Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
SubiecteLP Rezolvate PDF
SubiecteLP Rezolvate PDF
1
Microbiologie
Tehnica de lucru – Frotiul uscat si fixat la caldura se acopera cu fucsina fenicata Ziehl 1%, timp de 10
minute. In acest interval de timp, se incalzeste dosul lamei cu flacara becului Bunsen pana la emisia de
vapori (nu se fierbe!!!), de 3 ori. Daca se evapora fucsina, se poate completa. Apoi se raceste lama la
temperatura camerei. Dupa racire se spala cu apa de la robinet, se decoloreaza cu amestec acid-alcool
timp de 2-3 minute si se recoloreaza din nou prin acoperirea frotiului cu albastru de metilen 1%, timp de
1 minut. Ulterior lama se spala inca o data cu apa de la robinet, se usuca si se examineaza la microscopul
optic, utilizand obiectivul cu imersie.
Interpretare – Bacilii acido- alcoolo- rezistenti (BAAR) apar rosii pe fondul albastru. Ceilalti germeni si
elementele tisulere (celule epiteliale, PMN, limfocite, fibrina) apar colorate in albastru. La un frotiu din
sputa unui pacient cu tuberculoza bacilii sunt dispusi in funie rasucita, datorita unui factor de virulenta
numit cord-factor.
In ambele cazuri, urmatoare etapa este de dispersie a produsului patologic. Cu ansa incarcata se traseaza
pe suprafata mediului striuri ce apar sub forma unui poligon neinchis cu 5-6 laturi. Dupa descarcarea
fiecarei laturi, ansa se sterilizeaza prin incalzire pana la incandescenta si se incarca din nou cu produs. In
locul ultimei laturi, se traseaza linii in zig-zag de la marginea placii Petri spre centru, cu scopul de a se
obtine in aceasta zona colonii izolate. Ulterior, in functie de aspectul coloniei izolate se pot observa
caracterele de cultura ale speciei respective, inclusiv daca este virulenta sau nu.
2
Microbiologie
Medii multitest:
TSI (three sugars and iron) – Panta contine lactoza si sucroza. Fermentarea unuia dintre aceste
doua zaharuri (de obicei lactoza) determina virarea culorii din rosu in galben, datorita acidifierii
mediului. Coloana contine glucoza si tiosulfat de sodiu ca sursa de sulf. Fermentarea glucozei
determina producerea de CO2, ce se evidentiaza sub forma bulelor, iar producerea de H2S
determina virarea culorii coloanei spre negru.
MIU (mobilitate, indol, uree) – Dupa o perioada de incubare de 24 ore, turbiditate in jurul liniei
de intepare indica mobilitatea speciei bacteriene respective. Producerea ureazei, ce descompune
ureea, determina virarea culorii mediului din galben in rosu-violet. Productia de indol poate fi
pusa in evidenta utilizand cateva picaturi de reactiv Kovacs sau o hartie de filtru imbibata cu
acesta si plasata in eprubeta. Aparitia culorii violet pe hartia de filtru sau sub forma unui inel la
suprafata mediului este un rezultat pozitiv.
Mediu diferential Simmons Citrate – Contine citrat si ioni de amoniu. Bacteriile capabile de a utiliza
citratul ca unica sursa de carbon si ionii de amoniu ca unica sursa de azot determina alcalinizarea
mediului, cu virarea culorii de la verde la albastru.
Mediu diferential AABTL (albastru de brom timol si lactoza) – Fermentarea lactozei determina acidifierea
mediului si virarea culorii de la albastru la galben.
Colonii tip S (smooth) – rotunde, bombate, lucioase, cu suprafata neteda si marginile regulate.
Sunt caracteristice bacteriilor patogene.
Colonii tip R (rough) – plate, uscate, cu suprafata rugoasa si marginile neregulate, aderente de
mediu, aglutineaza spontan. Sunt caracteristice pentru germeni degradati, cu modificari
antigenice, de virulenta. Exista trei specii bacteriene care fac exceptie, crescand sub forma de
3
Microbiologie
Tot pe medii solide se poate observa fenomenul de invazie – cresterea se exprima printr-un strat
continuu, sub forma unor valuri succesive. Fenomen este caracteristic pentru Proteus spp.
4
Microbiologie
Interpretare – Reactia negativa este data de prezenta hemolizei, indicand absenta anticorpilor ASLO,
astfel ca ciclul litic al SL O asupra hematiilor nu este anihilata. Reactia pozitiva este evidentiata prin
absenta hemolizei si indica prezenta anticorpilor ASLO (se formeaza butoni de hematii). Ultima eprubeta
unde nu apare hemoliza indica prezenta anticorpilor ASLO. Normal trebuie sa fie mai mic de 200 U ASLO.
ASLO se foloseste pentru diagnostic si pentru monitorizarea tratamentului. Majoritatea bolnavilor
prezinta o crestere a tritrului antristreptolizinei O (ASLO), iar reactia de punere in evidenta este ASLO.
Titrurile de pana la 200 de U ASLO/mL de ser sunt considerate normale. Valoarea crescuta a ASLO se
mentine in mod normal 3-5 saptamani de la debutul infectiei streptococice. Persistenta anticorpilor in
titruri inalte timp indelungat sugereaza hipersensibilitate la antigenele streptococice, urmata de
instalarea complicatiilor poststreptococice.
Titrurile normale ASLO se situează între 166-200 u/ml. Ele variaza in functie de varsta, arie geografica,
sezon. Astfel, sub varsta de 14 luni o infectie streptococica nu determina cresterea ASLO, iar sub 2 ani
cresterile raman nesemnificative. In infectiile cutanate titrul ASLO este normal.
Metoda – Pe o lama de sticla curata si degresata se pune o picatura de solutie ce contin anticorpi
specifici genului sau speciei a carui prezenta se doreste evidentiata. Pe urma se preleva cu ansa
bacteriologica dintr-o colonie izolata, suspecta de a fi microorganismul in cauza, si se depune in picatura
5
Microbiologie
de solutie, dupa care se amesteca usor. Lama se roteste de cateva ori, pentru a facilita amestecarea.
Dupa un minut se observa si se interpreteaza rezultatul.
Interpretare – Testul pozitiv este dat de aglutinare evidenta (formarea de grunji in suspensie clara) in
intervalul de 1 minut. Lipsa aglutinarii reprezinta testul negativ.
Salmonella – Identificarea se face in functie de antigenul somatic O, alcatuit din fractiuni antigenice. Prin
studiile de cross-absorbtie s-au individualizat 67 de structuri antigenice diferite care sunt folosite pentru
identificare serologica. Microorganismele din genul Salmonella prezinta si antigene flagelare H, proteine
labile termic situate la nivelul cililor. Se cunosc peste 50 de antigene H care pot de asemenea sa fie
subtipate ca antigene partiale. Asadar, exista peste 2300 serotipuri diferentiate pe baza antigenelor
somatice O şi flagelare H.Deoarece unele serotipuri de Salmonella pot trece de la fenotipuri mobile la
fenotipuri imobile, acestea pot exprima antigene H diferite. In functie de aceste doua tipuri de antigene a
fost creat sistemul de clasificare Kaufman and White.
Shigella – Antigenul somatic O sta la baza impartirii îin 4 grupe antigenice si subdiviziunii acestora în
serotipuri:
Astfel, in cadrul reactiei de aglutinare pe lama pentru identificarea serotipului de Shigella, se utilizeaza
initial seruri polivalente, pentru identificarea grupului, apoi seruri monovalente, pentru identificarea
serotipului din cadrul grupului.
Metoda – Intr-o cutie Petri ce contine un mediu simplu se asaza o hartie de filtru imbibata in solutie ce
contina anticorpi antitoxina difterica. Dupa doua ore, timp in care anticorpii difuzeaza in mediu, se
insamanteaza in mediu, perpendicular pe hartia de filtru, o tulpina de C.d. toxigena, ce serveste drept
martor pozitiv, una de C.d. netoxigena, ca martor negativ, si tulpina de cercetat, formandu-se astfel o
serie de striuri perpendiculare pe hartia de filtru. Placa Petri se incubeaza la 37oC timp de 48 ore si se
urmareste zilnic aparitia precipitatului. De-a lungul liniilor de insamantare apare cultura bacteriana.
Interpretare – Din cultura de C.d. toxigena, toxina difterica difuzeaza in mediu. Unirea dintre antigen si
anticorp duce la formarea unor complexe Ag-Ac care precipita, iar in mediu vor aparea linii de precipitare
in unghiurile dintre cultura si hartia de filtru. In cazul in care apar linii de precipitare in unghiurile dintre
cultura de cercetat si hartia de filtru, respectiva tulpina este toxigena. Reactia va fi negativa pentru
martorul negativ si tulpinile de cerecetat netoxigene.
6
Microbiologie
Tehnica – Serul de cercetat se va mentine 30 minute la 56°C, pentru inactivarea complementului propriu.
Reactia de fixare a complementului are loc in 2 etape:
In prima etapa se pun in reactie complementul, serul de cercetat si antigenul cunoscut. Exista
doua posibilitati:
o In serul de cercetat exista anticorpi specifici, rezultand un complex Ag-Ac pe care se va
fixa complementul
o In serul de cercetat nu exista anticorpi specifici, nu se formeaza complexul Ag-Ac, iar
complementul ramane liber
In a doua etapa se introduce in reactie sistemul hemolitic indicator (format din hematii si
anticorpi anti-hematie). Din nou, exista 2 rezultate posibilite:
o Complementul nu este liber, nu are loc hemoliza
o Complementul se fixeaza pe sistemul hemolitic, lizeaza hematiile si observam aparitia
hemolizei
Interpretare – Initial se verifica rezultatele aparute pentru martori. In tubul martor pentru complement
trebuie sa fie hemoliza, la fel ca si in tubul martor pentru ser sigur negativ. In tuburile martor sigur
pozitiv si martor pentru sistemul hemolitic, nu trebuie sa fie hemoliza.
In tuburile cu serul de cercetat, daca apare hemoliza, inseamna ca nu exista Ac iar testul este negativ
(lichidul din tub va avea un aspect rosu, limpede).
Testul este pozitiv atunci cand in tuburile cu ser de cercetat nu apare hemoliza, iar hematiile se depun
formând un “buton” in partea inferioara a tubului (in serul de cercetat exista anticorpi).
7
Microbiologie
Transport – Tamponul de exudat faringian trebuie examinat in maxim 3 ore de la recoltare. Daca nu se
poate respecta acest termen, atunci este necesara imersia si transportul tamponului in bulion de
conservare.
Insamantare – Se insamanteaza probele pe mediu cu geloza sange. Se ruleaza toate fetele tamponului
pe un cardan al placii si se epuizeaza apoi inoculul cu ansa bacteriologica in celelalte trei cadrane. Prin
inteparea mediului cu ansa la sfarsitul epuizarii fiecarui cadran se creeaza conditii microaerofile care
protejeaza de oxidare streptolizina O. Se incubeaza aerob, timp de 24 ore la 37oC, cu prelungirea
timpului la 48 ore daca la prima citire lipsesc coloniile beta hemolitice.
Insamantare – Utilizand anse din platina calibrate 0,001mL si 0,01mL, dintr-un volum foarte mic de
suspensie bacteriana, se preleva si se epuizeaza pe doua placi cu mediu agarizat (una cu fiecare ansa), in
scopul de a se dezvolta cat mai multe colonii posibil. Astfel, se poate realiza o aproximare economica si
satisfacatoare clinic a numarului de bacterii in probele de urina. Suspensia se omogenizeaza cu grija,
dupa care se imerseaza ansa si se executa cateva miscari pe verticala. Ansa se retrage cu viteza
moderata. Descarcarea anselor se face in striu pe unul din diametrele placii, dupa care se epuizeaza
imediat inoculul pe toata suprafata placii in striuri stranse perpendiculare pe striul de descarcare. Se
folosesc medii MacConckey sau geloza sange. Se incubeaza placile aerob la 37oC, iar a doua zi se numara
coloniile de la suprafata placilor.
Placa cu agar sange favorizeaza dezvoltarea unei game largi de bacterii, in special cele gram pozitive care
sunt inhibitate pe mediul slab selectiv pentru bacilli gram negative sau tulpini exigente nutritiv. Se
inregistreaza rezultatele dupa ordinul de marime al bacteriuriei.
8
Microbiologie
Izolarea unei singure bacterii, intr-un numar de peste 100.000 colonii (sau UFC – unitati formatoare de
colonii) per mL, este un rezultat pozitiv pentru o infectie a tractului urinar la barbati. La femei, aceasta
valoare are predictie pozitiva numai de 0.80, repetarea rezultatului pe a doua proba crescand predictia la
0.95.
Izolarea unei singure bacterii in numar de 10.000 UFC/mL necesita epetarea analizei pentru bacili Gram-
negativi, dar se considera pozitiv pentru levuri si stafilococi coagulazo-negativi.
Izolarea a doua sau trei bacterii in numar de peste 100.000 UFC/mL necesita repetarea analizei.
Transport – Se face in maxim o ora. Daca nu se poate respecta acest termen, se utilizeaza mediul special
de transport Cary-Blair, in care enterobacteriile patogene pot supravietui pana la 48 ore. In cazul Vibrio
Cholerae, se foloseste apa peptonata alcalina ca si mediu de transport.
Bulion selenit
MacConkey
XLD sau ADCL
Se insamanteaza intotdeauna fragmentele sugestive ale materiilor fecale, anume cele cu mucus, puroi.
Se insamanteaza initial pe bulionul selenit, mediu de imbogatire in special pentru Salmonella spp.
Eprubeta se incubeaza timp de 18-24 ore la 35-37oC, iar a doua zi se insamanteaza din bulionul selenit pe
MacConkey si ADCL.
Interpretare:
MacConkey:
o Coloniile lactozo-pozitive – 1-3 mm, roz-rosii, cu sau fara halou opalescent, de tip S sau
M (Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter)
o Coloniile lactozo negative – 1-2 mm, necolorate, transparente (Salmonella, Proteus,
Shigella)
ADCL – Majoritatea bacteriilor lactozo-pozitive sunt inhibate. Pot aparea tardiv colonii de
dimensiuni mici, rosii, de tip S. Daca se produce H2S, centrul coloniei este negru (Salmonella –
toate speciile in afara de S. typhi).
9
Microbiologie
Caractere de cultura:
Caractere biochimice:
Testul catalazei – Se efectueaza pe placa. Se pune o picatura de apa oxigenata pe placa, iar apoi
in aceasta se depune un inocul prelevat cu ansa bacteriologica dintr-o colonie izolata. Reactia
pozitiva va determina formarea de bule. Testul catalazei este folosit ca DDx intre stafilococi, care
sunt cu totii catalazo-pozitivi, si streptococi, care sunt catalazo-negativi.
Testul coagulazei – Se poate efectua in eprubeta sau pe placa. In eprubeta se pune plasma, iar
pe placa se pune o picatura de plasma. Pe urma se depune un inocul prelevat cu ansa
bacteriologica dintr-o colonie izolata. In ambele cazuri, reactia pozitiva va determina formarea
unui cheag. S. aureus este coagulazo-pozitiv si se diferentiaza de celelalte specii ale genului
Staphylococcus prin producerea unei coagulaze libere. Coagulaza este o proteina extracelulara
10
Microbiologie
Diagnostic serologic – Alfa-hemolizina (toxina α) este o proteina sintetizata si secretata de S. aureus sub
forma monomerica, ce se uneste in mediul inconjurator cu sase alti monomeri pentru a forma un
heptamer la suprafata celulelor gazda. Acest heptamer prezinta in centru un por, iar formarea mai
multor astfel de pori pe suprafata unei celule duce la moartea acesteia. Diagnosticul serologic consta in
examinarea serului extras de la pacient pentru depistarea anticorpilor anti-stafilolizine- α. Un titru mai
mare de 2 UI/mL apare in caz de infectii profunde sau cronice.
Examen microscopic – Streptococii piogeni sunt coci Gram-pozitivi sferici, dispusi in lanturi scurte sau
perechi, imobili, capsulati si nesporulati.
Caractere de cultura – Pe geloza-sange streptococul de grup A dezvolta colonii mici (diametrul în jur de
0,5mm), transparente sau translucide, bombate, cu zona largă de hemoliză clară de tip β, ce depăseşte
de 2-4 ori diametrul coloniei. Privite la lupă, aceste colonii pot prezenta 4 aspecte. Aceste colonii pot fi
de tip M (mucoide), deoarece in cultura proaspata, S. pyogenes prezinta capsula. Sunt facultativ
anaerobi. In bulion glucozat sau bulion-ser formeaza depozit la fundul si pe peretii tubului.
Caractere biochimice:
Identificarea grupului – se face prin testul sensibilitatii la bacitracina. Este o metoda simpla, larg
utilizata, care diferentiaza streptococii de grup A, sensibili, de restul grupurilor rezistente la
bacitracina.
11
Microbiologie
Antibiograma – In cazul izolarii streptococilor de grup A, antibiograma nu este necesara, deoarece pana
in prezent nu s-au semnalat tulpini rezistente la penicilina. Pacientii alergici la penicilina pot fi tratati cu
eritromicina. După identificarea serogrupului A prin testul la bacitracina, examenul bacteriologic se
considera incheiat şi se poate elibera buletinul de analiza cu rezultatul definitiv.
Examen macroscopic – Este util in pneumonii, deoarece sputa are un aspect ruginiu caracteristic.
Examen microscopic – S. pneumoniae= coci gram pozitivi, lanceolati, dispusi in lanturi scurte sau perechi
izolate (diplo, pe ax longitudinal – aspectul caracteristic), incapsulati. Au aspect caracteristic, ca doua
flacari de lumanare care se ating cu bazele. Se observa si prezenta polimorfonuclearelor.
Caractere biochimice:
Testul la optochin – Se repica in striuri dese pe o placa cu geloza-sange cateva colonii izolate din
tulpina de cercetat. In mijlocul ariei insamantate se depune un microcomprimat de optochin. Se
incubeaza 24 ore la 37°C. Testul este pozitiv (germenii sunt sensibili la optochin) daca in jurul
microcomprimatului de optochin cultura este inhibata pe o arie de minimum 20mm. Este un test
foarte specific, care diferentiaza pneumococii (sensibili) de streptococii viridans (rezistenti la
optochin).
Biloliza (solubilizarea prin bila sau saruri biliare) – Se insamanteaza tulpina de cercetat in doua
eprubete cu bulion glucozat. A doua zi se adauga intr-o eprubeta 1 mL bila sau 1 mL saruri biliare
(dezoxicolat sau taurocolat de Na 10%), iar in cealalta eprubeta ser fiziologic (tub martor). Dupa
o ora de incubare la termostat se compara cele douaeprubete. Daca in bulion s-au dezvoltat
pneumococi, tubul in care s-au adaugat saruri biliare se va limpezi, comparativ cu martorul care
ramane opac. Bila sau sarurile biliare favorizeaza elaborarea autolizinelor, care vor determina
liza pneumococilor. ÎIn cazul streptococilor viridans, testul este negativ. Acest test se utilizeaza
12
Microbiologie
pentru a diferentia S. pneumoniae de alti streptococi α-hemolitici, care nu sunt lizati in prezenta
bilei.
Elaborarea enzimelor zaharolitice(descompunerea glucozei si inulinei) – Inulinele reprezinta un
grup de oligozaharide ce contin fructoza. Fermentarea inulinei reprezinta un caracter biochimic
important, util in diferentierea pneumococilor de Streptococcus viridans, care produce pe
geloza-sange acelasi tip de hemoliza α dar nu fermenteaza acest zahar. S. pneumoniae
fermenteaza si glucoza, aceasta fiind principala sa sursa de energie. Fermentarea zaharurilor
duce la acidifierea mediului, iar aceasta modificare de pH este de obicei evidentiata prin
utilizarea unor indicatori a caror culoare vireaza (ex.: rosu fenol -> galben).
Diagnostic serologic – Identificarea tipului serologic se poate face fie direct din produsul patologic (daca
acesta este lichid), fie din cultura de 10-14 ore in mediu lichid (dar pe medii speciale pe care
pneumococul poate sintetiza capsula).
Se utilizeaza reactia de aglutinare pe lama prin tehnica de “umflare a capsulei” (capsule swelling –
Quellung reaction). Pe o lama se pun îin contact o picatura din cultura de cercetat sau produs patologic şi
o picatura din serul specific de tip. Operatia se repeta pentru fiecare ser de tip. Apoi se adauga cate o
picatura de albastru de metilen la fiecare amestec Ag-Ac. Dupa 10 minute se examineaza la microscop,
utilizand obiectivul cu imersie. Acolo unde tipul antigenic intalneste serul omolog, se observa aglutinarea
pneumococilor si prezenta unei capsule bine delimitate, mult marita comparativ cu celelalte seruri.
Caractere de cultura – Neisseriile sunt bacterii strict aerobe. N. meningitidis este foarte fastidios – are
nevoie, in vederea izolarii, de medii de cultura imbogatite cu hemina, extract de levura si autolizat de
ficat (mediul Hyl – hemoglobin, yeast, liver) sau de medii selective (mediul Thayer-Martin – agar-chocolat
ce contine un amestec antibiotic care inhiba dezvoltarea altor microorganisme, acesta fiind compus din
vancomicina, ce omoara microorganismele gram-pozitive, colistina, ce omoara majoritatea
microorganismelor gram-negative, cu exceptia neiseriilor, si nystatin, ce omoara majoritatea levurilor).
Cresterea este influentata negativ de uscaciune si de prezenta acizilor grasi. Temperatura optima de
incubare este de 35-37°C. Atmosfera umeda suplimentată cu 3-10% CO2 este necesara cresterii.
Coloniile apar în 24-48 ore. Coloniile de meningococ sunt de tip S, cu dimensiuni de circa 1mm,
transparente, nepigmentate. Tulpinile capsulate (A, C) formează colonii de tip M (mucoide).
Caractere biochimice:
Catalazo-pozitiv
Testul oxidazei – Meningococul produce citocrom c-oxidaza, enzima ce catalizeaza transferul de
electroni de la donori precum NADH catre acceptorul final, care de obicei este oxigenul. Se
utilizeaza hartie de filtru impregnata cu un compus cu rol de indicator redox, sau o solutie ce
contin acel indicator. Compusul este incolor in stare redusa si capata o culoare albastru inchis
cand este oxidat. In cazul testului oxidazei, compusul functioneaza ca si donor de electroni, el
fiind oxidat de catre enzima elaborata de meningococ. Aparitia unei culori albastre indica o
13
Microbiologie
reactie pozitiva. In cazul testului efectuat cu solutia, se pun cateva picaturi de solutie pe o lama,
dupa care se preleva cu ansa bacteriologica dintr-o colonie izolata si se depune pe lama.
Fermentarea zaharurilor – Este utila pentru a face DDx intre N. meningitidis si n. gonorrhoeae –
meningococul fermenteaza glucoza si maltoza, gonococul doar glucoza.
Examen direct – Deoarece avem de-a face cu un bacil acido-alcoolo-rezistent, frotiul se coloreaza prin
metoda Ziehl-Neelsen. Se observa bacili fini, usor incurbati, cu dimensiuni de 2-5µm, colorati in rosu, pe
un fond albastru. Pe frotiul din cultura, tulpinile patogene se dispun in siruri paralele, alcatuind corzi,
datorita unui factor de virulenta ce leaga bacteriile intre ele, numit „cord factor”.
Caractere culturale – Se cultiva lent, intrucat timpul de generatie este de 20 ore. Este un germen aerob,
se dezvolta la 36°C si necesita medii de cultura speciale. Cel mai utilizat este mediul Loewenstein-Jensen,
care contine ou, cartof, asparagina, glicerina, saruri minerale si verde de malachit. Coloniile de M.t. pe
acest mediu sunt de tip R si au aspect conopidiform fiind uscate, zbarcite, rugoase, de culoare crem-bej.
In mediu lichid, creste sub forma unei membrane groase, cu multe pliuri, care se ridica pe peretele
flaconului de cultura.
Caractere biochimice:
14