Citologie Animala LP nr.

Obinerea omogenatelor celulare i

fracionarea lor prin centrifugare
n Biologia Celular prin metode de omogenizare se neleg
metodele de disociere a celulelor n elementele lor
componente.

Omogenizarea esuturilor i celulelor - orice tehnic de

omogenizare trebuie s acioneze asupra celulelor ntr-o
manier care s provoace ruperea suprafeei celulare i
s elibereze citosolul i organitele.

Principalul scop este acela de a gsi condiiile n care

ruperea celulelor s se produc cu eficien maxim, dar
utiliznd un minimum de fore distructive, astfel nct s nu
provoace leziuni ale organitelor de interes i s se evite
denaturarea proteinelor.

Omogenat celular

Pentru obinere omogenatului celular se

pornete de la 2 componente:

Materialul biologic (organul, esutul sau

suspensia de celule) care este supus
omogenizrii;
Mediul de omogenizare ce reprezint soluia
apoas ce urmeaz a realiza dispersia efectiv
a elementelor subcelulare.

1
 MATERIALUL BIOLOGIC
Criterii pentru alegerea materialului biologic
S conin organitele ce urmeaz a fi investigate
n cantitate mare;
S poat fi prelucrat cu un minim de dificulti
tehnice, n condiii controlate, reproductibile, care
s evite apariia de erori;
S fie bine delimitat din punct de vedere
anatomic i relativ uor accesibil pentru a scurta
timpul de prelevare i pentru a evita pericolul
confuziei cu alte esuturi sau organe.

Omogenizator POTTER-ELVEHJEM
Omogenizatorul Potter-Elvehjem este
format din:
- piston de sticl sau teflon;
- eprubet din sticl sau teflon,
ntre care exist un spaiu foarte mic
(~0,2mm).
Pistonul este antrenat de un motor
electric pentru a efectua o micare de
rotaie (circa 1000 ture/min) i n
acelai timp se realizeaz i o
micare n sus i n jos a eprubetei ce
conine mediul de omogenizare i
esutul. Acesta din urm este forat
s treac prin spaiul dintre piston i
peretele interior al eprubetei, spaiu
n care se dezvolt fore de forfecare
extrem de mari, ce produc la nceput
mrunirea esutului i apoi ruperea
membranelor celulare.

2
 Omogenizarea cu ajutorul
omogenizatorului cu cuite (blender)
se utilizeaz pentru prelucrarea esuturilor dure
(miocard, esut cartilaginos, placent, etc.); 10.000-
40.000 rotaii/minut, un interval de timp foarte scurt
(cteva secunde);

Omogenizarea prin ultrasonicare

(sonicator) se realizeaz prin aplicarea de
ultrasunete (18-50 kHz) ce conduce la producerea
local a unor presiuni de ordinul miilor
de atmosfere adecvat pentru
omogenizarea organismelor
unicelulare (drojdii).

MEDIUL n care se realizeaz omogenizarea

Meninerea unor condiii ct mai apropiate mediului intern
al organismului (soluii tampon, ageni osmotici).
Limitarea, pe ct posibil, a aciunii enzimelor autolitice,
pentru a reduce gradul n care acestea afecteaz structura i
funcionalitatea particulelor subcelulare (substane cu efect
de complexare a ionilor divaleni, inhibitori ai proteazelor
intracelulare).

RAPORTUL DE OMOGENIZARE
n mod tradiional, se folosete un raport de omogenizare
1:10 (g/v) ntre cantitatea de esut i volumul de mediu de
omogenizare utilizat (soluia apoas), ns este posibil
varierea acestui raport n funcie de necesiti.

3
Centrifugarea: este cea mai comod i mai
frecvent utilizat metod de fracionare a omogenatelor
celulare.

Prin rotirea centrifugii cu viteza unghiular ,

se constat c se produce o deplasare a unei
particule, cu o vitez dat de expresia:

dx (V p V m ) x
2

v
dt Ff

Relaia lui Svedberg

2 R 2 ( p m) 2 x
v
9

Din relaia lui Svedberg se deduce c diferena

de densitate dintre mediu i particul decide
direcia deplasrii particulei, iar viteza
deplasrii acesteia depinde preponderent de
dimensiunea sa.

4
 Coeficientul de sedimentare
Coeficientul de sedimentare al unei particule S
reprezint viteza de sedimentare a unei particule
ntr-un cmp centrifugal de valoare unitar (2x =1).
Coeficientul de sedimentare depinde exclusiv de
mediul de centrifugare i de caracteristicile particulei
i are drept unitate de msur svedbergul [S].

2R2 ( p m )
v
S 2
x 9

Acceleraia centrifugal creia i este supus o particul depinde de

parametrii funcionali ai aparatului n care se realizeaz procesul:
raza rotorului = r;
viteza de rotire =
fiind posibil utilizarea unor combinaii diferite ale celor 2 parametri
pentru generarea unei valori unice a acceleraiei centrifugale (2r). Pentru
a se descrie n mod univoc condiiile de centrifugare, se obinuiete s se
specifice acceleraia centrifugal sub forma de multiplii de g (acceleraia
gravitaional - 9,81 m/s2).

Exista 2 tipuri de conditii de realizare a separarii centifugale a

particulelor dintr-un omogenat celular:
- separarea lor in functie de dimensiune si forma, mediul
in care sunt suspendate avand densitatea mai mica decat a lor si constanta
in tot tubul de centrifuga, situatie denumita centrifugare diferentiala (se
realizeaza prin aplicarea unor campuri gravitationale succesiv
crescatoare);
- separarea pe baza diferentelor de densitate, intr-un
mediu a carui densitate variaza continuu sau in trepte de-a lungul tubului
de centrifuga spre valori din ce in ce mai mari, fiecare particula
deplasandu-se pana in zona de izodensitate, unde se stabilizeaza, ceea ce
corespunde centrifugarii izopicnice, denumita si centrifugare in
gradient de densitate.

5
Schema de fracionare celular prin
centrifugare diferenial

Centifugarea n
gradient de densitate