Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
n laboratorul de microbiologie se efectueaz diagnosticul de laborator n cazul multor infecii iar paii
care alctuiesc acest algoritm se efectueaz n hote microbiologice (cabinete de siguran biologic,
incinte, boxe, nie), clasificate dup cum urmeaz:
- Hota microbiologic de clas I (Figura nr. 2); este o incint aseptic cu flux de aer vertical care foloseste
un filtru pentru a curta aerosolii produi dinspre persoana care lucreaz i care se afl n laborator
ctre mediul exterior asigurnd un mediu de lucru steril. n plus, fluxul de aer creat previne
ptrunderea n spaiul de lucru a impurittilor din mediul inconjurtor.
- Hota microbiologic de clas II, (Figura nr. 6), folosete dou filtre. Unul dintre filtre asigur un curent
de aer steril n spaiul de lucru i cel de al doilea filtru purific aerul evacuat din hot. Aceast hot
asigur protecia total mpotriva particulelor strine si a contaminrii biologice.
- Hota microbiologic de clas III, (Figura nr. 7), ofer protecie maxim personalului din laborator i
mediului deoarece toate materialele periculoase sunt coninute ntr-o incint nchis total i
ventilat. nzona de lucru sunt prevzute dou mnui prin care utilizatorul poate manipula produsele
patologice i aparatura de laborator n siguran realiznd o izolare total fa de agenii patogeni i
de materiale toxice infecioase utilizate.
1. 5. Direcii de cercetare
Chiar dac nu toate noiunile prezentate n manualele de specialitate trebuie nvate ca atare, n
dezvoltarea pe parcursul activitilor universitare considerm c este necesar ca cititorii s citeasc mai
mult, pentru o ct mai bun informare. Ca atare, recomandm cteva link-uri corespunztoare unor
articole care pot fi studiate folosindu-se resursele World Wide Web.
1. 1.http://www.microbiologyonline.org.uk/teachers/safety-information/safety-guidelines
2. http://d.umn.edu/~rhicks/genmicro/Microbiology20Lab20Safety.pdf
3. http://www.mbio.ncsu.edu/mb452/safety/safety.html
4. http://dmcampus.webs.com/documents/lab20equipment20study.pdf
5. http://www.homeworkassignmenthelp.com/MicrobiologyOnline.aspx
6. http://microeguide.com/equipment/index.asp
1. 6. Povestire adevrat
Laboratoarele de microbiologie pot fi considerate i locuri periculoase. Cele mai multe dintre ele sunt
aprovizionate cu substane de tot felul, de la acizi sau alte chimicale cu poteniale efecte negative
asupra celuleui vii, la neurotoxine. n fiecare laborator de microbiologie exist becuri Bunsen ce
utilizeaz gaz natural i aparate care sterilizeaz la temperaturi nalte i presiune (autoclave).
Sunt multe povestiri privind aspecte n laborator. Un astfel de exemplu este cel al laborantei care nu a
calibrat corect centrifuga atunci cnd a centrifugat snge infectat HIV i tuburile centrifugate s-au
spart, trebuind s o curee (dar dac se mai i tia cu cioburile !?). Sau, un alt exemplu, cel al studentei
care nu a respectat normele de protecie i nu i-a legat prul i s-a ars la arztorul Bunsen. i s nu-l
uitm pe doctorul neatent ce a facut impetigo pentru c nu a manipulat corect o cultur
de Streptococcus pyogenes. Din fericire, toate acestea au fost accidente minore.
Iat ns i unul dintre cele mai grave accidente de laborator, din istorie.
n data de 2 aprilie 1979 , un focar de antrax a izbucnit lng oraul sovietic Sverdlovsk; a condus la
decesul a cel puin 64 de persoane. La momentul respectiv s-a dat vina pe un transport de carne
contaminat. Adevrul a fost dezvluit 13 ani mai trziu, cnd preedintele n funcie a recunoscut
cepidemia a avut ca surs un laborator de microbiologie din apropierea oraului. La un interviu dat
presei, fostul ef adjunct al departamentului Biopreparate care a mrturisit c sursa real a
contaminrii populaiei a fost laboratorul de microbiologie. Se pare c n cadrul unor manevre, nu au
fost respectate normele de protecie i nu a fost schimbat la timp un filtru de la sistemul de ventilaie.
Dei greeala a fost observat rapid, o mic cantitate despori de antrax a fost elibera i a infectat
populaia. Medicul a spus de asemenea c "n cazul n care vntul ar fi btut n direcie opus n acea zi
- spre oraul Sverdlovsk - rata de deces ar fi putut fi cu mult mai mare.
1. 7. De reinut
1. 8. Verificai-v cunotinele
soluiile fenolice se prepar proaspt (n fiecare zi de lucru); efectul nu este diminuat n prezena
substanelor organice;
au efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ, fungilor, unor virusuri (ex. HIV inactivat
de soluia 0,5%).
2. 4. 3. Glutaraldehida
cel mai frecvent este utilizat concentraia de 2% la un pH alcalin (efect asupra bacteriilor n form
vegetativ, endosporilor, fungilor, virusurilor);
efectul nu este diminuat n prezena substanelor organice;
se poate folosi i la dezinfectarea suprafeelor metalice;
nu poate fi folosit pentru suprafee (este nevoie de un timp mare de expunere pentru a fi
eficient); ideal pentru dezinfectarea echipamentelor contaminate, imersate n containere meninute
nchise (ex. endoscoape etc).
2. 4. 4. Iodoforii
sunt substane care elibereaz iodul n soluii apoase;
inhib sinteza proteic;
au efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ, unor spori bacterieni, fungilor, unor
virusuri (ex. virusuri cu nveli lipidic);
sunt inactivai de substane organice (ex. proteice), mase plastice, detergeni;
2. 8. Verificai-v cunotinele
1. Sterilizarea distruge:
A. Agenii patogeni
B. Agenii nepatogeni
C. Formele vegetative
D. Sporii
E. Endosporii
2. Dezinfecia:
A. Reprezint distrugerea formelor vegetative bacteriene
B. Reprezint distrugerea tuturor sporilor
C. Este eficient independent de cantitate
D. Se realizeaz cu ajutorul substanelor dezinfectante
E. Este eficient independent de timp
3. Prin autoclavare se sterilizeaz:
A. Articole de cauciuc
B. Medii de cultur
C. Diferite substane n soluie
D. Pipete i lame
E. Materiale contaminate din laborator
4. Iodoforii:
A. Sunt substane care elibereaz iodul n soluii apoase
B. Nu inhib sinteza proteic
C. Au efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ
D. Au efect asupra unor spori bacterieni
E. Nu pot fi utilizai pentru dezinfecia suprafeelor
5. Urmtoarele afirmaii sunt corecte:
A. Autoclavarea se realizeaz la otemperatur de 121C timp de 15 minute
B. Tindalizarea se realizeaz la 100C, 30 minute, 3 zile consecutive
C. Septic nseamn neinfectat
D. Aseptic nseamn infectat cu ageni nepatogeni
E. Agentul bacteriostatic este un agent care distruge bacteriile
2. 9. Myth busters (ALEGEI ntre adevrat i fals)
1. Argintul are propriei antimicrobiene. O moned de argint pus n mediu de cultur inoculat va
inhiba creterea bacterian.
2. Clorura de mercur este bactericid dar este inactivat de materia organic.
3. Afumarea este o metod de sterilizare foarte eficient.
4. Fierberea timp de 10 minute distruge sporii.
5. Radiaiile ultraviolete pot produce leziuni la nivel ocular.
3. Schema general a diagnosticului de laborator
microbiologic. (Gabriela-Loredana Popa, Loredana-
Sabina Manolescu)
3. 1. Cuvinte cheie
Recoltare i Transport
Produse patologice
Antibiogram
Diagnostic direct
Diagnostic indirect
3. 2. Introducere
Diagnosticul de laborator n microbiologie este un diagnostic complex i este diferit funcie de agentul
patogen ce trebuie identificat. Astfel diagnosticul de laborator n microbiologie poate
fi direct (urmrete identificarea agentului patogen direct din produsul patologic), bacteriologic,
micologic, parazitologic, virusologic; poate fi indirect (urmrete evidenierea rspunsului imun la
aciunea agentului patogen), sau poate fi o combinaie ntre cele dou (direct i indirect).
Principalele etape ale diagnosticului microbiologic respect un algoritm general, logic, aplicat pentru
fiecare microorganism n parte. nainte de a ncepe aceste etape este necesar o suspiciune de
diagnostic bazat pe examenul clinic obiectiv i anamnez. Coroborarea acestor informaii obiective i
subiective primite de la pacient cu informaii concrete provenite din cunoaterea patologiei infeciilor
bacteriene pot direciona tipul de diagnostic de laborator ce trebuie efectuat.
3. 3. Diagnosticul de laborator bacteriologic / micologic
Acest tip de diagnostic cuprinde 5 etape, exist ns i excepii (de exemplu n cazul diagnosticului
bacteriologic al infeciilor cu Treponema pallidum se realizeaz numai primele dou etape). Iat care
sunt cele 5 etape.
3. 3. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic (p.p.) urmeaz cteva reguli pe care este
foarte bine s le reinei n aceast succesiune:
Se recolteaz p.p. n care avem cele mai mari anse s decelm agentul etiologic (ex. urin ntr-o
infecie urinar, LCR n meningit etc);
Recoltarea se realizeaz rapid i ct mai aproape de debutul simptomatologiei, nainte de a administra
antibiotice, prin manevre aseptice bine determinate, corecte (vezi capitolul 4);
Dup recoltare se va eticheta corespunztor recipientul care conine p.p.;
Transportul p.p. se realizeaz ct mai rapid posibil, uneori este indicat s se foloseasc i mediu de
transport (dac se depete un anumit timp); temperatura de transport se stabilite n funcie de tipul
produsului patologic (vezi capitolul 4) i este n cele mai multe cazuri sczut (container izoterm 0-
4C); poate fi i o temperatur crescut (ex. 37C);
La recoltarea p.p. se va completa un formular specific care s conin urmtoarele informaii: numele,
prenumele, vrsta pacientului, data i locul recoltrii (+ ora recoltrii), diagnosticul prezumtiv, natura
p.p., analiza solicitat, data debutului bolii, ce medicaie antimicrobian a fost administrat
respectivului pacient, cine i cum a fcut recoltarea, cum a fost asigurat transportul p.p.
Nerespectarea tuturor acestor reguli poate justifica respingerea p.p.
3. 3. 2. Examinarea macroscopic i microscopic a produsului patologicrmne o etap foarte
important, chiar i dup apariia tehnicilor moderne.
3. 3. 2. 1. Examinarea macroscopic a p.p. poate orienta etapele ce urmeaz dar exist i situaii n
care nu aduce informaii importante.
3. 3. 2. 2. Examinarea microscopic a p.p. reprezint uneori o etap orientativ, util dar exist
situaii n care reprezint o etap esenial (ex. n gonoree sau n meningita cu meningococ).
Recomandm realizarea a minim 2 frotiuri din p.p. Un frotiu va fi colorat cu albastru de metilen (AM) i
al doilea prin metoda Gram. n cazul n care p.p. se recolteaz mai dificil se recomand realizarea a 3
frotiuri. n suspiciunea de tuberculoz (TB) se realizeaz minim 3 frotiuri, colorate AM, Gram i Ziehl-
Neelsen. Iniial frotiul se examineaz cu obiectivul 40x pentru o analiz mai general i pentru
stabilirea cmpului microscopic sau al zonei de interes, apoi cu obiectivul de imersie. Se vor evidenia
celulele din esutul respectiv (normale sau patologice), celulele inflamatorii (ex. PMN) i prezena
microorganismelor (interpretarea poate fi realizat n funcie de experien). (Figurile nr. 1-3)
Exist i situaii n care din p.p. se realizeaz preparate native (ntre lam i lamel) n loc de frotiuri
fixate i colorate, de exemplu cnd p.p. este reprezentat de snge, urin sau materii fecale. n cazul n
care p.p. este reprezentat de materii fecale, se realizeaz coprocitograma (se caut leucocite i alte
structuri sugestive). n cazul n care p.p. este reprezentat de urin, se va realiza sedimentul urinar (dup
centrifugare), i se va examina ntre lam i lamel pentru evaluarea prezenei i numrului de
PMN/cmp, prezenei unor celule normale sau patologice, prezenei altor structuri (ex. cristale de
oxalat, citrat, cilindrii leucocitari etc. (Figurile nr. 4-5)
n infeciile micotice se realizeaz de asemenea preparate proaspete (ex. preparatul n soluie de KOH-
glicerol 10-20%, KOH poate dizolva keratina care maschez prezena fungilor), precum i frotiurile
colorate. (Figurile nr. 6-7)
3. 3. 3. Cultivarea pe medii de cultur a p.p. se face n funcie de situaie (agent etiologic presupus)
respectnd condiiile de cretere ale bacteriei respective (ex. aerobioz sau anaerobioz, o anumit
temperatur, un anumit mediu de cultur).
Cultivarea se realizeaz prin punerea (nsmnarea) p.p. n care se presupune existena bacteriei, pe
un mediu de cultur adecvat, ntr-un incubator, la o temperatur de 35-37C. Pentru fungi trebuie
utilizate mediile potrivite creterii fungilor i o temperatur mai mic dect cea utilizat n cazul
bacteriilor (28C). Scopul cultivrii este obinerea unor colonii izolate (prin nsmnare n
poligon,(Figura nr. 8) n care s creasc doar agentul etiologic incriminat n afeciunea studiat i
respectiv obinerea unei culturi pure, pentru identificare.
3. 3. 4. Identificarea agentului etiologic se realizeaz numai pornind de la colonii izolate , n baza
caracterelor specifice fiecrei bacterii, dup cum urmeaz.
3. 3. 4. 1. Caractere morfologice
Din colonia izolat se va realiza un frotiu; acesta va fi colorat Gram sau Ziehl-Neelsen (dup caz);
examenul microscopic va evidenia forma, dimensiunile i tinctorialitatea (culoarea) bacteriilor din
colonie. De obicei bacteriile studiate la microscop sunt similare i au caracteristici comune pe frotiul
examinat dar exist situaii n care pe frotiu se pot observa aspecte morfologice diferite, de la aspecte
cocobacilare pn la forme filamentoase (ex. bacterii cu polimorfism, cum ar fi Proteus spp.). n cazul
levurilor, aspectul este cocobacilar, Gram-pozitiv, de dimensiuni mai mari. (Figura nr. 9-11)
3. 3. 4. 2. Caractere de cultur
Sunt caracterele n urma crora se poate realiza identificarea preeliminar. Se vor examina coloniile
izolate aprute pe mediile de cultur i se va caracteriza aspectul morfologic (forma, dimensiunea,
marginile, culoarea coloniei). Coloniile pot fi de tip S pentru levuri i majoritatea bacteriilor studiate, de
tip R (ex. Mycobacterium tuberculosis i Bacillus anthracis) sau de tip M (la bacterii capsulate,
ex. Klebsiella pneumoniae) i respectiv un aspect pufos n cazul mucegaiurilor. Pentru mediile lichide se
va examina tipul de cretere, modul n care tulbur mediul sau se sedimenteaz. (Figurile nr. 12-16)
3. 3. 4. 3. Caractere biochimice (sau metabolice)
Aceste caractere sunt foarte utile n cazul diferenierii enterobacteriilor (introducerea n practic a
mediilor multi-test permite evaluarea mai multor caractere simultan, ex. mediile TSI, MIU, citrat, etc)
i pot fi foarte variate de la o specie microbian la alta. (Figura nr. 13) De asemenea se pot evidenia
producerea de pigment endogen sau exogen sau producerea de hemolizine pe agar snge i tipul de
hemoliz. (Figurile nr. 14-15)
n cazul fungilor sunt utilizate auxanograma sau zimograma.
3. 3. 4. 4. Caractere antigenice
Caracterele antigenice pot fi evideniate datorit structurii antigenice a bacteriilor + capacitii Ag de a
cupla anticorpi (Ac) specifici pereche (reaciile Ag-Ac) (vezi cap. 9). Se utilizeaz Ac cunoscui pentru a
identifica Ag necunoscute. Reaciile Ag-Ac folosesc principii simple n care una din componente e
cunoscut i cealalt necunoscut. Tehnicile utilizate pot fi aglutinarea direct pe lam, aglutinarea
indirect, coaglutinarea, etc. Sunt tehnici comerciale accesibile i eficiente, sau tehnici in house. De
exemplu, prin reacii de aglutinare direct se pot identifica Ag din genul Shigella, Salmonella, iar prin
reacii de aglutinare indirect se pot detecta n p.p. streptococii de grup A sau B etc. Aceste teste se
folosesc i pentru detectarea unor Ag fungice (ex. Cryptococcus neoformans, Candida
albicans, Aspergillus spp).
3. 3. 4. 5. Caractere de patogenitate (ex. testul coagulazei pentru S. aureus)
Caracterele de patogenitate evideniaz capacitatea bacteriilor de a declana n organismul gazd
fenomene morbide. Patogenitatea este un atribut de specie i este determinat genetic. De exemplu
bacteriile pot elabora anumite substane cum ar fi coagulaza (o enzim produs de Staphylococcus
aureus) care produc fenomene patogene (in acest caz coagulaza produce coagularea plasmei). (Figura
nr. 16)
Prin inocularea unei bacterii patogene la animalul de laborator se poate declana infecia
experimental evideniind caracterul de patogenitate al respectivei bacterii.
3. 3. 4. 6. Lizotipie (sensibilitatea la bacteriofagi specifici)
Bacteriofagii (fagii) sunt virusuri care paraziteaz bacteriile. Au fost descoperii n 1915. Lizotipia
reprezint stabilirea sensibilitii la un anumit bacteriofag i este una dintre cele mai fine metode de
identificare (inclusiv din raiuni epidemiologice, ex. pentru determinarea originii unei epidemii).
3. 3. 5. Antibiograma (respectiv antifungigrama) reprezint testarea sensibilitii la antibiotice i
chimioterapice anti-bacteriene / respectiv anti-fungice, n vederea alegerii tratamentului etiologic
corect. Se realizeaz cel mai frecvent prin metode difuzimetrice. n anumite situaii (ex. n infecii grave,
la pacieni care au o capacitate de aprare redus, n infecii cu bacterii care au potenial ridicat de
rezisten la antibiotice i chimioterapice) se vor efectua i alte determinri, de ex. determinarea
concentraiei minime inhibitorii (CMI) i concentraiei minime bactericide (CMB).
n infecii cu potenial fatal este necesar determinarea eficienei antibioticului utilizat, respectiv
stabilirea nivelul de eficien inhibitorie (NEI) i nivelului de eficien bactericid (NEB).
3. 4. Diagnosticul de laborator imunologic (serologic i / sau imunobiologic)
3. 4. 1. Diagnosticul serologic urmrete determinarea prezenei Ac necunoscui, din serul
pacientului, utiliznd Ag cunoscute. Se bazeaz pe specificitatea reaciilor Ag-Ac. n vederea
identificrii unei infecii acute, se determin anticorpii specifici de tip IgM. n vederea identificrii unei
foste infecii sau unei infecii cronice se determin (de regul) Ac specifici de tip IgG. n unele situaii
este necesar doar un test calitativ, ce va determina prezena sau absena tipului de anticorpi dar n alte
situaii este necesar testarea cantitativ pentru a determina titrul (concentraia) de Ac din serul
pacientului. Tot cu ajutorul acestor teste cantitative vom analiza evoluia titrului de anticorpi n
dinamic. n acest sens se vor realiza minim dou determinri diferite la un interval de 7-10 zile; astfel
putem s difereniem o afeciune acut (titrul Ac este mai crescut la a doua determinare, n mod clasic
de 4 ori), de o afeciune n covalescen (titrul Ac la a doua determinare va fi mai sczut) sau de o
afeciune cronic (titrul Ac va fi asemntor sau foarte apropiat la cele dou determinri succesive).
(Figura nr. 17)
3. 4. 2. Diagnosticul imunobiologic evideniaz rspunsul imun celular, de exemplu reactivitatea
pacientului fa de un anumit Ag. Intradermoreacia la tuberculin (IDR cu PPD/derivat proteic
purificat), reprezint un exemplu n acest sens. (vezi cap. 11)
3. 5. Direcii de cercetare
Chiar dac nu toate noiunile prezentate n manualele de specialitate trebuie nvate ca atare, n
dezvoltarea pe parcursul activitilor universitare considerm c este necesar ca cititorii s citeasc mai
mult, pentru o ct mai bun informare. Ca atare, recomandm cteva link-uri corespunztoare unor
articole care pot fi studiate folosindu-se resursele World Wide Web.
1. http://www.idsociety.org/uploadedFiles/IDSA/Guidelines-
Patient_Care/PDF_Library/Laboratory%20Diagnosis%20of%20Infectious%20Diseases%20Guideline.pdf
2. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK8014/
3. http://www.chop.edu/service/laboratories/explore-chop-labs/labs-microbiology/home.html
4. http://www.cdc.gov/meningitis/lab-manual/chpt05-collect-transport-specimens.pdf
5. https://www.boundless.com/microbiology/immunology-applications/preparation-for-diagnosing-
infections/specimen-collection/
6. http://www.atousante.com/risques-professionnels/risques-infectieux/tuberculose/intradermo-reaction-
idr/
3. 6. Povestire adevrat
ncepnd cu 30 decembrie 2012, n 19 state din America a fost raportat un total de 35 pacieni infectai
cu o tulpin de Escherichia coli productoare de toxin Shiga (STEC O:121 ). 82 % din pacieni aveau n
jur de 21 de ani sau mai puin i 31 % au fost spitalizai. Doi din cei 35 pacieni au dezvoltat
un sindrom hemolitic uremic (SHU) i insuficien renal (IR) dar nu au fost raportate
decese. Sursa acestei epidemii a fost un lot de produse alimentare congelate. Firma productoare a
retras de pe pia toate produsele care puteau fi contaminate, adic produse alimentare congelate
produse n perioada 1 iulie 2011 si 29 martie 2013, din cauza unei posibile contaminri cu E.
coli O:121.Produsele retrase aveau date de expirare cuprinse ntre 1 ianuarie 2013 i 29 septembrie
2014. Datorit acestui fapt, dei epidemia a fost stopat, exist oricnd posibilitatea unei recurene,
deoarece unele produse ar putea fi nc n congelatoarele populaiei. S-a recomandat consumatorilor
s verifice congelatoarele i nu mnnce produsele din loturile retrase. Recomandarea vizeaz n
special copii sub 5 ani, adulii peste 60 de ani i persoanele cu imunodeficien, deoarece aceste
persoane sunt mult mai susceptibile s dezvolte o complicaie. E. coli nc reprezint o cauz
important de mbolnvire n Statele Unite ale Americii.
Iniial pacienii infectai cu aceast tulpin au prezentat crampe abdominale i diaree hemoragic la
aproximativ 3 sau 4 zile dup ingestia produselor contaminate. Perioada de stare a fost n jur de o
sptmm pentru cazurile uoare sau mai mult pentru cele complicate cu IR. Persoanele cu risc
crescut pentru SHU i IR sunt copii sub 5 ani, adulii peste 60 de ani i persoanele cu imunodeficien.
Simptomele de SHU includ febr, dureri abdominale, paloare, oboseal i iritabilitate, vnti mici,
sngerri inexplicabile din nas si gur i disurie. Toate persoanele care prezint aceste simptome
trebuie s solicite imediat asisten medical de urgen.
Diagnosticul de laborator microbiologic a pornit de la recoltarea produsului patologic cel mai
potrivit i cu ansele cele mai mari de a conine bacteria incriminat n simptomatologia descris i
anume un eantion de materii fecale, ns nu toate laboratoarele pot efectua acest tip de diagnostic,
mai ales dac se urmrete identificarea E. coli O:121. Pentru a dovedi c pacienii au fost contaminai
cu STEC O:121 din produse alimentare congelate, au fost testate i produsele alimentare consumate de
cei ce prezentau simptomatologia aferent. De asemenea pacienii au fost intervievai de ctre
persoane abilitate pentru a obine informaii cu privire la alimentele pe care le-ar fi mncat i alte
expuneri n sptmna de dinainte de boal. 24 pacieni au raportat consumul produselor alimentare
congelate iar tulpina epidemic STEC O:121 a fost identificat n dou produse congelate colectate din
congelatoarele a doi pacieni din New York i Texas. Identificarea tulpinii epidemice STEC O:121 a fost
posibil numai datorit coroborrii analizelor efectuate de mai multe organisme epidemiologice i
laboratoare: CDC (Centre for Disease Control and prevention), oficiali din domeniul santii publice
din mai multe state americane, Departamentul Agriculturii pentru Sigurana Alimentar din SUA i de
Serviciul de Control al alimentelor i medicamentelor (Food and Drug Administration / FDA).
Investigatorii au folosit teste de biologie molecular. Au fost folosite de asemenea date provenite de la
PulseNet, o reea internaional (care efectueaz supravegherea moleculara a infeciilor alimentare).
3. 7. De reinut
Colaborarea ntre departamente este esenial pentru succesul dignosticului de laborator microbiologic.
Corelarea noiunilor nvate n capitolele 1-8 i respectiv 9-11 au utilitate nu doar pe parcursul pregtirii
academice de microbiologie, dar i n viaa de zi cu zi.
3. 8. Verificai-v cunotinele
1. Care din urmtoarele sunt etape ale diagnosticului de laborator microbiologic:
E. Antibiograma
2. Din urmtoarele p.p. se realizeaz preparate native i nu frotiuri colorate:
A. Snge
B. Urin
C. Materii fecale
D. Puroi
E. Sput
3. Caracterele de patogenitate evideniaz:
A. Capacitatea bacteriilor de a declana fenomene morbide
B. Capacitatea bacteriilor de a declana incapacitatea funcional
C. Un atribut de specie
D. Determism genetic
E. Virulena.
4. Antibiograma
A. Reprezint testarea sensibilitii la antibiotice
B. Se realizeaz prin metode difuzimetrice
C. Evideniaz CMB
D. Evideniaz CMI
E. Evideniaz NEI
5. Diagnosticul imunobiologic
A. Evideniaz rspunsul imun celular
B. Evideniaz reactivitatea pacientului fa de un anumit Ag
C. Reprezint intradermoreacia la tuberculin
D. Urmrete determinarea prezenei anticorpilor (Ac) necunoscui
E. Se bazeaz pe specificitatea reaciilor Ag-Ac
4. 5. Povestire adevrat
Un brbat n vrst de 69 de ani se prezint la medic (n serviciul ambulatory). El prezint de 10
zile stare general alterat, debut brusc cu febr, durere la nivel faringian i artralgii la nivelul
genunchiului drept.Antecedentele personale arat un istoric de lobectomie pulmonar dreapt (s-a
extirpat lobul superiordatorit unui carcinom pulmonarcu celule scuamoase; cu un an mai devreme).
Pacientul declar c n urm cu doua sptmni a avut un contact sexual neprotejat i c a folosit
(automedicaie) de 5 zile Levofloxacindar starea general nu s-a ameliorat.
La examenul clinic pacientul a prezentat TA = 149/83 mmHg, AV = 98 de bti /
min.puls regulat, saturaia n oxigen 96% i temperatur de 37,9C.
Examenul clinic al genunchiului pune n eviden o articulaie mrit n volum cu semne de inflamaie
prezente.
3
Examenele de laborator: leucocitoz de (8.080/mm ), proteina C reactiv (1,07 mg/dL). Alte teste
biochimice de rutin i sumarul urinar au fost n limite normale.
S-a decis prelevarea de probe pentru hemocultur i culturi din lichidul articular. n 30 de minute de la
recoltarea lichidului s-a primit rezultatul de laborator preliminar care evidenia prezena unor coci
Gram negativi intra i extra leucocitari pe frotiu.
Culturile din lichidul articular precum i hemoculturile au ramas negative diagnosticul stabilindu-se
strict pe baza examenului microscopic pe frotiu.
Diagnosticul de internare al pacientului a fost: infecie gonococic diseminat. Tratamentul a fost
schimbat cu ceftriaxon 1g pe zi i.v.
Dup 3 zile de tratament simptomele pacientului inclusiv febra, faringitaiartralgiaau diminuat i a fost
externat, fr sechele, n ziua a 7-a.
La externare pacientul a fost informat de necesitatea testrii ulterioare pentru alte afeciuni
transmisibile pe cale sexual.
4. 6. De reinut
Probele recoltate dup administrarea de antibiotic pot fi negative n cultur dei la examenul
microscopic pe frotiu microorganismele se pot vizualiza. Datele prezentate n anamnez de pacient
mpreun cu aspectul morfologic i tinctorial al microorganismelor observate pot fi de folos n
stabilirea diagnosticului.
Mai mult de 60% dintre tulpinile de Neisseria gonorrhoeae sunt rezistente la quinolone.
4. 7. Verificai-v cunotinele
1. Pentru care din urmtoarele microorganisme este obligatorie recoltarea p.p. pe tampon cu alginat
de calciu?
A. Propionibacterium acnes
B. Haemophilus influenzae
C. Salmonella spp.
D. Bordetella pertussis
E. Shigella spp.
3. n cazul suspiciunii unei infecii cu Neisseria gonorrhoeae (p.p. de la nivel genital) mediul de
transport recomandat este:
A. Cary-Blair
B. Apa peptonat
C. Chapman
D. Stuart
E. nici un rspuns nu este corect.
Prezentm o situaie n care examinarea microscopic a p.p. pune diagnosticul i ajut la urmrirea eficacitii
tratamentului.
Tuberculoza (TB) este o boal infecioas ce are ca agent etiologic Mycobacterium tuberculosis (cauz major de
morbiditate i morbiditate la nivel mondial); se estimeaz c exist aproximativ 2 miliarde de persoane infectate i
aproximativ 1,7-2 milioane de decese n fiecare an. n 2010, se estima o inciden a de TB 8,8 milioane de cazuri la
nivel global (echivalentul a 128 de cazuri la 100.000 de locuitori), i o prevalen de 12 milioane de cazuri (cca.
o
178 /oooo).
Orientrile actuale de Organizaiei Mondiale a Sntii OMS) i Uniunii Internaionale mpotriva Tuberculozei i
Bolilor Pulmonare afirm c pasul esenial n investigarea pacienilor suspeci de a avea TB pulmonar ar trebui s
fie examinarea microscopic a sputei. Pentru orice pacient ar trebui s fie examinate cel puin 2 (preferabil 3)
probe de sput. Cu toate acestea, n epoca diagnosticului molecular, care este rolul examinrii microscopice
a frotiului de sput? Este important s se atribuie acestui test importana cuvenit, n special n contextul recentei
aprobri OMS a unui test automat de amplificare ADN, Xpert MTB/RIF.
Ipotetic, ar fi necesar un test accesibil, rapid i universal care s nu fie afectat de patologii asociate (inclusiv
infecia HIV/SIDA). Ideal, pentru a putea diagnostica eficient TB, testele ar trebui s fie disponibile i n centre
rurale (cu resurse limitate). Ar trebui s nu necesite nici electricitate, nici refrigerare, sau acces la ap curent. Ar
trebui s fie disponibile pe scar larg, uor de utilizat, cu o cerin de pregtire minim. Rezultatele trebuie s fie
disponibile ntr-o or, i ar trebui s aib o sensibilitate, specificitate i valori predictive pozitive i negative
ridicate. n prezent, un astfel de test diagnostic nu exist.
Pentru moment, cel mai apropiat test de testul ideal = examinarea microscopic a frotiului de sput. Pn la
apariia unui test mai eficient, disponibil la locul de diagnostic, diagnosticul microscopic al frotiului de sput
rmne unul din instrumentele cele mai importante de lupt mpotriva infeciilor cu M. tuberculosis.
5. 9. De reinut
Microscopul este una dintre cele mai importante unelte (tool) n diagnosticul bacteriologic direct, dar nu
putem stabili un diagnostic de certitudine doar pe baza examenului microscopic.
Variantele tehnice ale microscoapelor faciliteaz diagnosticul n cazul diferitelor tipuri de p.p. i de infecii
suspectate. Examinarea produselor ntre lam i lamel ct i a frotiurilor colorate, att din produs patologic ct i
din cultur pur ofer informaii necesare caracterizrii proceselor inflamatorii i a microorganismelor implicate.
Microscopul trebuie ngrijit periodic pentru a-l menine n perfect stare de funcionare.
5. 10. Verificai-v cunotinele
D. Obiectivul de 10x
D. Microorganismele Gram negative sunt roii, iar cele Gram pozitive sunt violet
E. Microorganismele Gram pozitive sunt roii, iar cele Gram negative sunt violet
A. Sursa de lumin emite att radiaii calorice (nocive) ct i radiaii cu und mare (ultraviolete)
8. 7. De reinut
Metodele de igien sunt importante n profilaxia infeciilor cu enterococi.
Programul de control al acestor infecii n spitale includ:
Instruirea personalului spitalului n ceea ce privete rezistena la vancomicin;
Depistarea precoce i raportarea prompt a rezistenei la vancomicin a enterococilor i a altor
microorganisme Gram-pozitive;
Implementarea imediat a msurilor adecvate de control a infeciei pentru a preveni transmiterea VRE
de la persoan-la-persoan.
8. 8. Verificai-v cunotinele
1. Tehnicile calitative de testare a sensibilitii in vitro includ:
A. Antibiograma difuzimetric comun
B. Antibiograma difuzimetric comparativ
C. Antibiograma difuzimetric standardizat
D. Metoda diluiilor n mediu lichid
E. Metoda diluiilor n agar
2. Tehnicile cantitative de testare a sensibilitii in vitro includ:
A. Metoda microdiluiilor n agar
B. Testul E
C. Metode i sisteme comerciale, automatizate de testare
D. Antibiograma difuzimetric comparativ
E. Antibiograma difuzimetric standardizat
3. Determinarea CMB:
A. Se bazeaz pe cunoaterea CMI.
B. Corespunde ultimei concentraii de antibiotic care a distrus microorganismele nsmnate
C. Reprezint cea mai mic concentraie de antibiotic, n micrograme/ml, cu aciune bacteriostatic
asupra microorganismului testat
D. Este o tehnic calitativ
E. Este o tehnica cantitativ
4. E test:
A. Reprezint o metod complex de testare a sensibilitii la antibiotice
B. Nu poate fi utilizat pentru bacteriile pretenioase sau anaerobe
C. Se aseamn metodei diluiei n agar
D. Permite determinarea valorii CMI
E. Are un cost mai ridicat
5. Elementele necesare standardizrii antibiogramei difuzimetrice standardizate sunt:
A. Mediul
B. Inoculul
C. Antibioticele
D. Utilizarea tulpinilor de referin
E. Interpretarea rezultatelor
8. 9. Myth busters (ALEGEI ntre adevrat i fals)
1. n cursul unei infecii care nu rspunde la tratament nu mai este necesar refacerea antibiogramei.
2. Utilizarea antibioticelor fr recomandare medical determin rezistena bacteriilor la antibiotice.
3. Antibiograma se poate realiza n anumite situaii i dac pacientul a luat o doz de antibiotic.
4. CMI nu are aceeai valoare pentru genuri, specii sau tulpini diferite. Adevrat/Fals
5. Stafilococul auriu meticilino-rezistent (MRSA) a fost identificat numai n infecii nosocomiale.
Reacii antigen-anticorp. Evaluarea RIC.
Reacia dintre antigen (Ag) i anticorp (Ac) necesit interaciunea epitopului (de pe Ag) cu paratopul
Ac. Factorii care condiioneaz interaciunea Ag-Ac sunt:
-complementaritatea structural (reacia este specific);
-complementaritatea electrochimic, consecin a complementaritii structurale (se adaug fore
intermoleculare, EX . legturile de hidrogen etc.); energie de legare mai mare = complexe Ag-Ac mai
stabile (Figura nr. 1).
Interaciunea dintre epitop i paratop este definit (i msurabil) de 2 parametri:
Afinitatea (msoar fora de legare dintre un epitop i un paratop); are ca substrat
complementaritatea structural i electrochimic menionate mai sus; o interaciune cu afinitate
nalt presupune structuri perfect complementare, n timp ce complementaritatea imperfect a
gruprilor reactante determin o afinitate sczut,
Aviditatea (suma de interaciuni Ag-Ac; rezult din multivalena Ag); cele mai multe Ag
posed mai mult dect un epitop; energia total de legare a epitopilor multipli ai unui Ag cu paratopii
specifici este mult superioar energiei individuale de interaciune dintre epitop i paratop; complexele
Ag-Ac formate de antigenele multivalente sunt stabile, disocierea lor fiind dificil, deoarece este
necesar ruperea tuturor legturilor existente.
Cu toate c didactic discutm despre specificitate ca i cum ar fi absolut, trebuie s cunoatem c
exist i reacii ncruciate (datorit faptului c anumite Ag posed anumii epitopi comuni; EX . Ag
care aparin unor specii diferite de enterobacterii).
Etape n cadrul reaciilor antigen-anticorp
Interaciunea primar (Figura nr. 2) reprezint legarea Ac de Ag potrivite; depinde de
cantitatea i afinitatea Ac; poate fi pus n eviden doarprin nefelometrie, deoarece complexele Ag-Ac
sunt de dimensiuni mici, solubile i se pot desface uor;
Interaciunile secundare (Figura nr. 3) apar dup 30 de minute (Ag poate avea mai muli
epitopi iar Ac are minim 2 paratopi; complexele primare se reunesc, formeaz complexe secundare,
respectiv o reea tridimensional, insolubil, care devine vizibil);
Interaciunile teriare (Figura nr. 4) sunt efectele biologice mediate in vivo de complexele
Ag-Ac rezultate fie n urma interaciunii primare, fie n urma interaciunii secundare (EX . fagocitarea
complexelor de ctre macrofage, etc).
Formarea complexelor Ag-Ac depinde de atingerea unei unui anumitraport de echivalen dintre
Ag-Ac. Aceasta reprezint punctul dintr-o reacie Ag-Ac realizat in vitro n care raportul dintre Ag i
Ac este practic egal cu 1, Ac i Ag libere n supernatant sunt minime, iar complexele formate au
dimensiunea cea mai mare (Figura nr. 5).
9. Reaciile de precipitare i reaciile de aglutinare.
(Gabriela-Loredana Popa, Alexandru-Andrei Muntean)
9. 1. Cuvinte cheie
antigen (Ag)
anticorp (Ac)
precipitare
aglutinare
raport de echivalen
imunodifuzie
9. 2. Introducere
Reaciile Ag-Ac sunt elemente eseniale att n diagnosticul bacteriologic direct ct i n diagnosticul
serologic a infeciilor (dar, bineneles i in vivo, n aprarea gazdei fa de infecii!). Astfel, putem
evidenia n mod direct reacia dintre Ag-Ac (reacii de precipitare, reacii de aglutinare) sau putem
folosi sisteme indicator (reacia de fixare a complementului, reacia de seroneutralizare)
(vezi capitolul 10). n acest capitol vom prezenta reaciile de precipitare i de aglutinare utilizate n
microbiologie, subliniind faptul c acestea formeaz o baz a diagnosticului serologic modern.
9. 3. Reaciile de precipitare utilizate n microbiologie
Reacia de precipitare poate avea loc n mediu lichid sau solid. Unirea Ag cu Ac specifici conduce la
formarea de complexe Ag-Ac care devin insolubile i stabile (vizibile, cu ochiul liber). Reacia de
precipitare este sensibil i specific pentru evidenierea prezenei Ag. Metodele clasice prezentate n
cadrul acestui capitol stau la baza testelor moderne folosite n practica curent.
NB: Pe parcursul capitolului, ne vom referi la Ag i Ac, dar cititorul este avizat c i imunoglobulinele
(de EX . anticorpii provenii de la o alt specie) pot juca rol antigenic.
9. 3. 1. Reacii de precipitare n mediu lichid
9. 3. 1. 1. Reacii de precipitare n amestec
Reacia Ag-Ac este cuantificabil. Permite, de EX . titrarea toxinei difterice (metoda
Ramon) punnd n contact (n amestec, n tuburi), cantiti egale din toxina difteric, cu cantiti
variabile de Ac anti-toxin, al cror titru este cunoscut. Cantitatea maxim de precipitat se gsete n
tubul unde existraportul de echivalen. Tubul care prezint cantitatea cea mai important de
precipitat se poate observa relativ uor (Figura nr. 6). Cunoscnd titrul Ac, se afl titrul toxinei (1 Lf =
1 limes floculans = cantitatea de toxin care se combin cu o unitate de antitoxic = 1 UA). Dac
spre EX . precipitarea maxim apare n tubul n care titrul anticorpilor este de 15 UA, titrul toxinei este
de 15 Lf.
9. 3. 1. 2. Reacii de precipitare n inel
Punem n contact Ag i Ac astfel nct s nu se amestece. Reacia apare la limita dintre Ag i Ac (inel de
precipitare).
n activitatea de la LP exemplificm prin reacia Ascoli utilizabil pentru identificarea prezenei Ag
crbunos (din Bacillus anthracis). Soluia de Ag se prepar din extract de organ (EX . splin) recoltat
de la un animal care a decedat cu suspiciunea de antrax (infecie generalizat cu Bacillus anthracis).
Reacia este una calitativ, prin care putem preciza doar prezena sau absena Ag. Utilizm 3 tuburi (1
pentru reacie i 2 tuburi martor). n primul tub martor pipetm 0,5 ml ser anticrbunos i 0,5 ml
soluie salin fiziologic iar n al doilea tub martor pipetm 0,5 ml ser normal de cal i 0,5 ml soluie de
Ag. n aceste dou tuburi, nu trebuie s apar precipitare, scopul acestor martori fiind verificarea
reactanilor. n tubul de reacie pipetm nti 0,5 ml din serul anticrbunos, urmnd ca soluia de
antigen (n cantitate de 0,5 ml) s fie pipetat foarte lent, pe peretele interior al tubului, n aa fel nct
cele 2 soluii s nu se amestece. n cazul reaciei pozitive (prezena Ag crbunos n soluia Ag), dup
circa 2-5 minute, la limita dintre cei 2 reactivi apare un inel de precipitare (Figura nr. 7).
9. 3. 2. Reacii de precipitare n mediu gelifiat
Utilizarea gelozei (o anumit concentraie de agar n soluie, n care cei doi reactivi pot s migreze)
permite vizualizarea reaciei Ag-Ac printr-un arc / linie de precipitare.
9. 3. 2. 1. Imunodifuzia radial simpl (IDRS Mancini)
IDRS se bazeaz pe difuzia Ag din proba de cercetat, ntr-un gel care conine o cantitate constant de
Ac. Difuzia n gel a Ag se face pornind de la godeul n care se pipeteaz soluia de cercetat, care poate
fi ser cu Ac (iar n gel sunt anti-Ac, IgG, IgM, IgA etc), sau un ser/soluie cu alt substan pe care
dorim s o cuantificm (fraciunea C3 a complementului, siderofilina, alfa-1 antitripsina, un antigen
microbian n LCR etc.). Complexele Ag-Ac vor precipita. Rezult un cerc de precipitare format din
puncte foarte apropiate (complexe Ag-Ac) cu diametrul direct proporional cu concentraia de Ag din
prob. Metoda permite determinricantitative. (Figura nr. 8)
Sunt necesare plcue n care se toarn gelul care include Ac anti structura pe care vrem s o
determinm. Plcile sunt cumprate gata turnate i prezint mici godeuri n care punem serurile de
cercetat i serul de referin (folosit ca un etalon, ntruct cunoatem concentraia componentei
studiate). Dilum serurile de cercetat (EX . pentru IgG, IgA i siderofilin), la fel i serul de referin.
n fiecare godeu introducem 5 ml din fiecare reactiv (referin i cercetat).
inem plcua pe mas 10 minute, apoi incubm la termostat (37C), 48 ore pentru IgA i IgM i 24 de
ore pentru celelalte componente testate. Citim cu ajutorul unei rigle speciale, pe care o vom utiliza la
LP. nti msurm diametrul cercului de precipitare din jurul godeului n care se afl serul de referin
(rezultatul trebuie s corespund indicaiilor productorului). Dac rezultatul este corespunztor, citim
direct diametrelor pentru serurile de cercetat (altfel, trebuie s facem corelarea cu rezultatul pentru
martor). nregistrm valorile diametrelor, comparm cu rezultatele din tabele preformate i nmulim
valoarea cu diluia probei. Am obinut rezultatul final. (Tabelul nr. 1)
9. 3. 2. 2. Imunodifuzia dubl radial (Ouchterlony)
n aceast variant tehnic, Ag i Ac difuzeaz unul spre cellalt. Dup ntlnire complexele Ag-Ac
precipit i rezult linii de precipitare vizibile. Prin folosirea acesteia, putem alege Ac dintr-un stoc
disponibil i nu este necesar includerea acestuia n agar.
Tehnica poate fi folosit ca o metod de determinare calitativ sau semi-cantitativ. Astfel, ne permite
s evideniem, de EX . prezena sau absena unei structuri proteice. Putem determina semi-cantitativ
alfa-fetoprotein, protein C reactiv, beta-2 microglobulin, produi de degragare ai fibrinogenului
etc. n micologie putem identifica exoantigene fungice (Histoplasma capsulatum, Coccidioides
immitis etc), etc.
Pe o lam de microscop se toarn un gel de agar 1% (pstrat n camer umed, la frigider). Dup
ntrirea gelului, perform 1-3 grupe de godeuri, 7 godeuri n fiecare grup (1 godeu central, 6 godeuri
periferice). De EX . pentru determinarea proteinei C reactiv (C reactive protein, CRP, reactant de faz
acut) la pacieni, utilizm un ser cu Ac anti-CRP, seruri de la pacieni i un ser de referin cu CRP. n
godeul central pipetm Ac anti-CRP, n godeurile 1 i 4 pipetm ser de referin cu CRP, iar n celelalte
godeuri pipetm serurile de cercetat. Incubm (37C, 24 de ore) n camer umed.
Verificm dac ntre godeul central i godeurile 1 i 4 (martori pozitivi) au aprut linii (arcuri) de
precipitare. Dac este aa, urmrim situaia pentru serurile de testat. Acolo unde apare linie de
precipitare, rezultatul este pozitiv (Figura nr. 9).
9. 3. 2. 3. Dubla difuzie (Elek)
Este o metod calitativ util pentru depistarea tulpinilor toxigene
deCorynebacterium diphteriae (apariia liniilor de precipitare demonstreaz elaborarea toxinei) (Figura
nr. 10).
Mediul este turnat n placa Petri, ateptm s se ntreasc i apoi decupm un an pe unul din
diametre. n acest an pipetm 0,5 ml ser antidifteric (cu Ac anti-toxin difteric, concentraia fiind
1.000 UI/ml). Ac anti-toxin difteric difuzeaz n mediu. Dup 2 ore nsmnm perpendicular pe
acest an i de fiecare parte a anului, 1 tulpin toxigen (martor pozitiv), 1 tulpin ne-toxigen
(martor negativ) i cteva tulpini de cercetat. Incubm timp de 48 de ore, la 37C, timp n care
tulpinile nsmnate se dezvolt. Din striurile cu tulpin toxigen, toxina difuzeaz n mediu i apare
reacia de precipitare a complexului Ag-Ac. Cnd examinm placa, urmrim apariia culturii i a
precipitatului (linii de precipitare n unghiurile dintre cultur i anul cu Ac anti-toxin) care trebuie s
apar cel puin la martorul pozitiv.
9. 3. 3. Reacii de precipitare n combinaie cu migrarea n cmp electric
9. 3. 3. 1. Electroforeza proteic n gel
Tehnica este folosit n laboratorul de imunochimie pentru decelarea unor proteine patologice.
Deplasarea proteinelor n gel (supus cmpului electric) se face difereniat (n funcie de greutatea
molecular i ncrctura electric a fiecrei proteine, n parte).
9. 3. 3. 2. Imunoelectroforeza
Electroforeza este asociat cu imunodifuzia dubl. Proteinele sunt nti separate prin electroforez apoi
are loc imunodifuzia dubl. Putem utiliza un ser monovalent sau polivalent, cu Ac anti-structura a crei
prezen dorim s o determinm. Reacia Ag-Ac devine vizibil sub forma unor arcuri de precipitare
(Figura nr. 11).
9. 3. 3. 3. Contraimunoelectroforeza (CIE)
Este o dubl difuzie. Deplasarea Ag i Ac este accelerat de cmpul electric. Turnm gel de agar pe o
lam de microscop, perform 1-3 grupe de perechi de godeuri, fa n fa (EX . Ag migreaz spre
anod). Astfel, n unul din cele 1-3 grupuri de godeuri pereche opuse catodului (polul negativ) pipetm
Ac cunoscui iar n godeurile opuse anodului (polul pozitiv) pipetm Ag cunoscute. Tehnica este mai
rapid i mai sensibil dect dubla difuzie, prin amplificarea datorat cmpului electric. Linia de
precipitare poate deveni vizibil dup 30-90 minute (Figura nr. 12). Se poate utiliza pentru identificarea
Ag K n LCR la pacieni cu meningit acut (H. influenzae, N. meningitidis, Streptococcus pneumoniae),
facilitnd un diagnostic rapid.
9. 4. Reaciile de aglutinare utilizate n microbiologie
Reacia de aglutinare sunt similare cu reaciile de precipitare, cu meniunea c Ag sunt de natur
corpuscular. Aglutinareaeste mai sensibil dect precipitarea.
Exist mai multe tipuri de aglutinare:
Aglutinarea direct reprezint aglutinarea Ag naturale (bacterii, celule) de ctre Ac specifici. Se poate
utiliza n diagnosticulbacteriologic (EX . pentru identificarea enterobacteriilor), n
diagnosticul serologic al febrei tifoide etc.;
Aglutinarea indirect este o reacie n care diferite particule (hematii formolizate, latex, cristale de
colesterol etc) sunt cuplatein vitro cu Ag sau Ac i sunt astfel pregtite s participe la reacia de
aglutinare prin combinare cu Ac sau Ag corespunztoare, din proba de cercetat (EX . determinarea
CRP);
Inhibarea aglutinrii (vezi i HAI de la LP virusologie) etc.
9. 4. 1 Reacii de aglutinare utilizate n diagnosticul microbiologic direct
Executm aceast tehnic (aglutinare pe lam) pentru identificarea tulpinii bacteriene implicate
etiologic n respectiva boal infecioas. Se pot face i aglutinri n tuburi, pentru confirmarea
rezultatului obinut pe lam. Unele laboratoare i pot sintetiza in house reactivii necesari.
n cursul identificrii unei tulpini enterobacteriene (Shigella spp., E. coli etc) sau a unei alte tulpini (EX
. Vibrio spp.), dup cultivarea p.p. pe diferite medii (vezi capitolele 13 i 14) i dup ce obinem colonii
izolate, putem face reacia de aglutinare. Aadar, avem nevoie de cultura de identificat (cultur
proaspt, de 18-24 de ore, cu colonii de tip S), soluie salin fiziologic, Ac cunoscui fa de Ag pe
care dorim s le identificm (Ac polivaleni, Ac monovaleni de grup, Ac monovaleni de tip, dup caz),
lame de microscop, amestec dezinfectant etc.
Pe o lam punem o pictur de soluie salin fiziologic, n care descrcm un fragment din colonia de
identificat, amestecm pn obinem o suspensie tulbure. Dac pictura devine limpede, cu grunji,
nseamn c apare autoaglutinare i nu mai putem s identificm tulpina prin reacie Ag-Ac (ar putea
fi, de EX . o tulpin din colonie de tip R, care i-a modificat structura). Dac suspensia rmne tulbure,
putem continua aplicarea tehnicii. Pe aceeai lam, la cealalt extremitate, punem o pictur de ser cu
Ac cunoscui (polivaleni). Descrcm un fragment din colonia de identificat n pictura de ser cu Ac i
amestecm pn obinem o suspensie tulbure. Prin nclinare, n mai multe direcii, favorizm contactul
dintre Ag-Ac mici i apar complexe mici, apoi reele de complexe Ag-Ac. Apar grunjii de aglutinare.
Citim reacia pe un fond negru. Lamele pe care am executat reacia de aglutinare conin
microorganisme vii i trebuie s le introduce n amestecul dezinfectant, dup examinarea rezultatelor
reaciei.
Reacia de aglutinare indirect se poate folosi pentru determinarea grupului streptococic, pentru
detectarea unor fungi (Cryptococcus neoformans, Candida albicans, Aspergillus spp.) sau a unor virusuri
i pentru detectarea prezenei Ag n lichide biologice. Tot prin tehnici de aglutinare indirect se pot
identifica exotoxine.
9. 4. 2. Reacii de aglutinare utilizate n diagnosticul serologic
n diagnosticul serologic, n mod obinuit, reaciile utilizate permit detectarea prezenei Ac n serul de
cercetat dar i stabilirea titrului. Totui exist i cteva exemple de reacii de aglutinare calitative.
9. 4. 2. 1. Aglutinarea pe lam
Reacia de aglutinare pe lam (Huddleson; diagnosticul brucelozei) a intrat n istoria medicinei. Avem
nevoie de lame de microscop, Ag brucelos inactivat (colorat n violet) i ser de cercetat. Pe lam
depunem o pictur din soluia de Ag brucelos i o pictur de ser de cercetat. Amestecm i
omogenizm cei 2 reactani. Reacia este pozitiv n cazul n care se remarc prezena aglutinatelor.
Reacia pozitiv pe lam trebuie confirmat prin aglutinare n tuburi.
9. 4. 2. 2. Aglutinarea n tuburi
Tehnica poate fi folosit n diagnosticul serologic al brucelozei (Wright), n diagnosticul serologic al
infeciilor produse de Cryptococcus neoformans, n diagnosticul serologic al febrei tifoide
(reacie Widal - ca nume istoric) etc.
Pentru diagnosticul serologic al febrelor enterice vom folosi seruri recoltate n dinamic, la 7-10 zile
distan, Ag cunoscute (Ag O i Ag H), 4 iruri de eprubete (dou iruri pentru anti-O, dou iruri
pentru anti-H (pentru c vom lucra n cele dou probe, n dinamic, pentru fiecare tip de Ac). Pentru
fiecare ir de tuburi dilum binar serul de cercetat. n final, pentru fiecare ir avem: un tub martor
(tampon pentru diluie + Ag, fr ser) i tuburi cu serul diluat, de EX . 1/40, 1/80, 1/160 etc (un ir de
tuburi pentru serul recoltat de la pacient astzi i altul la 10 zile, pentru titrarea Ac anti-O i nc
dou iruri pentru titrarea Ac anti-H). Incubm cele 2 iruri de tuburi cu Ag O timp de 20 ore la 52C iar
cele 2 iruri de tuburi cu Ag H le incubm 2 ore la 52C plus 10 minute la temperatura camerei.
Evaluarea o facem pentru fiecare tub n parte, ncepnd de la diluiile mari, prin examinare i uoar
agitare, pentru a surprinde aglutinatele. Ultimul tub care prezint aglutinare vizibil stabilete titrul
reaciei (pentru fiecare ir de tuburi, n parte). Un titru care crete de 4 ori n dinamic stabilete
diagnosticul n mod cert.
n cazul unor pacieni care se afl n convalescen sau n cazul persoanelor care ar putea fi purttori
ncercm s stabilim titrul Ac anti-Vi.
9. 5. Direcii de cercetare
Chiar dac nu toate noiunile prezentate n manualele de specialitate trebuie nvate ca atare, n
dezvoltarea pe parcursul activitilor universitare considerm c este necesar ca cititorii s citeasc mai
mult, pentru o ct mai bun informare. Ca atare, recomandm cteva link-uri corespunztoare unor
articole care pot fi studiate folosindu-se resursele World Wide Web.
1. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3570367/
2. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC321732/
3. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC87684/
9. 6. Povestire adevrat
Iat att o situaie de urgen n pediatrie ct i modul n care ar trebui condus diagnosticul i
comunicarea dintre echipa de clinicieni i medici de laborator, astfel nct diagnosticul i tratamentul
s fie obinut ct mai repede, n favoarea pacientului.
Un copil de 19 luni este adus la camera de gard a unui spital de pediatrie n urma unei crize comiiale.
Din anamneza mamei, aflm c n urm cu 2-3 zile s-au instalat simptome de rceal (tuse, congestie
nazal, i febr), care s-au agravat n cursul zilei n care se prezint la spital. Copilul a fost agitat, nu a
mncat i a dormit cea mai mare parte a dimineii (sau cel puin aceasta a fost impresia mamei). Au
urmat dou crize comiiale (grand-mal). Copilul nu avea istoric de convulsii. Mama a afirmat c nu s-au
fcut toate vaccinrile. La examenul clinic starea copilului este grav, temperatura de 38,1C, alura
ventricular 110 bti pe minut. Nu rspunde la vocea mamei, i nu retrage extremitile la stimuli
dureroi. Copilul prezint grimase atunci cnd se ncearc hiperflexia gtului. Nu prezint erupie
cutanat. Examenul ORL (nas, gt, urechi), cardiovascular, pulmonar i abdominal sunt normale.
Examenele paraclinice noteaz un numr mare de celule albe n snge. Se ia decizia de a efectua o
puncie lombar.
Se recolteaz 3 eprubete cu LCR (aspect intens tulbure). Examinarea a 2 frotiuri din LCR, colorate AM i
Gram, evideniaz frecvente celule PMN, rare hematii i multiple microorganisme cocobacilare roii
(coloraia Gram) dispuse intra i extracelular.
Se comunic rezultatele colegilor din clinic i este nceput tratamentul cu o cefalosporin de
generaia a treia, administrat intravenos.
Se nsmneaz pe: 1. agar-snge (pe care se aplic i 2 microcomprimate cu factorii de cretere X i
V), 2. agar-chocolat, 3. McConkey i 4. Mueller-Hinton.
Se efectueaz CIE din LCR confirmnd prezena antigenelor pentru H. influenzae, tip b. Rezultatele sunt
imediat transmise colegilor din clinic. Dup 1 zi, rezultatele culturilor efectuate confirm creterea pe
mediile mbogite, caracteristic H. influenzae. Se efectueaz o reacie de aglutinare pe lam care
confirm tipul b.
n ziua urmtoare, copilul a nceput s mnnce i s se joace n mod normal. Nu mai prezint febr i
rigiditatea gtului este mult diminuat. Tratamentul este continuat 7 zile, iar copilul este externat cu
diagnosticul de meningit acut bacterian cu H. influenzae tip b, vindecat. La vizitele de control,
mama nu mai raporteaz nici un episod de criz comiial, iar copilul se dezvolt normal.
9. 7. De reinut
Reaciile Ag-Ac au un rol important att in vivo ct i in vitro, pentru diagnostic i tratament. Exist
multe variante tehnice prin care aceste reacii pot fi puse n eviden. Aceste reacii pot fi folosite att
n diagnosticul bacteriologic direct (detecia Ag prezente la nivelul unei bacterii, util n identificarea
microorganismului) ct i n diagnosticul serologic (detecia n serul pacientului a Ac ndreptai
mpotriva unui anume Ag).
9. 8. Verificai-v cunotinele
1. Etapele reaciei antigen-anticorp sunt:
A. Interaciunea primar reprezint legarea anticorpilor de antigenele specifice
B. Interaciunea primar poate fi vizualizat sub form de flocoane de aglutinare
C. Interaciunea secundar implic formarea unei reele tridimensionale vizibile
D. Interaciunea secundar apare dup circa 10 de minute
E. Interaciunea teriar implic activitatea in vitro a complexelor Ag-Ac
2. Reacia de precipitare Elek:
A. Este folosit pentru a determina toxigeneza unei tulpini de Clostridium botulinum
B. Se efectueaz pe mediul Muller-Hinton
C. Necesit aproximativ 2 ore pentru ca Ac anti-toxin difterice s difuzeze n mediu
D. Implic nsmnarea a 2 martori (negativ i pozitiv) i a tulpinilor de investigat
E. Toxinogeneza se evideniaz prin apariia liniilor de precipitare n unghiurile dintre cultur i anul
cu Ac anti-toxin
3. Contraimunoelectroforeza:
A. Este o metod mai rapid dect imunoelectroforeza
B. Ac vor migra spre catod
C. Tehnica poate fi utilizat doar dac Ag investigat migreaz spre anod
D. Poate fi folosit n identificarea Ag K
E. Poate identifica Ag de la S. pneumoniae, N. meningitidis, H. influenzae
4. Afirmaiile FALSE despre reacii de precipitare n inel:
A. Este o reacie cantitativ
B. Reacia Ascoli este folosit pentru identificarea prezenei Ag crbunos
C. Pentru a efectua reacia, avem nevoie de 4 tuburi (3 martori i o prob)
D. Ag i Ac se amestec n eprubeta prob
E. Dup circa 5 minute, la limita dintre cei 2 reactivi apare un inel de precipitare
5. n reaciile de aglutinare putem folosi:
A. Ag solubile, precum exotoxinele secretate de Corynebacterium dyphteriae
B. Ag corpusculare naturale (bacterii, celule)
C. Particule pe care s-au cuplat in vitro cu Ag
D. Eritrocite, n scopul determinrii grupei ABO
E. Particule de latex pe care s-au alipit Ac
9. 9. Myth busters (alegei ntre Adevrat i Fals)
1. Folosind reaciile de precipitare, putem determina cantitativ titrul unei exotoxine n serul pacientului.
2. Reaciile de aglutinare pe lam pot contribui la diagnosticul meningitei acute bacteriene naintea
obinerii culturilor primare.
3. Toxinogeneza tulpinilor de Clostridium botulinum este evideniat de testul Elek.
4. Folosind reacia de aglutinare indirect putem determina grupul streptococic.
5. Atunci cnd dorim s evideniem caracteristicile antigenice ale unei culturi bacteriene, vom lucra
mereu cu culturi proaspete deoarece microorganismele btrne nu i pstreaz caracteristicile
antigenice.
10. Reacii antigen-anticorp care nu sunt vizibile, direct.
(Gabriela-Loredana Popa, Alexandru-Andrei Muntean)
10. 1. Cuvinte cheie
fixare a complementului
seroneutralizare
ASLO
boli poststreptococice
radioimunoanaliza
analiz imunoenzimatic
Imunofluorescen
10. 2. Introducere
Exist i reacii Ag-Ac care nu pot fi vizualizate direct; n aceast situaie este necesar utilizarea unui
artificiu tehnic (EX . utilizarea unui sistem hemolitic, etc).
10. 3. Reacii n care folosim un sistem hemolitic indicator
10. 3. 1. Reacia de fixare a complementului (RFC)
Rezultatul reaciei nu este vizibil n absena folosirii un sistem hemolitic indicator. Reaciile Ag-Ac,
aadar i RFC, se pot folosi att pentru identificarea Ag ct i n diagnosticul serologic (identificarea
Ac). Cu toate c RFC este o tehnic laborioas, executat corect este foarte exact, cu sensibilitate i
specificitate ridicat.
RFC cantitativ se poate utiliza pentru diagnosticul serologic al infeciilor produse de Brucella
spp., Treponema pallidum, Leptospira spp., Borrelia spp.,Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia spp., n
diagnosticul serologic al unor viroze, etc.
Vom lua ca exemplu RFC Bordet-Wassermann (RBW). Aceasta este o metod calitativ de identificare a
Ac mpotriva T. pallidum (atenie, Ag este nespecific!).
Principiu
Se inactiveaz C endogen (cel prezent n serul pacientului) deoarece poate prezenta variaii
cantitative (EX . n lupus eritematos sistemic; unele infecii duc la scderea nivelului C; unele
neoplazii determin nivele crescute ale C). Se adaug C exogen (cantitate stabilit conform
protocolului). a.Dac n serul de cercetat exist Ac specifici, rezult un complex Ag-Ac pe care se
fixeaz C(Cnu va mai fi disponibil pentru a se fixa pe sistemul indicator hematii-Ac anti-hematii,
adugat n a doua etap). b.Dac n serul de cercetat nu exist Ac specifici, nu se formeaz complex
Ag-Ac i C rmne liber. Dup adugarea sistemului indicator, dac exist C liber, acesta se va lega
de complexele Ag-Ac ai sistemului indicator i va conduce la apariia hemolizei.
Tehnica de lucru
Utilizm ser de cercetat, seruri de referin (martor pozitiv i negativ), Ag cunoscut, C, sistemul
hemolitic indicator, baie de ap pentru inactivarea serului propriu (la 56C) etc.
n RBW folosim 2 eprubete cu diluii diferite ale serului pacientului i eprubetele martor (sigur pozitiv,
sigur negativ, martor pentru serul de cercetat, martor pentru Ag, martor pentru C, martor pentru
sistemul hemolitic); nprima etap punem n reacie serul de cercetat, C i Ag cunoscut; n a doua
etap se introduce n reacie sistemul hemolitic indicator (hematii + Ac anti-hematie).
Interpretare
Verificm nti rezultatele aprute pentru martori (EX . n tubul martor sigur pozitiv nu trebuie s
apar hemoliz). (Figura nr. 1)
Testul este pozitiv atunci cnd n tuburile cu ser de cercetat nu apare hemoliz, hematiile se depun
formnd un buton n partea inferioar a tubului (n serul de cercetat exist Ac). Pentru a stabili
diagnosticul este obligatoriu ca un rezultat pozitiv s fie confirmat prin reacii specifice (deoarece
cardiolipina este un Ag nespecific!).
10. 3. 2. Reacia de neutralizare (seroneutralizare; RSN)
Ag are o proprietate biologic (EX . toxic) care poate fi blocat/neutralizat prin cuplarea cu Ac
specific. RSN se poate utiliza n:
diagnosticul bacteriologic (EX . identificarea Clostridium perfringensprin metoda plcilor
semineutralizate, toxinotipia n cazul suspicionrii TIA cuClostridium botulinum, pe animale de
laborator);
diagnosticul serologic (EX . reacia ASLO, n bolile post-streptococice);
prevenirea unor boli infecioase prin vaccinare;
evaluarea eficacitii vaccinale (titrarea prezenei Ac anti-toxine, testarea prin
intradermoreacie a susceptibilitii fa de o anumit boal infecioas care are la baz drept
mecanism patogenic efectul unei exotoxine, EX . difterie);
tratamentul unor boli infecioase (seroterapie).
10. 3. 2. 1. Reacia ASLO
Se poate utiliza n diagnosticul retrospectiv al unei infecii streptococice sau pentru confirmarea
etiologiei bolilor poststreptococice; determinm titrul Ac anti streptolizin O (SLO).
Principiu
SLO are efect hemolitic asupra hematiilor de iepure sau de berbec. Dac n serul pacientului exist Ac
anti-SLO, aciunea hemolitic a SLO este neutralizat. Prin diluii efectuate n tuburi, determinm titrul
ASLO (cea mai bun tehnic este cea clasic!).
Tehnica de lucru (Tabelul nr. 1)
Utilizmseruri de cercetat n pereche (recoltate la interval de 7-10 zile), SLO liofilizat, snge defibrinat
de iepure, soluie salin izoton, soluie de rivanol 0,3%, eprubete, pipete gradate foarte curate, baie
de ap, centrifug etc.
Respectm cu strictee indicaiile din protocolul de lucru (EX . omogenizm suspensia de hematii,
dilum serul 1/10 i repartizm n tuburi; adugm o cantitate constant de SLO). Nu putem vizualiza
rezultatul reaciei n aceast etap. Este necesar a doua etap (agitm tuburile, adugm suspensia
de hematii, agitm pentru omogenizare; incubm 45 minute, la 37C, centrifugm; inem tuburile la
frigider, pn a doua zi).
Interpretare (Figura nr. 2)
Prin respectarea protocolului, titrul potenial al Ac anti-SLO va fi 12, 50, 100, 125, 166, 250, 333 etc.
Titrul reaciei ASLO este dat de cea mai mare diluie de ser la care lipsete complet hemoliza. n ara
noastr se accept ca normal un titru de 200 (maxim 250) uniti ASLO. Exist i alte teste serologice
care pot fi utilizate (EX . anti dexoribonucleotidaza B). S-a demonstrat c dinamica
serologiei (creterea de patru ori a titrului ntre dou determinri succesive) este mai important dect
valoarea absolut a titrului, nregistrndu-se nivele crescute (titru de >1900 uniti ASLO) n absena
simptomatologiei sau a dovezii microbiologice a unei infecii cu streptococ beta hemolitic de grup A
timp de mai mult de 2 ani. De asemenea, exist i situaii n care, dinamica ASLO este constant, n
absena simptomatologiei clinice.
10. 3. 2. 2. RSN n profilaxia i tratamentul unor boli infecioase
Vaccinarea n scopul obinerii unei protecii prin seroneutralizare
Vaccinul DTaP (celular) se face dup urmtoarea schem: primovaccinarea ncepe la vrsta de 2 luni a
nou-nscutului (se administreaz 3 doze la interval de 2 luni, la 2, 4, 6 luni). Pentru meninerea
imunitii se practic revaccinarea I la 6 luni de la primo-vaccinare iar revaccinarea a II-a se practic la
36 de luni de via a copilului. Urmtoarea revaccinare are loc la intrarea n coala primar. Iar mai
departe, se recomand rapeluri cu dT din 10 n 10 ani. (Tabelul nr. 2)
Evaluarea eficacitii vaccinurilor
Este recomandat testarea strii de imunitate indus prin vaccinare. Spre EX . se titreaz Ac anti-
toxin (difteric, tetanic etc) n seruri prelevate de la persoanele vaccinate. Protecia anti-difteric e
asigurat de un titru de Ac-anti toxin difteric mai mare de 0,03 UAI/ml.
Terapia sau profilaxia specific
Se pot administra de imunoglobuline specifice omologe (de la persoane imunizate), de EX .
imunoterapia infeciei cu Clostridium tetani cnd administrm intramuscular 3-6.000 UAI. Se pot
administra seruri imune heterologe (obinute prin hiperimunizarea cailor) n tratamentul tetanosului,
difteriei, botulismului etc.
Seroterapia poate reprezenta o urgen medical.
10. 4. Reacii n care componentele sunt marcate
Marcarea componentelor se poate face:
primul reactiv (fie Ag, fie Ac, depinde de ce urmrim s determinm) este fixat pe un suport
solid (EX . godeurile unei plci speciale, cumprate de la productor);
dac exist potrivire ntre cei doi reactivi, are loc formarea complexului Ag-Ac; pentru eliminarea
reactivilor care nu au intrat n complex se spal (automat);
se adaug un reactiv marcat (EX . se poate aduga un alt anticorp anti-Ac (anti-Fc), cuplat cu un
conjugat enzimatic); are loc o nou splare (automat);
valorile nregistrate pentru prob se compar cu valorile nregistrate pentru martorul pozitiv i
martorul negativ, se aplic o formul (indicat de ctre productor; calculul se realizeaz tot automat);
interpretarea se face conform indicaiilor din protocolul care nsoete trusa ELISA.
Mai frecvent sunt utilizate fosfataza alcalin (substrat cromogen = p-nitro-fenil-fosfat) sau peroxidaza
(substrat cromogen = o-fenilen-diamina n soluie de ap oxigenat).
Specificitatea este bun sau foarte bun iar sensibilitatea este comparabil cu cea obinut n cazul
RIA. Tehnica este automatizat, iar ansamblul de instrumente foarte flexibil, permindu-ne practic s
efectum orice test dorim.(Figura nr. 6, Tabelul nr. 3)
10. 4. 3. Imunofluorescena (IF/FIA)
Pentru a efectua aceast tehnic este necesar ca unul dintre reactivi (Ag, Ac sau anticorp anti-Ac) s fie
marcat fluorescent. Imunofluorescena poate fi utilizat att n diagnosticul microbiologic direct (pe
p.p. recoltat de la bolnav sau pe cultura pur) ct i n diagnosticul serologic. (Figurile nr. 7 i 8)
Fluorocromii (EX . auramin O, rhodamin B, etc) sunt compui organici care, dup iradiere cu
radiaii UV absorb radiaia de o anumit lungime de und, intr n stare de excitaie; atunci cnd revin
n starea normal pierd energia acumulat emind radiaii luminoase sub forma de fotoni de o
lungime de und inferioar. Lumina vizibil emis depinde de fluorocrom (EX . culoare galben
pentru auramin O).
10. 4. 3. 1. IF direct (Figura nr. 7)
Principiu
Folosim Ac marcai fluorescent pentru a inti un Ag pe care l bnuim prezent.
Tehnica de lucru
Facem un frotiu pe care l acoperim cu serul care conine Ac marcai fluorescent, incubm, splm
pentru a ndeprta Ac care nu au intrat n complexul Ag-Ac. NB. Putem adapta tehnica pentru a
colora diferite Ag (EX . pentru a decela i alte tipuri celulare prezente), materialul genetic (ex. pentru
a colora nucleul celulelor eucariote). Ateptm s se usuce i examinm cu microscopul cu
fluorescen.
Interpretare
Aceast tehnic are avantajul de a prezenta o discriminare spaial a Ag investigate. Metoda este
rapid i aplicabil pentru frotiuri din p.p. sau din cultur, n anatomia patologic etc. Pentru fiecare Ag
de cercetat trebuie preparat serul care conine Ac specifici, marcai fluorescent. Putem
identificaLegionella pneumophila, Bordetella pertussis, Mycobacterium tuberculosis,Chlamydia
trachomatis, Treponema pallidum, Cryptococcus neoformans,Histoplasma capsulatum, Pneumocystis
carinii etc.
10. 4. 3. 2. IF indirect (Figura nr. 8)
Principiu
Ag este cunoscut i urmrim obiectivarea unui Ac. Vom folosi un al doilea anticorp anti-Ac (intii
mpotriva poriunii Fc a primului anticorp).
Tehnica de lucru
Facem un frotiu, l acoperim cu serul de cercetat. Dup incubaie splm pentru ndeprtarea
reactivilor care nu au intrat n reacia Ag-Ac. Punem apoi un ser cu Ac anti-Ig de om, marcai
fluorescent i incubm. Splm, ateptm uscarea frotiului, examinm la microscopul cu fluorescen.
Interpretare
Dac n serul de cercetat exist Ac specifici Ag cunoscut, are loc formarea complexului Ag-Ac iar n
etapa urmtoare, Ac anti-Ig de om se cupleaz pe complex i n mod indirect, prin IF, identificm Ac.
Metoda poate fi utilizat n diagnosticul serologic al legionelozei, leptospirozei, sifilisului, boreliozei,
infeciilor produse Mycoplasma pneumoniae, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, Pneumocystis
carinii etc.
10. 5. Direcii de cercetare
Chiar dac nu toate noiunile prezentate n manualele de specialitate trebuie nvate ca atare, n
dezvoltarea pe parcursul activitilor universitare considerm c este necesar ca cititorii s citeasc mai
mult, pentru o ct mai bun informare. Ca atare, recomandm cteva link-uri corespunztoare unor
articole care pot fi studiate folosindu-se resursele World Wide Web.
1. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3724245/
2. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2962976/
3. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3372158/
4. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2953097/
10. 6. Povestire adevrat
Cazul 1. Un biat de 6 ani se prezint cu edem generalizat, hipertensiune, hematurie microscopic i
proteinurie. La examenul paraclinic, prezenta disfuncie renal moderat (uree seric 48 mg/dl,
creatinin seric 0,8 mg/dl) i nivele sczute ale complementului (CH50: 17U/ml; C3: 6mg/dl i C4:
4mg/dl). Titrul ASLO a fost normal. S-a pus diagnosticul de GlomeruloNefrit Acut (GNA). A prezentat
impetigo repetat la nivelul membrelor inferioare n lunile premergtoare Una dintre surorile sale (Cazul
3) a fost diagnosticat cu Faringit Streptococic (FS) n momentul diagnosticului de GNA n acest
pacient (Cazul 1).
Cazul 2. O fat de 13 ani, prezint edem generalizat, la 2 sptmni dup debutul GNA n Cazul 1. La
examenul clinic, se mai noteaz hipertensiune. Paraclinic, prezint hematurie microscopic, proteinurie,
disfuncie renal uoar (uree seric 43 mg/dl, creatinin seric 1.0 mg/dl). Cu 2 sptmni nainte de
debutul GNA, a acuzat durere faringian, concomitent cu diagnosticul de FS a Cazului 3. La momentul
diagnosticului, prezint dermatit atopic i impetigo a membrelor inferioare. Titrul ASLO este normal
n limite normale. S-a recoltat Exudat Faringian (EF) din care s-au izolat o tulpin de streptococ beta
hemolitic de grup A. Acesta a fost serotip 49.
Cazul 3. O fat de 9 ani, sora Cazului 1 i Cazului 2 prezint rash maculopapular la nivelul faei i
trunchiului i limb zmeurie. Dup tratamentcu antibiotice timp de 4 zile, a fost adus la spital i s-a
pus diagnosticaticul cu FS. S-a recoltat EF dar nu s-au putut izolat tulpini de S. pyogenes. Titrul ASLO a
fost crescut (542 UI/ml). Nu s-au decelat hipertensiune sau edem. La examenul sumarului de urin se
noteaz hematurie microscopic.
Discuii. Nu exist istoric de boli de renale n familie, iar copiii erau clinic sntoi pn n momentul
declanrii GNA i FS. Proteinuria s-a remis n 2 sptmni de la debutul GNA n Cazul 1 i 2. Nivelul de
creatinin seric a sczut, atingnd 0.3 mg/dl (Cazul 1), respectiv 0.5 mg/dl (Cazul 2). Nivelul de
complement seric s-a normalizat la 2 luni de la debutul GNA. Hematuria microscopic s-a remis dup o
lun n Cazul 3 i dup 4 luni n Cazul 1 i 2. Cazul 3 a fost diagnosticat cu GNA subclinic, datorit
hematuriei microscopice tranzitorii ce au urmat FS.
NB: n aceste cazuri, titrul ASLO s-a interpretat n funcie de titrul maxim admis. Recomandarea noastr
este ca de fiecare dat, titrul de Ac s fie msurat n dinamic.
10. 7. De reinut
Reaciile antigen-anticorp care nu sunt vizibile direct folosesc artificii tehnice (sisteme indicatoare,
component marcate) pentru a pune n eviden complexe Ag-Ac de dimensiuni foarte mici, crescnd
astfel sensibilitatea reaciilor, meninnd specificitatea caracteristic acestor reacii.
Majoritatea variantelor tehnice pot fi folosite att pentru diagnosticul bacteriologic direct ct i pentru
diagnosticul serologic. Reaciile moderne (ELISA/EIA) sunt automatizate i pot oferi rezultate rapide.
C. dac exist potrivire ntre cei doi reactivi, are loc formarea complexului Ag-Ac
11. 2. Introducere
Putem folosi testele adresate RIC n cadrul diagnosticului imunobiologic sau n diagnosticul de
laborator pentru anumite boli infecioase (EX tuberculoza produs de Mycobacterium tuberculosis)
dar i n investigarea imunitii de tipcelular pentru un subiect cu suspiciune clinic de imunodeficient
(primar sau secundar).
11. 3. 1. Diagnosticul imunobiologic i imunologic de laborator al infeciei cu Mycobacterium
tuberculosis
11. 3. 1. 1. IDR cu PPD
Principiu
Tuberculina reprezint un amestec de Ag proteice mycobacteriene (nti secultiv M. tuberculosis n
mediu lichid, EX . Sauton; dup o perioad bine stabilit de multiplicare, cultura se filtreaz i apoi
prin mai multe proceduri de selectare-purificare se obine extractul proteic).
Dac o persoan este infectat cu germeni din grupul Mycobacterium tuberculosis, urmeaz
sensibilizarea i proliferarea LT. IDR cu PPD stimuleaz LT i RIC (inclusiv hipersensibilitatea de tip IV).
Rezult vasodilataie, edem i infiltrat cu LT, bazofile, monocite, neutrofile etc. Se cunoate c reacia
maxim este la circa 48 ore. Aria induraiei reflect HS de tip IV. Eritemul nu este interpretat ca reacie
pozitiv.
Procedura
Ne asigurm c dispunem de toate materialele necesare: seringi cu gradaii la 0,1 ml, PPD n fiole cu 2
UI/doz (echivalentul a 5 UI PPD-S) sau 10 UI/ doz, antiseptic etc.
Tehnica pe care o utilizm poart numele de IDR Mantoux (IDR cu PPD). Controlm fiola pentru a ne
asigura c este n termen, dac a fost pstrat corespunztor i o agitm energic pentru omogenizarea
PPD. Se folosete o sering nou pentru fiecare pacient; nu se admite aspirarea de PPD ntr-o sering
i schimbarea acului pentru fiecare pacient (!). Pregtim seringa, aspirm o cantitate suficient de
produs pentru a putea elimina bule de aer i a fi siguri c vom injecta intradermic 0,1 ml, fix.
Antiseptizm de EX . cu alcool medicinal (ateptm 3 minute) o zon situat pe faa anterioar a
antebraului stng, n treimea medie. Ptrundem aproape tangent la suprafaa antebraului, cu bizoul
n sus, pentru a ne situa n derm (Figura nr. 1). Injectm strict 0,1 ml. (Film nr. 1)
Dac am injectat corect, apare o bul uor denivelat cu diametru de circa 5 mm (Figura nr. 2).
Interpretare
La persoanele infectate, la locul injectrii poate aprea o reacie (eritem-edem-induraie) dup circa 6
ore, fiind maxim la 48-72 ore. Totui, cel mai frecvent, citirea rezultatului se face la 72 ore, la lumina
natural.
Recomandm citirea cel puin o dat la 24 de ore, astfel c efectum o prim citire la cel trziu 24 ore
(pentru a surprinde HS de tip umoral fa de Ag inoculat, structur proteic), o a doua citire la 48 ore i
citirea final la 72 de ore.
Zona unde s-a injectat PPD trebuie palpat pentru a delimita zona de induraie de zona de eritem.
Msurm diametrul maxim al zonei de infiltraie (induraie). Citirea reaciei este subiectiv, cu posibile
variaii individuale, totui rmne un element important, care nu trebuie neglijat. (Figura nr. 3; Film nr.
2)
Pentru investigarea infeciei cu M. tuberculosis, n ara noastr se consider drept negative reaciile
cu diametru mai mic sau egal cu 9 mm (analiza statistic a distribuiei valorilor pe eantioane
reprezentative de subieci a artat c plasarea limitei ntre valorile de 9-10 mm separ cel mai bine pe
cei neinfectai de cei infectai). O valoare mai mare de 10 mm recomand analize suplimentare i
investigaii care s elimine riscul tuberculozei-boal, care necesit tratament. Interpretarea corect, n
context clinic i epidemiologic revine membrilor reelei de pneumo-ftiziologie, conform algoritmului
stabilit n Programul Naional de Prevenire, Supraveghere i Control a TB.
11. 3. 1. 2. Testele de eliberare a Interferonului gama (TEIG; IGRA)
n prezent, exist variante tehnice (de laborator) considerate de ctre unii autori mai sensibile i mai
specifice dect IDR cu PPD. Astfel de teste folosite pentru diagnosticul in vitro sunt testele de
eliberare a Interferonului gama(Figura nr. 4). Specificitatea crescut a testului provine din eliminarea
unor reacii fals pozitive la IDR cu PPD, prin faptul c antigenele coninute de PPD sunt prezente i n
structura Bacilului Calmette-Guerin (BCG) i a unor mycobacterii non-tuberculoase.
Principiu
TEIG investigheaz rspunsul fa de peptide sintetice mai specifice pentru M. tuberculosis dect PPD
(early secretory antigenic target-6 (ESAT-6) and culture filtrate protein 10 (CFP-10), iar, n ultima iteraie
a acestor teste, se include i pri antigenice a proteinei TB7.7). Aceste proteine se gsesc n toate
culturile izolate de M. tuberculosis i conduc la o sintez i secreie msurabil a IFN- n majoritatea
persoanelor infectate, fiind absente din tulpina de vaccinare BCG i n majoritatea mycobacteriilor non-
tuberculoase. Totui, trebuie notat faptul c aceste proteine se gsesc i n M. kansasii, M. szulgai,
and M. marinum. Se folosete un martor pozitiv i un martor negativ, ct i un tub de test.
Procedura
Ne asigurm c dispunem de toate materialele necesare. Materialul biologic necesar de la pacient este
snge proaspt obinut prin puncie venoas periferic. Aceste teste comerciale ofer tuburile care
sunt prencrcate cu antigenele ce vor stimula populaia celular mononuclear i vor determina
secreia de Interferon-. Se identific traseul al unei vene superficiale periferice, se antiseptizeaz zona,
de EX . cu alcool medicinal (ateptm 3 minute) i efectum puncia cu un ac special ce permite
ataarea, pe rnd a mai multor tuburi vidate i extragerea unei cantiti exacte de snge.
Tuburile cu snge se incubeaz 16-24 de ore. Se folosete o tehnic ELISA (vezi capitolul 10) pentru
citirea cantitii de Interferon- n martorul negativ i martorul pozitiv, apoi n proba de investigat.
Interpretare
nti se interpreteaz rezultatele obinute n tuburile folosite ca martor pozitiv i negativ.
Se efectueaz pe baza diferenei dintre nivelul de baz (nivelul de Interferon- aflat n sngele
pacientului n absena stimulrii cu antigene martorul negativ) i nivelul de IFN- produs n cadrul
testului. Se ia n considerare i rspunsul din tubul martor pozitiv.
NB. Majoritatea autorilor sunt de acord cu faptul c n rile endemice pentru tuberculoz, rezultatele
TEIG nu sunt superioare rezultatelor obinute prin IDR cu PPD, ns sunt de multe ori mai scumpe).
11. 3. 2. Investigarea RIC
Un alt scop este reprezentat de utilizarea IDR cu PPD, mpreun cu alte IDR (cu alte Ag, provenind de la
alte microorganisme cu care presupunem c respectiva gazd a luat deja contact), pentru evaluarea
reactivitii n cadrul RIC.
Imunodeficienele primare (nnscute) se ntlnesc n aproximativ 1 din 2.000 de nscui vii, avnd
un spectru clinic foarte larg. Imunodeficienele primare au multe similariti cu imunodeficienele
secundare care pot surveni n cursul vieii, n urma infeciilor virale, dup administrarea de
imunosupresoare pentru a preveni rejetul de gref, n cursul tratamentului bolilor autoimune sistemice
sau dup administrarea de chimioterapie antineoplazic.
Principiu
Investigarea RIC la oricare pacient include:
discuia cu pacientul i anamneza (medicaie primit, momentul debutului suferinei, vaccinri
efectuate, infecii n antecedente etc.),
examenul clinic,
examenul de laborator
numrul elementelor figurate, formula leucocitar, frotiul din sngele periferic,
VSH, ali reactani de faz acut (proteina C reactiv, IL-6, etc.),
studiul subpopulaiilor limfocitare din punct de vedere numeric i funcional prin citometrie de
flux, utiliznd anticorpi specifici pentru a marca suprafaa celular,
determinarea numrului de celule formatoare de Ac fa de Ag timo-dependente,
studiul funciei celulelor fagocitare, evaluarea activitii citotoxice a celulelor NK i K,
studiul secreiei de citokine, etc.,
teste imunobiologice (IDR), folosind Ag care stimuleaz RIC; este recomandat o baterie de Ag,
patru-cinci din Ag (candidin, coccioidin, histoplasmin, Ag extras din virusul urlian,
fitohemaglutinin, lizat din cultur de Staphylococcus aureus, toxoid tetanic, toxoid difteric, tricofitin,
tuberculin etc).
Procedura
Instilarea Ag intradermic se face asemntor IDR cu PPD. Volumul de instilare va acelai, dar
trebuie s inem cont de concentraia Ag utilizate. Este vorba de mai multe instilri, la nivelul
antebraului, la distane diferite.
Interpretare
Pentru investigarea RIC pentru un subiect (am utilizat o baterie de Ag), dac de EX . rezultatul
este negativ (nu apare induraie) pentru niciuna dintre cele 4-5 Ag folosite, presupunem faptul c
subiectul respectiv este anergic n ceea ce privete RIC.
11. 4. Direcii de cercetare
Chiar dac nu toate noiunile prezentate n manualele de specialitate trebuie nvate ca atare, n
dezvoltarea pe parcursul activitilor universitare considerm c este necesar ca cititorii s citeasc mai
mult, pentru o ct mai bun informare. Ca atare, recomandm cteva link-uri corespunztoare unor
articole care pot fi studiate folosindu-se resursele World Wide Web.
1. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2863343/
2. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3749005/
3. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3786801/
4. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3598128/
11. 5. Povestire adevrat
Femeie n vrst de 32 de ani, nefumtoare, fr expunere profesional la noxe
respiratorii, normotensiv, nu are di abet prezint dispnee sever cu debut subacut,
de aproximativ patru sptmni, agravat progresiv, ce asociaz tuse cu expectoraie
hemoptoic. Iniial, a apelat la servicii medicale private, dar fr mbuntirea
simptomatologiei, astfel c s-a prezentat la spital.
La examenul clinic obiectiv, pacienta este contient, cooperant, sub-febril (37,7C), cianotic,
tahipneic, cu frecven respiratorie de 34 respiraii pe minut, puls de 94 bti pe minut i tensiune
arterial de 140/82 mmHg. Saturaia n oxigen a hemoglobinei era 70%. Se deceleaz crepitante
pulmonare bilaterale, cu caracter gros. Restul examinrii a fost normal.
Examenele paraclinice au decelat anemie uoar, leucocitoz, cu neutrofilie, restul formulei leucocitare
fiind normal. Examinarea echilibrului acidobazic i electrolitic a artat pH arterial de 7,34, pO2 de 40
mmHg, pCO2 de 45 mmHg, HCO3- de 22 mEq/L, sodiu i potasiu n limite normale. Pe baza acestor
analize, s-a diagnosticat insuficien respiratorie tip I (hipoxemic, normocapnic). Pe EKG s-a observat
tahicardie sinusal. Radiografiile toracice arat imagini reticulo-nodulare alturi de infiltrate fine
dispuse bilateral. ntrebat, pacienta menioneaz istoric de tuberculoz pulmonar n copilrie.
Datorit strii critice, s-a decis intubarea pacientei i administrarea de antibiotice cu spectru larg, fr
mbuntire marcat n 48 de ore.
S-a recoltat o prim serie de analize serologice, printre care serologia pentru grip i HIV (rezultatele
fiind negative).
Se recolteaz aspirat traheal, care este examinat n coloraie albastru de metilen, Gram i Ziehl-Neelsen
i demonstreaz celularitate mixt, cu neutrofile, hematii i rar flor bacterian polimorf. Se
efectueaz ecografie abdominal i cardiac la patul bolnavei, care nu indic nici o anomalie. Se
efectueaz un test IDR cu PPD. n paralel, se efectueaz un examen computer tomografic (CT) ce arat
un aspect diseminat, miliar bilateral ct i infiltrate de dimensiuni mari.
Pe baza suspiciunii imagistice i clinice, pacienta ncepe tratament antituberculos. La 48 de ore, zona
de induraie era deja de 15 mm, susinnd diagnosticul. Evoluia pacientei a fost favorabil i, n ziua a
12-a, a fost extubat. Culturile din aspiratul traheal au fost pozitive la 14 zile, ntr-un sistem de detecie
rapid. Diagnosticul a fost de tuberculoz pulmonar cu insuficien pulmonar secundar. Datorit
faptului examenul microscopic al sputei s-a dovedit a fi negativ, pacienta a fost externat n ziua 20,
pentru a urma tratament la domiciliu.
11. 6. De reinut
Rspunsul imun celular poate fi investigat att n cazul suspectrii unei infecii cu
un microorganism care se poate multiplica intracelular ct i pentru a diagnostica o
stare de imunodeficien (primar sau secundar). Este de notat c unele tratamente
aflate n arsenalul terapeutic actual pot cauza o scdere a specific a RIC prin
alterarea lanului de citokine care duce la activarea limfocitelor specifice. IDR este un
test important n diagnosticul tuberculozei pulmonare latente, dar exist i tehnici
mai noi care pot fi folosite.
11. 7. Verificai-v cunotinele
1. Este adevrat despre IDR cu PPD:
A. Tuberculina reprezint un amestec de Ag proteice mycobacteriene specifice
pentru M. tuberculosis, ce nu se regsesc n structura BCG
B. Injectarea corect, intradermic a Ag conduce la apariia unei bule, uor
denivelat cu diametru de circa 5 mm
C. n Romnia, se consider drept pozitive reaciile cu diametru mai mare sau egal
cu 8 mm, citit la 24 de ore
D. Citirile ar trebui efectuate la cel mult 24 de ore, apoi la 48 i 72 de ore
E. Examenul zonei de IDR vizeaz apariia unei unei induraii caracteristice HS tip
IV.
2. Testele de eliberare a interferonului gama (TEIG):
Sensibilitatea la bacitracin
12. 2. Introducere
Simpla vizualizare prin microscopia optic a unor coci nu este
echivalent cu stabilirea patogenitii acestora, implicarea acestora
ntr-o anume patologie i nicidelimitarea n microorganisme bune
sau rele. Bacteriile observate pot fi comensale, inofensive sau pot
determina infecii de o severitate variabil. Atunci cnd frotiurile sunt
colorate Gram, microorganismele care rein violetul cristal apar
colorate violet: Staphylococcus, Streptococcus, sau pot fi colorate roz-
rou (EX . Neisseria spp.). n funcie de dispoziie putem ridica o
anume suspiciune (EX . in diplo n cazul Streptococcus
pneumoniae i Neisseria spp., n lanuri Streptococcus spp. sau n
grmezi Staphylococcus spp.)
12. 3. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de
genulStaphylococcus
12. 3. 1. Clasificare. Genul Staphylococcus cuprinde mai multe specii
de microorganisme de interes medical, cele mai cunoscute fiind
reprezentate de:Staphylococcus aureus (prevalena cea mai
mare), Staphylococcus epidermidis iStaphylococcus saprophyticus.
Stafilococii sunt coci Gram-pozitivi aerobi, facultativ anaerobi, imobili,
nesporulai, catalaz-pozitivi. Stafilococii coagulaz-pozitivi sunt
ncadrati n specia S. aureus.
12. 3. 2. Cale de transmitere. Infeciile stafilococice se transmit cel
mai adesea prin contact direct piele/piele sau piele/obiect contaminat
(pansamente folosite, prosoape, lenjerie intim).
12. 3. 3. Tabloul clinic variaz n funcie de localizarea infeciei i de
mecanismul etiopatogenic. Prin multiplicare i invazivitate
local,Staphylococcus aureus determin infecii supurative (purulente)
ale pielii, mucoaselor i ale esuturilor subiacente, cu apariia de
pustule, furuncule ori abcese (Figura nr. 1). n absena tratamentului,
infecia poate disemina (pot aprea chiar i complicaii severe, sepsis i
chiar evoluia nefast, spre deces). Unele tulpini stafilococice
sintetizeaz exotoxine, provocnd toxiinfecii alimentare, necroliza
toxic a epidermului (Figura nr. 2) ori sindromul de oc
toxic. Staphylococcus saprophyticus poate determina infecii urinare, n
special la femeile tinere active sexual.
12. 3. 4. Diagnosticul de laborator
Principii generale. n cazul infeciilor cu puroi ale tegumentelor i
mucoaselor (EX . abces - Staphylococcus aureus) diagnosticul de
laborator este unul bacteriologic, direct, conform etapelor studiate vezi
capitolul 3.
12. 3. 4. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s
respecte regulile cunoscute (vezi capitolul 4) (ct mai apropape de la
debutul bolii, nainte ca pacientul s primeasc medicaie antibiotic
ori chimioterapic etc). n infeciile stafilococice, produsul patologic
poate fi reprezentat de secreiile purulente de la nivelul lezinilor
cutanate (EX . plgi i arsuri suprainfectate, abcese), de exsudatul
nazal sau faringian, de sput, snge, LCR, urin, secreie vaginal ori
lichid de vrstur etc. Vom discuta recoltarea puroiului.
12. 3. 4. 2. Examinarea macroscopic i microscopic a produsului
patologic. Se efectueaza minim 2 frotiuri: unul colorat Gram i unul cu
albastru de metilen. Prin examinarea la microscopul optic, notam
celulele cu morfologii diferite: celulele epiteliale, celulele
inflamatorii (EX . leucocite PMN) icocii Gram-pozitivi, cu diametrul
de 0.5-1.5 mm, dispui n grmezi neregulate, n lanuri scurte,
perechi sau izolai, localizati intra sau extraleucocitar (Figura nr. 3).
12. 3. 4. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic o
facem pentru a obine colonii izolate (cultur pur). Stafilococii sunt
germeni nepretenioi, motiv pentru care putem folosi medii de
cultur simple. Atunci cnd suspicionm contaminarea probelor este
recomandat utilizarea un mediu selectiv, precum mediul Chapman,
fiind cunoscut faptul c aceste microorganisme se multiplic pe medii
hiperclorurate (Figura nr. 4). Coloniile sunt de tip S, cu dimensiuni de
1-3 mm, pigmentate diferit n functie de specie (Staphylococcus
aureus-auriu (Figura nr. 5), Staphylococcus epidermidis-alb
iStaphylococcus saprophyticus-citrin).
12. 3. 4. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic o
facem pe baza:
Caracterelor morfotinctoriale: coci Gram-pozitivi, 0.5-1.5 mm,
dispui n grmezi neregulate, n lanuri scurte, perechi sau izolai
(Figura nr. 6)
Caracterelor de cultur: colonii de tip S, pigmentate auriu (Figura
nr. 5)
Caracterelor biochimice: Staphylococcus spp. sunt catalaz-pozitivi
si fermenteaz zaharuri cu producere de acid (EX . S.
aureuseste manit-pozitiv)
Caracterelor antigenice
Caracterelor de patogenitate: recomandm ferm
efectuareatestului coagulazei (Figura nr. 7)
Sensibilitii la bacteriofagi (n centrele de referin)
Altele (n centrele de referin, spre exemplu studiul acizilor grai
celulari, teste biochimice extinse, identificarea toxinelor, identificarea
prin biologie molecular a rezistenei la antibiotice etc).
12. 3. 4. 5. Antibiograma este obligatorie i se realizeaz de obicei
prin metode difuzimetrice. n ultimul deceniu atenia ntregii
comuniti medicale s-a concentrat asupra rezistenei la antibiotice n
cretere a Staphylococcus spp.,fiind deja celebru microorganismul
insensibil la antibioticele beta-lactamice: stafilococul meticilin-
rezistent (MRSA- methicillin resistant Staphylococcus aureus). Acesta se
transmite prin contact direct, iar respectarea msurilor generale de
igien contribuie semnificativ la prevenirea apariiei infeciilor
stafilococice.
12. 4. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de
genulStreptococcus
12. 4. 1. Clasificare. Streptococii sunt coci sferici Gram-pozitivi care
formeaz perechi sau lanuri n cursul diviziunii celulare. Dintre speciile
cu importan medical amintim: Streptococcus pyogenes (grup
A), Streptococcus agalactiae(grup B) i Streptococcus
pneumoniae (pneumococul). Dei nu a fost stabilit o clasificare
standard a Streptococcus spp., au fost propuse mai multe variante.
Astfel, pornind de la compozitia polizaharic a peretelui bacterian, a
rezultat clasificarea Lancefield, ce mparte streptococii n grupele
serologice A-H i K-U. Mai mult, Streptococcus pyogenes, conform
factorului de virulen-proteina M i a antigenului T, a fost submprit
n alte 100, respectiv 20 serotipuri. Cumulnd variate caractere
microscopice (prezena capsulei) i biochimice, precum hemoliza,
sensibilitatea la optochin ori la bacitracin vom obine o clasificarea
prezentat n Figura nr. 8.
n continuare vom discuta despre diagnosticul de laborator al
infeciilor produse de Streptococcus pyogenes.
12. 4. 2. Cale de transmitere. Este estimat c un procent cuprins ntre
5 i 15% din populaie este purttoare de S. pyogenes la nivel
faringian (prima localizare ca frecven), la nivel cutanat, anal ori
vaginal, fr ca aceste persoane s manifeste semne de boal. Infecia
se transmite de la om la om prin contactul direct al unui tegument
traumatizat ori al unei mucoase cu o secreie contaminat, dar i prin
inhalarea unor aerosoli ori prin ingerarea unor alimente contaminate.
12. 4. 3. Tablou clinic. Streptococii piogeni pot produce afeciuni
foarte variate:
Cu afectarea mucoaselor: faringit, angin streptococic (Figura nr. 9)
Patologii ale tegumentelor i ale esuturilor subcutanate: impetigo,
erizipel (Figura nr. 10), celulit, fasceit necrozant, gangren gazeoas
Afeciuni dezvoltate prin mecanism toxigen: scarlatina, sindromul de
oc toxic
Afeciuni mediate imunitar prin reacii de hipersensibilitate,
poststreptococice: reumatismul articular acut, glomerulonefrita acut.
Alegem pentru discuie diagnosticul n faringita streptococic.
12. 4. 3. 1 Diagnosticul de laborator este bacteriologic, direct.
12. 4. 3. 1. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic. Vom
recolta n condiii de asepsie exsudatul faringian (secreia purulent
de la nivelul faringelui), conform regulilor generale, dar respectnd
suplimentar urmtoarele condiii: nainte ca pacientul s se fi splat pe
dini, s fi mncat, s fi utilizat gargarisme cu diferite soluii. Dac
aceste condiii nu au fost respectate, recoltarea se va face dup minim
4 ore. Produsul recoltat trebuie prelucrat ct mai repede posibil, ns n
nici un caz nu trebuie s treac mai mult de 2-3 ore de la recoltare
pn la cultivare (preferabil 1-2 ore, sau mai repede). Dac aceast
recomandare nu poate fi respectat, produsul va fi nsmnat pe un
mediu de transport.
12. 4. 3. 1. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic va
ine cont de caracterul plurimicrobian al acestuia. Se vor colora 2
frotiuri, Gram i albastru de metilen, etap urmat de notarea
prezenei urmtoarelor elemente:celule epiteliale, celule
inflamatorii (EX . leucocite) i a diferitelor microorganisme printre
care i coci Gram-pozitivi aezai separat, n perechi sau n lanuri etc.
12. 4. 3. 1. 3. Cultivarea se realizeaz pe mediul agar-snge, urmat,
dup aproximativ 18-48 ore, de interpretarea rezultatului. n cazul unei
infecii cu streptococ urmeaz s vedem colonii de tip S, de mici
dimensiuni, nconjurate de o zon deb-hemoliz (clar, cu diametrul
mai mare dect diametrul coloniei) (Figura nr. 11).
12. 4. 3. 1. 4. Identificarea se face pe baza urmtoarelor caractere:
morfotinctoriale: coci Gram-pozitivi, dispui n lanuri (Figura nr.
12);
de cultur (mediul agar snge): colonii de tip S, cu diametrul de
0.5-1 mm, nconjurate deb-hemoliz (Figura nr. 11);
biochimice: hemoliz de tip beta, inhibiia multiplicrii
streptococilor de grup A de bacitracin (Figura nr. 13), rezistena la
trimetoprim-sulfametoxazol;
antigenice: determinarea polizaharidului specific de grup,
determinarea tipurilor M etc.
12. 4. 3. 1. 5. Antibiograma. Streptococii beta-hemolitici de grup
Asunt sensibili la penicilin. Doar dac pacienii sunt alergici la
medicamentele din clasa beta-lactaminelor se va efectua
antibiograma.
NB: Mai mult de 80% dintre episoadele de faringoamigdalit sunt de
etiologie viral i nu necesit antibioticoterapie.
12. 4. 3. 2. Diagnosticul de laborator serologic
Dac exist suspiciunea ca pacientul s sufere de o boal
poststreptococic sau se dorete confirmarea unei infecii invazive este
recomandat efectuarea diagnosticului serologic prin reacia ASLO
(vezi i capitolul 10). Acest test este util i n evaluarea evoluiei
pacientului sub tratament medicamentos (Figura nr. 14).
Reacia ASLO identific titrul anticorpilor anti-streptolizin O, o enzim
hemolitic produs de S. pyogenes. Repetarea testrii la un interval de
7-10 zile permite interpretarea serologic n dinamic i observarea
evoluiei pacientului sub tratament. Pentru zona noastr geografic se
accept ca normal un titru de 200 (maxim 250) uniti ASLO. Este strict
necesar realizarea controlului intern i extern de
calitate. N.B. Metoda cea mai corect este metoda clasic de
determinare.
12. 5. Diagnosticul de laborator n infeciile produse
de Streptococcus pneumoniae
12. 5. 1. Clasificare. Streptococcus pneumoniae se prezint
sub forma unor coci Gram-pozitivi, alungii, dispui n diplo,
ncapsulai, nesporulai, imobili. Pneumococii sunt aerobi, facultativ
anaerobi, multiplicarea microorganismelor fiind favorizat ntr-o
atmosfer cu 5% CO2. Pe mediul geloz-snge determina-hemoliz.
12. 5. 2. Cale de transmitere. Streptococcus pneumoniae este
condiionat patogen, putnd face parte din flora microbian normal a
tractului respirator superior. Infecia se transmite prin contactul
apropiat cu o persoan purttoare sau bolnav, ori prin inhalarea
picturilor contaminate, eliberate prin tuse ori strnut. Exist anumite
categorii de persoane predispuse spre a dezvolta boala: cei cu vrste
extreme (copiii foarte mici i adulii cu mai mult de 65 de ani),
persoane cu patologii asociate care determin imunodepresie (diabet
zaharat, afeciuni cardio-vasculare, HIV/SIDA) ori cu patologii
pulmonare (astm, defecte anatomice, mari fumtori).
12. 5. 3. Tablou clinic. Infecia pneumococic este principala cauz a
pneumoniilor comunitare (Figura nr. 15) i reprezint una dintre cele
mai frecvente etiologii ale meningitelor la copii i vrstnici. Poate
produce i infecii ale tractului respirator superior, ale urechii medii i
sinusurilor sau, prin diseminare sistemic, endocardit, septicemie.
Vom discuta diagnosticul microbiologic n pneumonia
pneumococic.
12. 5. 4. Diagnosticul pneumoniei este clinic, radiologic
i bacteriologic(direct).
12. 5. 4. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic,
reprezentat desput respect regulile generale, dar i condiii speciale
precum: educarea pacientului n vederea obinerii expectoraiei i nu a
unei probe salivare, necesitatea efecturii igienei cavitii bucale
anterior recoltrii.
12. 5. 4. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic impune
realizarea a dou frotiuri, colorate cu albastru de metilen, respectiv
Gram. Se noteaz prezena celulelor de la nivel alveolar (spre
exemplu macrofage), acelulelor inflamatorii (spre exemplu
leucocitele polimorfonucleare) i acocilor Gram-pozitivi, alungii,
lanceolai, dispui n diplo, cu o capsul comun (Figura nr. 16).
12. 5. 4. 3. Cultivarea pe medii de cultur. Pneumococii sunt
germeni pretenioi, care nu se dezvolt pe medii simple. Astfel,
nsmnarea se realizeaz pe mediul geloz-snge, cu incubarea ntr-
o atmosfer de 5% CO2 la o temperatur de 35-37C, condiii care
favorizeaz multiplicare germenilor. Se vor observa colonii de tip S sau
de tip M, cu a-hemoliz (Figura nr. 17).
12. 5. 4. 4. Identificarea se realizeaz pe baza caracterelor:
morfotinctoriale: coci Gram-pozitivi, alungii, lanceolai, n diplo,
capsulai (Figura nr. 16)
de cultur: colonii de tip S sau M, nconjurate de o zon de a-
hemoliz
biochimice: fermentarea inulinei, autoliza accelerat a srurilor biliare
(testul bilolizei), sensibilitatea la optochin (etil-hidrocuprein) (Figura
nr. 18)
antigenice: folosim seruri specifice polivalente i monovalente ce
intesc antigenul K, n reacia de umflare a capsulei
de patogenitate: inocularea la oarecele alb.
12. 5. 4. 5. Antibiograma este obligatorie i se realizeaz de obicei
prin metode difuzimetrice. Pentru verificarea sensibilitii la penicilin
se utilizeaz microcomprimate cu oxacilin.
12. 5. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de
genul Neisseria
12. 5. 1. Clasificare. Familia Neisseriaceae include mai multe genuri,
dar vom discuta n cele ce urmeaz numai despre diagnosticul de
laborator n infeciile produse de meningococ (Neisseria meningitidis)
i gonococ(Neisseria gonorrhoeae). Acetia sunt coci Gram-negativi,
dispui n diplo, reniformi, imobili, nconjurai de o structur capsular
comun. n funcie de structura capsulei exist mai multe serogrupuri.
12. 5. 2. Neisseria meningitidis
12. 5. 2. 1. Cale de transmitere. Infecia meningococic se transmite
prin contactul apropiat cu o persoan purttoare sau bolnav
(utilizarea n comun a obiectelor de igien personal, srut, tuse).
Microorganismul a fost izolat de la nivel nazo-faringian, la persoane
sntoase (purttor de N. meningitidis).
12. 5. 2. 2. Tablou clinic. N. meningitidis reprezint una dintre cele mai
frecvente etiologii ale meningitei bacteriene, alturi de Haemophilus
influenzaei Streptococcus pneumoniae. Dac la aduli redoarea cefei,
fotosensibilitatea, vrsturile fr senzaie de grea, febra pot sugera
afeciunea, la copii i la bebelui suspiciunea de meningit poate fi cu
greu intuit, acetia prezentnd adeseori un tablou clinic atipic (EX .
iritabilitate, vom, reflexe modificate). Meningita meningococic este o
afeciune cu risc vital, reprezentnd o urgen medical.
12. 5. 2. 3. Diagnosticul n meningita meningococic
Diagnosticul include elemente clinice, ntr-un context epidemiologic.
Pentru stabilirea etiologiei, diagnosticul este bacteriologic (direct)
i urgent. Este recomandat ca primele etape s fie efectuate la patul
bolnavului.
12. 5. 2. 3. 1. Recoltarea produsului patologic (LCR, puncie dup
realizarea examenului fundului de ochi) ar trebui realizat la patul
bolnavului, unde repartizm o cantitate de LCR pentru examenul
citologic i biochimic, iar restul pentru frotiuri i culturi (Figura nr. 19).
Dac transportul este inevitabil, trebuie efectuat fr ntrziere i nu la
temperaturi sczute, ci aproape de temperatura corpului.
Meningococul poate fi izolat i prin hemocultur, din exsudatul nazal
ori faringian.
12. 5. 2. 3. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic
permite vizualizarea celulelor inflamatorii (PMN) i a cocilor Gram-
negativi, dispui n diplo, capsulai, situai intra sau extraleucocitar
(Figura nr. 20).
12. 5. 2. 3. 3. Cultivarea o facem pe medii complexe, n atmosfer de
3-5% CO2, la 37C.
12. 5. 2. 3. 4. Identificarea rezult n urma analizei caracterelor:
morfotinctoriale (coci Gram-negativi, n diplo, reniformi);
de cultur: colonii de tip S sau M, cu o dimensiune de aproximativ
1-2 mm;
biochimice: metabolizeaz diferii carbohidrai (EX . glucoza i
maltoza) i produc citocrom-oxidaz (testul oxidazei este test cheie n
identificare) (Figura nr. 21);
antigenice: putem realiza serogruparea (spre exemplu pot aparine
grupului A, B, C, Y sau W-135) (Figura nr. 22).
12. 5. 2. 3. 5. Antibiograma este recomandat i se realizeaz de
obicei prin metode difuzimetrice. Sub un tratament antibiotic adecvat,
instituit prompt, majoritatea pacienilor cu meningit meningococic
se refac complet (a nu se uita c n anumite patologii este necesar
efectuarea CMI/CMB i eventual i NEI/NEB).
12. 5. 3. Neisseria gonorrhoeae
12. 5. 3. 1. Cale de transmitere. N. gonorrhoeae se transmite prin
contact sexual sau de la mam la ft n timpul naterii pe cale natural.
Nu arareori pacienii prezint multiple infecii transmise pe cale
sexual, fiind obligatorie investigarea complet. Gonoreea se asociaz
frecvent cu infecia cu Chlamydia trachomatis, schemele terapeutice
recomandate putnd s acopere ambele patologii.
12. 5. 3. 2. Tablou clinic. La brbai apare uretrita gonococic, iar la
femei, gonoreea se localizeaz endocervical. La nou-nscutul care se
nate pe cale natural din mam cu gonoree, poate aprea oftalmia
gonococic. Gonococul poate disemina cu apariia unor leziuni la
distan. Important de specificat este faptul c aproximativ 80% din
femeile infectate i 10% din brbai sunt asimptomatici, reprezentnd
o cauz de infertilitate.
12. 5. 3. 3. Diagnosticul de laborator n gonoree
Diagnosticul de laborator este numai bacteriologic (direct).
12. 5. 3. 3. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic respect
regulile cunoscute. La brbat recoltm secreia uretral, iar la femeie
recoltarea trebuie efectuat pe mas ginecologic de la nivelul
colului uterin. Secreiile au de obicei un aspect purulent. Este de
preferat cultivarea ct mai rapid, pemedii de cultur complexe (n
atmosfer de CO2). Transportul trebuie realizat foarte rapid n medii de
transport (EX . Amies plus crbune activat).
12. 5. 2. 3. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic poate
pune diagnosticul. Notm prezena celulelor epiteliale, a celulelor
inflamatorii (EX . leucocite) i a cocilor Gram-negativi (n diplo,
situai intra sau extraleucocitar) (Figura nr. 23).
12. 5. 2. 3. 3. Cultivarea se face pe medii selective (spre exemplu
medii cu vancomicin, colistin, trimetoprim i nistatin) dac produsul
patologic este contaminat. Recomandm cultivarea att pe medii
selective, ct i pe medii neselective, n atmosfer de 3-10% CO2, la
35-37C. Coloniile apar n 24-48 de ore. Sunt colonii de tip S, de 0,5-1
mm, sau colonii de tip M.
12. 5. 2. 3. 4. Identificarea rezult n urma analizei caracterelor:
morfotinctoriale: coci Gram-negativi, n diplo, eventual nconjurai
de o structur capsular comun;
de cultur: coloniile sunt de tip S sau M (pot exista pn la 5 tipuri
de colonii diferite, ceea ce poate deruta examinatorul neavizat);
biochimice: metabolizeaz diferii carbohidrai (EX . glucoza) i
produc citocrom-oxidaz (testul oxidazei este test cheie n identificare)
(Figura nr. 24); testul catalazei este intens pozitiv;
antigenice;
Altor caractere (de EX . studiate prin metode ale biologiei
moleculare).
12. 5. 2. 3. 5. Antibiograma este recomandat i se realizeaz de
obicei prin metode difuzimetrice. Este necesar testarea producerii
de b-lactamaz. Este necesar testarea prin tehnica diluiei (cel puin
determinarea CMI).
20. 7. Direcii de cercetare
Chiar dac nu toate noiunile prezentate n manualele de specialitate
trebuie nvate ca atare, n dezvoltarea pe parcursul activitilor
universitare considerm c este necesar ca cititorii s citeasc mai
mult, pentru o ct mai bun informare. Ca atare, recomandm cteva
link-uri corespunztoare unor articole care pot fi studiate folosindu-se
resursele World Wide Web.
1. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24265940
2. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23800598
3. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23793404
4. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23748454
5. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23575037
6. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23575037
7. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22895675
8. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22302695
9. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19884359
10. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23504236
11. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23393147
12. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24243883
12. 7. Povestire adevrat
O pacient n vrst de 27 de ani, aflat n sptmna a 32-a de
sarcin, se prezint la medicul stomatolog pentru o durere intens la
nivelul molarului 2 inferior, drept, amplificat la masticaie i la
percuia de ax, debutat n urm cu aproximativ 2 zile. Mai mult, afirm
sngerare recurent i eliminarea unui lichid purulent de la nivelul
rdcinii dentare. Medicul deceleaz palpatoriu un nodul ferm
submandibular, mobil pe planurile profunde. Decide intervenia
imediat, dar pacienta refuz tratamentul, deoarece se teme c
anestezicul administrat local ar putea avea efecte nocive asupra
dezvoltrii ftului. Decide consultarea medicului ginecolog, peste 5 zile
atunci cnd are programat o evaluare. Medicul i prescrie un
medicament antiinflamator i i recomand s revin de urgen dac
starea ei se nrutete.
Pacienta se prezint a doua zi acuznd agravarea afeciunii, cu apariia
febrei (37,8C) n urm cu 3 ore i a unui edem submandibular
bilateral, predominant drept. Medicul se alarmeaz i, cu suspiciunea
de angin Ludwig, ndrum pacienta la camera de gard a celui mai
apropiat spital.
La camera de gard starea pacientei se agraveaz prin disfagie, cu
imposibilitatea nghiirii secreiei salivare i prin apariia unui placard
dur sublingual. Se decide internarea de urgen, iar la evaluarea
semnelor vitale se deceleaz: febr 38,9C, hipotensiune arterial
90/50mmHg, tahicardie 120/min i o frecven respiratorie de
20/minut. La o saturaie n oxigen de 97% i se recomand
oxigenoterapie, fiind cunoscut faptul c pacienii suferinzi de angin
Ludwig se pot desatura rapid. Trusa de traheostomie se afl la patul
pacientei pentru intervenie ct mai rapid n caz de necesitate.
Dup consultarea unui medic obstetrician se decide intervenia
chirurgical oro-maxilo-facial. Operaia decurge favorabil, pacienta
este echilibrat, iar ecografia Doppler fetal nu prezint anomalii. Pe
durata interveniei s-a prelevat puroi din abcesul mandibular, iar
ulterior examenul bacteriologic a evideniat infecia cu Staphylococcus
aureus. Sub tratament antibiotic, iniial empiric, ulterior conform
rezultatelor antibiogramei, pacienta prezint o evoluie favorabil cu
vindecarea afeciunii. Peste 10 sptmni nate un biat sntos.
Discuii
Pe durata sarcinii, rspunsul imunitar al mamei este semnificativ
diminuat. Din aceast cauz, infeciile progreseaz mai rapid punnd n
pericol att viaa pacientei, ct i a ftului. Mai mult, modificrile
hormonale altereaz fiziologia esuturilor gingivale, care devin mai
sensibile i predispuse spre infecie.
Angina Ludwig este o celulit necrozant, rapid progresiv a planeului
cavitii bucale, cauzat de microorganisme aerobe sau anaerobe,
incluzndu-le pe acelea care fac parte din flora microbana oral,
precum: Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Bacteroides spp.
Afeciunea are risc vital, complicaiile majore fiind septicemia i
insuficiena respiratorie. n sarcin, att afeciunea, ct i potenialele
terapii pot pune n pericol starea de sntate a ftului.12. 8. De
reinut
n absena tratamentului, infeciile pot disemina sistemic, cu apariia
complicaiilor severe precum sepsisul i chiar decesul pacientului.
Stafilococii sunt germeni nepretenioi, motiv pentru care folosim
medii de cultur simple, spre deosebire de streptococci i de neisserii
care sunt microorganisme pretenioase.
Meningita meningococic este o afeciune cu risc vital,
reprezentnd ourgen medical.
Oxidaz-negativi
Catalaz-pozitivi
Febra tifoid
Dizenterie
Pesta bubonic
13. 2. Introducere
13. 2. 1. Clasificare
Familia Enterobacteriaceae cuprinde un numr foarte important de
genuri i specii, de microorganisme importante n medicin. Aceast
familie include att ageni patogeni (EX . Salmonella spp., Shigella
spp.) ct i condiionat patogeni (EX . E. coli) implicai
n patologia infecioas. Multe bacterii ale acestei familii fac parte din
flora intestinului uman sau animal, altele sunt prezente n ap, pe sol,
pe plante etc.
13. 2. 2. Calea de transmitere
13. 2. 2. 1. Genul Escherichia
E. coli face parte din flora intestinal normal. Este implicat (de
regul) n patologie atunci cnd i modific habitatul (de EX . ajunge
la nivelul tractului urinar). Eliminat n mediul extern cu materiile fecale,
contamineaz apa, solul, alimentele etc.
13. 2. 2. 2. Genul Klebsiella
Klebsiella pneumoniae este rspndit n natur; face parte din flora
normal a tractului gastrointestinal, a tractului respirator superior.
Dup terapia prelungit cu antibiotice (mai ales cu spectrul larg), n
mediul spitalicesc se selecteaz tulpini multirezistente ce pot coloniza
tractul urinar sau respirator la adult i la copil.
13. 2. 2. 3. Genul Proteus
Germenii din genul Proteus sunt rspandii ubicuitar. Se pot gsi pe
sol, n ape reziduale, ape de suprafa, n materiale organice n
putrefacie, n alimente i n produse patologice. Fac parte din flora
intestinal uman.
13. 2. 2. 4 Genul Salmonella
Principalul habitat al salmonelelor este tractul intestinal al
oamenilor i al animalelor. Pentru S. typhi omul este unicul rezervor.
Sursele majore, omul i animalele vor determina poluarea solului, a
apelor reziduale, a apelor de suprafa, n care vor supravieui de la
cateva zile la cteva luni, daca condiiile sunt favorabile.
13. 2. 2. 5 Genul Shigella
Bacteriile sunt ntlnite n intestinul i materiile fecale ale bolnavilor
precum i la purttorii aparent sntoi. Se pot izola din ap, alimente
sau de pe obiecte. Pot fi transmise prin intermediul mutelor i a
minilor murdare,
13. 2. 2. 6 Genul Yersinia
Speciile din genul Yersinia (specia cea mai patogen) au ca rezervor
roztoarele, psrile, mamiferele domestice. Se pot transmite prin
plgi mucate de la o roztoare la alta sau ocazional prin intermediul
puricilor (puricele de obolan, puricele de om).
13. 2. 3 Tabloul clinic
13. 2. 3. 1. Tabloul clinic n infeciile produse de E. coli
Genul Escherichia cuprinde n bun parte germeni comensali. Specia
tip este reprezentat de E. coli. Membrii acestui gen pot determina
infecii intestinale i extraintestinale. n condiiile n care prsete
habitatul natural, colonizeaz epiteliul urinar, fiind implicat n primul
rnd n infecii ale tractului urinar. Infeciile intestinale sau
enterocolitele infecioase sunt determinate de patotipuri (EAEC, EHEC,
EIEC, EPEC, ETEC etc.), fiecare avnd grupe serologice i determinnd
manifestri clinice distincte.
13. 2. 3. 2. Tabloul clinic n infeciile produse de genul Klebsiella
Klebsiella pneumoniae poate fi implicat ntr-o mare varietate de
boli precum toxiinfecii alimentare de tip infecios, infecii ale tractului
respirator superior, infecii urinare etc. Este un microorganism
condiionat patogen. Pneumoniile cauzate de K. pneumoniae sunt rare
dar foarte grave; cel mai des survin la pacienii cu boli debilitante ca
diabet, afeciuni pulmonare cronice, pacieni alcoolici i la cei cu un
sistem de aprare deficitar.
13. 2. 3. 3. Tabloul clinic n infeciile produse de Proteus
Proteus poate deveni patogen prin multiplicare i invazivitate i
poate declana infecii la diferite nivele ale organismului gazd. Sunt
implicai patogenic n afeciuni ce apar n afara tractului digestiv, dar
exist i toxiinfecii alimentare de tip infecios n care aceti germeni au
reprezentat agenii cauzali. Infeciile tractului respirator inferior,
pneumoniile, sunt de cele mai multe ori nosocomiale. Pot suprainfecta
plgile chirurgicale sau pe cele arse, ducnd la apariia abceselor. Sunt
frecvent implicai n infecii la nivelul tractului urinar,
capacitatea Proteus spp. de a descompune ureea joac un rol foarte
important n inducerea litiazei urinare.
13. 2. 3. 4. Tabloul clinic n infeciile produse de Salmonella
Principalele infectii produse de salmonele se pot mpri n
salmoneloze minore (enterocolite) i salmoneloze majore (febra
tifoid). Sunt patogene prin multiplicare i invazivitate. Pacienii
imunocompromii i cei cu boli hematologice sunt mai susceptibili la
infecii cu Salmonella dect adulii sntoi.
n caz de enterocolit (gastroenterit, toxiinfecia alimentar de tip
infecios, salmoneloz), germenii ptrund pe cale digestiv iar boala
apare dup ingestia a 105-108 salmonele. Incubaia dureaz de la
cteva ore pn la cteva zile, microorganismul multiplicndu-se n
epiteliul intestinal, n regiunea ileocecal, provocnd un sindrom
inflamator intestinal cu diaree mucopurulent i nesangvinolent. La
debut diareea este nsoit de greuri i vrsturi, iar n perioada de
stare a bolii simptomele frecvent ntlnite sunt reprezentate de febr,
colici abdominale, mialgii i cefalee. La nou nscut deshidratarea poate
duce la o stare de toxicoz grav. Persoana infectat poate fi
contagioas timp de circa 3 luni.
Febra tifoid (febra enteral) poate aprea dup ingerarea a 103 S.
typhi. Calea de ptrundere este digestiv, transmiterea fiind realizat
de la persoan la persoan. Dup ingestie, urmeaz o perioad de
incubare de aproximativ 1-3 sptmni, n care microorganismul
traverseaz mucoasa intestinal, urmat de multiplicarea n
submucoas i fagocitarea de catre macrofage. De aici, bacilii trec n
circulaia limfatic, apoi n cea sangvin determinnd etapa
bacteriemic a bolii. Simptomele generale se caracterizeaz prin febr
crescut, stare general alterat, stare de oc, nsoit de o
simptomatologie digestiv reprezentat de anorexie, colici
abdominale, constipaie sau diaree. Simptomatologia este cauzat att
de endotoxina, care activeaz diferitele cascade inflamatorii i
producerea de citokine, ct i consecina agresiunii intestinale,
hepatice i asupra vezicii biliare. La sfritul primei sptmni de boal,
salmonele se elimin n materiile fecale, dar excreia se poate prelungi
mult timp n convalescen.
13. 2. 3. 5. Tabloul clinic n infectiile produse de Shigella
Infectiile cu Shigella spp. sunt de regul limitate la nivelul tractului
intestinal, pot produce i toxiinfecii alimentare de tip infecios.
Shigeloza este o boal diareic acut, cu evoluie autolimitant, apare
dupa 2-5 zile de la ingestia a 10-1000 de bacterii. Debutul este brusc,
cu febr, diaree apoas, dureri abdominale intense. n perioada de
stare, pacientul are 30-40 de scaune nefecaloide, cu mucus, puroi i
snge, nsoite de tenesme rectale i stare general alterat. n cazul
unei infecii produse de Shigella shiga, starea general se nrutete,
pierderile hidro-electrolitice i instalarea unui sindrom de deshidratare
acut reprezint, ca i n cazul altor diarei, principala problem.
Evoluia poate fi fatal n lipsa tratamentului corespunztor.
13. 2. 3. 6. Tabloul clinic n infeciile produse de Yersinia
Genul Yersinia include 11 specii dintre care 3 sunt patogene pentru
om: Y. pestis (cauza ciumei), Y. pseudotuberculosis i Y. enterocolitica.
Y. pestis este un microorganism patogen al roztoarelor, oamenii
fiind gazde accidentale infectate prin muctura puricilor de obolan.
Microorganismul inoculat la om este fagocitat, dar se poate multiplica
att intra ct i extracelular. Infecia rezultat se rspndete rapid
ctre nodulii limfatici regionali. La nivelul nodulilor limfatici determin
leziuni caracteristice, ganglionii devin tumefiai, hemoragici, se
hipertrofiaz, sufer o necroz i devin fluctueni (aspect
caracteristic bubon negru). n cursul invaziei, Y. pestispoate ajunge n
torentul sanguin i infecia se poate generaliza. Pesta bubonic poate
produce leziuni hemoragice i necrotice n toate organele; n lipsa
tratamentului, letalitatea este de 50%.
Propagarea infeciei n cazul pestei pneumonice primare (forma
pulmonar) se face rapid, de la om la om, prin inhalarea particulelor
ncrcate cu germeni, fr s se mai treac prin stadiul de bubon. Se
manifest prin pneumonie hemoragic, septicemie, decesul survine n
mai putin de 24 de ore dup instalarea simptomelor clinice, la 90%
dintre pacienii netratai.
Y. pseudotuberculosis include cel puin 6 serotipuri, dar cel mai
frecvent implicat n infeciile umane este serotipul 1. n organismul
uman ptrunde pe cale digestiv, originea contaminrii fiind probabil
alimentar. Microorganismele penetreaz epiteliul poriunii terminale a
ileonului, ajung n ganglionii limfatici ai regiunii ileo-cecale, unde
produc o adenit reticular, nsoit de leziuni asemntoare
tuberculozei intestinale. Foarte rar, se ntlnete septicemie la pacienii
imunocompromii (cirotici si diabetici).
Y. enterocolitica cuprinde mai mult de 50 de serotipuri, cele mai
multe izolate la oameni bolnavi. Infecia oral cu serotipurile patogene
pentru om ale speciei Y. enterocolitica se poate manifesta clinic prin
mai multe tipuri de patologie; transmiterea are loc probabil prin
contaminarea apei i a alimentelor. Enteritele provocate de aceast
specie se manifest cu diaree, frecvent acompaniat de subfebrilitate i
dureri abdominale. Poate determina infecii cu caracter invaziv
localizate pe ileonul terminal cu prinderea ganglionilor mezenterici i
apariia unui sindrom al fosei iliace drepte, n paralel cu o adenit
mezenteric asemntoare celei provocate de Y. pseudotuberculosis. La
copii, simptomatologia poate conduce la punerea eronat a
diagnosticului de apendicit acut. La aduli s-a ntlnit n declanarea
unor artrite reactive sau a unui eritem nodos cu dificulti n ceea ce
privete diagnosticul diferenial.
13. 3. Diagnosticul de laborator
Familia Enterobacteriaceae cuprinde un mare numr de genuri i
numeroase specii (peste 2400, dac sunt luate n considerare i speciile
din genul Salmonella). Familia include germeni care se pot multiplica
pe medii simple, aerobi facultativ anaerobi, utilizeaz glucoza cu sau
fr producere de gaz, oxidaz-negativi, catalaz-pozitivi. Formeaz
colonii de tip S (R n cazul culturilor vechi) sau M (pentru speciile
capsulate), pot fermenta lactoza (EX .Escherichia coli, Klebsiella spp.)
sau sunt lactoz negativi (EX . Salmonella spp.,Shigella spp.). Pentru
izolare putem folosi medii selective i selectivo-difereniale. Exist
medii cu selectivitate mai redus (EX . Mac Conkey), medii cu
selectivitate medie (EX . ADCL) i medii cu selectivitate nalt (ex.
Wilson-Blair). Caracterele biochimice sunt eseniale pentru
identificare. Studiul caracterelor Ag (prin reacii Ag-Ac) este de
asemenea foarte util (toate enterobacteriile au AgO, cele mobile au
AgH, enterobacteriile capsulate au AgK, Salmonella typhi prezint n
plus AgVi etc.).
Diagnosticul de laborator este bacteriologic, direct (exceptnd
febrele enterale n care exist i diagnostic serologic).
13. 3. 1. Diagnosticul de laborator n infeciile produse
de Escherichia coli
Diagnosticul de laborator microbiologic n infeciile cu localizare
digestiv
1. Recoltarea i transportul p.p. respect regulile cunoscute; recoltm
materii fecale, lichid de vrstur etc. Dup examinarea macroscopic,
continu examenul de laborator. Spre ex., dac infecia ar fi produs
de E. colienterohemoragic (EHEC), am putea vizualiza cele ce urmeaz.
Materiile fecale pot avea aspect hemoragic, cu lambouri de mucoas
epitelial.
2. Nu facem frotiu. Examinm ntre lam i lamel i am putea vedea
hematiilor i PMN.
3. Cultivm pe MacConkey cu D-sorbitol (EHEC nu fermenteaz
sorbitolul, sau l fermenteaz tardiv). Coloniile suspecte, sunt de tip S,
1-, necolorate (coloniile sorbitol-pozitive au o culoare roz) (Figura nr.
1).
4. Identificarea se face pe baza caracterelor:
morfotinctoriale: bacili Gram-negativi;
de cultur: colonii de tip S,cu caracterele menionate mai sus;
biochimice (se examineaz numai acolo unde sunt condiii de
biosiguran, conform unei Directive Europene): fermenteaz glucoza
(cu producere de gaz), lactoz-pozitivi, nu fermenteaz (sau
fermenteaz tardiv) sorbitolul, nu produc H2S, pot produce indol, sunt
ureaz-pozitivi, mobili (exist i tulpini imobile) etc.;
antigenice: prin reacii de aglutinare sau latex aglutinare (seruri
monovalente anti O157 i anti H7).
5. Antibiograma este recomandat pentru supravegherea apariiei
fenomenului de rezisten la antibiotice i chimioterapice; se realizeaz
prin metode difuzimetrice.
Diagnosticul n infeciile urinare
n principal se recolteaz urin. n funcie de forma clinic se poate
recolta i snge (EX . n pielonefrita acut). Pe lng regulile
cunoscute, trebuie subliniat c iniial se realizeaz toaleta local. Atunci
cnd nu se poate recolta prima urin de diminea, trebuie ateptat
pentru recoltare 3-4 ore dup miciune. Dac p.p. nu este prelucrat
imediat (n maxim 30 de minute dup recoltare), trebuie meninut la
temperatura frigiderului iar transportul trebuie realizat la +. Se
recolteaz urina din mijlocul jetului. Exist i alte tehnici de recoltare,
neinvazive sau invazive (puncie i aspiraie suprapubian, cateterizare
uretral, cu riscurile respective).
Dup examenul macroscopic (EX . urina poate fi tulbure) pregtim un
sediment urinar. Examinm preparatul ntre lam i lamel; ncercm
s stabilim numrul de bacterii pe cmp i respectiv numrul de PMN
pe cmp (dac exist leucociturie).
Pentru cultivare putem utiliza mai multe medii diferite. Este de reinut
c facem o urocultur cantitativ (trebuie s determinm numrul de
bacterii/ml de urin). De EX ., dac nsmnm 0,1 mililitri de urin
diluat (ex. 1/1.000), incubm i dup apariia coloniilor calculm
numrul de bacterii/ml nmulind nr. de colonii cu 10 i cu 1.000. Asta
nseamn c, n condiiile de mai sus, prezena a 7 colonii nseamn
70.000 bacterii/ml. (Figura nr. 2)
Ce nseamn urocultur cantitativ? Avnd n vedere cele de mai sus,
dac numrul de bacterii/ml este mai mare de 100.000, considerm
urocultura ca fiind pozitiv. Lipsa coloniilor sau un numr de maxim
10.000 bacterii/ml, semnific o urocultur negativ. ntre 10-100.000
bacterii/ml eventual repetm analiza.
Dac urocultura este pozitiv, bacteria izolat se identific pe baza
caracterelor prezentate anterior i se trateaz conform
antibiogramei.
13. 3. 2. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de
genul Klebsiella
Sunt enterobacterii imobile, nesporulate. Degradeaz glucoza este
degradat cu producere de gaz i fermenteaz lactoza. Specia tip
este Klebsiella pneumoniae (bacili Gram negativi, capsulai). Este un
microb condiionat patogen. Poate produce TIA de tip infecios,
infecii ale tractului respirator superior, infecii urinare etc, inclusiv
infecii nosocomiale.
Pentru diagnostic, lum drept exemplu situaia n cazul pneumoniei
produse de Klebsiella pneumoniae. Diagnosticul integral include
elemente clinice, paraclinice i de laborator;
diagnosticul bacteriologic permite stabilirea etiologiei i tratamentului
corespunztor.
1. Recoltarea i transportul p.p. respect regulile cunoscute
(recoltm sput). Macroscopic, poate avea un aspect mucoid, de
culoare rou nchis, n jeleu de coacze.
2. Examinm microscopic p.p. i notm prezena celulelor (EX .
macrofage alveolare), celulelor inflamatorii (PMN) i a bacililor Gram
negativi, de dimensiuni relativ mari, cu capsul (halou, vizibil).
3. Cultivm pe medii de cultur obinuite (18-24 ore, 35-37C) i
examinm coloniile izolate, pentru a ncepe identificarea. Utilizm
medii slab selective (EX . MacConkey). Klebsiella pneumoniae nu se
dezvolt pe medii nalt selective i este parial inhibat pe cele
moderat selective. K. pneumoniaeformeaz colonii lactoz-pozitive,
mari, de tip M, cu aspect de curgere pe suprafaa mediului de
cultur (tendin de confluare).
4. Identificarea microorganismului se face urmrind caracterele:
morfotinctoriale: bacili Gram-negativi, dimensiuni mari, capsulai,
dispui n lanuri scurte, perechi sau izolai; (Figura nr. 3)
de cultur: colonii lactoz pozitive, de tip M, mari (2- la 24 de ore,
peste la 48 ore), bombate, vscoase, cremoase, n pictur de miere,
care dau aspectul de curgere pe suprafaa mediului de cultur, cu
tendin la confluare(Figura nr. 4);
biochimice: glucoz pozitiv (cu producere de gaz), lactoz pozitiv,
nu produce H2S, imobil, ureaz pozitiv, indol negativ, se dezvolt
folosind citratul ca unic surs de C. (Figura nr. 5)
antigenice: utilizm seruri cu Ac cunoscui pentru identificarea
tulpinilor deKlebsiella, prin aglutinare, coaglutinare sau latex aglutinare
(n laboratoare de referin);
testarea sensibilitii la bacteriofagi etc.
5. Antibiograma este obligatorie i se realizeaz de obicei prin
metode difuzimetrice (determinarea CMI este indicat).
13. 3. 3. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de
genul Proteus
Genul Proteus este format din germeni foarte pleomorfi, foarte mobili,
Gram negativi, aerobi facultativ anaerobi, nu fermenteaz lactoza,
produc ureaz. Exist 2 specii principale, Proteus
mirabilis i Proteus vulgaris. Sunt germeni condiionat patogeni.
Pot produce TIA de tip infecios, infecii ale tractului urinar (ITU), dar
chiar i alte infecii (tegumentare, genitale, infecii nosocomiale etc).
Discutm diagnosticul de laborator al ITU.
Diagnosticul de laborator microbiologic este bacteriologic, direct.
1. Recoltarea i transportul p.p. se realizeaz aa cum am discutat
anterior. Urina poate fi tulbure, purulent. Transportul trebuie realizat
n maxim 30 minute, iar dac nu e posibil, p.p. trebuie transportat la
rece (+4C). (Figura nr. 6)
2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea
preparatului proaspt ntre lam i lamel, din sedimentul urinar. Acest
tip de examinare este foarte important (uor de realizat, ieftin, permite
observarea unor elemente utile, care orienteaz
diagnosticul). Mobilitatea poate fi evaluat. Urmrim numrul de
leucocite/cmp. (Film nr. 1)
3. Cultivm pe medii de cultur simple. Trebuie s demonstrm
prezena a peste 100.000 bacterii/ml de urin. Pe mediile simple
uzuale, nu se pot obine colonii izolate; apare fenomenul de
invazie.
4. Identificarea microorganismului se va realiza pe baza mai multor
caractere:
morfotinctoriale: bacili Gram-negativi, cu polimorfism (bacili,
cocobacili, forme filamentoase de peste 30 m); (Figura nr. 7)
de cultur:
Fenomenul de invazie (dac nsmnm o tulpin la periferia unei
plci Petri cu mediu simplu, cultura se dezvolt n valuri concentrice,
pe toat suprafaa mediului) (Figura nr. 8),
Pe anumite medii selective (cu sruri biliare), invazia este inhibat i
se obin colonii izolate, de tip S, lactoz negative,
Fenomenul liniei de demarcaie (dac pe o plac cu mediu solid
cultivm 2 tulpini diferite, n 2 puncte opuse, tulpinile se vor dezvolta
invadnd pn n apropierea liniei de ntlnire, unde se va crea o linie
de demarcaie ntre cele 2 tulpini) (Figura nr. 9);
Fenomenul de crare;
Caractere biochimice: sunt microorganisme lactozo negative (alte
caractere biochimice se pot studia pe mediile multi test, TSI, MIU etc.),
glucoz pozitive, produc H2S, mobile, ureaz pozitive, se pot dezvolta
folosind citratul ca unic surs de carbon; (Figura nr. 10)
Caractere antigenice;
5. Antibiograma este obligatorie i se realizeaz de obicei prin
metode difuzimetrice.
13. 3. 4. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de
genulSalmonella.
Genul Salmonella include bacili Gram negativi, mobili cu cili peritrichi,
necapsulai, nesporulai, nu fermenteaz lactoza, produc H2S, utilizeaz
citratul ca unic surs de carbon.
Pot produce salmoneloze minore (EX . TIA) i salmoneloze majore (ex.
febra tifoid). n cazul TIA/enterocolitelor, diagnosticul de laborator
estebacteriologic, direct. n cazul afeciunilor sistemice, diagnosticul
poate fibacteriologic i serologic.
13. 3. 4. 1. Diagnosticul de laborator n infeciile cu localizare digestiv
1. Recoltarea i transportul p.p. (EX . materii fecale) respect regulile
cunoscute.
2. Examinm microscopic p.p., ntre lam i lamel (remarcm prezena
granulocitelor). (Figura nr. 11)
3. Cultivm pe urmtoarele medii de cultur: un mediu lichid de
mbogire (bulion selenit) i dou medii selectivo-difereniale
(MacConkey i ADCL). Dup 18-24 ore la 35-37C, pe mediile solide
pot aprea colonii bacteriene suspecte (lactoz-negative) din care
obinem cultura pur. Cultura de 18-24 ore din bulion selenit o
repicm pe medii solide. (Figura nr. 12)
4. Identificm microorganismului pe baza mai multor caractere:
morfotinctoriale: sunt bacili Gram-negativi;
de cultur: produc colonii de tip S, lactoz-negative (necolorate pe
MacConkey; necolorate, cu centrul negru pe ADCL) (Figura nr. 13);
biochimice: fermenteaz glucoza (cu producere de gaz), sunt
lactoz-negativi, produc H2S i utilizeaz citratul ca unic surs de
carbon; (Figura nr. 14)
antigenice: utilizm seruri imune cu Ac anti-O i ulterior Ac anti-H
(reacii de aglutinare pe lam, respectnd protocolul de lucru);
sensibilitatea la bacteriofagi.
5. Antibiograma este recomandat n cazul pacienilor foarte n vrst,
sau n cazul copiilor foarte mici, prematuri, cu alte boli adugate i
pentru supravegherea apariiei fenomenului de rezisten la antibiotice
i chimioterapice.
13. 3. 4. 2. Diagnosticul de laborator n febrele enterale (EX . febra
tifoid)
Diagnosticul cert este reprezentat de izolarea i identificarea S.
typhi din p.p.
Diagnosticul bacteriologic, direct respect etapele prezentate
anterior.
n prima sptmn de boal, p.p. e reprezentat de snge; ulterior
putem recolta materii fecale, urin, lichid biliar, mduv hematogen
etc. Dac p.p. este reprezentat de materii fecale, respectm ceea ce
am prezentat mai sus (exist i particulariti). Coloniile de S. typhi pot
s nu prezinte centrul de culoare neagr pe ADCL. S. typhi nu produce
gaz din glucoz iar H2S este n cantitate mic. Nu folosete citratul ca
unic surs de carbon. Pentru identificarea AgO este necesar o
inactivare prealabil (termic). Prezena AgVi poate crea probleme n
identificarea AgO. Lizotipia poate fi foarte util. Testarea sensibilitii la
antibiotice i chimioterapice este indicat n toate infeciile produse
de S. typhi.
Diagnosticul serologic: se realizeaz respectnd principiile generale.
Serodiagnosticul Widal (folosind culturi vii) nu se mai practic astzi.
Tehnica actual poart numele de analiz seric
cantitativ (aglutinare n tuburi). Utilizm serii de tuburi (cte o serie
pentru fiecare Ag cunoscut folosit). Utilizm 6 serii de tuburi pentru a
evidenia Ac anti-O (TO - S. typhi, AO - S. paratyphi A, BO - S.
paratyphi B), i anti-H (d - S. typhi, a - S. paratyphi A, b - S.
paratyphi B). Pregtim diluiile, incubm pentru Ac anti-O timp de 18-
20 ore la 52C i 10 minute la temperatura camerei iar pentru Ac anti-
H timp de 2 ore la 52 C i 10 minute la temperatura camerei. Apoi
citim reacia. Un titru de 1/250 n cazul Ac anti-O i respectiv 1/2.500 n
cazul Ac anti-H este sugestiv. Creterea de 4 ori a titrului, la 2
determinri succesive confirm diagnosticul.
n cazul convalescenilor i purttorilor este recomandat reacia de
aglutinare n tuburi pentru identificarea prezenei i titrului Ac anti-Vi
(titru mai mare de 1/40).
13. 3. 5. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de
genul Shigella
n genul Shigella exist 4 subgrupe: A. Shigella dysenteriae (13
serotipuri), B. S. flexneri (6 serotipuri), C. S. boydii (18 serotipuri) i D. S.
sonnei (1 serotip cu 2 faze, R i S). Sunt bacili gram negativi, imobili,
nesporulai, necapsulai, aerobi facultativ anaerobi, glucoz pozitivi
(fr producere de gaz), oxidaz negativi, lactoz negativi. Subgrupele
se pot diferenia, de EX . pe baza fermentrii manitei (subgrupul A
este manit negativ).
Produc infecii la nivelul tractului intestinal. Dizenteria poate aprea
dup ingestia a numai 10-100 bacterii. Shigella spp. poate produce i
toxiinfecii alimentare de tip infecios.
Diagnosticul de laborator este bacteriologic (direct) i trebuie
pus rapid.
1. Recoltarea i transportul p.p. (materii fecale) respect regulile
cunoscute. Macroscopic, m.f. pot fi n cantitate mic (mucus, puroi,
snge). Transportul trebuie s fie realizat rapid (recomand
nsmnarea la patul bolnavului; altfel, trebuie s folosim mediul de
transport, EX . Cary-Blair). Recoltarea se poate face i cu ajutorul
sondei Nelaton, din colonul sigmoid.
2. Examinarea microscopic a p.p. este foarte important. Poate oferi
un rspuns concret, rapid, util. Examinm preparatul ntre lam i
lamel, iniial cu obiectivul 40. Dac evideniem numeroase PMN,
mecanismul producerii bolii este de tip invaziv, iar dac remarcm un
procent de peste 75% PMN, alturi de hematii, acest aspect este
sugestiv pentru dizenteria bacterian. (Figura nr. 15)
3. Cultivm pe medii slab i moderat selective. Dac apar colonii
lactoz negative, repicm pe medii multitest (TSI, MIU, MILF).
4. Identificarea microorganismului se realizeaz pe baza mai multor
caractere:
Caractere morfotinctoriale: sunt bacili Gram-negativi;
Caractere de cultur: produc colonii de tip S, lactoz negative, 1-
(Figura nr. 16);
Caractere biochimice: sunt glucoz pozitivi, fr producere de gaz,
lactoz negativi, nu produc H2S, imobili, ureaz negativi, indol
negativi; (Figura nr. 17)
Caractere antigenice: utilizm seruri imune polivalente anti-subgrup
sau seruri imune specifice de tip (reacii de aglutinare pe lam,
conform schemelor de lucru);
Testarea sensibilitii la bacteriofagi (lizotipia) poate fi utilizat n
scop epidemiologic.
5. Antibiograma este recomandat. Se realizeaz prin metoda
difuzimetric standardizat att n special n scopul supravegherii
apariiei unor tulpini rezistente ct i pentru stabilirea tratamentului
antimicrobian corespunztor.
13. 3. 6. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de
genul Yersinia
Genul Yersinia include mai multe specii. Infecii umane pot
produce Yersinia pestis (cium), Y. pseudotuberculosis i Y.
enterocolitica. Sunt bacili sau cocobacili Gram negativi, colorai bipolar.
Prezint pleomorfism. Cresc pe medii simple.
Yersiniozele cu poart de intrare digestiv pot avea drept ageni
etiologici Y. enterocolitica sau Y. pseudotuberculosis. Diagnosticul de
laborator n yersiniozele cu poart de intrare digestiv
este bacteriologic, direct. Pentru manifestri extra-digestive se poate
face i diagnostic serologic.
Diagnosticul bacteriologic
1. Recoltarea i transportul p.p. (materii fecale), se face conform
regulilor prezentate anterior. Se poate folosi mediul de transport Cary-
Blair.
2. Examinarea microscopic a p.p. include realizarea unui preparat
ntre lam i lamel. Vom evidenia prezena celulelor inflamatorii.
3. Cultivm pe medii selective clasice (MacConkey, ADCL) sau mediul
CIN (cefsulodin, irgasan, novobiocin). Incubm i la temperatura
camerei (20-30C).
4. Identificm pe baza caracterelor:
morfotinctoriale: cocobacili sau bacili Gram-negativi,
pleomorfi (Figura nr. 18);
de cultur: produc colonii de tip S, 1-1,5 mm (2-3 mm dup 48 ore);
biochimice: fermenteaz glucoza fr producere de gaz, nu
fermenteaz lactoza, nu produc H2S, sunt imobile la 37C i mobile la
22 C, nu produc indol, produc ureaz;
antigenice: utilizm seruri specifice anti-Yersinia (reacii de
aglutinare pe lam).
5. Se recomand realizarea antibiogramei, prin metoda
difuzimetric standardizat.
Diagnosticul serologic
Diagnosticul serologic poate fi util n determinarea etiologiei artritelor
reactive, eritemului nodos sau n cazul altor manifestri extra-
intestinale. Anticorpii apar la circa 4-7 zile de la debutul bolii, ating
valoarea maxim dup circa 14 zile i persist cteva luni. Se pot
practica diferite tehnici, de EX . reacia de aglutinare n tuburi.
Un titru mai mare de 1/160 poate avea semnificaie. Se recomand
testarea n dinamic.
Trebuie s fie luat n considerare posibilitatea apariia unor reacii
ncruciate, datorit existenei unor Ag asemntoare la
microorganisme din genurileBrucella sau Salmonella.
13. 4. Direcii de cercetare
Chiar dac nu toate noiunile prezentate n manualele de specialitate
trebuie nvate ca atare, n dezvoltarea pe parcursul activitilor
universitare considerm c este necesar ca cititorii s citeasc mai
mult, pentru o ct mai bun informare. Ca atare, recomandm cteva
link-uri corespunztoare unor articole care pot fi studiate folosindu-se
resursele World Wide Web.
1. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24072767
2. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24661557
3. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24400226
4. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24429069
5. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24595804
6. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24630581
7. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24588391
13. 5. Povestire adevrat
Copil n vrst de 4 ani, de sex masculin, din mediul urban se
interneaz ntr-o secie de pediatrie cu febr, tuse seac, fatigabilitate,
inapeten, disfagie, dureri abdominale. n urm cu 10 zile, prezint
semnele unei angine acute eritematoase, cu febr , care nu se remite n
urmtoarele zile sub tratament antipiretic. Pe parcursul internrii
primete tratament antibiotic i simptomatic, durerea abdomnial
devine mai accentuat, apar scaune apoase, fetide. Se efectueaz
coprocultur.
Se decide transferul pacientului ntr-o secie de boli infecioase. Starea
general rmne deteriorat, facies palid, ncercnat, tegumente
palide, limb sabural cu descuamare la vrf, adenopatie
laterocervical, subangulo-mandibular; sistemul muscular hipoton,
hipokinetic; abdomen sensibil la palpare periombilical i n hipogastru;
tranzit intestinal accelerat. Din analize se evideniaz uoar anemie,
iar ecografia abdominal arat hepatomegalie. Se comunic i
rezultatul coproculturii recoltate: Salmonella gr. B, rezistent la
ampicilin, sensibil la cotrimoxazol, acid nalidixic, ciprofloxacin.
Diagnostic pozitiv: gastroenterit acut cu Salmonella gr. B, form
clinic medie; angina acut eritematoas, tulburri hidrice i
hidroelectrolitice. S-a instituit tratament cu ciprofloxacin; starea
pacientului s-a ameliorat.
Discuii
n cazul unei enterocolite la copiii sub 10 ani, simptomele sunt mai
severe. Astfel, chiar dac enterocolitele salmonelozice sunt de obicei
autolimitante i nu se trateaz cu antibiotice (existnd riscul de a
prelungi portajul i perioada n care pacientul va continua s excrete
salmonele), n aceast situaie (avndu-se n vedere i starea clinic) s-
au administrat pentru a evita apariia unor complicaii.
13. 6. De reinut
Familia Enterobacteriaceae reprezint cea mai larg reprezentat
optic
n anumite situaii reechilibrarea hidroelectrolitic este suficient
17. 2. Introducere
17. 2. 1. Clasificare
Bacteriile spiralate studiate fac parte din ordinul Spirochaetales,
submprit n familia Spirochaetaceae (genurile Treponema i Borrelia)
i familiaLeptospiraceae (genul Leptospira). Specia Treponema
pallidum, cu alte patru subspecii care pot produce infecii la om, este
clasificat n cadrul genuluiTreponema.
17. 2. 2. Cale de transmitere
Infecia cu Treponema pallidum subspecia pallidum determin
afeciunea denumit sifilis (lues); este transmis n aproximativ 90% din
cazuri pe cale sexual. Din acest motiv, atunci cnd consultm un
pacient suferind de sifilis, este esenial s efectum o anamnez
detaliat cu privire la contactele sexuale neprotejate, n vederea
depistrii partenerilor potenial infectai. Nu arareori, la aceste
persoane sunt decelate simultan multiple infecii transmise pe cale
sexual (ITS), un caz aparte fiind acela al asocierii infeciei HIV, care prin
imunosupresie poate determina o evoluie nefavorabil a luesului.
Sifilisul dobndit poate evolua n mai multe stadii clinico-biologice:
primar, secundar, latent i teriar, cu afectarea mucoaselor, a esutului
cutanat, iar n formele mai severe cu afectarea organelor interne, a
sistemului osteoarticular, nervos, cardiac.
Atunci cnd o femeie nsrcinat sufer de lues, bacteria poate s
depeasc bariera placentar determinnd avort spontan sau sifilis
congenital, cu posibilitatea unor malformaii fetale invalidante.
17. 2. 3. Tablou clinic
Dup aproximativ 3 sptmni de la contactul sexual infectant (uneori
fiind posibil totui o perioad de laten prelungit, de pn la 10
sptmni), la locul inoculrii se formeaz ancrul dur, o ulceraie cu
centrul i marginile de consisten ferm, ce exsudeaz un lichid clar,
foarte bogat n treponeme (Figura nr. 1). Aceast leziune este nsoit
de adenopatie regional. N.B.: orice ulceraie a mucoaselor bucal,
faringian, genital sau anorectal oblig la testarea serologic pentru
sifilis.
Dup alte 6 sptmni apar leziunile secundare sub forma unei
erupii maculopapulare roiatice, localizate la orice nivel (Figura nr. 2),
dar i condiloame mai frecvent n regiunea anogenital (Figura nr. 3).
n stadiile primar i secundar leziunile sunt foarte contagioase, fiind
bogate n spirochete.
n sifilisul teriar (nu foarte des ntlnit n practica actual datorit
tratamentului curativ larg rspndit cu penicilin - terapie de elecie),
pacientul poate s dezvolte complicaii neurologice, cardio-vasculare,
osteo-articulare etc.
N.B.: sifilisul este considerat marele imitator, tabloul clinic putnd fi
adeseori atipic, similar diferitor afeciuni dermatologice.
17. 6. De reinut
La un pacient diagnosticat cu sifilis este obligatorie testarea
Trahom
Conjunctivit
Pneumonie interstiial
Limfogranulomatoz
Traheobronit
18. 2. Introducere
18. 2. 1. Clasificare
Bacilii Gram negativi studiai n acest capitol sunt inclui n
genurile Chlamydiai Mycoplasma. Speciile cu cea mai mare
importan a genului Chlamydia suntChlamydia trachomatic, C.
psittaci i C. pneumoniae; acestea cauzeaz infecii variate fiind
implicate n infecii cu transmitere sexual i pneumonii atipice, dar i
alte forme de patologie. Unii autori clasific C. psittaci i C.
pneumoniaen genul Chlamydophila.
n genul Mycoplasma ntlnim speciile M. pneumoniae, M.
genitalium i M. hominis. Aceste microorganisme cauzeaz, la rndul
lor, infecii variate fiind implicate n infecii cu transmitere sexual
(uretrite non-gonococice), pneumonii atipice, dar i pielonefrit, febr
post-partum sau infecii sistemice (n special la pacienii
imunodeprimai).
18. 2. 2. Fiziologie i cale de transmitere
18. 2. 2. 1. Genul Chlamydia
Microorganismele din genul Chlamydophila prezint un ciclu de
dezvoltare particular. Aceste microorganisme sunt parazite, folosind
ATP din celulelei eucariote infectate. Astfel, replicarea lor are lor doar
intracelular. n mediul extracelular, aceste bacterii exist sub forme
numite corpusculi elementari (CE), asemntoare cu sporii bacterieni,
inactive metabolic, dar cu infeciozitate pstrat. CE sunt endocitai de
celulele eucariote i se reorganizeaz sub formele metabolic-active,
non-infecioase, capabile de replicare, numite corpusculi reticulai
(CR).
C. pneumoniae i C. psittaci se transmit aerogen, fiind o cauz de
pneumonie bacterian interstiil (numit i atipic). C.
trachomatis este responsabil de boli oftalmologice i boli cu
transmitere sexual. Acestea sunt transmise princontact direct, prin
fluide biologice sau prin vectori.
Pe baza proteinelor din structura sa, microorganismul se poate mpri
n multiple serogrupuri.
18. 2. 2. 2. Genul Mycoplasma
Microorganismele din genul Mycoplasma sunt cele mai mici
organisme carepot s supravieuiasc de sine stttoare n natur, fr
nevoia de a parazita o celul gazd. Spre deosebire de celelalte
microorganisme, acestea nu au perete celular i prezint steroli n
membran. Sunt microorganisme pleomorfe ce prezint forme
cocoidale sau bacilare (dimensiuni de la 0.1 0.2 m la 1 2 m).
Timpul de generaie a acestor microorganisme este de 6 ore, aa nct
culturile se dezvolt greu, necesitnd tehnici speciale de examinare i o
compoziie special a mediilor de cultur.
Calea de transmitere a M. pneumoniae este aerogen, n cursul
episoadelor de tuse. M. genitalium i M. hominis, sunt transmise prin
contact direct.