cu o rat a notificrilor maxim la grupa 0-4 ani. n statele unde
rata maxim a notificrilor a fost la grupele de vrst mijlocie, acestea
au fost cel mai adesea asociate cltoriilor, iar la aceste state majoritatea
cazurilor raportate au fost de import. De asemenea, variaia de la tiparul
sezonier general observat n unele state se poate datora tot cazurilor asociate
cltoriilor, din timpul vacanelor de iarn.
1.8. Manifestri clinice
Tabloul clinic de baz are dou forme de manifestare: diareea apoas
asociat cu vom i deshidratare sau cu dizenterie (volum mic al fecalelor,
cu mucus, snge, crampe i tenesme), (Djuretic T, col., 1996; Guerrant L.R.,
1995).
Semnele clinice apar la 24-48 ore de la ingerare n infecia acut,
cu limite ntre 7 i 36 ore, pn la 1-7 zile n transmisiile nealimentare.
Durata bolii este n medie de 7 zile la adulii tratai i pn la 30 zile la cei
netratai.
24

Dizenteria cauzat de Shigella spp. este marcat de penetrarea celulelor


epiteliului intestinal, cu ataarea shigelelor la suprafaa mucoaselor. Urmeaz
inflamaia local, cu descuamarea celulelor epiteliului intestinal i formarea
de ulcere. Inflamaia intestinului (colonului) este mediat de citokine, care
produc necroza epiteliului intestinal. Germenii se multiplica mai nti n
intestinul subire, apoi se mut n colon, de unde pot fi izolai n 1-3 zile de
la debutul clinic al infeciei (Schuch R., Maurelli A.T., 2001).
Studiile efectuate pe voluntari arat c infecia poate fi provocat
chiar i dup ingerarea unui numr redus de bacterii, cuprins ntre 10 i 100
microorganisme patogene.
La copii, diareea poate dura ntre 3 i 5 zile (evoluie scurt), 6-9 zile
(evoluie medie) i mai mult de 9 zile (evoluie cronic).
Una dintre cele mai severe complicaii este ileusul, obstrucie
intestinal nsoit de balonarea abdomenului, prin blocarea tranzitului, care
poate duce la megacolonul toxic.
O alt complicaie este glomerulonefrita acut produs de Shi. flexneri,
nsoit de evidenierea unei proteine sub form de complexe imune
(Mugochi T. et al., 1999).
Una din complicaiile tardive, deloc de neglijat, aprut dup infecia
cu Shigella, la cea 3% din bolnavi, este sindromul Reyter, manifestat prin
artrit reactiv dureroas, uretrit i conjuctivit.
1.9. Sensibilitatea fa de factorii de mediu
Sensibilitatea shigelelor la factori fizici i chimici
Shigelele rezist un timp scurt n condiii de aciditate extrem (pH
2,5); la cldur, inactivarea se produce n 10 minute la 58-60C, iar la
lumin solar direct mor n cel mult 60 minute. Supravieuiesc n mediul
nconjurtor aproximativ 60 de zile la temperaturi sub 0C, iar la uscciune
maximum 20 de zile.
Shigelele sunt enterobacterii cu rezisten sczut, comparativ cu flora
fecaloid saprofit din alimente i din mediul natural. Din aceast cauz
probele de la pacieni i prelevatele alimentare trebuie prelucrate imediat
sau conservate n medii speciale, sau prin crioconservare (-20C).
n diferite alimente (lapte, brnzeturi, ou, crustacei, molute, suc de
roii) inoculate experimental cu un numr mare de germeni, shigelele au
supravieuit perioade de timp variind de la 3 sptmni la 3 luni.
n lapte inoculat experimental, Shi. flexneri s-a multiplicat semnifi
cativ la temperaturi de 19-37C, ns creterea a fost observat i la niveluri
25

mai joase 12C.


Rezistena shigelelor n condiiile mediului extern este mai redus ca a
salmonelelor, dar pot supravieui un timp suficient de lung pentru a asigura
transmiterea infeciei.
Unele specii de Shigella (Shi. flexneri, Shi. sonnei) pot contamina
laptele prin intermediul mutelor, prin minile mulgtorilor, procesatorilor
sau prin apa poluat cu dejecii umane. Multiplicarea shigelelor este mai
intens n laptele pasteurizat din cauza lipsei florei concurente.
Rezistena shigelelor la antibiotice
Rezistena shigelelor la antibiotice este condiionat de uurina cu care
aceast grupare achiziioneaz i transfer plasmidial rezistena multipl.
Rezistena intrinsec, adic rezistena unui grup dat la un anumit
antibiotic este rar la genul Escherichia i Shigella. Susceptibilitatea
varietilor izolate difer foarte mult i de aceea antibiogramele sunt folosite
adesea ca markeri epidemiologici. Aceast rezisten non-intrinsec este
uzual mediat plasmidic (Du Pont H.L., 1995; Edwards BH., 1999).
Din cauza folosirii curente n clinica uman a unui numr mare de
antibiotice, Shigella spp. a devenit progresiv rezistent la cele mai rspndite
i mai accesibile antibiotice (tabelul 1.2).
Tabelul 1.2
Susceptibilitatea shigelelor la acidul nalidixic i la cele mai noi quinolone
(Toppley i Wilsons, sistematic Bacteriology, 1990)
Perioada

ara

Nr. cazuri
tratate

1977-1979
1984-1987

Suedia

43

M.B.

120

Antibioticul

Suscepti
bilitatea (%)

Autorul

100

Houstonetal. (1981)

1984-1989
Olanda
1985-1986
Elveia
1985-1986
SUA
1985
Bangladesh

1313
107
252
91

Acid nalidixic
Acid nalidixic
Quinolone noi
Acid nalidixic
Acid nalidixic
Acid nalidixic
Acid nalidixic

1986
Bangladesh
1987
Bangladesh
1987-1992
Israel

515
58
262

Acid nalidixic
Acid nalidixic
Acid nalidixic

68,7
40,0
98,1

Munshietal. (1987)
Munshietal. (1987)
Admonietal. (1995)

1989-1990 Germania

255

Acid nalidixic

100

Aleksieetal.(1993)

100

Lingetal. (1988)

99,8
98,0
99,6
100

Voogaletal. (1992)
Altweggetal. (1986)
Tauneetal. (1990)
Musnshictal.(1987)

Dobndirea uoar a rezistenei de la alte enterobacterii comensale,


poate face ineficient terapia iniial (intit prin testarea sensibilitii),
26

iar pe de alt parte poate induce enterobacterii rezistente implicate apoi n


complicaii secundare, reducnd gama antibioticelor active n terapie.
n terapia shigelozelor la om sunt recomandate trimetoprim, sulfametoxazolul i quinolonele de toate generaiile, deoarece scurteaz evoluia
i portajul cronic.
Fenomenul rezistenei transferabile, semnalat de Watanabe, 1963,
citat de Brzoi D., Meica S., Negu M., 1999, s-a extins mult, fiind raportat
n procent ridicat n unele zone geografice (Mexic, America Central,
Asia, India i Africa). Aceast rezisten multipl dobndit la sulfamide,
cloramfenicol, ampicilina i tetraciclin are dublu impact terapeutic.
Rezistena shigelelor n alimente, ap i alte suporturi biologice
ntruct habitatul normal al shigelelor este tractul intestinal al omului
i maimuelor superioare, rspndirea acestora n natur este limitat
aproape exclusiv la om. Alimentele i sursele de ap contaminate de om au
semnificaie de principal vector nespecific.
Alimentele care nu sunt acide sau prea uscate sunt surse de risc potenial
pentru mbolnvirea omului, ntruct aceti germeni pot supravieui i se
pot multiplica pe acest substrat.
Cu toate c rezistena n condiiile mediului extern este mai redus
dect a salmonelelor, shigelele pot supravieui un timp suficient de lung
pentru a asigura transmiterea infeciei.
n apele poluate shigelele triesc 2-4 zile, iar n apa sterilizat, infectat
experimental, 10-12 zile.
Pe alimentele cu pH apropiat de neutru acestea supravieuiesc i se
nmulesc. De exemplu, Shi. flexneri a putut fi izolat din icrele de Manciuria
cu pH 5,5 i concentraie de sare de 6%.
n produsele n care shigelele se afl n asociaie cu Escherichia coli
supravieuiesc puin timp, ntruct sunt sensibile la produsele de metabolism
ale acestei bacterii i, desigur, sunt sensibile i la acidifierea substratului,
produs de Escherichia coli.
Shigelele au rezisten sczut la flora fecaloid sau saprofit din
alimente sau din mediul natural.
n lapte, brnzeturi, crustacei, molute, suc de roii, ou, etc. shigelele
supravieuiesc ntre 3 sptmni i 3 luni.
n vinurile roii i albe, precum i n vinul Mukumbi (vin tradiional din
Zimbabwe), s-a observat c shigelele mor rapid, fenomen datorat aciditii
mai ridicate.
S-a observat c shigelele nu pot supravieui nici n pudra de sorg sau
27

n porrigde-ul fermentat sau gtit.


Potenialul shigelelor de a se multiplica pe alimente la temperaturi
de pn la 10C explic de ce unele alimente, iniial contaminate cu un
numr subinfectant de germeni sunt implicate n declanarea toxiinfeciilor
alimentare.
Shigelele pot supravieui i se pot multiplica i pe zarzavaturile crude
contaminate fie prin apa de la irigaii, fie prin manipularea lor neigienic de
ctre muncitorii purttori de germeni.
n praful uscat shigelele rezist aproximativ 10 zile, iar pe lenjerie
peste 2 sptmni.
n ap la temperatura de 7-10C shigelele supravieuiesc aproximativ
9 zile, iar n alimente 1-2 sptmni. n apa ngheat triesc circa 2 luni.
1.10. Prelevarea, ambalarea, transportul i conservarea probelor de
alimente de origine animal destinate investigaiilor microbiologice
Recoltarea, ambalarea, pstrarea i transportul probelor de alimente
de origine animal destinate examenelor microbiologice, trebuie s respecte
unele reguli procedurale obligatorii privind organizarea, prevzute n
Normele Ministerului Sntii.
Proba prelevat trebuie s fie reprezentativ i, dac este posibil, n
cantitate suficient pentru efectuarea tuturor investigaiilor necesare.
n toate manoperele se va evita contaminarea suplimentar a probei cu
ali germeni sau diveri ali ageni poluani care nu sunt implicai etiologic
n cazul cercetat, astfel nct rezultatul final al examenului de laborator s
nu fie denaturat sau influenat.
Trebuie subliniat obligativitatea ca toate probele trimise pentru
investigaii de laborator s fie expediate sigilat pentru pstrarea integritii
lor, cu not de nsoire completat detaliat i semnat de cei care au solicitat
examenul. n interiorul coletului se va introduce un exemplar al avizului de
identificare al fiecrui produs n parte, de asemenea, semnat de fiecare din
factorii autorizai.
Probele se recolteaz din unitile productoare, depozite, mijloace
de transport, reeaua de desfacere sau, n cazuri speciale, de la domiciliul
cumprtorului sau productorului unor asemenea produse, precum i de la
bolnavii suspeci de toxiinfecie alimentar.
Recoltarea probelor se face de ctre un medic veterinar oficial de
stat sau de ctre o persoan mputernicit de lege i de medicii care acord
asisten clinic bolnavilor suspeci de toxiinfecie alimentar.
nainte de recoltarea probelor, medicul veterinar trebuie s se
28

informeze amnunit asupra produsului ce urmeaz a fi expertizat, unitatea


productoare, data fabricrii, condiiile igienico-tehnologice de fabricare,
depozitare, transport sau desfacere, rezultatele controalelor sau analizelor
de laborator efectuate pn la acea dat, aspectul general al produsului sau
lotului, starea ambalajului, modul de etichetare sau tanare, dac asupra
produsului respectiv au existat litigii i modul de soluionare a acestora,
dac produsul se afl n termenul de valabilitate, etc.
Probele recoltate trebuie s fie reprezentative, s reproduc n mic
imaginea real a lotului i s fie corespunztoare pentru examenul solicitat.
Se vor recolta n mod proporional, att probe din prile care par
suspecte, ct i din cele care par nemodificate. Proba va cuprinde att pri
de la suprafa, ct i din centrul produsului i se va ambala n recipiente
curate i uscate care s permit o nchidere complet. n cazul recoltrii
probelor pentru examene bacteriologice fiecare prob se va ambala n
recipiente sterile sau n pungi de polietilen nefolosite.
Recoltarea succesiv a mai multor probe trebuie s se fac astfel nct
s nu se amestece pri din acestea sau s nu se contamineze ntre ele, iar
pentru recoltarea fiecrei probe se vor folosi alte instrumente sterilizate.
Dup recoltare fiecare prob se va individualiza prin etichetare corect,
se va ambala separat astfel nct s nu se deterioreze n timpul transportului
i se va sigila pentru a mpiedica substituirea produsului. Sigiliul pus pe
probe va fi menionat n procesul-verbal de recoltare.
Produsele preparate i livrate n recipientele nchise ermetic (con
serve, semiconserve) se vor recolta i expedia la laborator n ambalajele
originale, nedeschise. Dac aceste produse au sigilii, banderole sau etichete
care servesc marcrii sau prezentrii, acestea vor rmne obligatoriu la
proba ce se trimite la laborator.
La ridicarea probelor se ncheie un proces-verbal de recoltare, care va
fi semnat de medicul veterinar care recolteaz proba i va fi contrasemnat
de un reprezentant al unitii asupra cruia se afl n gestiune sau proprietate
produsul.
Procesul-verbal de recoltare va cuprinde numele i calitatea medicului
veterinar care a ridicat proba, numele i calitatea reprezentantului unitii
care a asistat, denumirea produsului (cu specificarea numrului standardului
sau al normei interne, dac este cazul), specificaiile de marcare a produsului,
motivul recoltrii i analizele de laborator solicitate.
n cazul crnii i laptelui se va meniona dac acestea provin de
la animale tratate cu antibiotice, chimioterapice, substane hormonale,
biostimulatori, etc.
n procesul-verbal de recoltare a probelor se va meniona numrul
29

lotului, cantitatea sau numrul unitilor de ambalaj care constituie lotul


controlat, numrul probelor recoltate i cantitatea lor, temperatura pro
dusului n momentul recoltrii, laboratorul la care se expediaz probele i
specificaia sigiliului pus pe ambalajele cu probe, alte informaii etc.
Concomitent cu ridicarea probelor reprezentative se vor ridica i
contraprobe identice pentru expedierea la laborator. Analiza contra-probelor
se va face la solicitarea unitii deintoare, organelor de justiie, poliie sau
altor foruri oficiale.
Contraprobele din loturile de produse conservabile pe durat lung
(conserve, semiconserve) se pstreaz pn la expirarea termenului de
valabilitate.
Nu se rein contraprobe din produsele evident alterate sau din cele
care nu se pot conserva dect foarte puin timp.
Probele recoltate trebuie transportate la laborator imediat, n condiii
care s nu determine alterri sau modificri ale nsuirilor avute n momentul
recoltrii.
Lotul de alimente aflat n litigiu se pune sub restricii sanitare
veterinare pn la terminarea tuturor analizelor de laborator i clarificarea
situaiei. n toat aceast perioad, deintorul produselor alimentare este
obligat s asigure condiiile corespunztoare de conservare.
Trebuie menionat c n practica curent exist tendina de a se da
noiunii de lot cele mai diferite i incorecte sensuri i definiii ce pot
denatura nu numai noiunea n sine, dar pot genera confuzii i interpretri
cu implicaii epidemiologice, economico-sociale i juridice dintre cele mai
grave (Enache T., 2002).
De aceea pentru nlturarea acestor situaii echivoce s-a propus
acceptarea n unanimitate a definiiei oficiale a noiunii de lot dat de
Dicionarul Explicativ al Limbii Romne:
55Grup de produse identice sau asemntoare fabricate simultan sau
succesiv;
55Grup de produse identice sau asemntoare, expediate n acelai
timp sau sosite n acelai timp i/sau depozitate n acelai loc sau spaiu
comercial.
n continuare, n scopul unei orientri generale ct mai corecte
i complete asupra modului n care se face recoltarea (pentru analize de
laborator a probelor de alimente de origine animal) i chiar din considerente
didactice, se va prezenta aceast conduit general pe grupe de produse.
Preparate de carne. Recoltarea probelor se face din locuri diferite
maximum 2% din numrul batoanelor sau calupurilor, dar nu mai puin
de dou buci i nu mai mult de 6. Din preparatele de carne prezentate
30

n ambalaje mici (sub 1 kg) se recolteaz din locuri diferite o cantitate de


1,5-2 kg. Batoanele sau calupurile recoltate sunt secionate longitudinal
la faa locului, de ctre medicul veterinar, n jumti egale i se face un
examen organoleptic (aspect pe seciune, miros i gust). Pentru preparatele
n ambalaje mici (sub 1 kg) proba iniial se desparte n dou jumti egale.
Cele dou jumti rezultate constituie proba i contraproba reprezentativ.
Dintr-o jumtate a batonului secionat se detaeaz de la mijloc i de
la capete cteva poriuni n greutate total de 300-800 g, care se trimit la
laborator pentru analize fizico-chimice i microbiologice.
Conserve. Recoltarea probelor se face pe loturi dup cum urmeaz:
cnd lotul are pn la 1000 recipiente se recolteaz 2 recipiente; de la 10015000 se recolteaz 5; de la 5001-10000 se recolteaz 10; de la 10001 - 50000
se recolteaz 20; de la 50001 -100000 se recolteaz 30 de recipiente.
Pentru fiecare 100000 sau fraciuni de 100000 n plus se vor recolta
cte 15 recipiente.
Din reeaua de desfacere se recolteaz de obicei 2% din cutiile de
conserve existente, dar pe ct este posibil s se in seama de sortimente.
VV
Semiconserve din carne. Recoltarea probelor se face pe loturi, n
funcie de mrimea acestora, dup cum urmeaz: cnd lotul are pn la
1000 recipiente se recolteaz 2 recipiente; de la 1001 -2000 se recolteaz
4; de la 2001-3000 se recolteaz 6; de la 3001-5000 se recolteaz 8; pentru
fiecare 5000 recipiente n plus se recolteaz cte 5 recipiente.
VV
Untur de porc i de pasre. Se recolteaz la ntmplare 5%
din numrul ambalajelor unui lot. Untura este ambalat n blocuri sau
preambalat n ambalajele de transport. Din blocuri cu ajutorul unei sonde
se scot probe din toate straturile. La loturile formate din pachete de pn la
1 kg se recolteaz 1% din numrul pachetelor, dar nu mai puin de 5 i se
recolteaz cte 1 prob din fiecare pachet. Din probele recoltate astfel se
face o prob medie, din care se trimit la laborator 500 g.
Cnd lotul este format din ambalaje de pn la 500 g se expediaz la
laborator 1% din ambalajele originale luate la ntmplare, dar nu mai puin
de 2 i nu mai mult de 5.
VV
Seu alimentar topit. Se deschid la ntmplare 5% din ambalajele
aparinnd aceluiai lot, dar nu mai puin de 3 ambalaje, din care se recolteaz
probe din toate straturile cu ajutorul unui cuit sond. Se face o prob medie
dup topire pe o baie de ap din care, dup omogenizare, se iau 500 g, se
ambaleaz i se expediaz ctre laborator.
VV
Pete. Se recolteaz la ntmplare 5% din ambalajele unui lot.
VV
Cnd greutatea individual a petelui nu depete 2 kg, cte
2 exemplare din fiecare ambalaj, unul de la suprafa i cellalt din
31

profunzime;
VV
Cnd greutatea individual a petelui depete 2 kg, cte o bucat
(de aprox. 1 kg) dintr-un pete de la suprafa i o bucat dintr-un pete
din profunzimea ambalajului. Cnd petele este n vrac se va recolta cte
o prob (de 1 kg) pentru fiecare 1.000 kg, ns nu mai puin de 3 probe i
nu mai mult de 10. Probele se vor recolta att de la suprafa, ct i din
profunzime;
VV
Dac petele este ambalat n butoaie cu saramur, din fiecare ambalaj
controlat se recolteaz i o prob de aproximativ 200 ml saramur.
VV
Icre. Se desfac 10% din ambalajele lotului i se recolteaz cte o
prob (suprafa i profunzime) de aproximativ 250 g din minimum dou i
maximum 5 ambalaje deschise.
VV
Crustacei i molute. Se recolteaz 1% din numrul exemplarelor
care formeaz lotul, astfel nct greutatea probei s fie de 500-1000 g pentru
fiecare lot. Probele se vor lua din diferite puncte ale lotului.
VV
Pulpe de broasc (pui de balt). Se recolteaz ambalajele originale
(brichete) n procent de 5%, dar nu mai puin de dou i nu mai mult de
cinci.
VVPentru probele de ou. Se deschid 10% din ambalajele care
formeaz lotul i din fiecare ambalaj se recolteaz 12 ou din cutiile de 360
ou. Numrul total al oulor recoltate dintr-un lot nu va fi mai mare de 100.
n cazul oulor preambalate se recolteaz 1% din numrul preambalajelor.
VVPudr de ou sau produse de ou pasteurizate sau congelate (ou
integral, glbenu, albu). Se recolteaz probe n procent de 2% din numrul
ambalajelor, dar nu mai puin de 5 i nu mai mult de 10.
VVRecoltarea probelor de lapte la locul de producie se face n caz
de litigii pentru stabilirea fraudelor privind integritatea (mai ales cantita
tea de grsime) sau calitatea igienic, n acest caz se vor recolta probe n
urmtoarele condiii:
VVCel mai trziu la 3 zile de la ivirea litigiului: de la aceeai vac sau
de la acelai numr de vaci i de la aceeai mulsoare sau de la acelai numr
de mulsori ca i proba n litigiu;
VVSe va controla dac alimentaia animalelor nu s-a schimbat ntre
timp;
VVMulgerea va fi complet i fcut n aceleai condiii ca i cea de
la care s-a obinut laptele;
VVPentru depistarea unor germeni n lapte se vor recolta probe
individuale de la fiecare animal direct n recipientul de recoltare, dup ce n
prealabil s-a asigurat dezinfecia ugerului i minilor muncitorului.
Probele se vor recolta de la nceputul mulsorii dup ce s-au ndeprtat
32

primele 3-4 jeturi, cu excepia controlului pentru leucoz i tuberculoz,


cnd probele se recolteaz din mulsul final. Probele se recolteaz n prezena
unor martori.
n unitile de prelucrare industrial se controleaz laptele sub
aspectul integritii i al calitii igienice i se recolteaz probe la recepie,
pe fluxul tehnologic de prelucrare i dup obinerea produsului finit.
n unitile de desfacere, recoltarea probelor se face astfel:
Din cisterne, bazine i tancuri se recolteaz cu ajutorul unor
sonde speciale minimum 500 ml pentru fiecare prob, dup o prealabil
omogenizare;
Din bidoane se formeaz o prob medie de 10% din bidoanele care
constituie lotul; din proba medie bine omogenizat se recolteaz 500 ml
pentru examen de laborator;
Din buteliile de sticl, pungi din material plastic, 2-3 uniti de
ambalaj din fiecare lot. Probele recoltate trebuie s ajung la laborator n
maximum 4 ore de la recoltare, transportul lor fcndu-se n condiii de
refrigerare.
Produsele lactate acide se recolteaz n ambalaje originale n
procent de 1% din ambalajele care alctuiesc lotul, dar nu mai puin de 2 i
nu mai mult de 5.
Smntn ambalat n bidoane i pregtit pentru livrare. Se
deschid 5% din numrul bidoanelor i se recolteaz o prob medie de 250 g.
Dac smntn este preambalat n uniti mai mici de 0,5 kg se recolteaz
1% din unitile de ambalaj, dar nu mai puin de 2 i nu mai mult de 5.
Untul ambalat n lzi sub form de blocuri. Recoltarea probelor
se face la 10% din ambalajele care formeaz lotul, dar nu mai puin de 3,
cu ajutorul unei sonde speciale, recoltndu-se, att de la suprafa, ct i
din profunzime cte 200 g din care se face o prob medie. Din proba medie
omogenizat se recolteaz 250 g pentru laborator.
Cnd untul este ambalat n pachete de pn la 200 g se recolteaz
pachete ntregi, n procent de 2% din numrul care formeaz lotul, dar nu
mai puin de 2 i nu mai mult de 5.
Laptele praf n ambalaje mari (peste 1 kg). Se recolteaz 10%
din numrul ambalajelor care formeaz lotul i se face o prob medie de
250 g. Recoltarea se face cu sonda, ndeprtndu-se stratul superficial pe o
adncime de 5-10 centimetri.
Brnza proaspt de vac. Se deschid 10% din ambalajele care
formeaz lotul, n cazul ambalajelor mari (bidoane, tvi) se iau probe de la
suprafa i profunzime din care se formeaz o prob medie.
33

Din proba medie se trimit la laborator 200 - 300 g. Dac lotul este
format din ambalaje mici (pachete) se recolteaz 2% din numru unitilor
de ambalaj, dar nu mai puin de 2 i nu mai mult de 5.
Pentru probele de cacaval i brnzeturi fermentate (diferite
sortimente) se deschid 5% din unitile de ambalaj care formeaz lotul,
dar nu mai puin de 2 i nu mai mult de 5. Din fiecare ambalaj deschis se
recolteaz pentru laborator cte o prob de 200-300 grame n felii sau cu o
sond special, astfel nct s cuprind att suprafaa, ct i profunzimea.
Pentru sotimentele ambalate n pachete mici de pn la 250 grame se
recolteaz pachete originale n procent de 1, dar nu mai puin de 3 i nu
mai mult de 10.
Brnza telemea n cutii sau bidoane. Se recolteaz o felie dintr-o
bucat de la suprafa i una dintr-o bucat din profunzime. De asemenea,
se recolteaz i 200-300 mililitri saramur.
Mierea de albine. Se deschid 10% din numrul ambalajelor din
fiecare lot, ns nu mai puin de 3 i nu mai mult de 7. Dup o omogenizare
atent se recolteaz din fiecare ambalaj deschis aproximativ 250 grame
miere, fcndu-se o prob medie. Dup omogenizare, din aceasta se
recolteaz pentru laborator 250 grame.
Trebuie menionat c n funcie de felul alimentului i al modului de
ambalare, probele recoltate pentru examen de laborator se refrigereaz la
1-4C, fr ns a le congela.
Din alimente congelate, prezentate n ambalaje mici, probele se iau
ca atare, iar din cele prezentate n ambalajele mari se recolteaz probe prin
forare, tiere sau prin achiere cu instrumentar corespunztor.
Prelevarea probelor de ap pentru identificarea germenilor
din genul Shigella spp.
Se recolteaz ap de robinet din sursa de alimentare, ap din rezervoare,
bazine, lacuri, fntni, etc, n funcie de situaia existent.
Pentru proba de ap din reeaua de alimentare se flambeaz robinetul,
apoi se deschide complet i se las s curg ap 5 minute i aproximativ 10
secunde din rezervor. Se scoate dopul flaconului pentru prob i se menine
sub jet pentru a se umple pn la aproximativ 2 centimetri sub dop. Sunt
necesare probe de 1-5 litri.
Probele se transport n lad izoterm pentru examinare n interval de
maxim 2 ore.
Examinarea se poate temporiza maximum 6 ore, dac proba este
34

refrigerat ab initio la 4C.


Alternativ, se pot folosi tampoane Moore, meninute 48 ore sub jetul
lent de ap din conduct, dup care sunt transferate n recipient cu mediu
de mbogire.
Prelevarea probelor de ghea alimentar
Din blocul de ghea se recolteaz calupuri de aproximativ 2 kilograme.
n laborator calupul se spal cu ap steril apoi, folosind instrumente sterile
se taie din profunzime cteva buci (aproximativ 0,5 kilograme), care se
menin n vas steril la temperatura camerei pn la topire, fiind supuse n
continuri protocolului obinuit de lucru, n cel mai scurt timp.
Prelevarea probelor de pe suprafeele de lucru
Este recomandat prelevarea cu tampoane sau burei. Metodele de
amprentare sau incluzionare n mediu agarizat sunt contraindicate pentru
investigaii n focarul de toxiinfecie alimentar.
Cu mnui sterile i cu burete mbibat cu ap peptonat 0,1% se terge
o suprafa ct mai mare, apoi buretele se introduce n flaconul cu mediu de
mbogire. Alternativ, se folosete pentru tergere tampon umezit cu ap
peptonat 0,1%.
Dac se urmresc determinri cantitative, se delimiteaz suprafaa
investigat printr-un ablon metalic, cu aria de 100 cm2, sterilizat prin
flambare. n final se introduce buretele sau tamponul ntr-un volum msurat
de diluant.
Pentru prelevarea probelor de ap clorinat se folosesc flacoane care
conin 10 mg tiosulfat de sodiu pentru fiecare 500 ml de ap. Dac suprafeele
investigate au fost deja dezinfectate se stropesc cu o soluie N/10 tiosulfat
de sodiu.
Probele se refrigereaz i se expediaz la laborator pentru examinare
n cel mai scurt timp.
Prelevarea probelor de la pacienii cu sindrom diareic acut,
de la purttorii cronici i de la personalul care produce,
manipuleaz i transport alimente de origine animal
n cazuri acute de toxiinfecii alimentare se vor preleva din colonul
sigmoid probe de fecale cu tampon rectal sau cu sonda Nelaton, dar i din
ulceraiile descoperite la rectoscopie. Nu se vor preleva probe de la pacienii
35

bolnavi de mai mult de 3 zile.

1.10. Izolarea i identificarea shigelelor


Izolarea i identificarea shigelelor din alimente
mbogirea la Shi. sonnei:
Se cntrete aseptic o prob de 25 de grame n 225 ml de bulion
Shigella cu novobiocin 0,5 mg/ml.
Amestecul se las 10 minute la temperatura camerei i se agit
permanent, dup care se toarn ntr-un balon Erlenmeyer steril de 500 ml.
Balonul se incubeaz anaerob ntr-un sistem Gas Pak, n baie marin,
la 44C, timp de 20 de ore.
Se omogenizeaz bine suspensia i se striaz n plci cu agar Mac
Conkey. Se incubeaz 20-48 de ore la 35C.
mbogirea altor specii de Shigella:
Se procedeaz ca mai sus, dar se ncorporeaz o cantitate de novobiocin
de 3 mg/ml i se incubeaz anaerob n baie marin la 42C.
Izolarea shigelelor:
Se examineaz plcile cu agar Mac Conkey. Coloniile de Shigella
apar roz palide i translucide. Coloniile suspecte se nsmneaz n bulion
cu glucoz, agar TSI, bulion cu lizin-decarboxilaz, agar pentru testarea
mobilitii i tripton.
Se incubeaz la 35C, 20-48 de ore, dar se examineaz la 20 de ore.
Se ndeprteaz toate culturile care prezint mobilitate, produc hidrogen
sulfurat, formeaz gaz, lizin-decarboxilaz, fermenteaz sucroza sau lactoza
i produc indol.
Identificarea biochimic:
Shigelele pot fi caracterizate biochimic astfel:
teste negative pentru: hidrogen sulfurat, ureaz, glucoz (gaz),
mobilitate, lizin-decarboxilaz, ornitin-decarboxilaz (exceptnd Shi.
sonnei), sucroz, adonitol, lactoz (2 zile), salicin, inozitol, cianur de
potasiu, malonat, citrat, Voges-Proskauer;
teste pozitive pentru: manitol (excepie Shi. dysenteriae) i reacia
roului metil.

36

IdEnTIfICArEA gEnULUI ShIgELLA


1. Amestecul
probei alimentare cu mediul
de mbogire

225 ml bulion Shigella cu novobiocin


25 g aliment

2. decantarea
supernatantului ntr-un balon
steril

3. Incubare
anaerob 20 de ore la 44C
(Shi. Sonnei) sau la 42C
(celelalte specii)

4. nsmnare
n placa Petri. Incubare la
35C, 20-48 de ore

Agar Mac Conkey

5. nsmnare
pe mediul TSI i alte teste
biochimice

6. Confirmarea serologic

Pant alcalin (roie)


Baz acid (galben); fr h2S
Agar TSI

37

Izolarea
Izolarea shigelelor de la pacieni i purttori se face dup metodologia
general preconizat la investigarea sindromului diareic.
Izolarea de la pacieni n stadiul acut al bolii se realizeaz prin etalarea
materiilor fecale (omogenizate i suspensionate n soluii saline tamponate)
direct pe mediile selective (fr a trece pe medii de mbogire), datorit
densitii mari a shigelelor n fecale (aproximaiv 107/g).
Mediile selective recomandate sunt geloza MacConkey (MC), agaruldeoxicolat-citrat-lactoza (ADCL), geloza Salmonella-Shigella (SS) i
agarul xiloz-lizin-deoxicolat (XLD) sau asocierea de medii din clase
selective diferite, slab selective: MC i moderat selective: ADCL, SS, XLD.
Rezultatele cele mai bune au fost raportate cu XLD.
Izolarea shigelelor din alimente de origine animal
Acest procedeu se realizeaz cu dificultate datorit mai multor
factori:

coninut mare de grsimi n alimente;

parametri fizici: pH, concentraia electrolitic;

flor microbian alimentar de competiie;

numr redus de shigele n alimente;

starea fiziologic a shigelelor la izolare (stres termic la


decongelare).
mbogirea 18-24 ore la 37 C pe medii fr inhibitori (bulion manit
sau pe medii preconizate pentru izolarea salmonelelor respectiv bulion
pentru Gram negativi (BGN) i bulion selenit) este necesar ntotdeauna la
izolarea shigelelor din alimentele de origine animal.
Dispersia pe mediile selective din mediile de mbogire trebuie s fie
dens, datorit prezenei n cantiti reduse a shigelelor n alimente.
Izolarea shigelelor din ap
Izolarea shigelelor din ap se face, de asemenea, dup mbogire prin
filtrare i nsmnarea membranei filtrante n ntregime n bulion pentru
Gram negativi.
38

Identificare biochimic
Identificarea biochimic a coloniilor prezumtive de Shigella spp.
se poate face prin teste exoenzimatice asociate (metoda multitest) sau
individuale pe seturi de teste comerciale.
O asociere multitest de TSI (triple sugar iron) i MILF (motilitate,
indol, lizin, fenilalanin) este larg utilizat datorit multiplelor avantaje pe
care le ofer. Celelalte metode de analiz biochimic, utile n caracterizarea
izolatului se pot face de pe TSI, prin metode macrotest ori microtest. La
acestea se adaug si testele de serotipizare sau de testare a sensibilitii la
antibiotice.
Identificare serologic
Identificarea serologic se face utiliznd suspensii antigenice inactivate
prin cldur (pentru a evita inaglutinabilitatea i a reduce riscul contaminrii
profesionale) cu seruri aglutinante ori latex aglutinante. ncadrarea de
serotip este obligatorie.
Markeri epidemiologici
Oportunitatea investigaiilor epidemiologice a impus folosirea unor
metode de difereniere a serotipurilor, mai ales n cazul Shi. sonnei (serotip
unic) i Shi. flexneri 2a (serotip ubicvitar, larg rspndit geografic).
Biotipia, antibiotipia, fagotipia i bacteriocinotipia au fost preco
nizate i utilizate de mai muli autori la investigarea unor focare cu areal de
evoluie foarte larg.
Determinarea profilului plasmidic i caracterizarea DNA-ului
plasmidelor de rezisten se utilizeaz n investigarea epidemiologic.
Colicinotipia, antibiotipia i profilul plasmidic au o valoare limitat datorit
mobilitii mari a plasmidelor de rezisten la acest gen.
Diagnosticul bacteriologic prin tehnici alternative
Detectarea shigelelor direct n prelevatele patologice ori alimentare
prin mijloace rapide suscit un larg interes medical. Metodele de diagnostic
bazate pe principii genetice i imunologice au fost aplicate deja n
diagnosticul dizenteriei acute.
39

Metode bazate pe investigarea DNA-ului


plasmidelor de virulena
Hibridarea pe colonie. A fost introdus pentru evidenierea tulpinilor
invazive de cele neinvazive. Se utilizeaz sonde oligonucleotidice de sintez
marcate radioactiv care se sintetizeaz rapid, au timp de reacie scurt,
ntruct folosesc concentraii nalte de DNA, au interferen mai redus
(DNA-ul monocatenar), intesc o anumit gen (Ipa H), deosebit de util la
diferenierea tulpinilor invazive.
S-au utilizat i sonde ce folosesc un nucleotid conjugat cu fosfataz
alcalin. Specificitatea a fost ns de numai 81%.
Hibridarea prin amplificare polimerazic (ERIC-PCR)
Tehnica ERIC-PCR (Enterobactenal-Repetitive-Intergenic ConsensusPolymerase-Chain-Reaction) se aplic la prelevatele cu densitate redus de
shigele, chiar i la cele alimentare i reprezint o modalitate simpl i rapid
de tipizare a Shigella sonnei, cu un nivel nalt de discriminare echivalent
cu PFGE, dar mai mare dect cel al profilului plasmidic, al folosirii
endonucleazelor de restricie ale plasmidelor sau al ribotiprii.
n prezent, pentru detectarea proteinelor bacteriene care sunt markeri
de virulen, izolate din anumite medii se folosete tehnica MALDITOF
(Matrix-Assisted-Laser-Desorption-Ionization Time of Flight).
La Shi. flexneri i Escherichia coli s-au detectat doi ioni markeri pentru
proteinele specifice asociate cu proprieti de virulen (acidorezisten).
Reacia ce utilizeaz primeri secveniali, corespunztori unor frag
mente ale plasmidului Hind III de 2,5 Kb este folosit att n determinri
clinice, ct i n experimente cu alimente. Pragul de detecie nu depete
104 bacterii/gram. Randamentul metodei s-a mbuntit prin introducerea
unei trepte de mbogire. Metoda este mult mai sensibil i nu este radio
activ.
Un sistem universal care folosete amplificarea genic prin PCR a fost
propus nu de mult timp pentru detectarea concomitent n alimente a 13
patogeni intestinali mai frecvent implicai n toxiinfeciile alimentare, ntre
care i Shigella spp.
Metode imunoenzimatice
Tehnica imunoenzimatic (ELISA) de evideniere a markerilor de
40

invazivitate (complexul Ipa BCDA) are specificitate redus n evidenierea


proteinelor implicate n patogenitate.
Prezena complexelor antigen-anticorp poate fi vizualizat i
cuantificat prin adugarea n mediul de reacie a conjugatului unui antigen
sau a unui anticorp cunoscut, cuplat cu o enzim i substratul cromogen
specific enzimei de marcare.
n funcie de modificarea activitii markerului enzimatic EIA (Enzyme
Imuno Assay) testele pot fi clasificate n reacii n faza omogen i reacii
n faza heterogen, acestea din urm fiind larg utilizate n microbiologia
clinic.
Latex aglutinarea folosete diferite tipuri de latex (necolorat, colorat).
Testul este rapid (1-2 minute) i efectuat direct din suspensia de materii
fecale de la pacieni n stadiul acut, are o specificitate cuprins ntre 92,6
i 99,2%. Sensibilitatea redus a metodei nu permite ns aplicarea ei i la
produsele alimentare.
Testele imunoenzimatice ELISA cu antigen proteic, marker de
virulen, dau rezultate foarte bune n testri pe prelevate clinice. Se poate
utiliza la investigri largi de screening i furnizeaz rezultate rapide (in
aproximativ 2 ore).
Examenul bacteriologic pentru izolarea shigelelor
din alimente de origine animal
Prima etap de lucru n examenul bacteriologic pe alimente, produi
de origine animal i ap const n efectuarea nsmnrilor din materialul
suspect pe medii uzuale, de mbogire, selective, speciale, dup care se face
examenul microscopic direct, urmat de examenul bacteriologic complex
pentru izolarea, cultivarea i identificarea germenului.
Prelevarea, conservarea i transportul probelor de alimente i ap
pentru investigaii de laborator trebuie s se fac n condiii de umiditate i
temperatur sczut i ntr-un timp ct mai scurt posibil.
Identificarea i tipizarea se realizeaz prin analizarea particularitilor
biologice, care permit stabilirea cu certitudine a agentului cauzal implicat n
procesul patologic, n funcie de care se pot institui corect msurile igienicosanitare i conduita terapeutic sau de combatere i profilaxie specific i
nespecific.
n controlul de rutin al salubritii produselor alimentare de origine
animal, apei i furajelor, ct i n expertiza medico-legal veterinar
examenul microbiologic este indispensabil, ntruct permite detectarea
contaminrii acestor produse cu germeni patogeni pentru om i animale.
41

Pe lng studierea caracterelor morfo-culturale i biochimice ale


tulpinilor microbiene izolate, examenul microbiologic se completeaz
cu antibiogram, pentru a determina sensibilitatea fa de antibioticele
cunoscute.
Sub aspect medico-legal veterinar, antibiograma este util i pentru
aprecierea corectitudinii cu care a fost aplicat terapia cu antibiotice desigur
cu un grad de subiectivism i relativitate inerente, care trebuie totui analizate
i acceptate ns cu prudena cuvenit. n litigiile\cauzele penale, justiia
cere verdicte categorice asupra eventualei ineficiene a actului terapeutic
utilizat, care face obiectul cercetrii.
Este tiut c nu ntotdeauna izolarea unui germen microbian din
materialul patologic cercetat echivaleaz cu posibilitatea desemnrii lui ca
agent etiologic responsabil de mbolnvirile unor animale sau a oamenilor.
De aceea, se recurge i la testarea patogenitii germenului izolat pe animale
de experien.
Corobornd semnele clinice declanate la animalele de experien
cu durata infeciei, localizarea modificrilor morfopatologice, tulburrile
funcionale i transmiterea n serie a germenilor specifici se poate stabili cu
precizie diagnosticul etiologic.
Executarea i examinarea frotiurilor din alimente
Din probele de alimente se execut frotiuri colorate prin metoda Gram
dup o prealabil pregtire.
Alimentele lichide se omogenizeaz prin agitare, iar alimentele solide
se vor mojara n prealabil cu diluant steril (soluie salin izotonic peptonat
0,1% n proporie de 1:5).
Frotiurile executate din alimente grase se vor degresa cu xilol timp de
30 secunde, de dou ori consecutiv i se vor usca nainte de colorare.
Se numr bacteriile din cel puin 10 cmpuri microscopice i se
calculeaz media pe cmp.
Shigelele apar ca bacili Gram negativi, subiri, cu margini drepte i
capete rotunjite, scuri sau mijlocii dar pot fi i pleomorfice, filamentoase i/
sau cu o coloraie neuniform, izolate sau n perechi, nesporulate.
Dac la coloraia Gram apar microorganisme cu proprietile morfo
logice caracteristice genului Shigella spp., iar n culturi germenii nu se
izoleaz, acest lucru poate fi rezultatul contaminrii reagenilor sau a altor
materiale, prezenei de ageni antimicrobieni sau diferite schimbri ale
microorganismelor n funcie de condiiile de mediu.
42

Izolarea shigelelor din alimente prin metoda recomandat de


Organizaia Mondial pentru Agricultur i Alimentaie - FAO
Principiul metodei publicat n Manual of Food Quality Control
Microbiological Analysis n 1992, const n parcurgerea succesiv a
urmtoarelor etape de lucru:
55 mixarea probei de aliment cu mediul de mbogire;
55 decantarea supernatantului n bulion steril;
55 incubarea anaerob a supernatantului 24 ore la 44C (pentru
Shigella sonnei i alte specii de Shigella spp. la 42C);
55 nsmnarea pe plci i incubarea la 35C, timp de 20-48 ore;
55 screening pe TSI i alte medii;
55 confirmarea serologic.
Dup obinerea probei omogenizate din alimentul studiat se fac
diluii cu ser fiziologic steril i, din diluii se pipeteaz 0,25 ml pe suprafaa
mediului cu xiloz solidificat i se uniformizeaz cu o baghet de sticl n
form de L.
Dup incubare se numr coloniile caracteristice din plcile care conin
pn la 300 colonii i se face calculul prezumtiv n funcie de diluie.
Coloniile suspecte au o culoare roie uniform.
Confirmarea biochimic se face dup inocularea coloniilr prezumtive
n mediile pentru identificare i termostatare la 37C, timp de 24 ore.
Ulterior, la culturile reinute se efectueaz testele serologice.
mbogirea pentru izolarea Shigella sonnei
Se cntresc aseptic 25 grame prob i se introduc n 225 ml bulion
Shigella cu novobiocin (0,5 micrograme/ml), sau bulion manit.
Suspensia se pstreaz 10 minute la temperatura camerei, agitndu-se
periodic.
Eluatul se transfer ntr-un balon Erlenmeyer de 500 ml care se
introduce ntr-un vas de anaerobioz cu catalizator proaspt, se insereaz
Gas Pak i se activeaz adugndu-se ap. Catalistul este bine s fie uscat
dup fiecare folosire.
Se incubeaz 20 ore n baie de ap la 44C. Suspensia se agit i se
striaz pe plci cu agar MacConkey.
Se incubeaz 20 ore la 35C.
43

mbogirea pentru izolarea altor specii de Shigella


Modul de lucru este identic, dar se adaug 3 micrograme novobiocin/
militru i se incubeaz anaerob n baie de ap la 42C.
Izolarea
Se examineaz plcile cu agar MacConkey.
Coloniile suspecte se inoculeaz n bulion glucozat, TSI n pant,
bulion pentru lizin-decarboxilaz, agar pentru motilitate i tripton. Se
incubeaz la 35C, timp de 48 ore, dar se examineaz i la 20 ore.
Culturile care exprim mobilitate, formare de gaz, fermentarea
glucozei, lactozei i lizin-decarboxilaz pozitiv se vor nltura.
Se nltur i culturile obinute prin incubarea bulionului de mbogire
la 44C, dar se rein cele care formeaz indolul. Se vor reine i culturile
obinute la 42C, care pot fi pozitive sau negative.
Izolarea germenilor din genul Shigella spp. din alimente prin
mbogire pe medii fr inhibitori i dispersie pe medii selective
Mediile selective cele mai recomandate pentru alimente sunt agarul
MacConkey, agarul deoxicolat-citrat-lactoz, agar Salmonella-Shigella,
agarul xiloz-lizin-deoxicolat. Sunt recomandate asocieri de medii din
clase selective diferite, slab selective i moderat selective.
Identificarea
Identificarea biochimic
Se face inocularea coloniilor selectate pe mediile pentru teste
biochimice incubate la 35C i se examineaz dup 24 i 48 ore.
Comportamentul shigelelor poate fi evaluat astfel: negativ pentru H2S,
ureaz, glucoza (gaz), motilitate, lizin-decarboxilaz, ornitin-decarboxilaz
(excepie Shigella sonnei, pozitiv), zaharoz, adonitol, lactoz (2 zile),
salicil, inozitol, KCN, malonat, citrat, V-P.
Cele mai multe shigele sunt pozitive pentru manitol (excepie Shigella
dysenteriae, negativ) i reacia RM.
O alt metod de izolare a bacteriilor din genul Shigella spp. din
alimente se bazeaz pe un test prezumtiv prin cultivarea pe un mediu care
44

conine xiloz (XLD).


Pentru efectuarea acestui test este necesar mediul cu xiloz, medii
pentru teste biochimice i ser fiziologic steril.
Identificarea serologic
Se suspend cultura n 3 mililitri soluie salin 0,85%. Se marcheaz
9 dreptunghiuri 3x1 centimetri pe o plac Petri. Se adaug picturi din
suspensie, antiser i soluie salin, n acord cu protocolul (tabelul 1.3).
Se amestec coninutul fiecrui careu cu o ans i se agit plcile 3-4
minute pentru accelerarea aglutinrii.
Tabelul 1.3.
Determinarea grupurilor serologice de Shigella spp.
Dreptunghiul Suspensia

Antiserul polivalent

Al

CI

C2

A-D

+
+
+
+
+
+
+

Gradul de aglutinare poate fi:


0 - nu apare aglutinare;
1+ - aglutinare detectabil;
2+ - aglutinare cu 50% clarificare;
3+ - aglutinare cu 75% clarificare;
4+ - floculare vizibil cu clarificarea complet a lichidului de
suspensie.
Se reexamineaz suspensiile cu seruri monovalente, atunci cnd apare
una din urmtoarele reacii pozitive (2+, 3+, 4+).
Cnd reacia este negativ, suspensia se nclzete n baie de aburi 30
minute pentru hidroliza antigelului capsular interferent. Se reexamineaz n
45

antiser polivalent, iar dac aglutinarea este pozitiv se reexamineaz n ser


monovalent.
Nu se cunosc metode foarte sensibile pentru Shigella, iar metodele
recomandate pot s nu detecteze shigelele prezente n numr mic n
alimente.
Dac proba nu poate fi examinat n 24 ore, se va pstra prin
congelare.
Este necesar selectarea mai multor colonii din fiecare plac cu agar
MC, deoarece multe bacterii enterice pot forma colonii asemntoare cu
cele de Shigella.
Examenul bacteriologic pentru izolarea germenilor din genul Shigella
spp. din fecalele bolnavilor cu sindrom diareic acut
Din fecalele etalate pe o lam de sticl se face un frotiu n strat foarte
subire i se coloreaz Gram.
n frotiul de fecale se pot observa i leucocite WCBS (white cells
bloody stools), care indic o infecie prin invazivitate.
Mucusul din fecale se omogenizeaz pe o lam ntr-o pictur de soluie
de albastru de metil Loffler, apoi se acoper cu o lamel i se examineaz.
Leucocitele din fecale sunt distruse n mediile de conservare sau
de transport, de aceea este indicat ca examenul microscopic s se fac n
momentul recoltrii.
n caz de toxiinfecie alimentar produs de Shigella se evideniaz
peste 50 polimorfonucleare neutrofile i eritrocite/cmp microscopic.
Izolarea germenilor din genul Shigella spp. din ap
prin metoda Istrati-Meitert
Cantiti diferite de ap (50 ml, 100 ml, 200 ml) sunt trecute prin filtru
Seitz pe care s-a montat pentru fiecare prob de ap o membran filtrant cu
pori de 0,7 microni diametru.
Pentru filtrare, pe lama criblat a filtrului se monteaz 1-2 foi de hrtie
de filtru de form corespunztoare. Filtrul astfel montat este sterilizat prin
autoclavare, timp de 30 minute la 120C.
Membranele filtrante se fierb nainte de utilizare, de trei ori cte 5
minute n ap bidistilat steril, schimbnd apa de fiecare dat. Dup ce
hrtia de filtru din filtrul Seitz este umectat cu ser fiziologic se aplic, cu
precauie, membrana filtrant.
46

Dup golire, cilindrul filtrului Seitz este splat cu ser fiziologic i cu


ap bidistilat steril.
Membranele filtrante sunt aplicate pe un mediu selectiv, n plci Petri,
dup o prealabil uscare a suprafeelor acestora (20-30 minute la 37C cu
capacul ntredeschis), astfel nct s se evite formarea de bule de aer ntre
membrana filtrant i mediu.
Dup 20-24 ore de incubare la 37C se vor examina plcile cu mediul
selectiv pe care s-au depus membranele filtrante.
Dac pe acestea s-au dezvoltat colonii lactozo-negative se vor replica
i identifica.
Se recomand asocierea metodei cu textul biologic, prin inocularea
pe conjunctiva palpebral la cobai a culturii recoltate de pe suprafaa
membranelor filtrante.
1.11. Surse de contaminare ale alimentelor i apei cu Shigella sp.
Materiile prime i ingredientele destinate fabricrii produselor
alimentare trebuie s fie condiionate cu respectarea tuturor normelor de
igien.
Datorit posibilitilor de contaminare a alimentelor n timpul trans
portului, precum i a faptului c exist modaliti sigure de prevenire a
acestor fenomene, transportul acestora este considerat un important factor
de risc.
La transportul materiilor prime i ingredientelor perisabile este
esenial inerea sub control a temperaturii pe toat durata transportului,
aceasta fiind un parametru critic pentru calitatea i inocuitatea produselor
alimentare.
Un alt factor de risc la fabricarea produselor alimentare este recepia
calitativ, ntruct n acest moment se decide acceptarea sau respingerea
unui lot suspect, precum i destinaia lui ulterioar, pentru a nu fi introdus
n mod fraudulos n consum.
La intrarea n fabric, produsele uor perisabile sau considerate
contaminate vor fi izolate de celelalte categorii de produse i vor fi
introduse n ciclul de fabricaie doar dup minuioase i complete verificri
de laborator.
Unele analize vor fi efectuate chiar naintea descrcrii materiilor
prime din mijloacele de transport.
Materiile prime nu vor fi prelucrate pn cnd nu se cunosc rezultatele
tuturor analizelor de laborator.
47

Pentru realizarea testelor i analizelor de laborator, fabricile de


prelucrare vor fi autorizate numai dup ce vor amenaja laboratoare de analiz
proprii, acreditate conform legislaiei naionale armonizat cu legislaia
veterinar a Uniunii Europene.
Ali factori de risc din procesul tehnologic sunt practicile de lucru
ale muncitorilor i operaiunile de curire-dezinfecie. Aceste operaiuni
constituie puncte critice de risc n industria alimentar, datorit apariiei
unor toxiinfecii alimentare provocate de microorganisme ce au ca surs
purttorii cronici.
n timpul distribuiei produselor alimentare, condiiile de asigurare
a temperaturii de pstrare constituie, de asemenea, puncte critice de risc
epidemiologie.
Produsele refrigerate trebuie pstrate la temperaturi de 4-8C, iar cele
congelate, la temperaturi de -18C.
Este foarte important ca produsele s fie refrigerate, respectiv congelate,
nainte de a fi ncrcate n mijloacele de transport, deoarece instalaiile
frigorifice ale mijloacelor de transport sunt proiectate doar pentru a menine
temperatura, nu pentru a rci produsul n cauz.
Operaiunea de ncrcare a produselor trebuie s dureze ct mai puin,
pentru a nu permite creterea temperaturii n interiorul mijloacelor izoterme
de transport.
Monitorizarea permanent a temperaturii n spaiile de depozitare
trebuie s asigure integritatea produselor att n reeaua comercial, ct i la
consumator, iar utilizarea vitrinelor frigorifice este obligatorie n comerul
cu produse alimentare refrigerate i congelate.
Operaiunile de desfacere i servire a produselor alimentare se
desfoar n cantine, restaurante, spitale i n uniti de tip fast-food.
n toate unitile de alimentaie public trebuie supravegheat strict
temperatura de pstrare a alimentelor care s nu permit dezvoltarea
microorganismelor.
Meninerea n stare cald a unor mncruri n cantine sau restaurante,
pentru un timp ndelungat, a determinat de nenumrate ori producerea de
toxiinfecii alimentare grave la consumatori.
n reeaua de desfacere a produselor alimentare prevenirea conta
minrii ncruciate este un alt factor de risc. Trebuie evitat transferul
microorganismelor patogene de pe alimentele crude, ustensile sau de pe
minile personalului pe produsele finite.
Modul de preparare a alimentelor constituie factor de risc, n special
pentru carnea de pasre, picioare de broasc, pete, fructe de mare etc.
Valoarea minim a temperaturii ce trebuie atins la preparare n centrul
48

geometric al acestor produse este de minimum 72C.


Pe plan mondial, abordarea calitii n toate domeniile activitii
economice s-a fcut pornind de la principiile calitii totale i ale realizrii
sistemelor calitii, n concordan cu prevederile standardelor din seria ISO
9000 (echivalente EN 29000 sau BS 5750).
n industria alimentar, pe lng sistemele proprii de management al
calitii devenite clasice, exist un sistem HACCP specific, care constituie
un sistem de management al calitii ce are ca obiectiv fabricarea de produse
sigure pentru consum.
Introducerea metodei HACCP n industria de prelucrare a petelui
i a produselor pescreti pornete de la identificarea principalelor riscuri
aferente acestor tipuri de produse.
n acest scop, produsele pescreti au fost clasificate n ordinea
descresctoare a gradului de risc n urmtoarele categorii:
55
molute, inclusiv scoici i stridii proaspete sau congelate, cu sau
fr carapace; aceste produse sunt consumate ca atare, fr a fi gtite;
55
produse pescreti uor conservate (coninut de NaCl mai mic
de 6% n faza apoas, pH>5). Aceast categorie include produsele srate,
marinate, afumate la rece, care se consum fr a fi gtite;
55
pete i crustacei, produse tratate termic (pasteurizate, fierte,
afumate la cald); unele dintre aceste produse se consum fr a fi gtite;
55
produse tratate termic (sterilizate i ambalate n ambalaje erme
tice), multe dintre acestea fiind consumate fr o alt pregtire culinar;
55
semiconservele de pete (cu peste 6% NaCl n faza apoas, pH
< 5, eventual conservani). Acest grup include petele srat sau marinat i
caviarul; se consum fr a fi gtite;
55
pete uscat, pete uscat i srat, pete uscat i afumat; n mod
normal se consuma fr a fi gtite;
55
pete i crustacei n stare proaspt i congelat; n mod normal se
consum dup gtire.
Numeroase date epidemiologice din literatura internaional de
specialitate fac tot mai des referire la implicarea produselor pescreti n
toxiinfeciile de origine alimentar.
Riscul nu const ns n simpla prezen a acestor microorganisme, ci
n dezvoltarea lor pe produs.
La obinerea i comercializarea petelui i fructelor de mare proaspete
i congelate, riscul de contaminare cu shigele poate fi controlat n cadrul
unui program exigent de asigurare a calitii, utiliznd metode i dotri
corespunztoare.
49

Contaminarea petelui, fructelor de mare i a produselor din pete cu


microorganisme din mediu nu este considerat de unii specialiti un risc,
deoarece aceste microorganisme se gsesc n mod obinuit pe materiile
prime utilizate.
Trebuie subliniat c dac aceste microorganisme contamineaz spaiile
de fabricaie, ptrunznd n crpturi sau alte spaii, unde se dezvolt n
condiii favorabile de mediu, pot contamina i produsele finite.
Este important s se reduc numrul de microorganisme n materiile
prime i n produsele finite la minimum posibil, prin controlul condiiilor
igienice pe fluxul de prelucrare.
n Marea Britanie, cerina de baz impus pentru obinerea de produse
refrigerate sigure pentru consum, conform recomandrilor Institutului de
tiin i Tehnologia Alimentelor, include:
VV selectarea unor furnizori siguri;
VV
proiectarea i construirea igienic a seciilor de fabricaie i a
depozitelor;
VV
proiectarea instalaiilor n vederea facilitrii unei igienizri
corespunztoare;
VV
programe de ntreinere, curenie, igienizare i dezinfecie;
VV
educarea i instruirea personalului pentru cunoaterea procedeelor
de fabricare i de depozitare igienic a materiilor prime, materialelor i
produselor finite.
Depozitele, mijloacele de transport i vitrinele frigorifice pentru
comercializare trebuie proiectate i exploatate corespunztor, pentru a
menine produsele la temperatura de siguran, indiferent de temperatura
mediului ambiant.
Temperatura produselor trebuie verificat, permanent la intrare n
depozitul frigorific i la recepia lor n unitile de desfacere cu amnuntul.
Spaiile folosite pentru asamblarea i manipularea produselor tratate
termic trebuie separate de spaiile destinate depozitrii materiilor prime.
1.12. Prevalena tulpinilor de Shigella spp. n alimentele de origine
animal i n ap
Evaluarea riscului epidemiologic prin izolarea tulpinilor de
Shigella spp din unele alimente de origine animal i ap
Evaluarea riscului de contaminare cu Shigella, prin intermediul unor
surse poteniale de contagiu, reprezint una dintre cele mai importante
verigi de control epidemiologic i de prevenire a toxiinfeciilor alimentare
50

produse de aceti germeni.


n acest context s-a inclus i studiul prevalenei, adic, evaluarea ntr-o
anumit perioad de timp a numrului total de cazuri de produse alimentare
de origine animal contaminate cu Shigella.
S-a insistat n principal asupra studiului de prevalen la grupele de
produse care sunt cel mai frecvent implicate n declanarea toxiinfeciilor
alimentare i care sunt cel mai bine studiate i redate n literatura mondial
de specialitate.
Prevalenta tulpinilor de Shigella spp. n lapte i derivate din lapte
n perioada 2001-2003 a fost studiat prevalena tulpinilor de Shigella
spp. pe eantioane mari de lapte i derivate proaspete din lapte, provenite de
la productorii neautorizai care comercializeaz aceste produse obinute n
condiii precare de tehnologie i igien.
Din cele 743 eantioane examinate, s-a izolat Shigella spp. din 5 probe
(0,6%), (tabelul 1.4).
Tabelul 1.4
Prevalenta tulpinilor de Shigella spp. n laptele comercializat de productorii
neautorizai n pieele capitalei* (perioada 2001-2003)
Felul produsului

Numrul de probe
examinate

Numrul de probe
pozitive

Lapte proaspt nepasteurizat

320

12

Ca proaspt

120

Urd dulce

46

Brnz proaspt de vaci

257

743

Total

* Productorii privai neautorizai de la care au fost prelevate probe proveneau din


mai multe judee limitrofe Municipiului Bucureti

Prevalena tulpinilor de Shigella spp. n carnea de pasre


dezosat mecanic (MDM)
n perioada 2000-2003, n Romnia, s-au importat cantiti mari de
carne de pasre dezosat mecanic (MDM), din care mai multe loturi (care au
nsumat sute de tone de produs) au fost gsite contaminate cu Salmonella i
51

au fost distruse conform prevederilor legale referitoare la astfel de situaii.


Avnd n vedere faptul c produsele contaminate cu Salmonella se pot
contamina i cu Shigella spp., prin aceleai verigi, s-au investigat 6 loturi
nsumnd 609 tone carne de pasre dezosat mecanic (MDM).
Pe probele examinate nu s-a reuit izolarea de Shigella (tabelul 1.5).
Tabelul 1.5
Prevalenta tulpinilor de Shigella spp. n carnea de pasre dezosat mecanic
(MDM) importat (perioada 2000-2003)
ara de
provenien

Numrul de loturi
Cantitatea
(tone/lot)

Numrul de probe
examinate

Numrul de probe
pozitive

Belgia

20

SUA

99

Italia

29

Frana

139

Olanda

390

14

Brazilia

31

Total

609

28

Prevalenta tulpinilor de Shigella spp. n prjituri i produse de


patiserie comercializate de uniti de alimentaie public
Din studiul fcut rezult c aceast grup de produse (prjituri
i produse de patiserie), cu un risc potenial aparent nesemnificativ n
producerea toxiinfeciilor alimentare cu Shigella, prezint n mod cert un
pericol real pentru sntatea public.
Din evaluarea surselor posibile de contaminare a acestor produse s-a
constatat c materiile prime folosite la prepararea prjiturilor i produselor
de patiserie nu sunt cauza contaminrii produsului finit.
Sursa real de contagiu o reprezint prelucrarea neigienic a acestor
produse, prin nclcarea normelor generale de tehnologie i igien indivi
dual a personalului (tabelul 1.6).
52

Tabelul 1.6
Prevalenta tulpinilor de Shigella sp. n prjituri i produse de patiserie
comercializate de uniti de alimentate public (perioada 2000-2002)
Denumirea
produsului

Cantitatea
(buci)

Numrul de
probe analizate

Numrul de probe
pozitive

Prjituri

785

20

2000

Produse de
patiserie

524

12

2001

Prjituri

23404

10

2002

Prjituri

232

15

24945

57

Anul

Total

Prevalena tulpinilor de Shigella spp. n semiconserve de pete


Rezultatele acestui studiu demonstreaz c petele i derivatele din
pete pot fi surs de contaminare cu Shigella (tabelul 1.7.)
Tabelul 1.7.
Probe de semiconserve de pete (fabricate n Romnia) analizate n cadrul
Institutului de Igien i Sntate Public Veterinar (perioada 2000-2003)
Denumirea produsului

Cantitatea Numrul de probe


(kg/lot)
examinate

Probe
pozitive

Salat de icre de crap

2573

17

Salat de icre hering

2135

11

Salat de icre cu adaosuri de legume

100

Salat nordic

30

Salat pescreasc

42

3100

15

7980

52

Macrou afumat
Total

Din salata simpl de icre de crap i hering i salata de icre cu adaosuri


de legume s-au identificat un numr de 5 probe pozitive pentru Shigella.
Aceste produse au fost, probabil, contaminate cu Shigella de la
purttori, n condiiile nerespectrii de ctre acetia a normelor de igien
individual i tehnologic pe fluxul de procesare a materiilor prime, de la
recepie pn la ambalarea i desfacerea produsului finit.
53

Prevalenta tulpinilor de Shigella spp. n maioneze


i sosuri pe baz de maionez
n conformitate cu Legislaia Sanitar Veterinar Naional i cea
aplicat n rile Uniunii Europene, toate produsele alimentare de origine
animal, precum i cele care au n coninutul lor componente de origine
animal, provenite din import, se supun obligatoriu (nainte de a fi puse
n consum) examenelor complexe de laborator pentru evaluarea riscurilor
acestor produse pentru sntatea public.
n tabelul 1.8 sunt prezentate loturile de maionez i sosuri pe baz de
maionez importate n perioada 2000-2002.
Pe probele examinate prin sondaj dintr-un import de aproximativ 32
tone din aceste produse nu s-a reuit izolarea de Shigella.
Tabelul 1.8
Prevalenta tulpinilor de Shigella spp. n maioneze i sosuri pe baz de
maionez provenite din import (perioada 2000 - 2002)
Anul

2000

2001

2002

Numrul
Numrul Numrul
Cantitatea
de loturi
de loturi de probe
(kg)
importate
examinate pozitive

ara de
provenien

Denumirea
produsului

Belgia

maionez

12

2521

Olanda

maionez

5795

sosuri pe baz de
maionez

23

2907

13

Polonia

maionez

300

Italia

sosuri pe baz de
maionez

1440

Germania

maionez

11

1883

sosuri pe baz de
maionez

24

7012

21

maionez

3750

Olanda

sosuri pe baz de
maionez

3041

Germania

maionez
sosuri pe baz de
maionez
maionez
sosuri pe baz de
maionez
-

324

2701

360

Belgia
Total

7
114
54

8
32036

75

Prevalenta tulpinilor de Shigella spp. n ap din unele


tranduri i lacuri din Bucureti
Investigarea acestei zone cu potenial de risc epidemiologic este
interesant pentru evaluarea riscului de contaminare cu Shigella a persoanelor
care n sezonul estival fac baie n lacurile de agrement, dar i n trandurile
supuse controlului sanitar permanent.
Rezultatele investigaiilor efectuate pe o perioada de 3 ani (2001- 2003)
au dovedit c, pe fondul unei igienizri ineficiente a bazinelor de not din
tranduri i clorinarea necorespunztoare a apei, este posibil supravieuirea
shigelelor provenite de la purttorii cronici.
n aceste condiii este posibil contaminarea pe cale oral, prin
intermediul apei, a unui numr mare de persoane receptive la aceast infecie
(tabelul 1.9).
Tabelul 1.9
Prevalenta tulpinilor de Shigella spp. n apa din unele tranduri i lacuri din
Bucureti (perioada 2001-2003)
Sursa de ap din care s-au
recoltat probe

Numrul de probe analizate

Probe pozitive pentru


Shigella

Lacul Floreasca

50

Lacul Tei

76

Lacul Toboc

70

Lacul Colentina

60

trandul 1

60

Lacul Snagov

60

Total

376

Prevalenta tulpinilor de Shigella spp. n apa de fntn


Pentru a izola shigelele din apa de fntn, n perioada 2001-2003,
s-a studiat un set de probe de ap recoltate din zone geografice diferite,
reprezentnd un numr de 9 judee din ar.
Probele au fost prelevate numai n perioadele cele mai clduroase din
an (iulie-august), din fntni aflate n incinta unor gospodrii rneti n
care latrinele erau amplasate n imediata lor vecintate.
Faptul c s-a izolat Shigella din 3 fntni din cele 32 cercetate (aflate n
55

judee diferite) demonstreaz ca infiltrarea n pnza freatic a apei fecaloide


din latrine poate ajunge n apa fntnilor, devenind astfel surs de contagiu
pentru alte persoane din afara gospodriei prin consumul apei contaminate
(tabelul 1.10).
Tabelul 1.10
Prevalenta tulpinilor de Shigella spp. n apa de fntn din mai multe zone
geografice (perioada 2001-2003)
Numrul de probe pozitive pentru
Judeul
Numrul de probe analizate
Shigella
Giurgiu

Mehedini

Botoani

Clrai

Ialomia

Dmbovia

Vaslui

Galai

Tulcea

32

Total

Prevalena tulpinilor de Shigella spp. n apa din canalele Deltei


Dunrii
ntruct n literatura de specialitate din ar nu este fcut nici o referire
n ceea ce privete izolarea de Shigella din apa canalelor Deltei Dunrii, n
intervalul 2001-2003 s-a studiat un numr de 192 probe de ap n perioada
canicular iulie-august (Enache T., Enache T. Jr., 2005).
Probele au fost luate din zona de vrsare n Marea Neagr a braului
Sulina, dar i din interiorul braelor Chilia, Sf. Gheorghe i Sulina, n
perimetrele n care sunt concentrate colectiviti umane care deverseaz, n
aceste zone apele menajere i haznalele din incint (tabelul 1.11).
56

Tabelul 1.11
Prevalena tulpinilor de Shigella spp. n apa din canalele Deltei Dunrii n
perioada 2001-2003 (Enache T. Enache T. Jr., 2005)
Locul de recoltare a probelor

Numrul de probe
recoltate

Numrul de pozitive
pentru Shigella

Zona de vrsare a Dunrii-Sulina

Braul Sulina

72

Braul Sf. Gheorghe

60

Braul Chilia

5
Total

192

Din probele pozitive, suspectate de a fi contaminate cu Shigella, dup


testarea biochimic i serologic, INCDMI Cantacuzino a confirmat o
singur tulpin atipic de Shi. flexneri.
Izolarea i identificarea n premier a unei tulpini de Shi. flexneri din
apa canalelor Dunrii este deosebit de util pentru evaluarea corect i critic
a surselor poteniale de contaminare a petelui i apoi a consumatorilor
acestui produs (Enache I, Enache T., Jr., 2005).
Screening privind portajul tulpinilor de Shigella spp.
la animale de ferm i n abatoare
Pentru a verifica datele din literatura de specialitate n ceea ce privete
portajul tulpinilor de Shigella spp., numai de ctre om, s-a fcut un screening
referitor la eventualitatea prezenei acestor germeni pe probe coprologice
recoltate de la bovine, porcine i psri din exploataii zootehnice din mai
multe judee din ar.
n perioada 2001-2003 s-au prelevat 582 tampoane rectale recoltate cu
predilecie de la animale i psri cu simptomatologie digestiv, manifestat
prin enterite dizenteriforme cu descrcri diareice acute i cronice, precum
i de la animale aflate ntr-o stare aparent de sntate, dar care au coabitat
cu cele bolnave (tabelul 1.12).
57

Tabelul 1.12
Probe coprologice recoltate de la animale vii pentru evaluarea contaminrii
cu Shigella spp. (perioada 2001-2003)

Specie

Numrul Numrul
de exploataii de probe
controlate analizate

Medii de izolare folosite


Mac Conkey Agar Salmonella
cu lactoza
Shigella

Agar XLD

Probe pozitive Probe pozitive Probe pozitive

Bovine

23

184

Porcine
Psri

16
9

128
270

Total

48

582

n aceeai perioad de timp s-au studiat 101 probe de ap tehnologic


prelevat din reeaua de evacuare a unor abatoare de psri, porci, ovine i
bovine (tabelul 1.12).
Tabelul 1.13
Probe de ap tehnologic recoltate din reeaua de evacuare a unor abatoare
(perioada 2001-2003)
Locul de recoltare a probelor

Numrul
Numrul de
Numrul de
unitilor
probe analizate probe pozitive
verificate

Abatoare de psri

36

Abatoare mixte (porcine, ovine, bovine)

65

Total

101

Din apa tehnologic de la abatoare i de la animalele i psrile cu


sindrom digestiv acut i cronic nu s-a putut izola Shigella, confirmnd astfel
datele din literatura de specialitate care susin c animalele i psrile nu
sunt rezervor natural pentru aceast specie microbian.
1.13. Rolul alimentelor de origine animal ca verig epidemiologic
n producerea toxiinfeciilor alimentare cu Shigella spp.
Cu toate acumulrile de date noi rezultate n urma studiilor ntreprinse
pe plan mondial pentru cunoaterea particularitilor biologice i de
patogenitate a tulpinilor de Shigella spp. exist nc numeroase incertitudini,
dar i faete inedite ale acestui domeniu deocamdat nc insuficient
58

investigat.
n acest context, trebuie avut n vedere faptul c infeciile produse
de bacteriile din genul Shigella nu pot fi nc controlate eficient, datorit
necunoaterii incidenei reale la bolnavii cu toxiinfecii alimentare, ntruct
prevalenta n produsele alimentare de origine animal i n ap nu este
evaluat corect i complet.
Pe acest teren, cu numeroase elemente incerte sau nc necunoscute,
n cadrul studiilor ntreprinse s-a urmrit investigarea, aprofundarea,
clarificarea i completarea acestor date cu noi observaii de cert valoare
tiinific i practic.
De aceea s-a cutat s se evidenieze i s se aprofundeze i alte
elemente revelatorii pentru clarificarea rolului alimentelor de origine animal
ca verigi epidemiologice majore n declanarea toxiinfeciilor alimentare la
om.
Rezultatele obinute ofer posibilitatea formulrii unor concluzii
fundamentate pe baza analizei comparative a acestor date cu cele din
literatura internaional:
Pn n prezent n literatura de specialitate nu s-au comunicat nc
rezultate certe, bazate pe date aprofundate privind prevalena i incidena
acestor germeni, pe grupe de alimente i nu exist statistici oficiale rezultate
dintr-un amplu screening (derulat succesiv de la recoltare, prelucrare,
transport, stocare, desfacere i pn la consumul alimentelor), din care s
rezulte c produsele alimentare de origine animal constituie rezervorul de
Shigella cu risc epidemiologic recunoscut pentru consumatori;
Sub raportul problemelor de sntate public veterinar nu se
cunosc nc ndeajuns sursele reale de contaminare cu Shigella i factorii
care influeneaz i determin apariia i gravitatea evoluiei unor focare
de toxiinfecii alimentare, care nu sunt ntotdeauna diagnosticate rapid i
corect din punct de vedere etiologic;
Cu toate c germenii din genul Shigella spp. fac parte din punct
de vedere epidemiologic din grupa de risc n care este ncadrat toxiinfecia
alimentar produs de Salmonella, nu este nc legiferat i impus
obligativitatea investigrii curente, n ceea ce privete prezena de Shigella,
a tuturor alimentelor de origine animal de ctre laboratoarele veterinare
pentru controlul alimentelor de origine animal;
Datele din prezenta lucrare dau numai o orientare general asupra
posibilelor surse de alimente de origine animal care constituie rezervor
de contaminare a consumatorilor cu Shigella, fr a fi luat n considerare
uriaul potenial de contaminare pe care l reprezint zarzavaturile i alte
legume comestibile obinute de pe culturi irigate cu ap provenit din surse
59

poluate din ce n ce mai des cu dejecii umane;


Din 53.304 probe de alimente de origine animal, examinate n
perioada 2000-2004 n Laboratorul de Bacteriologie al Institutului de Igien
i Sntate Public Veterinar, s-au selectat i urmrit n direcia identificrii
shigelelor 1.202 probe de alimente (2,25%). Dintre acestea s-au selectat
i reinut pentru studiu i identificare 58 tulpini din care, pe baza testelor
biochimice i serologice, s-au ncadrat n genul Shigella spp. 9 tulpini,
confirmate ulterior de INCDMI Cantacuzino;
Alimentele din care s-au izolat, identificat i confirmat tulpinile
de Shigella spp. au fost reprezentate de lapte i derivate proaspete din lapte,
produse de patiserie i cofetrie, salat de icre simpl i cu adaos de legume,
crevei ntregi i decorticai i carne de scoici.
Se constat varietatea suporturilor alimentare din care s-au izolat
aceti germeni din vieuitoarele marine, care se consum tot mai mult i n
ara noastr i care fac parte din grupele de risc epidemiologic ca urmare a
contaminrii lor prin intermediul purttorilor, n condiiile lipsei de igien
la recoltarea, depozitarea i prelucrarea lor;
Laptele crud i derivatele proaspete din care s-a izolat Shigella,
proveneau de la productori particulari care nu fac pasteurizarea laptelui
materie prim i care recolteaz, prelucreaz i transport aceste produse n
condiii precare de igien;
Tulpinile de Shigella spp. izolate din produsele de patiserie ar putea s
provin de la purttorii care au contaminat aceste produse n timpul lucrului,
prin nerespectarea condiiilor tehnologice i individuale de igien;
Salata de icre simpl i cu adaosuri de legume, este posibil s fi
fost contaminat cu Shigella de ctre purttori, n condiiile nerespectrii
normelor de igien individual i tehnologic pe fluxul de procesare a
materiilor prime, de la recepie pn la ambalarea produsului finit;
Fructele de mare provenite din import, din care s-a izolat Shigella,
este posibil s fi fost contaminate prin infiltrarea sau chiar prin deversarea
n bazinele de cretere intensiv a acestor vieuitoare a apelor menajere
poluate cu dejecii umane;
Din cele 600 probe de ap recoltate din fntni, lacuri de agrement,
tranduri i din braele de vrsare ale Dunrii (Sulina, Sf. Gheorghe, Chilia)
s-au izolat tulpini prezumtive de Shigella, din care au fost confirmate 5
tulpini;
Apa din unele fntni rurale este posibil s fi fost contaminat prin
infiltrarea deeurilor fecaloide umane, ca urmare a amplasrii latrinelor n
apropierea fntnilor, iar apa din tranduri este posibil s fi fost contaminat
cel mai probabil direct de la purttorii cronici de Shigella n condiiile unei
60

clorinri ineficiente a apei din bazinele de not;


Apa din lacurile de agrement din Bucureti i din braele Chilia,
Sulina i Sf. Gheorghe este posibil s fi fost poluat cu Shigella prin
deversarea haznalelor de la colectivitile umane din perimetrele nveci
nate;
Pentru verificarea concordanei cu datele din literatura de specia
litate, tulpinile confirmate de INCDMI Cantacuzino au fost analizate
pentru evidenierea elementelor de patogenitate prin testul ansei ligaturate
pe iepure.
ntruct criteriile de interpretare a testului clasic sunt susceptibile de
erori, care pot duce la obinerea unor rezultate neconcordante sau chiar
derutante, s-a propus modificarea acestora, lundu-se n calcul numai
parametri obiectivi, rezultatul testului fiind reprezentat de raportul dintre
greutatea lichidului acumulat n lumenul ansei ligaturate i greutatea ansei
dup golirea complet (Enache T., Enache T. Jr., 2005).
n urma studiilor efectuate pe o perioad de 4 ani, pe un numr mare de
probe de alimente de origine animal i pe probe de ap prelevate din diferite
medii naturale (lacuri, fntni, bazine de not, etc.), se poate concluziona
c, din punct de vedere al problemelor de sntate public veterinar, n
Romnia trebuie fcute ample investigaii pentru a se cunoate prevalena
i incidena alimentelor cu potenial real de risc i factorii care influeneaz
i determin declanarea toxiinfeciilor alimentare cu Shigella.
Pe baza acestor rezultate este necesar ca n toate laboratoarele
veterinare pentru controlul alimentelor de origine animal s fie legiferat
obligativitatea diagnosticului curent pentru Shigella, ntruct aceti germeni
fac parte din punct de vedere epidemiologic din aceeai grup de risc din
care face parte toxiinfecia alimentar produs de Salmonella (Enache I,
Enache T. Jr., 2005).

61

62

Shigella sp. Frotiu din fecale.

Shi. flexneri. Microscopie electronic


63

S. boydii pe agar enteric Hektoen

Shigella sonnei. Agar Mac Conkey


64

Shigella sonnei. Congo Red Agar.

Shi.
flexneri.
Agar Luria.
65

Bibliografie selectiv
1. Ashkenazi S (2004) Shigella infections in children: new insights. Semin Pediatr
Infect Dis 15:246-252
2. Ashkenazi S (2004) Shigella infections in children: new insights. Semin Pediatr
Infect Dis 15:246-252
3. Baird-Parker AC (1994) Foods and microbiological risks. Microbiology 140:687695
4. Baird-Parker AC (1994) Foods and microbiological risks. Microbiology 140:687695
5. Baylis, C. L., Penn, C. W., Thielman, N. M., Guerrant, R. L., Jenkins, C. and
Gillespie, S. H., 2006. Escherichia coli and Shigella spp., In Principles and Practice
of Clinical Bacteriology. Second Edition. S. H. Gillespie and P. M. Hawkey Eds.,
John Wiley & Sons Ltd, London: p 347-365.
6. Brian MJ, Van R, Townsend I, Murray BE, Cleary TG, Pickering LK (1993)
Evaluation of the molecular epidemiology of an outbreak of multiply resistant
Shigella sonnei in a day-care center by using pulsed-field gel electrophoresis and
plasmid DNA analysis. J Clin Microbiol 31:2152-2156
7. Brian MJ, Van R, Townsend I, Murray BE, Cleary TG, Pickering LK (1993)
Evaluation of the molecular epidemiology of an outbreak of multiply resistant
Shigella sonnei in a day-care center by using pulsed-field gel electrophoresis and
plasmid DNA analysis. J Clin Microbiol 31:2152-2156
8. Caprioli A, Morabito S, Brugre H, Oswald E., 2005. Enterohaemorrhagic
Escherichia coli: emerging issues on virulence and modes of transmission. Vet Res.
2005. 36(3):289-311.
9. Center for Disease Control and Prevention (2002) Shigella. Annual Summary.
Department of health and human services. National Center for Infectious Diseases.
Division of Bacterial and Mycotic Diseases. Foodborne and Diarrheal Diseases
Branch. Atlanta, GA
10. Center for Disease Control and Prevention (2002) Shigella. Annual Summary.
Department of health and human services. National Center for Infectious Diseases.
Division of Bacterial and Mycotic Diseases. Foodborne and Diarrheal Diseases
Branch. Atlanta, GA
11. Chen Q, Savarino SJ, Venkatesan MM., 2006, Subtractive hybridization and optical
mapping of the enterotoxigenic Escherichia coli H10407 chromosome: isolation of
unique sequences and demonstration of significant similarity to the chromosome of
Escherichia coli K-12. Microbiology. Apr;152(Pt 4):1041-54.
12. Cheryl L. Tarr, Adam M. Nelson, Lothar Beutin, Katharina E. P. Olsen, and Thomas
S. Whittam. 2008, Molecular Characterization Reveals Similar Virulence Gene
66

Content in Unrelated Clonal Groups of Escherichia coli of Serogroup O174 (OX3)


J. Bacteriol. 2008 190: 1344-1349.
13. de Sablet T, Bertin Y, Vareille M, Girardeau JP, Garrivier A, Gobert AP, Martin C.,
2008., Differential expression of stx2 variants in Shiga toxin-producing Escherichia
coli belonging to seropathotypes A and C., Microbiology. 154:176-86.
14. DeLappe N, OHalloran F, Fanning S, Corbett-Feeney G, Cheasty T, Cormican M
(2003) Antimicrobial resistance and genetic diversity of Shigella sonnei isolates
from western Ireland, an area of low incidence of infection. J Clin Microbiol
41:1919-1924
15. DeLappe N, OHalloran F, Fanning S, Corbett-Feeney G, Cheasty T, Cormican M
(2003) Antimicrobial resistance and genetic diversity of Shigella sonnei isolates
from western Ireland, an area of low incidence of infection. J Clin Microbiol
41:1919-1924
16. Devasia RA, Jones TF, Ward J, Stafford L, Hardin H, Bopp C, Beatty M, Mintz
E, Schaffner W., 2006. Endemically acquired foodborne outbreak of enterotoxinproducing Escherichia coli serotype O169:H41. Am J Med. 2006 Feb;119(2):168.
e7-10.
17. Donnenberg, M. S., 2002, Escherichia coli virulence mechanisms of a versatile
pathogen, London, Academic Press.
18. Duffy, G., Garvey, P. and McDowell, D. A., 2001, Verocytotoxigenic Escherichia
coli, Trumbull, Connecticut, Food & Nutrition Press Inc.
19. DuPont HL, Levine MM, Hornick RB, Formal SB (1989) Inoculum size in shigellosis
and implications for expected mode of transmission. J Infect Dis 159:1126-1128
20. DuPont HL, Levine MM, Hornick RB, Formal SB (1989) Inoculum size in shigellosis
and implications for expected mode of transmission. J Infect Dis 159:1126-1128
21. EFSA, 2007, Monitoring of verotoxigenic Escherichia coli (VTEC) andidentification
of human pathogenic VTEC types, Scientific Opinion of the Panel on BIOLOGICAL
HAZARDS (Question No EFSA-Q-2007-036) The EFSA Journal.
22. Hyams KC, Bourgeois AL, Merrell BR, et al. (1991) Diarrheal disease during
Operation Desert Shield. N Engl J Med 325:1423-1428
23. Hyams KC, Bourgeois AL, Merrell BR, et al. (1991) Diarrheal disease during
Operation Desert Shield. N Engl J Med 325:1423-1428
24. Kaper, J. B. and OBrien, A. D., 1998, Escherichia coli O157:H7 and other Shiga
toxin-producing Escherichia coli strains, Washington D.C, ASM Press.
25. Karmali, M. A., 2003, The medical significance of Shiga toxin-producing Escherichia
coli infections. An overview. Methods Mol. Med. 73: 1-7
26. Le Gall T, Darlu P, Escobar-Pramo P, Picard B, Denamur E., 2005, Selectiondriven transcriptome polymorphism in Escherichia coli/Shigella species. Genome
Res. Feb;15(2):260-8.
27. Lee TM, Chang CY, Chang LL, Chen WM, Wang TK, Chang SF (2003) One
67

predominant type of genetically closely related Shigella sonnei prevalent in four


sequential outbreaks in school children. Diagn Microbiol Infect Dis 45:173-181
28. Lee TM, Chang CY, Chang LL, Chen WM, Wang TK, Chang SF (2003) One
predominant type of genetically closely related Shigella sonnei prevalent in four
sequential outbreaks in school children. Diagn Microbiol Infect Dis 45:173-181
29. Lee TM, Chang LL, Chang CY, Wang JC, Pan TM, Wang TK, Chang SF (2000)
Molecular analysis of Shigella sonnei isolated from three welldocumented outbreaks
in school children. J Med Microbiol 49:355-360
30. Lee TM, Chang LL, Chang CY, Wang JC, Pan TM, Wang TK, Chang SF (2000)
Molecular analysis of Shigella sonnei isolated from three welldocumented outbreaks
in school children. J Med Microbiol 49:355-360
31. Litwin CM, Leonard RB, Carroll KC, Drummond WK, Pavia AT (1997)
Characterization of endemic strains of Shigella sonnei by use of plasmid DNA
analysis and pulsed-field gel electrophoresis to detect patterns of transmission. J
Infect Dis 175:864-870
32. Litwin CM, Leonard RB, Carroll KC, Drummond WK, Pavia AT (1997)
Characterization of endemic strains of Shigella sonnei by use of plasmid DNA
analysis and pulsed-field gel electrophoresis to detect patterns of transmission. J
Infect Dis 175:864-870
33. Liu PYF, Lau YJ, Hu BS, Shyr JM, Shi ZY, Tsai WS, Lin YH, Tseng CY (1995)
Analysis of clonal relationships among isolates of Shigella sonnei by different
molecular typing methods. J Clin Microbiol 33:1779-1783
34. Liu PYF, Lau YJ, Hu BS, Shyr JM, Shi ZY, Tsai WS, Lin YH, Tseng CY (1995)
Analysis of clonal relationships among isolates of Shigella sonnei by different
molecular typing methods. J Clin Microbiol 33:1779-1783
35. Morabito S, Karch H, Mariani-Kurkdjian P, Schmidt H, Minelli F, Bingen E, Caprioli
A., 1998, Enteroaggregative, Shiga toxin-producing Escherichia coli O111:H2
associated with an outbreak of hemolytic-uremic syndrome. J Clin Microbiol. 1998.
36(3):840-2.
36. Nataro J. P. and Kaper, J. B., 1998, Diarrheagenic Escherichia coli. Clin. Microbiol.
Rev. 1998. 11(1): 142-201.
37. Scheutz, F. and Strockbine, N. A., 2005, Escherichia. Bergeys manual of systematic
bacteriology. G. M. Garrity, D. J. Brenner, N. R. Krieg and J. T. Staley Eds. New
York, NY, Springer,: 607-624.17
38. Scheutz, F. and Strockbine, N. A., 2005, Escherichia. In Bergeys manual of
systematic bacteriology, G. M. Garrity, D. J. Brenner, N. R. Krieg and J. T. Staley
Eds. New York, NY, Springer,: 607-624.
39. Scheutz, F., Beutin, L., Pierard, D. and Smith, H. R., 2001, Nomenclature of Vero
cytotoxins. In Verocytotoxigenic Escherichia coli, G. Duffy, P. Garvey and D. A.
McDowell Eds. Trumbull, Connecticut, Food and Nutrition Press Inc: 447-452. 16
68

40. Simona Ivana, 2002 Bacteriologie veterinar special (Ed. Ceres, Bucureti; 460
pagini), ISBN: 973-40-0568-5
41. Simona Ivana, 2005 Bacteriologie general (Ed. tiinelor medicale, Bucureti;
250 pagini), ISBN: 973-86485-7-2
42. Simona Ivana, 2006 Tratat de bacteriologie medical-veterinar i introducere n
micologie (Ed. tiinelor medicale, Bucureti;768 pagini), ISBN (10) 973-865715-6; ISBN (13) 978-973-86571-5-1
43. Simona Ivana, 2007 Manual de microbiologia alimentelor (Ed. tiinelor medicale,
Bucureti; 160 pagini), ISBN: 978-973-86571-3-7
44. Simona Ivana, 2007 Microbiologie medical veterinar, Vol. I (Ed. tiinelor
medicale, Bucureti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-01-6
45. Simona Ivana, 2007 Microbiologie medical veterinar, Vol. II (Ed. tiinelor
medicale, Bucureti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-02-3
46. Simona Ivana, 2008, Microbiologia alimentelor, Ed. Orizonturi, ISBN: 978-973736-090-8
47. Simona Ivana, 2008, Practical guide of microbiogical diagnosis, Ed. Orizonturi,
ISBN: 978-973-736-089-2
48. Sussman, M., 1997, Escherichia coli, Mechanisms of virulence, Cambridge,
Cambridge University Press.
49. Traian Enache, tefan Nicolae, tefan Enache jr., Felicia Hlciuc, 2005,
Toxiinfecii alimentare, prin alimente de origine animal contaminate cu Shigella
spp., Editura Coral Sanivet.
50. Welch RA, Burland V, Plunkett G 3rd, Redford P, Roesch P, Rasko D, Buckles EL,
Liou SR, Boutin A, Hackett J, Stroud D, Mayhew GF, Rose DJ, Zhou S, Schwartz
DC, Perna NT, Mobley HL, Donnenberg MS, Blattner FR, 2002, Extensive mosaic
structure revealed by the complete genome sequence of uropathogenic Escherichia
coli. Proc Natl Acad Sci U S A. Dec 24;99(26):17020-4.
51. Wick LM, Qi W, Lacher DW, Whittam TS, 2005, Evolution of genomic content in
the stepwise emergence of Escherichia coli O157:H7, J Bacteriol. Mar; 187(5):178391.
52. Wickham, M. E., Lupp, C., Mascarenhas, M., Vazquez, A., Coombes, B. K., Brown,
N. F., Coburn, B. A., Deng, W., Puente, J. L., Karmali, M. A. and Finlay, B. B, 2006,
Bacterial genetic determinants of non-O157 STEC outbreaks and hemolytic-uremic
syndrome after infection. J. Infect. Dis. 194(6): 819-827
53. Yang J, Nie H, Chen L, Zhang X, Yang F, Xu X, Zhu Y, Yu J, Jin Q., 2007, Revisiting
the molecular evolutionary history of Shigella spp. J Mol Evol. Jan;64(1):71-9.

69

CAPITOLUL 2
Implicaiile bacteriilor din genul
Escherichia n producerea toxiinfeciilor
alimentare
2.1. Caractere generale
Enterobacteriaceele sunt prezente n intestinul animalelor i al omului,
iar fecalele conin peste 1010 per gram enterobacterii, de unde ajung n
mediul ambiant (sol, ap, plante, animale). Sunt cunoscute ca fiind agenii
etiologici ai sindromului diareic infecios.
Grupul coliformilor se limiteaz la bacterii care cresc n tractul
gastrointestinal al omului i al animalelor i include 5 genuri: Escherichia,
Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Raoultella - adugat de curnd,
formnd o parte din genul Klebsiella. Aceste bacterii prezint o mare
importan pentru microbiologia alimentar deoarece reprezint unul din
cei mai utilizai indicatori microbiologici sanitari care reflect condiiile
de igien la prelucrarea i manipularea produselor, iar n multe situaii
reflect modul de respectare al diferitelor tratamente termice (de exemplu,
pasteurizare) aplicate diverselor produse. Separarea bacteriilor coliforme
n cele de origine fecal i nefecal se face prin folosirea temperaturilor
ridicate.
Prin definiie grupul coliformilor fecali conine bacili sau cocobacili
Gram negativi, nesporogeni, aerobi i facultativ anaerobi, mobili prin
flageli peritrichi sau imobili care fermenteaz lactoza cu producere de gaz
i produc colonii nchise la culoare ce au suprafaa cu luciu metalic i reflex
auriu-verzui n decurs de 48 de ore la 45,5C.
Din genul Enterobacter, speciile mai importante pentru microbiologia
alimentar sunt: E. (Pantoea) agglomerans, care a fost transferat n genul
Pantoea i E. sakazakii.
Citrobacter produce colonii tipice pigmentate n galben, fermenteaz
lent lactoza i utilizeaz citratul ca unic surs de carbon. Specia prevalent
din alimente este C. freundii, care se gsete de obicei n legume i carnea
70

proaspt.
Klebsiella cuprinde mai multe specii trecute de curnd n genul
Raoultella: K. (Raoultella) terrigena, R. planticola, R. ornitinolytica, ce se
izoleaz din sol, ap, plante, dar i de la nivelul tubului digestiv. Contamineaz
frecvent alimentele, de obicei n asociaie cu alte microorganisme,
determinnd alterarea acestora.
Escherichia coli este larg rspndit n natur i reprezint microflora
dominant a intestinului gros, de unde prin intermediul fecalelor se elimin
n mediul exterior contaminnd solul, apa, furajele, alimentele, etc. Tulpinile
capabile de a provoca mbolnviri la om se situeaz ntr-una din cele 4
categorii de Escherichia coli enteropatogen:
1. Tulpini enteropatogene (EPEC);
2. Tulpini enterotoxigene (ETEC);
3. Tulpini enterohemoragice (EHEC);
4. Tulpini enteroinvazive (EIEC).

2.2. Istoric
Pentru prima dat n 1885 Theobold Escherich a izolat germenul din
fecalele unor copii sugari, cu diaree. Implicaiile lui n patologia veterinar
au fost recunoscute treptat, pe msura acumulrii cunotinelor dobndite n
acest domeniu.
Prezena n filtratele culturilor unor tulpini de Escherichia coli a unei
citotoxine necunoscute pn atunci, activ pe celulele Vero, a fost relatat
de Konowalchuk i colaboratorii n 1977.
Un antiser preparat mpotriva unei citotoxine Vero (VT) parial
purificate, obinut de la tulpina de Escherichia coli productoare de
VT (ECVT) prototip H30 (serotip O26:H11) a neutralizat activitatea
verotoxinelor provenite de la 8 din 10 tulpini pozitive pentru VT, dar nu
i pentru celelalte dou, sugernd existena unei heterogeniti serologice,
observaie care a fost confirmat ulterior.
apte tulpini ECVT au provenit de la pacieni cu gastroenterit,
sugernd faptul c VT a fost un factor de virulen n boala enteric.
n 1983, OBrien i La Veck au purificat i caracterizat toxina H30
i au demonstrat c este un polipeptid subunitar similar toxinei produse de
Shigella dysenteriae tipul 1. De atunci a fost denumit Shigella-like toxin
(SLT-toxin asemntoare toxinei Shiga).
n 1983, Riley i colaboratorii, de la Centrul de Control al Bolilor
din Atlanta, au coordonat investigaiile epidemiologice n dou episoade de
71

boal, puin neleas, pe care au numit-o colit hemoragic, caracterizat


prin crampe abdominale severe, diaree hemoragic i absena unei febre
semnificative. Au descoperit o legtur strns ntre boal i consumul de
hamburgeri, ntr-un lan comercial fast-food.
Investigaiile microbiologice au demonstrat asocierea dintre boal
i prezena unei tulpini de Escherichia coli aparinnd serotipului rar
O157:H7, care mai trziu a fost dovedit ca productor de VT.
Tot n 1983, Karmali i colaboratorii, n Toronto, au stabilit legtura
dintre infecia cu ECVT aparinnd ctorva serotipuri, inclusiv O157:H7 i
sindromul uremic hemolitic (SUH), o stare patologic a crei etiologie era
necunoscut i care fusese descris pentru prima dat n 1955.
SUH se manifest printr-o triad de caracteristici: insuficien renal
acut, trombocitopenie i anemie microangiopastic hemolitic, care, n
sindromul clasic apar la cteva zile dup declanarea diareei sangvinolente,
asemntoare unei colite hemoragice.
n ultimul deceniu s-au nregistrat progrese semnificative n nelegerea
epidemiologiei i patogenezei infeciei cu ECVT, care a fost recunoscut
drept o infecie zoonotic major la om.
Holt i colaboratorii (1994) grupeaz cele dou entiti taxonomice
nrudite, Escherichia i Shigella, ntr-un singur gen, numit Escherichia
Shigella.

2.3. Taxonomie
n cadrul genului sunt incluse 5 specii de Escherichia: Escherichia
coli (cu dou biovaruri: Escherichia coli normal i Escherichia coli inactiv),
Escherichia fergusonii, Escherichia hermannii, Escherichia vulneris,
Escherichia blattae, Escherichia adecarboxylata, Escherichia albertii.
Descoperirea unei toxine VT1, la Escherichia coli, care este virtual
identic toxinei Shiga, produs de Shigella dysenteriae, tip 1 nu este
surprinztoare.
Proprietatea produciei VT distinge ECVT de alte serotipuri de
Escherichia coli enterice, patogene, de tipul Escherichia coli enterotoxigen,
Escherichia coli enteroinvaziv, Escherichia coli enteropatogen i Escherichia
coli enteroagregativ.
Mai mult de 150 de serotipuri OH ECVT diferite au fost pn acum
asociate cu boala de la om. Multe altele au fost izolate exclusiv de la
animale.
Termenul Escherichia coli enterohemoragic (EHEC) a fost aplicat
acelor serotipuri VT EC, care au caracteristici clinice, epidemiologice i
72

patogenetice identice celor asociate tulpinii prototip de Escherichia coli


O157:H7.
Whittam i colaboratorii au investigat originea clonal a tulpinilor
ECVT O 157 prin testarea variaiei alelice la aproape 20 de loci enzimatici
diferii prin electroforeza multilocus enzimatic.
Tulpinile de Escherichia coli O157:H7 provenind de la diverse surse
constituie un grup clonal genetic distinct, care este mai slab nrudit cu ECVT
din alte serotipuri.
Pe de alt parte, n comparaie cu tulpinile EPEC, clona O157:H7 s-a
dovedit a fi strns nrudit cu tulpinile clonei O55:H7, care au fost de mult
vreme asociate episoadelor de diaree infantil semnalate n ntreaga lume.

2.4. Morfologie
Escherichia coli este o bacterie Gram negativ, de form bacilar
sau cocobacilar cu dimensiuni de 1-1,5/2-6 microni. Este nesporogen, n
general flagelat peritrich.
Exist tulpini capsulogene i necapsulogene. Unele tulpini prezint
fimbrii i sunt hemaglutinante.
Au fost identificate dou tipuri fimbriale: tipul 1, care sunt manozsensibile i tipul 2, manoz-rezistente, caracterizate printr-o mare diversitate
antigenic.
Fimbriile manoz rezistente mplinesc funcia unor factori de
patogenitate.
Unele tulpini prezint plasmide F, fiind prevzute cu pil de sex,
detectabile serologic sau cu ajutorul fagilor sexuali.

2.5. Condiii de cultivare i caractere culturale


Escherichia coli este o bacterie aerob sau facultativ anaerob i se
dezvolt optim la 37C (temperatur la care sunt produse i exotoxinele,
enterotoxinele, hemolizinele). Se poate dezvolta i la temperaturi cuprinse
ntre 14-44C sau n anaerobioz.
n bulion, variantele S se dezvolt n 24 de ore i determin
turbiditate uniform, fr sedimentare, iar variantele R tulbur mai mult
sau mai puin mediul, formnd la suprafa inel sau vl i depozit, pe fundul
eprubetei.
Pe mediile solide variantele S formeaz colonii de 2-3 mm, rotunde,
bombate, umede, cu suprafa neted i margini regulate, iar variantele R,
colonii rotunde, plate, de mrime mijlocie, cu suprafa rugoas i margini
73

neregulate.
Exist i tulpini care dau colonii mucoide. Pe agar snge de iepure,
unele tulpini (n special cele izolate de la porcine) determin hemoliz
incomplet, fr legtur cu enteropatogenitatea.
Longevitatea germenilor n culturi pe medii uzuale este de 2-3 luni.
Culturile bacteriene degaj un miros caracteristic de amoniac.

2.6. Proprieti biochimice


Escherichia coli produce indol, reacioneaz negativ la testul VogesProskauer i pozitiv la testul cu rou metil, nu produce hidrogen sulfurat, nu
descompune ureea, nu lichefiaz gelatina, fermenteaz glucoza i lactoza cu
producie de gaz.
Tabelul 2.1
Principalele caractere exoenzimatice ale speciilor din genul Escherichia
(dup Carp-Crare M., 1997)
E.
E.
E.
E.
Escherichia
Testul
fergusonii hermannii vulneris
blattae
coli
Indol
+
+
+
Lyzin decarboxilaza
+
+
(+)
Ornitin decarboxilaza
d
+
+
Mobilitate
+
+
+
+
KCN
+
(-)
Malonat
d
(+)
Glucoz gaz
+
+
+
+
D-adonitol
L-arabinoz
+
+
+
+
D-arabinol
Celobioz
+
+
+
Lactoz
+
d
(-)
Manitol
+
+
+
+
D-sorbitol
+
Voges-Proskauer
H2S
Catalaz
+
+
+
+
Legend: + = 90-100% din tulpini reacioneaz pozitiv; - = 90-100% din
reacioneaz negativ; d = reaciile difer de la o tulpin la alta.
74

+
+
+
+
+
+
tulpini

Importani liganzi la Escherichia coli sunt fimbriile Pap (pilli associated


with pyelonephritis), numite i pili P, pentru c au, ca receptor, antigenul
de grup sanguin P, prezent nu numai pe hematii, ci i pe uroepiteliu i n
mucusul urinar.
Avnd n vedere prevalena categoric a Escherichia coli de biotip
1 n totalul microorganismelor prezente n fecalele omului i animalelor,
organismele internaionale de specialitate au stabilit c ea reprezint
indicatorul sanitar cel mai important i cel mai fidel pentru aprecierea
contaminrii fecale a apei i alimentelor.
Din aceleai motive Comitetul American Naional pentru Criteriile
Microbiologice la Alimente (NACMFC) a introdus de civa ani Escherichia
coli biotip 1 (Escherichia coli generic) ca indicator igenico-sanitar i test
obligatoriu pentru verificarea la nivelul abatoarelor a contaminrii fecale a
carcaselor animalelor de mcelrie i ale psrilor.
Acest test a fost introdus i n ara noastr i se regsete n Programul
Naional al Aciunilor Strategice Sanitar-Veterinare.

2.7. Proprieti antigenice


n cadrul speciei Escherichia coli exist o mare heterogenitate
antigenic.
Principalele antigene identificate sunt urmtoarele:
antigene somatice, notate cu O;
antigene capsulare, notate cu K;
antigene flagelare, notate cu H;
antigene fimbriale, notate cu F;
antigene comune cu alte enterobacteriacee, notate cu M.
n cadrul fiecrei categorii exist mai multe fraciuni antigenice, pe
baza crora au fost identificate peste 173 de antigene O, 101 antigene K
i 56 antigene H.
Antigenele O difereniaz specia n serogrupe i sunt de natur
lipopoliglucidic. Antigenele somatice cresc persistena bacteriilor n
tractusul urinar.
Antigenele poliglucidice capsulare K au proprietatea de a proteja
colibacilii fa de complement i fagocite favoriznd aderarea lor la
enterocite.
Antigenele K se subdivid n trei tipuri A, B i L dintre care numai
cele de tip A (termostabile) sunt antigene capsulare adevrate, n timp ce
antigenele B (relativ termostabile) i L (termolabile) sunt de nveli.
Antigenele fimbriale (adezinele fimbriale), de natur proteic,
75

faciliteaz aderarea colibacililor la enterocitele jejunale i ileale, evitnd


evacuarea lor n intestinul gros prin peristaltism.
Adezinele fimbriale sunt notate cu F1, F2, F3, F4, F18, F41, F165. Primele
trei tipuri sunt specifice colibacililor patogeni pentru om. Antigenul F4 este
sinonim cu K88, fiind prezent la tulpinile enterotoxigene pentru purcei, F5
(K99), identificat la tulpinile enterotoxigene de la viei, F6, sinonim cu 987
P.
Spre deosebire de antigenele somatice, capsulare i flagelare,
determinate de gene cromozomale, antigenele fimbriale sunt de regul
controlate de gene plasmidice.
Tabelul 2.2
Tipuri de antigene fimbriale la Escherichia coli
(dup Orskov)
Tipul de antigen fimbrial

Denumiri anterioare

Asocieri patologice

F1
F2
F3
F4
F5
F6
F7
F8
F9
F10
F11
F12

Tipul I
CFA I
CFA II
K88
K 99
K 987
C 1212
C 1254-79
3669
C 1960-79
C 1976-79
C 1979-79

Antigene fimbriale comune


ETEC la om
ETEC la om
ETEC la porc
ETEC la bovine
ETEC la porc
ITU la om
ITU la om
ITU la om
ITU la om
ITU la om
ITU la om

Pe baza structurii antigenice, colibacilii au fost clasificai n serogrupe


i serotipuri. Grupele au fost constituite pe baza identitii de structur
antigenic somatic i se noteaz cu numrul antigenului precedat de
iniiala indicatoare O. Exist relaii ntre structura antigenic somatic i
patogenitatea tulpinilor pentru diferite specii de animale.
Pentru serotipizare se folosete reacia de seroaglutinare, iar pentru
identificarea antigenelor fimbriale i a celor capsulare se poate aplica i
seroprecipitarea n gel.
n practica de laborator, pentru identificarea serologic a tulpinilor
patogene de Escherichia coli se execut aglutinarea OK.
Tulpinile vii care posed antigene K nu sunt aglutinate de serul
76

omolog anti O. De aceea, se lucreaz cu tulpini tratate termic (pentru


distrugerea antigenelor de nveli K, care ar mpiedica aglutinarea
antigenelor O) atunci cnd se urmrete identificarea antigenelor K.

2.8. Sensibilitatea fa de factorii de mediu


Escherichia coli rezist la 55C timp de o or i 15-20 minute la
60C. n fecale i gunoi de grajd, meninute ntr-un mediu umed, pot s
supravieuiasc 45 de zile, n sol 45-140 zile, n apa de canal 70-270 zile.
Este sensibil la aciunea dezinfectantelor uzuale (sod caustic 1-2%,
aldehid formic 1%, clorur de var cu 1-2% clor activ, etc.) i a coloranilor
din grupa trifenil metanului) ca verdele briliant i verdele de malachit.
Antibioticele cele mai active sunt tetraciclina, gentamicina, polimixina,
neomicina, amoxicilina, cloramfenicolul, colimicina, iar chimioterapicele:
sulfatiazol, sulfametazin, nitrofuran, furazolidon.
Dobndesc cu uurin mutante rezistente la antibiotice datorit
prezenei unor plasmide (factor R), care se pot rspndi repede n populaia
de bacterii.
Majoritatea informaiilor privind creterea i rezistena se bazeaz
n mod curent pe studiile asupra serotipului Escherichia coli O157:H7.
Cunoaterea rezistenei n mediu este limitat, dar s-a demonstrat c
O157 poate supravieui perioade ndelungate (> 40 zile) n ap i este
posibil ca mediile contaminate cu materii fecale s fie surse pentru aceste
microorganisme mai mult timp.
n alimente, tulpina O:157 este distins prin pasteurizarea de rutin
a laptelui sau la temperaturile de gtit, n mod similar multor altor bacterii
patogene.
Izolarea tulpinilor O:157 din carnea de vit tocat i congelat, dup
mai multe luni, sugereaz c aceste microorganisme pot persista, n mediu,
n condiii de iarn, perioade foarte lungi.
Capacitatea unor tulpini de a supravieui n condiii de pH sczut (4,5),
ntlnit n episoade asociate cu cidrul i maioneza au ndreptat investigaia
asupra supravieuirii acestor microorganisme n urma diferitelor metode de
preparare a hranei.
Investigaiile ulterioare asupra ecologiei i rezistenei acestui grup
complex de ageni patogeni vor fi decisive pentru elaborarea msurilor
eficiente de aprare a sntii publice.
n maioneza comercial E. coli 0157:H7 a supravieuit 35 de zile n
produsele depozitate ntre 5oC i 7oC, dar dup 72 de ore la 25oC bacteria
nu a mai fost detectat n acest produs. Maioneza are un pH de 3,65, iar
77

inoculul de celule bacteriene a fost de ~107 utc/g.


n ceea ce privete tolerana la sare, tulpinile de E. coli 0157:H7
n bulion cu NaCl 4,5% s-a dublat timpul de generaie, n timp ce la
o concentraie de 6,5% NaCl n 36 de ore, timpul de generaie a fost de
31,7ore. Aceti cercettori au observat c dezvoltarea bacteriei este inhibat
la un pH de 8,5% NaCl.
Tulpinile EHEC sunt mult mai sensibile la aciunea temperaturii dect
majoritatea salmonelelor. Un studiu recent asupra valorilor D de temperatur
ntre diferite produse de carne este notat mai jos:
- carnea de vit - 0,45-47
- carne de porc - 0,37-0,55
- carne de pui - 0,38-0,55
- carne de curcan - 0,55-0,58
Valorile D se mresc o dat cu creterea coninutului n grasime. Un
studiu al valorilor D i Z din carnea gras de vac arat urmatoarele:
- 30,5% grsime; D=0,45 minute; Z=8,37oF
- 2,0%grsime; D=0.30 minute; Z=8,30oF
ntr-un alt studiu pe carnea tocat cu un coninut mai mic de grsime
ce coninea tulpina 0157:H7 n inoculum de aproximativ 103/g, aceasta a
fost distrus cnd temperatura intern a atins valoarea de 66oC, 68oC sau
72oC. Din sucul de mere Escherichia coli 0157:H7 a fost distrus la 66oC
n 1,6 minute.
n ceea ce privete rezistena la radiaii a tulpinilor EHEC nu se
difereniaz de celelalte bacterii enterice. Din carnea de pui tulpinile de
E. coli 0157:H7 au fost distruse la 5oC de radiaii D de 0,27 kGy, iar la
temperatura de -5oC de radiaii D de 0,42 kGy.

2.9. Patogenitatea
Escherichia coli este o bacterie condiionat patogen cu numeroase
fenotipuri patogene (patotipuri).
Genele cromozomale, dar mai ales resortarea variailor factori de
patogenitate prin transfer plasmidic i conversie lizogenic determin
constituirea numeroaselor sale patotipuri diareigene i uropatogene.
Unele tipuri sunt predominant toxigene n timp ce altele sunt virulente
i invazive.
Pe baza mecanismului de aciune de la nivelul tubului digestiv, tulpinile
de Escherichia coli se mpart n enteroinvazice i enterotoxice.
Enteroinvazivitatea se datoreaz posibilitii bacteriei de a penetra
78

epiteliul intestinal, iar enterotoxicitatea se datoreaz producerii de


enterotoxine.
Enterotoxinele sunt exotoxine elaborate de colibacili in vitro i in vivo.
Au fost identificate o enterotoxin termolabil i imunogen (LT) i dou
enterotoxine termostabile i imunogene (ST I i ST II).
Acestea sunt elaborate de tulpinile de Escherichia coli care posed
K88 i K99 i alte antigene cu rol n colonizarea colibacililor.
Enterotoxinele
Toxina LT este distrus la 60oC n 30 de minute, n timp ce ST poate
suporta 100oC, 15 minute.
Toxina LT este o protein cu o greutate molecular de aproximativ
91 kDa, posednd o activitate enzimatic similar cu cea a toxinei holerice
(CT= cholera toxin). n timp ce CT este transportat din citoplasm la
exteriorul celulelor producatoare, LT este depozitat n periplasm. Mai
mult, antiserurile pentru CT neutralizeaz LT, iar imunizarea cu CT induce
protecia, att mpotriva lui CT ct i a lui LT.
Aceste toxine sunt produse n faza timpurie de producere a tulpinilor,
cu o cantitate maxim de ST dup 7 ore de cretere ntr-un mediu cu extract
de drojdii cu 0,2% glucoz.
n mediu sintetic ST a aprut dup 8 ore, atingnd maximul de cantitate
produs dup 24 de ore, n condiii aerobe.
Cu toate c LT i ST se dezvolt n orice condiii care permit dezvoltarea
celular, eliberarea lui LT din celule ntr-un mediu mbogit a avut loc cel
mai favorabil la un pH de 7,5-8,5.
Toxina LT este compus din 2 protomeri:
- A: cu o greutate molecular de 25,5 kDa, care atunci cnd se combin
cu tripsin devine A1 enzimatic activ i formeaz un lan polipeptidic de
21 kDa legat printr-o legatur disulfidic cu un lan tip A2.
- B: de 59 kDa format din 5 lanuri polipeptidice legate individual
necovalent; LTB constituie subunitatea de legatur, n timp ce LTA
stimuleaz sistemul adenilat ciclazei.
LTA i LTB posed proprietai imunologice similare subunitilor A i
B ale toxinei lui Vibrio cholerae. LTh i LTp desemneaz tulpinile umane
i porcine.
STa este solubil n metanol i provoac un rspuns secretor la oareci
infantili. Este un peptid format din 18-19 aminoacizi ce conine 3 legturi
disulfidice, avnd o legtur molecular de 1972 Da. Stimuleaz guanilat
ciclaz intestinal. STb este insolubil n metanol fiind de origine porcin.
79

Este cea mai rspndit toxin asociat cu izolatele diareigene de origine


porcin i afecteaz intestinul subire i ileonul purceilor.
Genele pentru STb (EstB) au fost clonate i secvenializate. Toxina
STb sensibil la tripsin este sintetizat de 71 de aminoacizi, fiind clivat
pentru activarea unei molecule de 48 de aminoacizi cu 4 reziduuri de
cistein care strbat membrana intern i ajung n periplasm. Cu toate c
modul de aciune este nc neclar, s-a demonstrat c stimuleaz sinteza de
prostaglandin E2.
Receptorul celular n celulele intestinale de oarece este o protein cu
greutatea molecular de 25 kDa.
Modul de aciune al enterotoxinelor.
Gastroenteritele produse de tulpinile ETEC sunt cauzate de ingestia
de 106-1010 celule viabile per gram, care colonizeaz intestinul subire i
produc enterotoxine. Factorii de colonizare sunt n general fimbriile i
pilii.
Sindromul se caracterizeaz n prima faz prin diaree nesangvinolent
fr exsudate inflamatorii n fecale.
Diareea este apoas, asemntoare cu cea produs de V. cholerae.
Aceasta apare din activarea adenilat ciclazei intestinale de ctre
enterotoxin.
n ceea ce privete LT, protomerul B mediaz legarea moleculei de celule
intestinale. LT se leag de gangliozide, n special de monosialogangliozide
(gangliozidele monosialice) (GM1). CT se leag i el, de asemenea, de
gangliolizidele GM1. Se tie c i LT mparte determinanii antigenici printre
protomerii corespondeni cu toate c nu produc reacii ncruciate. La legare
lanul polipeptidic A catalizeaz ribozilarea proteinei G care activeaz
adenilat-ciclaza i induce creterea AMPC-ului intracelular.
STA se leag ireversibil la un receptor monogangliozid specific
cu afinitate nalt i iniiaz un semnal transmembranar pentru activarea
guanilat-ciclazei declannd producerea de guanozin monofosfat ciclic
(GMPC). Nivelurile ridicate de GMPC din mucoasa intestinal duc la
pierderea de fluide i electrolii. ST difer de CT prin faptul c stimuleaz
numai forma particular de guanilat ciclaz. STb crete cantitile luminale
de 5-hidroxitriptomina i postaglandina E2, ambele fiind mediatori pentru
secreiile intestinale. STb crete cantitile luminale de prostaglandin E2 i
S-hidroxitriptoamin, ambii fiind mediatori ai secreiilor intestinale.
STb crete cantitile luminale de S-hidroxitriptamin i prostaglandin
E2, ambele fiind mediatori pentru secreiile intestinale. STb nu activeaz
guanilat-ciclaza. Genele care controleaz producerea STb sunt nregistrate
80

subclonate i secvenializate.
Mecanismele produse de Shigella, Stx1, Stx2, Stx2e i ricin sunt
asemntoare. Ele sunt N-glicozidaze ce cliveaz un reziduu de adenin
specific din subunitatea 28S a RNA-ului eucariotic, ducnd la inhibarea
sintezei de proteine.
Capacitatea de a produce enterotoxine se evideniaz prin testul ansei
ligaturate, care de regul se face pe iepure, prin administrare intragastric la
oarece sau in vitro, respectiv prin teste serologice.
Endotoxina de natur lipopolizaharidic, prezent i la alte bacterii
Gram negative, favorizeaz diseminarea septicemic i particip la
producerea ocului endotoxic. Se identific cu antigenele somatice O,
fiind determinante pentru ncadrarea n serogrupe. Este responsabil de
producerea septicemiilor, mamitelor, infeciilor urinare.
Hemolizinele alfa i beta acioneaz asupra integritii membranelor
celulare. Sunt incriminate ca ageni etiologici ai bolii edemelor.
Hemolizinele sunt codificate plasmidic i acioneaz ca citotoxine
calciu dependente.
Sideroforii influeneaz aciunea colibacililor enteroinvazivi, ca
urmare a competiiei dintre celulele somatice i cele bacteriene, pentru
utilizarea fierului biodisponibil.
Factorii de patogenitate toxici, cu efect necrozant CNF1 i CNF2 sunt
toxine de natur proteic, ce pot facilita rspndirea bilateral a tulpinilor
uropatogene din tractusul urinar spre i din torentul sangvin.
Acetia sunt:
1. Escherichia coli enterotoxigen (ETEC), fiind grupa cu cea mai
important pondere n patologia enteritelor infecioase la animale.
Acioneaz prin inhibarea absorbiei apei i electroliilor fr lezionarea
mucoasei intestinale, n condiiile meninerii sau exacerbrii exorbiei,
ceea ce se soldeaz cu deficit n balana hidroelectrolitic (deshidratare,
acidoz).
Aceste tulpini se ataaz i colonizeaz intestiul subire prin intermediul
CFAs (colonization factor antigens = factor fenibrial(de colonizare)
Exist 4 tipuri de CFA mature cu I, II, III, IV care au fost clonate i
secvenializate.
CFA-urile sunt codificate n general de aceeai plasmid care codific
enterotoxina termostabil nefiind produse sub 20oC. O data ataate ele
produc una sau dou enterotoxine. O dat ataate ele produc una sau dou
enterotoxine.
ntr-un studiu al tulpinilor ETEC izolate de la 109 pacieni ,cele care
au produs att ST ct i LT erau mai restricionate n serotipurile O:K:H
81

dect cele care produceau doar una dintre aceste toxine.


Spre deosebire de tulpinile EPEC (care cauzeaz diaree la persoanele
foarte tinere), tulpinile ETEC produc diaree atat la copii ct i la aduli.
Acestea reprezint principalele tulpini ce produc diareea cltorului.
Simptomele sunt rareori acompaniate de febr, iar diareea apare subit.
S-a estimat c pentru producerea diareei la aduli sunt necesari
108_1010cfu.
2. Escherichia coli enteropatogen (EPEC, AEEC) cuprinde tulpini
de Escherichia coli, care nu produc enterotoxine i nici verotoxine, dar
posed adezine, cu ajutorul crora ader la enterocitele vilozitare, pe care
pot chiar s le penetreze, producnd enterite.
i exercit patogenitatea prin ataarea la marginea n perie a
enterocitelor vilozitare, urmat de distrugerea acestora i implicit a capacitii
lor de absorbie (attaching and effacing AE), de unde i denumirea grupei
de AEEC).
Exist dou clase de tulpini AEEC:
a) care posed gene numai pentru AE;
b) care posed gene att pentru AE, ct i pentru producerea de toxine
Shiga.
3. Escherichia coli enterohemoragic (EHEC), include tulpinile
care, la fel ca EPEC, ader la mucoasa intestinal i produc distrugerea
microvililor cu efect inflamator, mai ales la nivelul intestinului gros.
Principala lor caracteristic este c elaboreaz verotoxine.
Identificarea EHEC se face prin ncadrarea n serogrupul O157:H7
(pozitiv sau negativ) i, uneori, O26 sau O111 i determinarea capacitii
citotoxice asupra celulelor VERO, genelor care codific SLT I i SLT II;
genei eae A, care codific intimina (proteina responsabil de adeziunea
celular).
4. Escherichia coli enteroinvaziv (EIEC) determin un sindrom
diareic dezinteriform.
Procesul invaziv are 4 faze:
penetrarea EIEC n celulele M din mucoasa colonului;
captate din aceste celule de ctre macrofage, bacteriile se elibereaz
subepitelial i se ataeaz la suprafaa celulelor intestinale;
bacteriile se multiplic activ intracelular i intercelular i se
rspndesc rapid n submucoas prin intermediul fagocitelor n care
supravieuiesc;
82

moartea celulelor intestinale, ca urmare a blocrii sintezei proteice,


precum i a leziunilor citoplasmatice ireversibile, ceea ce determin i
ulceraiile tipice pe fond inflamator.
5. Escherichia coli enteroagregativ (EAggEC)
Aceast grup se inrudete cu EPEC, dar aderena agregativ
manifestat de aceast tulpin este unic.
Tulpinile ader la celulele Hep-2 sub forma unor crmizi aezate
una peste alta (Stacked-Brick-Typ) i prezint o plasmid necesar pentru
producia de fenibrii responsabile de aderare i pentru producia unei
proteine specifice a membranei externe(OMP).
Anticorpii specifici OMP previn aderena la celulele Hep-2.
O prob de DNA de EAggEC a fost construit prin folosirea unui
fragment de Kilobaza(kb) 1,0 din plasmida Mda-60 a tulpinilor 03:H2, i a
fost gasit specific pentru aceste tulpini n proporie de 99%.
Unele tulpini EAggEC produc o enterotoxin termostabil care a fost
denumit EAST1. Gena plasmidic pentru EAST1 este ast A care codific o
molecul de 38 de aminoacizi n contrast cu ast A care codific enterotoxina
Sta de 72 de aminoacizi.
Aceste tulpini produc o enterotoxin /citotoxin de 108kDa localizat
pe o plasmid de virulen. Manifestarea chimic specific tulpinilor
EAggEC este diareea persistent care poate dura mai mult de 14 zile, n
special la copii. Aceste tulpini nu reprezint ns cauza principal a diareei
cltorului.Nu este ns foarte clar dac aceste tulpini reprezint patogeni
alimentari.
Tabelul 2.3.
Cteva serotipuri O ale celor 5 tipuri de virulen
EAggEC
3
4
6
7
17
44
51
68
73
75
77
78

EHEC
2
5
6
4
22
26
38
45
46
82
84
88

EIEC
28 ac
29
112 a
124
135
136
143
144
147
152
164
167
83

EPEC
18 ab
19 ac
55
86
111
114
119
125
126
127
128 ab
142

ETEC
6
8
15
20
25
27
63
78
80
85
101
115

EAggEC
85
111
127
142
162

EHEC
91
103
113
104
111
116
118
145
153
156
157
163

EIEC

EPEC
158

ETEC
128 ac
139
141
147
148
149
153
159
167

Tabelul 2.4
Cazuri de gastroenterite alimentare provocate de Escherichia coli patogen
Anul

ara

Sursa alimentar

1947
1961

Anglia
Romnia

1963

Japonia

1966
1967
1971
1980
1981
1982

Japonia
Japonia
SUA
SUA
SUA
SUA

salam
substitut de cafea
ohagi - mncare
tradiional din orez
legume
sushi
brnzeturi importate
carne de vit
carne de vit
carne de vit

Nr. de victime/
Nr. de risc

Toxina/
Tipul tulpinii

Serotip

47/300
10/50

EIEC
EPEC

O124
O86:B7:H34

17/31

EIEC

O124

244/435
835/1736
387/?
500/3000
282/3000
26/?

EIEC
?
EIEC
ETEC
ETEC (LT)
EHEC

O124
O11
O124:B17
O6:H16
O25:H+
O157:H7

Verocitotoxinele (toxinele Shiga-like)


Verotoxinele cuprind o familie de proteine subunitare, nrudite, al
crei prototip VT1 este virtual identic toxinei Shiga.
A doua toxin major VT2 are un numr de variante strns nrudite,
incluznd VT2c i VT2e.
Verotoxinele sunt printre cele mai puternice substane biologice
cunoscute, toxice pentru celule n concentraii de pico la nanomolar.
Utilizarea diferitelor denumiri pentru toxinele majore i subtipurile
84

acestora a condus la propunerea raionalizrii denumirii, astfel nct termenul


VT este interschimbabil cu SLT (Shiga-like toxin) i desemnarea subtipului
este identic. Astfel, SLTIIc este interschimbabil cu VT2c.
Receptorul funcional pentru toxina Shiga, VT1, VT2 i VT2c este
glico-lipidul de membran celular de mamifer, globotriosilceramida
(Gb3).
Aceste toxine sunt prin excelen inhibitori ai translaiei, activi la
concentraii de pico sau nanomolar.
Tipurile majore de toxine ale familiei VT au fost clonate i secveniate
la nivel transcripional.
O boal a ogarilor de curse denumit boala de Alabama sau
vasculopatia cutanat i glomerulorenal idiopatic, se aseamn izbitor
cu SUH de la om. Recent a fost demonstrat ca fiind asociat infeciei cu
ECVT.
Fundamental, n leziunile microangiopatice observate la nivelul
glomerulilor renali ai pacienilor cu SUH este edemul caracteristic al
celulelor endoteliale din capilare, nsoit de depunerea de fibrin i ocluzia
lumenului vaselor.
Citokinele de tipul interleukinei-1 i factorul de necroz tumoral s-au
dovedit a mri potenialul citotoxic al VT pentru celulele endoteliale ale
venei ombilicale umane, n cultur, fapt corelat cu o expresie mrit de
receptor Gb3.
Rolul cert al VT include coagularea intravascular local,
trombocitopenia i anemia microangiopatic hemolitic.
Rolul VT n producerea diareei nu este clar. Nu exist receptori
pentru toxin la nivelul mucoasei epiteliale intestinale; totui, pe seciunile
intestinale umane de la pacienii cu SUH au fost observate: microangiopatie,
edem i hemoragie, care pot afecta proprietile de absorbie ale intestinului
rezultnd diareea.
Examenul histopatologic al biopsiilor intestinale, prelevate de
la pacieni sau al esuturilor de la animalele cu infecie natural ori
experimental cu EPEC, a demonstrat un model caracteristic al atarii
bacteriene la enterocite, care const n distrucia microvililor, nivelarea
membranei citoplasmatice i aderena intim a bacteriei la epiteliu, care
emite prelungiri ce nvelesc parial bacteria.
Acest aspect este denumit leziune de ataare-nivelare (attaching and
effacing AE).
Dovezi recente indic faptul c mecanismele leziunii AE implic
interaciunea unor factori mediai plasmidic i cromozomal, care sunt supui
unui complex de reglare genetic i ambiental.
85

Aderena iniial a EPEC, anterior leziunii AE, const n ataarea


fimbrial la enterocite, care este mediat plasmidic prin formarea pililor
de legare (bundle-for-ming-pillus BFP). Totui ECVT nu exprim BFP i
eventuala faz de ataare fimbrial nu a fost stabilit cu certitudine.
Toi factorii de virulen necesari pentru formarea leziunii AE, att la
ECEP, ct i n cazul ECVT sunt codificai de un locus mai mare cromozomal
de 35480 pb (insula de patogenitate), denumit LEE (locus for enterocyte
effacement locus de nivelare a enterocitului LNE).
Una dintre genele structurale ale LEE, care este absolut important n
formarea leziunii AE este gena eae, care codific proteina de ataare din
membrana extern, intimina de 94 Kda, responsabil de ataarea intim a
bacteriei la enterocit.
Alte dou gene, esp A i esp B codific proteine (esp A i respectiv
esp B), care activeaz semnalul cilor de transducie, care la rndul lor
induc modificrile de citoschelet n enterocit i fosforilarea proteinei Hp 90,
aparinnd celulei gazd, protein ce se leag de intimin.
Studiile asupra ECVT au demonstrat c tulpinile aparinnd mai
multor serotipuri manifest leziuni AE in vitro i n modelele experimentale
animale, iar dovezile de pn acum indic faptul c mecanismele leziunilor
AE induse de ECVT i ECEP sunt similare.
Tabelul 2.5
Unele caractere ale Escherichia coli patogen productoare de toxiinfecii
alimentare
Rezervorul
Surse de
Grupa de
Alimente implicate n
cunoscut sau
contaminare a
E. coli
toxiinfeciile alimentare
presupus
alimentelor
prelucrtorii i carnea de porc;
manipulatorii de apa;
EPEC
omul
alimente;
nlocuitorii de cafea
apele de canal
brnza Brie;
brnza Camembert;
EIEC
salata;
omul
apa;
conserve de Salmonidae
brnza Brie;
carnea de curc;
ETEC
omul
maionez;
preparate de restaurant, cofetrie
86

Grupa de
E. coli

EHEC

Rezervorul
cunoscut sau
presupus

Surse de
contaminare a
alimentelor

Alimente implicate n
toxiinfeciile alimentare

fecale de bovine
carnea tocat de vit;
vacile de lapte i i de alte animale;
laptele nepasteurizat;
alte animale
utilaje;
salata
lptrii

Pentru demonstrarea enteropatogenitii tulpinilor de Escherichia coli


se folosesc mai multe metode, dintre care menionm:
testul ansei ligaturate;
inocularea la oareci sugari;
inocularea culturilor celulare;
hemaglutinarea, efectul hemaglutinant fiind determinat de prezena
pililor i corelndu-se cu existena antigenelor fimbriale.
Pentru alte proprieti patogene, cu valoare relativ, se folosesc i alte
criterii, cum sunt:
activitatea hemolitic fa de hematiile de cal, tulpinile patogene
fiind, de regul, hemolitice;
colicinogenia i colicinosensibilitatea, tulpinile izolate din procese
patologice fiind mai des colicinogene dect cele provenite din mediile
naturale.

2.10. Epidemiologie
Infeciile cu Vero/shiga toxin Escherichia coli (VTEC/STEC) din
2006 au nregistrat la nivelul a 27 de state membre ale UE i EEA/EFTA un
numr de 3.463 raportri cu 3.458 de confirmri, furniznd astfel o rat a
notificrilor la nivelul UE de 0,74 la 100.000 locuitori.
Tabelul 2.6.
Numrul i rata notificrilor de cazuri VTEC/STEC raportate n UE i EEA/EFTA
n 2006
ara
Austria
Belgia
Bulgaria
Cipru

Tipul de
raportare

Total cazuri

Cazuri confirmate

Nr. cazuri per


populaii de 100.000
de oameni

C
C
U
U

41
47
0
0

41
47
0
0

0,50
0,45
0,0
0,0

87

ara

Tipul de
raportare

Total cazuri

Cazuri confirmate

Nr. cazuri per


populaii de 100.000
de oameni

Republica Ceh

0,1

Danemarca

146

146

2,7

Estonia

0,59

Finlanda

14

14

0,27

Frana

67

67

0,11

Germania

1236

1236

1,5

Grecia

0,1

Ungaria

0,1

Irlanda

158

153

3,6

Italia

17

17

0,1

Latvia

0,0

Lituania

0,0

Luxembourg

0,43

Malta

1,2

Olanda

42

42

0,26

Polonia

0,1

Portugalia

Romnia

Slovacia

0,15

Slovenia

30

30

1,5

Spania

13

13

0,1

Suedia

265

265

2,9

Marea Britanie

1301

1301

2,2

3412

3407

0,74

Total UE
Islanda

0,33

Liechtenstein

Norvegia

50

50

1,1

3463

3458

0,74

Total

Sursa: Raportri naionale. A = Raportri de date agregate; C = Raportri bazate pe


cazuri; - = fr raportare; U = nespecificat
88

Dup muli ani de evoluie ascendent a ratei notificrilor de VTEC/


STEC la nivelul UE (aceasta este consecina unui complex de factori i nu
este obligatoriu o cretere real), rata notificrilor a nceput s nregistreze
o scdere ncepnd cu 2004, aceasta probabil ca o consecin a creterii
tendinei de raportare corect numai a infeciilor confirmate de VTEC/
STEC, care difer substanial de toate infeciile cu Escherichia coli
patogene. O scdere a cazurilor raportate a fost observat n special n
Slovacia, Germania (cu toate c aceasta contribuie cu aproape o treime
din totalul cazurilor raportate) i Bulgaria, dar o cretere a fost notat n
Norvegia, Suedia, Irlanda i Regatul Unit. Cea mai mare rat a notificrilor
a fost observat n Irlanda (3,6 al 100.000) i Suedia (2,9 la 100.000). Toate
celelalte state membre ale UE i EEA/EFTA care au raportat date au avut rate
ale notificrilor sub 3,0 la 100.000 (Portugalia, Romnia i Liechtenstein nu
au raportat). Majoritatea cazurilor au fost contactate domestic cu o medie
UE a cazurilor importate de 9%.
Distribuia pe grupe de vrst i sex.
Rata notificrilor a fost semnificativ mai mare la grupa de vrst a
copiilor de 0-4 ani, cu o rat la nivelul UE de 7,5 la 100.000, urmat de
grupa copiilor de 5-14 ani cu o rat de 1,6 la 100.000. Nu au fost identificate
diferene notabile ntre ratele celor dou sexe, att la brbai, ct i la femei
aceasta fiind de 1,0 la 100.000.
Sezonalitatea.
A fost observat o evident distribuie sezonier a cazurilor de TEC/
STEC. Acestea cresc progresiv de la nceputul anului atingnd un maxim
n lunile de var dup care descresc n timpul toamnei. O excepie a fost
semnalat n Norvegia unde numrul cel mai mare de cazuri a fost raportat
n februarie i martie datorit unui focar de boal asociat cu consumul unor
mezeluri contaminate.
Proporia serogrupurilor non-O:157 raportate n 2006 a crescut
substanial fa de anii precedeni i nregistreaz aproape jumtate din
serogrupurile cunoscute (serogrupuri raportate la 72% din cazuistica
analizat). n Regatul Unit 78% din cazuri sunt asociate serogrupului O:157
(1275 cazuri). ase state au raportat cazuri confirmate de sindrom uremic
hemoragic: Frana Ungaria, Irlanda, Olanda, Norvegia i Regatul Unit, cu
un total de 126 cazuri. Majoritatea cazurilor de sindrom uremic hemoragic
au fost la copii de 0-14 ani i au fost cel mai frecvent asociate cu serogrupul
O:154. Un tipar sezonier al incidenei cazurilor de VTEC O:157 este evident,
dar acest lucru nu a fost observat i n cazul serogrupurilor non-O:157.
89

Cazuri

Figura 2.1
Distribuia sezonier a cazurilor de VTEC/STEC n EU i EEA/EFTA n 2006
(3323 cazuri) (Centrul European Pentru Prevenirea i Controlul Bolilor, 2008)

Ian

Feb

Mar

Apr

Mai

Iun

Iul

Aug

Sep

Oct

Nov Dec

Copiii mici sunt semnificativ suprareprezentai n cadrul cazuisticii


VTEC/STEC i al cazurilor de sindrom uremic hemoragic (HUS). O
explicaie a acestei situaii ar putea fi aceea c ei sunt mult mai sensibili la
toxinele produse de aceste bacterii, dar aceasta poate s reflecte o expunere
mai mare la VTEC/STEC. O alt motivaie este aceea c este mult mai
probabil ca la copii s se solicite investigaiile de laborator. ntr-un studiu
asupra factorilor de risc pentru bolile asociate infeciilor cu VTEC/STEC, n
Germania, factorul de risc a avut cea mai mare valoare pentru copiii sub trei
ani care s-au mbolnvit. n aceast investigaie laptele crud a fost singurul
aliment identificat ca un factor de risc pentru acest grup de vrst. La copiii
cu vrsta de 10 ani sau mai mari doar produsele alimentare (ex: carnea
de miel i crnaii cruzi) au fost semnificativ asociate cu mbolnvirile.
Alimentele sunt o surs bine cunoscut de infecie cu VTEC/STEC, n
special alimentele provenite de la rumegtoare cum sunt laptele, brnza i
carnea. n 2006, Norvegia a raportat un focar cu 17 cazuri de mbolnvire cu
Escherichia coli O:103 produs prin consumul de crnai afumai, din acetia
10 au dezvoltat sindrom uremic hemoragic. Cinsprezece cazuri au avut
vrsta cuprins ntre doi i opt ani. De asemenea, Regatul Unit a raportat
cteva focare de infecii cu Escherichia coli O:157 sorbitol-fermentative.
Dar sursa infeciei nu a fost identificat. Cu toate c serogrupul O:157
nc este cel mai frecvent serogrup izolat n cazurile de sindrom uremic
hemoragic, i alte serogrupuri pot provoca boli severe aa cum s-a artat
mai sus n exemplul din Norvegia.
90

Cazuri/100.000

Figura 2.2.
Distribuia pe grupe de vrst a cazurilor de VTEC/STEC n EU i EEA/
EFTA n 2006
(Centrul European Pentru Prevenirea i Controlul Bolilor, 2008)

2.11. Detectarea EPEC, ETEC i EIEC


n alimente i materiale patologice
Pentru distrugerea microflorei de asociaie se impune folosirea
mediilor de mbogire i de izolare selective.
Ca medii de mbogire se folosesc bulionul cu bil, lactoz i verde
briliant (BBLV) sau bulionul cu lauril sulfat, iar ca medii selective, agarul
Mac Conkey (VRBL = cristal violet, rou neutru, bil, lactoz) i agarul
EMB sau GEAM (eozin-albastru de metilen lactoz).
Mediile de mbogire turnate n eprubete cu tub de fermentaie, se
inoculeaz cu materialul de cercetat i diluiile acestuia, se incubeaz, iar
cultura obinut (cu gaze sau fr gaze) se striaz pe suprafaa agarului Mac
Conkey sau EMB.
Dup incubare, 10 colonii lactoz pozitive i 10 colonii lactoz
negative se cerceteaz biochimic i asupra patogenitii.
n acest mod se prind tulpinile de Escherichia coli din toate cele trei
grupe (inclusiv tulpinile ETEC, care sunt lactoz negative).
Dac se bnuiete c materialele de cercetat conin un numr foarte
mare de Escherichia coli, se poate renuna la faza de prembogire i se
striaz ca atare sau diluate, pe suprafaa mediilor selective.
n legtur cu izolarea Escherichia coli din grupele menionate
trebuiesc fcute cteva precizri:
folosirea temperaturii de incubare de 44-45C poate fi nefavorabil
91

unor tulpini patogene, acestea nedezvoltndu-se i neproducnd indol;


mbogirea tulpinilor patogene n bulion lauril-sulfat la 44,5C
determin pierderea plasmidelor care codific factorii de virulen i scad
eficiena decelrii lor, rspunznd negativ la unele teste de patogenitate la
care se supun;
unele tulpini de EIEC nu se dezvolt pe agarul SS (SalmonellaShigella), motiv pentru care acesta nu trebuie folosit n lucrrile de detectare
a Escherichia coli;
ntruct marea majoritate a tulpinilor EIEC nu fermenteaz lactoza,
se va avea n vedere c agarul Mac Conkey, folosit ca mediu selectiv de
izolare a Escherichia coli s se prepare cu glucoz, n loc de lactoz;
EIEC prezint unele particulariti biochimice de care trebuie s se
in seama. Ele sunt lizin-decarboxilaz negative, tartrat negative, incapabile
de a fermenta mucatul i de a utiliza acetatul, ca unic surs de carbon.
EIEC se aseamn din punct de vedere biochimic i antigenic cu
Shigella.
Pentru difereniere se execut urmtoarele teste: folosirea D-serinei,
D-xilozei, acetatului de sodiu i fermentarea mucatului. Tulpinile EIEC pot
da unul sau mai multe rspunsuri pozitive la aceste teste, n timp ce Shigella
d numai rezultate negative.
Dup izolarea i identificarea izolatelor de Escherichia coli, n mai
multe cazuri se impune determinarea patogenitii lor.
Aceasta se poate realiza prin mai multe teste, dintre care unele sunt
specifice numai unei serogrupe.
Astfel izolatele de EIEC se pot identifica prezumptiv prin determinarea
capacitii lor de a invada celulele HeLa i confirma, pentru potenialul
invaziv, prin testul Sereny.
Capacitatea ETEC de a produce enterotoxina LT se poate determina
prin testarea filtratelor culturilor pe culturi Y-1 sau CHO, iar a enterotoxinei
ST, pe oareci nou nscui sau prin ELISA, teste radioimune sau sonde DNA
specifice EAF.
O alt metod pentru detectarea ETEC o reprezint hibridarea DNA,
pentru identificarea genelor care codific LT i ST. Sondele de DNA marcate
cu 32P au un grad mare de specificitate i sensibilitate, dar un timp scurt
de njumtire, cost ridicat i inactivarea isotopului. Din acest motiv n
ultimul timp s-a recurs la marcarea neizotopic a acizilor nucleici sub form
de sonde de DNA biotinilat pentru LT i ST, dei sunt mai puin sensibile
dect primele.
Deosebit de interesant i util pare aplicarea ELISA, n faza solid,
pentru numrarea Escherichia coli productoare de LT din alimente, metoda
92

asigurnd detectarea bacteriei i n cazurile cnd aceasta reprezint 1 din


totalul microflorei prezente n aliment.
Nu exist nici o metod pe deplin fidel pentru detectarea direct a
EPEC n alimente.

2.12. Detectarea Escherichia coli O157:H7 din fecale i alimente


Datorit semnificaiei patogene pronunate s-au pus la punct o serie
de metode eficiente pentru detectarea acestei bacterii din fecale i alimente,
din care menionm:
Strierea direct a fecalelor pe suprafaa agarului Mac Conkey cu
sorbitol.
Dup o incubare de 24 de ore la 35-37C sau la 42C, coloniile sorbitol
negative (incolore) se transfer pe suprafaa agarului nutritiv nclinat, iar
cultura obinut se supune seroaglutinrii rapide pe lam cu ser anti O157.
Dac aceast reacie este pozitiv se execut i reacia de seroaglutinare
rapid pe lam cu ser anti H7. Dac cele dou reacii sunt pozitive se
apreciaz c bacteria izolat este Escherichia coli O157:H7.
Pentru a uura recunoaterea coloniilor specifice dezvoltate pe
suprafaa agarului Mac Conkey cu sorbitol, la acest mediu se adaug
5 bromo-4 cloro-3 indolil--D-galactopiranosid de sodiu (BCIG) sau
ortonitrofenil-galactopiranosid (ONPG) pentru punerea n eviden a
-galactozidazei i 4-metilumbelifenyl--D-glucuronid (MUG) pentru
evidenierea glucuronidazei.
Escherichia coli O157:H7 nu elaboreaz -galactozidaz i, deci, nu
descompune substratul specific, iar colonia va fi incolor; de asemenea ea
nu elaboreaz -D-glucuronidaz i deci nu hidrolizeaz indicatorul (MUG),
formnd colonii nefluorescente.
Metoda strierii directe pe agarul Mac Conkey cu sorbitol este eficient
pentru examinarea fecalelor de la pacienii n faz acut, dar nu i pentru
alimente, n care numrul acestei bacterii fa de cel al microflorei de
asociaie este foarte mic.
Detectarea toxinelor Shiga-like direct din fecale sau din filtratele
culturilor obinute se folosete n prezent n unele laboratoare.
Izolarea Escherichia coli O157:H7 din alimente este mult mai
dificil din cauza numrului mic. Dat fiind doza minim infectant, extrem
de redus, specialitii americani accept folosirea numai a metodelor foarte
sensibile, capabile s detecteze bacteria i din alimentele contaminate cu 3
celule bacteriene/g produs.
n acest scop s-au pus la punct mai multe metode de lucru, care
93

includ o faz de mbogire, una de izolare selectiv i alta de identificare


i confirmare.
Pentru faza de mbogire se folosete bulion Escherichia coli
modificat + novobiocin, pentru izolare, agarul Mac Conkey cu sorbitol,
BCIG i MUG, iar pentru identificare i confirmare producerea de indol,
mobilitatea, seroaglutinarea cu ser anti O157 i ser anti H7.
n scopul sporirii posibilitilor de izolare a bacteriei din alimentele
congelate, unii autori au folosit pentru prembogire un bulion Escherichia
coli modificat, fr sruri biliare, incubat 2 ore la 25C i apoi mbogirea
selectiv la 42C, timp de 18 ore, n mediu cu sruri biliare i novobiocin.
Deasemenea, ali cercettori au preparat o variant a agarului Mac
Conkey cu sorbitol, cu cefixin i telurit (CT-SMAC), prin adugarea salicinei
i a 4 metilumbeliferil--galactopiranosidei. Acest mediu modificat s-a
notat cu iniialele CT-SSMAC. Din 101 tulpini de bacterii non-Escherichia
coli, izolate de pe ridichi i care pe mediul CT-SMAC formau colonii
incolore, ca i Escherichia coli O157:H7, 92 (91%) formau colonii roz-roii
sau -galactozidaz negative i fr culoare pe CT-SSMAC. Coloniile de
Escherichia coli O157H7 pe CT-SSMAC sunt incolore i -galactozidaz
pozitive. Deci, mediul CT-SSMAC s-a dovedit mai selectiv dect CTSMAC pentru Escherichia coli O157H7.
Pentru a mri sensibilitatea metodei i a reduce timpul de analiz se
aplic diferite tehnici intermediare, cum sunt separarea imuno-magnetic,
imuno-captarea (TECRA) i altele.
Folosirea testelor imunologice i imunoenzimatice: tratarea
coloniilor transferate pe membrane de nitroceluloz, cu ser anti O157 conjugat
cu fosfataz alcalin, latex-aglutinarea, ELISA (EHEC-Teck; Petrifilm kitHEC).
Detectarea verotoxinelor (VT) are o foarte mare valoare, deoarece
ntr-un substrat nu poate exista bacteria fr a nu fi prezent verotoxina
liber.
Verotoxina poate fi prezent, fr a se putea izola bacteria. Din aceast
cauz se acord mare importan metodelor de detectare a verotoxinelor din
diferite substraturi (fecale, alimente, culturi).
Menionm cteva dintre acestea:
o testarea efectului citotoxic al VT pe linia celular Vero;
o tehnici ELISA;
o folosirea sondelor sintetice oligonucleotidice pentru detectarea
genelor care codific VT;
o folosirea PCR.
94

EPEC

EIEC

EHEC

ETEC

Patotipul

Tabelul 2.7
Metode de identificare a patotipurilor diareigene de Escherichia coli
(dup Negu M., 1999)
Metode in vitro
Metode in
ncadrare n
Efect
Metode
Metode
vivo
serogr.
citopatogen
genetice
imunologice
iepure:
- ans ligat.
- factorul de
perm. cut.;
oarece nou
nscut:
- inoculare
intragastric

neconcludent pentru
incadrarea n
patotip

purcel:
enterocolit
hemoragic
letal

ser 0157:H7
(aglutinare;
coaglutinare;
latex
aglutinare)

cobai:
inoculare n
sacul conjunctival
(testul
Sereny)

aglutinare/
latex aglutinare cu seruri
polivalente i
monovalente:
28, 29, 124,
136, 143,
144, 152, 164,
167

aglutinare
cu seruri
polivalente i
monova-lente
OK: 26, 55,
86, 111, 114,
119, 125, 126,
127, 128, 142,
158

amplificare
genic (PCR);
efect citopatodetectarea genei
gen pe celule:
toxinei termola- CHO (globubile LTI (lt I);
lizare);
detectarea genei
- Y1 (picnoz)
toxinei termostabile ST (st I)
amplificare
genic (PCR):
efect citopatodetectarea genegen pe celule
lor SLT (slt IB):
Vero; leziuni
- direct n scaun
de tipul A-E
a eae A;
(aderen,
- n colonii
tergere a
izolate pe agar
microvililor)
Mac Conkey cu
sorbitol

efect citopatogen pe celule


HeLa: dezvoltare intracelular

efect citopatogen pe celule:


Hep-2:
aderen
difuz i
leziuni de tip
A-E (aderen,
tergere a
microvililor);
HeLa: ibidem
95

pentru LTI:
- latex aglutinare;
- ELISA;
- Imunodifuzie
(testul Biken);
pentru ST:
- ELISA
latex aglutinare
i ELISA pt. detectarea separat
a toxi-nelor:
- SLT 1;
- SLT 2;
seroneutralizarea
efectului citotoxic pe celule
Vero

amplificare
genic (PCR):
detectarea genei
ipa H

amplificare
genic (PCT):
detectarea
operonului alfa;
detectarea genei
eae A

Episoade de infecie cu ECVT asociate serotipurilor O157:H7 au fost


nregistrate n cel puin 14 ri din ase continente.
Alte serotipuri ECVT care au fost implicate n episoadele de infecie
cu Escherichia coli O157:H7 au indus O111, O145:NM i O104:H21.
n una dintre cele mai mari epidemii produs de Escherichia coli
O157:H7 din America de Nord, aproximativ 500 de cazuri au fost nregistrate
n statele Washington, Idaho, California i Nevada.
Un episod care se pare ca a implicat mii de cazuri, s-a petrecut n
sudul Africii n 1992.
n 1996, o epidemie produs de Escherichia coli O157:H7 n Scoia
afectnd mai mult de 400 de persoane a fost legat de consumul produselor
de carne la un mcelar local i a fost asociat cu 151 de spitalizri i 18
decese (afectnd pacienii n vrst).
De asemenea, n 1996 s-a nregistrat un episod masiv al acestei infecii
presupus a fi de origine alimentar, n Japonia, care a afectat 6309 copii
de vrst colar (19,4%) din 62 de coli elementare. La 102 copii a fost
nregistrat SUH, iar trei copii au decedat.
n general, n episoadele de infecie cu Escherichia coli O157:H7
ratele de atac au variat de la 0,1 la 71%, iar locurile de izbucnire au inclus
restaurantele, azilele, creele, penitenciarele i casele personale.
Izolri sporadice de ECVT, de obicei Escherichia coli O157:H7 din
cazuri de diaree sangvinolent sau SUH, au fost nregistrate n mai multe
ri.
Majoritatea studiilor s-au concentrat asupra incidenei serotipului
O157:H7 deoarece metodele de decelare pentru serotipurile non O157 nu sunt
n uzul curent.
ntr-un studiu prospectiv important, efectuat pe 2 ani de ctre Alberta,
Pai i colaboratorii, care a inclus peste 5.000 de cazuri de diaree, prezentate
n spitalele din Calgary, n 1988, a izolat ECVT (n majoritate serotipul
O157:H7) la 3,7% din pacieni, comparativ cu Salmonella spp. la 2,7% i
Campylobacter spp. la 2,0%.
n alte studii, serotipul O157:H7 a fost izolat la 0,6-2,5 din probele de
fecale examinate, de obicei reprezentnd a doua sau a treia bacterie patogen
frecvent izolat.
Frecvena de izolare din probele de fecale sangvinolente a variat ntre
15-37%.
n Europa i America de Nord numrul de cazuri crete n lunile de
var, fapt care poate fi corelat unei combinaii de factori, cum ar fi consumul
crescut de hamburgeri, incidena mai mare a ECVT la vaci i ncrctura
bacterian mai mare n carnea tocat.
96

Vrful de frecven corelat cu vrsta a diareei asociate cu ECVT i


SUH este la copiii mici.
Principala complicaie a infeciei ECVT este SUH, care a fost
nregistrat cu o frecven de aproximativ 8% n mai multe episoade de
infecie cu Escherichia coli O157:H7, dei ntr-un episod care a afectat
pacienii mai n vrst dintr-un azil, aceast frecven s-a situat la 22%.
Frecvena cazurilor sporadice de SUH n America de Nord este
de aproximativ 2-3 cazuri la 100.000 de copii cu vrsta pn la 5 ani, n
contrast cu incidena de aproape 10 ori mai mare la acest grup de vrst n
Argentina.
n Africa de Sud, SUH pare s fie mai frecvent la copiii albi, dect la
cei de culoare.
n Anglia, sindromul pare mai frecvent n zonele rurale, dect n cele
urbane. Cazurile acestor diferene regionale i/sau socioculturale rmn a fi
stabilite.
Factorii de risc majori pentru contactarea infeciei cu ECVT sunt
ingestia alimentelor sau a apei contaminate i contactul strns cu indivizii
afectai.
Factorii de risc pentru dezvoltarea unei boli severe de tipul SUH includ
vrsta (foarte tineri sau btrni), gastrectomia anterioar, probabil mrimea
inoculului i posibila utilizare recent de antibiotic.
Factorii de gazd de tipul imunitii preexistente antitoxice sau
antibacteriene, distribuia receptorilor i fenotipul antigenic P al hematiilor,
pot determina, de asemenea, natura i severitatea bolii, la fel cum le pot
determina i factorii bacterieni, fenotipul toxinic i factorii de colonizare.
Sunt necesare studii ulterioare pentru descrierea determinanilor bolii
i a gravitii acesteia.
Bovinele sunt, probabil, principalul rezervor animal pentru tulpinile
ECVT implicate n boala de la om, iar alimentele de origine bovin (n
special pateurile cu carne tocat de vit semigtit i laptele nepasteurizat)
constituie sursele majore ale infeciei la om.
Episoade asociate consumului de cidru, proaspt preparat au fost
probabil corelate cu utilizarea merelor contaminate cu fecale bovine.
Un caz de infecie cu Escherichia coli O157:H7 la un lactovegetarian a
fost presupus a se datora consumului de vegetale dintr-o grdin fertilizat
cu fecale bovine.
Alte alimente care au servit ca vehicul pentru infecia cu ECVT (fie ca
surse primare, fie n urma contaminrii de la o surs primar) includ friptura
de vit, apa, tartinele reci (curcan, unc i/sau brnz), cartofii cruzi i
iaurtul.
97

Dovezi ale contaminrii cu ECVT a arjelor de carne tocat din


magazine au fost nregistrate n America de Nord i Thailanda i au variat de la
9 la 36,4% din probele testate, cu o frecven de izolare a microorganismului
de 5-10% (toate serotipurile) sau de 0-3,7% (O157:H7).
Mai mult, n aceleai studii, ECVT au fost decelate n carnea de porc
(1-10,6%), pui (0-1,5%) i miel (2%), cu o frecven de izolare a Escherichia
coli O157:H7 de 0-1,5%, 0-1,5% i respectiv 2%.
Nu este clar dac prezena ECVT n alimentele de alt origine dect
cea bovin reprezint starea de purttor a acestor specii i/sau contaminarea
de la sursele bovine n timpul prelucrrii.
ECVT au fost decelate de asemenea, la 1% din filtrele de lapte.
O dat cu recunoaterea faptului c infecia ECVT se transmite de la
individ la individ, persoanele infectate constituie n mod clar o alt surs
major de infecie ECVT.
Infecia poate fi contractat prin contactul cu animalele infectate,
oamenii infectai i consumul alimentelor sau a apei contaminate.
A fost nregistrat i un caz de infecie n laborator contractat de un
tehnician.
Frecvena relativ nalt a transmiterii infeciei cu Escherichia coli O157
de la persoan la persoan, demonstrat n studii de familie, sugereaz c
doza infectant a acestui serotip este foarte mic, probabil chiar mai mic
de 100 de microorganisme. Acest fapt mrete importana procedurilor de
prevenire i combatere stricte ale infeciei n spitale i n alte instituii.
Sunt disponibile cteva metode pentru subtipizarea tulpinilor de
Escherichia coli O157 care s uureze studiile epidemiologice, metode care
includ biotipizarea, tipizarea fagic, profilul plasmidic i polimorfismul de
restricie cromozomal (RFLP).

2.13. Infeciile naturale la animale


Se numesc colibaciloze i prezint urmtoarele trsturi caracteristice.
Gravitatea infeciilor colibacilare este influenat de specie, vrst i starea
imunologic, precum i de nsuirile tulpinii de colibacili infectani, putnd
mbrca una din urmtoarele forme de exprimare anatomoclinic:
enterita colibacilar (diareea colibacilar, colibaciloza enteric,
colibaciloza enterotoxic);
enterotoxiemia colibacilar (boala edemelor, colienterotoxiemia);
septicemia colibacilar;
mamita colibacilar;
coligranulomatoza (granulomul lui Hyarre).
98

Colibaciloza vieilor
Poate evolua ca enterit colibacilar (diaree colibacilar) sau ca
septicemie colibacilar.
Tulpinile de Escherichia coli care produc enterita colibacilar aparin
serogrupelor O8, O9, O101, O15, O115, dau pe medii glucozate colonii
mucoide, produc enterotoxine, posed antigenul A i L (ca factori de
adeziune), K99 sau F4.
n etiologia septicemiei colibacilare, cel mai frecvent raportat, n toate
rile este O78, urmat de O15, O111 i O115.
Enteritele colibacilare reprezint rezultatul aciunii colibacililor
aparinnd fie patotipului ETEC (cel mai frecvent), fie patotipului EPEC,
EHEC sau EIEC.
n cazul lui ETEC i EPEC sunt prezente adezinele fimbriale F5 (mai
frecvent) fie adezinele F6, F41, F17 (rar).
n cazul colibacilozei septicemice, principalul factor de patogenitate l
reprezint endotoxinele, care dup ce se multiplic intravascular, genereaz
ocul endotoxic.
Colibaciloza purceilor
Se manifest sub urmtoarele forme:
diareea colibacilar (DC) sau enterita colibacilar (EC) sau
colibaciloza enterotoxic ntlnit la purcei n primele zile de via, fiind
cea mai frecvent i pgubitoare form.
Cele mai multe tulpini enterotoxigene izolate de la purcei posed
adezinele fimbriale F4 (K88) i, mai rar F5 (K99), F6 (987) sau F41 i aparin
serogrupurilor somatice O141, O147, O149, O157, O8, O9, O138, O64,
O10, O15 i altele.
O parte dintre acestea elaboreaz, n afara enterotoxinelor ST i LT i
verotoxinele care, de obicei nu posed adezine fimbriale.
diareea de nrcare (DI) apare n creterea intensiv, n primele
zile dup constituirea loturilor de tineret;
septicemia colibacilar (SC) apare la purceii sugari, dar n proporie
mai mic dect DC;
enterotoxiemia colibacilar, numit i boala edemelor (B.E.). De la
purceii cu B.E. se izoleaz, de regul, tulpini de Escherichia coli hemolitice,
care aparin serotipurilor O138 K81, O139 K82, O141 K85, care posed
adezine i au capacitatea de a produce verotoxine.
99

Datorit similitii (dar nu identitii) cu verotoxina produs de


Shigella dysenteriae, la om, verotoxina produs de tulpinile de Escherichia
coli izolate din B.E. se mai numete i Shiga-like.
infecii cu localizare extraintestinal: mamita colibacilar, relativ
rar ntlnit la vaci i scroafe i ocup ca frecven, locul trei dup mamitele
streptococice i stafilococice.
Colibaciloza psrilor
Escherichia coli produce colisepticemia (CS) i coligranulomatoza
(CG). Au fost izolate i identificate din colisepticemia aviar peste 60 de
serotipuri, cele mai frecvente fiind: O2, O1, O8, O15, O3, O18, O22, O23, O73,
O109, O17, O119, O139, O141, O165.
Au fost recunoscui ca factori de virulen la tulpinile de Escherichia
coli patogene pentru psri adezinele fimbriale F1 (active n tractusul
respirator) i P (active n viscere), antigenul capsular K1 i indirect sistemul
Fe-dependent.

2.14. Infecii cu Escherichia coli la om


Infecia ECVT este asociat unui spectru larg de manifestri clinice,
care include:
colita hemoragic;
sindromul uremic hemolitic (SUH).
Colita hemoragic (colita ischemic). Se caracterizeaz prin apariia
brusc a crampelor abdominale severe, urmate n cteva ore de diaree
apoas.
Pacienii pot prezenta grea, dar voma nu este caracteristic. Diareea
apoas progreseaz rapid spre faza caracterizat de eliminare sanguinolent
profuz, asemntoare hemoragiei intestinale inferioare.
Febra este absent sau de mic intensitate. Coninutul n leucocite, din
snge poate fi crescut, cu o uoar deviere spre stnga.
Boala este, de obicei, autolimitant i dispare n decurs de o sptmn.
Forma mai grav poate fi complicat de constricia intestinal.
Sindromul uremic hemolitic (SUH). SUH este definit de o triad de
simptome: insuficien renal acut, trombocitopenia i anemia hemolitic
microangiopatic.
Cea mai comun form de SUH este cea clasic sau D + (asociat
100

diareei), care are cea mai nalt inciden la copii. De obicei, se manifest
n cteva zile de la declanare, printr-o diaree acut prodromal, care
este frecvent sanguinolent, cu trsturi indistincte de cele din colita
hemoragic.
SUH clasic rmne cauza major a insuficienei renale acute la copii.
Se pot ntlni complicaii grave, ca rezultat al bolii microangiopatice de
la nivelul altor sisteme organice, cum ar fi sistemul nervos (SNC), cordul,
pulmonul i pancreasul.
SUH clasic i/sau SUH asociat ECVT, cu manifestri predominant
nervoase este frecvent denumit purpura trombotic trombocitopenic
(PTT).
SUH reprezint de asemenea complicaia major a dizenteriei Shiga,
asociat cu Shigella dysenteriae, tipul 1.
Factorul responsabil n geneza SUH, aprut att n urma infeciei
ECVT ct i a dizenteriei Shiga este probabil aceeai exotoxin proteic,
denumit VT1 sau Shiga toxin (toxin Shiga), care este elaborat att de
ECVT, ct i de Shigella dysenteriae tipul 1.
La majoritatea pacienilor cu diaree i colit hemoragic, asociate
ECVT, boala este autolimitant, iar recuperarea total se obine prin msuri
generale de susinere.
SUH nregistreaz, de obicei, o rat a fatalitii cazurilor de aproximativ
50%.
Terapia intravenoas cu imunoglobuline a fost benefic n cazul unor
copii cu SUH, dei bazele acestui efect rmn a fi elucidate.

2.15. Toxiinfecii alimentare produse de Escherichia coli


Tulpina prototip pentru sindroamele de mai jos este E. coli 0157:H7.
Tipul H7 a fost izolat iniial n 1944 la un om cu diaree, n timp ce tipul
0157 a fost izolat si definit 1972 din fecalele de la porci cu diaree. Tulpina
0157:H7 a fost pentru prima dat identificat n 1975 la un pacient cu diaree
sangvinolent. Tulpinile producatoare de Stx de E.coli au fost identificate
n 1977 n SUA i Canada.
HUS este cauza de tulpini de E. coli producatoare de Stx. S-a estimat
c 2 pan la 7% din infeciile cauzate de E.coli 0157:H7 vor produce HUS.
Acesta const n anemie hemolitic, trombocitopenie i insuficiena renal
acut. Cu toate c nu a fost legat direct de tulpinile EMEC pan n 1985,
HUS a fost pentru prima dat descris n 1975.
ntr-un studiu german asupra perioadei de eliminare a tulpinii E. coli
157:H7 la 53 de copii cei 28 de copii care aveau diaree HC au eliminat
101

microorganismul ntre 2 i 62 de zile (media de13 zile), n timp ce ceilali


25 care au contactat HUS au eliminat germenii ntre 5-124 de zile (media de
21 de zile). HUS este asociat mai mult cu tulpinile care produc Stx2 dect
cu cele care produc Stx1 sau ambele toxine.
ntr-un studiu efectuat n Anglia n perioada 1989-1991, 15% din 1275
de indivizi de la care au fost izolate culturi pozitive EHEC au facut HUS.
Colita hemoragic (HC) ca boal de origine alimentar a aparut pentru
prima dat n 1982 n Oregon i Michigan, unde n ambele cazuri victimele
au consumat sandwichuri de la un fast-food care coninea carne de vit
gatit necorespunzator. Toti cei 43 de pacieni au avut diaree sangvinolent
i crampe abdominale severe, 63% manifestnd grea, 49% vom i
doar 7% febr. n alte epdemii, perioada de incubaie a variat ntre 3 i 8
zile. Scaunul sngeriu reprezint simptomul caracteristic bolii i reflect
implicarea agentului etiologic n colon. Febra apare rar, iar doza infectioas
se pare c este de doar 10 ufc.
Prima epidemie datorat altor toxine STx dect cele produse de
E.coli 0157 :H7 n US (din 1994) a fost serotipul 014:H21. Sursa a fost
reprezentat de laptele pasteurizat contaminat. Serotipul 0111:NM a fost
izolat n Australia de sud (1995) din crnai semiuscai fermentai. n 1992
n Italia acelai serotip a produs pentru prima dat tulpini producatoare de
Stx asociate cu HUS, iar moartea a avut loc la 1 din 9 copii.
n Japonia, au fost 29 de epidemii cu E. coli 0157 :H7 ntre 19911995. n 1996 au fost 11826 de cazuri de gastroenterite cu 12 mori cauzate
de E. coli 0157:H7.
Prevenirea:
Trebuie luate msuri speciale datorit consecinelor pe care boala le
poate avea asupra copiilor mici.
Msurile de prevenire trebuie ndreptate n primul rnd asupra
toxiinfecilor alimentare produse la copii mici i a consecinelor pe care
boala le poate produce asupra acestora.
Aceti germeni sunt foarte sensibili la temperatura iar gastroenteritele
nu ar trebui s apar dac mncarea ar fi gatit corespunzator. Se recomand
n cazul crnii de vit ca mncarea s fie gatit la 71oC sau ca temperatura
intern s fie de minimum 58,3oC pentru cel puin 15 secunde. Cu toate c
cea mai mare epidemie a fost asociat cu carnea de vit, toate crnurile crude
de pui, unele fructe i legume ar trebui considerate ca posibile vehicule ale
colitelor hemoragice.
Diareea cltorului (Travelers diarrhea)
Escherichia coli reprezint principala cauz a acestei boli.
Printre voluntarii Peace Corps din Thailanda rural, 57% din 35 au
102

manifestat sindromul n timpul primelor 5 sptmni n ar i 50% au


manifestat evident simptomele infeciei cu tulpini ETEC.
n 1976 a fost raportat o epidemie pe un vas de croazier, cauzat de
serotipul O25:K98:NM productoare de LT.
Alte microorganisme asociate cu acest sindrom sunt rotavirusurile,
novovirusurile, Entamoeba histolytica, Yersinia enterocolitica, Giardia
lamdia, Campylobacter jejuni/coli, Shigella spp., Aeromonas hydrophila,
Klebsiella pneumoniae i Enterobacter cloacae.

2.16. Strategii de prevenire i combatere


Marele episod ECVT nregistrat n mai multe state din vestul SUA
n cursul anului 1992 a devenit punctul pivot n regndirea programelor de
siguran alimentar, n lumea ntreag.
S-a impus necesitatea unor strategii de siguran alimentar integrat,
care s implice toate verigile lanului alimentar de la ferm la mas.
Sistemele care se concentreaz, n special la nivelul prelucrrii,
comercializrii i al consumatorului pot fi inadecvate, fr considerarea
sectorului din amonte, incluznd informaii asupra strii de sntate a
efectivelor i a fiecrui animal.
Prevenirea expunerii bovinelor la ECVT n ferm ar genera o scdere
considerabil a numrului de animale care transport ECVT n abatoare i,
deci, o reducere a contaminrii produselor din carne.
Testarea prezenei ECVT n fecalele bovinelor naintea comercializrii
lor i reinerea acestora pn cnd nceteaz s mai elimine aceste bacterii
reprezint una dintre opiunile de combatere, dar trebuie depit costul
operaiunii i este necesar acordul prilor interesate.
Tratarea vitelor infectate, cu antibiotice, nu este eficient financiar i
poate genera dezvoltarea bacteriilor rezistente (ECVT i altele).
Vaccinarea bovinelor pentru reducerea colonizrii intestinale cu ECVT
ar putea fi luat n studiu.
La abator, contaminarea crnii se poate produce atunci cnd coninutul
intestinal sau materiile fecale vin n contact cu suprafeele acesteia. Gradul
de contaminare poate fi mrit n timpul operaiilor de dezosare i tocare.
Orientarea actual pentru sisteme concentrate n sectorul de prelucrare
alimentar i distribuie rapid a generat laboratoare care produc un milion
de hamburgeri pe zi, cu distribuire n zone geografice mari. Acest fapt poate
genera mari episoade, atunci cnd se aplic proceduri improprii de preparare
sau manipulare la nivelul comercializrii sau al consumatorului. Pe de
alt parte, o astfel de concentrare de volum poate facilita implementarea
103

strategiilor de control de tipul programelor HACCP (Hazard Analisys


Critical Control Points Analiza riscului n punctele de control critice), care
pot asigura producii de mare volum de hran de calitate nalt i sigur.
Este deosebit de important prevenirea transmiterii la nivelul preparrii
alimentelor prin manipulare i tratare termic adecvate.
Asocierea strns a infeciei cu ECVT i carnea tocat, spre
deosebire de carnea de vit tranat se datoreaz probabil diferenelor de
prelucrare. Atunci cnd carnea de vit tranat are suprafeele contaminate,
microorganismele pot fi distruse uor prin gtit.
n pateurile cu carne tocat, totui, microorganismul se afl amestecat
n carne i realizarea unor temperaturi interne de distrugere i timpul de
gtire devin foarte importante n reducerea riscului de infecie. O dat
preparat, orice surplus rmas trebuie imediat refrigerat sau congelat.
n plus, minile i orice material care a venit n contact cu carnea
crud (cuite, ustensile) trebuie splate cu ap fierbinte i detergent i s nu
intre n contact cu orice alt aliment crud.
Datorit dovezilor tot mai abundente privind transmiterea infeciei cu
ECVT de la o persoan la alta sunt necesare proceduri eficiente de prevenire
i combatere, a acesteia n spitale, cmine i alte instituii.
Dezvoltarea i implementarea tehnicilor de diagnostic rapid, vor
conduce la recunoaterea din timp a infeciei cu ECVT i, astfel, vor putea
fi aplicate, la timp, msuri de control pentru sntatea public.
Dou posibile opiuni includ utilizarea vaccinurilor pentru prevenirea
colonizrii cu ECVT a mucoasei intestinale i utilizarea toxoizilor sau a
componentelor subunitare ale holotoxinelor pentru elucidarea consecinelor
toxiemiei VT sistemice.
Natura factorilor de colonizare i produii poteniali ai genei eae, aa
cum este intimina, sunt nelese de abia acum, iar cunoaterea rspunsurilor
locale sau sistemice n anticorpi fa de aceste proteine este nc limitat.
n urma infeciei cu tulpini ECVT care exprim una sau mai multe
toxine, numai unele persoane dezvolt anticorpi fa de VT1, n timp ce
rspunsurile imune specifice fa de VT2 i VT2c par s fie foarte rare.
Motivul naturii inconsecvente a rspunsului seric antitoxic la pacienii
cu infecie ECVT productoare de VT1 rmne s fie elucidat.
Explicaiile posibile includ:
stimulul antigenic sczut, datorat unei toxine cu activitate biologic
nalt;
efectul imunosupresor al toxinei, cunoscut ca fiind in vitro
citotoxic pentru limfocitele B;
limitarea rspunsului imun la indivizii cu genotipuri specifice clasei
104

II a complexului major de histocompatibilitate;


epitopii moleculei VT1, fa de care are loc un rspuns imun mai
consecvent in vivo, probabil nu au fost expui adecvat n testul utilizat.
Absena rspunsului serologic nu exclude n mod necesar capacitatea
de inducere a proteciei dup imunizarea cu toxoid. Toxoidul VT1, i
componenii subunitii B-VT1 s-au dovedit a induce imunitate protectoare
la animalele de laborator.
n domeniul veterinar Mac Leod i Gyles (1991) au fost capabili
s protejeze purceii fa de testul de control cu VT2e purificat, att prin
imunizare pasiv cu anticorpi neutralizani, ct i prin imunizare activ cu
toxoidul VT2e.
Programele de inspecie a crnii din ntreaga lume sunt n revizuire
i supuse unei schimbri de la o metod bazat pe metode organoleptice
la implementarea analizei de risc HACCP i a altor strategii cu accent pe
gestiunea total a calitii.
Integrarea sectorului zootehnic n programele de siguran alimentar
va genera probabil extinderea metodei de analiz a riscului HACCP i la
nivelul fermei.
Pe plan internaional, sistemele de control ale crnii sunt sub presiunea
tot mai mare a comerului pentru a corespunde standardelor internaionale
de tipul seriilor ISO 9000.
n multe ri reglementrile de sntate public indic temperaturile
minime de preparare care trebuie respectate i practicile de igien alimentar
care s asigure alimentele gata de consum de la nivelul vnzrii cu
amnuntul.
Alte metode de control propuse, includ utilizarea compuilor chimici
sau iradierea pentru scderea sau eliminarea ncrcturii microbiene din
produsele de carne.
Detergenii de tipul fosfatului trisodic s-au dovedit a fi promitori
n scderea numrului de coliformi de la nivelul carcaselor i sunt deja
acreditai ca mijloace de prelucrare n anumite ri.
Un alt mijloc de reducere a ncrcturii microbiene este -iradierea.
Acest procedeu s-a dovedit a reduce eficient ECVT din hamburgeri i nu
pare s aib efecte adverse asupra produsului.
Comercializarea recent a puilor iradiai n Statele Unite ale Americii
a demonstrat schimbarea de atitudine a consumatorilor i faptul c iradierea
poate fi o metod util pentru reducerea contaminrii cu ECVT a alimentelor
comercializate cu amnuntul.
Aceste dezvoltri cuplate cu programele de educaie public privind
manipularea adecvat a alimentelor i tehnicile de preparare vor avea un
105

efect pozitiv n reducerea gradului de expunere a populaiei la ECVT prin


alimente contaminate.
n anumite ri sunt implementate programe de control pentru ECVT
la nivel de ferm, n special pentru O157:H7.
n multe ri, comercializarea laptelui nepasteurizat este ilegal, ceea
ce reprezint o msur eficace pentru reducerea episoadelor ECVT datorate
laptelui.
De asemenea, n multe state s-au stabilit reglementri privind
standardele temperaturilor interne de preparare, care trebuie atinse n
alimente i msurile sanitare de la nivelul comercializrii, care adecvat
realizate, constituie bariere importante pentru infecia nregistrat la om.
Supravegherea sntii publice privind infecia cu ECVT poate juca
un rol major n conturarea i implementarea msurilor de control.
n timp ce, n unele ri, raportarea ctre autoriti a cazurilor umane
de infecie cu ECVT (sau doar de infecie cu O157:H7) este obligatorie, n
alte ri ea nu este.
Raportarea consecvent n toate rile poate fi o contribuie esenial
la supravegherea internaional i la conturarea unor strategii de prevenire
i combatere globale.

2.17. Metode de izolare i identificare a lui


Escherichia coli din alimente

Tehnica de lucru:
Determinarea prezenei i a numrului de bacterii coliforme se poate
efectua att n medii lichide ct i pe medii solide, de izolare selectiv (fr
mbogire).
1. Se cntresc 50 g de prob ntr-un blender de nalt vitez. Se
adaug 450 ml de fosfat tampon Butterfield i se omogenizeaz 2 minute la
10.000-12.000 rot/min. Astfel se obine diluia 10-1.
2. Toate diluiile zecimale se pregtesc cu 90 ml diluant + 10 ml
din diluia anterioar. Diluiile pregtite depind de densitatea anticipat a
coliformilor. Se omogenizeaz bine fiecare diluie.
3. Pentru testul prezumptiv se transfer cte 1 ml din fiecare diluie n
cte 3 tuburi per diluie cu bulion LT (lauril-triptoz). Pipeta se ine n aa
fel nct marginea sa inferioar s fie sprijinit de tub.
4. Se incubeaz tuburile 24-48 de ore, la 35C. Se examineaz la 24 de
ore pentru producia de gaz n tubul Durham.
5. Se reincubeaz tuburile negative nc 24 de ore i se examineaz
pentru a doua oar pentru producia de gaz.
106

6. Se efectueaz testul de confirmare pe toate tuburile prezumptiv


pozitive (productoare de gaz). Se consider c bacteriile coliforme sunt
prezente dac se observ att dezvoltarea bacterian ct i apariia gazelor
n tubul de fermentare, iar n urma coloraiei Gram, la examinarea frotiului
apar exclusiv bacili sau cocobacili Gram negativi. n acest caz, n funcie
de diluiile pozitive se raporteaz prezena sau absena coliformilor la o
anumit cantitate de produs. De exemplu: s-au confirmat bacterii coliforme
n diluiile 10-1, 10-2. Aceasta denot c bacteriile coliforme sunt prezente n
0,01 g prob, dar sunt absente n 0,001 g de prob.
Testul de confirmare pentru coliformii totali
1. Se agit uor fiecare tub cu mediul LT (lauril-triptoz), care
elibereaz gaze i se transfer o ans din suspensie ntr-un tub cu mediu
BGB (bulion cu bil verde-briliant 2%).
2. Se incubeaz tubul BGB 48 de ore la 35C.
3. Se examineaz pentru producia de gaz i se nregistreaz.
4. Se consider reacie pozitiv atunci cnd prezena gazelor apare n
cel puin 1/10 din nlimea tubului Durham.
5. Se calculeaz numrul cel mai probabil de germeni (MPN = most
probable number) pe baza combinaiei unor tuburi LT (M47), cu eliberare de
gaze confirmate de-a lungul a trei diluii consecutive. n funcie de numrul
de eprubete pozitive, din fiecare diluie se raporteaz MPN per gram (ml)
produs, conform tabelului Mc Crady. De exemplu: dac s-au confirmat
bacterii coliforme n 3 eprubete cu diluia 10-1, n dou eprubete cu diluia
10-2, i n dou eprubete cu diluia 10-3, se va obine combinaia de 3 cifre
322, n dreptul creia se va citi din tabelul Mc Crady MPN-ul.
Testul de confirmare pentru coliformii fecali
1. Se agit uor fiecare tub LT care elibereaz gaze i se transfer o
ans din fiecare suspensie n tubul cu mediu EC.
2. Tubul cu mediul EC se incubeaz 48 de ore la 45,5C. Examinarea
produciei de gaz se face dup 24 de ore, iar dac testul este negativ se
examineaz din nou dup 48 de ore.
3. Se calculeaz MPN pentru coliformii fecali pe baza proporiei
tuburilor confirmate productoare de gaz pe mediul EC, pentru 3 diluii
consecutive.
107

Testul de confirmare pentru Escherichia coli


Se aplic o ans de suspensie din fiecare tub eliberator de gaz, cu
mediul EC pe agar L-EMB (Levine eozin albastru de metilen) (M 49).
Se incubeaz plcile timp de 18-24 de ore la 35C.
Se examineaz coloniile, iar cele tipice pentru Escherichia coli au
centrul ntunecat i suprafaa cu sau fr luciu metalic.
Se transfer 2 colonii tipice din fiecare plac cu agar L-EMB pe pante
PCA (plate count agar) (M 8) pentru testele morfologice i biochimice.
Se incubeaz mediul nsmnat 18-24 de ore la 35C.
Se recolteaz 2 colonii din fiecare plac.
Se efectueaz coloraia Gram din fiecare cultur.
Pentru toate culturile Gram negative cu bacili scuri sau cocobacili se
urmrete n continuare: producia de indol; testul Voges-Proskauer; testul
roului metil, producia de gaz din lactoz.
Interpretarea reaciei: toate culturile care fermenteaz lactoza cu
producie de gaz n 48 de ore la 35C; sunt bacili sau cocobacili Gram
negativi asporogeni; i dau tipuri de IMViC de ++-- (biotipul 1) sau -+-biotipul 2 sunt considerate a fi Escherichia coli.
Se calculeaz MPN pe baza proporiei de tuburi cu mediu EC n 3
diluii succesive care s-au dovedit a fi Escherichia coli.
Metoda MUG pentru numrarea rapid a lui Escherichia coli
din alimente refrigerate sau congelate
Acest test se bazeaz pe determinarea glucuronidazei, enzim posedat
de majoritatea tulpinilor de Escherichia coli spre deosebire de celelalte
bacterii intestinale.
Substratul MUG (4-metilumbeliferil beta D-glucuronidaz) se
ncorporeaz n bulionul LT. Tuburile inoculate se incubeaz n condiii
specifice i se examineaz n lumina UV pentru prezena ca produs final
a unei glucuronidaze fluorogene. Fluorescena n mediul LT-MUG (M 48)
termolabil indic prezena lui Escherichia coli.
Testul prezumptiv LT-MUG pentru Escherichia coli
1. Se prepar probele alimentare dup cum s-a descris la metoda
convenional.
2. Se prepar diluii zecimale ca la metoda convenional.
3. Se inoculeaz 1 ml n trei tuburi LT-MUG pentru fiecare diluie.
108

4. Se incubeaz tuburile 24 de ore la 35C i se examineaz: creterea,


producia de gaz i fluorescena. Fluorescena se examineaz la o lamp cu
UV la ntuneric. Dac aceasta este albstruie testul este pozitiv.
Testul de confirmare a LT-MUG
1. Din fiecare tub fluorescent, se nsmneaz prin striere o ans pe
agar L-EMB i se incubeaz 24 de ore la 35C.
2. Interpretare: toate culturile care devin fluorescente n mediul LTMUG; fermenteaz lactoza cu producie de gaz n 48 de ore la 35C; apar ca
bacili sau cocobacili Gram negativi asporogeni; dau tipurile ++-- (biotipul
1) sau -+-- (biotipul 2), sunt considerate a fi Escherichia coli.
Izolarea i identificarea unor serotipuri de E. coli enteropatogene
(enterotoxigene) din carne i preparate din carne
ncrctura cu E. coli a crnii, ca materie prim (porc, vit), ca i
a semi-preparatelor (salamuri, carne tocat, past de mici, slnin) i a
tampoanelor de sanitaie recoltate de pe diverse utilaje sunt redate n tabelul
2.9., sub forma numrului de tulpini de E. coli.
Acest studiu s-a efectuat n cadrul Facultii de Medicin Veterinar i
a INCDMI Cantacuzino n perioada 2008-2009.
Tabelul 2.8.
ncrctura cu E. coli a crnii i preparatelor din carne
Probe
Nr. probe
Nr. de E. coli NEC/g
Tampoane de pe utilaje
20
64,02
Carne de porc
17
27,12
Carne de vit
19
290,98
Slnin
5
0,22
Salamuri semiafumate finite
8
12,2
Carne tocat
4
65,1
Past de mici
12
355,4

Din totalul de 85 de probe prelucrate s-au izolat 15 tulpini de E. coli.


Rezultatele serologice referitoare la numrul de tulpini de E. coli izolate,
ncadrabile i nencadrabile sunt redate n tabelul 2.9.
109

Tabelul 2.9
Sortiment
Tampoane utilaje
Carne de porc
Carne de vit
Slnin
Salamuri
semiafumate finite
Carne tocat
Past de mici
Total

Nr.
probe

Tulpini
izolate

Tulpini ncadrate
serologic

Tulpini nencadrate
serologic

nr.

nr.

nr.

20
17
19
5

5
2
1
0

25
11
5
0

1
1
0
0

20
50
0
0

4
1
1
0

80
50
100
0

37

33

66

4
12
85

1
6
18

25
50
21

0
2
5

0
33
27

1
4
13

100
66
72

Datele privind structura antigenic a tulpinilor de E. coli izolate i


principalele serogrupe identificate sunt prezentate n tabelul 2.10:
Tabelul 2.10
Principalele serogrupe de E. coli identificate n materia prim utilizat la
prepararea mezelurilor, produselor finite i a unor semipreparate
Serogrupe identificate
Probe

Tampoane
utilaje
Carne porc
Carne vit
Slnin
Salamuri
semiafumate
finite
Carne tocat
Past mici
Total

Nr. tulpini izolate/


Nr. tulpini
ncadrate

07

08

010

015

020

nr

nr

nr

nr

nr

5/1

20

20

2/1
1/0
0/0

0
0
0

0
0
0

0
0
0

0
0
0

0
0
0

0
0
0

0
0
0

0
0
0

1
0
0

50
0
0

3/1

1/0
6/2
18/5

1
0
2

50
0
11

0
0
1

0
0
5,5

0
1
1

0
16,6
5,5

1
0
1

100
0
5,5

0
1
2

0
16,6
11

Aspectele legate de unii factori de patogenitate cercetai la tulpinile


izolate sunt redate n tabelul 2.11.
110

Tabelul 2.11
Testarea patogenitii unor tulpini de E. coli izolate pe fluxul producerii
mezelurilor i a unor semipreparate
Tulpini
Tulpini Globule
examinate pozitive
roii
Testul
Obs.
nr. % nr. % oaie/om
1=N
Producia de hemolizine
85 100 2 23,52
1 = 010
RSAR
85 100 2 23,52
1 = N:K99F41
Prezena fimbriilor
latex aglutinare
1 1,17
1 = N: F41
Testul ansei ligaturate
pentru ST/LT
5 100 0
0
(purcel sugar nrcat)
Producia de H2S
85 100 10 11,76
N = tulpin nencadrat serologic

Valorile individuale ale parametrilor analizai (numrul de E. coli)


variaz n limite largi, n funcie de prob, seria de probe i respectiv unitatea
din care s-au recoltat probele.
ncrctura cu E. coli (NEC/g) prezint urmtoarele valori: slnin
(0,35), carne de porc n lucru (45,12), salamuri (32,5), tampoane de pe
utilaje i mini personal (120,07).
La restul probelor se constat valori cuprinse ntre 380,57-1234,5.
Din analiza acestor date se poate deduce faptul c materiile prime
ajung la fabricile de prelucrare cu o anumit ncrctur bacterian
dependent n principal de zestrea microbiologic a animalului nainte de
sacrificare, condiii igienico-sanitare pe flux, condiii de pstrare a crnii
dup sacrificarea animalelor, frecvena manipulrilor pe timpul pstrrii i,
respectiv, condiiile igienice n timpul transportului.
Se cunoate, de asemenea, c att carnea i, mai ales, semifabricatele
i respectiv compoziia de umplere prin contactul cu minile lucrtorilor, cu
utilajele de lucru, cu adaosul diferitelor ingrediente, i sporete ncrctura
bacterian, aspect confirmat i de investigaiile noastre.
Remarcm, de asemenea, rolul deosebit al proceselor de prelucrare
termic (fierbere i afumare), care n condiiile cnd sunt bine efectuate,
reduc ncrctura n bacterii E. coli la produsele finite (prospturi i salamuri
semi-afumate), indiferent de ncrctura iniial a crnii i semifabricatelor.
Acest aspect dorit att de productori ct i de controlorii de calitate a fost
ntlnit pe ntreaga perioad a investigaiilor noastre. n condiiile noastre
de lucru s-au preparat 15 seruri anticolibacilare O pentru 15 serogrupe.
Examenul serologic al tulpinilor de E. coli izolate din materia prim,
semifabricate, produse finite, unele semipreparate i tampoanele de sanitaie
111

ne-au permis ncadrarea serologic a unui procent de 18 tulpini din cele 85


de tulpini izolate. Majoritatea sunt nencadrabile serologic 13 (72,22%),
fapt datorat n principal marii variabiliti genetice a germenilor din familia
Enterobacteriaceae, precum i din alte familii, aspect constatat i de ctre ali
autori. Dintre serogrupele identificate, menionm: O7 = 2 tulpini (11,11%),
O8 = 1 tulpin (55,55%), O10 = 1 tulpin, O15 = 1 tulpin, O20 = 1 tulpin.
Serogrupele O7 i O10 sunt recunoscute pe plan mondial ca avnd
implicaii n patologia uman.
Serogrupele O8, O15, O20 sunt implicate n patologia animal n septicemiile nou-nscuilor.
Studiul factorilor de patogenitate prin reacia de seroaglutinare rapid
(RSAR) i latex aglutinare, cu un kit Fimbrirex K99, F41 ne-au permis
evidenierea prezenei fimbriilor de tip F41 la o tulpin nencadrabil
serologic, izolat din carnea tocat.
Datele din literatura de specialitate arat c tulpinile cu astfel de
fimbrii sunt tot mai frecvent implicate n forma enteric de colibaciloz la
viei, porci i miei.
Studiul prezenei enterotoxinelor prin testul ansei ligaturate la purcelul
sugar/nrcat a unui numr de 5 tulpini de E. coli nu a evideniat prezena
enterotoxinelor termostabile (ST) sau a enterotoxinei termolabile (LT).
Testarea activitii hemolitice ne-a permis identificarea a dou tulpini
(23,52%), una nencadrabil, izolat din carnea de mici i una aparinnd
serogrupei O10 izolat din salam.
Activitatea de producere a hidrogenului sulfurat a fost identificat la 10
probe (11,76%) din cele 85 analizate i la 2 probe (23,52%) din tampoanele
de pe utilaje i minile lucrtorilor.
Tulpinile de E. coli productoare de H2S nu au fost identificate n
produsele finite. Se cunoate c hidrogenul sulfurat determin o cretere
a motilitii intestinale, putnd determina deranjamente gastro-intestinale,
att la om, ct i la animale.
Din studiul efectuat n cadrul Facultii de Medicin Veterinar i
INCDMI Cantacuzino s-au desprins urmtoarele concluzii:
1. Probele testate au fost reprezentate de carne de porc, vit, slnin,
salamuri, carne tocat, past de mici, din diferite uniti de desfacere a
acestora.
2. Pentru examenul serologic al tulpinilor de E. coli izolate au fost
ncadrate serologic un numr de 18 tulpini (21,17%) din cele 85 de tulpini
izolate. Serogrupele identificate au fost: O7 (11,11%), O8 (55,55%), O10
112

(55,55%), O15 (55,55 %), O20 (55,55%).


3. Examenele bacteriologice efectuate din carnea de bovin i porcin
(materie prim), din unele preparate i semipreparate din carne, au condus
la izolarea i identificarea unor serotipuri de E. coli enteropatogene.
4. Mediile folosite n cadrul testrii prezumptive au fost reprezentate
de: bulionul glucozat (B.G.) i mediul Levine (GEAM).
5. Prin testarea tulpinilor pentru evidenierea fimbriilor s-a constatat
prezena fimbriilor de tip F41la o tulpin nencadrabil serologic, izolat din
carnea tocat.
6. Studiul prezenei enterotoxinelor prin testul de ans ligaturat la
purcel sugar sau nrcat, la un numr de 5 tulpini de E. coli nu au evideniat
prezena enterotoxinelor LT (termolabil) sau ST (termostabil).
7. Prezena activitii hemolitice a fost constatat la dou tulpini de
E. coli (23,52%) din carne de mici i din salam.
8. Au fost identificate n produsele finite 10 tulpini de E. coli (11,76%)
productoare de hidrogen sulfurat.
9. Pentru testele de confirmare s-au folosit un agar nutritiv nclinat,
bulion-bil-lactoz-verde-briliant (BBLV) i ap tripeptonat.

113

dETErmInArEA COLIfOrmILOr TOTALI

1. Se amestec
proba alimentar
ntr-un
blender
rotativ de nalt
vitez.

450 g diluant tampon fosfat


Butterfield
50 g aliment se amestec la
10.000-12.000 RPm pentru 2 minute
90 ml
diluant

2. Se dilueaz
omologatul
de
prob alimentar.

3. Test prezumptiv. Se incubeaz


la 35C pentru
24-48 de ore

Bulion lauril-triptoz

4. Test de confirmare.
Se incubeaz la
35C 48 de ore
Bulion BGB 2%
5. Interpretare: Se numr tuburile gaz-pozitive i se calculeaz mPN din tabele.

114

Escherichia coli O157:H7. Microscopie electronic

Escherichia coli O157:H7. Se remarc prezena flagelilor i a fimbriilor.


115

Escherichia coli O157:H7. Microscopie electronic - SUH (sindromul urohemolitic)

Escherichia coli. Coloraia Gram.


Preparat din cultur

Escherichia coli. Coloraia Gram.


Preparat din cultur

Escherichia coli.
Coloraia Gram. Preparat din cultur

Escherichia coli.
Coloraia Gram. Preparat din cultur
116

Mediul Mac Conkey.


Colonii lactoz pozitive, roz-mate

Mediul Leifson. Colonii roii de


Escherichia coli.

Mediul Mac Conkey.


Colonii lactoz pozitive, mucoide.
Identificate cu ajutorul testului API pentru
diferenierea de Klebsiella pneumoniae

117

Plac cu agar Mac Conkey inoculat


cu Escherichia coli (lactoz
pozitiv) i Serratia marcescens
(lactoz negativ, de culoare rou
aprins)

Bibliografie selectiv
1. Baylis, C. L., Penn, C. W., Thielman, N. M., Guerrant, R. L., Jenkins, C. and
Gillespie, S. H., 2006. Escherichia coli and Shigella spp., In Principles and Practice of
Clinical Bacteriology. Second Edition. S. H. Gillespie and P. M. Hawkey Eds., John Wiley
& Sons Ltd, London: p 347-365.
2. Caprioli A, Morabito S, Brugre H, Oswald E., 2005. Enterohaemorrhagic
Escherichia coli: emerging issues on virulence and modes of transmission. Vet Res. 2005.
36(3):289-311.
3. Chen Q, Savarino SJ, Venkatesan MM., 2006, Subtractive hybridization and
optical mapping of the enterotoxigenic Escherichia coli H10407 chromosome: isolation
of unique sequences and demonstration of significant similarity to the chromosome of
Escherichia coli K-12. Microbiology. Apr;152(Pt 4):1041-54.
4. Cheryl L. Tarr, Adam M. Nelson, Lothar Beutin, Katharina E. P. Olsen, and
Thomas S. Whittam. 2008, Molecular Characterization Reveals Similar Virulence Gene
Content in Unrelated Clonal Groups of Escherichia coli of Serogroup O174 (OX3) J.
Bacteriol. 2008 190: 1344-1349.
5. de Sablet T, Bertin Y, Vareille M, Girardeau JP, Garrivier A, Gobert AP, Martin
C., 2008., Differential expression of stx2 variants in Shiga toxin-producing Escherichia
coli belonging to seropathotypes A and C., Microbiology. 154:176-86.
6. Devasia RA, Jones TF, Ward J, Stafford L, Hardin H, Bopp C, Beatty M, Mintz
E, Schaffner W., 2006. Endemically acquired foodborne outbreak of enterotoxin-producing
Escherichia coli serotype O169:H41. Am J Med. 2006 Feb;119(2):168.e7-10.
7. Donnenberg, M. S., 2002, Escherichia coli virulence mechanisms of a versatile
pathogen, London, Academic Press.
8. Duffy, G., Garvey, P. and McDowell, D. A., 2001, Verocytotoxigenic Escherichia
coli, Trumbull, Connecticut, Food & Nutrition Press Inc.
9. EFSA, 2007, Monitoring of verotoxigenic Escherichia coli (VTEC)
andidentification of human pathogenic VTEC types, Scientific Opinion of the Panel on
BIOLOGICAL HAZARDS (Question No EFSA-Q-2007-036) The EFSA Journal.
10. Kaper, J. B. and OBrien, A. D., 1998, Escherichia coli O157:H7 and other
Shiga toxin-producing Escherichia coli strains, Washington D.C, ASM Press.
11. Karmali, M. A., 2003, The medical significance of Shiga toxin-producing
Escherichia coli infections. An overview. Methods Mol. Med. 73: 1-7
12. Le Gall T, Darlu P, Escobar-Pramo P, Picard B, Denamur E., 2005, Selectiondriven transcriptome polymorphism in Escherichia coli/Shigella species. Genome Res.
Feb;15(2):260-8.
13. Morabito S, Karch H, Mariani-Kurkdjian P, Schmidt H, Minelli F, Bingen E,
Caprioli A., 1998, Enteroaggregative, Shiga toxin-producing Escherichia coli O111:H2
118

associated with an outbreak of hemolytic-uremic syndrome. J Clin Microbiol. 1998.


36(3):840-2.
14. Nataro J. P. and Kaper, J. B., 1998, Diarrheagenic Escherichia coli. Clin.
Microbiol. Rev. 1998. 11(1): 142-201.
15. Scheutz, F. and Strockbine, N. A., 2005, Escherichia. Bergeys manual of
systematic bacteriology. G. M. Garrity, D. J. Brenner, N. R. Krieg and J. T. Staley Eds.
New York, NY, Springer,: 607-624.17
16. Scheutz, F. and Strockbine, N. A., 2005, Escherichia. In Bergeys manual of
systematic bacteriology, G. M. Garrity, D. J. Brenner, N. R. Krieg and J. T. Staley Eds. New
York, NY, Springer,: 607-624.
17. Scheutz, F., Beutin, L., Pierard, D. and Smith, H. R., 2001, Nomenclature of
Vero cytotoxins. In Verocytotoxigenic Escherichia coli, G. Duffy, P. Garvey and D. A.
McDowell Eds. Trumbull, Connecticut, Food and Nutrition Press Inc: 447-452. 16
18. Simona Ivana, 2002 Bacteriologie veterinar special (Ed. Ceres, Bucureti;
460 pagini), ISBN: 973-40-0568-5
19. Simona Ivana, 2005 Bacteriologie general (Ed. tiinelor medicale, Bucureti;
250 pagini), ISBN: 973-86485-7-2
20. Simona Ivana, 2006 Tratat de bacteriologie medical-veterinar i introducere
n micologie (Ed. tiinelor medicale, Bucureti;768 pagini), ISBN (10) 973-86571-5-6;
ISBN (13) 978-973-86571-5-1
21. Simona Ivana, 2007 Manual de microbiologia alimentelor (Ed. tiinelor
medicale, Bucureti; 160 pagini), ISBN: 978-973-86571-3-7
22. Simona Ivana, 2007 Microbiologie medical veterinar, Vol. I (Ed. tiinelor
medicale, Bucureti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-01-6
23. Simona Ivana, 2007 Microbiologie medical veterinar, Vol. II (Ed. tiinelor
medicale, Bucureti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-02-3
24. Simona Ivana, 2008, Microbiologia alimentelor, Ed. Orizonturi, ISBN: 978973-736-090-8
25. Simona Ivana, 2008, Practical guide of microbiogical diagnosis, Ed. Orizonturi,
ISBN: 978-973-736-089-2
26. Sussman, M., 1997, Escherichia coli, Mechanisms of virulence, Cambridge,
Cambridge University Press.
27. Welch RA, Burland V, Plunkett G 3rd, Redford P, Roesch P, Rasko D, Buckles
EL, Liou SR, Boutin A, Hackett J, Stroud D, Mayhew GF, Rose DJ, Zhou S, Schwartz DC,
Perna NT, Mobley HL, Donnenberg MS, Blattner FR, 2002, Extensive mosaic structure
revealed by the complete genome sequence of uropathogenic Escherichia coli. Proc Natl
Acad Sci U S A. Dec 24;99(26):17020-4.
28. Wick LM, Qi W, Lacher DW, Whittam TS, 2005, Evolution of genomic
content in the stepwise emergence of Escherichia coli O157:H7, J Bacteriol. Mar;
187(5):1783-91.
119

29. Wickham, M. E., Lupp, C., Mascarenhas, M., Vazquez, A., Coombes, B. K.,
Brown, N. F., Coburn, B. A., Deng, W., Puente, J. L., Karmali, M. A. and Finlay, B.
B, 2006, Bacterial genetic determinants of non-O157 STEC outbreaks and hemolyticuremic syndrome after infection. J. Infect. Dis. 194(6): 819-827
30. Yang J, Nie H, Chen L, Zhang X, Yang F, Xu X, Zhu Y, Yu J, Jin Q., 2007,
Revisiting the molecular evolutionary history of Shigella spp. J Mol Evol. Jan;64(1):71-9.
31. Erickson, J.P., J.W. Stamer, M. Haycs, D.N. McKenna, and L.A. van Alstine.
1995. An assessment ol Escherichia ,,,/, 0157:H7 contaniinaiion risks in commercial
mayonnaise Iroin pasicurized eggs and environmcntal sourccs. and behavior in Iow-pH
dressings. J. FoodProtect. 58:1059-1064.
32. Fenton, L.L., L.W. Hand, T.G. Rehberger, F.K. Ray, and T.G. Harbolt. 1995.
Fate of Escheruhia coli Ol 57:H7 in theniially processed low fat ground becf pattics. Proc.
Inst. Food Technol. 36.
33. Ficlding, L.M., P.E. Cook, and A.S. Grandison. 1994. The effecl of electron
beam irradiation and modified pH on the survival and recovery of Escherichia coli. J. Appl.
Bacteriol. 76:412-416.
34. Fisher, T.L., and D.A. Golden. 1998. Fate of Escherichia coli Ol57:H7 in ground
apples used in cider production. /. Food Proiect. 61:1372-1374.
35. Frantz, J.C., L. Jaso-Fricdman, and D.C. Robertson. 1984. Binding of
Escherichia coli heat-stable enterotoxin to rat intestinal cells and brush border membranes.
Infect. Immun. 43:622-630.
36. Glass, K.A., J.M. Loeffelholz, J.P. Ford, and M.P. Doyle. 1992. Fate of
Escherichia coli 0157:H7 as affected by pH or sodium chloride and in fermented, dry
sausage. Appl. Environ. Microbiol. 58:2513-2516.
37. Gonthier, A., V. Gue>in-Faublee, B. Tilly, and M.-L. Delignette-Muller. 2001.
Optimal growth temperature of 0157 and non-0157 Escherichia coli strains. Lett. Appl.
Microbiol. 33:352-356.
38. Griffin, P.M., and R. V. Tauxe. 1991. The epidemiology of infections caused by
Escherichia coli 0157:H7, other enterohe-morrhagic Escherichia coli, and the associated
hemolytic uremie syndrome. Epidemiol. Rev. 13:60-98.
39. Gross, R.J.. L.V. Thomas, T. Cheasty, N.P. Day, B. Rowe, M.R.F. Toledo, and
L.R. Trabulsi. 1983. Enterotoxigenic and enteroinvasive Escherichia coli strains belonging
to a new O Group, 0167. J. Clin. Microbiol. 17:521-523.
40. Herriott, D.E., D.D. Hancock, E.D. Ebel, L. V Carpenter, D.H. Rice, and TE.
Besser. 1998. Association of hercl management factors with colonization of dairy cattle by
Shiga toxin-positive Escherichia coli 0157../. Food Proiect. 61:802-807.
41. Hitotsubashi, S., Y. Fujii, and K. Okamota. 1994. Binding protein for Escherichia
coli heat-stable enterotoxin II in mouse intestinal membrane. FEMS Microbiol. Lett.
122:297-302.
42. Hitotsubashi. S., Y. Fujii. and H. Yamanaka. 1992. Some properties of purified
120

Escherichia coli heat-stable enterotoxin II. Infect Immun. 60:4468-4474.


43. Harrison, J., and M. Harrison. 1995. Fate of Escherichia coli 0157.H7, Listeria
monocytogenes, and Salmonella Ty-phimurium during preparation and storage of becf
jerky. Proc. Inst. Food Technol. 30.
44. Hathcox, A.K., L.R. Beuchat, and M.P. Doyle. 1995. Death of enterohemorrhagic
Escheruhia coli 0157:H7 in real mayonnaise and reduced-caloric mayonnaisc dressing
as influenced by iniial population and storage temperature. Appl. Environ. Microbiol.
61:4172-4177.
45. Hobbs, B.C., M.E.M. Thomas, and J. Taylor. 1949. School outbreak of
gastroenteritis associated with a pathogenic paracolon bacillus. Lancet 2:530-532.
46. Itoh, Y., Y. Sugita-Konishi, F. Kasuga, M. Iwaki, Y. Hara-Kudo, N. Saito, Y.
Noguchi, H. Konuma, and S. Kumagai. 1998. Enterhemorrhagic Escherichia coli 0157:H7
present in radish sprouts. Appl. Environ. Microbiol. 64:1532-1535.
47. Janisiewicz, W.J., W.S. Conway, M.W. Brown, G.M. Sapcrs, R Fratamico, and
R.L. Buchanan. 1999. Fate of Escherichia coli 0157:H7 on fresh-cut apple tissuc and its
potenial for transmission by fruit flies. Appl. Environ. Microbiol. 65:1-5.
48. Jordan, D., and S.A. McEwen. 1998. Effect of duration of fasting and a shortterm high-roughage ration on the concentration of Escherichia coli biotype 1 in cattle
feces. J. Food Proiect. 61:531-534.
49. Karch, H., H. Russmann, H. Schmidt, A. Schwarzkopf. and J. Heeseman. 1995.
Long-term shedding and clonal turnover of enterohemorrhagic Escherichia coli 0157:H7
in diarrheal diseases. J. Clin. Microbiol. 33:1602-1605.
50. Klipstein, F.A., R.F. Engert, and R.A. Houghten. 1983. Properties of synthetically
produced Escherichia coli heat-stable enterotoxin. Infect. Immun. 39:117-121.
51. Konowalchuk, J., J.l. Speirs, and S. Stavric. 1977. Vero response to a cytotoxin
of Escherichia coli. Infect. Immun. 18:775-779.
52. Kudva, I.T., K. Blanch, and C.J. Hovde. 1998. Analysis of Escherichia coli
0157:H7 survival in ovine or bovine manure and manure slurry. Appl. Environ. Microbiol.
64:3166-3174.
53. Kunkel, S.L., and D.C. Robertson. 1979. Purification and chemical
characterization of the heat-labile enterotoxin produced by enterotoxigenic Escherichia
coli. Infect. Immun. 25:586-596.
54. Lallier, R., S. Lariviere, and S. St-Pierre. 1980. Escherichia coli heat-stable
enterotoxin: Rapid method of purification and some characteristics of the toxin. Infect.
Immun. 28:469-474.
55. Lee, C.H., S.L. Moseley. H.W. Moon, S.C. Whipp. C.L. Gyles, and M. So.
1983. Characterization of ihe gene encoding heat-stahle toxin II and prelitninary molecular
epidomiological siudies of tnttrotoxigenic Escherichia coli heat-stahle toxin II producers.
Infei i Immun. 42:264-268.
56. LeJeune, J.T.. T.E. Besser. D.H. Rice. J.L. Berg. R.P. Stilborn, and D.D. Hancock.
121

2004. Longitudinal study ol fecal shedding of Escherichia coti ()157:H7 in feedlot cattle:
Predominante and persistence of specific clonal typcs despite massive cattle population
turnover. Appl. Environ Mu robioi. 70:377-384.
57. Leyer. G.J.. L.-L. Wang. and E.A. Johnson. 1995. Acid adaptation of Escherichia
coli 0157:H7 increases survival in acidic foods. Appl. Environ. Microbiol. 61:3752-3755.
58. Line. J.E.. A.R. Fain, Jr.. A.B. Moran. L.M. Martin. R.V. Lechowich, J.M.
Carosella, and W.L. Brown. 1991. Lethality of heat to Escherichia coli 0157:H7: D-value
and r-value determinations in ground beef. J. Food Protect. 54:762-766.
59. Lior. H. 1994. Escherichia coli0\51\Hl and verotoxigenic Escherichia coli
(VTEC). Dairy Food Environ. Sanil. 14:378-382.
60. Louise, CB., S.A. Kaye. B. Boyd, CA. Lingwood, and T.G. Obrig. 1995. Shiga
toxin-associated hemolytic uremie syndrome: Effect of sodium butyrate on sensitivity of
human umbilical vein endothelial cells to Shiga toxin. Infect. Immun. 63:2766-2769.
61. Machino. H.. K. Araki, S. Minami, T. Nakayama, Y. Ejima. K. Hiroe, H. Tanaka,
N. Fujita, S. Usami, M. Yonekawa. K. Sadamoto, S. Takaya, and N. Sakai. 1998. Recent
outbreaks of infections caused by Escherichia coli Ol57:H7 in Japan. In Escherichia coli
0157.H7 and Other Shiga Toxin-Producing Escherichia coli Strains, ed. J.B. Kaper and
A.D. OBrien, 73-81. Washington. DC: ASM Press.
62. Marier. R., J.G. Wells, R.C Swanson, W. Callahan. and I.J. Mehlman. 1973.
An outbreak of enteropathogenic Escherichia coli foodborne disease traced to imported
French cheese. Lancet 2:1376-1378.
63. Mazaitis, A.J., R. Maas. and W.K. Maas. 1981. Structure of a naturally occurring
plasmid with genes for enterotoxin production and drug resistance. J. Bacteriol. 145:97105.
64. Merson. M.H., F. Orskov. I. Orskov. R.B. Sack. I. Huq. and F.T. Koster. 1979.
Relationship between enterotoxin production and serotype in enterotoxigenic Escherichia
coli. Infect. Immun. 23:325-329.
65. Montenegro, M.A., M. Buhe. T. Trumpf, S. Aleksic, G. Reuter, E. Bulling, and
R. Helmuth. 1990. Detection and characterization of fecal verotoxin-producing Escherichia
coli from healthy cattle. J. Clin. Microbiol. 28:1417-1421.
66. Mundell. D.H., C.R. Anselmo, and R.M. Wishnow. 1976. Factors influencing
heat-labile Escherichia coli enterotoxin activity. Infect. Immun. 14:383-388.
67. Neill. M. A.. P.I. Tarr. D.N. Taylor. and M. Wolf. 2001. Escheru hia coli. In
Foodborne Disease Handbook: Diseases Caused by Bacteria, ed. Y.H. Hui. M.D. Pierson,
and J.R. Gorham, 2nd ed., 169-212. New York: Marcel Dekker.
68. OBrien. A.D., M.R. Thompson. J.R. Cantey. and S.B. Formal. 1977. Production
of Shigella dysenteriae-Uke toxins by pathogenic Escherichia coli. Abstr.. Amer. Soc.
Microbiol. 32.
69. OBrien, A.D.. and R.K. Holmes. 1987. Shiga and Shiga-like toxins.
Microbiol. Rev. 51:206-220.
122

70. OBrien, A.D.. V.L. Tesh, A. Donohue-Rolfe, MP Jackson, S. Olsnes, K.


Sandvic, A.A. Lindberg, and G.T. Keusch. 1992. Shiga toxin: Biochemistry, genetics,
mode of action, and role in pathogenesis. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 180:65-94.
71. Oelschlaeger, T.A., T.J. Barrett, and D.J. Kopecko. 1994. Some structures and
processes of human epithelial cells involved in uptakc of enterohemorrhagic Escherichia
coli 0157:H7 strains. Infect. Immun. 62:5142-5150.
72. Omisakin, F. M. MacRae, I.D. Ogden, and N.J.C Strachan. 2003. Concentration
and prcvalence of Escherichia coli 0157:H7 in cattle feces at slaughter. Appl. Environ.
Microbiol. b9\2444-2<WI.
73. 0rskov. I., F. 0rskov, B. Jann. and K. Jann. 1977. Serology, chemistry, and
genetics of O and K antigens of Escherichia coli. Bacteriol. Rev. 41:667-710.
74. Ostroff, S.M., P.I. Tarr. M.A. Neill, J.H. Lewis, N. Hargrett-Bean, and J.M.
Kobayashi. 1989. Toxin genotypes and plasmid profiles as determinants of systemic
sequelae in Escherichia coli ()157:H7 infections. J. Infect. Dis. 160:994-998.
75. Palumbo. S.A., J.E. Caii. F.J. Schultz, and A.C. Williams. 1995. Minimum and
maximum temperatures for growth and verotoxin production by hemorrhagic strains of
Escherichia coli../. Food Protect. 58:352-356.
76. Park. S.. R.W. Worobo, and R.A. Durst. 1999. Escherichia coli 0157:H7 as an
emerging foodborne pathogen: A literatura review. Crit. Rev. Fd. Sa Nutr. 39:481-502.
77. 70 Picken, R.N.. A.J. Ma/aitis. W.K. Maas. M. Rey, aud II Heyneker. 1983.
Nuclcotide sequence ofthe gene lor hcat-stable enterotoxin II of Escherichia coli. Infect
Immun. 42:269-275.

123

CAPITOLUL 3
Implicaiile bacteriilor din genul Yersinia
n producerea toxiinfeciilor alimentare
3.1. Caractere generale
A fost constituit n 1944 la propunerea lui Van Loghem.
Cuprinde 13 specii, dintre care, cele mai importante n patologia
veterinar i uman sunt: Yer. pseudotuberculosis (cu dou subspecii:
pseudotuberculosis i pestis), Yer. pestis, care este agentul etiologic al ciumei
la om; Yer. pseudotuberculosis, care produce yersinioza la multe specii de
animale; Yer. enterocolitica (subsp. enterocolitica i palearctica), care este
agentul etiologic al unei enterite grave la om i animale, dar care se izoleaz
i din intestinul porcilor sntoi; Yer. ruckeri, care produce la salmonide
infecia numit gura roie.
Bacterii din genul Yersinia, sunt Gram negative, au form bacilar,
sunt facultativ anaerobe, imobile la 37C, mobile la 25-30C (cu excepia
lui Yer. pestis i Yer. ruckeri, care sunt ntotdeauna mobile). Sunt oxidaz
negative, catalaz pozitive, testul Voges-Proskauer negativ la 37C, nu
produc hidrogen sulfurat, nu fermenteaz lactoza, ureaz pozitivi.
Se dezvolt pe medii de cultur ca: snge, Mac Conkey, bulion-cord,
agar SS, la temperatura camerei sau la 39C i n ser fiziologic, tamponat,
la 4C.
Coloniile sunt foarte mici, dup 24 de ore, dar bine vizibile dup 48
de ore.
3.2. Epidemiologie
n 2006, au fost confirmate 9.067 cazuri de yersinioz uman din
9.075 notificri provenide de la 25 state (Frana, Grecia, Olanda, Romnia
i Liechtenstein nu au raportat). Aceste notificri sunt cu 4,5% mai mici
dect cele raportate cu un an n urm de ctre aceleai state. Rata medie a
notificrilor pentru 2006 a fost 2,3 la 100.000 locuitori.
Distribuia yersiniozelor pe grupe de vrst i sex.
124

Aceast distribuie a fost furnizat de 19 state pentru un total de 8.608


(95%) cazuri raportate. Cel mai afectat grup a fost grupa de vrst 0-4
ani cu 2.799 (31%) cazuri, tot acest grup a avut i cea mai mare rat a
notificrilor, respectiv de 14,8 la 100.000.

Cazuri/100.000

Figura 3.1.
Distribuia pe grupe de vrst a cazurilor de yersinioz n 2006 (8608cazuri)
(Centrul European Pentru Prevenirea i Controlul Bolilor, 2008)

Informaiile referitoare la sexul persoanelor afectate au fost diponibile


la 8.646 (95,3%) din cazuri. Analiza acestora nu a scos n eviden diferene
semnificative ntre brbai (2,4 la 100.000) i femei (2,1 la 100.000).
Sezonalitatea
Cazurile de yersinioz nu expun un adevrat tipar sezonier, chiar dac
majoritatea cazurilor au fost raportate spre a doua jumtate a anului 2006.
Tabelul 3.1.
Numrul i rata notificrilor yersiniozelor non-holerice raportate n UE i EEA/
EFTA n 2006

ara

Austria
Belgia
Bulgaria
Cipru

Tipul de raportare
C
C
C
U

Total cazuri

Cazuri confirmate

Nr. cazuri per


populaii de
100.000 de
oameni

158
264
5
0

158
264
5
0

1.9
2.5
0.06
0.0

125

Total cazuri

Cazuri confirmate

Nr. cazuri per


populaii de
100.000 de
oameni

535

534

5.2

Danemarca

215

215

4.0

Estonia

42

42

3.1

Finlanda

795

795

15.1

Frana

Germania

5161

5161

6.3

Grecia

Ungaria

38

38

0.38

Irlanda

0.1

Italia

0.0

Latvia

94

92

4.0

Lituania

411

411

12.1

Luxembourg

1.1

Malta

0.0

Olanda

Polonia

110

110

0.29

Portugalia

0.0

Romnia

Slovacia

83

82

1.5

Slovenia

80

76

3.8

Spania

375

375

0.86

Suedia

558

558

6.2

Marea Britanie

59

59

0.10

8989

8981

2.4

ara

Tipul de raportare

Republica Ceh

Total UE
Islanda

0.0

Liechtenstein

Norvegia

86

86

1.9

Total

9075
9067
2.3
Sursa: Raportri naionale. A = Raportri de date agregate; C = Raportri bazate
pe cazuri; - = fr raportare; U = nespecificat
126

Cazuri

Figura 3.2.
Distribuia sezonier a cazurilor de VTEC/STEC n EU i EEA/EFTA n 2006
(n=8660) (Centrul European Pentru Prevenirea i Controlul Bolilor, 2008)

Ian

Feb

Mar

Apr

Mai

Iun

Iul

Aug

Sep

Oct

Nov Dec

Investigaiile efectuate pentru evaluarea incidenei Yersinia spp. la


diferite tipuri de animale i produse alimentare, inclusiv carne de porc i vit
au artat c Y. enterocolitica este identificat rar. Izolarea i identificarea Y.
enterocolitica creaz o serie de probleme, ntruct identificarea tulpinilor
virulente pentru oameni solicit att stabilirea biotipului, ct i a serotipului.
n Europa cea mai frecvent izolat Y. enterocolitica este biotipul 4 (serotip
O:3) i, mai rar biotipul 2 (serotip O:9).

3.3. Specii ale genului Yersinia implicate


n toxiinfeciile alimentare
3.3.1. Yersinia pseudotuberculosis subsp. pseudotuberculosis
(Pasteurella pseudotuberculosis)
Istoric
Germenul a fost descris n 1883 de Malassez i Vignal, care
inoculeaz la cobai materialul patologic din leziunea unui copil i reproduc
o infecie asemntoare morfopatologic cu tuberculoza. Pfeiffer (1889) a
fost primul care a descris Bacillus pseudotuberculosis, pe care l-a rebotezat
Pasteurella pseudotuberculosis, n 1929. n 1935 a fost denumit Shigella
pseudotuberculosis, iar Smith i Thal (1965) au plasat-o n genul Yersinia.
127

Morfologie
Bacterie Gram negativ, de 0,8-6/0,8 microni, pleomorf mai frecvent
cocobacilar cu tendin de coloraie bipolar.
Necapsulogen, nesporogen, prezint flageli peritrichi, cnd este
cultivat la 28-30C.
Condiii de cultivare i caractere culturale
Crete bine pe medii de cultur uzuale n aerobioz. Pentru izolarea
din materiale patologice cu flor bacterian mixt se utilizeaz mediul lui
Morris, n compoziia cruia intr substane care i confer selectivitatea,
cum ar fi eritromicina, novobiocina, teluritul de potasiu.
Pe agar dezvolt la 37C n 24 de ore colonii de 1-1,5 milimetri,
care n 48 de ore ating 2-3 milimetri. Acestea sunt rotunde, uor granulate,
translucide i cu centrul opac, avnd un aspect striat la periferia coloniei.
Proprieti biochimice
Fermenteaz glucoza fr producia de gaz, nu produc hidrogen
sulfurat, nu fermenteaz lactoza. La 37C este imobil (mediul MILF se
tulbur numai dup meninerea 24 de ore la temperatura camerei).
Nu produce indol, lizindecarboxilaz i fenilalanin-deaminaz.
Nu cresc pe mediul cu citrat (Simmons), nu scindeaz malonatul,
produce ureaz i beta galactozidaz.
Tabelul 3.2.

Ureaz

Indol

Zaharoz

Ramnoz

Celobioz

Sorbitol

Salicin

Yer. pestis
Yer. pseudotuberculosis
Yer. enterocolitica
Yer. frederiksenii
Yer. ruckeri

Ornitindecarboxilaz

Yersinia spp.

Mobilitatea la
37Ca

Diferenierea biochimic a speciilor de Yersinia


(dup Fanner, 1995)

0
0
2
5
0

0
0
95
95
100

5
95
75
70
0

0
0
50
100
0

0
0
95
100
0

1
70
1
99
0

0
0
75
100
5

50
0
99
100
50

70
25
20
92
0

128

Sorbitol

Salicin

Celobioz

Zaharoz

100 15
100 20
100 20
100
0
60
0
100 100

Indol

100
100
100
25
0
96

Ureaz

Ramnoz

Ornitindecarboxilaz

Mobilitatea la
37Ca

5
92
77
30
0
0
Yer. kristensenii
0
80
20
0
100
0
Yer. mollaretii
0
80
60
0
100
0
Yer. bercovierii
0
25
62
0
100
0
Yer. rohdei
0
40
60
0
20
0
Yer. aldovae
5
100
80 100 100 100
Yer. intermedia
a)
Cu excepia Yer. pestis, toate speciile sunt mobile la 25C

Yersinia spp.

Proprieti antigenice
Posed antigene somatice O i antigene flagelare H, pe baza
crora specia este divizat n 8 serogrupuri majore, dintre care unele sunt
subdivizate n subgrupe, fiecare cu mai multe serotipuri.
Subspecia pseudotuberculosis prezint antigene comune cu subspecia
pestis, salmonelele din grupele B, D i Escherichia coli. Nu exist
nrudiri antigenice ntre Yer. pseudotuberculosis i Yer. enterocolitica.
Identificarea antigenic prin aglutinare cu ser anti Yer. pseudotuberculosis
tip 1 (serovarurile dominante n ara noastr) confirm apartenena de gen
i specie.
Comportarea fa de factorii de mediu
Yer. pseudotuberculosis este o bacterie sensibil la aciunea factorilor de
mediu fizici i chimici i a dezinfectantelor obinuite n concentraii uzuale.
Cele mai active antibiotice sunt streptomicina, neomicina, tetraciclina.
Ecologie
Rezervorul natural al acestei bacterii l constituie roztoarele i psrile
slbatice, de unde ajunge n sol i n apele de suprafa, unde supravieuiete
chiar i la temperaturi joase. La om, ajunge pe cale alimentar, fiind cauza
unor enterite subacute, nsoite de adenopatie mezenteric ce poate mima
apendicita.
129

Patogenitate
Ajunse n tubul digestiv, yersiniile se multiplic n mucoasa intestinal,
producnd focare inflamatorii n lamina propria i nodurile limfatice aferente,
sub form de microabcese determinnd atrofierea vilozitilor intestinale.
Ca rezultat se produce malabsorbie, maldigestie i uneori diaree.
Virulena bacteriilor depinde de antigenele V i W, care determin
dependena de calciu, cnd sunt cultivate la 37C.
Tulpinile patogene sunt rezistente la complementul seric, ptrund n
celulele epiteliale umane (celulele He La), sunt letale pentru oarecii de
laborator i prezint citotoxicitate.
Factorii de virulen sunt codificai de plasmida de 70 Kdal. Acetia
sunt reprezentai de o protein-kinaz i de o protein din membrana extern
(YOP = yersinia outer membrane protein), care inhib fagocitoza.
Bacteria ptrunde n celulele eucariote folosind o protein de suprafa
(invaziv), codificat de o gen cromozomal.
Multe tulpini produc o toxin termostabil similar cu cea generat de
Escherichia coli. Aceasta prezint importan (cnd este eliberat la 22C)
n producerea diareei.
Germenul mai produce i o endotoxin, LPS, cu proprieti biologice
similare ce cele provenite de la alte bacterii Gram negative.
Infecia natural. mbrac forme anatomoclinice variate, care
prezint urmtoarele trsturi comune:
55
calea digestiv de contaminare;
55
caracterul sezonier;
55
incidena mare n anotimpurile reci i umede;
55
afectarea constant a ganglionilor mezenterici;
55
prezena unor noduli pseudotuberculoi asemntori cu cei
din tuberculoz, cu centrul necrotic cazeos, cu sau fr tendin de
ncapsulare;
55
evoluia latent a infeciei evideniabil numai prin examen
serologic.
Infecia natural poart denumirea de yersinioz (pseudotuberculoz
sau rodenioz), fiind mai frecvent la roztoare, dar afecteaz i multe specii
de animale i omul. Se caracterizeaz prin slbire progresiv, adenopatie i
formare de noduli cazeoi n diverse organe i pe seroase.
La iepure i cobai, yersinioza se manifest prin apariia de leziuni
nodulare n ganglionii limfatici, ficat, splin, rinichi, plmni, cu tendin
de transformare n abcese.
130

Infecia are un caracter contagios i o evoluie enzootic. obolanul i


oarecele reprezint un important rezervor natural, fiind purttori.
Mai sunt receptive: pisica, vulpea argintie, maimua, caprinele,
bovinele, iar ovinele se infecteaz sporadic. Omul se contamineaz rar, cu
tendin de diseminare septicemic, care este urmat de cele mai multe ori
de sechele renale.
Infecia experimental. Animalele de laborator sensibile sunt cobaiul
i iepurele, indiferent de calea de inoculare, tabloul anatomoclinic fiind
foarte asemntor cu cel din infecia natural.
3.3.2. Yersinia enterocolitica
Yer. enterocolitica a fost izolat pentru prima dat de Mc Iver i Pike, n
1943, iar n 1964 Frederiksen a propus actuala denumire a acestei bacterii.
n cadrul speciei au fost recunoscute dou subspecii, enterocolitica i
palearctica i cinci chimiotipuri (biotipuri), care cuprind aproximativ 27 de
serotipuri. Unele chimiotipuri produc indol i dau testul VP pozitiv.
Yer. enterocolitica posed factori de virulen i toxicitate ca
enterotoxinele termostabile (ST), asemntoare cu cele de la Escherichia
coli i factori de adeziune.
Yer. enterocolitica nu produce un siderofor pentru transportul fierului,
necesar n cretere i multiplicare, dezvoltndu-se mai bine n prezena altor
bacterii, care posed aceast capacitate.
Endotoxinele sunt responsabile, ca i n cazul colibacililor de
producerea exorbiei i, n ultim instan, a diareei.
Acestea sunt elaborate att in vitro ct i n alimentele pstrate
la temperatura mediului ambiant sau la frigider, conducnd la apariia
toxiinfeciilor alimentare.
Pe baza antigenelor somatice i flagelare au fost identificate 50 de
serotipuri, dintre care unele (0:9) posed antigene comune cu brucelele
i reacioneaz ncruciat cu Brucella spp. la RAL i RFC (reacii fals
pozitive).
Germenul este foarte rezistent n alimentele de origine animal, la
temperatura de refrigerare i la pH acid. Este sensibil la aciunea substanelor
dezinfectante n concentraii uzuale, la antibiotice i chimioterapice cu
spectru larg, printre care: gentamicina, cloramfenicolul, clotrimazolul,
acidul nalidixic.
Infeciile cu Yer. enterocolitica se ntlnesc la bovine, ovine, cabaline,
caprine, porcine, cmile, cini. Dintre animalele domestice afecteaz, mai
ales, tineretul ovin sub un an, porcii, cini, pisicile.
131

La om infecia cu Yer. enterocolitica se produce cel mai adesea


cu tipurile 0:3, 0:5, 0:8, 0:9, de origine porcin, care se manifest prin
enterocolite, mai rar prin septicemie.
Ca rezultat al numrului mare de specii care constituie rezervorul
natural de Yer. enterocolitica, n natur i a incidenei ridicate a purttorilor,
sursele de infecie secundare contaminate cu fecale, cum sunt punile, apele
de suprafa, furajele, apa de but, alimentele, ocup veriga intermediar
n circuitul epidemiologic al yersiniilor n natur i animalul receptiv sau
omul.

3.4. Specii zoonotice din genul Yersinia


3.4.1. Yersinia enterocolitica cu serotipurile 03, 05, 27, 08, 09
i Yersinia pseudotuberculosis
Sunt cei doi ageni zoonotici ai yersiniozei umane.
Prin studiile de hibridare DNA s-a demonstrat c ntre Yer.
pseudotuberculosis i Yer. pestis exist o strns nrudire, astfel nct, bacilul
pestei a fost redenumit Y. pseudotuberculosis subsp. pestis.
n ceea ce privete ns epidemiologia i rezervoarele de infecie cele
dou infecii sunt diferite la om.
Infecia uman cu Yer. enterocolitica a fost descris pentru prima dat
n 1939 de ctre Schleifstein i Coleman.
n 1963, Daniels o denumete Pasteurella X, iar n 1964 Frederiksen
o adaug genului Yersinia.
n 1975, s-au raportat aproximativ 6000 de cazuri n toat lumea. Cele
mai multe au fost descrise n Scandinavia, Europa, Canada i SUA.
Gazdele principale de Yer. enterocolitica sunt reprezentate de ctre
porci, roztoare, iepuri, oi, capre, bovine, cai, cini i pisici, bacteria gsinduse n orofaringele i lumenul tractului gastrointestinal al acestor animale. n
cazul lui Yer. pseudotuberculosis gazdele sunt reprezentate de roztoare,
cprioare, animale domestice, psri. n general animalele infectate sunt
purttoare asimptomatice, nepre-zentnd manifestri clinice.
Oamenii reprezint gazde ntmpltoare nefiind implicai nici n
meninerea microorganismului n natur i nici n transmiterea lui la ali
oameni.
Manifestrile clinice includ febra, diareea, durerile abdominale, care
mimeaz apendicita i artrita cronic. Apar de asemenea leziuni tipice de
enterit i limfadenit mezenteric.
Mai receptivi la infecie sunt copii dect adulii. Transmiterea se
132

realizeaz prin ingestia de alimente sau ap i mai rar prin contact direct cu
animalele infectate sau pacienii umani.
Transmiterea infeciei n rile nord europene de la animale la om, se
realizeaz probabil prin cinii de companie i prin consumul de carne de
porc insuficient pregtit.
Germenul se poate gsi n lacuri, izvoare, ap potabil, ns rareori,
s-au produs infecii pe aceast cale.
Supravieuiete la frigider, ceea ce arat c produsele refrigerate pot
fi contaminate.
Epidemiile de boal n SUA prin consum de alimente s-au semnalat
prin ciocolat contaminat, lapte pasteurizat, intestine crude de porc.
Infecia cu Yer. pseudotuberculosis, este extrem de rar, fiind
semnalat mai ales n Europa, transmiterea realizndu-se prin ingestie, dup
contactul cu un animal infectat sau prin contaminare intrafamilial prin ap
i alimente.
Majoritatea mbolnvirilor depind de: vrst (copiii ntre 5-15 ani);
sex (masculin); anotimp (iarna).
Transmiterea bolii de la un animal la altul se realizeaz pe cale fecaloral, prin ingestia furajului sau a apei contaminate.
Yer. enterocolitica este sensibil in vitro la aminoglicozide,
cloramfenicol, tetracicline, trimetoprim, sulfametoxazol, piperaciclin i
cefalosporine de generaia a III-a.
Yer. pseudotuberculosis prezint sensibilitate la urmtoarele antibiotice:
ampicilin, tetraciclin, cloramfenicol, cefalosporine i aminoglicozide.
Combaterea trebuie concentrat asupra rezervoarelor animale din
toate zonele.
Pregtirea complet a crnii i pasteurizarea laptelui ar trebui s fie
principalele mijloace de protecie.
Christiansen (1987) a propus evitarea refrigerrii crnii pentru perioade
mai mari de timp datorit capacitii bacteriei de a se nmuli la 4C.
Pentru a mpiedica transmiterea bolii prin transfuziile de snge este
necesar testarea donatorilor pentru episoadele recente de diaree sau febr.
3.4.2. Yersinia pestis
Pesta a produs dezastre nc din Evul Mediu, cnd a ucis un sfert din
populaia Europei.
n prima jumtate a secolului trecut, India a fost grav afectat de o
epidemie de pest n care au murit mai mult de 10 milioane de oameni.
ntre anii 1960 i 1970 n Vietnam, pesta a fcut peste 10.000 de
133

victime pe an.
O dat cu descoperirea streptomicinei a sczut drastic mortalitatea la
om. Mai mult de 10 milioane de oameni au fost vaccinai n timpul rzboiului
din Vietnam cu tulpina atenuat EV76.
Cele mai importante rezervoare ale acestui bacil sunt reprezentate de
obolanii urbani i domestici.
n SUA, n focarele silvatice, rezervoarele sunt reprezentate de ctre
veveria de stnc i cinele de preerie. Mai rar, iepurii, pisicile i alte
carnivore.
Yer. pestis rezist n interiorul fagocitelor mononucleare multiplicndu-se intracelular, prin producerea antigenelor de membran.
Cel mai eficient vector este puricele obolanului asiatic.
Transmiterea ntre animale se face prin muctura puricelui sau prin
ingerarea de esuturi animale moarte.
Boala, la animale se poate prezenta de la forma bacteriemiei subclinice
pn la afeciuni cu limfadenopatii i abcese n multiple organe sau moarte
subit prin septicemie.
Cea mai comun manifestare, la om este pesta bubonic. Boala se
manifest prin febr, frisoane, cefalee, iar n cteva ore apar buboanele
(adenoflegmoane), n special n zona inghinal, axilar i cervical.
O caracteristic special a pestei o reprezint capacitatea bolii de a
nvinge rezistena organismului prin proliferarea intens a bacteriilor n
fluxul sanguin.
Una din complicaiile de temut ale pestei la om este reprezentat de
pneumonia secundar.
Diagnosticul bacteriologic const n efectuarea de culturi din biopsii
ganglionare. Picturile din aspiratul biopsic trebuie puse pe lame de
microscop i uscate la aer i apoi colorate Gram sau Wayson.
n coloraia Wayson, aspiratul este aplicat pe o lam, fixat 2 minute n
metanol concentrat i colorat 10-20 secunde n amestecul colorant, splat cu
ap i uscat (Thomas Butler).
Yersiniile apar sub forma unor bacili azurii cu o extremitate albastru
nchis, iar mediul apare colorat n roz.
Pesta netratat prezint o rat a mortalitii de 50%. Streptomicina
reduce mortalitatea la mai puin de 5%. Se administreaz intramuscular n
doze de 30 de mg/kg/zi, timp de 10 zile.
Majoritatea infeciilor apar n mai-octombrie, cnd oamenii ies n
natur i vin n contact cu roztoarele.
ntre 1980-1989 s-au raportat de OMS, 8554 de cazuri de pest n
17 ri. rile cu mai mult de 100 de cazuri sunt: Tanzania, Vietnam, Zair,
134

Brazilia, Madagascar, Peru, Uganda, Burma, Bolivia, SUA, Botswana


(Thomas Butler, 2005).
Omul nu are nici un rol n meninerea infeciei n natur fiind gazd
accidental. Infecia se transmite prin muctura puricilor infectai. Transmiterea infeciei de la om la om se realizeaz extrem de rar (n epidemiile
de pest pneumonic).
Dei purecii, sunt parazii specifici ai fiecrei specii schimbndu-i
rar gazdele, au fost identificai la cinii i pisicile de companie implicai n
transmiterea pestei la om n SUA.
Pacienii suspeci de pest trebuiesc raportai la Departamentul
Sntii Publice i la OMS.
n laboratoarele n care se lucreaz cu acest germen, este absolut
necesar existena unor tehnici bacteriologice standard, care s evite
contactul culturilor cu pielea sau formarea de aerosoli.
La persoanele care cltoresc n zonele epidemice, la cele care vin
n contact cu roztoarele i la tehnicienii care manipuleaz Yer. pestis se
folosete Plaque Vaccine USP (vaccin cu bacterii inactivate cu aldehid
formic) (Thomas Butler).
Datorit potenialului exploziv al acestei infecii, o dat identificat o
epidemie, sunt necesare msuri de urgen din partea autoritilor.
Se va folosi tratamentul cu pulberi insecticide, deoarece puricii
infectai reprezint cea mai mare ameninare pentru oameni.
Cea de-a doua msur prioritar const n omorrea obolanilor (dup
administrarea tratamentului cu insecticide, deoarece puricii infectai pot
trece la oameni, cnd animalele sunt otrvite).

135

Harta focarelor de unde Yersinia pestis F1991016, E1979001, B42003004,


K1973002 a fost izolat. Dup Zhou et al., 2004
Acest bacil Gram negativ,
produce la oameni, psri,
animale domestice i
animale de companie
infecii gastrointestinale
caracterizate prin
scaune apoase uneori
sangvinolente, febr i
dureri abdominale. Uneori
poate mima durerea
provocat de apendicita.
Yersinia enterocolitica.
Microscopie electronic
de transmisie. Coloraie
negativ pentru
mbuntirea contrastului.
Wadsworth Center, New
York State Department of
Health
136

Yer. enterocolitica. Mediul XLD (Xylose Lysine Sodium Deoxycholate)

Yersinia enterocolitica. Coloraia Gram.


137

Bibliografie selectiv
1. Aleksic, S., and J. Bockemuhl. 1984. Proposed revision of the Wauters et al.
antigenic scheme for serotyping of Yersinia enterocolitica. J. Clin. Microbiol. 20:99-102.
2. Aleksic, S., A. Steigerwalt, J. Bockemuhl, G. Huntley-Carter, and D.J. Brenner.
1987. Yersinia rohdei sp. nov. isolated from human and dog feces and surface water. Int. J.
Syst. Bacteriol. 37:327-332.
3. Archer, J R, R F Schell, D R Pennell and P D Wick. 1987. Identification of
Yersinia spp. with the API 20E system. J Clin Microbiol. 25(12): 2398-2399.
4. Aulisio, C.C.G., I.J. Mehlman, and A.C. Sanders. 1980. Alkali method for rapid
recovery of Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis from foods. Appl.
Environ. Microbiol. 39:135-140.
5. Aulisio, C.C.G., J.M. Lanier, and M.A. Chappel. 1982. Yersinia enterocolitica
O:13 associated with outbreaks in three southern states. J. Food Prot. 45:1263.
6. Aulisio, C.C.G., J.T. Stanfield, S.D. Weagant, and W.E. Hill. 1983. Yersiniosis
associated with tofu consumption: serological, biochemical and pathogenicity studies of
Yersinia enterocolitica isolates. J. Food Prot. 46:226-230.
7. Aulisio, C.C.G., J.T. Stanfield, W.E. Hill, and J.A. Morris. 1983. Pathogenicity
of Yersinia enterocolitica demonstrated in the suckling mouse. J. Food Prot. 46:856-860.
8. Aulisio, C.C.G., W.E. Hill, J.T. Stanfield, and R.L. Sellers, Jr. 1983. Evaluation
of virulence factor testing and characteristics of pathogenicity in Yersinia enterocolitica.
Infect. Immun. 40:330-335.
9. Bercovier, H., D.J. Brenner, J. Ursing, A.G. Steigerwalt, G.R. Fanning, J.M.
Alonso, G.P. Carter, and H.H. Mollaret. 1980. Characterization of Yersinia enterocolitica
sensu stricto. Curr. Microbiol. 4:201-206.
10. Bercovier, H., A.G. Steigerwalt, A. Guiyoule, G. Huntley-Carter, and D.J.
Brenner. 1984. Yersinia aldovae (Formerly Yersinia enterocolitica-like group X2): a new
species of enterobacteriaceae isolated from aquatic ecosystems. Int. J. Syst. Bacteriol.
34:166-172.
11. Bhaduri, S., C. Turner-Jones, and R.V. Lachica. 1991. Convenient agarose
medium for simultaneous determination of the low-calcium response and congo red binding
by virulent strains of Yersinia enterocolitica. J. Clin. Microbiol. 29:2341-2344.
12. Boyce, J.M., E.J. Evans, Jr., D.G. Evans, and H.L. DuPont. 1979. Production
of heat-stable methanol-soluble enterotoxin by Yersinia enterocolitica. Infect. Immun.
25:532-537.
13. Buchrieser, C., S. D. Weagant and C. W. Kaspar, 1994. Molecular characterization
of Yersinia enterocolitica by pulsed-field gel electrophoresis and hybridization of DNA
fragments to ail andpYV probes. Appl. and Environ. Microbiol. 60:4371-4379.
14. Carter, P.B., and F.M. Collins. 1974. Experimental Yersinia enterocolitica
138

infection in mice: kinetics of growth. Infect. Immun. 9:851-857.


15. Doyle, M.P., M.B. Hugdahl, and S.L. Taylor. 1981. Isolation of virulent Yersinia
enterocolitica from porcine tongues. Appl. Environ. Microbiol. 42:661-666.
16. Feng, P. 1992. Identification of invasive Yersinia species using oligonucleotide
probes. Mol. Cell. Probes 6:291-297.
17. Fukushima, H., K. Saito, M. Tsubokura, and K. Otsuki. 1984. Yersinia spp. in
surface water in Matsue, Japan. Zentralbl. Bakteriol. Abt. 1 Orig. B. Hyg. Kranhenhaushyg.
Betreibshyg. Praev. Med. 179:235-247.
18. Fukushima, H., M. Gomyoda, S. Ishikua, T. Nishio, S. Moriki, J. Endo, S.
Kaneko, and M. Tsubokura. 1989. Cat-contaminated environmental substances lead to
Yersinia pseudotuberculosis infections in children. J. Clin. Microbiol. 27:2706-2709.
19. Gemski, P., J.R. Lazere, and T. Casey. 1980. Plasmid associated with
pathogenicity and calcium dependency of Yersinia enterocolitica. Infect. Immun. 27:682685.
20. Gemski, P., J.R. Lazere, T. Casey, and J.A. Wohlhieter. 1980. Presence of
a virulence-associated plasmid in Yersinia pseudotuberculosis. Infect. Immun. 28:10441047.
21. Heesemann, J., B. Algermissen, and R. Laufs. 1984. Genetically manipulated
virulence of Yersinia enterocolitica. Infect. Immun. 46:105-110.
22. Hill, W.E., W.L. Payne, and C.C.G. Aulisio. 1983. Detection and enumeration
of virulent Yersinia enterocolitica in food by DNA colony hybridization. Appl. Environ.
Microbiol. 46:636-641.
23. Isberg, R., A. Swain, and S. Falkow. 1988. Analysis of expression and
thermoregulation of the Yersinia pseudotuberculosis inv gene with hybrid protein. Infect.
Immun. 56:2133-2138.
24. Isberg, R., D.L. Voorhis, and S. Falkow. 1987. Identification of invasin: a
protein that allows enteric bacteria to penetrate cultured mammalian cells. Cell 50:769778.
25. Isberg, R., and S. Falkow. 1985. A single genetic locus encoded by Yersinia
pseudotuberculosis permits invasion of cultured animal cells by Escherichia coli K-12.
Nature 317:262-264.
26. Isberg, R., and J.M. Leong. 1988. Cultured mammalian cells attach to the
invasin protein of Yersinia pseudotuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6682-6686.
27. Isberg, R. 1989. Determinants for thermoinducible cell binding and plasmidencoded cellular penetration detected in the absence of Yersinia pseudotuberculosis invasin
protein. Infect. Immun. 57:1998-2005.
28. Kandolo, K., and G. Wauters. 1985. Pyrazinamidase activity in Yersinia
enterocolitica and related organisms. J. Clin. Microbiol. 21:980-982.
29. Kay, B.A., K. Wachsmuth, and P. Gemski. 1982. New virulence-associated
plasmid in Yersinia enterocolitica. J. Clin. Microbiol. 15:1161-1163.
139

30. Laird, W.J., and D.C. Cavanaugh. 1980. Correlation of autoagglutination and
virulence of Yersinia. J. Clin. Microbiol. 11:430-432.
31. Lee, W.H., P.P. McGrath, P.H. Carter, and E.L. Eide. 1977. The ability of some
Yersinia enterocolitica strains to invade HeLa cells. Can. J. Microbiol. 23:1714-1722.
32. Linde,H.-J. H. Neubauer, H. Meyer, S. Aleksic, and N. Lehn. 1999. Identification
of Yersinia Species by the Vitek GNI Card. J. Clin. Microbiol.. 37:211-214.
33. Miliotis, M.D. 1991. Acridine orange stain for determining intracellular
enteropathogens in HeLa cells. J. Clin. Microbiol. 29:830-832.
34. Miliotis, M.D., and P. Feng. 1992. In vitro staining technique for determining
invasiveness in foodborne pathogens. FDA Laboratory Information Bulletin, March,
9(3):3754.
35. Miliotis, M.D., J.E. Galen, J.B. Kaper, and J.G. Morris. 1989. Development and
testing of a synthetic oligonucleotide probe for the detection of pathogenic Yersinia strains.
J. Clin. Microbiol. 27:1667-1670.
36. Miller, V.A., and S. Falkow. 1988. Evidence of two genetic loci in Yersinia
enterocolitica that can promote invasion of epithelial cells. Infect. Immun. 56:1242-1248.
37. Miller, V., J.J. Farmer III, W.E. Hill, and S. Falkow. 1989. The ail locus is found
uniquely in Yersinia enterocolitica serotypes commonly associated with disease. Infect.
Immun. 57:121-131.
38. Minnich, S. A., M. J. Smith, S. D. Weagant and P. Feng. 2001. Yersinia, Chapter
19, pp. 471-514. In Foodborne Disease Handbook, 2nd Ed., Vol. 1. Y. H. Hui, M. D. Pierson,
J. R. Gorham (Eds.) Marcel Dekker, Inc. New York.
39. Pai, C.H., and L. DeStephano. 1982. Serum resistance associated with virulence
in Yersinia enterocolitica. Infect. Immun. 35:605-611.
40. Pierson, D.E., and S. Falkow. 1990. Nonpathogenic isolates of Yersinia
enterocolitica do not contain functional inv-homologous sequences. Infect. Immun.
58:1059-1064.
41. Portnoy, D.A., S.L. Moseley, and S. Falkow. 1981. Characterization of plasmids
and plasmid-associated determinants of Yersinia enterocoliticapathogenesis. Infect. Immun.
31:775-782.
42. Portnoy, D.A., and R.J. Martinez. 1985. Role of plasmids in the pathogenicity
of Yersinia species. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 118:2943. Prpic, J.K., R.M. Robins-Brown, and R.B. Davey. 1985. In vitro assessment of
virulence in Yersinia enterocolitica and related species. J. Clin. Microbiol. 22:105-110.
44. Ramamurthy T, Yoshino K, Huang X, Balakrish Nair G, CRNAiel E, Maruyama
T, Fukushima H, Takeda T. 1997. The novel heat-stable enterotoxin subtype gene (ystB)
of Yersinia enterocolitica: nucleotide sequence and distribution of the yst genes. Microbial
Pathogenesis. 23: 189-200.
45. Robins-Brown, R., and K. Prpic. 1985. Effects of iron and desferrioxamine on
infections with Yersinia enterocolitica. Infect. Immun. 47:774-779.
140

46. Robins-Brown, R., M.D. Miliotis, S. Cianciosi, V.L. Miller, S. Falkow, and J.G.
Morris. 1989. Evaluation of DNA colony hybridization and other techniques for detection
of virulence in Yersinia species. J. Clin. Microbiol. 27:644-650.
47. Schiemann, D.A. 1982. Development of a two-step enrichment procedure for
recovery of Yersinia enterocolitica from food. Appl. Environ. Microbiol. 43:14-27.
48. Schiemann, D.A. 1989. Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis,
pp. 601-672. In: Foodborne Bacterial Pathogens. M. Doyle (ed). Marcel Dekker, New York
and Basel
49. Sereny, B. 1955. Experimental Shigella keratoconjunctivitis. Acta Microbiol.
Acad. Sci. Hung. 2:293-296.
Simona Ivana, 2002 Bacteriologie veterinar special (Ed. Ceres, Bucureti; 460
pagini), ISBN: 973-40-0568-5
50. Simona Ivana, 2005 Bacteriologie general (Ed. tiinelor medicale, Bucureti;
250 pagini), ISBN: 973-86485-7-2
51. Simona Ivana, 2006 Tratat de bacteriologie medical-veterinar i introducere
n micologie (Ed. tiinelor medicale, Bucureti;768 pagini), ISBN (10) 973-86571-5-6;
ISBN (13) 978-973-86571-5-1
52. Simona Ivana, 2007 Manual de microbiologia alimentelor (Ed. tiinelor
medicale, Bucureti; 160 pagini), ISBN: 978-973-86571-3-7
53. Simona Ivana, 2007 Microbiologie medical veterinar, Vol. I (Ed. tiinelor
medicale, Bucureti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-01-6
54. Simona Ivana, 2007 Microbiologie medical veterinar, Vol. II (Ed. tiinelor
medicale, Bucureti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-02-3
55. Simona Ivana, 2008, Microbiologia alimentelor, Ed. Orizonturi, ISBN: 978973-736-090-8
56. Simona Ivana, 2008, Practical guide of microbiogical diagnosis, Ed. Orizonturi,
ISBN: 978-973-736-089-2
57. Tsubokura, M., K. Otsuki, K. Sato, M. Tanaka, T. Hongo, H. Fukushima,
T. Maruyama, and M. Inoue. 1989. Special features of distribution of Yersinia
pseudotuberculosis in Japan. J. Clin. Microbiol. 27:790-791.
58. Wauters, G. 1981. Antigens of Yersinia enterocolitica, pp. 41-53. In: Yersinia
enterocolitica. E.J. Bottone (ed). CRC Press, Boca Raton, FL.
59. Wauters, G., M. Janssens, A.G. Steigerwalt, and D.J. Brenner. 1988. Yersinia
molleretii sp. nov. and Yersinia bercovieri sp. nov., formerly called Yersinia enterocolitica
biogroups 3A and 3B. Int. J. Syst. Bacteriol. 38:424-429.
60. Weagant, S.D. 1983. Medium for the presumptive identification of Yersinia
enterocolitica. FDA Laboratory. Appl Environ Microbiol. 45(2):472-3.
61. Weagant, S. D. and P. Feng. 2001. Yersinia, Chapter 41, pp. 421-428. In
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th Ed., F. Pouch
Downes and Keith Ito (Eds.) American Public Health Assoc. Washington, D. C.
141

62. Weissfeld, A.S., and A.C. Sonnenwirth. 1982. Rapid isolation of Yersinia spp.
from feces. J. Clin. Microbiol. 15:508-510.
63. Zink, D.L., J.C. Feeley, J.G. Wells, C. Vanderzant, J.C. Vickery, W.D. Roof, and
G.A. ODonovan. 1980. Plasmid-mediated tissue invasiveness in Yersinia enterocolitica.
Nature 283:224-226.

142

CAPITOLUL 4
Implicaiile bacteriilor din genul Vibrio n
producerea toxiinfeciilor alimentare
4.1. Caractere generale
Genul Vibrio face parte din familia Vibrionaceae (cu 8 genuri).
Cuprinde 76 de specii. Genul reunete bacili Gram negativi cu aspect
caracteristic de virgul (rar n S), necapsulogeni, nesporogeni i extrem
de mobili. n mediile lichide prezint flageli polari (mono sau lofotrichi), iar
pe mediile solide formeaz flageli laterali.
V. parahaemolyticus reprezint principala cauz a gastroenteritelor
epidemice, mai ales n zonele unde se consum pete crud (Japonia). Exist
dovezi c nc alte 4 specii halofile de Vibrio sunt patogene pentru om:
V. alginolyticus, V. fluvialis, V. metschnikovii i V. vulnificus. Toate aceste
specii halofile se difereniaz printr-unul sau mai multe teste biochimice.
Tabelul 4.1.
Teste biochimice de difereniere ntre V. parahaemolyticus i alte specii de Vibrio
Specia

V. parahaemolyticus V. alginolyticus V. vulnificus

Flageli laterali pe mediul solid

Bacili

Reacia Voges-Proskauer

Creterea n mediu cu 10% NaCl

Dezvoltarea n NaCl 6%

Fenomenul de roire

Producia de acetoin/ diacetil

Sucroz

Celobioz

Utilizarea putresceinei

Agar TCBS

Legend: D = drept; C = curb; v = verde; g = galben; % = 11-90% din tulpinile pozitive


143

Alimentele frecvent implicate n epidemiile cu V. parahaemolyticus


sunt reprezentate de: pete, stridii, crevei, crabi, homari, scoici. Toxiinfeciile
alimentare sunt probabil provocate de refrigerarea necorespunztoare, de
fierberea insuficient, de contaminarea ncruciat sau de recontaminare.
Tulpinile izolate de la bolnavi sunt de regul hemolitice, iar activitatea
hemolitic a acestei bacterii poart denumirea de fenomenul Kanagawa.
Tulpinile Kanagawa pozitive produc o hemolizin direct termostabil,
iar tulpinile Kanagawa negative produc o hemolizin termolabil. Exist
tulpini care produc ambele hemolizine. Hemolizina termolabil nrudit
reprezint un factor important de virulen pentru unele tulpini de V.
parahaemolyticus. Acesta este un organism halofil ce poate fi detectat
n apele oceanice i costiere la temperaturi n jur de 19-20C. Un studiu
efectuat n golful Chasapeake (pe coasta de est a SUA) arat c bacteriile
supravieuiesc n sedimentul marin pe timpul iernii, iar apoi sunt eliberate n
coloana de ap prin zooplancton din aprilie pn la sfritul lui iunie. Aceste
microorganisme nu se gsesc de obicei n adncimile oceanelor deoarece nu
pot tolera presiunea hidrostatic. V. parahaemolyticus se dezvolt optim la
un pH de 7,2-7,3 i 3% NaCl sau la un pH 7,6 i 7% NaCl.
Genul Vibrio reunete bacili Gram negativi, frecvent ncurbai sau n
virgul, nesporogeni, mobili n medii lichide, prin flageli polari, mono sau
lofotrihi, iar pe medii solide prin flageli laterali cu lungime de und mai
mic dect flagelul polar, catalaz i oxidaz pozitivi. Excepie face numai
V. metschnikovii, care este oxidaz negativ.
Sunt germeni nepretenioi nutritiv, facultativ anaerobi i fermenteaz
zaharurile fr producere de gaz. Cele mai multe specii sunt sensibile la
agentul vibriostatic O/129 (2,4-diamino-6,7-di-izopropilpteridin) n
concentraii de 10 i/sau 150 g.
Produc variate enzime extracelulare, care includ toxine citotoxice i
citolitice, neuraminidaz, chitinaz, proteaze, lipaze etc.
Sunt organisme acvatice adaptate la variate saliniti (clorura de
sodiu stimuleaz creterea unor specii i este obligatorie pentru altele).
Abund n apele marine i estuariene n simbioz cu vertebratele i
nevertebratele acestor ecosisteme.

4.2. Taxonomie
Familia Vibrionaceae, cuprinde genurile: Vibrio, Allomonas,
Catenococcus, Enterovibrio, Grimontia, Listonella, Photobacterium,
Salinivibrio
n genul Vibrio sunt ncadrate mai multe specii, patogene i nepatogene.
144

Hibridrile RNA-DNA indic o nrudire, de aproape 60%, cu genurile


Aeromonas i Plesiomonas, ceea ce justific separarea acestor taxoni. Sunt
cunoscute pn n prezent aproximativ 49 specii de Vibrio, patogene att
pentru om (aproximativ 12) ct i pentru animale (24).
Dintre speciile nou ncadrate i descrise de ctre Bergeys Manual of
Determinative Bacteriology, 9th ed., 2000, amintim:
55 Vibrio albensis, a fost descris de ctre Lehmann i Neumann n
1896 i inclus taxonomic de Skerman, n 1980.
55 Vibrio alginolyticus, subspecia iophagus a fost descris de ctre
Welton i Woods, n 1973 i ncadrat taxonomic de ctre Moore i Cato
(1985);
55 V. anguillarum, descris de ctre Bergeman, n 1909 i ncadrat
taxonomic de ctre Skerman n 1980, rencadrat de Mac Donell i Colwell,
n 1986, sub denumirea de Listonella anguillarum.
55 V. fischerii, a fost studiat i ncadrat taxonomic de Lehmann i
Neumann sub aceast denumire, nc din 1980, ns a fost recunoscut i
ncadrat ca specie Vibrio n 1994.
55 V. campbelli a fost denumit i studiat de Baumann n 1981;
55 V. diabolicus a fost descoperit la un anelid polichet, descoperit
n curenii marini hidrotermali de adncime, fiind descris i ncadrat n
1997.
55 V. ichthyoenteri a fost descris n 1996 de Ishimaru i col.;
55 V. gazogenes a fost denumit i ncadrat taxonomic de ctre
Harwood i col., n 1980, fiind recunoscut ca specie n 1994.
Cinetica asocierii DNA-RNA indic o anumit heterogenitate
filogenetic a genului n care se pot contura urmtoarele grupuri de
vibrioni:
55 vibrioni O:1 V. cholerae;
55 vibrioni non O:1 V. metschnikovii
55 vibrioni halofili V. furnissi.

4.3. Istoric
Holera a fost descris pe toate continentele n decursul a ase pandemii.
Prima a aprut n 1817, n India, Pakistan, Birmania, de unde a difuzat n
China i Europa n decursul a patru ani. Cea de-a doua s-a declanat n
Europa (1829) i a difuzat n America de Nord.
n Romnia a fost semnalat n 1913, n cursul celei de-a asea
pandemii. nc din 1855, Snow a artat c holera este transmis la om de un
microb din ap, fecale sau alimente contaminate.
145

n anul 1833, Robert Koch, izoleaz agentul cauzal i demonstreaz


reproducerea bolii la cobaii inoculai intraduodenal i intragastric.
n trecut, holera gastric era denumit i holer asiatic, datorit
izbucnirii mai frecvent a pandemiilor n zona Indiei i Asiei.
ncadrat n categoria vibrionilor non-holerici, Vibrio parahaemolyticus
determin gastroenterite la consumatorii de produse acvatice contaminate.
Fujino i col. au izolat pentru prima dat bacteria n anul 1951 din
scaunele bolnavilor care au consumat o specialitate de pescrie denumit
shirasu, de unde au dat i numele toxiinfeciei alimentare.
Takikawa i Fujisawa izoleaz bacteria din fecalele unor bolnavi cu
gastroenterit, ncadrnd-o n genul Pseudomonas.
Miyamoto i col. (1961) decid ncadrarea acestei bacterii n familia
Enterobacteriaceae.
Ulterior, datorit diferenelor metabolice clare fa de aceast familie,
a fost ncadrat n genul Vibrio.
Sakazaki i col. mpart tulpinile izolate n trei grupe, i anume:
grupa 1, ce ncadreaz tulpinile ce se dezvolt n ap peptonat,
cu adaos de 3-7% clorur de sodiu, nu produc acetil-metil-carbinol, nu
fermenteaz zaharoza;
grupa 2, cuprinde tulpinile care se dezvolt n ap peptonat, cu
adaos de 3,7-10% NaCl, fermenteaz zaharoza, produc acetil-metil-carbinol,
se izoleaz, de obicei, din apele marine i din animalele acvatice, implicat,
mai rar n etiologia gastroenteritelor umane;
grupa 3, cuprinde tulpini care se dezvolt pe medii cu 3% NaCl, nu
fermenteaz zaharoza i nu produc acetil-metil-carbinol, care se izoleaz de
la animalele acvatice.
Brzoi i Lzrescu (1972) au izolat mai multe tulpini de vibrioni nonholerici din petele marin, n Romnia.

4.4. Morfologie
Genul Vibrio reunete bacili Gram negativi, cu diametrul de 0,5-2/0,30,4 microni, frecvent ncurbai ntr-un singur plan, cu aspect caracteristic de
cornioare sau de virgul, necapsulogeni, nesporogeni i extrem de mobili.
n mediile lichide, mobilitatea le este asigurat de flageli polari, mono
sau lofotrihi, iar pe mediile solide, prin flageli laterali, cu lungime de und
mai mic dect a flagelului polar.
La examenul ntre lam i lamel, pe fond ntunecat din culturi n
medii lichide, V. cholerae prezint o micare vie de rostogolire, caracteristic
organismelor monoflagelare, care se traduc plastic prin traversarea
146

cmpului microscopic ca bancurile de pete, ca sgeile sau cu micri


dezordonate, de unde i numele de Vibrio (vibraii).
n culturile tinere predomin formele ncurbate n virgul i ocazional
sub forma literei S. O dat cu mbtrnirea culturii, formele drepte devin
tot mai numeroase, iar diferenierea de ali bacili enterici devine tot mai
dificil.
Cultivai pe medii cu concentraii suboptimale de clorur de sodiu,
vibrionii apar polimorfi. Polimorfismul este accentuat, mai ales la speciile
halofile, n frotiurile din prelevate patologice de la formele fine, bacilare, cu
ncurbare minim, pn la forme cocobacilare.
Dup subcultivarea acestor specii, pe medii cu concentraie salin
favorabil, revin la morfologia normal.

4.5. Condiii de cultivare i caractere culturale


Sunt germeni aerobi (dezvoltndu-se foarte bine n prezena oxigenului
la suprafaa mediilor) i tolereaz pH-ul alcalin 8,6-9,6.
Nu sunt pretenioi din punct de vedere nutritiv, dezvoltndu-se pe
medii simple (ap peptonat, glucoz simpl) sau ap peptonat alcalin la
37C.
n bulion produc o turbiditate intens, iar uneori formeaz la suprafaa
mediului o pelicul. Dezvoltarea culturii bacteriene apare mai abundent la
suprafaa mediului, fiind mai intens n medii alcaline.
Pe agar simplu formeaz colonii cu diametrul de 2-5 mm, turtite
sau uor convexe, netede, umede, lucioase. Exist variante de colonii
transparente sau opace. Variantele rugoase formeaz colonii zbrcite, greu
emulsionabile.
Pe agar cu 5% snge de berbec, iepure sau cal, V. fluvialis, V.
metschnikovii, tulpinile non O:1 de V. cholerae produc beta hemoliz dup
24 de ore de incubare la 37 C.
V. alginoliticus V. parahaemolyticus sau V. vulnificus sunt nehemolitice
sau produc numai o nverzire a mediului, circumscris coloniilor, echivalent
alfa hemolizei.
Activitatea hemolitic a lui V. parahaemolyticus este cunoscut
sub denumirea de fenomenul Kanagawa. Acest fenomen reprezint beta
hemoliza pe care o produce V. parahaemolyticus n condiii speciale de
cultivare, i anume pe agarul Wagatsuma (agar cu D-manitol, cu 7% NaCl
i snge uman grupa O sau snge de iepure).
Tulpinile Kanagawa negative se izoleaz mai rar din cazuri de
toxiinfecii alimentare i nu reproduc boala prin administrri la voluntari.
147

Hemolizina Kanagawa a fost identificat ca o toxin letal cu efect


cardiotoxic. Pe medii fr concentraie optim de sare, majoritatea speciilor
halofile nu se pot dezvolta.
Unele tulpini de V. alginoliticus i V. parahaemolyticus prezint o
cretere invaziv. La V. parahaemolyticus acest tip de cretere este declanat
de condiiile feriprive i de limitarea rotaiei flagelare la replicarea n bulion
pe mediu agarizat (dezvoltarea flagelilor laterali).
Pe agarul Mac Conkey se dezvolt numai unele specii (V. cholerae),
care formeaz colonii lactoz-negative.
Izolarea vibrionilor (din materii fecale) impune utilizarea mediilor
selective. Selectivitatea se bazeaz pe capacitatea vibrionilor de a crete
la pH 8,6, care este defavorabil dezvoltrii multor specii bacteriene. De
asemenea, au capacitatea de a tolera concentraiile toxice ale unor compui
organici (bil, sruri biliare) sau anorganici (iodur de potasiu, telurit de
potasiu).
Cel mai indicat este s se foloseasc un mediu cu selectivitate medie,
cum ar fi mediul B.S.A. (bile salts agar) i cu selectivitate nalt, ca de
exemplu mediul T.C.B.S. (thiosulphate-citrate-bile-salts-sucroze).
Tabelul 4.2.
Aspectul culturii de 18-24 ore pe mediul T.C.B.S. a speciilor de Vibrio,
comparativ cu alte specii posibil asociate (dup Buiuc D., 1999)
Fermentarea
Diam.
Culoarea
Specia
zaharozei
Cretere
coloniei (mm)
coloniilor
(% tulpini)
V. cholerae

2-3

100

galben

bun

V. alginolyticus

2-5

99

galben

bun

V. fluvialis

2-3

100

galben

bun

V. furnissi

2-3

100

galben

bun

V. metschnikovii

2-4

100

galben

poate fi
slab

V. parahaemolyticus

2-5

verde

bun

Aeromonas hydrophila
Plesiomonas shighelloides

0-3
1

> 90
0

galben
verde

variabil
variabil

Proteus vulgaris

2-3

97

galben

bun

Alte enterobacteriacee

0,1

variabil

transparente

variabil

variabil

verde

variabil

Pseudomonas spp.

148

Se mai folosete, ca mediu de izolare, agarul cu 5% snge de berbec.


Izolarea germenului din plgi contaminate cu ap de mare, muctur
de rechin etc., se poate face pe un mediu selectiv.
4.6. Proprieti biochimice
Fermenteaz zaharurile fr producere de gaz (glucoz, galactoz,
sucroz, manoz). Produc oxidaz i catalaz.
Lichefiaz gelatina, hidrolizeaz cazeina, reduc nitraii n nitrii. Nu
produc ureaz i nici hidrogen sulfurat.
V. cholerae i V. parahaemolyticus produc lecitinaz i indol la 22C i
la 37C, fermenteaz manita, hidrolizeaz amidonul, decarboxileaz lizina
i ornitina, cresc la 5C.

Testul

Tabel 4.3.
Caractere biochimice difereniale ale speciilor din genul Vibrio
(dup Janda, 1998, McLaughlin, 1995)
V.
V. parahae- V. alginoV.
V.
V.
cholerae molyticus
lyticus fluvialis furnissi metschnikovii
100
100
100
100
100
0

Oxidaz
0/129 zon
de inhibiie la
discul cu 150 g
Crete n
bulion cu 0%
NaCl
1% NaCl
6% NaCl
8% NaCl
10% NaCl
12% NaCl
Indol
Decarboxilaze,
Moeller
Arginin
Lizin
Ornitin
ONPG
VogesProskauer

99

20

19

31

90

100

100
53
1
0
0
99

100
99
80
2
1
98

99
100
94
69
16
85

99
96
71
4
0
13

99
100
78
0
0
11

100
78
44
4
0
20

93

100

60

99
99
94

100
95
5

99
50
0

0
0
40

0
0
35

35
0
50

75

95

96

149

Acid din:
L-arabinoz
m-inozitol
Lactoz
Zaharoz
Ureaz

80

93

100

0
7
100
0

0
1
1
15

0
0
99
0

0
3
100
0

0
0
100
0

40
50
100
0

4.7. Ecologie
Vibrionii sunt microorganisme acvatice. Speciile halofile sunt limitate
la apele marine, estuariene, costiere i lagunare.
Speciile non-halofile se gsesc i n apele dulci: ruri, lacuri. Prezena
vibrionilor n apele dulci este tranzitorie.
n apele marine se gsesc sub mai multe forme:
forma liber triete n aceste ape atta timp ct apa le ofer
transporturi i concentraii de nutrieni optime pentru cretere;
forma epibiotic reprezint o asociaie intim a vibrionilor cu
matricea chitinoas a zooplanctonului, a scoicilor sau copepodelor. Vibrionii
epibioni rezist mai mult n mediul marin dect vibrionii liberi i traverseaz
mai uor bariera gastric acid;
forma dormant este reprezentat de microvibrioni, care
sunt celule necultivabile, prezena lor fiind demonstrat prin coloraii
imunofluorescente a probelor provenite din mediul marin.

4.8. Factorii de patogenitate


Vibrionii sunt rspunztori de producerea enzimelor extracelulare, care
sunt foarte variate i includ toxine citotoxice i citolitice, neuraminidaz,
chitinaz, proteaze, lipaze etc.

4.9. Specii mai importante de vibrioni


Vibrio cholerae
(Pacini, 1854), sinonim Vibrio comma.
V. cholerae a fost izolat i descris de ctre Roberth Koch n 1884,
ca fiind agentul holerei la om. Holera se caracterizeaz prin gastroenterit,
manifestat clinic prin diaree profuz (pn la 100 de scaune pe zi, cu
aspect caracteristic de ap de orez) i deshidratare rapid. Letalitatea este
150

n medie de 50%, prezentnd un interes major pentru sntatea public prin


morbiditate i mortalitate.
Este determinat de serogrupele O:1 i O:139. Principalul factor
de patogenitate al vibrionilor holerigeni este reprezentat de enterotoxina
termolabil de natur proteic, numit i factor de permeabilizare. Toxina se
leag ireversibil de celulele mucoasei intestinului subire, fiind responsabil
de fuga de ap i de ioni, din esuturi.
Neuraminidaza (sialidaza) reprezint factorul de fluidificare a
mucusului.
Lecitinaza eliberat de vibrionul holeric este nc insuficient studiat.
Sursele de infecie sunt determinate de apa i alimentele infectate, vectorul
viu fiind musca.
Holera are o evoluie epidemic sau pandemic, iar n prezent se
limiteaz la Extremul Orient i la Africa Occidental, cu o recrudescen
din patru n patru ani.
Vibrionul holeric se transmite, cel mai frecvent, prin consumul de ap
potabil contaminat i, mai rar, prin intermediul unor alimente (n principal
acvatice). Rezervorul de infecie principal l reprezint omul bolnav,
purttorii convalesceni i purttorii sntoi. n ultimii ani s-a evideniat
c exist purttori umani cronici, ce pot elimina prin fecale, timp de cteva
luni, cantiti enorme de vibrioni.
Rezervoarele naturale de vibrioni holerici sunt reprezentate de
crustacee, molute (crabi, midii, stridii) i unele specii de pete.
Vibrionii holerici sunt considerai ca specie endemic pentru apele
litorale, estuare, delte i chiar bli. Studiile fcute n apele de coast ale SUA
i Australiei au demonstrat existena unor rezervoare de Vibrio cholerae (att
tulpini O1 ct i non-O1) n crustacee i molutele cu cochilie. De aceea, n
aceste state, sursa principal de infecie o constituie consumul de stridii.
Vibrio parahaemolyticus
(Fujino i col., 1931)
Este o bacterie halofil, cu sediul n mediul marin (ap i alimente
derivate din fauna marin, mai ales pete oceanic) care determin la om
enterite acute grave, mai ales n zonele geografice unde se consum mult
pete de mare.
Toxiinfeciile alimentare sunt mai frecvente n sezonul cald, cnd
temperatura apei depete 15C.
Tulpinile izolate de la bolnavi sunt de regul hemolitice, iar activitatea
hemolitic a acestei bacterii poart denumirea de fenomenul Kanagawa.
151

Hemolizina Kanagawa a fost identificat ca o toxin letal cu efect


cardiotoxic.
n mod obinuit aceast specie produce hemoliz de tip beta pentru
sngele de om. Factorul care d reacia Kanagawa pozitiv const ntr-o
hemolizin termolabil i o lizin termostabil.
n 1971, investigaiile fcute de Sakazaki i colaboratorii, pe 2720 de
tulpini de V. parahaemolyticus izolate de la bolnavii cu diaree, au demonstrat
c 98% dintre acestea erau Kanagawa pozitive, n timp ce din 650 de
tulpini de V. parahaemolyticus izolate de la vieuitoare acvatice doar 1%
erau Kanagawa pozitive. Aceast corelaie ntre fenomenul Kanagawa i
proveniena tulpinilor, i-a determinat pe cercettori s foloseasc acest test
pentru identificarea tulpinilor virulente.
Testarea acestei teorii pe animalele de laborator a demonstrat c
tulpinile de V. parahaemolyticus, Kanagawa pozitive produc dilatarea
ansei ileale ligaturate de iepure, n timp ce tulpinile Kanagawa negative
nu produc aceast dilatare.
Hemolizina Kanagawa este o molecul proteic sensibil la tripsin i
termostabil, cu o greutate molecular de 44.000 daltoni, compus din dou
uniti monomerice identice cu greutatea molecular de 22.000 daltoni.
V. parahaemolyticus mai produce i alte toxine (adezine i mucinaze)
ce asigur aderarea i ptrunderea bacteriei n enterocit, unde se iniiaz
producerea de hemolizine.
Rezervorul principal pentru V. parahaemolyticus este reprezentat
de apele estuarelor, apele litorale, sedimentul blilor, zooplancton, pete,
meduze, crustacee, sepii i calmari (Oliver i colab., 1997).
Toxiinfeciile alimentare au un caracter sezonier, majoritatea cazurilor
fiind semnalate n lunile iunie-octombrie.
Numai tulpinile Kanagawa pozitive sunt capabile s declaneze
toxiinfecii alimentare (Oliver i colab., 1997). Studiile efectuate pe probe
de alimente, ap i sedimente marine, arat c doar 1% dintre tulpinile
izolate sunt Kanagawa pozitive.
Cel mai frecvent implicate n producerea unor toxiinfecii alimentare
sunt crustaceele i lamelibranhiatele consumate crude sau insuficient
preparate termic.
Beuchat (1982) a constatat c din 42 de cazuri de toxiinfecii alimentare
determinate de V. parahaemolyticus, 33 au fost produse prin consum de
crevei, consumai sub form crud sau tratai termic prin abur nclzit.
Cel mai mare episod de toxiinfecii alimentare cu V. parahaemolyticus
a avut loc n SUA, producnd 320 de mbolnviri prin consumul de crevei
fieri insuficient i pstrai n condiii improprii. Tot n SUA, majoritatea
152

cazurilor de mbolnviri au fost provocate de consumul de midii i stridii


crude, recoltate din apele Pacificului.
Vibrio vulnificus
Produce mai multe toxine. Cea mai important este o hemolizincitolizin, o toxin extracelular cu proprieti antigenice, termolabil i
citolitic pentru eritrocitele de mamifere. Aceast toxin are o greutate
molecular de 56.000 daltoni i acioneaz mpreun cu ali factori
de virulen. Aceast hemolizin acioneaz, n special, n infeciile
extradigestive, determinnd edem, necroz local sau distrucii locale de
esut (Kreger i Lockwood, 1981).
Studiile clinice efectuate de Oliver i colab. (1989) au dus la concluzia
c exist o legtur ntre septicemiile cu V. vulnificus i o serie de disfuncii
hepatice, cum sunt cele produse de etilism, hepatite cronice, hepatoze,
care determin o suprancrcare a capacitii de legare a fierului de ctre
transferina seric. Simpson i Olivier au demonstrat c tulpinile virulente de
V. vulnificus nu au produs infecia, cnd transferina era incomplet saturat
n fier, dar aceasta s-a instituit rapid, atunci cnd transferina era complet
saturat.
Simpson i colab. au artat c exist o corelaie strns ntre virulen
i aspectul morfologic al coloniilor. Ei au observat c tulpinile virulente
formau colonii opace i translucide, iar cele avirulente formau numai colonii
translucide. Au corelat opacitatea coloniilor cu capacitatea tulpinilor de a
folosi fierul, legat de transferin i cu virulena (prezena capsulei).
V. vulnificus a fost izolat n toat lumea, rezervor principal fiind
considerate stridiile. A fost izolat i din crabi, raci, peti i crevei (Tamplin
i colab., 1982).
Vibrio alginolyticus
(Miyamoto i col., 1961).
Este o specie asemntoare cu V. parahaemolyticus. Prezint cili
laterali, fenomenul de roire pe suprafaa mediilor solide, capacitatea de
multiplicare la 40C, metabolizarea zaharozei, valeratului, L-leucinei i Ltirozinei.
Farmer i colab. (1985) constat c n urma unui studiu pe 74 de
izolate, 5,4% au origine fecal sau intestinal.
n Japonia, V. alginolyticus a fost izolat n procent de 0,5% din populaia
sntoas, neasociat cu simptome specifice bolilor aparatului digestiv.
153

Vibrio alginolyticus a fost izolat din toate tipurile de alimente cu


origine acvatic: peti, crevei, homari, crabi, scoici, midii, stridii.
Vibrio anguillarum
(Bergeman, 1909)
Este o specie patogen pentru peti, la care produce o boal septicemic
(septicemia hemoragic) caracterizat prin leziuni de miozit necrotic i
hemoragii subcutanate. Produce pierderi n cresctorii.
Declanarea infeciei este corelat cu temperatura apei, care trebuie s
aib minimum 15C.
7. Vibrio metschnikovii, Gamabia, 1888 (V. cholerae biovar proteus,
Shewar i Veron, 1974).
Produce gastroenterit la psri i o form benign de holer la om,
descris sub numele de cholera nostras.
Aceast specie se ntlnete sporadic n apa potabil i apa marin
din fiorduri, golfuri sau mri nchise. A fost semnalat la gtele i raele
domestice, hrnite cu fin de pete sau care sunt crescute n sistem extensivgospodresc.
Vibrio mimicus
A fost izolat din scoici i probe de ap i din scaunele diareice i probele
de secreie otic de la pacienii cu gastroenterite sau cu otite externe.
Se transmite prin produse marine crude.

4.10. Metode de izolare i identificare


a speciilor din genul Vibrio din alimente
Pentru identificarea corect a vibrionilor trebuie respectate dou
aspecte:
cultivarea vibrionilor halofili s se realizeze pe medii de purificare
a culturii i de identificare cu concentraie optim de clorur de sodiu. De
exemplu, V. parahaemolyticus izolat pe mediul TCBS i subcultivat pe medii
nesuplimentate cu clorur de sodiu prezint caractere biochimice aberante;
urgena identificrii lui V. cholerae; este favorizat de caracterul
nonhalofil al speciei.
154

Tabelul 4.4.
Caractere difereniale ale biovarurilor de V. cholerae 0:1
(dup Buiuc D., 1999)
Testula
Clasic
Biovarul
El-Tor
b
Hemoliza
d
c
Hemaglutinarea
+
Sensibilitatea la:
+
Polimixina B (50 UI)
Fagul clasic IV
+
Fagul El Tor
+
a
Simboluri: + = > 90% din tulpini pozitive; d = 11-89% din tulpini pozitive; - = >
90% din tulpini negative.
b
Hematii de berbec.
c
Hematii de pui de gin.

Pentru identificare se trimit la laborator materiale patologice


reprezentate de probe de ap, coninut intestinal, alimente pete i fructe de
mare.
Examenul bacterioscopic const n efectuarea de nsmnri din
probe proaspete sau conservate n medii de transport (Cary-Blair).
Folosirea ca mediu de cultur a apei peptonate alcaline cu efectuarea
de pasaje la ase ore de la suprafaa mediului, permite izolarea rapid a
germenului n cultur pur.
Se examineaz aspectul cultural i mobilitatea accentuat a
germenilor.
Pentru identificarea preliminar a genului se mai pot folosi urmtoarele
teste: oxidaz, sensibilitatea la agentul vibriostatic O/129, tolerana la
6-6,5% NaCl i testul uviei de DNA.
Testul oxidazei difereniaz speciile de Vibrio, Aeromonas i
Plesiomonas shigelloides, oxidaz pozitive, de enterobacteriacee, care
eventual cresc pe mediile selective (de exemplu: Proteus vulgaris), oxidaznegative. Excepie face V. metschnikovii, lipsit de citocromul C, care este
oxidaz negativ.
Principiu: Citocrom oxidaza este o hemoprotein din lanul respirator
de transport al electronilor, cuplat cu fosforilarea oxidativ. Sub aciunea
citocrom oxidazei tetrametil-p-fenilendiamina este oxidat ntr-un compus
de culoare purpurie.
Procedura: Se plaseaz un dreptunghi din hrtie de filtru ntr-o plac
Petri i se umecteaz cu reactivul pentru oxidaz. Se prelev o poriune de
155

colonie cu o ans de platin ori cu vrful unei pipete Pasteur cudat n tromp
de musc i se etaleaz uor n spot pe suprafaa hrtiei impregnate.
Testul pozitiv: Se traduce prin virajul spotului la purpuriu n interval
de 10 secunde. Un viraj mai tardiv, ntre 10 i 60 de secunde, nu este
caracteristic: poate fi datorat testrii unei culturi btrne sau de pe un mediu
cu carbohidrai fermentabili.
Testul negativ: Se traduce prin absena culorii purpurii.
Testul vibriostatic cu O/129 (2,4-dinamic-6,7-diizopropilpteridina).
Se prepar o suspensie a tulpinii de identificat cu turbiditatea echivalent
etanolului 0,5 Mac Farland i se nsmneaz ca pentru antibiograma
difuzimetric o plac cu agar tripticaz soia.
Se plaseaz pe aria nsmnat cte un disc cu 10 g i respectiv 150
g O/129.
Orice zon de inhibiie aprut n fundul discurilor dup ncurbare
peste noapte semnific un test pozitiv. Eficiena testului a devenit relativ
odat cu apariia tulpinilor de V. cholerae rezistente la O/129. De exemplu,
peste 90% din tulpinile de V. cholerae O:1 izolate n India sunt rezistente la
ambele concentraii. Deci, rezistena la O/129 nu exclude n mod necesar
aceast specie.
Tolerana la 6-6,5% NaCl.
Acest test difereniaz corect genul Vibrio, tolerant, de Aeromonas i
Plesiomonas, care nu cresc la aceast concentraie salin.
Testul uviei de DNA.
Se suspensioneaz o colonie suspect de Vibrio, ntr-o pictur din
soluia 0,5% dezoxicolat de sodiu depus pe o lam de microscop.
Prin liza vibrionilor este eliberat DNA, care poate fi tras cu ansa ca o
uvi. Testul difereniaz rapid V. cholerae de Aeromonas spp., care sunt
oxidaz pozitive i pot forma colonii asemntoare pe mediile de izolare.
Alternativ, izolatele suspecte pot fi triate pe mediul TSI:
Vibrionii cu interes medical:
fermenteaz fr producere de gaz glucoza;
fermenteaz sau nu zaharoza;
uzual, speciile diareigene nu fermenteaz lactoza;
nu produc H2S.
Aeromonadele diareigene, uzual produc gaz din glucoz.
Orict de fidel ar fi, un singur test nu individualizeaz corect genul
Vibrio.
156

Pentru ca diferenierea s fie corect avem nevoie de o baterie minimal


de teste, care include: oxidaze, creterea pe agar nutritiv cu 0% i 6% NaCl,
fermentarea glucozei cu/fr gaz, testul uviei de DNA, sensibilitatea la
10 i 150 g O/129, la 10 g ampicilin.
Teste definitive.
Se procedeaz la testele biochimice de confirmare a V. cholerae sau
de identificare a celorlalte specii de Vibrio pornind de la cultura pur a
izolatelor suspecte.
Se utilizeaz pentru testri, medii cu concentraia de NaCl crescut
pn la 1%, cu excepia testelor de cretere n absena sau la alte concentraii
de sare. Se incubeaz la 30-37C i se urmresc rezultatele, pn la o
sptmn cu citire zilnic, pentru c, frecvent se pozitiveaz i n primele
dou zile.
Tabel 4.5.

Oxidaz
O/129 zon de inhibiie
la discul cu 150 g
Creterea n bulion cu:
0% NaCl
1% NaCl
6% NaCl
8% NaCl
10% NaCl
12% NaCl
Indol
Decarboxilaze Moeller
Arginin
Lizin
Ornitin
ONPG

V. carchariae

V. cincinnatiensis

V. metschnikovii

V. damsella

V. hollisae

V. furnissi

V. fluvialis

V. alginolyticus

V. vulnificus

V. parahaemolyticus

V. mimicus

Testula

V. cholerae

Caractere biochimice difereniale ale speciilor


de Vibrio cu interes medical (dup Janda, 1998; McLaughlin, 1995)

100 100 100 100 100 100 100 100 95

100 100

99

95

20

90

25 100

100
100
53
1
0
0
99

100
100
49
0
0
0
98

0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
100 99 99 99 99 99 100 100 100 100
99 65 100 96 100 83 95 78 100 100
80 0 94 71 78 0
0 44 62 0
2
0 69 4
0
0
0
4
0
0
1
0 17 0
0
0
0
0
0
0
98 97 85 13 11 97 0 20 8 100

98

0
0
0
0
99 100 100 99
99 99 95 55
94 90 5 75
157

19

0
99
50
0

31

93 100
0
0
0
0
40 35

40

0
0
0
0

90

95
50
0
0

60
35
0
50

0
0
57 100
0
0
86 0

V. damsella

V. metschnikovii

V. cincinnatiensis

V. carchariae

0
40
9
50
100
0

V. furnissi

0
0
0
0
5
0

V. fluvialis

50

V. alginolyticus

V. vulnificus

V. hollisae

V. parahaemolyticus

96

V. mimicus

95

V. cholerae

Voges-Proskauer
75 9
0
0 95 0
0
0
Acid din:
L-arabinoz
0
1 80 0
1 93 100 97
m-inozitol
0
0
0
0
0
0
0
0
Salicin
1
0
1 95 4
0
0
0
Lactoz
7 21 1 85 0
3
0
0
Zaharoz
100 0
1 15 99 100 100 0
Ureaz
0
1 15 1
0
0
0
0
a
Rezultate pozitive exprimate procentual.

Testula

100 0
100 0
100 0
0
0
100 50
0
0

Biotipia
Vibrio cholerae O:1 se difereniaz n biovarurile, clasic i El Tor.
Vibrio cholerae O:139 este o mutant O a biovarului El Tor.
Serotipia
Vibrio cholerae O:1 are, indiferent de biovar, trei serovaruri definite
prin factorii antigenici a, b i c: Ogawa (a, b), Inaba (a, c) i Hikojima (a, b,
c), primele dou curent izolate i cu rspndire epidemic, al treilea, foarte
rar i nerecunoscut de ctre unii specialiti.
Identificarea combinat biovar-serovar ofer un marker epidemiologic
orientativ.
Lizotipia
Sistemul de lizotipare a biovarului El Tor a fost mult ameliorat prin
completarea setului Basu-Mukerjee, cu cinci fagi litici (I-V), cu ali cinci
noi fagi i redefinirea diluiei test de la liza confluent la liza aproape
confluent.
n acest mod au fost definite 146 de lizovaruri care acoper tiparea a
circa 99% din tulpini.
Capacitatea discriminatorie a acestor lizovaruri este excelent, mai
puin lizovarului 115, cu o prevalen de 12%.
Metode ale biologiei moleculare
n prezent, mai greu accesibile, ofer markeri epidemiologici fideli
pentru biovarul El Tor.
158

Tehnica de lucru
Prepararea probei
a) probe de pete: se recolteaz esuturi de suprafa, intestine,
branhii;
b) crustacee cu cochilie: se recolteaz ntregul coninut interior; se
adun 10-12 crustacee, din care se recolteaz 50 g pentru o prob test.
c) crustacee fr cochilie: se prepar n ntregime sau se recolteaz
poriunea central inclusiv branhii i intestine.
Ziua I:
Se amestec 450 ml de bulion cu NaCl 3% i polimixin B, ntr-un
blender steril pentru 1 minut, cu 8.000 rpm. Aceasta reprezint diluia 1:10.
n continuare se fac diluii seriate (1:100, 1:1.000, 1:10.000 etc.). Din fiecare
diluie seriat se trec cte 10 ml n cte 3 tuburi per diluie cu bulion GST
(glucose salt Teepol).
mbogirea: Se incubeaz bulioanele respective la 35C, 18-24 de
ore. Dac diluarea i incubarea nu se pot realiza n aceeai zi, probele se
pstreaz pe ziua urmtoare la o temperatur cuprins ntre 0 i 5C. n
cazul produselor congelate se recomand s se efectueze o a doua izolare
dup 18 ore de incubare.
Ziua a II-a:
Izolarea i identificarea: dup incubare se nsmneaz din fiecare tub
o ans de cultur pe suprafaa mediului de izolare TCBS (agar cu sucrozsare-bil-citrat-tiosulfat) (M65) n plci Petri (cte 3 per diluie) astfel nct
s se obin colonii izolate. Se incubeaz plcile la 35C, timp de 18-24 de
ore.
Ziua a III-a:
Testul diferenial I: Se recolteaz cu acul de nsmnare dou sau
mai multe colonii tipice (netede, verzi, zaharoz negative, cu diametrul de
2-3 milimetri), de pe suprafaa plcilor cu agar TCBS i se transfer pe
urmtoarele medii:
a) Agar TSI salin: V. parahaemolyticus i V. vulnificus realizeaz o
pant alcalin (roie = lactoz i zaharoz negative); baza mediului este
acid (galben = glucoz pozitiv), fr producere de gaze i nu prezint
nnegrire (hidrogen sulfurat negativ). Aceasta este o reacie tipic shigeloid
(Shigella-like). V. alginolyticus, V. fluvialis i V. metschnikovii dau o pant
acid i o baz fr gaz.
b) Mediul TSA (3% NaCl) i TSB (3% NaCl): Se nsmneaz mediile
TSA i TSB cu bacteria de cercetat i se nsmneaz 18-24 de ore la 35C.
Aceste culturi se folosesc ca surse de inoculare pentru alte teste, pentru
159

coloraia Gram i examinri microscopice. Vibrionii sunt bacterii Gram


negative, pleomorfe, cu aspect de bastonae, curbe sau drepte, prevzute cu
flageli polari.
c) Mediul pentru testarea mobilitii: Se inoculeaz un tub cu mediu
pentru testarea mobilitii prin neparea centrului coloanei de mediu n
profunzime. Se incubeaz 18-24 de ore la 35C. O cretere circular difuz
de la linia de nepare constituie un test pozitiv. V. parahaemolyticus i
vibrionii nrudii sunt mobili.
Ziua a IV-a:
Testul diferenial II:
a) Bulion cu glucoz Hugh-Leifson (Hugh-Leifson glucose broth): Se
inoculeaz dou tuburi de mediu HLGB cu un ac de nsmnare de pe
mediul TSA. Se acoper suprafaa mediului cu ulei mineral steril ntr-un
strat de aproximativ 3 cm i se incubeaz 2-3 zile la 35C. Dac culoarea
mediului se modific din purpuriu n galben nseamn c microorganismul
fermenteaz hidraii de carbon. V. parahaemolyticus i vibrionii nrudii
fermenteaz glucoza fr producie de gaz.
b) Testul de citocrom oxidaz: Se nsmneaz bacteria de cercetat
pe mediul TSA i se incubeaz 24 de ore la 35C. Se adaug 2-3 picturi de
reagent pentru testul oxidazei peste coloniile bacteriene crescute pe pant
sau peste coloniile din plci Petri. Dac n aproximativ 2 minute mediul se
va colora n albastru nchis testul este pozitiv. V. metschnikovii este negativ,
iar toi ceilali vibrioni halofili sunt pozitivi.
c) Testul pentru dihidrolaza argininei, lizinei i ornitindecarboxilazei:
Mediile au culoare galben, ca rezultat al producerii de acid din glucoz.
Apariia unei culori violete i tulburarea mediului la sfritul perioadei de
incubare este considerat reacie pozitiv. Rezultatul acestor teste i a altor
teste difereniale sunt prezentate n tabelul de mai jos:

V. anguillarum

V. vulnificus

V. fluvialis

V. metschnikovii

Aeromonas
hydrophila

Plesiomonas
shigelloides

TCBS (colonii verzi)


Creterea la 42C

V. alginolyticus

Test

V.
parahaemolyticus

Tabelul 4.6.
Teste de difereniere a lui V. parahaemolyticus de bacteriile nrudite

+
+

+
nd

var

var

+
-

160

V. alginolyticus

V. anguillarum

V. vulnificus

V. fluvialis

V. metschnikovii

Aeromonas
hydrophila

Plesiomonas
shigelloides

Creterea n medii cu:


NaCl 0%
NaCl 6%
NaCl 8%
NaCl 10%
Lizindecarboxilaz
Arginindihidrolaz
Ornitindecarboxilaz
Fermentarea sucrozei
Fermentarea lactozei
Fermentarea manitolului
Fermentarea arabinozei
Voges-Proskauer

V.
parahaemolyticus

Test

+
+
+
+
+
+
-

+
+
+
+
var
+
+
+

+
var
var
+
+
var

var
+
var
+
var
-

+
var
+
+
+
+
-

+
var
var
+
+
var
+
+

+
var
var
var
var
+
var
var

+
+
+
var
var
-

d) Mediul TSB (salt tripticase broth), halofilismul: Se nsmneaz


4 tuburi cu mediu TSB ce conin 0, 6, 8 i 10% NaCl, din cultura de TSB
cu 3% NaCl. Se incubeaz 24 de ore la 35C. Speciile halofile de Vibrio
care cresc i n absena srii se dezvolt bine n mediul cu 6% NaCl. V.
parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. fluvialis i, ocazional, tulpinile de V.
metschnikovii se dezvolt n 8% NaCl. Numai V. alginolyticus crete bine n
mediile cu 10% NaCl.
e) Creterea la 42C: Se inoculeaz un tub cu bulion TSB cu NaCl
2% cu o ans de cultur bacterian de 24 de ore de pe mediul TSB cu
NaCl 3% i se incubeaz n baie marin la 42C, timp de 24 de ore. Dac
creterea are loc n profunzimea mediului reacia este considerat pozitiv.
V. parahaemolyticus, V. alginolyticus i ocazional tulpinile de V. fluvialis i
V. metschnikovii sunt pozitive la acest test.
f) Bulionul MP-VP (testul Voges-Proskauer) (M56): se nsmneaz
un mediu MP-VP cu o ans dintr-o cultur de pe mediul TSA i se incubeaz
2 zile la 35C. Se efectueaz testul Voges-Proskauer. V. parahaemolyticus,
V. vulnificus i V. fluvialis sunt VP negative, n timp ce V. alginolyticus i V.
metschnikovii sunt pozitive.
g) Reaciile de fermentare n bulion cu bromcrezol purpuriu: Se
inoculeaz cte un tub cu bulion cu sucroz, lactoz, manitol i arabinoz
cu o cultur bacterian de pe mediul TSA i se incubeaz la 35C pentru 4,
161

5 zile. Reacia acid se traduce prin virarea culorii bulionului din purpuriu
n galben. Rezultatele acestor teste de fermentaie sunt incluse n tabelul de
mai sus.
h) Fenomenul Kanagawa (agar Wagatsuma) (M71): Reacia
Kanagawa reprezint un test pentru determinarea prezenei hemolizinei
termostabile directe specifice pe agarul Wagatsuma. S-a constatat c
reacia pozitiv se coreleaz strns cu patogenitatea rezultatelor de V.
parahaemolyticus. Izolatele care produc boala la om, sunt de obicei Kanagawa
pozitive, n timp ce izolatele recuperate din hrana marin sunt Kanagawa
negative, aproape ntotdeauna. Pentru efectuarea testului Kanagawa se
introduce o pictur dintr-o cultur de 18 ore n TSB cu NaCl 3% cu o
scobitoare steril pe o plac cu agar snge Wagatsuma, bine uscat. Se pot
face mai multe nepturi de tip circular pe o singur plac. Se nsmneaz
ntotdeauna culturi pozitive i negative pe fiecare plac. Se incubeaz la
35C i se urmresc rezultatele nregistrndu-se la 24 de ore.
Testul pozitiv const n beta-hemoliz, adic n clarificarea mediului
n jurul coloniei datorit unui proces de hemodigestie. Zona are o singur
margine, clar delimitat, fr inele concentrice multiple. Hemoliza este pe
deplin clar, fr s aib loc nverzirea mediului. Zonele de hemoliz se
observ de la marginea coloniei pn la marginea extern a zonei. Izolatele
care produc zone clare de hemoliz, mai mici de 3 mm pot fi slab patogene
prin testul ansei ileale de la iepure. Este important de reinut c n acest test
nu e valabil nici o observaie dup 24 de ore.
i) Conservarea culturilor bacteriene: Se inoculeaz un mediu de
conservare semisolid pe termen lung prin nepare n profunzime. Se
las capacul lax, pn la apariia unei creteri vizibile n cursul incubrii
la 35C, timp de 24 de ore. Se nchide etan capacul pentru a mpiedica
deshidratarea i se pstreaz la temperatura camerei. Pentru conservarea
lui V. parahaemolyticus i a lui V. vulnificus pentru cteva luni la -70C
se plaseaz 1 ml dintr-o cultur de 6-12 ore de TSB NaCl 3% i 0,09 ml
de dimetil-sulfoxid (DMSO) n criotuburi sterile; se congeleaz imediat la
-70C.
f) Confirmarea serologic a lui V. parahaemolyticus: Antigenele K,
care cuprind diferite grupe somatice sunt prezente n tabelul de mai jos:
Tabelul 4.7.

O grup
1
2
3
4

Tipul K
1, 25, 26, 32, 38, 41, 56, 58, 64
3, 28
4, 5, 6, 7, 29, 30, 31, 33, 37, 43, 45, 48, 54, 57, 58, 59
4, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 34, 42, 49, 53, 55, 63
162

O grup
5
6
7
8
9
10
11
TOTAL

Tipul K
15, 17, 30, 47, 60, 61
18, 46
19
20, 21, 22, 39, 62
23, 44
19, 24, 52
36, 40, 50, 51
60 de tipuri K/63 de serotipuri

Se procedeaz astfel: se spal o pant cu 2 ml dintr-o soluie de NaCl 3%


(o suspensie mai mare este optim pentru acest test de aglutinare pe lam).
Suspensia de celule se mparte n dou volume egale n tuburi separate. Se
autoclaveaz tubul o or la 121C. Aceast suspensie autoclavat reprezint
antigenul O. Suspensia netratat reprezint antigenul K. Pentru
efectuarea reaciei de aglutinare O se mparte lama n 12 compartimente
egale, folosind un creion de cear. Se introduce o pictur n fiecare
compartiment i se adaug cte o pictur din cele 11 antiseruri de grup
O. n compartimentul al 12-lea care conine martorul de aglutinare se
adaug o pictur de NaCl 3%. Se balanseaz uor lama timp de 1 minut
pentru amestecarea componentelor. Aglutinarea pozitiv se citete imediat.
Aceasta determin ce antigene de tip K trebuiesc testate. n acest
sens se marcheaz pe lam numrul de compartimente pozitive. Se plaseaz
o pictur mic de suspensie neautoclavat n fiecare compartiment i se
adaug cte o pictur de antiser K adecvat n fiecare compartiment. n
compartimentul de control se adaug o pictur de NaCl 3%. Se balanseaz
uor lama nainte i napoi pentru amestecarea componentelor, timp de un
minut. Se citete imediat.

4.11. Izolarea i identificarea vibrionilor din produsele acvatice


n perioada 2007-2009 au fost recoltate i prelucrate prin examen
bacteriologic complex 25 de tulpini bacteriene din genul Vibrio, dintre
care 10 tulpini de Vibrio parahaemolyticus din scaun diareic, 5 tulpini de
Vibrio vulnificus izolate din scoici, molute i stridii, 3 tulpini de Vibrio
alginolyticus izolate din probe de zooplancton, pete i ap, 2 tulpini de
Vibrio metschnikovii izolate din pete congelat i fin de pete i 2 tulpini
de Vibrio furnissi izolate din fin de pete.
Studiul s-a efectuat n cadrul Facultii de Medicin Veterinar,
163

Bucureti i a INCDMI Cantacuzino, Bucureti.


Caracteristicile celor 25 de tulpini analizate conform metodei propuse
de Organizaia Internaional de Standardizare (SR/ISO-8914/1992) sunt
prezentate pe larg n tabelele 4.8 i 4.9.
Tabelul 4.8
Teste preliminare
Nr.
Colora- MoGaz
Nr.
OxiGluLac- ZahaSpecia bacterian de tulia
biliglucocrt.
daz
coz
toz roz
pini
Gram tate
z
1 V. parahaemolyticus
10
+
+
+
2 V. vulnificus
5
+
+
+
+
3 V. alginolyticus
5
+
+
+
+
4 V. metschnikovii
3
+
+
+
+
5 V. furnissi
2
+
+
+
+
Teste biochimice de confirmare
Nr.
Nr. de
Specia bacterian
ADH LDC ONPG ODC
crt.
tulpini
1 V. parahaemolyticus
10
+
+
2 V. vulnificus
5
+
+
3 V. alginolyticus
5
+
4 V. metschnikovii
3
+
5 V. furnissi
2
+
+
Legend:
ADH = arginin-dehidrolaz;
LDC = lizin-decarboxilaz;
ONPG = hidroliza ortonitrofenil--D-galactopiranozidei;
ODC = ornitin-decarboxilaz;
H2S = producere de hidrogen sulfurat.

Tabelul 4.9
Indol

H2S

+
+
+
-

Rezultatele antibiogramei
Analiznd comparativ rezultatele obinute n urma efecturii
antibiogramelor, constatm c, speciile de Vibrio non-holerice sunt sensibile
la aciunea tetraciclinei, a penicilinei, ampicilinei, cefalosporinelor,
cloramfenicolului, aminoglicozidelor i fluorochinolonelor. Vibrio
parahaemolyticus i Vibrio alginolyticus sunt rezistente la aciunea
penicilinei i a ampicilinei.
A fost constatat antibiorezistena unor tulpini la ampicilin (V.
alginolyticus i V. parahaemolyticus), la gentamicin (V. metschnikovii), la
164

eritromicin (V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. alginolyticus).


Sensibilitatea maxim a fost constatat la tetraciclin, cefalosporine
i quinolone.
Rezultatele statistice ale interpretrii antibiogramelor sunt prezentate
n tabelul 4.10.
tulpini rezistente, cele care au zona de inhibiie 0-1 mm;
tulpini cu sensibilitate medie, cele care au zona de inhibiie 10-14
mm;
tulpini cu sensibilitate maxim, cele care au zona de inhibiie
14-16 mm;
Tabelul 4.10
Testarea sensibilitii tulpinilor Vibrio non-holerice fa de antibiotice
Media zonei de inhibiie (mm)
Specia bacterian
T
P
A
Cf Cfc
C
G
E
Ef Cft
1 10,25 15,92
V. parahaemolyticus 14,90 0,85 0,90 15,08 14,28 8,00 4,50
16,00 5,00 4,38 14,35 14,25 3,28 6,25
1 10,50 16,00
V. vulnificus
15,00 0,52 1,00 15,92 15,18 4,00 5,11 0,63 11,20 15,34
V. alginolyticus
15,52 6,28 2,00 16,00 15,92 8,25 0,73 3,28 13,40 14,28
V. metschnikovii
14,35 4,02 3,15 14,53 14,38 5,18 2,73 4,56 15,92 14,72
V. furnissi
Legend: T = tetraciclin; P = penicilin; A = ampicilin; Cf = ciprofloxacin; Cfc
= cefaclor; C = cloramfenicol; G = gentamicin; E = eritromicin; Ef = enrofloxacin; Cft
= cefotaxim.
Tabelul 4.11
Interpretarea statistic a rezultatelor obinute din citirea antibiogramelor
Tulpini cu
Tulpini cu
Antibioticul
Media zonei
Tulpini
sensibilitate
sensibilitate
testat
de inhibiie rezistente (%)
medie (%)
maxim
Tetraciclin
15,15
0
0
100
Penicilin
3,33
40
60
0
Ampicilin
2,28
40
60
0
Ciprofloxacin
15,17
0
0
100
Cefaclor
14,80
0
0
100
Cloramfenicol
5,74
0
100
0
Gentamicin
3,86
20
80
0
Eritromicin
2,09
40
60
0
Enrofloxacin
12,25
0
0
100
Cefotaxim
15,25
0
0
100

Din studiile efectuate s-au desprins urmtoarele concluzii:


1. Speciile de Vibrio au fost izolate i identificate din diferite probe
biologice prin metoda ISO-8914/1992.
165

2. n ceea ce privete fermentarea lactozei, au fost negative tulpinile


de V. parahaemolyticus, V. alginolyticus i pozitive cele de V. vulnificus, V.
metschnikovii i V. furnissi.
3. Prin coloraia Gram s-a dovedit c toate tulpinile de vibrioni au
fost Gram negative.
4. Testul oxidaz a fost pozitiv pentru toate speciile, n afar de Vibrio
metschnikovii, care a rspuns negativ la aceste teste.
5. Testul mobilitii i fermentarea glucozei au fost pozitive, n toate
cazurile, n timp ce nici una dintre tulpini nu a produs gaz din glucoz.
6. Testele preliminare au fost reprezentate de: testul oxidazei,
coloraia Gram, mobilitate, glucoz, gaz-glucoz, lactoz, zaharoz.
7. Rezultatele testelor biochimice de confirmare au fost
urmtoarele:

cele 5 tulpini de V. alginolyticus au rspuns pozitiv la urmtoarele
teste: LDC, indol i negativ la ADH, ONPG, ODC, H2S;

V. vulnificus, toate cele 5 tulpini au rspuns negativ la ADH,
ODC, H2S i pozitiv la LDC, ONPG, indol;

V. furnissi, cu 2 tulpini pozitive la ADH i ONPG i negative la
LDC, ODC, indol, H2S;

V. parahaemolyticus, toate cele 10 tulpini au rspuns negativ la
ADH, ONPG, H2S i pozitiv la LDC, ODC, indol.

V. metschnikovii, cu 3 tulpini izolate a rspuns pozitiv la ONPG
i negativ la toate celelalte teste de confirmare;

cele 25 de tulpini non-holerice de Vibrio s-au dovedit a fi sensibile
fa de urmtoarele antibiotice: tetraciclin, penicilin, aminoglicozide,
fluorochinolone.

am remarcat faptul c vibrionii sunt bacterii halofile, ce se
dezvolt optim n mediile cu concentraii n clorur de sodiu situate n
intervalul 1-6%;

tulpinile de V. parahaemolyticus i V. alginolyticus au fost
rezistente la aciunea penicilinei i a ampicilinei;

sensibilitatea maxim (de 100%) a fost constat la tetraciclin,
ciprofloxacin, cefaclor, enrofloxacin, cefotaxim;

tulpinile de Vibrio testate de noi s-au dovedit a fi rezistente fa
de aciunea penicilinei (40%), ampicilin (40%), gentamicinei (40%) i
eritromicinei (20%).

n produsele alimentare solide, la temperaturi de refrigerare i
congelare vibrionii se distrug rapid, iar la temperaturi mai mari de 80C
rezist cteva minute.
166

izolarea i identificarea lui V. parahaemolyticus


-schema de lucru-

1. diluarea

450 ml de diluant (ap cu 3% NaCl)

probei alimentare
50 g aliment; se amestec la 8.000
rpm pt 1 min.

diluii seriate
n 90 ml
tampon fosfat

2. Efectuarea
diluiilor seriate

3. mbogirea
Incubarea la 35C,
18-24 de ore

1 g de inocul
n fiecare tub
GSTB

0,1 g de inocul
n fiecare tub
GSTB

4. Obinerea
coloniilor izolate
Agar TCBS
5. Teste biochimice i serologice de confirmare

167

0,01 g de inocul
n fiecare tub
GSTB

Mediu selectiv Agar TCBS (tiosulfat-citrat-bil-sucroz) propus de NAKANISHI


(1962), modificat de KOBAYASHI et al. (1963). Se utilizeaz la izolarea i cultivarea
selectiv a Vibrio cholere i ali vibrioni enteropatogeni (V. parahaemolyticus, NAG
vibrios).

Vibrio parahaemolyticus: Colonii grii, de dimensiuni


medii, nehemolitice
168

Bacili Gram-negativi, curbai. Frotiu din cultur de Vibrio cholera

Vibrio parahaemolyticus : Bacili drepti sau curbai.


Microscopie n contrast de faz
169

Bibliografie
1. Adams MR & Moss MO., 2000, Bacterial Agents of Foodborne Illness., Food
Microbiology 2nd Edition, The Royal Society of Chemistry; P.184-271.
2. Chai TJ & Pace JL., 2001. Vibrio parahaemolyticus, Hui YH, Pierson MD &
Gorham JR, editors. Foodborne Disease Handbook Volume 1: Bacterial Pathogens,
2nd Edition. New York: Marcel Dekker, Inc.; P.407-437.
3. Dalsgaard et al., 2001. Vibrio vulnificus., Foodborne Disease Handbook Volume
1: Bacterial Pathogens, 2nd Edition. New York: Marcel Dekker, Inc.; P.439-470
4. FAO/WHO. Joint FAO/WHO Activities on Risk Assessment of Microbiological
Hazards in Foods. Preliminary Document. Hazard Identification, Exposure
Assessment and Hazard Characterization of Vibrio spp. in Seafood. Disponibil la:
ftp://ftp.fao.org/es/esn/food/vibrio.pdf
5. Gram L & Huss HH. Fresh and Processed Fish and Shellfish, 2000, The
Microbiological Safety and Quality of Food. Volume I. Maryland: Aspen
Publishers, Inc; P.472-506.
6. Heymann DL., 2004, Cholerae and Other Vibrioses., Control of Communicable
Diseases Manual, 18th Edition. Washington DC: American Public Health
Association;. P.103-117 United States Food and Drug Administration Centre for
Food Safety and Applied Nutrition. Bad Bug Book: Vibrio cholerae Serogroup
O1. Disponibil la: http://www.cfsan.fda.gov/~mow/chap7.html
7. International Commission on Microbiological Specifications for Foods., 1996,
Vibrio cholerae, Microorganisms in Foods Characteristics of Microbial Pathogens.
London: Blackie Academic & Professional; P.414-425.
8. International Commission on Microbiological Specifications for Foods, 1996,
Vibrio parahaemolyticus, Microorganisms in Foods 5. Characteristics of Microbial
Pathogens, Blackie Academic & Professional; P. 426-435.
9. International Commission on Microbiological Specifications for Foods, 1996.
Vibrio vulnificus, Microorganisms in Foods 5. Characteristics of Microbial
Pathogens., Blackie Academic & Professional P.436-439.
10. International Commission on Microbiological Specifications for Foods., 1998.
Fish and Fish Products., Microorganisms in Foods 6. Microbial Ecology of Food
Commodities, Blackie Academic & Professional; P. 130-189.
11. Kaysner CA., Vibrio species, 2000. The Microbiological Safety and Quality of
Food. Maryland: Aspen Publishers, Inc.; P.1336-1362.
170

12. Nutrition. Vibrio vulnificus. Disonibil la: http://www.cfsan.fda.gov/~mow/


chap10.html
13. Oliver JD & Japer JB., 1997, Vibrio species., Doyle MP, Beuchat LR & Montville
TJ. Food Microbiology Fundamentals and Frontiers. Washington DC: ASM
Press; P.228 264.
14. Raport Comisia Europeana. Opinion of the Scientific Committee on Veterinary
Measures, Public Health on Vibrio vulnificus and Vibrio parahaemolyticus (in
raw and undercooked seafood) (adoptat la data de 19-20 sept. 2001).
15. Simona Ivana, 2002 Bacteriologie veterinar special (Ed. Ceres, Bucureti;
460 pagini), ISBN: 973-40-0568-5
16. Simona Ivana, 2005 Bacteriologie general (Ed. tiinelor medicale, Bucureti;
250 pagini), ISBN: 973-86485-7-2
17. Simona Ivana, 2006 Tratat de bacteriologie medical-veterinar i introducere n
micologie (Ed. tiinelor medicale, Bucureti;768 pagini), ISBN (10) 973-865715-6; ISBN (13) 978-973-86571-5-1
18. Simona Ivana, 2007 Manual de microbiologia alimentelor (Ed. tiinelor
medicale, Bucureti; 160 pagini), ISBN: 978-973-86571-3-7
19. Simona Ivana, 2007 Microbiologie medical veterinar, Vol. I (Ed. tiinelor
medicale, Bucureti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-01-6
20. Simona Ivana, 2007 Microbiologie medical veterinar, Vol. II (Ed. tiinelor
medicale, Bucureti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-02-3
21. Simona Ivana, 2008, Microbiologia alimentelor, Ed. Orizonturi, ISBN: 978-973736-090-8
22. Simona Ivana, 2008, Practical guide of microbiogical diagnosis, Ed. Orizonturi,
ISBN: 978-973-736-089-2
23. Sutherland J. & VRNAam A., 2000, Enterotoxin-producing Staphylococcus,
Shigella, Yersinia, Vibrio, Aeromonas and Plesiomonas., Blackburn CW &
McClure PJ., editors. Foodborne Pathogens. Hazards, Risk Analysis and Control.
Cambridge: Woodhead Publishing Limited;. P. 358-415.
24. United States Food and Drug Administration Centre for Food Safety and Applied
Nutrition, Bad Bug Book: Vibrio cholerae Serogroup Non-O1. Disponibil la:
http://www.cfsan.fda.gov/~mow/chap8.html
25. United States Food and Drug Administration Centre for Food Safety and Applied
Nutrition, Vibrio parahaemolyticus: http://www.cfsan.fda.gov/~mow/chap9.html
171

26. United States Food and Drug Administration Centre for Food Safety and
Applied
27. Xu H et al., 1998, Occurrence and Distribution of Vibrios in Fishes and Shellfishes
in Coastal Waters of Hong Kong, Acta Oceanologica Sinica, 17: 545-553.
28. Yam WC et al., 1999. Abundance of Clinical Enteric Bacterial Pathogens in
Coastal Waters and Shellfish. Water Research; 34: 51-56.

172

CAPITOLUL 5
Implicaiile campylobacteriilor n toxiinfeciile alimentare
5.1. Caractere generale
Genul Campylobacter conine 25 de specii, iar dintre acestea cea mai
important specie izolat din alimente este Cam. jejuni subsp. jejuni. Spre
deosebire de Cam. jejuni subsp. doylei este rezistent la cefalotin, crete
la 42C i reduce nitraii n nitrii. Diferenierea de Cam. coli const n
capacitatea de a hidroliza hipuratul. Genul Campylobacter este strns
nrudit cu genul Arcobacter. Campilobacteriile au fost clasificate n trecut
ca specii Vibrio.
Din punct de vedere morfologic Cam. jejuni este un bacil subire
n form de virgul sau litera S. Se pot ntlni i forme mai lungi,
multispiralate, ct i scurte, cocoide. Este monoflagelat, iar flagelul poate
fi dispus la unul sau la ambii poli ai celulei bacteriene. Produce oxidaz
i catalaz i nu se dezvolt la 25C, n prezen de NaCl 3,5%. Este
microaerofil, necesitnd pentru cretere cantiti mici de oxigen (3-6%).
Temperaturile minime, optime i maxime de cretere pe mediile solide sunt
de 30C, 40C i respectiv 45C. Se dezvolt bine la un pH ntre 5,5-8,0 i
n prezen de NaCl 1,75%. Creterea este inhibat de oxigen 21%. Dioxidul
de carbon 10% este necesar pentru creterea bacterian. Metabolismul este
respirator.
Datorit dimensiunilor lor mici, campilobacteriile pot fi separate de
alte bacterii Gram negative folosind filtre de 0,65 microni.
Campilobacteriile cresc mai lent pe mediile de cultur dect
enterobacteriaceele.
De obicei, nu sunt asociate cu mediul nconjurtor ci cu animalele
homeoterme. S-a dovedit c majoritatea animalelor de carne conin aceste
microorganisme n fecale, n special psrile de cas.
Cel puin cteva tulpini de Cam. jejuni produc o enterotoxin
termolabil asemntoare cu enterotoxinele produse de Vibrio cholerae i
Escherichia coli. Producia maxim de toxin ntr-un mediu special are loc
la 42C, n 24 de ore i sporete prin adugarea de polimixin.
Simptomele toxiinfeciilor provocate de aceste microorganisme includ
173

durere sau crampe abdominale, diaree, disconfort, cefalee, febr. Perioada


de incubaie este de obicei de 48-82 de ore, dar poate ajunge i la 7-10
zile, organismul putnd fi detectat chiar i dup dou luni de la ncetarea
simptomelor.
Enteritele campilobacteriene sunt de origine alimentar n proporie de
90%. Cam. jejuni, ca i Vibrio parahaemolyticus i Yersinia enterocolytica
sunt bacterii ce se distrug uor la temperatura de pasteurizare a laptelui.
Campilobacteriozele pot fi prevenite prin prepararea termic a
alimentelor de origine animal, n special a laptelui i a crnii de pui.

5.2. Taxonomie
Genul Campylobacter face parte din familia Campylobacteriaceae
(Vandamme i De Ley, 1991) i cuprinde urmtoarele specii: Cam. fetus cu
subspeciile: fetus i veneralis; Cam. jejuni cu subspeciile: jejuni i chloylei;
Cam. hyointestinalis cu subspeciile hyointestinalis i lawsonii; Cam.
sputorum cu subspeciile: sputorum i bubulus; Cam. mucosalis; Cam. coli;
Cam. helveticus; Cam. upsaliensis.
Tot din aceast familie, mai fac parte:
55Genul Lawsonia, cu specia Lw. intracellularis.
55Genul Helicobacter, cu specia tip Hlb. pylori.
55Genul Arcobacter, cu specia tip Aob. nitrofragilis.

5.3. Specii ale genului Campylobacter implicate n producerea


toxiinfeciilor alimentare
5.3.1. Campylobacter jejuni
Cam. jejuni se caracterizeaz morfologic prin forme caracteristice
de virgul sau litera S. Se pot ntlni i forme mai lungi, multispiralate,
ct i scurte, cocoide. n condiii neprielnice adopt forma cocoidal, care
pstreaz intacte peretele celular i flagelii.
Aceste forme pot trece ntr-o faz latent, n care tolerana la oxigen
este crescut. Pot rmne viabile mai multe luni, n apa rece, fiind capabile
s infecteze gazdele susceptibile, dar nu sunt cultivabile prin metode uzuale.
Este mobil, nesporogen, necapsulogen, Gram negativ.
Cam. jejuni i Cam. coli necesit o temperatur optim de cretere
mai mare (42-43C), fa de cea necesar altor campilobacterii, ele fiind
considerate specii termofile.
174

Se dezvolt pe medii obinuite, mbogite cu adaos de snge defibrinat


i unii acizi aminai.
Ca substane inhibitorii pentru restul florei bacteriene se nglobeaz
bacitracin (25 U/ml), polimixina B, sulfat (20 U/ml) sau novobiocin
(0,025 mg/ml).
La Cam. jejuni exist dou categorii moleculare de lipopolizaharide
(LPS) parietale. Prima cuprinde LPS de greutate molecular mare, cuprins
ntre 4,5 i 5 Kdal. Aceste LPS au o structur asemntoare cu cea a tulpinilor
de tip R de enterobacteriaceae.
A doua categorie de LPS parietale este reprezentat de componeni cu
greutate molecular mare, a cror structur este asemntoare cu LPS de la
tulpinile de tip S de la enterobacteriaceae.
n cadrul acestor dou categorii de LPS, exist o mare diversitate
structural i antigenic. Dup Euzeby, la Campylobacter s-au identificat
63 de serovarieti (dup schema propus de Lior). Dintre acestea
biotipul I este implicat n leziuni intestinale (enterita campylobacterian)
iar biotipul II responsabil de aa numita hepatit vibrionic (hepatit
campylobacterian). Componentele polizaharidice sunt antigenic distincte,
fiind antigene O termostabile, care formeaz baza schemei (larg utilizat)
de serotipare Penner.
Schema Lior este construit pe baza proteinelor flagelare i de
suprafa, care sunt antigene termolabile.
n schema Penner au fost definite 66 de antigene O, iar n schema Lior
peste 160 de antigene termolabile.
Serotipizarea reprezint cea mai uzual metod de diagnostic,
ns utilizarea ei este posibil doar n laboratoarele specializate. n cele
nespecializate pot fi utilizate seturi comerciale care combin biotipizarea i
testele de rezistotipizare.
Recent au fost descrise metode de tipizare molecular, majoritatea
fiind bazate pe anumite forme de analiz a DNA-ului.
Cam. jejuni este sensibil la aciunea unui spectru larg de ageni
antimicrobieni (tetraciclin, streptomicin) i chimioterapice, dar nu i la
aciunea polimixinei, bacitracinei i novobiocinei.
Cam. jejuni este o bacterie sensibil la aciunea agenilor fizici i chimici.
Este distrus de pasteurizare, clorinare, precum i prin iradiere cu raze gamma.
Supravieuirea crete la rece, dar procesele de congelare i decongelare
determin reducerea de 10 ori a numrului de microorganisme.
n condiii naturale sunt receptive galinaceele, n special ginile tinere
de 3-4 luni. Infeciile campylobacteriene au mai fost identificate la curc,
bibilic, potrniche, dropie, ra, cioar, stru american Nandu.
175

Cam. jejuni mai produce gastroenterit i diaree mucoid-sangvinolent la taurine, ovine i om.

5.4. Epidemiologie
n 2006, au fost raportate 180.009 cazuri (179.510 confirmate) de ctre
24 state membre ale UE, Islanda i Norvegia (Grecia, Portugalia, Romnia
i Liechtenstein nu au raportat). Numrul cazurilor de campylobacterioz
raportate n 23 de state cu date disponibile, att pentru 2005, ct i pentru
2006 a fost n mic msur diferit, constatndu-se doar o uoar scdere
(12%) a cazuisticii din 2006 fa de cea din 2005. Rata total a notificrilor
a fost de 39,5 la 100.000 locuitori, cu cea mai mare rat a notificrilor n
Republica Ceh (220,2 la 100.000). Numai Lituania a raportat 0 cazuri.
Tabelul 5.1.
Numrul i rata notificrilor camylobacteriozelor raportate n UE i EEA/EFTA n
2006

ara

Tipul de raportare

Austria
Belgia
Bulgaria
Cipru
Republica Ceh
Danemarca
Estonia
Finlanda
Frana
Germania
Grecia
Ungaria
Irlanda
Italia
Latvia
Lituania
Luxembourg
Malta

C
C
A
C
C
C
C
C
C
C
U
C
C
C
C
A
C
C

Total cazuri

Cazuri confirmate

Nr. cazuri per


populaii de
100.000 de
oameni

5020
5771
75
2
22713
3239
124
3439
2675
52035
6829
1815
801
0
624
285
54

5020
5771
75
2
22571
3239
124
3439
2675
52035
6807
1812
801
0
624
285
54

60,7
54,9
1,0
0,26
220,2
59,7
9,2
65,4
4,2
63,1
67,6
43,1
1,4
0,0
18,3
60,8
13,3

176

ara

Tipul de raportare

Total cazuri

Cazuri confirmate

Nr. cazuri per


populaii de
100.000 de
oameni

Cazuri/100.000

Olanda
C
3401
3186
19,5
Polonia
C
157
156
0,4
Portugalia
U
Romnia
U
Slovacia
C
2797
2728
50,6
Slovenia
C
944
897
47,1
Spania
C
5883
5883
13,4
Suedia
C
6078
6078
67,2
Marea Britanie
C
52543
52543
87,0
Total UE
177304
176805
39,3
Islanda
C
117
117
39,0
Liechtenstein
N
Norvegia
C
2588
2588
55,8
Total
180009
179510
39,5
Sursa: Raportri naionale. A = Raportri de date agregate; C = Raportri bazate
pe cazuri; - = fr raportare; U = nespecificat
Figura 5.1.
Distribuia pe grupe de vrst a cazurilor de campylobacterioz n 2006 (177.469
cazuri)(Centrul European Pentru Prevenirea i Controlul Bolilor, 2008)

5.4.1. Distribuia campylobacteriozelor la om dup vrst i sex


177

Date referitoare la distribuia pe grupe de vrst a infeciilor


campylobacteriene umane au fost furnizate n 2006 de 23 state europene
(177.479 cazuri). Cel mai mare numr de cazuri raportate a fost la grupa de
vrst 25-44 ani cu 51.155 cazuri (28,8%). Totui, n zece state cel mai mare
numr de cazuri a fost raportat la copii sub 5 ani. Acest grup de vrst a avut
i cea mai mare rat a notificrilor (107,1 la 100.000).
Informaii privind sexul persoanelor bolnave au furnizat 23 de state
europene raportul brbai/femei fiind de 1,1:1, cu o rat a notificrilor de
43,6 la 100.00 la brbai i 36,8 la 100.000 la femei.
5.4.2. Sezonalitatea
Date referitoare la luna n care a a vut loc fiecare caz de campylobacterioz au furnizat 23 de state europene, numai Lituania a raportat 0 cazuri.
Cele mai multe cazuri au fost raportate n lunile de var, ntre iunie i septembrie.
5.4.3. Cazurile importate
Date referitoare la statutul de boal importat sunt furnizate de 19
state membre ale UE, Islanda i Norvegia. Aproape 10% din cazurile de
campylobacterioz sunt raportate ca importate. n Cipru, republica Ceh,
Ungaria, Lituania, Malta, Polonia, Slovacia i Spania 99% din cazurile
raportate sunt domestice, n timp ce n Suedia i Finlanda, 63% i respectiv
59% din cazurile raportate sunt importate.

Cazuri

Figura 5.2.
Distribuia sezonier a cazurilor de campylobacterioz n 2006 (178.838 cazuri)
(Centrul European Pentru Prevenirea i Controlul Bolilor, 2008)

Ian

Feb

Mar

Apr

Mai

Iun

178

Iul

Aug

Sep

Oct

Nov

Dec

5.4.4. Rezistena Campylobacter sp. la antibiotice


Datele furnizate de Enter-net arat c C. jejuni i C. coli reprezint
43,0% i respective 2,3% din totalul infeciilor campylobacteriene declarate
de 25 state membre ale UE n anul 2006. O proporie mare (53,6%) a cazurilor
confirmate nu furnizeaz informaii referitoare la specia dat. ntre 2.200 i
4.801 izolate C. jejuni i ntre 430 i 630 izolate C. coli au beneficiat de
antibiogram. Proporia tulpinilor rezistente la ciprofloxacin, acid nalidixic
i tetraciclin a fost mai mare la C. coli (57,6%, 51,0% i 45,9%) dect la
C. jejuni. Aproape toate tulpinile C. jejuni i C. coli testate au fost sensibile
la amoxicilina+acid clavulanic (99,9% i 100%) i gentamicin (98,8% i
98,2%).
n 2006, la fel ca i n 2005, Campylobacter a fost cea mai frecvent
raportat cauz a bolilor gastro-intestinale n UE, stnd la baza mai multor
focare naionale i internaionale de boal. Existena unei variabiliti mari
ntre sistemele de raportare a evenimentelor de la un stat la altul, alturi de
numrul destul de mare al cazurilor de boal neraportate face extrem de
dificil compararea datelor comunicate de diferite state. Sursele alternative
de informare, cum ar fi utilizarea turitilor rentori n ar ca oameni
santinel, sugereaz un nivel foarte ridicat al cazuisticii neraportate n unele
state europene.
Datele furnizate de Raportul privind Zoonozele al Uniunii Europene
pe anul 2006 arat c o surs important de expunere uman la campylobacteriile transmisibile prin alimente este carnea de broiler. Majoritatea statelor au raportat nivele mari sau foarte mari ale prezenei acestei bacterii n
carnea proaspt de broiler. O serie de state au raportat o proporie ridicat
de izolate Campylobacter rezistente la antibiotice uzuale, i un interes particular l reprezint apariia tulpinilor rezistente al ciprofloxacin, un produs
folosit frecvent n afeciunile gastrointestinale severe la om.
5.5. Specii zoonotice din genul Campylobacter
Dintre bacteriile care produc campylobacterioz la om i animale,
numai Cam. jejuni i Cam. coli prezint interes pentru sntatea public.
Aceti germeni se afl la nivelul tractului intestinal al psrilor slbatice i
n cel al animalelor domestice. Carnea de pasre vndut n magazine este
mai des contaminat dect carnea roie i subprodusele de carne.
n rile industrializate determin pierderi economice ce se ridic la
mai multe milioane de lire sterline, fiind cea mai frecvent form de diaree
179

infecioas identificat (inciden de 1% pe an).


Omul se contamineaz prin consum de carne i lapte crude, carne
semipreparat sau prin apa contaminat.
Prevenirea infeciei se face att prin respectarea normelor igenicosanitare n ferme (mai ales de psri), abatoare (la sacrificare i prelucrare),
magazine i gospodriile populaiilor (prin manipularea corect a materiilor
prime n timpul prelucrrii alimentelor).
n anul 1886, Theodor Escherich descrie campylobacteriile n
amprentele obinute din mucoasa colonului la autopsia copiilor mori de
cholera infantum.
n anul 1906, McFadyean i Stockman izoleaz pentru prima dat
bacteria n timpul unor investigaii asupra avortului epizootic la oi i vaci,
iniiat de Ministerul Britanic al Agriculturii.
n anul 1919, Smith i Taylor izoleaz germenul denumindu-l Vibrio
fetus.
Cercetrile efectuate la Institutul Pasteur, n anul 1963, au demonstrat
c aceste bacterii sunt diferite de vibrioni, iar pentru clasificarea lor a fost
creat genul Campylobacter.
ntr-un penitenciar din SUA, n anul 1938, s-a descris primul caz la
om datorit consumului de lapte infectat, manifestat prin gastroenterit.
Butzler, n Belgia (1948), a reuit s izoleze bacteria din fecale. El a
demonstrat c n fecalele a 5% dintre copiii cu diaree pot fi gsite campylobacterii.
Prin tehnologia DNA modern s-a demonstrat c genul Campylobacter
alturi de Arcobacter, Helicobacter i Wolinella formeaz un grup distinct
de familii, cunoscut ca Superfamilia VI RNAr. Acest grup de bacterii se
caracterizeaz printr-o morfologie spiralat i o mobilitate mare care le
permite s se deplaseze liber prin mucus.
Cam. jejuni (90%) i Cam. coli (10%) produc majoritatea enteritelor
campylobacteriene n rile industrializate i n cele n curs de dezvoltare.
Cam. jejuni subspecia doylei se ntlnete la copii care triesc n
condiii sociale precare.
Cam. upsaliensis, Cam. lari, Cam. hyointestinalis i Arcobacter
butzlerii determin infecii rare la copii din rile subdezvoltate cu
semnificaie incert.
Campylobacter fetus specia tip a genului, se ntlnete n infecii
sistemice la pacienii cu imunodeficien sau boal preexistent.
Helicobacter cineadi, izolat frecvent de la hamsteri i Hlb. fennelliae
produc n majoritatea cazurilor proctocolita homosexualilor (Mishu i col.,
1995).
180

Hlb. heimannii, care nc nu a putut fi cultivat se pare c este identic


cu cel izolat de la cini i pisici.
Hlb. pylori este monopatogen pentru om, jucnd un rol important n
producerea ulcerului peptic i a cancerului gastric.

5.6. Metode de izolare i identificare a genului Campylobacter


din alimente
5.6.1. Prepararea probelor
1. Buci de carne, molute, picioare de broasc. Se amestec 25 g
de prob alimentar cu 100 ml de bulion de mbogire cu soluia numrul
1 de antibiotice, ntr-un sac cu filtru Stomacher, timp de 3 minute. Proba se
recolteaz cu ajutorul unei pense sterilizate prin alcool flambare sau unui
clete steril.
Dac proba este reprezentat de o carcas ntreag sau dac este
sngernd sau foarte gras se cltete 3 minute cu pepton 0,1% la un
raport prob/bulion de 1/6. Se ndeprteaz grsimea prin filtrare, printr-un
tifon steril. Se centrifugheaz timp de 10 minute la 4C. Se ndeprteaz
supernatantul i se resuspend depozitul n 5 ml de pepton 0,1%. Se obine
diluia 1/10 dintr-un ml de sediment i 9 ml de pepton 0,1%. Se striaz
n plci Petri cu agar de izolare. Se incubeaz 24-48 de ore la 42C, ntr-o
atmosfer microaerofil.
2. Produse lactate.
a) Lapte i crem de ngheat. Se determin i la nevoie se regleaz
pH-ul probei la 7,6. Pentru probele de lapte nefiert se elimin etapa de
prembogire. n cazul probelor lactate procesate se utilizeaz o etap de
prembogire, care dureaz 4 ore. Se cntresc 2 porii de cte 25 ml i
se centrifugheaz la 16.000xg n condiii de refrigerare, 40 de minute. Se
ndeprteaz supernatantul, se recolteaz o ans de sediment i se amestec
cu 1 ml de pepton 0,1%. Se pipeteaz 0,1 ml de suspensie de cultur
emulsifiat ntr-un tub steril i se adaug 0,1 ml de tampon pepton 0,1%.
Se amestec uor i se striaz pe medii de izolare. Plcile se incubeaz 2448 de ore la 42C, n condiii microaerofile.
b) Brnz i unt. Se amestec 2 probe de cte 25 g fiecare cu 100 ml
de pepton 0,1%, la 10.000-12.000 rpm, 30 de secunde. Se filtreaz probele
printr-un tifon steril i se centrifugheaz n condiii de refrigerare la 16.000xg,
timp de 40 de minute. Se ndeprteaz supernatantul i din sediment se fac
nsmnri pe un agar de izolare. Se resuspend un sediment n 100 ml
de bulion de mbogire ce conine suplimentul de antibiotic nr. 1 i un
181

alt sediment se resuspend n 100 ml de bulion de mbogire ce conine


suplimentul antibiotic nr. 3. Se regleaz pH-ul bulioanelor inoculate la 7,5.
3. Carne tocat sau organe. Se centrifugheaz 25 g de prob cu
100 ml de pepton 0,1% la 10.000-12.000 rpm, 15 secunde, dup care se
centrifugheaz n condiii de refrigerare la 2.000 x g timp de 2 minute.
Se transfer supernatantul ntr-o alt cup de centrifug steril i se
centrifugheaz la 5.000 x g pentru 30 minute. Se ndeprteaz supernatantul.
Se resuspend sedimentul n 2 ml de pepton 0,1% i se prepar o diluie
de 1/10 folosind 0,1 ml suspensie i 0,9 ml pepton 0,1%. Se striaz n
plci Petri pe agarul de izolare. Se incubeaz la 42C, 24-48 de ore, ntr-o
atmosfer microaerob. Sedimentul rmas se introduce n 100 ml bulion.
Pentru a crea o atmosfer microaerofil pentru creterea optim a
campilobacteriilor se utilizeaz una dintre urmtoarele metode de producere
de gaze:
sistemul de gaz cu bule fluent:
o se poate folosi o baie marin cu agitator care poate fi reglat la 3
temperaturi (pentru procedura de prembogire de 5 ore) sau la 2 temperaturi
(pentru procedura de 4 ore); incubarea cu agitator este preferabil deoarece
stimuleaz o rat de cretere mult mai rapid; se regleaz baia la 30C i
se plaseaz sacii Stomacher; se conecteaz pipete la liniile de barbotare i
se ncepe producia de gaze; viteza agitatorului se regleaz la 50 rpm; se
incubeaz 3 ore; se regleaz temperatura la 37C i se incubeaz 2 ore; n
final se regleaz temperatura la 42C i se incubeaz 19 ore;
o dac se folosesc prembogiri timp de 5 ore, n baie de ap static,
probele mbogite se incubeaz ntr-o prim etap la 30C pentru 3 ore,
fr barbotare deoarece bulionul devine anaerob i va fi stimulat creterea
clostridiilor; probele mbogite se transfer ntr-o baie de ap la 37C i se
conecteaz pipetele din saci la liniile de barbotare; ncepe formarea gazelor;
dup 2 ore se regleaz la 42C;
o dac se utilizeaz o prembogire de 4 ore, sacii se plaseaz ntrun agitator sau ntr-o baie marin static la 37C; se conecteaz liniile de
barbotare i ncepe producerea gazului; dup 4 ore instalaia se regleaz la
42C i se incubeaz nc 20 de ore;
sistemul de agitare (incubator cu aer):
o dac se folosete procedura de prembogire de 4 ore, se ncepe
incubarea la 37C, dup care se regleaz temperatura la 42C i se incubeaz
20 de ore;
o dac se folosete procedura de prembogire de 5 ore, se plaseaz
sticlele gazate ntr-un incubator cu agitator la 30C i se ncepe agitarea
la 200 rpm; dup 3 ore se ajusteaz temperatura la 37C; dup 2 ore se
182

regleaz la 42C i se incubeaz 19 ore;


sistemul de vase gazate:
o dac se folosete procedura de prembogire de 5 ore vasele se
introduc ntr-un incubator la 30C, pentru 3 ore, iar apoi se transfer la
37C, timp de 2 ore, i n cele din urm la 42C, timp de 19 ore;
o dac se folosete procedura de prembogire de 4 ore, vasele se
incubeaz la 37C, 4 ore i apoi la 42C, 20 de ore.
5.6.2. Izolarea speciilor de Campylobacter
Se striaz mediul de izolare dintr-o plac Petri cu o ans de cultur
bacterian din mediul de mbogire. Probele de lapte (aproximativ 3 ml)
se trec prin filtre de 0,65 microni. Este suficient un filtrat de 0,25-0,5 ml. Se
nsmneaz att culturile filtrate ct i cele nefiltrate. Plcile se plaseaz
n vasele de gazare i se incubeaz la 42C, timp de 24 de ore. Dac dup
4 ore de incubare cultura bacterian nu se dezvolt, aceasta se reincubeaz
48 de ore la 37C.
5.6.3. Identificarea speciilor de Campylobacter
Coloniile tipice de Campylobacter sunt rotunde sau de form
neregulat, de culoare alb pn la incolor cu marginile netede.
Se aleg cel puin 2 colonii per plac i se emulsifiaz pe o lam de sticl
ntr-o pictur de ser fiziologic. Se acoper cu o lamel i se examineaz la
un microscop cu cmp ntunecat sau cu ulei la un microscop cu contrast
de faz. Celulele de Campylobacter sunt curbe cu lungimea de 1,5-5
microni, se execut micri n zig-zag dac preparatul este fcut din medii
solide sau micri n tirbuon n cazul celulelor din bulion. Aproximativ
20% din izolatele de Cam. jejuni nu sunt mobile. Celulele btrne sau
stresate pot prezenta o mobilitate diminuat i o form cocoid. Dac este
necesar resuscitarea plcilor, acestea se pstreaz la 4C, ntr-o atmosfer
microaerofil, ferit de lumin.
5.6.4. Confirmarea campilobacteriilor
Se recolteaz aproximativ 5 colonii caracteristice.
Se transfer 2 colonii bacteriene n sticle cu bulion de confirmare.
Se incubeaz la 42C, ntr-o atmosfer microaerofil 24 de ore, pn cnd
bulionul devine tulbure. Pentru inocularea substanelor biochimice se
folosesc culturi n bulion simplu, iar dac cultura respectiv nu se dezvolt
183

bine n acest mediu, se folosesc bulioane, cu ser bovin fetal. Se studiaz


urmtoarele proprieti:
producia de catalaz: se recolteaz o colonie pozitiv i se testeaz;
prezena bulelor arat c testul este pozitiv;
sensibilitatea la antibiotice: se inoculeaz uniform cu un tampon
steril imersionat n cultura n bulion, suprafaa unei plci Petri cu agar
infuzie de inim, cu 5% snge integral (sau lizat) i FBP 0,25%; se aplic
un disc de cefalotin i unul de acid nalidixic; se incubeaz la 37C, timp de
24-48 de ore, ntr-o atmosfer microaerofil; se msoar zonele de inhibiie
din jurul fiecrui disc; majoritatea tulpinilor de Cam. jejuni sunt sensibile la
acid nalidixic i rezistente la cefalotin;
coloraia Gram: se folosete carbol-fuxin pentru coloraia de
contrast; speciile de Campylobacter sunt Gram negative;
hidroliza hipuratului: se nsmneaz ntr-o eprubet cu soluie de
hipurat o colonie mare de pe placa cu agar infuzie de inim (folosit la testul
de sensibilitate la antibiotice); se incubeaz 2 ore la 37C ntr-o baie marin;
se adaug 0,5 ml de reactiv minhidrin, se agit i se incubeaz 10 minute;
tuburile se citesc rapid, o culoare violet nchis indic o reacie pozitiv;
Cam. jejuni este pozitiv pentru acest test;
agar TSI: se inoculeaz mediul TSI i se incubeaz la 35-37C timp
de 5 zile, n atmosfer microaerob; Cam. jejuni produce o pant i o baz
alcalin, fr producie de hidrogen sulfurat;
utilizarea glucozei: se nsmneaz de 3 ori cu cultura de testat, 2
tuburi cu mediu fermentativ oxidativ; un tub conine glucoz, iar cellalt
numai baz; se incubeaz la 35-37C, timp de 4 zile, ntr-o atmosfer
microaerofil; speciile de Campylobacter nu utilizeaz glucoza sau alte
zaharuri;
testele de catalaz i oxidaz: se inoculeaz din culturi n bulion
o pant de agar cu infuzie de inim i se incubeaz la 35-37C, 48 de ore
ntr-o atmosfer microaerofil; se recolteaz o ans de cultur de pe pant i
se plaseaz ntr-o pictur de peroxid de hidrogen 3%; se adaug o pictur
de oxidaz; dac reactivul devine purpuriu, cultura este considerat oxidaz
pozitiv; Cam. jejuni este catalaz i oxidaz pozitiv;
tolerana la temperatura de cretere: se dilueaz 2 ml din cultura n
bulion cu pepton 0,1%, pn la turbiditatea standard Mc Farland nr. 1; se
striaz o linie n fiecare dintre cele 3 plci cu agar-snge i infuzie de inim
FBP cu o ans de cultur diluat; n fiecare plac se pot inocula 4 culturi; se
incubeaz o plac la 25C, una la 35-37C i a treia la 42C, pentru 3 zile
ntr-o atmosfer microaerofil; dac se produce o turbiditate accentuat n
mediul de cultur, nseamn c testul este pozitiv; Cam. jejuni nu crete la
184

25C, dar se dezvolt la 35-37C i la 42C;


creterea pe agar Mac Conkey: se nsmneaz o ans din cultura
n bulion pe agarul Mac Conkey; pot fi testate pe aceeai plac, pn la 4
culturi diferite; se incubeaz la 35-37C, 3 zile, n condiii microaerofile;
Cam. jejuni se dezvolt pe agarul Mac Conkey;
teste biochimice pe medii semisolide: mediul semisolid conine bulion
Brucella, cu agar 0,18%; se aplic 0,1 ml de cultur diluat pe suprafaa
mediului i se incubeaz 5 zile;
o creterea n glicin 1%: Cam. jejuni este pozitiv;
o creterea n NaCl 3,5%: Cam jejuni este negativ;
o producerea de H2S din cistein: se inoculeaz mediul cu bacteria
de cercetat i se introduce pe lng dopul eprubetei o band de hrtie de
filtru mbibat cu acetat de plumb la aproximativ 1-2 cm distan de mediu:
nnegrirea benzii reprezint reacia pozitiv; Cam jejuni nnegrete banda n
poriunea de deasupra mediului;
o reducerea nitratului: nroirea coloniilor dup adugarea reactivilor
de nitrit este considerat reacie pozitiv; Cam. jejuni reduce nitraii n
nitrii.

185

186

+
+
+

NaCl 3,5 %

H2S, TSI

Catalaz

Oxidaz

Mac Conkey

Mobilitate

Creterea n 1% glicin

Utilizarea glucozei

Hidroliza hipuratului

Rezistena la acid nalidixic

Rezistena la cefalotin

Cam.
jejuni

25C
35-37C
42C
Reducerea nitratului:

Creterea la:

Caractere biochimice

+
+
+

Cam.
coli

+
+
+

+
+
+
+

+
+
+

+
+
-

+
+
+

+
+
+
+

Cam. Cam. fetus Cam.


Cam.
Cam.
Cam
lari subsp. fetus cinaedi fennelliae cryaerophilus hyointestinalis

Tabelul 5.2. Diferenierea speciilor de Campylobacter

+
+
+

Cam. upsaliensis

Medii selective pentru Campylobacter


Mediul

Componenta bazal Componenta


(nutritiv)
selectiv

Skirow

Agar Columbia
snge de cal

Butzler

Agar Columbia
snge defibrinat de
cal

BlaserWang

Agar Columbia
snge de berbec ori
snge de cal

Campy-ic

Agar nutritiv Campylobacter snge de


berbec 7-10%

Campylosel
Agar Columbia
(biosnge de berbec 5%
Mrieux)

Preston

Agar de baz Campylobacter snge


de cal

Tabelul 5.3.

Aspectul coloniilor

Vancomicin
Trimetoprim
Polimixin

- 1-2 mm
- semitransparente
- rotunde, bombate
- suprafa umed
- tendin de a se ntinde pe striuri

Novobiocin

- 1-2 mm
- semitransparente, gri-metalic,
strlu- citoare
- rotunde
- nehemolitice

Vancomicin
Trimetoprim
Cephalothin
Amfotericin
B
Polimixin B
Vancomicin
Rifampicin
Cefalotin
Trimetoprim
Colistin
Cefoprazon
Colistin
Vancomicin
Amfotericin
B
Polimixin B
Rifampicin
Trimetoprim
Cicloheximid
Hemin
Piruvat de Na
Cefoperazon
Vancomicin
Cicloheximid

Karmali

Agar Columbia
crbune activat

CCDA

Agar nutritiv crbune


activat
Cefoperazon
Hidrolizat de cazein Amfotericin
Sulfat feros
B
Piruvat de Na
187

- 1-2 mm
- semitransparente, gri, umede
- rotunde, de mrimi diferite
- nehemolitice
- 1-2 mm
- rotunde, bombate
- de culoare gri-castaniu
- cu tendina de a se ntinde pe
striu
- 1-2 mm
- translucide
- plate, cu margini neregulate
- cu tendin de ntindere pe striu
- nehemolitice
- 1 mm
- semitransparente
- preponderent rotunde
- 3-5 mm
- semitransparente
- mucoase
- de form neregulat cu tendin
de a se ntinde pe striu
- 2-3 mm
- semitransparente
- polimorfe, rotunde
- deseori mucoide

Campylobacter jejuni. Frotiu din cultur de pe mediu solid. Bacili n form de virgul
sau litera S, dar i forme mai lungi, ct i scurte cocoide

Campylobacter fetus. Hemocultur. Coloraia


Gram. Se remarc prezena bacteriilor poliforme cu predominan a formelor ncurbate,
n form de S sau spiralate

Campylobacter fetus. subsp. intestinalis.


Agar cu snge
188

Campylobacter sp. Agar cu snge


Campy

Campylobacter jejuni. Microscopie


electronic Flageli bipolari

Campylobacter jejuni

Campylobacter fetus. Agar tioglicolat

Campylobacter lari - rezistent; Campylobacter jejuni subsp. jejuni - sensibil. Scopul acestui test este acela de a determina sensibilitatea unui microorganism la acid nalidixic. Este
de obicei folosit pentru identificarea lui Cam. lari. Discul cu acid nalidixic se plaseaz
n centrul plcii Petri i se incubeaz, dup nsmnare n condiii microaerofile. Dac
apare o zon de inhibiie mai mare de 5-7 mm (msurat de la marginea coloniilor) cultura respectiv este considerat pozitiv.

Campylobacter sp. Agar Campy.


189

Bibliografie selectiv
1.

Achtman, M., K. Zurth, G. Morelli, G. Torrea, A. Guiyoule, and E. CRNAiel.


1999. Yersinia pestis, the cause of plague, is a recently emerged clone of Yersinia
pseudotuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:14043-14048.

2.

Adak, G. K., J. M. Cowden, S. Nicholas, and H. S. Evans. 1995. The Public


Health Laboratory Service national case-control study of primary indigenous
sporadic cases of campylobacter infection. Epidemiol. Infect. 115:15-22.

3.

Altekruse, S. F., N. J. Stern, P. I. Fields, and D. L. Swerdlow. 1999. Campylobacter


jejuni-an emerging foodborne pathogen. Emerg. Infect. Dis. 5:28-35.

4.

Bolton, F. J., S. B. Surman, K. Martin, D. R. A. Wareing, and T. J. Humphrey.


1999. Presence of Campylobacter and Salmonellae in sand from bathing beaches.
Epidemiol. Infect. 122:7-13.

5.

Bolton, F. J., D. R. A. Wareing, M. B. Skirrow, and D. N. Hutchinson. 1992.


Identification and biotyping of campylobacters, p. 151-161. InR. G. Board, D.
Jones, and F. A. Skinner (ed.), Identification methods in applied and environmental
microbiology. Blackwell Scientific Publications Ltd., London, United Kingdom.

6.

Bygraves, J. A., R. Urwin, A. J. Fox, S. J. Gray, J. E. Russell, I. M. Feavers,


and M. C. J. Maiden. 1999. Population genetic and evolutionary approaches to
the analysis of Neisseria meningitidis isolates belonging to the ET-5 complex. J.
Bacteriol. 181:5551-5556.

7.

Embley, T. M. 1991. The linear PCR reaction: a simple and robust method for
sequencing amplified rRNA genes. Lett. Appl. Microbiol. 13:171-174.

8.

Enright, M., and B. G. Spratt. 1998. A multilocus sequence typing scheme for
Streptococcus pneumoniae: identification of clones associated with serious
invasive disease. Microbiology 144:3049-3060.

9.

Feavers, I. M., S. J. Gray, R. Urwin, J. E. Russell, J. A. Bygraves, E. B.


Kaczmarski, and M. C. J. Maiden. 1999. Multilocus sequence typing and antigen
gene sequencing in the investigation of a meningococcal disease outbreak. J.
Clin. Microbiol. 37:3883-3887.

10. Harrington, C. S., F. M. Thomson Carter, and P. E. Carter. 1997. Evidence for
recombination in the flagellin locus of Campylobacter jejuni: implications for the
flagellin gene typing scheme. J. Clin. Microbiol. 35:2386-2392.
11. Heuvelink, A. E., J. J. H. C. Tilburg, N. Voogt, W. van Pelt, W. J. van Leeuwen,
J. M. J. Sturm, and A. W. van de Giesen. 1999. Surveilance of zoonotic bacteria
among farm animals (Dutch). RIVM-report 285859-009. RIVM, Bilthoven, The
Netherlands.
12. Holmes, E. C., R. Urwin, and M. C. J. Maiden. 1999. The influence of
recombination on the population structure and evolution of the human pathogen
190

Neisseria meningitidis. Mol. Biol. Evol. 16:741-749.


13. Hudson, J. A., C. Nicol, J. Wright, R. Whyte, and S. K. Hasell. 1999. Seasonal
variation of Campylobacter types from human cases, veterinary cases, raw
chicken, milk and water. J. Appl. Microbiol. 87:115-124.
14. Huson, D. H. 1998. SplitsTree: a program for analysing and visualising
evolutionary data. Bioinformatics 14:68-73.
15. Jackson, C. J., A. J. Fox, D. M. Jones, D. R. Wareing, and D. N. Hutchinson. 1998.
Associations between heat-stable (O) and heat-labile (HL) serogroup antigens of
Campylobacter jejuni: evidence for interstrain relationships within three O/HL
serovars. J. Clin. Microbiol. 36:2223-2228.
16. Jolley, K. A., J. Kalmusova, E. J. Feil, S. Gupta, M. Musilek, P. Kriz, and M.
C. J. Maiden. 2000. Carried meningococci in the Czech Republic: a diverse
recombining population. J. Clin. Microbiol. 38:4492-4498.
17. Ketley, J. M. 1997. Pathogenesis of enteric infection by Campylobacter.
Microbiology 143:5-21.
18. Konkel, M. E., S. A. Gray, B. J. Kim, S. G. Garvis, and J. Yoon. 1999. Identification
of the enteropathogens Campylobacter jejuni and Campylobacter coli based on
the cadF virulence gene and its product. J. Clin. Microbiol. 37:510-517.
19. Kumar, S., K. Tamura, and M. Nei. 1994. MEGA: molecular evolutionary genetics
analysis software for microcomputers. Comput. Appl. Biosci. 10:189-191.
20. Maiden, M. C. J. 2000. High-throughput sequencing in the population analysis of
bacterial pathogens of humans. Int. J. Med. Microbiol. 290:183-190.
21. Maiden, M. C. J., J. A. Bygraves, E. Feil, G. Morelli, J. E. Russell, R. Urwin,
Q. Zhang, J. Zhou, K. Zurth, D. A. Caugant, I. M. Feavers, M. Achtman, and
B. G. Spratt. 1998. Multilocus sequence typing: a portable approach to the
identification of clones within populations of pathogenic microorganisms. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 95:3140-3145.
22. Maynard Smith, J. 1991. The population genetics of bacteria. Proc. R. Soc.
London B 245:37-41.
23. Maynard Smith, J., C. G. Dowson, and B. G. Spratt. 1991. Localized sex in
bacteria. Nature 349:29-31.
24. Maynard Smith, J., N. H. Smith, M. ORourke, and B. G. Spratt. 1993. How
clonal are bacteria? Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4384-4388.
25. Nachamkin, I., B. M. Allos, and T. Ho. 1998. Campylobacter species and GuillainBarre syndrome. Clin. Microbiol. Rev. 11:555-567.
26. Nachamkin, I., H. Ung, and C. M. Patton. 1996. Analysis of HL and O serotypes
of Campylobacter strains by the flagellin gene typing system. J. Clin. Microbiol.
191

34:277-281.
27. Parkhill, J., B. W. Wren, K. Mungall, J. M. Ketley, C. Churcher, D. Basham, T.
Chillingworth, R. M. Davies, T. Feltwell, S. Holroyd, K. Jagels, A. V. Karlyshev,
S. Moule, M. J. Pallen, C. W. Penn, M. A. Quail, M. A. Rajandream, K. M.
Rutherford, A. H. van Vliet, S. Whitehead, and B. G. Barrell. 2000. The genome
sequence of the food-borne pathogen Campylobacter jejuni reveals hypervariable
sequences. Nature 403:665-668.
28. Peabody, R., M. J. Ryan, and P. G. Wall. 1997. Outbreaks of Campylobacter
infection: rare events for a common pathogen. Communicable Dis. Rep. 7:R33R37.
29. Penner, J. L., J. N. Hennessy, and R. V. Congi. 1983. Serotyping of Campylobacter
jejuni and Campylobacter coli on the basis of thermostable antigens. Eur. J. Clin.
Microbiol. 2:378-383.
30. Selander, R. K., D. A. Caugant, H. Ochman, J. M. Musser, M. N. Gilmour, and
T. S. Whittam. 1986. Methods of multilocus enzyme electrophoresis for bacterial
population genetics and systematics. Appl. Environ. Microbiol. 51:837-884.
31. Skirrow, M. B. 1994. Diseases due to Campylobacter, Helicobacter and related
bacteria. J. Comp. Pathol. 111:113-149.
1.

Simona Ivana, 2002 Bacteriologie veterinar special (Ed. Ceres, Bucureti;


460 pagini), ISBN: 973-40-0568-5

2.

Simona Ivana, 2005 Bacteriologie general (Ed. tiinelor medicale, Bucureti;


250 pagini), ISBN: 973-86485-7-2

3.

Simona Ivana, 2006 Tratat de bacteriologie medical-veterinar i introducere


n micologie (Ed. tiinelor medicale, Bucureti;768 pagini), ISBN (10) 97386571-5-6; ISBN (13) 978-973-86571-5-1

4.

Simona Ivana, 2007 Manual de microbiologia alimentelor (Ed. tiinelor


medicale, Bucureti; 160 pagini), ISBN: 978-973-86571-3-7

5.

Simona Ivana, 2007 Microbiologie medical veterinar, Vol. I (Ed. tiinelor


medicale, Bucureti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-01-6

6.

Simona Ivana, 2007 Microbiologie medical veterinar, Vol. II (Ed. tiinelor


medicale, Bucureti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-02-3

7.

Simona Ivana, 2008, Microbiologia alimentelor, Ed. Orizonturi, ISBN: 978-973736-090-8

8.

Simona Ivana, 2008, Practical guide of microbiogical diagnosis, Ed. Orizonturi,


ISBN: 978-973-736-089-2
192

9.

Slater, E., and R. J. Owen. 1998. Subtyping of Campylobacter jejuni Penner


heat-stable (HS) serotype 11 isolates from human infections. J. Med. Microbiol.
47:353-357.

10. Staden, R. 1996. The Staden sequence analysis package. Mol. Biotechnol. 5:233241.
11. uerbaum, S., J. Maynard Smith, K. Bapumia, G. Morelli, N. H. Smith, E.
Kunstmann, I. Dyrek, and M. Achtman. 1998. Free recombination within
Helicobacter pylori. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:12619-12624.
32. Walker, R. I., M. B. Caldwee, E. Lee, P. Guerry, T. J. Trust, and G. M. RuizPalacios. 1986. Pathophysiology of Campylobacter enteritis. Microbiol. Rev.
50:81-94.
33. Wareing, D. 1999. The significance of strain diversity in the epidemiology of
Campylobacter jejuni gastrointestinal infections. Ph.D. thesis. University of
Central Lancashire, Preston, United Kingdom.
34. Wassenaar, T. M., and D. G. Newell. 2000. Genotyping of Campylobacter species.
Appl. Environ. Microbiol. 66:1-9.

193

CAPITOLUL 6
Toxiinfecii alimentare de origine
bacterian cu inciden redus
6.1. Genul Aeromonas
6.1.1. Taxonomie
Interesul tiinific fa de bacteriile din genul Aeromonas a crescut
foarte mult ncepnd cu anul 1980, cnd s-a demonstrat patogenitatea lor
pentru om i animale, i mai ales asocierea unora dintre specii cu bolile
gastrointestinale la oameni, cu alur de toxiinfecii alimentare.
S-au izolat, de la muli copii cu diaree, specii de Aeromonas
productoare de enterotoxine.
Din momentul demonstrrii semnificaiei lor patogene s-au ntreprins
numeroase cercetri referitoare la taxonomia complicat a genului i la
factorii de virulen implicai n infeciile umane i animale.
Dei continu s existe ideea c toxiinfecia alimentar ar fi provocat
numai de A. hydrophila specia tip a genului n realitate aceast mbolnvire
poate fi cauzat i de alte specii, n primul rnd de A. sobria.
Genul Aeromonas cuprinde 14 specii. Speciile clasice ale grupului
psichrofil (A. salmonicida, cu subspeciile sale) i ale grupului mezofil (A.
hydrophila, A. caviae, A. sobria) sunt de fapt fenospecii, n care analizele
prin hibridare DNA-RNA au delimitat 12 grupe de hibridare (HG) care, dat
fiind homologia de 70-100% n cadrul unei grupe de hibridare, au cptat
rang de genospecii:
A. hydrophila = HG1;
A. salmonicida = HG3;
A. caviae = HG4;
A. media = HG5;
A. eucremephila = HG6;
A. sobria = HG7;
A. veronii biovar sobria = HG8;
A. jandaei = HG9;
194

A veronii biovar veronii = HG10;


A. schubertii = HG12.
Au rmas nenumite HG2 i HG11.
La acestea se adaug noi specii, care au fost definite pe criteriul
secvenierii RNAr 16S:
A. allosaccharophila;
A. trota.
Analiza secvenial a RNA-ului subunitii ribozomale justific pentru
aeromonade rangul de familie.
6.1.2. Morfologie
Aeromonadele sunt bacili Gram negativi, uneori cu aspect cocoid, de
0,3-1 micron grosime/1-3,5 microni lungime, drepi, indistinci de bacilii
coliformi.
Sunt monotrichi, cu un mic flagel polar, n mediile lichide i pot deveni
peritrichi n culturile tinere pe mediile agarizate.
Toate subspeciile de A. salmonicida sunt atriche (imobile).
Sunt necapsulogeni i nesporogeni.
6.1.3. Condiii de cultivare i caractere culturale
Germeni facultativ anaerobi, nepretenioi nutritiv, tolerani pn la
4% NaCl, pH 5-9 sau sruri biliare.
Pot fi mbogii n ap peptonat alcalin i cresc bine pe medii
selective uzuale pentru izolarea enterobacteriaceelor i a vibrionilor.
Speciile mezofile se cultiv optim la 35-37C i formeaz n 24 de
ore colonii cu diametrul de 3-5 mm, cenuii, uor rugoase. Coloniile de A.
caviae sunt nehemolitice.
Multe tulpini ale altor specii sunt beta hemolitice pe agar cu snge de
berbec, iar la o examinare superficial pot fi confundate cu Pseudomonas
aeruginosa, fr a avea ns luciu metalic sau arome caracteristice bacilului
piocianic.
Exist tulpini care produc hemoliz dubl, format dintr-o zon extern
de hemoliz incomplet i una intern, complet de beta hemoliz.
A. salmonicida este specia tip a genului, este psichrofil, patogen
pentru peti i se cultiv optim la 22-25C, formnd pe medii cu 1 tirozin
un pigment brun, hidrosolubil.
Pentru izolare se folosesc medii speciale, cum ar fi mediul Difcofurunculosis-agar.
195

Tabel 6.1.
Criteriile de difereniere ale subspeciilor din specia A. salmonicida
(dup Quinn i col., 1994)
A. salmonicida
Pigment Gaz din
Catalaz
Importana patogen
(subspeciile)
brun
glucoz
+
+
+
Furunculoz (tulpini tinere)
Subsp. salmonicida
Eritrodermatit la crap
Subsp. nova
Se izoleaz de la salmonide i
Subsp. achromogenes
+
sunt considerate tulpini atipice
+
+
Subsp. masoucida

Dei aeromonadele sunt bacterii fr cerine nutritive speciale, putnd


crete uor pe medii simple, izolarea lor din alimente i materiale patologice
este posibil numai prin folosirea mediilor selective, pe suprafaa crora se
striaz materialul de cercetat i pe care se dezvolt colonii caracteristice,
dup o incubare de 24-48 de ore la 35C.
Menionm cteva dintre aceste medii selective:
agarul nutritiv cu snge de oaie i ampicilin (SB-A);
agarul cu amidon i ampicilin;
agarul de difereniere pentru Aeromonas (ADA);
agarul selectiv Pseudomonas-Aeromonas (GSP-agar).
De pe suprafaa mediilor selective inoculate i incubate se aleg cte
5 colonii caracteristice, care se nsmneaz fiecare n cte o eprubet cu
bulion nutritiv i alta cu agar nutritiv nclinat, care constituie cultura ce se
supune testelor de diagnostic menionate mai sus.
6.1.4. Ecologie
Aeromonadele se izoleaz curent din apele dulci (ruri, lacuri, fntni,
rezervoare de ap), din coninutul gastrointestinal al petilor, batracienilor,
reptilelor i a unor vertebrate superioare, de unde contamineaz uor solul i
produsele agricole. Prezena lor n biotipurile marine este ocazional.
La om produc gastroenterite. Acioneaz toxic prin elaborarea a dou
enterotoxine, dintre care una este aerolizina (citolizin bet-hemolitic), iar
alta o citotoxin.
Exist mai multe aerolizine distincte imunologic i genetic, dar cu
mecanism de aciune unic. Aerolizinele produse de A. hydrophila i A.
veronii prezint cele mai strnse nrudiri imunologice.
Infeciile extradigestive sunt reprezentate de infecii ale plgilor,
bacteriurii, iar la gazdele imunocompromise (anemie aplastic, leucemie,
196

sarcoame, ciroz hepatic), infecii sistemice.


A. salmonicida produce furunculoz la somn, iar A. hydrophila este
patogen pentru broate, la care produce infecia numit red leg.
La peti produce infecii locale sau septicemie. Elaboreaz o endotoxin
i o hemolizin, care acioneaz cooperant.
6.1.5. Diagnostic
Tipurile de Aeromonas pot fi confundate cu Escherichia, Enterobacter,
Providencia, ns spre deosebire de enterobacteriacee sunt oxidaz pozitive
(tabelul 6.2).
Tabel 6.2
Teste minimale pentru diferenierea ntre genurile:
Vibrio, Aeromonas i Plesiomonas (dup Buiuc D., 1999)
Vibrio
Testula

Oxidaza
Creterea pe agar cu:
0% NaCl
6% NaCl

Aeromonas

Plesiomonas

+b

+
-

+
-

Nonhalofil

Halofil

+
+
+

Glucoz:
+
+
+
+
Fermentarea
-c
v
Producere de gaz
d
+
+
Testul uviei DNA
Rezistena la:
-c
v
+
O/129 (10 g)
-e
v
+
O/129 (150 g)
v
+
Ampicilin (10 g)
a
Simboluri: + = reacie pozitiv (pentru testele de rezisten: rezistent); - = reacie
negativ (pentru testele de rezisten: sensibil); v = diferit la diferite specii.
b
Cu excepia V. metschnikovii.
c
Cu excepia V. furnissi i rare tulpini de V. damsella.
d
Cu excepia unor tulpini de V. parahaemolyticus.
e
Cu excepia A. trota.

Teste definitive. Identificarea speciilor de Aeromonas poate fi fcut


prin bateria de teste recomandate n tabelul 1.7.
197

Testele adiionale sunt necesare pentru diferenieri corecte ntre


grupele A. hydrophila, HG2 A. salmonicida (utilizarea DL-lactatului i
acidului urocanic, fermentarea D-rhamnozei).
A. caviae A. media (utilizarea DL-lactatului, fermentarea manozei,
producerea de pirazinamidaz i beta-hemoliz), dar rmn de competena
laboratoarelor de referin.
De altfel, erorile pentru izolatele cu semnificaie clinic sunt semnificative, dat fiind diferena de patogenitate ntre A. hydrophila i A. caviae, pe
de o parte i speciile cu care pot fi confundate, pe de alt parte.
A. allosaccharophila nu poate fi identificat corect n laboratorul clinic
date fiind multiplele asemnri fenotipice cu alte specii.
Ca markeri epidemiologici, accesibili numai laboratoarelor de
referin, sunt de reinut grupele serologice O i ribotiparea.
Tabel 6.3.

Caracterul
LDC
ODC
ADH
Indol
VP
Hemoliz
Esculin
Glucoz**
Arabinoz**
Celobioz*
Manitol*
Zaharoz*
Salicin

Caractere biochimice ale speciilor din genul Aeromonas


(dup Euzeby, 1993)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11

12

+
V
V
+
V
V
+
V
+
+
+
-

+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+

+
+
v
+
+
+
+
+
+

+
+
+
+
+
+
-

+
+
+
+
+
+
+
+

+
+
+
+
+
+
+
+
+
+

Legend:
* Are loc acidifierea.
** Produce gaz din glucoz.
1 = A. allosaccharophila;
2 = A. caviae;
3 = A. enteropelogenes;
4 = A. eucrenophila;
5 = A. hydrophila;

+
+
+
+
+
+
-

+
+
+
+
+
+
+
6 =
7 =
8 =
9 =
10 =
11 =
12 =

198

+
+
+
+
-

+
+
+
+
+
v
+
+
-

+
+
+
v
+
+
+
-

A. ichthiosmia;
A. jandae;
A. schubertii;
A. sobria;
A. trota;
A. veronii (sobria);
A. veronii (veronii)

+
+
+
+
+
+
v
+
+
-

6.2. Genul Plesiomonas


Conine specia P. shighelloides, care este un bacil Gram negativ,
cilogen. Are form de bastona drept, cu capetele rotunjite (0,8-1-3 microni),
grupat izolat, n perechi sau n lanuri scurte, asporogene, acapsulogene.
Este o bacterie nepretenioas nutritiv, facultativ anaerob, catalaz i
oxidaz pozitiv. Metabolismul este fie respirator, fie fermentativ.
Fermenteaz hidraii de carbon cu producere de acid, dar nu i de
gaze.
Cele mai multe tulpini se dezvolt pe medii minerale, care conin o sare
de amoniu, ca unic surs de azot i glucoza, ca singur surs de carbon.
Nu elaboreaz exofermeni ca fosfataz, lipaz, deoxiribonucleaz
i proteinaze. Decarboxileaz lizina, ornitina i arginina. Reduc nitraii n
nitrii, produc indol i nu produc acetilmetilcarbinol, hidrogen sulfurat,
fenildezaminaz, gelatinaz. Nu hidrolizeaz malonatul i nu pot folosi
citratul ca unic surs de carbon. Dau reacia KCN negativ.
Un caracter biochimic important al bacteriilor din genul Plesiomonas
este fermentarea inozitolului, caracter care lipsete la toate genurile cu care
se aseamn.
Se cultiv pe medii uzuale ntre 8 i 45C, la pH 4,5-8,5.
Nu necesit suplimentarea cu sare a mediilor de cultur. Pe agar snge,
dup 24 de ore de incubare la 37C formeaz colonii rotunde, cu diametrul
de 1-2 mm, convexe, cenuii, nehemolitice.
Majoritatea tulpinilor sunt sensibile la vibriostaticul 0-129 (2-4
diamino-6,7 diizopropil-pteridin).
n acest gen este ncadrat o singur specie P. shighelloides care
mai nainte a fost repartizat de diferii cercettori ntr-unul din genurile sau
familiile apropiate: Aeromonas, Vibrio, Pseudomonas, Enterobacteriaceae,
de care se deosebete printr-o serie de caractere proprii, menionate mai
sus.
S-a constatat c aceast specie bacterian are un antigen O comun
cu Shigella sonnei (de unde i numele), iar Sakazaki i colaboratorii, pe
baza studiului serologic la 57 de tulpini, le-au mprit n 16 grupe O. P.
shighelloides se izoleaz frecvent din apele dulci i estuariene, cu poluare
fecal. Concentraiile realizate sunt dependente de temperatura ambiant,
mari vara i mici iarna.
Bacteria a fost izolat din sedimente estuariene de la ipari, peti,
batracieni, crabi, scoici, precum i din fecale de om i maimu, ganglioni
limfatici de cine, embrioni de pui mori.
199

Poate determina ocazional diaree acut. Autorii japonezi au descris un


episod de gastroenterit infecioas, la om, produs de aceast bacterie.

6.3. Genul Photobacterium


Bacteriile ncadrate n genul Photobacterium au form cocobacilar,
mai rar bacilar, mici (1-2,5/0,4-1 microni), dispuse izolat i, rar, n perechi,
asporogene, acapsulogene, de obicei mobile, Gram negative, facultativ
anaerobe.
Au un metabolism respirator sau fermentativ, oxidaz pozitive.
Fermenteaz hidraii de carbon, cu producere de gaze. n general,
fermenteaz hexozele, dar nu i pentozele i hidraii de carbon mai compleci.
Produc amoniac din pepton, nitrii din nitrai, decarboxileaz lizina, dar nu
i ornitina.
Reacia Voges-Proskauer i pepton sunt pozitive. Diger chitina
rar, lichefiaz gelatina slab, nu hidrolizeaz amidonul. Sunt sensibile la
cloramfenicol, streptomicin, polimixina D i vibriostaticul O/129.
Se dezvolt pe medii nutritive obinuite, la un pH 6-9. Unele tulpini
sunt halofile, neputndu-se dezvolta n bulionul nutritiv, dac nu conine
2-3% clorur de sodiu.
Concentraia optim de sare din mediile nutritive pentru aceste bacterii
este de 3%, majoritatea tulpinilor dezvoltndu-se la concentraii de 0,5-5%.
Temperatura optim de dezvoltare este de 20-30C.
n condiii convenabile acestei bacterii produc luminescen de unde i
numele dat genului. Aceast proprietate se pierde n urma trecerilor repetate
pe mediile artificiale.
Habitatul obinuit al acestor bacterii l formeaz apa marin, suprafaa
corporal a unor specii de peti marini, precum i organele unor peti i
cefalopode.
Pot contamina petele i produsele din pete, i n condiii convenabile
de multiplicare concur la alterarea lor.
Speciile ncadrate n acest gen, sunt: P. phosphoreum; P. angustum; P.
leiognathi.

6.4. Genul Brucella


Genul Brucella face parte din familia Brucellaceae.
Cuprinde ase specii: Bru. abortus, Bru. melitensis, Bru. suis, Bru.
canis, Bru. neotomae, Bru. ovis.
n cadrul primelor trei specii au fost identificate mai multe biovaruri.
200

Speciile se difereniaz prin susceptibilitatea lor la fagi. Bru. melitensis,


Bru. abortus, Bru. ovis sunt subdivizate n 3,7 i respectiv 5 biovaruri, pe
baza urmtoarelor teste suplimentare:
55necesitatea prezenei de dioxid de carbon;
55producia de hidrogen sulfurat;
55creterea n prezena coloranilor pe baz de tiamin i fucsin
bazic i aglutinarea serurilor monospecifice anti A i anti M.
Istoric. Marston, n anul 1861, semnaleaz pentru prima dat la om o
infecie pe care o denumete febra de Malta.
n 1887, David Bruce a izolat primul reprezentant al genului, din
splinele soldailor britanici mori, pe care l-a denumit iniial Micrococcus
melitensis, dup numele dat de localnici insulei lor (Melita).
n 1897, Bang i Stribold, n Danemarca, au izolat o bacterie
asemntoare, de la vaci, care au avortat.
Pe 21 iunie 1905, Horrocks a izolat Bru. melitensis din laptele unei
capre, infectate natural. Investigaiile ulterioare au artat c peste 40%
din caprele de Malta erau serologic pozitive, iar multe dintre ele aparent
sntoase excretau Bru. melitensis n lapte.
n 1918, Alice Ewans, n SUA, propune constituirea genului Brucella
(n cinstea lui Bruce), n care ncadreaz dou specii: Bru. melitensis i
Bru. abortus, fiind prima care a fcut legtura ntre micrococul lui Bruce i
bacilul lui Bang.
Meyer i Shaw (1920) au confirmat cercetrile ntreprinse de Alice
Evans i au propus crearea genului Brucella, cu dou specii: Bru. melitensis
i Bru. abortus.
n 1929, Huddleson a izolat Bru. suis, care fusese mult timp considerat o varietate suin a bacilului lui Bang.
Bruceloza este considerat de ctre OMS ca fiind cea mai rspndit
zoonoz.
n ara noastr, bruceloza a fost identificat pentru prima dat n 1923,
de ctre Flcoianu i Mihilescu la bovine, n 1934 de Pop Al. la porcine,
iar n 1958 la iepuri i berbeci.
La om a fost semnalat de ctre Combiescu n 1939.
Morfologie. Brucelele sunt cocobacili fini de 0,5-0,7 microni n
diametru i 0,6-1,5 microni n lungime, dispui izolat i mai rar, n perechi,
lanuri scurte sau mici aglomerri, Gram negativi. n general, se coloreaz
palid i de aceea, este indicat prelungirea la 1-3 minute a recolorrii cu
safronin sau fuxin.
Sunt nesporogeni, necapsulogeni i imobili. Prezint un grad redus de
acidorezisten, care st la baza coloraiilor speciale: Kster, Kozlowsky,
201

Stamp i, mai ales metoda Kster modificat, recomandat de ctre OMS.


Condiii de cultivare i caractere culturale. Brucelele sunt organisme
exigente care pot fi cultivate pe medii de calitate, suplimentate cu glucoz,
ser sangvin sau snge. Infuzia de ficat, frecvent utilizat n trecut, este n
prezent nlocuit cu bulionul i agarul cu triptoz de soia. Agarul triptoz cu
5% ser bovin a devenit mediul standard pentru izolarea brucelelor, pentru
c satisface exigenele nutritive ale pretenioaselor tulpini de Bru. ovis i
Bru. abortus, biogrup 2, ca i a altor tulpini de Bru. abortus grup 3 i 4.
Hemoculturile trebuie fcute n medii difazice (R. M. Mnzat).
Izolarea brucelelor din prelevatele contaminate, impune suplimentarea
mediilor cu amestecuri selective compuse din bacitracin (25 UI/ml),
polimixin B (50 UI/ml), ciclohexamin (100 mg/ml) i nistatin (100 UI/
ml).
Din punct de vedere respirator, brucelele sunt aerobe i carboxifile.
Necesit la cultivare anumii aminoacizi i vitamine i nu cresc pe agarul
Mac Conkey. Pentru cretere sunt necesare tiamina, nicotinamida i biotina.
Creterea poate fi stimulat prin adaos de ser normal, n proporie de 5-10%.
Creterea este inhibat pe medii care conin sruri biliare, telurit sau selenit.
Tulpinile de Bru. abortus biovar 2 sunt cele mai sensibile la inhibitori.
Temperatura optim pentru toate speciile de brucele este de 36-38C;
pH-ul corespunztor este n jur de 7.
Aciditatea excesiv (de ex: fermentaia unor brnzeturi) omoar rapid
celulele de Brucella.
La izolare creterea brucelelor este lent i de aceea culturile incubate
aerob n atmosfer cu 5-10% dioxid de carbon trebuiesc urmrite pn la 10
zile, iar hemoculturile pn la 3 sptmni.
Cultivate n medii lichide, dup cteva zile de incubare produc o
turbiditate moderat cu depozit cenuiu i uneori inel la suprafa, producnd
i alcalinizarea mediului (pH 8). Creterea este slab dac nu se asigur o
aerare corespunztoare.
Creterea n medii lichide statice favorizeaz disocierea coloniilor din
netede n lucioase.
Pe agar cu 1% glucoz i 5% ser sangvin ori pe medii similare, dup
48 de ore la 37 de grade Celsius apar coloniile de Brucella care sunt rotunde,
convexe, de 0,1-1 milimetru n diametru i cresc n urmtoarele 4-5 zile
pn la 2-7 milimetri. Pe agar-snge sunt nehemolitice.
Pe cartoful glicerinat formeaz colonii lucioase de culoare glbuie,
care se pigmenteaz prin nvechire n brun ocolatiu.
n cazul mediilor semisolide, Bru. abortus CO2 dependent produce
un disc de civa milimetri, sub suprafaa de cretere, n timp ce tulpinile CO2
202

independente de Bru. melitensis i Bru. suis produc o turbiditate uniform


de la suprafa spre profunzime, pe o adncime de civa milimetri.
Pe mediile solide, coloniile din culturile primare sunt de tip S
(cu excepia lui Br. ovis i Br. canis, care dau colonii de tip R), dar prin
nvechire i treceri repetate apare la brucele, un fenomen de disociere
spontan n toate cele trei tipuri culturale principale (S, R, M). Acestea se
pot diferenia prin examinarea lor n lumin oblic (Henry, 1932), ct i
pe baza caracterelor culturale n medii lichide, a stabilitii suspensiilor n
soluie cloruro-sodic i a aglutinabilitii suspensiilor nclzite la 90 de
grade Celsius (testul Burnet) sau tratate cu soluie de tripaflavin 1/1000
(testul Panama). Astfel, coloniile de tip S dau o suspensie omogen cu
aceast soluie, iar cele de tip R i M aglutineaz.
Coloniile S examinate n lumin transmis apar galben-deschise,
transparente, cu aspect caracteristic de picturi de miere, iar n lumin
reflectat prezint suprafaa neted, strlucitoare, cu transparen cenuiu
albstruie.
Coloniile R, mai puin transparente, au suprafaa mai granular, alb
mat sau alb glbuie i sunt fragile sau vscoase, dificil de detaat complet
de pe suprafaa mediului.
Coloniile netede sunt mai patogene, n timp ce variantele rugoase sunt
mai puin virulente. De aceea examinarea morfologiei coloniilor dintr-o
cultur prezint o importan deosebit n producerea de vaccinuri vii i n
antigene de diagnostic.
Longevitatea n culturi este de aproximativ 2 luni.
Diferenierea speciilor se poate face pe baza testului de cromobacteriostaz, care const n examinarea aciunii inhibante asupra multiplicrii
germenilor a unor substane colorante (tionina, fuxina etc.) adugate n
diferite concentraii la mediul Huddleson.
Proprieti biochimice. Brucelele prezint proprieti fermentative
slabe, reduc nitraii n nitrii, nu produc indol, utilizeaz citratul de amoniu
ca unic surs de carbon, lichefiaz gelatina, iar testul Voges-Proskauer i
testul roului metil sunt pozitive.
Caracterele biochimice permit diferenierea speciilor prin activitatea
ureazic i prin producerea de hidrogen sulfurat.
Proprieti antigenice i imunogene. La speciile clasice de brucele
(abortus, melitensis, suis) s-au evideniat n faza S dou componente de
nveli solubile, de natur polizaharidic, i anume:
factorul antigenic M (de la melitensis);
factorul antigenic A (de la abortus).
203

Cei doi factori antigenici difer cantitativ de la o specie la alta.


Alte dou antigene majore (R i Z) au fost identificate ulterior la
celelalte specii. Ca urmare, identificarea serologic a speciilor este posibil
numai pentru seruri aglutinante (adsorbite), antimelitensis (anti M) i
antiabortus (anti A), inndu-se seama de titrurile reaciilor obinute n
raport cu titrurile celor dou seruri imune de referin.
Specii de brucele implicate n infeciile zoonotice
Speciile de brucele care transmit bruceloza la om sunt Brucella
melitensis, care afecteaz oile i caprele, Brucella abortus, care afecteaz
bovinele i Brucella suis, patogen pentru porcine.
Infecia se transmite prin contact direct sau indirect cu animalul infectat.
Are loc o infecie primar a sistemului reticuloendotelial cu bacteriemie i
febr ondulant. Infecia produce leziuni de tip granulomatos care pot afecta
diferite esuturi i organe. n urma bolii pot aprea sechele osteoarticulare,
cardiace i neurologice.
n urma administrrii antibioterapiei adecvate se produce vindecarea
n aproximativ 6 luni.
La animale brucelele se localizeaz la nivelul placentei (producnduse avort sau ftarea de produi infectai) sau a ugerului. Contaminarea
mediului se face prin excreie genital.
Transmiterea bolii la om se poate realiza i prin consum de lapte
nepasteurizat, brnz i alte produse din lapte.
Bruceloza nc este considerat endemic n Africa, Orientul Mijlociu,
Asia Central i de Sud-Est, America de Sud i unele ri mediteraneene.
Bruceloza este i o boal profesional n sensul c atac grupuri expuse
ca veterinari, fermieri, muncitori n abatoare, laboratoare, ferme, etc.
Profilaxia bolii se bazeaz pe educaia sanitar i pe supraveghere.
Tipurile predominante depind de sistemul regional de cretere.
Speciile de brucele care dezvolt colonii natural netede (de tip S) cu
localizare la nivelul placentei sau a ugerului, sunt responsabile de zoonoze
grave la om, n timp ce coloniile natural rugoase (de tip R) produc infecii
relativ benigne, fr transmitere la om.
n Romnia nu s-a semnalat niciodat infecia cu Brucella melitensis
la ovine, iar ultimul caz de bruceloz bovin a fost lichidat n 1969.
204

6.5. Genul Enterobacter


Genul Enterobacter face parte din Familia Enterobacteriaceae, fiind
o specie condiionat patogen. Specia implicat n toxiinfeciile alimentare
este Enterobacter sakazakii. Aceast bacterie a fost descoperit n anul 1961
i a fost iniial denumit Enterobacter cloaceae. Este o bacterie pigmentat
n galben ce cauzeaz enterocolite necrotice neonatale (NEC), meningite
neonatale i septicemii.
Vehiculul alimentar a fost reprezentat de ctre laptele praf. Este
considerat germen oportunist, de ctre unii autori. Cteva tulpini produc
enterotoxine, iar infecia experimental se reproduce pe oarecele sugar.

6.6. Genul Bacteroides


Taxonomie. Genul Bacteroides face parte din Familia Bacteroidaceae
i cuprinde 10 specii dintre care amintim: B. acidifaciens, B. gracilis,
fragilis, B. oris, B. ovatus, B. putredinis, etc.
Speciile din genul Bacteroides prezint urmtoarele caracteristici:
sunt Gram negative, obligatoriu anaerobe, saharolitice, conin enzime ale
ciclului fosfat-pentoz-monofosfat-hexoz. Are o compoziie n baze DNA,
guanin+citozin, 40-48 mol%, membrana conine sfingolipide, acizi grai
cu lanuri lungi, sintetizeaz menaquinonele MK 10 i MK 11 ca produi
majori, conin n stratul de peptidoglican, acid mezo-diamino-pimelic.
6.6.1. Bacteroides fragilis
Este un potenial patogen alimentar, deoarece a fost implicat n
producere diareei la om, alturi de A. hydrophila, i P. shigelloides.
Prezena enterotoxinei a fost demonstrat n 1984, iar tulpinile
enterotoxice de B. fragilis au fost pentru prima dat asociate cu sindromul
diareic uman, n 1987.
B. fragilis face parte din microbiota intestinal uman, n proporie de
2%.

6.7. Genul Klebsiella


Primul reprezentant al genului Klebsiella a fost descris de ctre
Friedlnder n anul 1883. Numele genului a fost dat n cinstea bacteriologului
Edwin Klebs (1834-1913).
Genul Klebsiella cuprinde bacterii imobile, capsulogene, care
205

fermenteaz glucoza cu producere de mari cantiti de gaz (excepie face


K. rhinoscleromatis). Pe mediile gelozate simple sau slab selective crete
repede, formnd de obicei colonii mucoide. Fermenteaz majoritatea
zaharurilor (cu excepia dulcitolului) i produc acetoin din glucoz (reacia
Voges-Proskauer pozitiv).
Taxonomie. Genul Klebsiella include 12 specii (K. pneumoniae,
cu trei subspecii: pneumoniae, ozaenae, rhinoscleromatis; K. oxytoca, K.
(Raoultella) terrigena; K. (Raoultella) planticola; K.(Raoultella) ornitinolytica).
Pentru bacteriologia veterinar, de interes majoritar este K. pneumoniae, ca agent etiologic al unei game largi de infecii i K. oxytoca, care poate
fi ocazional patogen. K. terrigena este saprofit, nepatogen, prezent n sol
sau n ap, iar K. planticola se izoleaz de la plante i din mediul acvatic.
Principalul caracter diferenial al ultimelor trei specii fa de K.
pneumoniae este capacitatea lor de multiplicare la 10 grade Celsius.
6.7.1. Klebsiella pneumoniae
Morfologie. Bacil polimorf, mare (0,6-6/0,3-1,5 microni), Gram
negativ, imobil, capsulogen i nesporogen. Tulpinile izolate din infecii au
capsule mari, bine vizibile prin coloraii obinuite. Se dispun izolai sau
n perechi, cap la cap, formnd diplobacili i uneori lanuri scurte (R. M.
Mnzat).
Capsula este moale sintetizat in vivo i in vitro, cu caracter pronunat
mucos, de natur polizaharidic (fig. 5.2).
Multe tulpini de K. pneumoniae i K. ozaenae posed pili (au fost
descrise diferite tipuri morfologice i hemaglutinante).
Condiii de cultivare i caractere culturale. Germen facultativ
anaerob, ce se dezvolt pe medii uzuale la temperatura optim de 37 grade
Celsius n 18-24 de ore. n bulion produce turbiditate intens i un inel gros,
mucos la suprafa. Prin nvechire, gradul de vscozitate crete datorit
secreiei n exces de substan mucoas capsular, iar mediul capt un
aspect filant.
Pe agarul nutritiv formeaz colonii neuniforme mari, 4-5 milimetri
diametru, nepigmentate, rotunde, bombate, umede, cu aspect mucoid. Acest
aspect se accentueaz dup 48 de ore, cnd diametrul coloniilor atinge 4-5
milimetri, aprnd o evident tendin de confluare.
Pe mediile slab selective, coloniile lactoz-pozitive i pstreaz
206

caracterul mucoid.
Proprieti biochimice. Fermenteaz glucoza cu producie de
gaz, produce ureaz, lizindecarboxilaz, utilizeaz citraii ca unic surs
de carbon, reacia Voges-Proskauer este pozitiv. Nu produce indol,
ornitindecarboxilaz, hidrogen sulfurat, gelatinoliz.
Proprieti antigenice. Klebsielele conin antigene somatice O
(lipopoliglucide, care dau frecvent reacii ncruciate cu polizaharizii O
Escherichia) i capsulare K (poliglucide acide capsulare ce dau reacii
ncruciate cu polizaharizii capsulari de S. pneumoniae, Escherichia, S.
paratyphi B).
Deoarece, polizaharizii capsulari sunt termostabili, antigenele O
situate mai profund sunt greu de pus n eviden. n practic, se face numai
diferenierea serotipurilor K.
Tipizarea serologic se practic dup schema Kauffman i Orscov.
ncadrarea ntr-un serovar K se poate realiza prin aglutinare, coagulare,
latex aglutinare. Prin oricare din aceste metode ncadrarea este laborioas i
pretenioas, datorit numrului mare de serovaruri i a nrudirilor antigenice
frecvente dintre acestea.
Ecologie. Principalul habitat al klebsielelor este tubul digestiv. n urma
contaminrii mediilor naturale cu fecale, K. pneumoniae se poate adapta i
multiplica ntr-o mare diversitate de biotipuri, cum ar fi suprafaa arborilor,
plante, ceea ce implic acestora un caracter mucos-vscos.
Patogenitate. K. pneumoniae este o bacterie virulent (prin capsula
polizaharidic antifagocitar, prezena pililor cu aderen specific,
bacteriocinele factori de autoselectare), posed o endotoxin, condiionat
patogen. Afecteaz, n special organismele cu aprare antiinfecioas
deficitar. Odat ajuns n esuturi se nmulete rapid, este piogen, uneori
bacteriemic.
Klebsielele produc complicaii supurative bronhopneumonice postvirale (mai ales n viroze tratate cu antibiotice i chimioterapice), n
tuberculoz; complic leziunile n pasteureloza iepurilor; produce infecii
secundare n tusea de canis, mai ales dup intervenia agenilor virali,
izolndu-se frecvent de la cinii bolnavi; mamite la vaci; infecii pulmonare primare sau asociate cu ali germeni la viei i cobai); metrite la iap,
etc.
La om, subspecia ozaenae determin ozena, care se manifest printr-o
secreie nazal, purulent i fetid, cu leziuni granulomatoase i evoluie
cronic, iar subspecia rhinoscleromatis (Frisch, 1882) produce rinoscleroma,
care se manifest printr-o rinit cronic cu leziuni granulomatoase.
Aceast bacterie a fost izolat dintr-un episod de toxiinfecie alimentar
207

cu Escherichia coli din probe de hamburgeri i din sngele unui pacient.


Tulpina de K. pneumoniae a fost LT pozitiv.
Infecia experimental. Animalul cel mai sensibil este oarecele alb
inoculat intraperitoneal, care face o infecie septicemic, iar n frotiurile
efectuate din organe se evideniaz numeroi germeni capsulai.
Sensibilitatea la antibiotice i chimioterapice. Speciile de Klebsiella
sunt natural sensibile la majoritatea antibioticelor i chimiote-rapicelor cu
spectru larg, n special la polimixine i la concentraii mari de penicilin
G, dar tot mai multe tipuri sunt multirezistente datorit transferului de
fR-plasmidic. Datorit procentului foarte mare de tulpini rezistente la
antibioticoterapie, Stp. aureus, Ps. aeruginosa, Proteus formeaz mpreun
grupul bacteriilor problem a terapeuticii medicale umane i veterinare.

6.8. Genul Streptococcus


Familia Streptococcaceae face parte din ordinul Lactobacillales.
Acesta cuprinde n afar de familia Streptococcaceae, nc ase familii,
dup cum urmeaz: Lactobaci-llaceae (cu 3 genuri), Aerococcaceae,
CRNAobacteriaceae, Enterococca-ceae (cu 5 genuri, streptococi enterici),
Leuconostoccaceae (streptococii din produsele lactate), Incertae sedis.
Istoric. Studiul streptococilor a preocupat n decursul timpului pe
muli cercettori: Lister, Rivolta, Billroth, Pasteur, Koch, Rosenbach,
Lancefield.
n 1873, Rivolta pune n eviden agentul etiologic al gurmei, boal
infecioas specific solipedelor. Ulterior, s-au realizat studii ample de ctre
numeroi cercettori, n ara noastr evideniindu-se cele efectuate de Jivoin
i Mitroi.
Stc. suis a fost identificat prima dat ca specie n 1959, de ctre Moor,
care l-a izolat din leziuni septicemice de la porci.
Taxonomie. Familia Streptococcaceae a suferit numeroase remanieri
pe baza criteriilor de taxonomie molecular: hibridarea acizilor nucleici,
analiza secvenelor RNAr 16S, procentajul coninutului n G+C al DNAului, compoziia n lipide, analiza electroforetic a diverselor enzime,
utilizarea anticorpilor monoclonali.
Cuprinde n prezent 2 genuri (dup J.P. Euzby, 2006): Streptococcus
(cu 83 de specii) i Lactococcus (cu 5 specii).
208

Tabelul 6.4
Diferenierea grupelor de streptococi n funcie de unele caractere de baz
(dup Rpuntean Gh., Boldizsar E., 2001)
Streptococi de
grup

Hemoliz

Sensibilitatea la
bacitracin

CAMP

6,5% NaCl

Bil
esculin

nehemolitic

Viridans

Pneumococi

Clasificarea streptococilor se poate realiza pe baza urmtoarelor


caractere:
55aspectul hemolizei determinat pe agar snge;
55structura antigenic (clasificarea Lancefield);
55criterii ecologice i metabolice (clasificarea Sherman).
Pe baza activitii hemolitice streptococii se clasific n urmtoarele
tipuri:
55streptococii beta-hemolitici, care produc hemoliz complet (clar)
n jurul coloniilor, cu diametrul variabil, n funcie de grupul antigenic.
55 streptococii alfa-hemolitici, care produc hemoliz incomplet,
coloniile fiind nconjurate de o zon galben-verzuie, datorit transformrii hemoglobinei n methemoglobin sub aciunea peroxidului de hidrogen,
hematiile fiind numai parial lizate.
55streptococii alfa prim () hemolitici, ce produc n jurul coloniilor
o zon asemntoare alfa hemolizei, dar bordat de o zon ngust de beta
hemoliz.
55streptococii nehemolitici, care formeaz n mediul de cultur
colonii, fr modificarea acestuia.
Clasificarea antigenic Lancefield a fost realizat pe baza antigenului
specific de grup, poliglucidul (poliozidul) C din peretele celular, cu excepia
grupului D, care este constituit din acid glicerol-teichoic. n 1928, Rebecca
Lancefield a mprit genul Streptococcus n 18 grupe serologice, notate de
la A la T. Grupele A, B, F, H i I sunt echivalente cu cte o specie, iar mai
mult de 90% din infeciile streptococice sunt produse de grupa antigenic
209

A, respectiv de Stc. pyogenes.


n prezent, clasificarea antigenic a fost readaptat n:
VV streptococi grupabili, grupele A-W (cu excepia literelor I i J);
VV streptococi negrupabili, care nu conin antigenul de grup.
Specii de streptococi de interes zoonotic
Speciile de streptococi de interes zoonotic sunt reprezentate de Stc.
suis i Stc. equi subsp. zooepidemicus.
n cazul lui Stc. suis, sursa de infecie pentru om este reprezentat de
porcii sau carnea de porc infectat, iar n cazul Stc.equi zooepidemicus de
laptele nepasteurizat.
Toi streptococii zoonotici produc exotoxine (hemolizine, hialuronidaze i proteinaze) care distrug esuturile.
Stc. equi zooepidemicus poate produce leziuni septice la numeroase
specii de mamifere, de la bovine i cabaline, pn la cobai i iepuri.
Produce infecii ale tractului respirator la cabaline, manifestate prin
catar.
La vaci poate fi implicat n producerea mastitelor, care reprezint
principala cale de transmitere la om.
La om determin faringite acute, datorit faptului c este localizat la
nivelul tractului respirator. Infecia se poate complica prin diseminare pe
cale pulmonar sau sangvin.
Infeciile cele mai severe de la om au fost asociate cu consumul de
lapte nepasteurizat de la vaci cu mastit.
n Romnia, 85 de persoane s-au mbolnvit de glomerulonefrit acut
prin consum de lapte nepasteurizat. Un episod asemntor a avut loc ntr-o
familie de fermieri din Yorkshire (R.T. Mayon-White, 2005).
Prevenirea acestui tip de infecii se poate realiza prin pasteurizarea
laptelui. n tratament se folosete penicilina.
Stc. suis. Exist dou tipuri, 1 i 2.
Tipul 1 a fost semnalat la purceii nou-nscui i nu transmite boala la
om, iar tipul 2 la purceii nrcai, rspunztor de infecia zoonotic cu Stc.
suis face parte din grupul R (tipul 2), fiind implicat n producerea meningitei
la om i la porc.
Se pare c omul contracteaz infecia de la porc prin intermediul
picturilor inhalate n timpul prelucrrii crnii.
Germenul a fost identificat n 1959 de ctre Moor, care l-a izolat din
leziuni septicemice de la porc.
210

Pe baza antigenelor polizaharidice de grup speciile au fost divizate n


grupul R (tipul 2) i grupul S (tipul 1).
Boala a fost semnalat la om pentru prima dat ntre 1960-1966 n
Danemarca. S-a rspndit apoi n Olanda, Frana, Marea Britanie. n HongKong (1978-1980) boala a fost considerat ca fiind cea mai frecvent cauz
de meningit la om (R.T. Mayon-White, 2005).
Calea de contaminare nu este nc clar. Se pare c infectarea se
produce de la esuturile de porc (carne, esut limfoid inclusiv tonsile) prin
pielea lezat sau prin inhalarea streptococilor care colonizeaz subclinic
faringele.
Nu exist o metod satisfctoare de prevenire a infeciei deoarece
majoritatea cazurilor umane au fost nregistrate printre persoanele care
nu au intrat n contact direct cu purceii tineri sau bolnavi. Antibioticul de
elecie este penicilina.
Streptococcus iniae a fost pentru prima dat izolat n 1972 dintr-o
infecie a delfinilor din Amazon, n Israel, n 1986, din infecii la tilapia i
pstrv, iar mai trziu din Taiwan i SUA.
Primul caz uman de intoxicaie alimentar a fost semnalat n 1991,
n Texas i n 1994, n Otawa. Patru cazuri de intoxicaii alimentare au
fost semnalate n Ontario, Canada 1995-1996, att din probele de pete
consumat, ct i de la pacieni. Petele a fost tilapia, importat din SUA.
S. iniae este beta-hemolitic pe globulele roii de oaie. La om produce
infecii fulminante ale esuturilor moi.

6.9. Genul Erysipelothrix


Taxonomie. Genul Erysipelothrix face parte din familia
Erysipelothrichaceae. (Bergeys Manual of Systematic Bacteriology, 2nd,
2004.
Genul cuprinde trei specii: Ers. rhusiopathiae i Ers. tonsillarum, Ers.
inopinata (Verbarg et al., 2004)
6.9.1. Erysipelothrix rhusiopatiae
(Migula, 1900; Buchanan, 1918)
Istoric. Robert Koch n 1876, a izolat pentru prima dat dintr-o
infecie septicemic, o bacterie fin, Gram pozitiv, pe care o denumit-o
Ers. murisepticus.
Pasteur i Thuillier (1883) descriu un germen asemntor dintr-un caz
de rujet la porc.
211

Friedrich Lffler este primul care realizeaz un studiu concludent,


iar Rosenbach (1909) descrie pentru prima dat infecia la om, pe care o
denumete cu termenul de erizipeloid. Ulterior, Leclainche i Lorenz au
preparat serul antirujetic pe cal i, respectiv, pe porc.
Trevistan (1885) propune denumirea de Ers. insidiosa, iar Migula
(1900) cea de Bacterium rhusiopathiae.
Buchanan (1918) combin cele dou apelative, crend numele de Ers.
rhusiopathiae, acceptat pn n prezent.
Morfologie. Bacterie Gram pozitiv, cu dimensiuni de 0,5-2,5/0,2-0,4
microni. Este nesporogen, necapsulogen i imobil.
Bacilul rujetului este considerat cel mai fin bacil din grupa bacteriilor
clasice i apare n frotiuri drept sau uor ncurbat.
Variantele S apar dispuse izolat, n perechi unghiulare (V, Y, N, etc.),
grmezi sau lanuri scurte.
Variantele R se caracterizeaz prin apariia formelor filamentoase,
foarte lungi de circa 50-60 microni, care devin predominante.
Ambele forme se decoloreaz uor i pot aprea Gram negative cu
poriuni Gram pozitive, ceea ce d filamentelor un aspect moniliform,
putnd fi considerat Gram labil.
n frotiurile efectuate din ficat, n infecii experimentale, se ntlnesc
numeroi bacili fagocitai n citoplasma celulelor Kuppfer, care iau aspectul
unor pernie cu ace.
Condiii de cultivare i caractere culturale. Germen facultativ
anaerob sau microaerofil, care se dezvolt bine pe medii uzuale. Pentru
stimularea creterii se recomand incubarea germenului la 37oC n bulion
glucozat i atmosfer cu 5-10% dioxid de carbon.
Pe agar infuzie de cord cu 5% snge de berbec sau iepure, n 24-48 de
ore de incubare la 37 de grade Celsius n atmosfer mbogit cu dioxid de
carbon, formeaz att colonii S ct i R.
Variantele S sunt foarte fine (circa 0,5 milimetri), cu aspect de
geam aburit caracteristic, rotunde, convexe, strlucitoare, transparente i
cu centrul din ce n ce mai opac.
Variantele R sunt mai mari, mai turtite, cu suprafaa ondulat i
margini neregulat fimbriate.
Formele S (dar nu i cele R) sunt nconjurate de o zon ngust de
alfa hemoliz de culoare verzuie.
Cultivat n profunzimea mediilor semisolide, bacilul rujetului se
dezvolt uniform de-a lungul liniei de nsmnare, cultura bacterian avnd
212

aspectul unei periue de splat eprubete.


n bulion produce o turbiditate discret, care la agitare, n cazul
culturilor tinere formeaz valuri cu aspect de fum de igar. n culturile
vechi formeaz un depozit lenticular, care dup agitare se ridic n mediu
sub forma unui filament rsucit (tirbuon).
Pentru izolarea germenului din materiale patologice, se folosesc medii
de mbogire selectiv cum ar fi: mediul Packer, pe baz de azid de sodiu
i cristal violet; mediul Bhm, din bulion de carne de porc, pepton Whitte,
fosfat de sodiu, glucoz, cristal violet i azid de sodiu.
n cazul preparrii vaccinurilor se folosete un mediu lichid recomandat
de Feist, care conine: fosfat acid de sodiu, glucoz, pepton, extract de
drojdie de bere, L-arginin i Tween80.
Proprieti biochimice. Fermenteaz fr producie de gaz: glucoza,
lactoza, fructoza i galactoza.
Nu produce catalaz, oxidaz n schimb produce hidrogen sulfurat pe
mediul TSI (triple sugar iron).
Proprieti antigenice. Bacilul rujetului posed antigene poliglucidice i polipeptidice cu caracter de haptene. Prin reacia de seroprecipitare
n gel de agar au fost identificate iniial trei serogrupuri, notate cu A, B i N.
Ulterior, au fost identificate peste 23 de serovaruri, dintre care serovarurile
notate cu 1 i 2, corespund celor notate anterior cu serogrupurile A i B.
De remarcat c n primele dou serotipuri s-au ncadrat 75-80% din
tulpinile examinate.
Tipul 1 (fost tip A) are dou subtipuri 1a i 1b. Se izoleaz din infeciile
acute i este virulent, iar tipul 2 (fost tip B) se izoleaz din infeciile cronice i
posed n plus un antigen hemaglutinant i o substan solubil imunizant.
De aceea, pentru prepararea vaccinurilor antirujetice se utilizeaz tulpinile
de tip B.
Prin testele de aglutinare ncruciat s-a dovedit c toate tulpinile de
Ers. insidiosa, posed cel puin un antigen comun.
Sensibilitatea fa de factorii de mediu. Bacilul rujetului prezint o
rezisten destul de crescut la aciunea factorilor de mediu.
La temperatura de 70OC rezist 5-10 minute i este rezistent la
uscciune.
n snge i carne rezist luni de zile, chiar dac acestea au intrat n
putrefacie. n dejecii sau reziduuri de pete rezist pn la 6 luni, dac
temperatura este sub 12OC.
213

Prezint o rezisten foarte mare n mediile de cultur. De exemplu, n


culturile din medii lichide, supuse variaiilor de temperatur, germenii i-au
conservat nu numai viabilitatea, dar i patogenitatea, ntre 6 luni i 2 ani.
Bacilul rujetului este sensibil la aciunea substanelor dezinfectante,
cum ar fi: hidroxid de sodiu 5%, formol 2% i clorur de var 1%.
Este sensibil la antibiotice ca: penicilina i tetraciclina, fiind rezistent
la polimixin, neomicin, kanamicin.
Ecologie. Ers. rhusiopathiae este o bacterie cu rspndire cosmopolit,
fiind natural gzduit la vertebrate (porci, ovine, cobai, bovine, psri, peti
i nurca domestic) i nevertebrate (crustacee).
Sediul de predilecie l constituie rinofarinxul i amigdalele. Prezena
bacteriei n coninutul intestinal, dejecii, mucusul petilor i rezistena n
mediul extern explic rolul solului, apelor de suprafa, apelor reziduale
de la ferme i abatoare, a nmolului, n transmiterea bacteriei pe cale oral
ntre animale.
Produsele de carne i pete, chiar afumate ori saramurate, vehiculeaz
eficient aceast bacterie.
Frecvena mbolnvirilor este mai mare n sezonul clduros i mai
mic n sezonul rece iar n efectivele n care a aprut infecia, mbrac un
caracter staionar sau trenant.
Patogenitate. Nu este nc pe deplin neleas. Bacilul rujetului
acioneaz prin virulen i toxigenez. Tulpinile virulente aparin serotipului A i produc de regul, hialuronidaz.
Alte tulpini produc neuraminidaz, endotoxine productoare de eritem,
evideniate de ctre Leimbeck, n 1979, pe embrioni de gin. Activarea
neuraminidazei poate fi asociat cu mai multe aspecte ale patogenezei
bolii, cum ar fi: creterea permeabilitii pereilor vasculari, formarea n
exces a fibrinei din fibrinogen i stimularea aglutinrii eritrocitare, ducnd
la hemoliz.
Neuraminidaza cliveaz legturile alfa glicozidice ale acidului
neuraminic, un mucopolizaharid reactiv, care se gsete pe suprafeele
celulare.
Modificrile cronice din artrita erizipelic sunt asociate cu procese
imunologice. Bacteriile nu dispar complet din articulaiile afectate cronic
i leziunea poate progresa ca rspuns la expunerea continu la aceste
componente antigenice.
Infecia natural. Se numete rujet (rash), iar popular, brnc i
214

afecteaz, de regul, suinele, dar este ntlnit i la alte specii de animale i


psri inclusiv la om, cu caracter endemic.
Se manifest clinic prin evoluie septicemic, febril, cu tulburri
generale i leziuni cutanate congestive i urticariforme, sau prin evoluie
cronic, cu localizri cardiace, auriculare i cutanate.
Porcul este specia cea mai receptiv, iar datorit frecvenei i pierderilor
mari, pe care le producea n trecut, a fost considerat boala numrul doi a
porcinelor, dup pest. Infecia are de obicei, o evoluie enzootic producnd
mari pierderi economice (cu dermatite, artrite, endocardite).
n ordinea receptivitii, dup porcine urmeaz ovinele n special mieii
cu vrsta de 2-3 luni i psrile, n special curcile i fazanii (Stilles, 1946).
Au mai aprut infecii la gte, gini outoare, puni, potrnichi.
Omul, este de asemenea, receptiv, fcnd n special infecii localizate
sub forma unei dermatite acute, numit i erizipeloidul lui Baker-Rosenbach,
boal profesional, ce apare mai ales la mcelari, mezelari, care intr n
contact direct i repetat cu carnea contaminat.
Infecia poate mbrca aspectul unei dermite cu posibiliti de
generalizare septicemic i localizri secundare (artrite, endocardite).
Unul dintre primele studii ale incidenei acestui microorganism n
alimente a fost efectuat de ctre Ternstrom i Molin, n 1982, n Suedia. Ei
au examinat 135 de probe de carne de pui, de vit i de porc i au gsit E.
rhusiopatiae n 36%, respectiv 13%, dintre probele de porc i pui.
n probele din carnea de vit nu au gsit acest germen.

215

Aeromonas hydrophila susp. hydrophila: Colonii netede, de


dimensiuni medii sau mari, de culoare alb. Coloniile au marginile regulate

Acelai mediu de agar cu snge examinat n fundal luminous.


Coloniile sunt nconjurare de o zon de hemoliz
216

Bacteroides fragilis: cultur agar cu snge, colonii de


dimensiuni mici, netede, de culoare alb.

Bacteroides fragilis: filamente bacilare n frotiu din cultur.

217

Enterobacter aerogenes: mediu Eosin-Methylene Blue. Colonii mari mucoide, brune cu central ntunecat, ce indic fermentarea lactozei i producia
de acid (Naowarat Cheeptham, Thompson Rivers University, Canada)

Mediu Eosin-Methylene Blue inoculat simultan cu (A) Escherichia coli, (B)


Pseudomonas aeruginosa, (C) Klebsiella pneumoinae i (D) Enterobacter
aerogenes. Toate cele patru bacterii gram-negative exprim morfologie
diferit. Coloniile de Escherischia coli prezint morfologie tipic lactozofermentativ cu producie excesiv de acid i precipitarea de pigment verde
metalizat (colonii verzi cu luciu metalic). Coloniile de Pseudomonas aeruginosa expun o morfologie nefermentativ (colonii roz), ambele colonii de
Klebsiella pneumoniae i Enterobacter aerogenes au morfologie lactozofermentativ i productoare de acid (colonii brune cu centrul ntunecat).
(Naowarat Cheeptham i Carolynne Fardy, Thompson Rivers University,
Canada)
218

Brucella suis: cultur n agar cu snge ( foto: CDC/Dr. W.A.


Clark, Public Health Image Library)

Brucella spp.: Cocobacili mici gram-negativi (0,5-0,7 x x0,61,5 ) (are gram-negative in their staining morphology (CDC,
Public Health Image Library)
219

Klebsiella pneumoniae subsp. pneumonia: colonii gri,


de dimensiuni medii, nehemolitice

Klebsiella pneumonia: microscopie in contrast de faz. Bacili


scuri cu marginile paralele i capetele rotunjite, imobil
220

Mediu Plesiomonas shigelloides CCM 5860, 37C, 24h

Plesiomonas shigelloides CCM 5860 , mediu de cultur, 37C, 24h

221

Erysipelothrix rhusiopathiae: Mediu agar cu snge. La 48 de


ore coloniile sunt punctiforme, nepigmentate i transparente,
nehemolitice

Erysipelothrix rhusiopathiae: bacilli drepi sau ncurbai

222

Streptococcus equi subsp. zooepidemicus. Agar cu snge ,


colonii mucoide, semitransparente, punctiforme i mici

Streptococcus zooepidemicus: coloratie Gram. Lanuri de coci


gram pozitivi
223

Bibliografie selectiv
1.
Amagliani, G.; Omiccioli, E.; Andreoni, F.; Boiani, R.; Bianconi, I.; Zaccone, R.;
Mancuso, M.; Magnani, M. Development of a multiplex PCR assay for Photobacterium
damselae subsp. piscicida identification in fish samples.; Blackwell Publishing, Oxford,
UK, Journal of Fish Diseases, 2009, 32, 8, pp 645-653, 28 ref.
2.
Benno, Y.; Mitsuoka, T. Incidence and isolation of three new Bacteroides spp.
from abscesses in pigs.; Japanese Journal of Veterinary Science, 1984, 46, 5, pp 749-752,
9 ref.
3.
Bergagna S, Zoppi S, Ferroglio E, et al. Epidemiologic survey for Brucella suis
biovar 2 in a wild boar (Sus scrofa) population in northwest Italy. [Journal Article, Research Support, Non-U.S. Govt] J Wildl Dis 2009 Oct; 45(4):1178-81.
4.
Chacko, K. L.; Vineeth Rajagopal; Jaibi, K.; Latha, C.; Nanu, E. Fish borne bacterial zoonoses. ; Intas Pharmaceuticals Ltd, Ahmedabad, India, Intas Polivet, 2006, 7, 2, pp
207-211, 5 ref.
5. Falkenhorst G, Bagdonaite J, Lisby M, et al. Outbreak of group A streptococcal
throat infection: dont forget to ask about food. [JOURNAL ARTICLE] Epidemiol Infect
2007 Nov 16.:1-7.
6.
Gonzlez-Rey, C.; Svenson, S. B.; Bravo, L.; Siitonen, A.; Pasquale, V.; Dumontet, S.; Ciznar, I.; Krovacek, K. Serotypes and anti-microbial susceptibility of Plesiomonas
shigelloides isolates from humans, animals and aquatic environments in different countries. ; Pergamon Press, Oxford, UK, Comparative Immunology, Microbiology & Infectious Diseases, 2004, 27, 2, pp 129-139, 40 ref.
7. Hassan, N. B. A.; Abdalla, M. O. M.; Nour, A. A. A. M. Microbiological quality
of heat-treated milk during storage.; ANSInet, Asian Network for Scientific Information,
Faisalabad, Pakistan, Pakistan Journal of Nutrition, 2009, 8, 12, pp 1845-1848, 24 ref.
8.
Jaradat, Z. W.; Ababneh, Q. O.; Saadoun, I. M.; Samara, N. A.; Rashdan, A. M.
Isolation of Cronobacter spp. (formerly Enterobacter sakazakii) from infant food, herbs
and environmental samples and the subsequent identification and confirmation of the isolates using biochemical, chromogenic assays, PCR and 16S rRNA sequencing. ; BioMed
Central Ltd, London, UK, BMC Microbiology, 2009, 9, 225, pp (27 October 2009), 51
ref.
9.
Jin ShengQuan; Yin BinCheng; Ye BangCe Multiplexed bead-based mesofluidic
system for detection of food-borne pathogenic bacteria.; American Society for Microbiology (ASM), Washington, USA, Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75, 21,
pp 6647-6654, 44 ref.
10. Linhart Y, Amitai Z, Lewis M, et al. A food-borne outbreak of streptococcal pharyngitis. [Journal Article] Isr Med Assoc J 2008 Aug-Sep; 10(8-9):617-20.
11. Manzat, R. M.; Vintila, C.; Isolation and cultivation of Fusiformis (Bacteroides)
nodosus. Lucrari Stiintifice, Institutul Agronomic Timisoara, Seria Medicina Veterinara,
1980, 17, pp 159-162, 12 ref.
12. Munn, C. B. Microbial diseases of fish. ; Garland Science, Taylor and Francis
Group, LLC, New York, USA, Marine microbiology: ecology and applications, 2004, pp
223-242, 39 ref.

224

13. Musgrove, M. T.; Jones, D. R.; Shaw, J. D.; Sheppard, M.; Harrison, M. A. Enterobacteriaceae and related organisms isolated from nest run cart shelves in commercial shell
egg processing facilities. ; Poultry Science Association, Savoy, USA, Poultry Science,
2009, 88, 10, pp 2113-2117, 25 ref.
14.
Nagano, I.; Inoue, S.; Kawai, K. Repeatable immersion infection with Photobacterium damselae subsp. piscicida reproducing clinical signs and moderate mortality.; Oshima, S.; Springer-Japan, Tokyo, Japan, Fisheries Science, 2009, 75, 3, pp 707-714
15.
Nakazawa H, Hayashidani H, Higashi J, et al. Occurrence of Erysipelothrix spp.
in chicken meat parts from a processing plant. [Journal Article] J Food Prot 1998 Sep;
61(9):1207-9.
16.
Neta AV, Mol JP, Xavier MN, et al. Pathogenesis of bovine brucellosis. [JOURNAL ARTICLE] Vet J 2009 Sep 2.
17.
Newaj-Fyzul, A.; Mutani, A.; Ramsubhag, A.; Adesiyun, A. Prevalence of bacterial pathogens and their anti-microbial resistance in tilapia and their pond water in Trinidad.; Blackwell Publishing, Berlin, Germany, Zoonoses and Public Health, 2008, 55, 4, pp
206-213, 44 ref.
18.
Pereira, C. S.; Amorim, S. D.; Santos, A. F. das M.; Siciliano, S.; Moreno, I. B.;
Ott, P. H.; Rodrigues, D. dos P. Plesiomonas shigelloides and Aeromonadaceae family
pathogens isolated from marine mammals of southern and southeastern Brazilian coast.;
Sociedade Brasileira de Microbiologia, So Paulo, Brazil, Brazilian Journal of Microbiology, 2008, 39, 4, pp 749-755, 30 ref.
19.
Roop RM, Gaines JM, Anderson ES, et al. Survival of the fittest: how Brucella
strains adapt to their intracellular niche in the host. [JOURNAL ARTICLE] Med Microbiol
Immunol 2009 Sep 22.
20.
Salerno, A.; Deltoile, A.; Lefevre, M.; Ciznar, I.; Krovacek, K.; Grimont, P.;
Brisse, S. Recombining population structure of Plesiomonas shigelloides (Enterobactenaceae) revealed by multilocus sequence typing. ; American Society for Microbiology
(ASM), Washington, USA, Journal of Bacteriology, 2007, 189, 21, pp 7808-7818, 57 ref.
21.
Scheff, G. J. Comparison of Fusobacterium sp. versus Bacterioides sp. in the
monoxenic cultivation of E. histolytica.; Zentralblatt fur Bakteriologie, Parasitenkunde
und Infektionskrankheiten, Abteilung 1, Originale A, 1978, 242, 3, pp 419-421
22.
Suzuki J, Sakaguchi K [Properties of metabolic substance produced by group A
Streptococcus from two food-borne epidemic] [English Abstract, Journal Article] Kansenshogaku Zasshi 2009 Jul; 83(4):380-5.
23.
Takayama Y, Hikawa S, Okada J, et al. A foodborne outbreak of a group A streptococcal infection in a Japanese university hospital. [JOURNAL ARTICLE] Eur J Clin
Microbiol Infect Dis 2008 Aug 21.
24.
Yez, M. A.; Cataln, V.; Apriz, D.; Figueras, M. J.; Martnez-Murcia, A. J.
Phylogenetic analysis of members of the genus Aeromonas based on gyrB gene sequences.; Society for General Microbiology, Reading, UK, International Journal of Systematic
and Evolutionary Microbiology, 2003, 53, 3, pp 875-883, many ref.
25.
Ye YingWang; Wu QingPing; Yao Lin; Dong XiaoHui; Wu Kui; Zhang JuMei;
Mary Ann Liebert A comparison of polymerase chain reaction and international organization for standardization methods for determination of Enterobacter sakazakii contamination of infant formulas from Chinese mainland markets. Inc., New Rochelle, USA, Foodborne Pathogens and Disease, 2009, 6, 10, pp 1229-1234, 31 ref.
225

Capitolul 7
Principalele micotoxine implicate n
producerea toxiinfeciilor alimentare
Caractere generale
Micotoxinele sunt metabolii toxici produi de micei n substraturile
alimentare i furaje. Termenul de micotoxin deriv de la grecescul
mykes, mucos = ciuperc (fung) i latinescul toxicum = otrav.
Se pare c fungii (mucegaiurile) reprezint grupul cel mai mare de
microorganisme din sistemul biologic (~300 000 specii), fapt care a dus
la concluzia c nu trim ntr-o lume cu fungi, ci mai degrab ntr-o lume a
fungilor (Bulmer, 1969).
Un numr foarte mare de ciuperci produc micotoxine. Unele sunt
mutagene i carcinogene, altele prezint o toxicitate cu specificitate pentru
anumite organe.
Toxicitatea acestora pentru om nu a fost nc demonstrat. Se cunosc
ca substane carcinogene 14 micotoxine, dintre care aflatoxinele sunt cele
mai importante.
n general este acceptat faptul c 93% dintre compuii mutageni sunt
carcinogeni.
Micotoxinele sunt metabolii secundari. Ei se formeaz la sfritul
fazei exponeniale, nefiind implicai n cretere sau metabolism. n general
se formeaz cnd se acumuleaz cantiti mari de precursori primari de
metabolism (aminoacizi, acetat, piruvat). Din fericire speciile patogene
sunt n numr de cteva zeci.
n patologie, fungii sunt implicai n trei categorii de afeciuni:
micoze, micotoxicoze i alergiile fungice.
Micozele sunt boli determinate de fungi a cror prezen este obligatorie
n organismul afectat (de exemplu: candidoza, tricofiia, etc).
Micotoxicozele sunt entiti determinate de micotoxine care ptrund
n organism o dat cu furajele n care au fost elaborate de ctre fungii toxici.
Astfel, micotoxicozele nu implic prezena agentului biotic (fungului)
n organismul animal i uneori nici chiar n substratul n care a fost elaborat
micotoxina.
Alergia fungic este un sindrom determinat cel mai frecvent de sporii
226

de mucegai.
Tabelul 7.1.
Toxicitatea i efectele biologice ale unor micotoxine majore din alimente
Alimentele
Activitatea
LD50 (mg/
Micotoxina
Specii productoare
implicate
biologic
kg)
porumb, alune,
0,5 (cine),
smochine, lapte Aspergillus flavus
hepatotoxic,
Aflatoxine
9,0
i produse din
Aspergillus parasiticus carcinogen
(oarece)
lapte
Aspergillus flavus
Acid
brnz, porumb,
36
Penicillium
convulsii
ciclopiazonic alune, mei
(obolan)
aurantiogriseum
DeoxinivaFusarium graminearum vom, refuzarea 70
cereale
lenol
Fusarium culmorum
hranei
(oarece)
leucopenie toFusarium
xic de origine 4 (obolan)
Toxina T-2
cereale
sporotrichioides
alimentar
Ergotamina secar
Claviceps purpurea
neurotoxin
55encefalomalacia ecvin
55edem pulmoFumonizin porumb
Fusarium moniliforme nar - la ecvine ?
55carcinom
esofagian - la
suine
2030
porumb, cereale, Penicillium verrucosum
Ochratoxina
nefrotoxic
(obolan)
boabe de cafea
Aspergillus ochraceus
edem, hemo35
suc de mere,
Penicillium expansum ragii, posibil
Patulina
produse din mere
(oarece)
carcinogen
Penicillium
efect tremorgen 1,05
Penitrem A
nuc
aurantiogriseum
(oarece)
Sterigmatocistina

cereale, boabe de
Aspergillus versicolor
cafea, brnz

Acid
tenuazonic

past de tomate

Alternaria tenuis

Zearalenona

porumb, orz,
fin

Fusarium graminearum Efect estrogen

227

hepatotoxic,
carcinogen
Convulsii, hemoragii

166
(obolan)
81
(oarece
) 186
(oarece
)
nu prezint
toxicitate
acut
Tabelul 7.2.

Limitele admise pentru micotoxine


Micotoxine
Aflatoxine n alimente
Aflatoxina M1 n lapte
Deoxinivalenol n fin
Ochratoxina A n alimente
Patulina n sucul de mr
Toxina T2
Zearalenona

Limite admise (g/kg)


0
0-1
1000-4000
1-300
20-50
100
30-1000

Nr. de ri
48
17
5
6
10
2
4

7.1. Aflatoxinele
Aflatoxinele reprezint un grup de metabolii secundari elaborai dup
faza de cretere logaritmic a unor tulpini toxigene de Aspergillus. Sunt de
departe cele mai studiate micotoxine.
Sunt cunoscute, nc din anii 1960, cnd mai mult de 100.000 de
pui de curc au murit n Anglia dup ce au consumat o mncare cu alune,
importat din Africa i America de Sud. Din alimentul toxic au fost izolate
Aspergillus flavus i o toxina produs de acest microorganism, care a fost
denumit aflatoxin (toxina lui A. flavus: A-fla-toxin).
Aspergillus flavus este un microorganism mezofil care se dezvolt la
temperaturi cuprinse ntre 6C i 46C, cu un interval optim de 36-38C.
Umiditatea, substratul, gradul de aerare etc sunt foarte importante
pentru dezvoltarea tulpinilor aflatoxigene.
Aspergillus flavus se dezvolt i elaboreaz aflatoxine cnd umiditatea
relativ a aerului este de 80% i a substratului de 30%.
Temperatura optim de dezvoltare n condiii de laborator este de 25C,
cnd tulpina este cultivat pe arahide, iar elaborarea aflatoxinei ncepe din a
7 a pn n a 9 a zi de cultivare (Diener i Davis, 1966).
Hesseltine i col. (1966) au publicat o sintez a cercetrilor privind
producerea aflatoxinei pe boabele de cereale ntregi sau mcinate: porumb,
gru, orez. Mayne i col. (1966) au artat c producia de aflatoxine pe
seminele de bumbac a fost egal cu cea de pe gru i de dou ori mai
mare dect cea de pe arahidele infectate cu Aspergillus flavus. Cantiti de
ordinul zecilor de g/ml aflatoxin au fost obinute prin cultivarea fungului
pe sucuri de mere, caise, grapefruit, struguri, portocale, piersici, ananas,
roii (Wildman citat de Diener i Davis, 1969) precum i pe alte substraturi
alimentare ca: paste finoase, brnz, lapte praf, alune de pdure, nuci,
semine de mac, miez de nuc de cocos, cartof, bacon afumat, mazre,
228

fasole, prune, mere, pere, smochine (Frank, 1966).


n general, datele existente n literatur indic faptul c substraturile
bogate n glucide (gru, orez) favorizeaz producerea unor cantiti mai
mari de aflatoxine dect cele bogate n ulei (arahide, bumbac, soia), (Diener
i Devis, 1969).
Studiile asupra naturii toxine a acestor substane, relev urmtoarele
4 componente.

Aspergillus flavus produce AFB1 i AFB2, iar Aspergillus parasiticus


produce toate cele 4 aflatoxine majore (B1, G1, B2 i G2) n funcie de culoarea
fluorescentei lor n lumina UV de 254 i 366 nm (B - blue, G - green) i de
poziia lor pe placa cromatografic.
Aceti compui sunt cumarine, nalt substituite, fiind cunoscute cel
puin 18 toxine nrudite. AFM1, este un produs hidroxilat al lui AFB1, i
apare ca produs metabolic n lapte, urin, fecale.
AFL, AFLH1, AFQ1, i AFP1, sunt derivai din AFB1, AFB2 (este forma
2,3-dihidro- a lui AFB1).
Toxicitatea celor mai potente aflatoxine descrete n ordinea urmtoare:
B1-M1 -G1-B2-M2-G2. Privite n lumin ultraviolet prezint urmtoarea
fluorescen: B1 i B2 - albastru, G1 - verde, G2 -verde-albstrui, M1 -albastru
violet, M2 - violet.
Aflatoxinele sunt metabolii secundari al cror schelet de carbon vine
de la acetat si malonat.
Calea parial propus pentru sinteza AFB1 este urmtoarea: acetatacid
norsolorinic-averantin-averufanin-averufin-acetat
verziconal
hemiacetal, versicolorina A, sterigmatocistina, metil-sterigmatocistina
229

O, AFB1.Verzicolorina A este prima din lan, care conine legtura dubl


esenial C2-C3.
Proprietile fizico-chimice ale aflatoxinelor
Aflatoxinele naturale sunt compui foarte stabili n substraturile
alimentare i furaje, fiind foarte reactivi la extremele de pH (10< pH< 3), n
lumin UV i n prezena oxigenului, reactivitate datorat ciclului furanic
nesaturat i structurii lactonice.
Din 25 de probe de A. flavus i A. parasiticus pe agar la 2C, 7C,
41C sau 46C n 8 zile, nu a fost produs nici o aflatoxin, sub 7,5C sau
peste 40C, chiar i n condiii favorabile.
Pe agarul Sabouraud dezvoltarea minim a lui A. flavus i A. parasiticus
a aprut la 33C, la un pH 5 i un aw=0,99. La 15C dezvoltarea a aprut
la un aw=0,95, n timp ce la 27C i la 33C, la aw=0,85 s-a observat o
dezvoltare slab.
ntr-un studiu, creterea maxim a lui A. parasiticus a aprut la 35C,
dar nivelul cel mai nalt de toxin a fost produs Ia 25eC.
Coninutul limitant (pn la 50 ng/g) de umezeal pentru AFB1 i AFB2
n porumb a fost de 17,5% la o temperatur peste 24C. La temperatura de
13C nu a avut loc producia de toxin. Per ansamblu producerea de toxin
(cu valori raportate de 0,71 -0,94) a avut loc la un pH de 0,93-0,98.
ntr-un alt studiu creterea maxim a lui A. parasiticus a avut loc la
35C, dar cel mai nalt nivel de toxin s-a produs la 24C.
Per ansamblu parametrii maximali i minimali ce controleaz
dezvoltarea i producerea de toxin de ctre aceste organisme eucariote,
nu sunt uor de definit, pe de o parte datorit habitatelor diverse din natur,
iar pe de alt parte datorit statutului lor de eucariote. Este clar c se pot
dezvolta fr s produc toxine.
AFG1 este produs la temperaturi de cretere mai mici dect AFB1. n
timp ce unii cercettori au gsit mai mult AFB1 dect AFG1 la 30C, alii au
gsit o producie relativ egal.
A. flavus produce numai AFB1 i AFG1. Aerarea favorizeaz producerea
de aflatoxin. Aceasta poate fi produs n cantiti de 2 mg/g, de ctre
substane naturale ca orezul, porumbul, soia i altele.
n bulion cu cantiti potrivite de Zn2+ pot fi produse pn la 200-300
mg/l. Eliberarea de AFB1 de ctre A. flavus implic un sistem de transport
energo-dependent.
230

Toxicitatea, mecanismul de aciune i metabolismul aflatoxinelor


Efectele toxice acute ale aflatoxinei se datoreaz interferenei ei cu
replicarea, transcripia i transducia DNA-ului, deci inhibiia sintezei proteice
(Moule, 1977). Inhibiia este rapid i intens chiar la doze de 1/20 din DL50
(Lafage i Frayssinet cit. de Moule, 1977). Aceste tulburri biochimice au
drept consecin alterarea infrastructurilor celulare, segregarea nuclear,
deformri polisamice, agregarea granulelor intercromatiniene etc.
Sistemele metabolizante ale mamiferelor sunt eseniale pentru
aflatoxina AFB1 pentru exprimarea mutagenicitii. De asemenea, este
esenial legarea de acizii nucleici, n special de DNA. AFB1 se leag de
DNA-ul mitocondrial al ficatului, preferenial fa de cel nuclear.
Situsul responsabil pentru mutagenicitate al aflatoxinei este dubla
legtur din molecula de dihidrofurofuran C2-C3. Reducerea sa la forma
2.3 dihidro(AFB2) reducemutagenicitatea de 200-500 ori. Leziunile
genetice predominante induse de aflatoxine sunt mutaiile punctiforme. S-a
demonstrat c mutageneza lui AFB1 poate fi potenat de 2 ori de ctre BHA
(hidroxianisol-butilat) i de BHT (hidroxitoluen-butilat).
DL50 de AFB1 pentru obolani pe cale oral este de 1,2 mg/kg i de 1,52,0 mg/kg pentru AFG1. Bobocii de ra i puietul de pstrv sunt printre
cele mai sensibile, fiind urmate de obolani (30-1/713). Majoritatea speciilor
de animale susceptibile mor n trei zile dup administrarea toxinelor, apar
grave distrucii ale ficatului, care dup examinare post mortem relev c
aflatoxinele sunt hepato-carcinogene.
Toxicitatea este mai mare pentru animalele tinere i pentru masculi,
dect pentru animalele mai n vrst i pentru femele, iar efectele sunt
sporite de dietele srace n proteine.
Evidenele circumstaniale arat c aflatoxinele sunt cancerigene
pentru oameni. Se pare c aflatoxinele au o influen destul de mare n
producerea sindromului EFDV n Tailanda, sindromului Reye n Noua
Zeeland i a hepatomului acut la un copil din Uganda. n ultimul caz s-au
gsit modificri histologice identice cu cele observate la maimuele tratate
cu aflatoxine.
Doi cercettori care au lucrat cu aflatoxina purificat au fcut
carcinom de colon. Riscul apariiei cancerului de ficat n urma consumului
de aflatoxine este de 30 de ori mai mare pentru indivizii care au fost expui
hepatitei A.

231

Tabelul 7.3.

DL50 n cazul aflatoxinelor pentru diferite specii de animale

Specie

boboc de ra

obolan

hamster
porc de guineea
iepure

Vrst (sau greutate)


1 zi
1 zi
1 zi
21 zile
21 zile
100 g
100g
150 g
30 zile
adult
nrcat

Sex
M
M
M-F
M
F
M
M
F
M
M
M-F

Cale
per os
per os
per os
per os
per os
per os
intraperitoneal
per os
per os
intraperitoneal
intraperitoneal

DL50 (mg/kg)
0,37
0,56
1,0
5,5
7,4
7,2
6,0
17,9
10,2
15,0
9,0

adult

M-F

intraperitoneal

0,5

adult
100 g

M-F
M-F

per os
per os

0,38
7,5

cine
pstrv
Dup Wogan G. N.

AFB1 i AFB2 se pot distruge din porumb prin folosirea bisulfitului.


Smochinele uscate dozate cu 250 ppb de AFB1 au fost supuse la cteva
tratamente observndu-se urmtoarele aspecte:
1) n cazul folosirii bisulfitului de sodiu 1% s-a produs o reducere cu
28,2% n 72 de ore;
2) apa oxigenat 0,2% a produs o reducere de 65,5%;
3) nclzirea la 45-65C pentru o or a produs o reducere de 68,4%;
4) radiaia UV a produs o reducere 45.7%.
Seminele de bumbac contaminat cu aflatoxin, tratate cu amoniac i
date vacilor, au coninut niveluri mai mici de AFB1 n lapte, dect produsele
netratate.
S-a demonstrat c Flavobacterium aurantiacum produce AFB1 ntr-o
mare varietate de alimente. Aceast bacterie n cantitate de 1010cfu/ml, din
filtratele de culturi mai vechi de 72 de ore, au fost mai eficiente dect cele
din culturile proaspete (24-48 de ore).
ntr-un alt studiu s-a dovedit c Mg2+ i Ca2+ sporesc activitatea
distructiv a acestei bacterii. Cu toate c nu degradeaz aflatoxinele,
bifidobacteriile i bacteriile acidolactice se leag de AFB1 i AFM1 n culturi
i substraturi alimentare. Att celulele vii, ct i cele moarte se leag de
aceste micotoxine.
232

Mixobacterianannocystis exedens care triete n sol, a fost testat


mpotriva exosporilor i hifelor productoare de aflatoxine, A. flavus i A.
parasiticus, iar rezultatele au artat c ambii fungi au fost inhibai dup
14 zile la 28C. De fapt, mixobacteria a lizat dezvoltarea coloniei dup 24
de ore. Nu este de neconceput c principiul activ pote fi extras i folosit n
forma purificat mpotriva altor fungi i chiar a unor bacterii.
Descoperirile din acest studiu sugereaz c unele mixomicete pot fi
eficiente n distrugerea fungilor micotoxigenici.
Tabelul 7.4
Limitele admise de aflatoxine n alimente, n diferite ri
ara
Marea Britanie

Limita (g/kg)

Alimente

nuci, smochine uscate


aceleai de sus, dar pentru procesate
toate alimentele
aflatoxina M1 n lapte integral,
lapte degresat, lapte smntnit
toate alimentele cu excepia produselor pe baz de alune
produse pe baz de alune
toate alimentele
toate alimentele
orez, alune, porumb, sorg, fasole,
fin, orz i ovz

5
20

SUA

Australia

0,5
5

India
Japonia

15
30
10

China

50

Analize chimice pentru evidenierea aflatoxinelor


Acestea se mpart n 4 categorii: vizuale, calitative rapide, de confirmare
i cantitative (Romer, 1976).
1) Metoda rapid de vizualizare a aflatoxinei n lumin UV permite
identificarea acesteia n porumb la o concentraie de peste 10 ppb (Shatwell
i col. 1972).
2) Testele de screening calitative rapid sunt cele mai numeroase i mai
des utilizate, att n cercetarea micotoxicologic, ct i n scopuri practice.
Metodele oficiale n vigoare n diferite ri indic utilizarea pentru
extracia aflatoxinelor a sistemelor: metanol-ap (Liem i Belfoars); acetonap (Ponce i col.); cloroform-ap (Velasco. 1970); acetonitril-KCI (Stahr,
233

1977).
Procedeele de purificare a extractului primar depind de compoziia
chimic iniial a substratului analizat. Cele mai dificile sunt cele care
implic analizele nutreurilor combinate, datorit multiplelor posibiliti
de interferen fizico-chimic. Cel mai indicat procedeu n acest sens este
utilizarea unui precipitat de plumb acid, urmat de trecerea fazei lichide pe o
coloan de absorbie cu gel de aluminiu acid (Ponce i col, 1971).
Separarea, identificarea i evaluarea aflatoxinelor se face prin procedee
cromatografice: cromatografie, n strat subire (CSS), cromatografie n faz
de gaz-lichid (CGt) i cromatografie de lichid de nalt presiune (CtIP).
3. Testele de confirmare se realizeaz de obicei prin reacii de
derivatizare a aflatoxinei in situ pe placa cromatografic cu diferii reactivi
chimici.
Derivatizarea are drept scop modificarea culorii fluorescentei
aflatoxinei n lumin UV de 366 nm.
4. Pentru evaluarea cantitativ a aflatoxinelor din alimente i
substraturife furajere, fluorodensimetria reprezint cea mai practic metod
(Peterson, Stotoff, 1972). O nou metod cantitativ pentru determinarea
aflatoxinelor o reprezint cromatografia n lichid de nalt presiune (CLIP)
(Engsticom i col.).

7.2. Toxinele produse de Alternaria


Sunt produse de mai multe specii de Alternaria. Au fost gsite n
mere, roii i alte alimente. Toxinele produse includ alternariolul, eter de
alternariol monometil, alternuen, acid tenuazonic si altertoxina-1.
Pe felii de mere, roii sau afine zdrobite, incubate 21 de zile la 21C, mai
multe specii de Alternaria au produs toxine n cantitate de 137 mg/100g.
ntr-un alt studiu, acidul tenuazonic a fost principala toxin produs
n tomate cu niveluri pn la 13,9 mg/100g. Pe portocale i lmi, A. citri
a produs acid tenuazonic, alternariol i eter de alternariol monometil, n
concentraie de 1,15 - 2,66 mg/100g. Fructele au fost incubate la temperatura
camerei pentru 21-28 de zile.
ntr-un studiu pe 150 de probe de floarea soarelui n Argentina,
85% conineau alternariol, 47% alternariol eter monometil i 65% acid
tenuazonic.
n urma fermentrii timp de 28 de zile de ctre A. alternata i separarea
uleiului de aliment, toxinele au fost gsite numai n ulei.
O tulpin de A. alternata a produs stemfiltoxina III, care s-a dovedit a
fi mutagen prin testul Ames.
234

Specii de Alternaria i leziunile pe care le produc


la om, plante i animale
* Alternaria alternata - cauzeaz infecii respiratorii, la pacienii
HIV pozitivi, astm, rinosinuzite cronice. Cauzeaz tciunele cartofilor i
altor plante.
* Alternaria arborescens - distrugerea celulelor stem la roii
* Alternaria arbusti - pete pe frunzele prului asiatic
* Alternaria blumeae - leziuni la Blumea aurita
* Alternaria brassicae - legume i trandafiri
* Alternaria brassicicola - culturi de varz
* Alternaria brunsii - semine de chimen
* Alternaria carotiincultae - frunze de morcov
* Alternaria conjuncta - pstrnac
* Alternaria dauci - morcov
* Alternaria euphorbiicola - culturi de varz
* Alternaria gaisen - leziuni punctiforme la pere
* Alternaria infectoria - fin
* Alternaria japonica - culturi de varz
* Alternaria molesta - leziuni cutanate la marsuini (mamifer
cetaceu)
* Alternaria panax - ginseng
* Alternaria petroselini - frunze de ptrunjel
* Alternaria selini - ptrunjel
* Alternaria solani - cartofi i roii
* Alternaria smyrnii - ptrunjel

7.3. Citrinin
Cu toate c ciupercile productoare de citrinin au fost gsite pe boabele
de cafea i cacao, acestea nu au produs micotoxine n aceste substraturi.
Citrinina este o substan cristalin cu greutatea molecular de 250 Kda
i punctul de topire la 170-1710C. n stare cristalizat din alcool citrinin
(C13H14O5 ) formeaz cristale aciforme de culoare galben-citrin care n
lumin UV de 366 nm prezint fluorescen galben strlucitoare.
235

Citrinina este puin solubil n ap, dar solubil n soluii diluate de


NaOH i Na2CO3, i n majoritatea solvenilor organici.
Citrinina este o micotoxin izolat pentru prima dat din Penicillium
citrinum. Este produs de o mare varietate de fungi, folosii n producerea
unor alimente ca brnzeturi, cereale, sake i pigmeni roii.
Citrinina este o nefrotoxin ce cauzeaz nefropatii n efectivele de
animale i a reprezint unul dintre agenii etiologici ai nefropatiei balcanice
i a febrei galbene de orez.
Citrinina este folosit ca reagent n cercetarea biologic. Induce
permeabilitate mitocondrial, i inhib respiraia prin interferena cu
complexul I al lanului respirator.
Citrinina este produs de ctre Penicillium citrinum, P. viridicatum,
Aspergillus niveus, Aspergillus ochraceus, Aspergillus oryzae, Aspergillus
terreus, Monascus ruber, Monascus purpureus, Penicillium citrinum,
Penicillium camemberti. A fost izolat din orez, pine mucegit, unc
preparat n cas, gru i alte produse similare.
Este un cunoscut cancerigen. Din 7 tulpini de P. viridicatum toate au
produs citrinin n bulion cu dextroz de cartof, n 14 zile la 20-30C, dar
nu i la 10C.
Citrinin a fost identificat n Germania din alimentele mucegite i
mpreun cu alte micotoxine a putut fi produs ntr-un mediu sintetic.
Din culturile de micei toxigeni, citrinina poate fi obinut prin extracii
simple la rece cu cloroform.
Din furaje i, n special din nutreurile combinate, tehnica de izolare
i identificare este mai complicat, implicnd i etapele de degresare i
decolorare (Coman i col. 1978).
236

Pentru confirmare se poate folosi sistemul de developare toluen acetat de etil-acid formic.

7.4. Ochratoxinele
Ochratoxina A este o substan cristalin, incolor, optic activ n
cloroform i fluorescent n lumina UV de 254 nm i 366 nm. Greutatea
ei moleculara este de 403 kda, iar punctul de topire de 90C, cnd este
cristalizat din benzen i 169C cnd este cristalizat din xilen (Steyn i
Holzapfef, 1967).

Ochratoxina B este analogul decolorat al ochratoxinei A care se


observ n lumin UV fluorescent albastr. Micotoxina pur se prezint
sub forma unei substane cristaline incolore cu greutate molecular de 369
Kda, fiind rar ntlnit n condiii naturale de mediu Krogh, 1979).
Ochratoxina C este un ester etilic amorf al ochratoxinei A (Ioan Coman
i Ovidiu Popescu, 1985).
Ochratoxinele fac parte, mpreun cu citrinina, acidul oxalic i
viridicatumtoxina, din grupul micotoxinelor nefrotoxice, care sunt
implicate n etiopatogenia afeciunilor renale, ntlnite la om i animale.
Ele sunt produse de micei ce aparin taxonomic genurilor Penicillium i
Aspergillus.
Ochratoxinele au fost evideniate pentru prima dat n condiii de
laborator, n cursul testrii toxicitii tulpinilor de micei din cereale i
legume (Ioan Coman, Ovidiu Popescu, 1985).
Acestea conin un grup de 7 metabolii asemntori structural, din care
ochratoxina A (OA) este cea mai cunoscut i cea mai toxic.
OB este OA declorinat i mpreun cu OC poate aprea n mod natural.
OA este produs de un numr mare de fungi, incluznd A. ochraceus. A.
alliaceus, A. ostianus, A mellus, A. niger i A carbonarius. Ultima a fost
237

gsit n Spania ca principal productor de OA din fructele uscate. Din 91


de izolate, 97% au fost productori de OA.
Dintre speciile de Penicillium productoare de OA menionm: P.
cyclopium, P. variable i altele.
OA este produs la niveluri maxime la temperaturi de 30C i la un aw
0,95. A. ochraceus produce OA n furajele pentru psri la un aw minim de
0,85 i la temperatura de 30C.
La obolani Dl50 este de 20-22 mg/kg, avnd un efect hepatotoxic i
nefrotoxic. Aceste micotoxine au fost gsite n porumb, boabele de cacao,
boabele de soia, ovz, orz, citrice, nuci de Brazilia, tutun mucegit, alune,
boabe de cafea i alte produse similare. A. ochraceus a produs OA i OB n
mncruri de orez i alune.
ntr-un studiu pe 4 inhibitori chimici privind dezvoltarea i producerea
de OA la un pH de 4,5 n ordinea eficienei enumerm: sorbat de potasiu propionat de sodiu - paraben metil - bisulfit de sodiu; n timp ce la un pH
de 5,5 cele mai eficiente au fost paraben metilul i sorbatul de potasiu. Ca
multe alte micotoxine OA este termostabil. ntr-un studiu OA nu a putut
fi distrus prin procedurile normale de gtire din boabele de faba (specie de
fasole originar din Africa).
n lumina UV, OA are o culoare verzuie, n timp ce OB emite o culoare
albastr. OB induce o mitoz anormal n celulele renale de maimu.
Biocenoza unui substrat condiioneaz n mare msur producia
de ochratoxine, ntruct ntre elementele unui ecosistem pot exista relaii
de antagonism sau de simbioz (loan Coman, Ovidiu Popescu, 1985).
De exemplu A. ochraceus nu se poate dezvolta pe grunele de cereale
contaminate deja cu A. glaucus. Fenomenul ar putea explica incidena mai
redus a afeciunilor produse de A. ochraceus (Christensen, 1962).
n condiii experimentale, ochratoxina s-a dovedit a fi teratogen i
carcinogen.
Odat ptrunse n organism ochratoxinele sunt absorbite foarte lent
n tractul digestiv, ncepnd din stomac i continund pn n intestinul
subire.
Imediat dup absorbie, ochratoxina A poate fi ntlnit liber n snge
(Galtia, 1974) sau legat de proteine (Chu. 1971).
Ochratoxinele afecteaz echipamentul enzimatic celular, determinnd
astfel tulburri metabolice grave.
Ochratoxina A inhib RNA-sintetaza i implicit procesele de sintez
ale proteinelor la nivelul diferitelor celule microbiene, precum i celulele
hepatomului la obolan (Creppy i col., 1979).
Experienele efectuate pe obolan au demonstrat c aceast micotoxin
238

inhib gluconogeneza renal printr-un efect exercitat asupra carboxikinazei


fosfoenolpiruvatului renal, n timp ce enzima hepatic similar a rmas
neafectat (Meisner i Selanic, 1979).
Ochratoxinele produc la om nefropatia endemic balcanic (nefrita
endemic) descris pentru prima dat n 1950. A fost diagnosticat la
populaia rural din Bulgaria, Iugoslavia, Romnia. Este ncadrat n grupa
nefritelor cronice i se ntlnete mai des la femei ntre 30-50 ani, producnd
o mortalitate ridicat (loan Coman, Ovidiu Popescu, 1985).
Cele mai multe metode de identificare a ochratoxinelor se bazeaz pe
cromatografie. O separare bun a ochratoxinelor A i B prin cromatografie
preparativ a fost realizat de ctre Steyn (1969) pe silicagel impregnat cu
acid oxalic 5% dup developare cu un sistem neutru de solveni.
Aceast faz staionar a fost utilizat n cromatografia pe coloan
pentru separarea ochratoxinei A de compuii acizi nrudii (Scott i col.,
1970).

7.5. Patulina
Patulina este un antibiotic toxic produs de un numr mare de fungi
ce aparin genurilor Penicillium (P. claviforme, P. expansum, P. patulum),
Aspergillus (A. clavatus, A. terreus i alii) i Byssochlamys (B. nivea, B.
fulva). n mai multe ri s-au impus restricii n folosirea patulinei drept
conservant n produsele pe baz de mere. OMS (WHO) recomand o
concentraie maxim de 50 g/l n sucul de mere. n UE, limita maxim
admis este 50 g/kg att n sucul de mere, ct i n cidru, 25 g/kg n
produsele pe baz de mere, pentru aduli i 10 g/kg n produsele pe baz
de mere pentru copii (1 noiembrie 2003).
Proprietile sale biologice sunt asemntoare cu cele ale acidului
penicilic. Unii fungi pot produce patulina i sub 2C
Aceast micotoxin a fost gsit n pinea mucegit, crnai, fructe,
suc de mere, cidru, i alte produse. Au fost gsite n sucul de mere (de pn
la 440 g/l) i n cidru (pn la 45 ppm). A fost identificat n alimentele
mucegite examinate n Germania.
P. expansum i P. patulum au nevoie petru dezvoltare de un minim de
aw de 0,83 i 0,81.
P. patulum i P. roquefortii au produs patulina n 10 zile n bulion cu
dextroz de cartofi, prin incubare la 12C. P. roquefortii a produs pn la
1033 ppm. Patulina a fost produs i n sucul de mere la 12C de ctre B.
nivea, cea mai mare concentraie obinndu-se dup 20 de zile la 21C
Aceti cercettori au confirmat c producia de patulin este favorizat
239

de temperaturi sub optimul de cretere. Ulterior au fcut cercetri pe P.


expansum i au observat c producia de patulina are loc peste intervalul de
5-20C i n cantiti mici la 30C.
n 5 probe comerciale din Georgia, nivelurile patulinei au fost de 244
pn la 3993 g/l. Atmosfera de CO2 i N2 a redus producia da patulin
(comparativ cu aerul). SO2 s-a dovedit mai eficient dect sorbatul de potasiu
sau benzoatul de sodiu n inhibarea produciei de patulina.
DL50 pentru obolani administrat
pe cale subcutanat este de 15-25 mg/
kg. Iar la unele dintre animale induce
formarea sarcoamelor subcutanate.
Patulina
produce
aberaii
cromozomale n celulele animale i
vegetale i este carcinogen. Inhib
sinteza RNA-ului n culturi celulare
(Kawasaki, 1972). Doza de aciune
cancerigen a patulinei a fost adus
nc din 1961 de ctre Dickens i Jones.
Autorii au inoculat subcutanat de 2 ori pe sptmn obolanilor
masculi de 61-64 sptmni cte 0,2 mg de patulin solubilizat n ulei
de arahide. La locul de injectare au aprut formaiuni tumorale la 6 din 6
animale, care au supravieuit la sfritul experienei.
Patulina este dotat cu importante proprieti citostatice i
antibacteriene, dar toxicitatea sa pentru animalele de laborator, aciunea sa
mutagen faa de levuri i puterea ei cancerigen au mpiedicat utilizarea n
terapeutic (Ioan Coman i Ovidiu Popescu, 1985).
Evidenierea patulinei n substraturi se face deobicei prin cromatografie
n strat subire sau pe coloan. Ca solvent se folosete deobicei acetatul de
etil. Dup extracie purificarea se face prin cromatografie pe coloan, folosind
ca element de separare alumina, silicagelul sau rinile schimbtoare de
ioni (Norstadt).
Rezidul brut obinut dup evaporarea extractului pe baia de ap (n vid
sau n curent de N2), ori fraciile purificate prin cromatografie pe coloan sunt
etalate pe plci cu silicagel, care se developeaz ntr-un tanc cromatografic.
n care se gsete sistemul toluen-aceton-cloroform.
Dup developare plcile se usuc n curent de aer cald i se vizualizeaz
n lumin UV, de 254 nm, condiii n care patulina apare ca un spot ntunecat
(Frank. 1976).
240

7.6. Acidul penicilic


Aceast micotoxin posed proprieti biologice similare cu patulina.
Este produs de un numr mare de fungi care includ specii din genul
Penicillium (ca de exemplu, P. puberulum) i membrii ai grupului A.
ochraceus. Unul dintre cei mai mari productori de acid penicilic este P.
cyclopium.
A fost gsit n porumb, fasole i alte cereale. A fost cultivat
experimental n brnza elveian.
DL50 pentru oarece administrat pe cale subcutanat este de 100-300
mg/kg i este cangerigen.

Din 346 de izolate cu Penicillium din salam, aproximativ 105 au


produs acid penicilic n mediile lichide, dar n cinci probe de crnai nu s-a
produs toxina nici dup 70 de zile.
Din 183 de fungi izolai din brnza elveian la 5C, 87% au fost din
genul Penicillium. Extractele de Penicillium au fost toxice n proporie de
35% pentru embrionii de gin, 5,5% din amestecurile toxice au coninut
acid penicilic, patulin i aflatoxine.
Acidul penicilic a fost produs la 5C, n 6 sptmni de 4 din 33 de
tulpini fungice.

7.7. Sterigmatocistina
Sterigmatocistina i derivaii si au fost izolai iniial n condiii de
laborator din culturi de Aspergillus versicolor (Bullocu si col, 1962, Pohland,
1976), P. luteum (Dean, 1963), A. nidulans, A. rugulosus (Ballantin i col
1965), Bipolaris sorokiniana Drechslera (Holzapfel si col. 1966).
Coman i col., 1981 au izolat din nutreuri combinate trei tulpini
toxigene de A. versicolor, capabile s sintetizeze sterigmatocistina.
Sterigmatocistina a fost identificat pe cromatoplci, pe baza fluorescenei
i a valorii RG-ului.
Unele sortimente de brnz care reclam n procesul de preparare i
241

o faz de maturare se pot contamina foarte uor cu micei n spaiile n care


sunt depozitate.
Nortbolt i col, (1980) au izolat din astfel de probe de brnz mucegit
o flor micotica variat.
Din 39 de probe analizate micotoxicologic, 9 au coninut
sterigmatocistin, n cantiti cuprinse ntre 5 i 600 g/kg.
Aciunea chimic a derivailor furofuranici fa de animalele de
laborator depinde de specie, dar i de structura lor chimic.
Sterigmatocistina a indus carcinogeneza la
obolani prin inoculri subcutanate sau
administrri orale (Dickens i Jones).
Intoxicaia oral cronic a maimuelor
s-a caracterizat clinic prin scaune frecvente i
hepatit cronic (Van der Watt).
Sterigmatocistina este o micotoxin
nrudit structural i biochimic cu aflatoxinele,
avnd activitate hepatocancerigen la animale.
Sunt cunoscui cel puin 8 derivai.
DL50 pentru obolanii infectai intraperitoneal este de 60-65 mg/kg. n
lumina UV toxina are o culoare fluorescent, roie-crmizie nchis.
Cu toate c nu se gsete n produsele naturale, a fost izolat din gru,
ovz, brnz danez i boabe de cafea. Sterigmatocistina se nrudete cu
aflatoxinele dar nu este la fel de potent ca acestea. Acioneaz prin inhibarea
sintezei de DNA.
O metod semnificativ de evaluare a sterigmatocistinei din brnz
a fost comunicat de Egmond i col. (1980). Metoda const n extracia
micotoxinei cu metanol -clorur de potasiu 4%, purificarea extractului pe o
coloan de florisil i poliamid i apoi evidenierea sterigmatocistinei prin
cromatografie n strat subire bidimensional.
Testul de confirmare const n etalarea extractului brut pe placa
cromatografic, developarea acesteia n cloroform metanol i urma ei
uniform dup uscare cu acid trifluoracetic benzen.
Metoda este suficient de sensibil pentru a putea permite detectarea
sterigmatocistinei n concentraii de pn la 5g/kg.

7.8. Fumonizinele
Fumonizinele sunt produse de Fusarium spp. pe porumb i pe alte
cereale, iar mbolnvirile la oameni i animale sunt asociate cu consumul
de cereale sau produse ale acestora, care conin niveluri ridicate de astfel de
242

mucegaiuri.
Speciile care produc fumonizine sunt: F. sacchari, F. subglutinans,
F. thapsinum, F. globosum, F. anthophilum, F. dlamini,F. napiforme, F.
nygami, F. moniliforme, F. proliferatum. Ultimele 3 specii produc cantiti
mari de toxin. F. moniliforme (iniial denumit F. verticilliodes; Gibberella
fujikuroi) este cea mai studiat dintre cele 3.
Prevalena lui F. moniliforme este mai mare n porumb n zonele unde
exist o rat ridicat a cancerului esofagian.
Exist cel puin 15 fumonizine, cele mai cunoscute fiind: FB1, FB2,
FB3, FB4, FA1, FA2, FA3.
Cele mai importante sunt FB1-FB3 celelalte fiind considerate minore.
Din 9 tulpini de F. moniliforme, FB1 , produs n grul autoclavat n cantitate
de 960 - 2350 micrograme/g n timp ce FB2 a fost produs ntre 120-320
g/g.

Fuzarina A Fuzarina B

Fuzarina C este produs de ctre F. moniliforme, dar aparent nu este


implicat n activitatea hepatocancerigen. S-a demonstrat prin testul Ames
c are un efect mutagen.
O cantitate mai mare a fost obinut pe mediile de cultur, la pH 6,0,
ntre ziua a 2-a i a 6-a, la o temperatur de 28C.
Structura chimic a lui FB1 i FB2 difer prin faptul c FB1 are o
grupare OH n loc de H pe carbonul 10. Aceste toxine difer de majoritatea
celorlalte pentru c nu posed grupri ciclice sau inelare, fiind solubile n
ap. Pe de alt parte sunt termostabile ca i alte micotoxine.
ntr-un studiu, materialele de cultur liofilizate care conineau FB1 au
fost fierte 30 de minute, iar apoi uscate la cuptor la 60C, 24 de ore fr s-i
piard activitatea toxic.
ntr-un alt studiu a fost demonstrat stabilitatea termic a acestor
toxine la un nivel de 5 g/g de FB1, n porumbul procesat. La 204C, 30
minute nu s-a nregistrat nici o pierdere important. Reducerea complet s-a
nregistrat la 218C, 15 minute.
O reducere semnificativ a fost observat la pinea de porumb la
232C, 20 minute.
243

ntr-un studiu privind stabilitatea termic a acestor toxine n conserve,


au fost adugate 5 g/g, dup care acestea au fost reconservate. Nu s-a
observat nici o reducere semnificativa n porumbul cremat pentru copii i n
mncarea pentru cini, reduceri semnificative aprnd n porumbul crem.
La animalele de experien, ficatul este inta principal a FB1. ntr-un
alt studiu, pe obolani pe o perioad de 26 de luni, toate animalele care au
murit (dup 18 luni) au prezentat: ciroz micro i macronodular, noduli
mari expansivi de colangiofibroz la nivelul hilului hepatic.
Colangiofibroza este considerat un precursor al leziunilor de
colangiocarcinom.
Din 15 obolani care au murit ntre 18 i 26 de luni, 66% au prezentat
carcinom hepatic primar. Ctre sfritul studiului au aprut i unele
disfuncii renale. Nu au fost nregistrate leziuni esofagiene sau modificri
neoplazice.
Activitatea hepatocancerigen a lui FB1 la oareci a fost demonstrat
prin adugarea de 50.000 g/g n raiile alimentare, ntr-o perioad de 26 de
luni.
ntr-un alt studiu s-a demonstrat c FB1 este cancerigen prin
capacitatea sa de a mri activitatea -glutamiltranspeptidazei la oareci.
Leucoencefalomalacia (LEM) a fost reprodus la un cal prin injectarea
intravenoas a 7 doze de 0,125 mg/g greutate corporal de FB1, zilnic pe o
perioad de 10 zile.
La un porc, dup 4 zile de administrare a unei cantiti de 0,4 mg
FB1/g s-a produs edem pulmonar.
Prevalenta cancerului esofagian la om, n Transkei, Africa de Sud este
corelat statistic cu nivelurile ridicate de FB1 si FB2 din cereale.
7.9. Sambutoxina
Sambutoxina a fost izolat pentru prima dat n 1994, iar structura sa
este prezentat mai jos.
A fost asociat cu cartofii putrezii i
uscai. Este produs de tulpinile de Fusarium
sambucinum i F. oxysporum. Din 13 specii
de Fusarium, 90% au produs aceast toxin.
Din probele de cartofi mucegii din Coreea,
9 din 21 au coninut 15,8-78,1 ng/g de
sambutoxin.
Toxina a fost gsit n cartofii din Irak
unde exist o inciden mare a cancerului esofagian.
244

7.10. Zearalenonele
Exista 5 tipuri de zearalenone naturale, produse de Fusarium spp. (n
special F. graminearum i F. tricinctum). Zearalenonele se produc dup
acumularea unor cantiti mari de fungi n cereale.
Toxinele produc n lumina UV, cu unde lungi o fluorescen bleverzuie, iar n lumina UV cu unde scurte o culoare verzuie. Posed proprieti
estrogene i produc estrus la oareci i hiperestrogenism la suine. Nu sunt
mutagene prin testul Ames i produc un rspuns pozitiv la testul cu Bacillus
subtilis.
Metode de izolare i identificare a levurilor i mucegaiurilor
din alimente
Din cauza creterii lor lente i a capacitii relativ reduse de a concura
cu bacteriile, levurile i mucegaiurile se gsesc, cel mai probabil n alimentele
al cror mediu nconjurtor este mai puin favorabil creterii bacteriene:
pH-redus, umiditate crescut, coninut mare de sare sau zahr, temperatur
de depozitare redus, prezena antibioticelor sau expunerea la radiaii.
Analiza probelor.
Se prepar un mediu steril de agar (porii de 250 ml n sticle sau flacoane,
autoclavate 15 minute la 121C). Se rcesc la 45C, n baie marin.
Prepararea mediului se face cu mult timp nainte i se las s se
solidifice. Mediul nu se retopete, dect o singur dat sau sub presiune. Se
recomand o camer de distilare Arnold. O dat ce mediul a fost rcit, acesta
poate fi pstrat 2-3 ore nainte de folosire, cu condiia ca nivelul apei din
baia marin s fie cu 2-3 centimetri deasupra suprafeei agarului. Mediul de
elecie este reprezentat de agarul cu dextroz de cartofi. Agarul cu dextroz
de cartofi i sare este deosebit de util pentru analizarea probelor care conin
mucegaiuri de rspndire (Mucor, Rhizopus, etc.) deoarece NaCl inhib
creterea lor permind detectarea altor propagule de levuri i mucegaiuri.
Pentru inhibarea creterii bacteriene, mediul se amendeaz fie cu
antibiotice, fie cu soluie de acid tartaric 10% (dup rcirea agarului i
imediat nainte de turnarea plcilor), dup cum urmeaz:
antibiotice: se recomand clortetraciclin HCL, la un mediu
de agar cu concentraie de 40 ppm; mai pot fi folosite i alte antibiotice
(cloramfenicol, streptomicin) n aceeai concentraie cu clortetraciclina
HCL.
245

Se prepar soluia stoc prin dizolvarea a 1 gram de antibiotic n 100


ml de ap distilat steril i prin filtrare, printr-o membran de 0,45 microni.
Soluia stoc se pstreaz la ntuneric, la 4-8C. Perioada de valabilitate nu
trebuie s depeasc o lun.
soluia de acid tartaric: se sterilizeaz soluia prin filtrare printr-o
membran de 0,45 microni; se ajusteaz pH-ul la 3,5, dup adugarea
soluiei n mediu se verific din nou pH-ul.
Se prepar omologatul alimentar i se efectueaz diluii seriate. Sunt
suficiente diluii pn la 10-6 .
Se transfer cte 1 ml din fiecare diluie n plci Petri i se adaug
imediat 20-25 ml de agar cu dextroz de cartofi, rcit cu antibiotic sau acid
tartaric. Se amestec bine coninutul prin rotirea uoar a plcilor n sensul
acelor de ceasornic i n sens contrar, avnd grij s se evite rspndirea pe
capacul vasului. Fiecare diluie se toarn n plci Petri n triplicat, utiliznd
pipete cu calibru mare. De la prepararea primei diluii i pn la turnarea
plcii finale nu trebuie s treac mai mult de 10-20 minute.
Plcile se incubeaz la ntuneric la 22-25C, pentru 5 zile. Nu se aeaz
mai mult de 3 plci una peste alta i nici nu se inverseaz. Plcile nu se vor
mai deplasa pn la numrare, deoarece manipularea lor ar putea avea drept
rezultat o cretere secundar din sporii dislocai invalidnd numrtoarea
dup 5 zile.
Se numr plcile ce conin ntre 10 i 150 de colonii. Se raporteaz
rezultatele n colonii per gram sau n colonii per mililitru, fcnd media
setului n triplicat. Dac a treia cifr este 6 sau mai mult se rotunjete pn
la cifra superioar (de exemplu: 456 = 460). Dac cifra a treia este 4 sau
mai puin, se rotunjete pn la cifra inferioar (de exemplu 454 =450).
Dac a treia cifr este 5, se rotunjete pn la cifra inferioar dac primele
dou cifre sunt un numr par (de exemplu: 445 = 440); se rotunjete la cifra
superioar dac primele dou cifre sunt un numr impar (455 = 460).
Determinarea numrului de levuri i mucegaiuri
prin nsmnarea direct n plci Petri (pentru alimente ca
fasole uscat, nuci, condimente ntregi, boabe de cafea i cacao)
Analiza alimentelor nedezinfectate pe suprafaa (NSD). nainte de
nsmnarea n plci Petri, probele se pstreaz la -20C, timp de 72 de
ore, pentru a omor cpuele sau alte insecte care ar putea mpiedica analiza
alimentelor.
Prepararea plcilor de agar. Se utilizeaz agar cu dextroz de cartofi
i sare (conine 75 de grame NaCl per litru). Sarea inhib creterea
246

mucegaiurilor de rspndire i germinarea seminelor viabile, care ar putea


ridica capacul plcii Petri.
La agarul rcit se adaug 40 ppm clortetraciclin HCL. Se toarn
aproximativ 30 ml de mediu n plci Petri i se las s se solidifice. Se
prepar 10 plci per prob. Perioada dintre preparare i utilizare a plcilor
nu trebuie s depeasc 24 de ore.
nsmnarea probelor n plcile Petri. Din fiecare prob se transfer
aproximativ 50 de grame ntr-un pahar steril de 150 mililitri. Se plaseaz 5
poriuni de prob per plac, sub form de rozete (una n centru i celelalte
n fiecare cuadrant) cu ajutorul unei pense flambate n etanol. Se utilizeaz
alternativ mai multe pense pentru a se evita supranclzirea. Nu se aplic pe
poriuni vizibil mucegite sau decolorate.
Incubarea probelor. Se aliniaz plcile Petri n stive de cte 10.
Se noteaz numrul probei i dat nsmnrii, pe fiecare plac. Stivele
incubate se las nederanjate la ntuneric, la 22-25C, timp de 14-21 de zile.
Citirea plcilor. Apariia mucegaiului se determin n procente.
De exemplu, dac acesta a aprut n toate cele 50 de poriuni de prob,
mucegirea este de 100%, dac mucegaiul a aprut n 32 de probe,
mucegirea se consider c are loc n proporie de 64%.

247

DETERMINAREA NUMRULUI DE DROJDII I MUCEGAIURI

(schem adaptat dup W. Andrews, 1992)

1. Se amestec ingredientele ntr-un blender

2. Se dilueaz omogenatul de prob


alimentar

3. Se pipeteaz 1 ml din
fiecare diluie n plci
separate cu PDA

PDA (Potato Dextrose Agar) suplimentat cu Clortetraciclin HCL sau acid tartric
4. Se incubeaz la ntuneric, la 22-25C, timp de 5 zile.
5. Se numr plcile ce conin ntre 10 i 150 colonii.
248

Saccharomyces cerevisiae
Microscopie electronic

Saccharomyces cerevisiae
Microscopie cu contrast de faz n cmp
ntunecat

Saccharomyces cerevisiae
Microscopie cu contrast de faz n cmp
ntunecat (coloraie cu floxin). Reproducere asexuat prin nmugurire

Saccharomyces cerevisiae
Microscopie cu contrast de faz n cmp
ntunecat (coloraie cu floxin). Se observ
n mijlocul figurii o asc cu 4 ascospori

Saccharomyces cerevisiae
Cultur pe agar cu dextroz de cartof

Saccharomyces cerevisiae
Cultur pe mediul Czapek
249

Bibliografie selectiv
1. Enomoto, M., and M. Saito. 1972. Carcinogens produced by fungi. Annu. Rev.
Microbiut. 26:279-312.
2. Eschcr. F.E., P.E. Koehler, and J.C. Ayres. 1973. Production of ochratoxins A and B
on country cured ham. Appl. Microbiol. 26:27-30.
3. Escobar, A., and O.S. Regueiro. 2002. Determination of aflatoxin Bi in food and
feedstuffs in Cuba (1990 through 1996) using an immunoenzymatic reagent kit
(Aflacen). J. Food Proiect. 65:219-221.
4. Farber, J.M., and G.W. Sanders. 1986. Fusarin C production by North American
isolates of Fusarium moniliforme. Appl.Eimron. Microbiol. 51:381-384.
5. Gclderblom. W.C.A., N.P.J. Kriek, W.F.O. Marasas. and P.G. Thiel. 1991. Toxicity
and carcinogenicity of the Fusarium moniliforme metabolite, fumonisin B|, in rats.
Carcinogenesis 12:1247-1251. I. Gelderblom.
6. W.C.A., K. Jaskiewicz, W.F.O. Marasas. P.G. Thiel, R.M. Horak, R. Vleggaar, and
N.P.J. Kriek. 1988. Fumonisinsnovei mycotoxins with cancer-promoting aclivity
produced by Fusarium moniliforme. Appl. Environ. Microbiol. 54:1806-1811.
7. Gourama. H., and L.B. Bullerman. 1995. Antimycotic and antiaflatoxigenic effect
of lactic acid bacteria: A review. J. Food Proiect. 58:1275-1280.
8. K Gutema, T., C. Munimbazi, and L.B. Bullerman. 2000. Occurrence of fumonisins
and moniliformin in corn and corn-based food products of U.S. origin. J. Food
Proiect. 63:1732-1737.
9. Harrison, M.A. 1989. Presence and stability of patulin in apple products: A review./
FoodSaf 9:147-153. ).
10. Henry. S.H., F.X. Bosch, T.C. Troxell. and P.M. Bolger. 1999. Reducing liver
cancerglobal control of aflatoxin. Science 286:2453-2454. ).
11. Hesseltine, C.W. 1967. Aflatoxins and other mycotoxins. Health Lab. Sci. 4:222228.
12. I. Holmquist. G.U., H.W. Walker. and H.M. Stahr. 1983. Influence of temperature.
pH, water activity and antifungal agents on growth of Aspergillus flavus and A.
parasiticus. J. Food Sci. 48:778-782. .
13. Jorgenssen, K.V., D.L. Park. S.M. Rua, Jr., and R.L. Price. 1990.
Reduction of mutagenic potcntials in milk: Effects of ammonia treatment
on aflatoxin-contaminated cotton-seed. J. Food Protect. 53:777-778, 817.
3.
14. Karunaratne. A., E. Wezenberg, and L.B. Bullerman. 1990. Inhibition of mold
growth and aflatoxin production by Lactobacillus spp. J. Food Protect. 53:230236.
15. Kcdera. C.J.. R.D. Plattner. and A.E. Desjardins. 1999. Incidence of Fusarium spp.
250

and levels of fumonisin B| in maizc in western Kenya. Appl. Environ. Microbiol.


65:41-44.
16. Kim. J.-C., and Y.-W. Lee. 1994. Sambutoxin, a new mycotoxin produced by toxic
Fusarium isolates obtained from rotted potato tubers. Appl. Environ. Microbiol.
60:4380-4386.
17. Kim. J.-C.. Y.-W. Lee, and S.-H. Yu. 1995. Sambutoxin-producing isolates of
Fusarium species and occurrence of sambutoxin in rotten potato tubers. Appl.
Environ. Microbiol. 61:3750-3751.
18. Kurtzman, C.P, B.W. Horn, and C.W. Hesseltine. 1987. Aspergillus nomutus, a new
aflatoxin-producing species related to Aspergillus flavus and Aspergillus tamarii.
Antonie van Leeuwenhoek 53:147-158.
19. Labuza. T.P 1983. Regulation of mycotoxins in food. J. Food Protect. 46:260265.
20. Lee, Y.J., and W.M. Hagler, Jr. 1991. Aflatoxin and cyclopiazonic acid production
by Aspergillus flavus isolated from contaminated maize. J. Food Sci. 56:871-872.
21. Leistner, L., and C. Eckardt. 1979. Vorkommen toxigener Penicillien bei
Fleischerzeugnissen. Fleischwirtsch. 59:1892-1896.
22. Leistner. L.. and F. Tauchmann. 1979. Aflatoxinbildung in Rohwurst durch
verschiedene Aspergillus flavus-SlUmme und einer Aspergillus parasiticus-Slamm.
Fleischwirtschaft 50:965-966.
23. Lie.J.L-.andE.H. Marth. 1967. Formation of aflatoxin in cheddarcheesebyAsperg/7/
w.s//avM.s and Aspci gillus pai -a.situ us. J.DairySci. 50:1708-1710.
24. Line, J.E.. R.E. Brackett, and R.E. Wilkinson. 1994. Evidence for degradation of
aflatoxin B, by Flavobacterium auran-tiacum. J. Food Protect. 57:788-791.
25. Marasas. W.F.O., K. Jaskiewicz, F.S. Venter, and D.J. van Schalkwyk. 1988.
Fusarium moniliforme contamination of maize in ocsophageal cancer areas in
Transkei. 5. Afr. Med. J. 74:110-114.
26. Marin, S., N. Magan, J. Serra, A.J. Ramos, R. Canela, and V. Sanchis. 1999.
Fumonisin B, production and growth of Fusarium moniliforma and Fusarium
proliferatum on maize, wheat, and barley grain. J. Food Sci. 64:921-924.
27. Marin, S., V. Sanchis. F. Rull, A.J. Ramos. and N. Magan. 1998. Colonization of
maize grain by Fusarium monilifor and Fusarium proliferatum in the presence of
competing fungi and their impact on fumonisin production. J. Food Pron 61:14891496.
28. Marin, S., V. Sanchis. 1. Vines. R. Canela. and N. Magan. 1995. Effect of water
activity and temperature on growth ; fumonisin B| and B? production by Fusarium
proliferatum and F. moniliforme on maize grain. Lett. Appl. Microb 21:298-301.
29. Marth, E.H., and B.G. Calanog. 1976. Toxigenic fungi. In Food Microbiology:
Public Health and Spoilage Aspects, M.P. deFigueiredo and D.F. Splittstoesser,
210-256. New York: Kluwer Academic Publishers.
251

30. Mphande. F.A., B.A. Siame, and J.E. Taylor. 2004. Fungi aflatoxins, and
cyclopiazonic acid associated with pea retailing in Botswana. J. Food Protect.
67:96-102.
31. Nelson. PE., R.D. Plattner, D.D. Shackelford. and A.E. Desjardins. 1992. Fumonisin
Bi production by Fusarium spec other than F. moniliforme in section Liseola and by
some related species. Appl. Environ. Microbiol. 58:984-989.
32. Newsome, R. 1999. Issues in internaional trade: Looking to the Codex Alimentarius
Commission. Food Technol. 53(6):
33. Niranjan. B.G., N.K. Bhat, and N.G. Avadhani. 1982. Preferenial attack of
mitochondrial DNA by aflatoxin B| dur hepatocarcinogenesis. Science 215:73-75.
34. Northolt, M.D., C.A.H. Verhulsdonk. P.S.S. Soentoro, and W.E. Paulsch. 1976.
Effect of water activity and temperat on aflatoxin production by Aspergillus
parasiticus. J. Milk Food Technol. 39:170-174.
35. Oatlcy, J.T., M.D. Rarick, G.E. Ji, and J.E. Linz. 2000. Binding of aflatoxin Bi to
bifidobacteria in vitro.y. Food Prot 63:1133-1136.
36. Pestka, J.J., J.I. Azcona-Olivera, R.D. Plattner, F. Minervini, M.B. Doke, and A.
Visconti. 1994. Comparative assessm of fumonisin in grain-based foods by ELISA,
GC-MS, and HPLC. J. Food Protect. 57:169-172.
37. Pierides. M.. H. El-Nezami, K. Peltonen. S. Salminen, and J. Ahokas. 2000. Ability
of dairy strains of lactic acid bact( to bind aflatoxin Mi in a food model. J. Food
Protect. 63:645-650.
38. Pittet, A., V. Parisod, and M. Schellenberg. 1992. Occurrence of fumonisins Bi
and B2 in com-based products from Swiss market. J. Agric. Food Chem. 40:13521354.
39. Park. K.Y., and L.B. Bullerman. 1983. Effect of cycling temperatures on aflatoxin
production by Aspergillus prsii and Aspergillus flavus in rice and cheddar cheese.
J. Food Sci. 48:889-896.
40. Ram, B.P. P Hart. R.J. Cole, and J.J. Pestka. 1986. Application of ELISA to retail
survey of aflatoxin B| in peanut bui ./ Food Protect. 49:792-795.
41. Rheeder, J.P. W.F.O. Marasas, P.G. Thiel, E.W. Sydenham. and D.J. van Schalkwyk.
1992. Fusarium moniliforme fumonisins in corn in relation to human esophageal
cancer in Transkei. Phytophathology 82:353-357.
42. Roland, J.O., and L.R. Beuchat. 1984. Biomass and patulin production by
Byssochlamy.s nivea in apple juice as affec by sorbate, benzoate, SO and
temperature. J. Food Sci. 49:402^*06.
43. Ross, P.F., L.G. Rice, R.D. Plattner, G.D. Osweiler, T.M. Wilson, D.L. Owens, H.A.
Nelson, and J.L. Richard. 1< Concentration of fumonisin B| in feeds associated
with animal health problems. Mycopathology 114:129-135.
44. Ross, P.F., P.E. Nelson, J.L. Richard, G.D. Osweiler, L.G. Rice, R.D. Plattner. and
T.M. Wilson. 1990. Productioi fumonisins by Fusarium moniliforme and Fusarium
252

proliferatum isolates associated with equine leukoencephalomal; and a pulmonary


edema syndrome in swine. Appl. Environ. Microbiol. 56:3225-3226.
45. Schillinger, U.. R. Geisen. and W.H. Holzapfel. 1996. Potenial of antagonistic
microorganisms and bacteriocins for biological preservation of foods. Trends Food
Sci. Technol. 7:158-164.
46. Schindler, A.F. 1977. Temperature limits for production of aflatoxin by twenty-five
isolates of Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus. J. Food. Protect. 40:39-40.
47. Scrck-Hanssen. A. 1970. Aflatoxin-induced fatal hepatitis? Arch. Environ. Health
20:729-731.
48. Shelef, L.A., and B. Chin. 1980. Effect of phenolic antioxidants on the mutagenicity
of aflatoxin Bi. Appl. Envi Microbiol. 40:1039-1043.
49. Shih, C.N., and E.H. Marth. 1974. Some cultural conditions that control biosynthesis
of lipid and aflatoxin by Aspergi parasiticus. Appl. Microbiol. 27:452^156.
50. Shim, W.-B.. J.E. Flaherty, and C.P. Woloshuk. 2003. Comparison of fumonisin B,
biosynthsis in maize germ degermed kernels by Fusarium verticillioides. J. Food
Protect. 66:2116-2122.
51. Shotwell. O.L.. and C.W. Hesseltine. 1983. Five-year study of mycotoxins in
Virginia wheat and dent corn. J. Assoc. Anal. Chem. 66:1466-1469.

253

Capitolul 8
Scurt prezentare a principlalelor
virusuri ce se transmit prin alimente
Caractere generale
Moto
Virusurile sunt entiti potenial patogene care au o faz infecioas,
posed un singur tip de acid nucleic, se multiplic sub form de material
genetic, nu cresc, nu se divid i sunt lipsite de sistem Lippman (Lwoll A,
1957; The concept of a virus; Y. gen. Microbul).
n 1972, Uniunea Internaional de Biochimie (IUB) recomand
folosirea prescurtrilor DNA i RNA pentru acid dezoxiribo i respectiv
ribonucleic indiferent de limba n care este scris textul (Diem K i
Lentner).
Virusurile constituie un regim aparte, VIRA, datorit caracterelor de
structur i funcie prin care se deosebesc fundamental de microorganismele
procariote i eucariote.
Pasteur a intuit prezena virusurilor n studiile sale privind agentul
turbrii (1884) ca fiind un microoganism infinitezimal de mic.
D. I. Ivanovski (1892) demonstreaz c mozaicul tutunului este produs
de un agent att de mic, nct poate trece prin filtrele care rein cele mai
mici bacterii.
Loefler i Frosch n 1898, n febra aftoas a bovinelor, J. Cord mpreun
cu Watter Reed (1901) n febra galben, Remlinger (1903) n turbare, au pus
n eviden faptul c agenii infecioi respectivi sunt filtrabili.
n urmtoarele decenii, au fost identificai i ali ageni cu caractere
asemntoare prin inocularea la animalele de laborator de filtrate lipsite de
bacterii obinute din suspensii de organe sau fluide de la gazdele naturale
(animale, plante, bacterii).
Aceti ageni noi au fost denumii iniial virusuri filtrabile
ultramicroscopice apoi virusuri ultrafiltrabile, i n cele din urm
254

virusuri.
n 1915, Twort i, independent, n 1917, dHerelle au descoperit
bacteriofagul. n 1930, studiile pe modelul fag-bacterie i-au permis lui
Schlesinger (1930) s arate c particula de fag este alctuit din DNA i
protein.
Virusurile sunt sisteme genetice independente dotate cu continuitate i
variabilitate genetic i care posed o istorie evolutiv proprie.
Pentru replicare virusurile utilizeaz mainria de sintez a celulei viigazd dirijnd-o spre sinteza de virioni, particule specializate care conin
genomul viral (acid nucleic) i componentele structurale (proteine, nveli),
care permit transferul acestuia la alte celule gazd.
Clasificarea virusurilor se bazeaz pe urmtoarele criterii:
1) Tipul de acid nucleic: DNA sau RNA; structura i proprietile
acestora;
2) Dimensiuni i morfologie (tipul de simetrie al capsidei, numr de
capsomere, prezena de inveliuri);
3) Comportarea fa de agenii fizici i chimici (fa de eter);
4) Caractere antigenice;
5) Modul de transmitere n natur;
6) Gazda, esutul, celula pentru care prezint tropism;
7) Leziuni celulare i anatomopatologice.
8) Simptome clinice.
Componentele principale ale unui virus sunt acidul nucleic i
proteina.
Metodele de purificare sunt reprezentate de: a) metode care se
adreseaz fracionrii proteinelor din matricea lipoidal i b) metode fizice,
ca de pild adsorbia i ultracentifugarea, care in seama de diferenele de
dimensiune, densitate i proprieti de suprafa ntre particula de virus i
componentele subcelulare, nevirale, prezente n omogenatul de celule sau
esut infectat folosit ca surs de virus.
Pn n prezent se cunosc mult mai puine date legate de incidena
virusurilor n alimente, dect a bacteriilor i a fungilor.
n primul rnd virusurile fiind parazii obligatorii nu se dezvolt pe
medii de cultur ca bacteriile sau fungii. Replicarea lor se realizeaz numai
n celulele vii. Pentru replicarea virusurilor animale se pot folosi celule vii
provenind din trei surse: a) animale de laborator, b) embrioni de gin n
dezvoltare (ou embrionate) sau c) culturi celulare.
255

Datorit faptului c virusurile nu se pot replica n alimente, numrul


lor n acestea fiind sczut n comparaie cu cel al bacteriilor, sunt necesare
metode de extracie i concentrare pentru recuperarea lor. Cu toate c au
fost efectuate multe cercetri n acest sens este dificil recuperarea a mai
mult de 50% din particulele virale din carnea de vit tocat.
Un alt motiv este reprezentat de faptul c n majoritatea laboratoarelor
de microbiologie alimentar nu se practic tehnicile de virusologie.
Deasemenea, nu toate virusurile care prezint interes pentru
microbiologia alimentar, pot fi cultivate prin metode obinuite.
Un interes deosebit l reprezint reacia de revers transcriptazpolimerizare n lan (RT-PCR) care a permis detectarea virusurilor
transmisibile pe cale alimentar din esuturile de stridii i molute.
Eficacitatea tehnicii RT-PCR pentru detectarea virusurilor din alimente
a fost demonstrat de mai muli cercettori.
Au fost comparate 4 metode de concentrare i extracie a astrovirusurilor,
hepatitei A i poliovirusurilor din stridii. Cele mai eficiente au fost metodele
care au folosit soluia de glicerina i boratul tamponat. Astfel au fost folosite
mai multe combinaii pentru detectarea celor 3 virusuri din probele de
analizat.
Intr-un alt studiu, detectarea prin hibridizare dot-blot a ampliconilor
prin tehnica RT-PCR a permis detectarea a 8 ufp de hepatit A/g n carnea
de stridii (ufp = uniti formatoare de plaje; pfu = plaque forming units).
Datorit faptului c s-a demonstrat c n condiii insalubre orice agent
patogen bacterian poate fi gsit n alimente, se poate presupune acelai
lucru i despre virusurile intestinale, cu toate c acestea nu se multiplic n
alimente.
Cliver a demonstrat c orice aliment poate servi ca rezervor de virusuri,
marcnd importana modului de transmitere oral-anal, n special pentru
hepatita viral de origine alimentar.
La fel cum bacteriile non intestinale se pot gsi n alimente, acelai
lucru se poate spune i despre virusuri, dar datorita afinitii lor pentru
esuturi, alimentele vor juca rolul de rezervoare numai pentru virusurile
intestinale i pentru enterovirusuri.
Ca frecven, gastroenterita viral se pare c se situeaz imediat dup
rceal.

256

8.1. Virusurile hepatice enterice


Tabelul 8.1.
Virusul hepatic

Caracteristici

Virusul hepatitei A (HAV)

Familia Picornaviridae, nenvelite, capsid icosaedral, 2732 nm, RNA monocatenar, nu produce infecii cronice i nu
are statut de purttor, exist vaccinuri, mortalitate sczut

Virusul hepatitei E (HEV)

Virusul hepatitei F (HFV)

Familia Caliciviridae, nenvelite, 25-35 nm, capsid


icosaedral, RNA monocatenar, nu produce infecii cronice,
nu are statut de purttor, nu exist vaccin, mortalitate mare
la femeile gravide
Neclasificat, nenvelit, 27-37 nm, capsid icosaedral, DNA
dublu catenar, nu produce infecii cronice, nu are statut de
purttor, nu exist vaccin, mortalitate sczut

8.1.1. Virusul hepatitei A


Hepatita A Virusul hepatitei A (HAV) este un virus ARN nenvelit, de
27 nm, termo-, acido- i etero-rezistent. Virionul conine patru polipeptide
n capsid, denumite de la VP1 la VP4, care sunt clivate posttranslaional
din produsul poliproteic al unui genom de 7500 de nucleotide. Inactivarea
activitii virale se poate obine prin fiebere 1 minut, prin contact cu
formaldehida i clorul sau prin iradiere cu raze ultraviolete.
n ciuda variaiei de pn la 20% a secvenei nucleotidice printre
izolatele de HAV, toate varietile acestui virus identificate pn acum nu se
pot deosebi din punct de vedere imunologic i aparin unui singur serotip.
Hepatita A are o perioad de incubaie de aproximativ patru sptmni.
Replicarea este limitat la ficat, dar virusul este prezent n ficat, bil, scaun i
snge spre sfritul perioadei de incubaie i n timpul fazei acute preicterice
a bolii. n ciuda persistenei virusului n ficat, eliminarea viral n fecale,
viremia i infectivitatea diminu rapid o dat ce icterul devine manifest.
HAV este singurul virus hepatic uman care se poate cultiva in vitro.
Anticorpii anti-HAV pot fi detectai n cursul bolii acute, atunci cnd
activitatea aminotransferazei serice este crescut i virusul nc se mai
elimin n fecale. Acest rspuns precoce este reprezentat de elaborarea de
anticorpi predominant din clasa IgM i persist mai multe luni, doar arareori
pn la 6-12 luni. n timpul convalescenei anticorpii anti-HAV din clasa
257

IgG devin predominani. Ca urmare, diagnosticul hepatitei A este realizat n


timpul bolii acute prin demonstrarea existenei titrurilor nalte de anticorpi
anti-HAV din clasa IgM. Dup perioada de boal acut, anticorpii antiHAV din clasa IgG rmn detectabili pentru un timp nedefinit i pacienii
cu anticorpi serici anti-HAV sunt imuni la reinfecie. ntr-adevr, activitatea
neutralizant a anticorpilor crete concomitent cu apariia anticorpilor antiHAV, iar protecia mpotriva infeciei HAV este oferit de anticorpii IgG
anti-HAV prezeni n imunoglobuline.
nainte de anii 1990 au fost nregistrate mai multe epidemii de hepatit
A de origine alimentar, dect oricare alt infecie viral. Virusul aparine
familiei Picornaviridae cu RNA monocatenar. Din care fac parte:
Enterovirusurile, din care face parte, virusul hepatitei A (HAV),
clasificat de curnd n genul Hepatovirus (nainte g. Heparnavirus). Ca
multe alte picornavirusuri, cauzeaz infecii cu simptome terse sau fr
simptome, mai ales la copii. Incidena acestora este strns legat de condiiile
de sanitaie i igien, majoritatea mbolnvirilor avnd loc n copilrie.
Simptomele clinice apar de obicei la aduli, mortalitatea este mai mic
de 1%. Poate cauza epidemii atunci cnd e prezent n ap i alimente.
Calea de transmitere este cea oral-fecal, prin consum de ap i
alimente poluate cu fecale sau prin contact direct cu o persoan infectat.
Un pas important l-a constituit vizualizarea HAV prin microscopie
electronic imun.
Ruta oral-fecal reprezint principalul mod de transmitere, iar
rezervoarele principale sunt reprezentate de crustacee crude sau parial
gtite din apele poluate.
n SUA n 1973, 1974 i 1975 au fost 5, 6 i respectiv 3 epidemii cu
425, 282 i 173 de cazuri. Epidemiile din 1975 au fost datorate salatelor,
sandwich-urilor i gogoilor glazurate servite n restaurante. Conform cu
CDCP (Centrul de prevenire i control, Centers for disease control and
prevention) numrul de cazuri de hepatit A a sporit n SUA ntre 19831989 de la 9,2 la 14,5 din 100.000 de oameni.
Din numrul cazurilor de hepatit, din anul 1988, n SUA, 7,3% au
fost de origine alimentar. Din 88 de elevi i profesori in Georgia, 15 s-au
mbolnvit de hepatit A.
Din 641 de rezideni i angajai dintr-un centru pentru oamenii cu
handicap din Montana, 13 cazuri s-au mbolnvit de hepatit A. n ambele
cazuri vehiculul a fost reprezentat de prjitura cu cpuni.
Cea mai mare epidemie de hepatit A, nregistrat n SUA a avut
loc n noiembrie 2003 i au fost cca 600 de victime i 3 mori. Alimentul
vehicul a fost reprezentat de ceapa verde servit de un lan de fast-food.
258

ntre 1992-2001, au fost raportate de CDCP aproximativ 230.000


de cazuri de hepatit A. n 2001 ntr-o epidemie cu 46 de cazuri din
Massachusetts a fost asociat cu consumul de sandwich-uri contaminate de
procesator.

Tabelul 8.2

Genul

Specii (* = specia tip)

enterovirusul bovin
enterovirusul uman A
enterovirusul uman B
enterovirusul uman C
enterovirusul uman D
poliovirusul*
enterovirusul porcin A
enterovirusul porcin B
enterovirusul simian A
rinovirusul uman A
rinovirusul uman B
rinovirusul uman C
virusul hepatitei A (HAV)
virusul encefalomielitei aviare (AEV)
virusul encefalomiocarditei (EMCV)
theilovirus
virusul febrei aftoase*
virusul rinitei ecvine A (ERAV)
parechovirusul uman (HPeV)
virusul Ljungan
virusul rinitei ecvine B
virusul aichi
kobuvirusul bovin
teschovirusul porcin

Enterovirus

Rhinovirus
Hepatovirus (nainte Heparnavirus)
Cardiovirus
Aphthovirus
Parechovirus
Erbovirus
Kobuvirus
Teschovirus
259

8.1.2. Virusul hepatitei E (HEV)


Existena HEV a fost confirmat la sfritul anilor 1970.
Acest virus a fost descoperit recent si producele hepatitele non-A,
non-B (NANB). Este un calicivirus sferic, nenvelit, de 27-34 nm, i genom
RNA monocatenar.
n forma acut, perioada de incubaie este de 30-40 zile. Nu prezint
form cronic i nici statut de purttor. Predomin la persoanele adulte (1540 ani). Pot aprea complicaii la femeile gravide, rata de mortalitate fiind
la acestea de peste 40%.
Patogenitatea este asemntoare cu cea a hepatitei A, virusul se
replic iniial n intestin, dup care invadeaz ficatul i ajunge n fecale.
Este slab virulent, fiind necesar o mare cantitate de virus pentru producerea
infeciei.
Se pare c incidena bolii este sczut n rile puternic industrializate.
Epidemii mari au aprut n India, Mexic i America de Nord, unde principala
surs de infecie pare a fi contaminarea cu fecale a surselor de ap.
Transmiterea interuman nu a fost raportat (se presupune c este
necesar o cantitate mare de virus pentru transmiterea bolii). Virusul nu se
poate cultiva in vitro. Pentru diagnostic se folosesc urmtoarele metode:
identificarea particulelor de calicivirus n fecale prin microscopie electronic,
teste serologice, PCR.
8.1.3. Virusul hepatitei F (HFV)
Hepatita F (non A, non E) a fost raportat recent, n cazuri izolate
n Europa de Vest, SUA i India. HFV a fost izolat din fecalele subiecilor
infectai, unde apare sub form de particule, cu dimensiuni cuprinse ntre
27-37 nm, conine o molecul de DNA dublucatenar de aproximativ 20
Kbytes. Nu a fost nc clasificat. Acest virus difer substanial de HAV,
HEV ambele fiind alctuite dintr-o molecul de RNA monocatenar de 7,5
Kbytes. Nu exist teste serologice pentru diagnosticul hepatitei F, dar el
poate fi pus n urma examinrii prin microscopie electronic, din scaunul
pacienilor. Sunt suspecte cazurile de hepatit a cror etiologie nu poate fi
determinat n urma testrii pentru celelalte virusuri. Infecia experimental
a fost raportat la maimua Rhesus. Se replic i produce efect citopatic n
linia celular Hep-2 (Human larynx carcinoma).
260

8.2. Norovirusurile
Norovirusurile (nainte denumite Norwalk virus - like) sunt virusuri
noi, aparinnd familiei Caliciviridae, cu RNA monocatenar, de 7,5 knt,
conine proteina structural major VP1, de aproximativ 58-60 Kda i o
protein capsidic minor (VP2). La microscopul electronic apar ca structuri
amorfe, cu dimensiuni ntre 27 i 38 nm.

Tabelul 8.3.
Serotipurile genului Norovirus
Serotip

Tulpin

Desert Shield
Lordsdale
Mexico
Norwalk
Hawaii
Snow Mountain
Southampton

[U04469]
[X86557]
[U22498]
[M87661]
[U07611]
[L23831]
[L07418]

Izolat
(Hu/NLV/DSV395/1990/SR)
(Hu/NLV/LD/1993/UK)
(Hu/NLV/MX/1989/MX)
(Hu/NLV/NV/1968/US)
(Hu/NLV/HV/1971/US)
(Hu/NLV/SMV/1976/US)
(Hu/NLV/SHV/1991/UK)

Aceste virusuri sunt responsabile de aproximativ 90% dintre epidemiile


de gastroenterite non-bacteriene n lume i de 50% dintre epidemiile de
gastroenterite alimentare din SUA.
Norovirusurile afecteaz persoanele de toate vrstele, se transmit
prin contaminarea apei i a alimentelor cu fecale sau de la persoan la
persoan.
261

Imunitatea este incomplet i temporar. Exist o predispoziie la


infecie a indivizilor cu grupa sanguin O, n timp ce persoanele cu grupele
B i AB sunt mai rezistente.
Epidemiile apar n comuniti nchise sau semi-nchise, cum ar
fi spitale, nchisori, dormitoare, vase de croazier, campinguri, n care
infecia se transmite cu repeziciune de la o persoan la alta, prin alimentele
contaminate sau prin persoane infectate care manipuleaz alimentele.
Norovirusurile sunt inactivate rapid de dezinfectante pe baz de
clor, ns datorit anvelopei lipidice, sunt mai puin sensibile la alcool i
detergeni.
Norovirusurile sunt clasificate genetic n 5 genogrupe (GI-GV), care
se clasific la rndul lor n mai multe grupuri sau genotipuri.
De exemplu, genogrupul II, cel mai frecvent genogrup uman, conine
18 genotipuri. Genogrupurile I, II i IV sunt patogene pentru om, n timp ce
genogrupul III infecteaz bovinele i genogrupul V, a fost izolat recent, de
la oarece.
Genogrupul II, genotipul 4 (GII.4) este responsabil de producerea
epidemiilor de gastroenterite, n care sunt implicate, n special persoanele
adulte, cu rspndire pandemic.
Exemple recente de astfel de epidemii includ:
tulpina US95/96-US - cu rspndire pe tot globul - anii 90;
virusul Farmington Hills - Europa i SUA - 2002;
virusul Hunter - Europa, Japonia, Australia, Asia - 2004.
n 2006, au crescut cazurile de mbolnaviri cu norovirusuri pe tot
globul. n 2007, a izbucnit o epidemie, ntr-un club country din California
de Nord, cu 80-100 de cazuri de mbolnvire.
Istoric. Norovirusurile au fost denumite iniial Norwalk virusuri.
Denumirea provine de la localitatea Norwalk, Ohio, unde a izbucnit o
epidemie de gatroenterit acut, ce a afectat majoritatea copiilor din coala
Elementar Bronson, noiembrie 1968. Virusul a fost identificat n 1972,
prin microscopie electronic imun, efectuat din probe de fecale de la
pacieni. n anul 2002, denumirea de Norovirusuri (genul Norovirus) a fost
recunoscut de ctre Comitetul internaional de taxonomie viral.
Boala poart diferite denumiri cum ar fi: winter vomiting disease,
stomach flu gastroenterit viral sau gastroenterit acut non-bacterian.
Virusul a purtat nainte diferite denumiri, cum ar fi: virusul Norwalk,
Norwalk-like virus, SRSV (Small Round Structured Viruses) sau virusul
Snow Mountain
Diagnostic. Testele specifice de diagnostic de laborator sunt PCR,
RT-PCR, care confirm rezultatul n cteva ore, putnd detecta concentraii
262

mai mici de 10 particule virale. Exista kituri ELISA comerciale, ns au


specificitate i sensibilitate sczut.
Norovirusurile sunt extrem de contagioase, n medie o persoan
infectat transmite infecia altor 14.
Splarea minilor i igienizarea suprafeelor rmn cele mai importante
metod de prevenire a acestei infecii.
n 2007, Ligocyte i col., au creat un vaccin, nc n faz
experimental.
Recent, n Nicaragua s-a observat faptul c norovirusurile sunt
responsabile de 11% din cazurile de diaree la copiii sub 5 ani, iar 15% dintre
cazuri necesit rehidratare intravenoas.
Norovirusurile se pot transmite direct de la persoan la persoan sau
indirect prin apa sau alimentele contaminate. ntr-un studiu CDC, n 11
epidemii din statul New York, s-a observat c modul de transmitere la 7
dintre acestea a fost de la persoan la persoan, la 2 prin alimente, 1 prin apa
de but, iar una necunoscut.
Alimentele cele mai des implicate n epidemiile Norwalk, sunt
alimentele pe baz de scoici i diferite salate. Consumul de molute i stridii
crude sau insuficient preparate termic, prezint un risc mare de infeciozitate
cu virusul Norwalk.
8.3. Rotavirusurile (Duovirusuri)
Rotavirusurile sunt virusuri RNA dublu catenare din familia Reoviridae,
care produc diaree sever la copii i sugari.
Statistic, se poate spune c fiecare copil din lume a fost infectat cu
Rotavirus cel puin o dat. Imunitatea se instaleaz treptat, pe parcursul
vieii, persoanele adulte fiind rar afectate.
Exist 7 specii de virus, notate cu A, B, C, D, E, F i G. Rotavirusul A
este cel mai ntlnit, cauznd peste 90% din infeciile umane. Infecii umane
mai produc i speciile B i C.
Conine dou proteine structurale, glicoproteina VP7, care definete
tipurile G i VP4 pentru tipurile P.
Genomul este constituit din 11 molecule de RNA, dublu helix, constiuit
n total din 18.555 de perechi de baze nucleotide.
RNA-ul este nvelit de o capsid proteica, icosaedral, tristatificat.
Particulele virale au aproximativ 76,5 nm i nu sunt nvelite.
Virionul este format din 6 proteine structurale (VP1, VP2, VP3, VP4,
VP6 i VP7) i 6 proteine nestructurale (NSP1-NSP6).
263

stnga:
Rotavirus A,
microscopie
electronic
dreapta:
distribuirea
proteinelor n
virion

Peste 500.000 de copii, sub 5 ani mor anual din cauza infeciilor cu
rotavirusuri, iar peste 2.000.000 prezint forme severe.
Istoric. n 1943, Jacob Light i Horace Hodes au dovedit c agentul
filtrabil, din scaunele diareice ale copiilor este acelai cu cel care produce
diareea infecioas n efectivele de vite.
n 1974, Thomas Henry Flewett, a propus denumirea de Rotavirus
dup ce a observat prin microscopie electronic aspectul asemntor al
particulelor virale cu al spielor de roat (rota n latin). Numele a fost
recunoscut oficial de ctre Comitetul internaional de taxonomie viral, n
1978.
n 1980 au fost descrise serotipurile de Rotavirus i n anul urmtor au
fost izolate pe culturi celulare de rinichi de maimu.
n 1998, a aprut primul vaccin comercial, n SUA, care a fost scos de
pe pia un an mai trziu, deoarece exista suspiciunea ca ar produce ocluzie
intestinal la 1/12.000 copii.
n 2006, au aprut dou noi vaccinuri vii atenuate mpotriva infeciilor
cu Rotavirus A (Rotarix - GlaxoSmithKline i RotaTeq - Merck), care s-au
dovedit a fi sigure i eficiente.
Aceste vaccinuri sunt disponibile n Australia, Europa, Canada,
Brazilia, Egipt, India, Israel, Taiwan, Africa de Sud, Panama, Argentina i
SUA.
Programul de vaccinare mpotriva rotavirusului A, reprezint o
colaborare ntre PATH, OMS i CPC i este finanat de GAVI Alliance.
Programul are ca scop reducerea mortalitii i morbiditii prin campanii
de vaccinare, n rile n curs de dezvoltare.
n iunie 2009, WHO a recomandat vaccinarea obligatorie n toate
programele de imunizare naionale.
Epidemiologie. Calea de transmitere este cea fecal-oral, prin
contactul cu mini, suprafeele sau obiectele contaminate i posibil pe
cale respiratorie. Fecalele unei persoane bolnave conin peste 10 trilioane
de particule infecioase/gram (numai 10-100 dintre acestea pot transmite
264

infecia la alte persoane).


Tabelul 8.4
ara

Rat de
mortalitate

Sursa

Anh DD, Thiem VD, Fischer TK, Canh DG, Minh TT, Tho le
H, Van Man N, Luan le T, Kilgore P, von Seidlein L, Glass RI
Viet1 din 61 - 1
(2006). The burden of rotavirus diarrhea in Khanh Hoa Provnam
din 113
ince, Vietnam: baseline assessment for a rotavirus vaccine trial.
Pediatr. Infect. Dis. J. 25 (1): 3740
Tanaka G, Faruque AS, Luby SP, Malek MA, Glass RI, Parashar
Ban1 din 330 - UD (2007). Deaths from rotavirus disease in Bangladeshi chilgladesh 1 din 660 dren: estimates from hospital-based surveillance. Pediatr. Infect. Dis. J. 26 (11): 10148
Prez-Schael I, Salinas B, Gonzlez R, Salas H, Ludert JE, EsVencalona M, Alcal A, Rosas MA, Matern M (2007). "Rotavirus
1 din 1800
ezuela
mortality confirmed by etiologic identification in Venezuelan
children with diarrhea". Pediatr. Infect. Dis. J. 26 (5): 3937.
Soriano-Gabarr M, Mrukowicz J, Vesikari T, Verstraeten T
UE
1 din 20433 (2006). Burden of rotavirus disease in European Union countries. Pediatr. Infect. Dis. J. 25 (1 Suppl): S7S11.
Cook SM, Glass RI, LeBaron CW, Ho MS (1990). Global seaSUA 1 din 21675 sonality of rotavirus infections. Bull. World Health Organ. 68
(2): 1717.

n zonele temperate, infeciile cu rotavirusuri apar n special iarna, iar


n cele tropicale de-a lungul ntregului an.
De-a lungul anului 2005 a fost raportat cea mai mare epidemie, n
Nicaragua.Au aprut mutaii genetice ale Rotavirusului A, care au afectat i
populaia adult.
Rotavirusul B, denumit i rotavirusul diareei la aduli (ADRV),
a cauzat epidemii severe de diaree, ce au afectat mii de oameni de toate
vrstele n China. Aceste epidemii au fost produse prin consumul apei. n
1998, a aprut i n India o epidemie cauzat de Rotavirus B, tulpina CAL,
care este endemic.
Rotavirusul C a fost asociat cu cazuri sporadice de diaree la copii, n
mai multe ri, dintre care Japonia i Anglia.

265

CAPITOLUL 9
Principalii prioni ce se transmit prin
alimente
Prionii sunt proteine unice prin faptul c pot converti alte proteine n
unele duntoare fcndu-le s i modifice forma.
Proteina prionic din celula normal (PrP) exist n membrana
celular din creier, avnd unele funcii vitale i fiind degradat de proteaze.
Forma sa patogen apare deformat, fiind rezistent la proteaze, i astfel se
acumuleaz n esutul creierului i d natere bolilor.
S-a postulat ideea c molecula prionic distorsionat acioneaz ca o
matri, convertind proteinele normale n forme deformate. Proteina normal
(forma -helical) cnd devine patogen ia o form -linear, rezistent la
proteaze.
Formele patogene au tendina s se agrege n fibrilele amiloide, unde
cauzeaz degenerarea celulei nervoase, ceea ce conduce la manifestarea
clinic.
Aceste particule au fost pentru prima dat denumite prioni de ctre
Stanley Prusiner n 1982, cruia i-a fost acordat premiul Nobel pentru
munca sa de pionierat n domeniul fiziologiei.
Prionii cauzeaz scrapia la oi, capre i hamsteri i kuru la oameni.
Alte infecii cu aceeai origine etiologic sunt: boala Kreutzfeldt Jacob
(CJD), encefalopatia spongiform bovin (BSE) - boal a vacilor i oilor,
denumit i boala vacii nebune, encefalopatia transmisibil a nurcilor,
boala cahectizant a cervideelor.
Toate acestea aparin unei familii de boli denumite encefalopatii
spongiforme transmisibile (TSEs)

9.1. Encefalopatia spongiform bovin (BSE)


BSE (Mad cow disease) a fost descoperit pentru prima dat n Marea
Britanie n 1984 i diagnosticat specific la vaci n 1986. Patru ani mai
trziu, n Marea Britanie, dintr-o populaie de 10.000.000 de vite au fost
confirmate 14.000 de cazuri. Epidemia a atins un maxim de 1.000 de cazuri
pe sptmn n 1993. Pn n februarie 1998 au fost confirmate 172.324
de cazuri.
266

Perioada de incubaie pentru BSE la om este ntre 1 i 15 ani.


n 8 ri din afara Statelor Unite au fost nregistrate 600 de cazuri,
cu 256, numai n Elveia. Din 1996-2000, au fost omorte 4.500.000 de
vaci. ntre 1986 i noiembrie 2003, n SUA au fost diagnosticate cu BSE
183.634 de vaci i 4.469, n alte 22 de ri. n 2000 s-au nregistrat n SUA,
n jur de 84 de victime umane. Primul caz confirmat n Japonia a aprut n
septembrie 2001, iar pn n 2003 au fost nregistrate aproximativ 9 cazuri.
n America de Nord, primul caz confirmat a fost anunat n mai 2003, n
Alberta, Canada.
n SUA, primul caz a fost confirmat n decembrie 2003 n Mosses
Lake, Washington. Vaca avea 6 ani jumtate i consumase nutreuri cu
materii animale (n prezent interzise).
Testele de detectare a proteinelor prionice constau ntr-o metod
imuno-histochimic (considerat metod standard), un CDI (conformation
dependent immunoassay) practicat din 2003; un test screening elaborat de
Bio-Rad Co. (TeseE) i alte 5-6 teste postmortem pentru SNC la vaci.
BSE este o afeciune neurologic ntlnit numai la bovinele adulte,
cu evoluie progresiv, insidioas. Se caracterizeaz clinic prin modificri
de comportament, tulburri locomotorii, pareze i moarte, iar histopatologic
prin vacuolizarea neuropilului, degenerarea pericarionilor i astroglioz,
datorate interveniei unei proteine patogene (prion). Datele epidemiologice
arat c sursa primar de infecie o constituie hrana contaminat cu agentul
cauzal al BSE. n momentul de fa se accept c sursa de infecie este
reprezentat de fina de carne i de oase, provenite de la carcasele de oi i
capre, bolnave de BSE, insuficient prelucrate industrial, ndeosebi termic
permind supravieuirea agentului contaminant. Se consider c SNC,
intestinele, splina, esutul limfoid i ocular, precum i placenta, constituie
sursele de contaminare cele mai active.
n SUA, incidena a fost mai mare la vacile din fermele de lapte,
comparativ cu cele din fermele de carne, deoarece administrarea finii de
carne i oase, la prima categorie a fost fcut din primele luni de via, pe o
perioad lung de timp.
Multiplicarea iniial a agentului infecios are loc n esutul
limforeticular, dup care se rspndete n SNC pe cale nervoas.
Dup infectarea vieilor pe cale oral, agentul etiologic al BSE poate
fi detectat n regiunea distal a ileonului (plcile Payer).
Infectivitatea a fost demonstrat la rdcina ganglionului toracic
dorsal la 32-40 de luni dup infecie i n ganglionul trigemen la 36-38 de
luni (Constantin Vasiu, 2003).
S-a dovedit experimental c prin acidifierea mediului, are loc
267

o modificare structural a PrPc, practic transformarea ntr-o structur


monomeric, cu solubilitate ridicat, -PrP, bogat n structuri . Aceste
experimente arat c legarea mai multor molecule de -PrP poate duce la
apariia unei configuraii ireversibile, probabil baza acumulrii PrPsc n
BSE. (Constantin Vasiu, 2003).
n rile indemne de boal se impune respectarea urmtoarelor msuri
de prevenire:
1. Supraveghere clinic i prin examene de laborator a bovinelor
domestice, bovideelor exotice i cervideelor din mediul silvatic si din
captivitate.
2. Interzicerea importului de animale i produse ale acestora din rile
unde evolueaz boala.
3. Eliminarea din hrana rumegtoarelor a oricrui produs posibil
contaminat.
n rile n care boala evolueaz, msurile aplicate urmresc reducerea
sau eliminarea surselor de infecie pentru animale i a riscului de expunere
a oamenilor la mbolnvire prin consum de alimente de origine animal. Se
interzice folosirea, n hrana bovinelor a finii de carne i oase. Animalele
bolnave se sacrific i se distruc prin incinerare.
Tabelul 9.1
Situaia cazurilor de BSE (infecia bovin) i vCJD (infecia uman) raportate
pn n septembrie 2009 (The National Creutzfeldt-Jakob Disease Surveillance Unit
(NCJDSU), University of Edinburgh. February 2009)
ar
Austria
Belgia
Canada
Republica Ceh
Danemarca
Insula Falkland
Finlanda
Frana
Germania
Grecia
Hong Kong
Irlanda
Israel

cazuri BSE

cazuri vCJD

5
133
15
28
14
1
1
900
312
1
2
1,353
1

0
0
1
0
0
0
0
23
0
0
0
4
0

268

ar
Italia
Japonia
Liechtenstein
Luxembourg
Olanda
Oman
Polonia
Portugalia
Arabia Saudit
Slovacia
Slovenia
Spania
Suedia
Elveia
Thailanda
Marea Britanie
SUA
Total

cazuri BSE

cazuri vCJD

138
26
2
2
85
2
21
875

1
1
0
1
3
0
0
2
1
0
0
5
0
0
2
167
3
214

15
7
412
1
453
nu exist date
183,841
3
188,579

9.2. Boala Creutzfeldt-Jakob (CJD, vCJD)


n martie 1996, a fost nregistrat o nou variant de CJD (nvCJD,
vCJD) n SUA la un grup mic de oameni majoritatea fiind mai tineri dect
vrsta semnalat la cazurile precedente. n mod normal CJD apare la
oamenii cu vrsta peste 60 de ani, dar n SUA, vCJD atac indivizii cu
vrste cuprinse ntre 15-40 de ani.
S-a concluzionat c vCJD reprezint de fapt forma uman de BSE.
Prin studii pe oareci s-a demonstrat c BSE i CJD sunt similare.
ntre februarie 1994 i octombrie 1995 au fost depistate n SUA 10
persoane cu nvCJD, dintre care 8 au murit. Majoritatea victimelor aveau
sub 30 de ani. ntre anii 1995 i 1998 au fost depistate n SUA 32 de cazuri.
n 2003, n Europa boala a produs 150 de victime. ntre 1991 i 1995 au
fost nregistrate n SUA, 94 de decese, dintre care 9 au avut vrste sub 55
de ani. Peste 85% dintre pacienii cu CJD mor la aproximativ un an de
la declanarea bolii. ntre 1991 i 1995 rata mortalitii anuale n SUA,
datorat CJD a fost de 1,2/1.000.000 de oameni.
269

9.3. Boala cahectizant cronic


(Chronic Wasting Disease - CWD)
CWD este o boal prionic detectat pentru prima dat n 1967, n
statul Colorado. A fost diagnosticat la cerbii slbatici i la elani n districtele
Wyoming, Nebraska i n provincia Saskatchewan din Canada.
Boala se pare c se transmite prin saliv i fecale. Se estimeaz c
n zonele endemice sunt infectai ntre 4% i 6% dintre cerbi i 1% dintre
elani. Simptomele primare la elani sunt emacierea musculaturii i salivaie
permanent.
n decembrie 2003, departamentul de agricultur din SUA a pus la
punct un program prin care se interzice deplasarea cerbilor captivi i a
elanilor ntre diferite state. Pentru detectarea agentului etiologic se folosesc
dou teste postmortem din SNC.

270

Vacuole microscopice caracteristice pe o seciune dintr-un esut nervos afectat de prioni, cu


aspect spongiform (www.aphis.usda.gov)

Imagine clasic cu vac bolnav de BSE. Se observ dificulti locomotorii datorate


afeciunilor nervoase (www.aphis.usda.gov)
271

Distribuia BSE. Zonele verde nchis reprezint cazuri confirmate la om, iar cele verde
deschis, zone n care au fost raportate cazuri umane.

Infarcte cerebeloase la un pacient cu vCJD. Seciuni adiacente cerebeloase, colorate imun


pentru markerul neuronal al proteinei din neurofilament (A) i PrP (B) (H. Budka 2000).
272

Se remarc vacuole mici rotunde sau ovale grupate difuz sau focal n neuropil. Spectrul
de intensitate crete de la fig. (A) - fr modificri, (B) - modificri moderate la (C) modificri pronunate. Coloraia HE. (H. Budka 2000).

vCJD cu plci florale vizibile (plci amiloide fibrilare nconjurate de vacuole spongiforme).
Coloraia HE. H. Budka 2000
273

Bibliografie selectiv
1. Bovine Spongiform Encephalopaphy: An Overview. Animal and Plant Health
Inspection Service, United States Department of Agriculture. 2006. http://www.aphis.
usda.gov/publications/animal_health/content/printable_version/BSEbrochure122006.pdf.
2. Bovine Spongiform Encephalopathy - Mad Cow Disease. Fact Sheets. Food
Safety and Inspection Service. 2005. http://www.fsis.usda.gov/Fact_Sheets/
Bovine_Spongiform_Encephalopathy_Mad_Cow_Disease/index.asp.
3. BSE cases - Italy 2001 - 2006. 2006. http://www.izsto.it/ceafoc_bse.htm.
4. BSE Cases in North America, by Year and Country of Death, 1993-2008. Centers
for Disease Control and Prevention, Department of Health and Human Services.
2008. http://www.cdc.gov/ncidod/dvrd/bse/images/bse_cases_namerica_2008.gif.
5. BSE in Belgium. 2006. http://home.hetnet.nl/~mad.cow/landen/Belgium.htm.
6. BSE in Greece. http://home.hetnet.nl/~mad.cow/landen/Greece.htm.
7. BSE Positive Findings in the Czech Republic. State Veterinary Administration,
Ministry of Agriculture, Czech Republic. 2007. http://www.svscr.cz/files/bse/en_
mappositivefindingsbse.pdf.
8. BSE: Disease control & eradication - Causes of BSE, Department for Environment,
Food, and Rural Affairs, 2007.
9. Commonly Asked Questions About BSE in Products Regulated by FDAs Center for
Food Safety and Applied Nutrition (CFSAN). Center for Food Safety and Applied
Nutrition, Food and Drug Administration. 2005. http://vm.cfsan.fda.gov/~comm/
bsefaq.html.
10. Creutzfeldt-Jakob Disease Fact Sheet. National Institute of Neurological Disorders
and Stroke. 2008. http://www.ninds.nih.gov/disorders/cjd/detail_cjd.htm.
11. Israel: BSE testing according to source of cattle and age groups, 2002-2008. 2008.
http://agri3.huji.ac.il/~yakobson/bse/bse_test.htm.
12. Mad cow disease: Still a concern. MayoClinic.com. CNN. 2006. http://premium.
edition.cnn.com/HEALTH/library/ID/00012.html.
13. Mad cow watch goes blind. USA Today. 2006. http://www.usatoday.com/news/
opinion/editorials/2006-08-03-our-view_x.htm.
14. Overzicht BSE-gevallen. Ministerie van Landbouw, Natuur en Voedselkwaliteit.
2008. http://www.minlnv.nl/portal/page?_pageid=116,1640440&_dad=portal&_
schema=PORTAL&p_document_id=110016&p_node_id=1161644&p_
mode=BROWSE.
15. Statistics. Trade Library. U.S. Meat Export Federation. http://www.usmef.org/
TradeLibrary/Statistics.asp.
16. The BSE Inquiry, Lord Phillips of Worth Matravers, 2000.
274

17. The Current Status of BSE and scrapie in Denmark. Danish Veterinary and Food
Administration. 2007. http://www.uk.foedevarestyrelsen.dk
18. vybp7ro2oirh77lz4kacv72gwfhuv6gmt4g643hvuhg4t2wgmynpbco2zpem2ucte/
StatusreportonBSEandscrapieinDenmarkMay20071.
19. Variant Creutzfeld-Jakob Disease, Current Data, 2009. The National CreutzfeldtJakob Disease Surveillance Unit (NCJDSU), University of Edinburgh. http://www.
cjd.ed.ac.uk/vcjdworld.htm.
20. Almer, G., Hainfellner, J. A., Brcke, T., Jellinger, K., Kleinert, R., Bayer, G., Windl,
O., Kretzschmar, H. A., Hill, A., Sidle, K., Collinge, J., and Budka, H. (1999): Fatal
familial insomnia: a new Austrian family. Brain 122, 5-16.
21. Belichenko, P. V., Miklossy, J., Belser, B., Budka, H., and Celio, M. R. (1999):
Early destruction of the extracellular matrix around parvalbumin-immunoreactive
interneurons in Creutzfeldt-Jakob disease. Neurobiol Dis 6, 269-279.
22. Bell, J. E., Gentleman, S. M., Ironside, J. W., McCardle, L., Lantos, P. L., Doey,
L., Lowe, J., Fergusson, J., Luthert, P., McQuaid, S., and Allen, I. V. (1997): Prion
protein immunocytochemistry -- UK five centre consensus report. Neuropathol
Appl Neurobiol 23, 26-35.
23. Brown, David, 2001. The recipe for disaster that killed 80 and left a 5bn bill.
The Daily Telegraph. http://www.telegraph.co.uk/news/uknews/1371964/Therecipe-for-disaster-that-killed-80-and-left-a-5bn-bill.html. Retrieved.
24. Budka, H. (1997a): The human prion diseases: from neuropathology to pathobiology
and molecular genetics. Final report of an EU Concerted Action. Neuropathol Appl
Neurobiol 23, 416-422.
25. Budka, H. (1997b): Transmissible spongiform encephalopathies (prion diseases),
pp. 449-474. In J. H. Garcia (Ed.): Neuropathology. The diagnostic approach,
Mosby, St.Louis.
26. Budka, H. (2000a): Histopathology and immunohistochemistry of human
transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). Arch Virol.
27. Budka, H. (2000b): Prions and transfusion medicine. Vox Sang 78 (suppl 2), 231238.
28. Budka, H., Aguzzi, A., Brown, P., Brucher, J.-M., Bugiani, O., Gullotta, F., Haltia,
M., Hauw, J.-J., Ironside, J. W., Jellinger, K., Kretzschmar, H. A., Lantos, P. L.,
Masullo, C., Schlote, W., Tateishi, J., and Weller, R. O. (1995): Neuropathological
diagnostic criteria for Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) and other human spongiform
encephalopathies (prion diseases). Brain Pathol 5, 459-466.
29. Chesebro, B. (1999): Minireview: Prion protein and the transmissible spongiform
encephalopathy diseases. Neuron 24, 503-506.
30. Colchester AC, Colchester NT 2005. The origin of bovine spongiform
encephalopathy: the human prion disease hypothesis. Lancet.
31. Colchester, A; Colchester, N 2006. Origin of bovine spongiform encephalopathy
275

Authors reply. The Lancet (Elsevier).


32. Constantin Vasiu, 2003. Viroze i boli prionice la animale. Ed. Nereamia Napocae.
33. Digesta Artis Mulomedicinae, Publius Flavius Vegetius Renatus Vol.1 - Executive
Summary of the Report of the Inquiry
34. Dorandeu, A., Wingertsmann, L., Chrtien, F., Delisle, M.-B., Vital, C., Parchi, P.,
Montagna, P., Lugaresi, E., Ironside, J. W., Budka, H., Gambetti, P., and Gray, F.
(1998): Neuronal apoptosis in fatal familial insomnia. Brain Pathol 8, 531-537.
35. Giaccone, G., Canciani, B., Puoti, G., Rossi, G., Goffredo, D., Iussich, S., Fociani,
P., Tagliavini, F., and Bugiani, O. (2000): Creutzfeldt-Jakob disease: Carnoys
fixative improves the immunohistochemistry of the proteinase K-resistant prion
protein. Brain Pathol 10, 31-37.
36. Groschup, M. H., Beekes, M., McBride, P. A., Hardt, M., Hainfellner, J. A., and
Budka, H. (1999): Deposition of disease-associated prion protein involves the
peripheral nervous system in experimental scrapie. Acta neuropathol 98, 453-457.
37. Guentchev, M., Groschup, M. H., Kordek, R., Liberski, P. P., and Budka, H. (1998):
Severe, early and selective loss of a subpopulation of GABAergic inhibitory neurons
in experimental transmissible spongiform encephalopathies. Brain Pathol 8, 615623.
38. Guentchev, M., Hainfellner, J.-A., Trabattoni, G. R., and Budka, H. (1997):
Distribution of parvalbumin positive neurons in brain correlates with hippocampal
and temporal cortical pathology in Creutzfeldt-Jakob disease. J Neuropathol Exp
Neurol 56, 1119-1124.
39. Guentchev, M., Voigtlnder, T., Haberler, C., Groschup, M. H., and Budka, H.
(2000): Evidence for oxidative stress in experimental prion disease. Neurobiol Dis
(in press) 7.
40. Guentchev, M., Wanschitz, J., Voigtlaender, T., Flicker, H., and Budka, H. (1999):
Selective neuronal vulnerability in human prion diseases. Fatal familial insomnia
differs from other types of prion diseases. Am J Pathol 155, 1453-1457.
41. Hainfellner, J. A., and Budka, H. (1996): Immunomorphology of human prion
diseases, pp. 75-80. In L. Court, and B. Dodet (Eds): Transmissible Spongiform
Encephalopathies: Prion Diseases, Elsevier, Paris.
42. Hainfellner, J. A., and Budka, H. (1999): Disease associated prion protein may
deposit in the peripheral nervous system in human transmissible spongiform
encephalopathies. Acta Neuropathol 98, 458-460.
43. Hainfellner, J. A., Brantner-Inthaler, S., Cervenakova, L., Brown, P., Kitamoto, T.,
Tateishi, J., Diringer, H., Liberski, P. P., Regele, H., Feucht, M., Mayr, N., Wessely,
P., Summer, K., Seitelberger, F., and Budka, H. (1995): The original GerstmannStrussler-Scheinker family of Austria: divergent clinicopathological phenotypes
but constant PrP genotype. Brain Pathol 5, 201-211.
44. Hainfellner, J. A., Jellinger, K., Diringer, H., Guentchev, M., Kleinert, R., Pilz, P.,
276

Maier, H., and Budka, H. (1996): Creutzfeldt-Jakob disease in Austria. J Neurol


Neurosurg Psychiat 61, 139-142.
45. Harden, Blaine 2003. Supplements used in factory farming can spread disease.
The Washington Post. http://archives.seattletimes.nwsource.com/cgi-bin/texis.cgi/
web/vortex/display?slug=madcowdairy28&date=20031228.
46. Hegyi, I., Hainfellner, J. A., Flicker, H., Ironside, J. W., Hauw, J. J., Tateishi,
J., Haltia, M., Bugiani, O., Aguzzi, A., and Budka, H. (1997): Prion protein
immunocytochemistry: reliable staining protocol, immunomorphology, and
diagnostic pitfalls. Clin Neuropathol 16, 262-263.
47. Hill, A. F., Butterworth, R. J., Joiner, S., Jackson, G., Rossor, M. N., Thomas, D.
J., Frosh, A., Tolley, N., J E Bell, Spencer, M., King, A., Al-Sarraj, S., Ironside, J.
W., Lantos, P. L., and Collinge, J. (1999): Investigation of variant Creutzfeldt-Jakob
disease and other human prion diseases with tonsil biopsy samples. Lancet 353,
183-189.
48. Kordek, R., Hainfellner, J. A., Liberski, P. P., and Budka, H. (1999): Deposition
of the prion protein (PrP) during the evolution of experimental Creutzfeldt-Jakob
disease. Acta neuropathol 98, 597-602.
49. Kretzschmar, H. A., Ironside, J. W., DeArmond, S. J., and Tateishi, J. (1996):
Diagnostic criteria for sporadic Creutzfeldt-Jakob-disease. Arch Neurol 53, 913920.
50. MacKenzie, Debora 2007. New twist in tale of BSEs beginnings. New Scientist
http://www.newscientist.com/article/mg19325954.400-new-twist-in-tale-of-bsesbeginnings.html.
51. Mago, Chandrika; Sinha, Kounteya 2005. India dismisses Lancets mad cow. The
Times of India. http://timesofindia.indiatimes.com/articleshow/1218869.cms.
52. Parchi, P., Giese, A., Capellari, S., Brown, P., Schulz-Schaeffer, W., Windl, O., Zerr, I.,
Budka, H., Kopp, N., Piccardo, P., Poser, S., Rojiani, A., Streichemberger, N., Julien,
J., Vital, C., Ghetti, B., Gambetti, P., and Kretzschmar, H. (1999): Classification of
sporadic Creutzfeldt-Jakob disease based on molecular and phenotypic analysis of
300 subjects. Ann Neurol 46, 224-233.
53. Pathogens and Contaminants. Food Safety Research Information Office. Nov. 2007.
http://fsrio.nal.usda.gov/document_fsheet.php?product_id=169.
54. Peck, Clint 2004. Reader Questions Poultry Litter And Downer Bans. Organic
Consumers Association. http://www.organicconsumers.org/madcow/cow110504.
cfm.
55. Phillips, Kyra; Meserve, Jeanne 2001. FDA Not Doing Enough to Prevent Mad
Cow Disease?. Organic Consumers Association. http://www.organicconsumers.
org/madcow/cnn22602.cfm.
56. Rampton, Sheldon; Stauber, John 2004. Mad Cow USA (1st ed.). Monroe, Maine:
Common Courage Press. ISBN 978-1-56751-110-9.
277

57. Richt JA, Hall SM 2008. BSE case associated with prion protein gene mutation.
PLoS Pathogens.
58. Schulz-Schaeffer, W. J., Tschoke, S., Kranefuss, N., Drose, W., Hause-Reitner, D.,
Giese, A., Groschup, M. H., and Kretzschmar, H. A. (2000): The paraffin-embedded
tissue blot detects PrP(Sc) early in the incubation time in prion diseases. Am J Pathol
156, 51-56.
59. Seltzer, Molly 2008. Meat Recalls to Name Retailers. Bloomberg News.
The
Washington
Post.
http://www.washingtonpost.com/wp-dyn/content/
article/2008/07/11/AR2008071102818.html.
60. Thompson, Geoff 2005. New theory traces mad cow disease to animal feed
exported from India. The World Today (ABC). http://www.abc.net.au/worldtoday/
content/2005/s1453543.htm.
61. Valleron AJ, Boelle PY, Will R, Cesbron JY 2001. Estimation of epidemic size
and incubation time based on age characteristics of vCJD in the United Kingdom.
Science (New York, N.Y.) .
62. Van Everbroeck, B., Palsa, P., Martina, J.-J., and Cras, P. (1999): Antigen retrieval
in prion protein immunohistochemistry. J Histochem Cytochem 47, 1465-1470.
63. Wanschitz, J., Klppel, S., Jarius, C., Birner, P., Flicker, H., Hainfellner, J. A.,
Gambetti, P., Guentchev, M., and Budka, H. (2000): Alteration of the serotonergic
nervous system in fatal familial insomnia. Ann Neurol (in press).
64. Weiss, Rick 2007. Scientists Announce Mad Cow Breakthrough. The Washington
Post.
http://www.washingtonpost.com/wp-dyn/content/article/2006/12/31/
AR2006123100672.html.
65. WHO (1998): Global surveillance, diagnosis and therapy of human transmissible
spongiform encephalopathies: report of a WHO consultation. Geneva, Switzerland,
9-11 February 1998, pp. WHO/EMC/ZDI/98.9, WHO, Geneva.

278