Der Pharma Chemica,2016, 8 (16): 58-65

Implementarea unei metode spectrofotometrice cu lungime de undă

multiplă, cu calcularea matrixului pentru determinarea
acetominofenului și a cafeinei în tablete comerciale
Muchlisyam*, Tuty Roida Pardede and Kangga Sri Wilyta
Traducere: Damoc Elena, Rezident Laborator Farmaceutic, An II, Stagiul Controlul
Medicamentelor

ABSTRACT
S-a folosit o metodă spectrofotometrică cu lungime de undă multiplă pentru validarea
determinării cantitative a amestecurilor binare de acetaminofen și cafeină disponibile în
antipiretice și analgezice. Scopul cercetării este determinarea combinației de acetaminofen și
cafeină în tablete comerciale, folosind o metodă spectrofotometrică în ultraviolet, cu lungimi de
undă multiple. Determinarea conținutului într-o tabletă ce conține 600 mg paracetamol și 50 mg
cafeină se realizează în solvent 0,1 N acid clorhidric, la 6 lungimi de undă diferite: 223 nm,
243,8 nm, 254 nm, 258 nm, 262 nm și 271 nm, calculănd apoi matrixul. Rezultatele cercetării au
arătat concentrația paracetamolului încadrată în limitele 91.75% + 0.31% și a cafeinei în limitele
99.49% + 0.38%, iar procentul coeficientului de variație al acetominofenului este 0.40% și al
cafeinei 0.36%. Se poate conclude deci că această metodă spectrofotometrică este simplă,
sensibilă, prezintă acuratețe și precizie, putând fi aplicată cu succes în determinarea conținutului
acetominofenului și al cafeinei în tbletele comerciale.
Cuvinte cheie: acetaminofen, cafeina, tabletă, spectrofotometrie în ultraviolet, lungime de undă
multiplă.

INTRODUCERE
O combinație obisnuită întâlnită în tabletele analgezice este cea acetaminofen-cafeina. Acestea se
eliberează fără prescripție medicală, Folosirea acestui amestec ca analgezic și antipiretic e bine
cunoscut și stabilit în formulările farmaceutice [1]. Pentru obținerea unei mai bune eficacități
terapeutice și a unei toxicități scăzute, este important să existe un control al conținutului în
substanțe active al tabletelor farmaceutice. Acetaminofen, sau p-aminofenol, 4-
hidroxiacetanilida, este puțin solubil în apă [2]. Este metabolit al fenacetinei, analgezic cu
eficacitate antipiretică, însă nu și activitate anti-inflamatoare. Efectele analgezice pot fi
îmbunătățite până la 50% de către cafeină. Este eficient în prevenirea durerilor de cap,
migrenelor, șia altor dureri, precum cele musculare, nevrlgii, dureri de spate, încheieturi,
reumatice, generale, dueri dentare, menstruale; efectele sale antiinflamatorii sunt mult mai slabe;
are foarte puține efecte adverse [1]. Cafeina, sau 1,3,7- trimetilxantina este un stimulent al
sistemului nervos central, SNC, sin clasa metilxantinelor, utilizat în principal ca diuretic și
stimulator al sistemelor nervos central și cardiovascular [2]. Se încearcă determinarea cantitativă
a acetaminofenului și a cafeinei în soluție acida, la 245, respectiv 273 nm [2]. Totuși, prezența

Pagina 1
 Der Pharma Chemica,2016, 8 (16): 58-65

mai multore substanțe active simultan îngreunează determinarea separată a concentrației fiecărei
componente. Structura chimică a acetaminofenului, espectiv a cafeinei se prezintă în Fig. 1:

Diverse studii au mai fost efectuate anterior despre acetaminofen și cafeina, prin metode
spectrofotometrice derivative, HPLC, sau metode spectrofotometrice în UV cu
multicomponente[3,4,5].
Una din problemele principale cu care se confruntă chimiștii analiști in spectrofotometrie este
determinarea mai multor componente simultan într-un amestec, fără o separare preliminară a
acestora. Rezolvarea problemei suprapunerii spectrelor amestecurilor binare sau cu mai multe
componente este destul de dificilă [6]. Metoda spectrofotometrica în UV poate analiza de obicei
doar substanțe singulare, dat prin modificarea ușoară a metodei se pot analiza și amestecuri
multicomponente, fără o separare preliminară a componentelor. Modificarea metodei se bazează
pe principiul ecuației de regresie prin calcularea matricei.
În metoda lungimilor de undă multiple se obțin șase lungimi de undă de analiză prin
suprapunerea maximului de absorbție al spectrului fiecărui component, apoi determinarea se
bazează pe calcularea ecuația de regresie, cu ajutorul matricei. Metoda nu necesită separarea
acetominofenului de cafeină, amândouă putând fi determinate simultan[7].
Formele farmaceutice dozate, în acest caz tablete, trebuie să corespundă standardelor în vigoare
existente în farmacopee. Una din cerințe este concentrația. Conform farmacopeei Indoneziene
(2014), acetominofenul și cafeina din tablete nu trebuie să conțină mai putin de 90.0 % și mai
mult de 110.0 % decât conținutul declarat pe etichetă în substanțe active.
Metoda spectrofotometrică cu lungimi de undă multiple folosită în determinarea cantitativă a
amestecurilor de substanțe trebuie să îndeplinească cerințele de validare prin parametrii:
acuratețe și precizie, acești doi parametri fiind suficienți pentru validarea metodei [7].
Scopul acestei lucrări este dezvoltarea unei metode specrofotometrice pentru determinarea
concentrației acetominofenului și a cafeinei în tablete , folosind soluție 0,1 N HCl.

Pagina 2
 Der Pharma Chemica,2016, 8 (16): 58-65

MATERIALE ȘI METODE
Aparatură: Un spectrofotometru UV-Vizibil cu dublu fascicul model Shimadzu 1800, cu
lățimea benzii spectrale de 1 nm, acuratețea lungimii de undă 0,1 nm (la 656.1 nm D2) a fost
folosit pentru măsurarea absorbanțelor tuturor solutiilor. Spectrul obținut automat prin software-
ul UV-Probe a fost utilizat în studiu.
Materiale și reactivi: Acetaminofen și cafeină de puritate farmaceutică au fost furnizate de
Agenția de Reglementare a Alimentelor și Medicamentelor din Indonezia, HCl 0.1 N analitic.
Tableta comercială ce conținea 600 mg acetaminofen și 50 mg cafeină a fost produsă de PT
Tempo Scan Pacific.
Prepararea soluției standard: O cantitate standard (50 mg) de pudră de acetaminofen respectiv
cafeină căntărite cu precizie au fost aduse fiecare în baloane cotate volumetrice separate de 50
mL și dizolvate în HCl 0.1 N. Baloanele coate au fost aduse până la semn cu soluție HCl 0.1 N,
pentru a obține în fiecare soluție oconcentrație de 1000 µg/ml acetominofen/cafeină (soluții
standard I). Apoi, 5 mL din fiecare soluție standard I au fost introduși în alte doua baloane cotate
de 50 mL, pentru a obține concentrații de 50 µg/ml din fiecare substantă (soluții standard II).
Determinarea Maximului Spectrului de Absorbție al Acetaminofenului: Din soluția standard
II au fost luați 0.65 mL de acetominofen și aduși într-un balon cotat de 10 mL, apoi diluați cu
HCl 0.1 N. Soluția a fost adusă până la semn cu HCl 0.1 N, pentru a obține o concentrație de 6.5
µg/ml de acetaminofen. Absorbanța a fost măsurată la o lungime de undă de 200-400 nm.
Determinarea Maximului Spectrului de Absorbție al Cafeinei: Din soluția standard II au fost
luați 0.86 mL de cafeină și aduși într-un balon cotat de 10 mL, apoi diluați cu HCl 0.1 N. Soluția
a fost adusă până la semn cu HCl 0.1 N, pentru a obține o concentrație de 8.6 µg/ml de cafeină.
Absorbanța a fost măsurată la o lungime de undă de 200-400 nm.
Determinarea domeniului lungimii de unda de analizat și a spectrului de absorbție: După
determinarea absorbanțelor la 200-400 nm a soluțiilor de concentrații 6.5 µg/ml de acetaminofen,
respectiv 8.6 µg/ml de cafeină, s-au obținut și suprapus spectrele de absorbție ale componentelor.
S-au ales șase lungimi de undă din aceste spectre și s-a măsurat absorbanțele corespunzătoare
fiecărei lungimi de undă. Absorbanțele componentelor se determină prin metoda regresiei liniare
obținută din concentrațiile și absorbanțele fiecărei componente la lungimile de undă alese.
Determinarea cantitativă a amestecului binar de acetaminofen-cafeină: S-au cântărit cu
precizie 10.0 mg de substanță de referință de acetaminofen (Standard Indonezian) și s-au
introdus într-un balon cotat de 10.0 mL, apoi s-au diluat cu HCl 0.1 N, până la obținerea unei
concentrații de 6.5 ug/mL acetaminofen. Același procedeu se repetă și pentru cafeină, diluția cu
HCl 0.1 N realizându-se până la obținerea unei concentrații de 8.6 ug/mL cafeină. Se măsoară
absorbanțele soluțiilor la cele șase lungimi de undă predeterminate.
Ecuația de regresie obținută pentru soluția standard a fost: y = ax + b, unde y ete absorbanța, a
este coeficientul de regresie, x este concentrația, iar b este o constantă.

Pagina 3
 Der Pharma Chemica,2016, 8 (16): 58-65

Determinarea concentrației de Acetaminofen și Cafeină în tableta comercială: S-au cântărit

20 de tablete comerciale conținând fiecare 600 mg de actaminofen și 50 mg cafeină, apoi s-au
triturat în mojar până la obținerea unei pulberi fine, omogene. Apoi s-au cântărit echivalentul în
pudră a 10 mg acetaminofen și a cantității corespunzătoare de cafeina (s-au repetat cântăririle de
până la șase ori). S-a adus pudra cântărită într-un balon cotat de 50 mL și s-a dizolvat în HCl 0.1
N (omogenizat cu sonicatorul timp de 15 minute), apoi s-a adus balonul cotat la semn cu HCl 0.1
N, agitănd până la omogenizare. Soluția s-a filtrat, aruncând în prealabil primii 10 mL de filtrat.
Apoi, din restul de filtrat s-au pipetat 1.58 mL și s-au adus într-un balon cotat de 50 mL.
Din soluția standard de cafeină (de concentrație 100 µg/ml) s-au luat 4.3 mL (pentru a obține o
concentrație de 8.6 ug/ml cafeină în soluția preparată din tablete) și s-au adus în balonul cotat de
50 mL ce conține cei 1.58 mL de filtrat. Soluția s-a adus la semn cu HCl 0.1 N, pentru a obține
concentrații de 6.5µg/ml acetaminofen și 8.6 ug/ml cafeină. S-au măsurat apoi absorbanțele
soluției la cele 6 lungimi de undă determinate anterior. S-au facut până lașase repetiții.
Calculul concentrației de Acetaminofen și Cafeină în tableta comercială: Concentrația
fiecărei componente a amestecului a fost determinată pe baza absorbanței probei (Ac) și a
absrbanței fiecărui component la multiplele lungimi de undă rezultate din măsurători, folosind
ecuația matricei:
[c] = [[a] x [a1]]-1 x [a] x Ac]
Notă:
[c] : concentrațiile componentelor probei
[a]: absorbția matricei componentelor constituente ale amestecului
[a1]: valoarea transpunerii matricei componentelor constituente ale amestecului
[[a] X [a1]]-1: valoarea inversă a absorbției și transpunerii matricei componentelor constituente
ale amestecului
Ac : valoarea absorbției probei
REZULTATE ȘI DISCUȚII
Determinarea maximului de absorbție al spectrului
Determinarea maxmului de absorbție al spectrului acetaminofenului și cafeinei s-a efectuat la
lungimi de unda cuprinse între 200-400 nm. Rezultatele s-au obținut la lugimea de undă maximă
de 243.8 nm pentru acetaminofen (6.5 µg/ml), respectiv 271 nm pentru cafeină (8.6 µg/ml) (Fig.
4).

Pagina 4
 Der Pharma Chemica,2016, 8 (16): 58-65

Pagina 5
 Der Pharma Chemica,2016, 8 (16): 58-65

Figurile 2 și 3 arată că lungimea de undă maximă de absorbție a acetaminofenului, respectiv

cafeinei este 243 nm și 271 nm, iar conform Moffat (2011) diferențele ar trebui să se încadreze în
intervalul +2 nm fața de maxim. Această condiție este respectată, întrucât lungimea de undă
maximă de absorbție a acetaminofenului în mediu acid (A11 = 668a) este situată la 245 nm, în
vreme ce a cafeinei în mediu acid (A11 = 668a) la 273 nm [4].
Determinarea lungimilor de undă multiple pentru analiză:
În acest studiu s-au utilizat șase lungimi de undă pentru o solutie standard de acetaminofen și
cafeină realizate în șase serii de concentrații, 30 de valori fiind numărul minim de date pentru a
obține o distributie normală a populației [7]. Zona de spectru selectată din spectrul absorbției e
cea corespunzătoare unei concentrații de acetaminofen de 6,5µg / mL, respectiv unei concentrații
de cafeină de 8,6µg / mL . Cele șase lungimi de undă selectate se pot vedea în fig. 5 de mai jos:

Se poate observa în figura 5 că absorbția are loc la cele șase lungimi de undă predeterminate.
Acestea sunt: 223 nm, prima lungime de undă la care se intersectează acetaminofenul și cafeina,
de aici începând absorbția acetaminofenului; 243.8 reprezentă maximul de absorbție al
acetaminofenului, în vreme ce cafeina prezintă un declin la 254 nm; 258 nm, a doua intersecție a
acetaminofenului și a cafeinei; la 262 nm paracetamolul are un declin în absorbție, iar la 271 nm
este maximul de absorbție al cafeinei.
Determinarea spectrului de absorbție prin metoda lungimilor de undă multiple:
Valoarea absorbanței indică contributia absorbanței unei substanțe la absorbanța unui amestec la
o anumita lungime de undă. Dupa măsurarea absorbanței fiecărei soluții la diferite concentrații la
cele șase lungimi de undă (223 nm; 243,8 nm; 254 nm; 258 nm; 262 nm; 271 nm), valoarea
absorbanței se determină prin ecuația de regresie liniară analoagă ecuației din legea Beer: Y = aX
+ b, unde Y este absorbanța (A).

Pagina 6
 Der Pharma Chemica,2016, 8 (16): 58-65

Calculele datelor de absorbtie ale acetaminofenului și cafeinei pot fi observate în tabelele 1 și 2.

Valoarea absorbanței folosite (a) este valoarea absorbției acetaminofenului și cafeinei din
tabelele 1 si 2. Selecția acestei absorbanțe (a) se bazează pe valoarea coeficientului de corelație
(r). Valoarea lui r față de r tabelat la un interval de încredere de 95% este 0.8114, mai mare decât
valoarea lui r tabelat, ceea ce înseamnă că ecuația prezintă o liniaritate bună, r fiind cuprins între
-1 și 1 (-1≤ r ≤ 1) [10]. Valorile absorbanțelor obținute sunt apoi folosite pentru a determina
concentrați acetaminofenului și a cafeinei din amestec, cu ajutorul matricei [9-10].

Notă:
c = concentrația
a = valoarea coeficientului de regresie
b = constantă
r = coeficientul de corelație
Conținutul, coeficientul de variație, acuratețea și precizia determinării acetaminofenului și
a cafeinei în tabletele comerciale

Pagina 7
 Der Pharma Chemica,2016, 8 (16): 58-65

Prepararea soluției probă din tabletele comerciale a fost realizată prin metoda standard a adiției,
întrucât cantitatea de pudră necesară obținerii unei concentrații de 6.5 ug/ml acetaminofen
corespunde unei cantități prea mici de cafeină în amestec, de aceea este necesară adiția unei
cantități suplimentare de cafeină standard, astfel încât principiile legii Ceer să fie îndeplinite.
Conform Hamita (2004), în metoda adiției, concentrația probei plus concentrația analitului
reprezintă de obicei 80-120% din valoarea concentrației estimate a analitului, în amestec și re-
analizat. Diferența dintre cele două resultate reprezintă concentrația reală [10].
Pentru soluțiile probă preparate s-au măsurat absorbanțele la 6 lungimi de undă predeterminate,
anume: 223 nm; 243.8 nm; 254 nm; 258 nm; 262 nm și 271 nm.

Conform Tabelului 3, absorbanțele obținute pentru amestecul de acetaminofen și cefeină din

tabletele comerciale au fost folosite pentru determinarea concentrației fiecărei substanțe,
introducând datle în formula de calcul a matricei. Rezultatele obținute prezintă acuratețea
corespunzătoare coeficientului de variație (CV) [7,9-13].
Calcularea matricei pentru acetaminofen și cafeină, pentru soluția probă nr. 1 :

Rezultatele calculelor concentrațiilor și coeficientul de variație pentru acetaminofen și cafeină se

pot observa în tabelul 4. Coeficienții de variație pentru acetaminofen și cafeină sunt 0.40%,
respectiv 0.36%, ceea ce înseamnă o bună precizie a metodei folosite.

Pagina 8
 Der Pharma Chemica,2016, 8 (16): 58-65

Datele de absorbanță ale soluției probă obținute au fost folosite pentru determinarea
concentrațiilor, prin introducerea datelor în formula de calcul a maricei. După obtinerea
concentrațiilor analiților s-au calculat acuratețea matricei și coeficientul de variație (%CV).
Acuratețea matricei este o măsură a acurateței metodei, în timp ce coeficientul de variație (%CV)
se folosește pentru a determina precizia metodei analitice. O acuratețe optimă a unei metode
analitice pentru substanțe cu concentrații joase se încadrează în intervalul 90-107%, în timp ce o

bună precizie e caracterizată de un %CV < 2% [9,11-14]. Rezultatele concentrațiilor obținute

pentru acetaminofen și cafeina se pot observa în tabelul 5.

Conform Tabelului 5, se observă că nivelele de concentrație ale acetaminifenului și a cafeinei

îndeplinesc cerințele Farmacopeei Indoneziene [2], anume că la prepararea amestecurilor de
acetaminofen și cafeină in tablete concentrațiile acestora să nu fie mai mici de 90% sau mai mari
de 110% decât cantitatea declarată pe etichetă [2].
CONCLUZII
Pe baza rezultatelor cercetării, se poate concluziona că:
1. Implementarea metodei spectrofotometrice cu lungimi de undă multiple ce folosește calculul
matricei a reușit determinarea cantitativă simultană a acetaminofenului și a cafeinei din
tabletă fără interferențe datorate excipienților. Rezultatele studiului indică faptul că metoda
folosia este precisă, simplă, rapidă și cu o bună acuratețe. Analiza statistică arată că metoda e
selectivă și reproductibilă pentru analiza acetominofenului și a cafeinei.
2. Concentrațiile de acetaminofen și cafeină din tablete, determinate la multiple lungimi de

Pagina 9
 Der Pharma Chemica,2016, 8 (16): 58-65

undă prin spectrofotometrie au îndeplinit cerințele Farmacopeei Indoneziene (2014),

rezultatele fiind 91.75% ± 0.39% pentru acetaminofen, respectiv 99.49% ± 0.34% pentru
cafeină.

REFERINȚE BIBLIOGRAFICE:
[1] Tjay, TH and Rahardja, K. Drugs Important Benefits, Uses And Side Effects Securities.Sixth
Edition.Jakarta: PT.Elex Media Komputindo. 2007. Pages 318-373
[2] Indonesian Health Ministry, Indonesian Pharmacopoeia, Jakarta, Indonesia, 2014, 04,
998.1048
[3] Vichare V, Mujgond P, Tambe V and Dhole SN.. IJPRIF. 2010; 2(4): 2512‐16.
[4]. Dinç E, Yurtsever Y, Onur F. Turkish J. Pharm. Sci. 2004; 1: 115‐38.
[5] Wulandari, F. Thesis. Fakultas Farmasi Universitas Andalas. Padang Indonesia 2008 page
15-25
[6]. Day, RA, and Underwood, AL. Quantitative Analysis Sixth Edition. Translators: Sopyan, I.
(2002). Analysis of Quantitative Chemical Sixth Edition.Jakarta: publisher. 1998. 419 pages.
[7] Zainuddin,M.. Indonesian Pharmacy Magazines. 1999. 10(4) 217-218
[8] Moffat, AC, Osselton, MD, and Widdop, B. Clarke's Analysis of Drug and poisons. Third
Edition.London: Pharmaceutical Press, 2005. 507, 1028, 1856.pages [9] Ermer, J., and Burgess,
C.. Method Validation in Pharmaceutical Analysis . Weinheim: Wiley-VCH Verlag GmbH &
Co. KGaA. 2005, 16-24
[10] Harmita, Magazines Pharmaceutical Science, 2004, I, 3, 117-135.
[11] Rohman, A. Pharmaceutical Analysis, Yogyakarta: Student Library. 2007, Pages 65. 81, 91-
92, 262, 482-483
[12] Bliesner, D.M. Validating Chromatographic Methods: A Practical Guide. New Jersey: John
Wiley and Sons, Inc. 2006. page 2-20
[13] Huber, L. Validation and Qualification in Analytical Laboratories second edition. New
York: Informa Healthcare USA, Inc, 2007 page 125-126.
[14] United State Pharmacopoeia. The National Formulary XXX, The United States
Pharmacopoeial Convention, 2007. 3128 pages.

P a g i n a 10