METODE DE EXTRACTIE SI SEPARARE A CAROTENOIDELOR

DIN PLANTE

Consideratii generale
Dezvoltarea impetuoasa a tehnicilor de izolare si identificare a
compusilor naturali a avut ca rezultat o imbogatire rapida a numarului
pigmentilor carotenoidici. Pentru izolarea din amestecurile de produsi
naturali, se tine cont de proprietatile lor fizice si chimice.
Pigmentii carotenoidici sunt sensibili la lumina, caldura, oxigen,
acizi si baze alcaline. Din acest motiv, trebuie respectate anumite conditii,
pentru pastrarea materialului supus analizei. Prin expunerea la lumina, in
mod deosebit la lumina solara directa sau la lumina UV, se realizeaza
fotoizomerizarea cis-trans, ceea ce poate conduce la fotodistrugerea lor. De
aceea, materialele biologice ce contin carotenoide sau solutiile lor trebuie
ferite de actiunea luminii.
Multe carotenoide sunt termolabile, in special xantofilele, incalzirea
lor realizandu-se doar in situatia cand este absolut necesar acest lucru.
Separarea carotenoidelor trebuie realizata la temperatura camerei, pana la
200C si la intuneric. In cazul saponificarii la cald, solutiile trebuie protejate
prin utilizarea solventilor cu puncte de fierbere nu foarte ridicate (30-600C).
In prezenta oxigenului (aer) sau a peroxizilor, multe carotenoide pot fi
oxidate, ele fiind foarte sensibile la oxigen in stare adsorbita (in
cromatograme, pe coloana si pe strat subtire). Este necesar sa se lucreze in
stare inerta (in atmosfera de azot sau vacuum). Oxidarea in timpul extractiei
si saponificarii poate fi minima prin utilizarea unei atmosfere de azot.
Prin expunerea carotenoidelor sau a materialelor biologice actiunii
acizilor, au loc o serie de transformari, cum sunt descompunerile
oxidative, izomerizarea cis-trans si izomerizarea 5,6-epoxizilor la 5,8-
epoxizi. Inlaturarea acestor inconveniente se realizeaza prin neutralizarea
cu CaCO3, piridina sau dimetilalanina. De asemenea, se lucreaza cu
solventi purificati si proaspat distilati, indeosebi derivatii clorurati, cum este
diclormetanul, care contine in mod frecvent HCl.
Depozitarea pigmentilor carotenoidici se realizeaza la intuneric, sub
atmosfera de azot sau in vacuum, la o temperatura de .200C. Cel mai bine se
pastreaza in stare cristalina. Pastrarea sub forma de solutie se realizeaza in
eter de petrol, hexan sau benzen.
Determinarea unor constante fizice ca temperatura de topire,
temperatura de fierbere, densitatea, indicele de refractie, intensitatea

1
absorbtiei la anumite lungimi de unda etc., ofera date distincte care permit
individualizarea unui compus organic, caracterizarea lui. Totusi, in
cercetarile actuale se utilizeaza metodele spectrale, care ofera informatii mai
precise privind structura si proprietatile substantelor organice. Metodele
spectrale au avantajul, fata de metodele chimice de identificare, ca
furnizeaza date in timp mult mai scurt si sunt mai precise, necesita cantitati
mici de substanta si ofera posibilitatea analizarii continue, in diferite etape
ale prelucrarii compusului extras, fara modificarea compozitiei substantei
cercetate, ceea ce permite recuperarea sa.
In lucrarea de fata sunt prezentate principalele metode de extractie,
separare si identificare a compusilor organici, cu aplicatii directe la pigmenti
carotenoidici.

Metode de extractie
Generalitati privind metodele generale de extractie
Distributia intr-o mare varietate de materiale si lichide biologice
a compusilor biologic activi a facut sa nu se poata adopta o metoda general-
valabila de extractie care sa poata fi aplicabila in mod universal si adoptata
ca o tehnica standardizata. Acest lucru se datoreaza structurii diferite a
compusilor biologic activi, chiar si cei din aceeasi clasa deosebindu-se intre
ei prin lungimea catenei, prin grupari functionale specifice sau
configuratie, solubilizarii diferite in solventi etc. Metoda de extractie se
alege in functie de natura materialului vegetal, de usurinta extractiei cu
solventi, de cantitatea si proprietatile compusilor supusi extractiei
(solubilitate, termolabilitate) etc. [1]
Dupa natura substantei de extras, lichida sau solida, se aplica extractia
solid-lichid, in marea majoritate a cazurilor, si extractia lichid-lichid,
adica extractia unui lichid sau a principiilor active aflate intr-un lichid
(rezultatul primei faze de extractie), cu ajutorul altui lichid nemiscibil.
Produsul vegetal proaspat sau uscat se pulverizeaza sau se zdrobeste
foarte fin pana la gradul de maruntire convenabil realizarii extractiei.
Alegerea solventului este determinata de natura principiilor active,
proprietatile fizico-chimice ale solventului, selectivitatea solventului. In
general, substantele termolabile sunt extrase la rece prin percolare sau
agitare. Pentru extractia la cald se folosesc mai multe metode in
functie de regimul de extractie, si anume extractia la reflux, extractia
continua solid-lichid sau lichid-lichid. Cele mai bune rezultate se obtin prin
aplicarea extractiei in contracurent. O metoda eficace de extractie o
constituie ultrasonicarea materialului supus extractiei cu solventi.

2
 Metode de extractie a carotenoidelor
Extractia carotenoidelor din produsul vegetal se realizeaza cu
solventi organici nepolari, de regula eter etilic sau cloroform, prin
macerare, agitare mecanica sau prin refluxare pe baia de apa in
fierbere. Se impune un grad de maruntire avansat, deoarece solventul
nepolar nu patrunde prin membrana celulara pentru a dizolva carotenoidele.
Materialul vegetal supus extractiei poate fi in stare proaspata sau
uscata.
Daca materialul supus extractiei se afla in stare proaspata, acest
lucru implica si existenta apei in tesuturi, pentru indepartarea ei fiind
necesara uscarea prealabila a materialului vegetal prin extractia cu solventi
miscibili cu apa (acetona, metanol, etanol), materialul trebuind sa fie
suficient de deshidratat pentru a se preta extractiilor ulterioare cu solventi
neaposi. In cazul materialului uscat, extractia se realizeaza cu solventi
nemiscibilicu apa.
Solutia extractiva organica contine derivati carotenoidici nativi, alaturi
de numeroase substante balast, cum ar fi clorofila.

Extractia din tesuturile plantelor superioare

Schema generala de extractie a carotenoidelor din produse
vegetale este cea prezentata mai jos.[2] Pentru tesuturile plantelor
superioare se cunosc o multitudine de metode de extractie, in continuare
fiind prezentate doua, ce constituie variante simplificate ale metodei
generale de extractie. [1]

Metoda I
Materialul vegetal este maruntit foarte fin (din considerentele
aratate mai sus) si omogenizat cu acetona, timp de 1-2 minute, in atmosfera
de azot. Omogenatul este filtrat, iar reziduul este supus extractiei
ulterioare cu acetona, pana cand omogenatul devine incolor. Extractele
acetonice se reunesc si se concentreaza la volum mic prin evaporare la
rotavapor. Peste extractul acetonic se adauga un volum egal de eter etilic
proaspat distilat, omogenizand amestecul si spalandu-l apoi cu o solutie de
NaCl (pentru ca eterul etilic sa se indeparteze usor si pentru a se evita
emulsionarea amestecului), pana la indepartarea completa a acetonei.
Aceasta metoda este foarte utilizata in cazul in care se
realizeaza extractii ale tesuturilor verzi ale plantelor, flori si fructe.

3
 EXTRACTIA CAROTENOIDELOR DIN PRODUSE VEGETALE

PRODUS VEGETAL PULVERIZAT

-epuizare cu eter(cloroform);macerare,agitare,percolare,refluxare

FAZA ORGANICA REZIDUU VEGETAL

-distilare volum redus;agitare Na2CO3

FAZA APOASA ALCALINA FAZA ORGANICA

(sapunuri ale acizilor grasi liberi) -saponificare KOH 10% in alcool(1-2 ore in baia de apa
in fierbere);racire;epuizare cu eter

FAZA ORGANICA FAZA ALCALINA

-anhidrizare cu Na2SO4 sicc.,filtrare, (lipide saponificate)
distilare vid volum mic

Hidrocarburi alifatice FAZA ORGANICA FAZA ORGANICA REZIDUU TOTAL

precipitat alb-sidefos o
-racire 5-10 C;filtrare -evaporare CAROTENOIDIC
reluari repetate cu eter

SOLUTIE EXTRACTIVA ETERICA REZIDUU

filtrare;evaporare reluari cu CH3OH 92%;
filtrare;evaporare

TOTAL CAROTENOIDIC I TOTAL CAROTENOIDIC II

HIDROCARBURI CAROTENOIDICE XANTOFILE DIHIDROXILATE
XANTOFILE MONOHIDROXILATE ALTE CAROTENOIDE SUPERIOR OXIDATE

Metoda II
Aceasta metoda este utila in cazul in care se lucreaza cu cantitati mici
de substanta. Tesutul este maruntit si triturat cu Na2SO4 anhidru, pana se
obtine o pudra foarte fina, care este apoi supusa extractiei cu acetona,
urmata de eter etilic. Extractul se centrifugheaza, precipitatul obtinut
extragandu-se in continuare pana la incolor, solutiile supernatante
reunindu-se si concentrandu-se, transferandu-se apoi intr-un volum egal de
eter etilic, ca si in cazul metodei I.
Pentru ambele metode este necesara saponificarea, care permite
indepartarea substantelor balast, mai ales a clorofilei, si hidroliza
esterilor xantofilei. Saponificarea se realizeaza prin adaugarea de KOH

4
15% peste extract (1:10, v/v). Aceasta saponificare se poate realiza in
doua moduri:
- incalzirea amestecului alcalin timp de 10-15 minute pe baie de apa,
in atmosfera de azot,
la intuneric;
- pastrarea la temperatura camerei sau la 50C, la intuneric, timp de
10-15 ore.
Este de preferat utilizarea metodei de saponificare prin racire, datorita
faptului ca unii pigmenti carotenoidici (cum sunt xantofilele) sunt labile
termic, existand posibilitatea degradarii.

Extractia din alge

In cazul extractiei carotenoidelor din alge nu se mai aplica metoda
generala prezentata mai sus, datorita faptului ca, pentru o extractie eficienta,
este necesara o disruptie mecanica sau un pretratament. De asemenea,
extractia carotenoidelor din alge se realizeaza cu solventi mai polari decat
acetona (etanol sau amestec acetona:etanol), datorita faptului ca au polaritate
mare si permit efectuarea saponificarii pe extractul initial. [3]
Pretratamentul poate consta in suspendarea algelor in apa distilata si
racirea timp de 5-8 ore inaintea extractiei propriu-zise, apoi extractia cu
metanol. Un alt pretratament consta in decolorarea preliminara cu vapori
de apa sau tratarea cu apa fierbinte, timp de 2-3 minute, apoi racirea rapida
cu gheata. Acest ultim procedeu inlesneste extractia carotenoidelor, dar are si
un inconvenient, si anume posibilitatea distrugerii enzimelor care actioneaza
asupra carotenoidelor si clorofilelor.
Pentru o izolare eficienta a carotenoidelor din alge, acestea pot fi
supuse uscarii, desi, prin acest procedeu, unii compusi pot suferi modificari,
si pot exista diminuari ale randamentelor de extractie.
Un procedeu care implica uscarea prealabila a algelor a fost utilizat la
extractia carotenoidelor din Fucus serratus, cand algele sunt uscate timp de
cateva zile, macinate, apoi pudra este amestecata cu apa (800 ml apa la 500
g pudra), dupa care amestecul este eluat intr-o coloana prin percolare cu
amestec benzen:metanol (1:10, v/v). Eluatele de culoare verde se
indeparteaza, iar zona bruta se elueaza cu mult solvent, se concentreaza si se
cromatografiaza pe coloana de CaCO3.

Cromatografia
Cromatografia este o metoda fizica de separare bazata pe distributia
componentelor dintr-un amestec intre doua faze: una fixa, denumita
faza stationara, si alta mobila, ce strabate faza stationara. Faza stationara

5
poate fi un adsorbant solid (cromatografie de adsorbtie), un lichid depus pe
suprafata unui suport solid (cromatografie de repartitie), un schimbator de
ioni (cromografie prin schimb ionic) sau un gel (cromatografie prin
excluziune sterica).[5]
Cromatografia se aplica in scopul izolarii unor componenti prin
separarea acestora la elutia coloanei (in cromatografia pe coloana), prin
razuirea spoturilor de pe cromatoplaci (cromatografia in strat subtire) sau
prin taierea spoturilor de pe hartie (cromatografia pe hartie).[6]
Termenul de cromatografie, care inseamna .scriere in culori.
(chrom=culoare in limba greaca) a fost dat de Tvet (1906), cu ocazia
separarii colorantilor din frunze verzi (clorofile, carotenoide), prin
adsorbtie lichid-solid.
Principiul metodei Tvet consta in stabilirea unui echilibru intr-un
proces cinetic de adsorbtie-desorbtie intre faza solida fixa si faza lichida
mobila. Faza stationara este alcatuita din material adsorbant, granular, plasat
intr-o coloana, iar faza mobila este o solutie a amestecului de separat intr-un
solvent potrivit. Solutia se deplaseaza in coloana prin cadere libera sau cu
ajutorul unei diferente de presiune. Pentru distantarea zonelor in care s-au
adsorbit diversi componenti ai amestecului se adauga un solvent la
partea superioara a coloanei. Componentii migreaza cu viteze diferite,
datorita faptului ca sunt retinuti in mod diferit de catre faza stationara.
Procesul este denumit developarea cromatogramei.
Separarea completa a componentilor din coloana, numita elutia
cromatogramei, se realizeaza prin adaugarea de solventi diferiti si
culegerea solutiilor respective in vase diferite. Componentii ies din
coloana in ordinea inversa adsorbabilitatii lor in faza stationara.
Dintre metodele cromatografice, cromatografia in faza gazoasa si
cromatografia gaz-lichid sunt foarte raspandite, datorita faptului ca pot
fi aplicate oricarui amestec de componenti lichizi cu temperaturi joase de
fierbere.
Pentru compusii organici cu volatilitate redusa, se utilizeaza
cromatografia in strat subtire si cromatografia pe hartie.
In cromatografia pe hartie, faza stationara este constituita dintr-o
foaie de hartie de filtru, pe care se aplica la o extremitate o picatura
din amestecul de analizat. Hartia se introduce apoi cu extremitatea
continand picatura intr-un eluent situat intr-un vas acoperit. Eluentul urca
prin capilaritate si antreneaza componentele in ordinea crescanda a valorii
Rf, ce reprezinta raportul dintre viteza de migrare a componentului si
viteza de migrare a eluentului:

6
 vc
Rf = v
e

Practic se masoara distanta de migrare a solventului si distanta de

migrare a componentului.
Recunoasterea componentilor incolori se realizeaza cu ajutorul unui
reactiv specific cu care dau compusi colorati.
Cand se doreste separarea neta a componentilor unui amestec, se
realizeaza o cromatografie bidimensionala cand, dupa o prima developare,
hartia se usuca, se roteste cu 900 si se asaza intr-un nou eluent.
In cromatografia in strat subtire, faza stationara este un strat
adsorbant (de silicagel sau alumina) cu o grosime de fractiune de
milimentru, depus pe o placa de sticla.
Principiul separarii este acelasi ca la cromatografia pe hartie, insa
prezinta avantajul unei separari mai rapide si mai precise.

Metode de separare a carotenoidelor

Separarea carotenoidelor dintr-un amestec este dependenta de natura
lor, si anume de polaritatea moleculei si de gruparile functionale din
molecula, ce determina caracterul lor hidrofil. Datorita acestor proprietati
exista doua metode de separare a carotenoidelor, si anume:
- repartitia intre doua faze lichide nemiscibile intre ele;
- separare prin adsorbtie pe adsorbant.
Schema generala de separare implica urmatoarele etape:
- faza organica, obtinuta dupa saponificarea extractului, este
anhidrizata cu Na2SO4 sicc., se supune repartitiei intre eter de petrol-
metanol 92% pentru a separa hidrocarburile carotenoidice si xantofilele
monohidroxilate care trec in epifaza(eter), iar xantofilele dihidroxilate si
alte carotenoide superior oxidate trec in hipofaza (alcool);
- fiecare faza se supune cromatografierii pe coloana de oxid de
aluminiu (Al2O3 standardizat .Brockmann II-III) sau alt adsorbant,
utilizand ca eluanti eter, alcool etilic:eter (1:9, v/v), alcool etilic absolut,
acetona. Se retin fractiuni de 50-100 ml, carora li se determina puritatea
prin cromatografie in strat subtire, folosind drept faza stationara silicagel, iar
drept faza mobila un sistem de solventi.

7
 Separarea prin repartitia lichid-lichid
Dupa cum s-a aratat mai sus, un sistem de repartitie il constituie eterul
de petrol si metanolul. Prin aceasta metoda se pot separa carotenoidele
hidrocarburice de xantofile. Separarea este utilizata ca o faza preliminara
cromatografiei pe coloana sau in strat subtire.
Separarea prin repartitie intre doua lichide poate fi o alternativa
a saponificarii in vederea indepartarii clorofilei din extractele ce nu se pot
saponifica prin adaugare de baze, datorita existentei carotenoidelor sensibile
la aceste substante. Acest procedeu implica trecerea xantofilelor in
hipofaza metanolica, clorofilele trecand in epifaza. O alta varianta este
extractia unei solutii metanolice a unui pigment cu eter de petrol, pana cand
clorofilele sunt indepartate. In ambele cazuri, xantofilele din hipofaza sunt
trecute in eter etilic si apoi spalate cu apa.
Acest procedeu este din ce in ce mai putin utilizat datorita
sensibilitatii metodelor cromatografice, prin repartitie randamentul de
separare fiind destul de redus, carotenoidele, din cauza solubilitatii diferite,
putandu-se gasi in ambele fractiuni de repartitie. In cazul unei carotenoide ce
poseda solubilitate doar in unul din cei doi solventi (glicozid sau acid), acest
procedeu se poate aplica, preferandu-se, totusi, metodele cromatografice.

Separarea prin metoda distributiei contracurent

Acest procedeu consta in repartitie repetata intre cei doi solventi
descrisi mai sus, ajungandu-se la metoda denumitadistributia
contracurent.[7] Dupa un numar suficient de mare de repartitii, amestecul
original este separat in fractiuni, avand fiecare o anumita solubilitate:
hidrocarburi carotenoidice, xantofile mono si dihidroxilate, etc. Acest
procedeu este urmat de o fractionare prin cromatografie pe coloana, prin
adsorbtie diferita datorata gruparilor specifice fiecarei grupe de carotenoide.
Acest procedeu este util in cazul separarii xantofilelor foarte polare, care
sunt puternic adsorbite.

Separea prin metode cromatografice

Pentru separarea carotenoidelor sunt foarte utilizate metodele
cromatografice, atat cea in strat subtire, cat si cea pe coloana.

Cromatografia in strat subtire

Cromatografia in strat subtire este o tehnica foarte utilizata in
separarea si purificarea carotenoidelor. Tehnica de baza a acestei metode a
fost descrisa de diferiti autori.[8] Gradul de purificare prin aceasta metoda
este mult mai mare, comparativ cu cromatografia pe coloana.

8
 In functie de natura carotenoidului se vor alege faza stationara,
precum si faza mobila si sistemul de eluare din placi.
In cromatografia in strat subtire a carotenoidelor trebuie luate anumite
precautii, si anume:
- aplicarea rapida a probei;
- aplicarea probei la lumina slaba;
- developarea imediata a cromatogramei;
- developarea la intuneric a cromatogramei;
- utilizarea unei atmosfere de azot.
Materialele biologice ce contin carotenoide sau solutiile lor trebuie
ferite de actiunea luminii deoarece prin expunerea carotenoidelor la lumina,
in mod deosebit la lumina solara directa sau la lumina UV, se realizeaza
fotoizomerizarea cis-trans, ceea ce poate conduce la fotodistrugerea lor.
Multe carotenoide sunt termolabile, in special xantofilele, incalzirea lor
realizandu-se doar in situatia cand este absolut necesar acest lucru. Separarea
carotenoidelor trebuie realizata la temperatura camerei, pana la 200C si la
intuneric. In cazul saponificarii la cald, solutiile trebuie protejate prin
utilizarea solventilor cu puncte de fierbere nu foarte ridicate (30-600C). In
prezenta oxigenului (aer) sau a peroxizilor, multe carotenoide pot fi oxidate,
ele fiind foarte sensibile la oxigen in stare adsorbita (in cromatograme, pe
coloana si pe strat subtire).

Alegerea fazei stationare

Pot fi utilizati drept faza stationara foarte multi adsorbanti, dupa cum
rezulta din tabelul 1.
Sistemele cele mai utilizate in cromatografia in strat subtire cuprind
separarea carotenoidelor pe strat cu silicagel si developarea cu eter de petrol
(+5% eter etilic) sau pe MgO si developare cu benzen:eter de petrol (9:1,
v/v). Cromatoplacile ce au drept sistem stationar ZnCO3, developate cu
amestec hexan- alcool, dau rezolutii foarte bune pentru xantofile, in timp ce
CaCO3, MgO si Ca(OH)2 sunt utile atat in separarea hidrocarburilor
carotenoidice, cat si a xantofilelor.

Alegerea solventului
Solventii utilizati in separarea carotenoidelor prin cromatografie in
strat subtire sunt eluanti slabi, cum ar fi eter etilic, benzenul, precum si
amestec de solventi acetona-eter etilic, etanol-eter etilic, acetat de etil-
benzen etc. Solventii care dau o inalta rezolutie, datorita proprietatilor
lor, sunt alcoolii tertiari. Cloroformul este in general omis datorita
urmelor de acid clorhidric pe care le contine si care pot conduce la

9
transformari ale carotenoidelor. Acidul acetic este utilizat doar in cazul
carotenoidelor puternic adsorbite pe adsorbant.
Adsorbanti utilizati pentru cromatografia in strat subtire a
carotenoidelor (tabelul 1):
Nr.crt Adsorbant
1. Al2O3
2. Celuloza
3. CaCO3:MgO:Ca(OH)2
(30:6:5, m/m/m)
4. Ca(OH)2
5. Ca(OH)2:silicagel (1:1,
m/m)
6. Kieselguhr
7. Manitol
8. MgO
9. MgO:celita(1:2, m/m)
10. MgO:silicagel
(1:1, m/m)
11. Silicagel
12. Zaharoza
13. ZnCO3

Detectarea carotenoidelor
Datorita faptului ca acesti pigmenti sunt colorati, se poate realiza si
identificarea vizuala a lor (se poate detecta vizual pana la 0,05 g -
caroten). Carotenoidele, insa, se decoloreaza rapid pe placa cromatografica,
din acest motiv fiind necesara stropirea cromatoplacii cu o solutie de
parafina in eter de petrol [8]. Unele carotenoide carbonilice sau produsii de
descompunere oxidativa pot fi identificati cu o solutie de rodamina 1% in
acetona [9] sau prin stropirea cu o solutie de SbCl3 in cloroform. Cea mai
sensibila metoda ramane totusi identificarea cu vapori de iod, cand se
formeaza spoturi de culoare bruna, prin aceasta metoda identificandu-se si
eventualele impuritati. Compusii incolori pot fi detectati prin vizualizarea
fluorescentei verde caracteristica la absorbtie in ultraviolet.

Eluarea carotenoidelor din cromatoplaci

Eluarea se face in functie de stratul adsorbant si de polaritatea
carotenoidelor. La cromatografiere pe silicagel G eluarea se face cu eter

10
etilic sau eter etilic +5-10% etanol (carotenoide polare), iar la
cromatografiere pe MgO eluarea se face cu acetona (hidrocarburi
carotenoidice si xantofile). Eluarea se face dupa scoaterea zonei colorate de
pe suport, urmat de filtrare.

Cromatografia pe coloana
Cea mai importanta metoda de separare a carotenoidelor,
cromatografia pe coloana, a fost inlocuita recent cu cromatografia in strat
subtire prin caracteristicile sale de adsorbtie. Aceasta metoda este utilizata
prin imbunatatirea ei odata cu descoperirea cromatografiei in faza lichida de
inalta performanta, metoda care prezinta avantajele utilizarii cantitatilor mici
de substanta si vitezei de separare mari, dar limitata la o anumita scara,
neputand fi utilizat in scopuri preparative [10].
In functie de natura carotenoidului se vor alege adsorbantul si
solventul de developare adecvat.
Dintre adsorbantii utilizati in cromatografia pe coloana pentru
separarea carotenoidelor, pot fi amintiti celuloza, Ca(OH)2 (utilizat mai
ales la separarea hidrocarburilor carotenoidice), zaharoza, amidon,
silicagel, Al2O3 (folosit la separarea monohidroxicarotenoidelor),
CaCO3 si MgO (acestia fiind utilaizai la separarea carotenoidelor cu
polaritate intermediara, cum este cazul xantofilelor). Pe aceeasi coloana se
pot utiliza si adsorbanti diferiti asezati in functie de puterea de adsorbtie, cel
mai adsorbant fiind asezat in partea superioara a coloanei.[11]
Solventii utilizati in cromatografierea pe coloana a carotenoidelor sunt
eluanti slabi. De obicei se lucreaza cu amestec de solventi, cum ar fi
acetona-eter etilic, etanol-eter etilic, acetat de etil-benzen etc. Coloana de
adsorbtie trebuie incarcata cu adsorbant in proportie de , o parte
ramanand pentru solvent si extract. Adsorbantul trebuie sa fie foarte bine
compactat in coloana, din acest motiv umplerea coloanei realizandu-se cu
portiuni mici de adsorbant ce trebuie apoi tasat. Extractul carotenoidic
trebuie sa fie foarte concentrat pentru a se putea adauga in coloana o singura
data. Dupa ce amestecul de pigmenti a fost introdus in coloana, se incepe
developarea cu solventi diferiti, incepand cu cel mai nepolar.[12]
In cromatografia pe coloana se disting trei procedee de baza pentru
separarea carotenoidelor, si anume :
a) cromatografia in zone;
b) cromatografia elutiei in trepte
c)cromatografia elutiei in gradient.

11
 Cromatografia in zone
Amestecul de carotenoide care se afla intr-un solvent nepolar se aplica
pe la partea de sus a coloanei. Pentru separarea zonelor pe coloana este
utilizat un solvent adecvat pentru developare. Zonele sunt scoase din
coloana, fiecare zona fiind apoi eluata individual cu un solvent polar.

Cromatografia elutiei in trepte

In aceasta metoda se aplica principiul general al cromatografiei pe
coloana, si anume introducerea amestecului carotenoidic in partea superioara
a coloanei, apoi aplicarea solventilor, in functie de polaritate. Pigmentii sunt
eluati in ordinea cresterii afinitatii lor de adsorbtie si colectati. Fiecare zona
eluata este apoi evaporata la sec, redizolvata intr-un volum mic de solvent,
in vederea spectrofotometrarii.

Concluzii
In perioada actuala, cand pe plan national si international se pune un
accent deosebit pe valorificarea superioara a plantelor de cultura si a
celor din flora spontana, a surselor naturale in general, in functie de
compozitia lor chimica, cunoasterea substantelor biologic active se impune
ca o cerinta de prima marime. Numai prin cunoasterea compozitiei
chimice a plantelor, a mecanismelor biochimice ce stau la baza fenomenelor
biologice se vor putea obtine hibrizi noi de plante, cu continut ridicat in
substante biologic active, care maresc valoarea biologica a plantelor in care
se gasesc.
Pentru stabilirea formulei moleculare, a structurii moleculare si a
proprietatilor fizico-chimice a unui compus biologic activ, este necesara
mai intai izolarea lui din amestecul de compusi naturali.
Metodele de extractie a compusilor biologic activi se aleg in functie
de proprietatile compusilor supusi extractiei. Extractia carotenoidelor din
produsul vegetal se realizeaza cu solventi organici nepolari (eter etilic,
cloroform), prin macerare, agitare mecanica sau prin refluxare pe baia de
apa in fierbere, impunandu-se un grad de maruntire avansat, datorita
faptului ca solventul nepolar nu patrunde prin membrana celulara
pentru a dizolva carotenoidele.
Metodele de separare se aleg de asemenea in functie de proprietatile
fizice si chimice ale substantelor ce urmeaza a fi separate. Dintre
metodele utilizate frecvent la separarea carotenoidelor, o importanta
deosebita o prezinta metodele cromatografice, atat pe coloana cat si in strat
subtire, precum si separarile prin repartitia lichid-lichid si prin metoda
distributiei contracurent.

12
 BIBLIOGRAFIE

[1] V.Tamas, G.Neamtu-Pigmenti carotenoidici si metaboliti, vol 1, Ed.

Ceres, Bucuresti (1986)

[2] I.Ciulei, V.Istudor, M.Palade-Analiza farmacognostica si fitochimica a

produselor vegetale, Ed. Didactica si Pedagogica, Bucuresti (1997)

[3] B.Amotz, A.Katz, M.Avron- J.Phycol., 18:529-37 (1982)

[4] I.Pogany, M.Banciu-Tehnica experimentala in chimia organica,

Ed.Stiint.Encicl.Bucuresti (1977)

[5] M.Iovu - Chimie organica, Ed Didactica si Pedagogica, Bucuresti (1982)

[6] E. Lederer, M.Lederer-Chromatography. A Review of Priciples and

Applications, Elsevier, Amsterdam (1979)

[7] I.A.Curl, G.F.Bailey - J.Agr.Food Chem., 9, 403 (1977)

[8] E.Stahl-Thin-Laye Chromatography, Springer-Verlag, N.Y. (1979)

[9]J.Avigan, D.Steinberg - J. Lipid Res., 4, 100 (1963)

[10] AB Barua, JA Olson- J.Chromat.Biomed.Sci.Appl., 707:1-2, 69-79

(1998)

[11]J.Dietz Bryant, J.D.McCord, L.Knight Unlu, J.W.Erdman- J.Agric.Food

Chem.,vol.40, No.4, 545-549 (1992)

[12] P.Hugueney, S.Romer, M.Kuntz, B.Camara- J.Biochem., 209, 399-407

(1992) Butterworth, Londra (1964)

13