Curs 7.

Testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice.

Metode de testare a sensibilităţii bactecteriilor la agenţi antimicrobieni

7.1. Metode de testare a sensibilităţii in vitro

Antibiograma face parte din prima categorie de metode menţionate. Reprezintă metoda
de laborator prin care se apreciază sensibilitatea la antibiotice a germenilor recoltaţi de la
bolnavii cu infecţii bacteriene, după cultivare pe medii îmbogăţite, care să permită
dezvoltarea optimă a microorganismului pentru care se efectuează testarea (de exemplu
pe agar Mueller-Hinton).
Pentru antibiograme trebuie să folosim culturi pure (reprezentând o singură tulpină
bacteriană), chiar în cazul infecţiilor multibacteriene. Cele mai frecvent utilizate tehnici
sunt:
a) Tehnicile calitative:
- antibiograma difuzimetrică comună (cu discuri)
- antibiograma difuzimetrică comparativă
- antibiograma difuzimetrică standardizată
- antibiogramele difuzimetrice rapide
b) Tehnicile cantitative:
- metoda diluţiilor în mediu lichid
- metoda diluţiilor în agar
- metoda microdiluţiilor în agar
- metoda „punctelor de ruptură”
- testul „E”
- metode şi sisteme comerciale, automatizate, de testare etc.

7.1.1. Antibiograma difuzimetrică comună

Din punct de vedere tehnic însămânţăm germenul de testat pe mediul solid
(ex. agar Mueller-Hinton) turnat în plăci Petri. Însămânţarea se poate realiza de exemplu
prin „inundarea” plăcii urmată de aspirarea, aseptic, a excesului de inocul sau cu ajutorul
unui tampon (există şi alte variante tehnice). După circa 20 minute (timp în care placa
Petri se lasă cu capacul întredeschis în vecinătatea becului de gaz, aprins) se aplică
microcomprimatele în care sunt încorporate antibiotice în concentraţie standardizată.
Aplicarea microcomprimatelor se poate face cu ajutorul unei pense, în condiţii aseptice,
sau cu ajutorul unui aplicator „automat” (la minim 30 mm distanţă între ele şi minim 15
mm de marginea plăcii; vom utiliza 5 antibiotice diferite pentru o placă Petri cu diametrul
de 9 cm).
Microcomprimatele trebuie să vină în contact perfect cu mediul, motiv pentru
care, cu ajutorul unei pense le presăm uşor (după caz). După încă 15-20 minute, incubăm
plăcile peste noapte în termostat, la 28 sau 35-37°C, în funcţie de temperatura optimă de
multiplicare a microorganismului testat.
Antibioticul eliberat din microcomprimat difuzează în mediu, realizând zone de
inhibiţie în care coloniile microbiene nu se dezvoltă.
Cu cât zona de inhibiţie este mai largă, cu atât germenul va fi considerat mai sensibil.
Dacă în interiorul zonei de inhibiţie (chiar dacă diametrul înregistrat este foarte mare) se
dezvoltă colonii, „mutanţi rezistenţi”, germenul va fi considerat rezistent.

1
Această metodă, cu toate că este folosită pe scară largă în laboratoare, permite de fapt
numai eliminarea antibioticelor complet inactive şi eventual selecţionarea antibioticelor
foarte active, pentru că tehnica nu este standardizată.

7.1.2. Antibiograma difuzimetrică comparativă (Stokes, Balş)

Se efectuează pentru microorganismul de testat în paralel cu un microorganism de
referinţă, din aceeaşi specie (sau o specie asemănătoare). Spre exemplu, pentru cocii
Gram-pozitivi putem alege pentru comparaţie o tulpină de Staphylococcus spp. Tulpina
de referinţă are o sensibilitate cunoscută la diferitele antibiotice pe care le utilizăm.
Prin această metodă se înlătură o parte din factorii de eroare ai metodei precedente, spre
ex. calitatea mediului, calitatea discurilor de antibiotice, care vor fi identice pentru
microorganismul de referinţă şi pentru microorganismul testat. Rezultatele se exprimă cu
termenii: „sensibil”, „intermediar”, „rezistent”, în funcţie de diametrul zonelor de
inhibiţie a multiplicării celor doi germeni, faţă de acelaşi antibiotic (jumătăţile de cerc se
examinează comparativ). În cazul în care cunoaştem CMI (concentraţia minimă
inhibitorie) a microorganismului de referinţă, putem face aprecieri cu privire la CMI
pentru microorganismul testat.
Din punct de vedere tehnic, pe o placă de forma unui pătrat („împărţită” în 3 zone egale
marcând pe partea externă a plăcii liniile de demarcaţie) se inoculează în treimea medie
microorganismul de referinţă iar în treimile exterioare 2 microorganisme diferite, pentru
care dorim să realizăm testarea. Inoculul trebuie să fie astfel realizat încât să conducă la
apariţia după incubare a unor colonii foarte apropiate, dar care să nu fie confluente.
Plasăm microcomprimatele cu antibiotice pe liniile de demarcaţie dintre culturi. Incubăm
peste noapte la 35-37°C urmând ca în ziua următoare să citim şi să interpretăm
rezultatele.

7.1.3. Antibiograma difuzimetrică standardizată (Kirby-Bauer, NCCLS)

Din punct de vedere tehnic se realizează asemănător cu prima metodă prezentată, dar este
standardizată, fiind singura metodă difuzimetrică recunoscută pe plan internaţional, care
permite obţinerea unor rezultate reproductibile şi corelabile între laboratoare diferite.
Elementele necesare standardizării sunt:
- mediul (în majoritatea cazurilor agar Mueller-Hinton, pentru că are o valoare
nutritivă corespunzătoare şi nu conţine substanţe cu acţiune inhibitoare)
- există elemente minerale care trebuie adăugate în cazul testării anumitor
microorganisme (ex. Mg2+ şi Ca2+, pentru tulpini de Pseudomonas aeruginosa,
atunci când este testată sensibilitatea la aminoglicozide);
- se va verifica pH-ul mediului (de obicei cuprins între 7,2 şi 7,4);
- există suplimente nutritive care trebuie adăugate în cazul testării unor
microorganisme pretenţioase;
- grosimea mediului trebuie să fie de 4 mm (25 ml de mediu/placă de 9 cm);
- inoculul, care se obţine de preferat din 5 colonii izolate (cultură pură) şi trebuie să
aibă o turbiditate corespunzătoare standardului turbidimetric 0,5 McFarland
(circa 108 unităţi formatoare de colonii/ml) în majoritatea cazurilor;
- timpul de incubare (în majoritatea cazurilor 16-18 ore la 35-37°C, nu mai mult de
2-3 plăci suprapuse), atmosfera de incubare, umiditatea atmosferei de incubare;

2
 - concentraţia substanţelor antimicrobiene din microcomprimate şi dimensiunea
microcomprimatelor (6 mm diametru);
- alegerea substanţelor antimicrobiene pentru care se face testarea;
- păstrarea plăcilor cu mediu până în momentul utilizării (maxim 7 zile, în pungi de
polietilenă, la +4°C);
- utilizarea tulpinilor de referinţă pentru controlul de calitate;
- interpretarea rezultatelor (se măsoară diametrul zonei de inhibiţie şi se compară
rezultatele cu cele din tabelele puse la dispoziţie de producători şi/sau centrele de
referinţă).
Metodele difuzimetrice au dezavantajul că nu permit aprecierea concentraţiilor eficace
ale antibioticului la nivelul focarului infecţios.

7.1.4. Metoda diluţiilor în mediu lichid

Acest tip de metodă oferă informaţii cu privire la CMI ale antibioticelor studiate,
faţă de microorganismul testat. CMI = concentraţia minimă inhibitorie, reprezintă cea
mai mică concentraţie de agent antimicrobian, exprimată în micrograme/ml, care mai
exercită o acţiune bacteriostatică asupra germenului testat.
Din punct de vedere tehnic, pentru fiecare antibiotic avem nevoie de mai multe
tuburi cu bulion Mueller-Hinton în concentraţii descrescânde (diluţii binare) pornind spre
ex. de la 16 micrograme/ml şi până la 0,125 micrograme/ml, în total 8 tuburi, plus
2 tuburi martor, fără antibiotic (cantitatea finală va fi de 1 ml în fiecare tub). Preparăm un
inocul standardizat turbidimetric şi în condiţii aseptice inoculăm toate cele 10 tuburi cu
câte 1 ml de inocul. Agităm pentru a omogeniza. Incubăm cele 8 tuburi cu antibiotice şi
1 tub martor timp de 16-20 ore la 35-37°C iar al doilea tub martor îl menţinem pentru
aceeaşi perioadă la temperatura frigiderului. Pentru controlul de calitate utilizăm şi un şir
de tuburi pe care le inoculăm cu o tulpină de referinţă corespunzătoare. În ziua următoare
citim şi interpretăm rezultatele.
Deoarece am utilizat o cantitate de inocul egală cu cantitatea de mediu,
concentraţia finală de antibiotic se va înjumătăţi (de ex. în tubul în care diluţia iniţială a
fost de 16 mg/ml, diluţia finală va fi 8 mg/ml etc.). În tubul martor menţinut la +4°C ar
trebui să nu fie prezentă creşterea, în tubul martor menţinut la 35-37°C creşterea trebuie
să fie prezent.
În tuburile inoculate cu tulpina de referinţă trebuie să avem rezultatul
corespunzător datelor pe care le cunoaştem privitor la respectiva tulpină.
În tuburile cu microorganismul testat, ultima diluţie care a inhibat dezvoltarea
microorganismului corespunde CMI. Se consideră (în general, pentru că CMI diferă în
funcţie de specia microbiană) că microorganismele în cazul cărora CMI este £ 3 mg/ml
vor fi eficient inhibate de către antibioticul respectiv şi in vivo.
CMI nu are aceeaşi valoare pentru genuri, specii sau tulpini diferite. De ex. CMI la
amoxicilină în cazul unor tulpini sensibile este de 0,1 mg/ml pentru Staphylococcus
aureus, 0,03 mg/ml pentru Streptococcus pneumoniae, 0,25 mg/ml pentru Haemophilus
influenzae, 2 mg/ml pentru E. coli, 16 mg ml (şi practic aceasta semnifică „rezistenţă in
vivo”) pentru Bacteroides fragilis iar în cazul Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas
aeruginosa sau Chlamydia trachomatis tulpinile sunt rezistente.

3
7.1.5. Determinarea CMB (concentraţia minimă bactericidă)
Pornind de la rezultatul obţinut prin metoda diluţiilor în mediu lichid, se vor utiliza ca
sursă de inocul tuburile în care dezvoltarea microbiană a fost inhibată.
Este necesară o placă Petri cu agar Mueller-Hinton care va fi împărţită în sectoare,
numărul de sectoare fiind corespunzător numărului de tuburi fără creştere microbiană.
Însămânţăm în condiţii aseptice din fiecare tub fără creştere microbiană, fiecare în
sectorul de placă corespunzător. Incubăm pentru 16-18 ore la 35-37°C. CMB va
corespunde ultimei concentraţii de antibiotic care a distrus microorganismele însămânţate
(sectoare de placă fără apariţia culturii). Se consideră că antibioticul va fi eficient in vivo
dacă în serul pacientului se pot atinge concentraţii de antibiotic care să depăşească de 4-8
ori CMB.
Determinarea CMI şi CMB este extrem de importantă pentru aprecierea
eficacităţii antimicrobiene a unui antibiotic asupra unei tulpini bacteriene.
Pentru tratamentul infecţiilor severe (de exemplu endocardite, meningite, sepsis etc),
precum şi la imunodeprimaţi, efectuarea acestei metode este indispensabilă.

7.1.6. Metoda „punctelor de ruptură” (breakpoints)

Metoda este folosită în laboratoarele moderne de microbiologie şi este utilizată
pentru a defini sensibilitatea şi rezistenţa la antibiotice. Depinzând de metoda de testare
rezultatele sunt exprimate sub forma unei concentraţii (mg/l sau µg/ml) sau sub forma
unui diametru (mm).
Metoda este practicată de multe dintre laboratoarele din Europa de Vest, mai ales
dacă volumul de muncă este mare sau foarte mare. Prin această metodă se pot testa mai
multe microorganisme, în acelaşi timp. Antibioticele sunt incorporate în mediul de
cultură, la o anumită concentraţie „limită”, în funcţie de cunoştinţele şi datele acumulate
în ceea ce priveşte activitatea „in vivo” a respectivelor medicamente. Plăcile sunt
inoculate simultan cu mai multe tulpini bacteriene, în „spot”, folosind un inoculator
construit special, sunt incubate în condiţii corespunzătoare pentru 16-18 ore. În cazul în
care tulpina sau tulpinile din diferitele specii bacteriene nu se dezvoltă la această
concentraţie „limită” de antibiotic (considerată ca fiind eficace „in vivo”), bacteria izolată
este considerată sensibilă. În cazul în care bacteria se dezvoltă (apare cultură bacteriană),
bacteria izolată este considerată rezistentă.
Această concentraţie limită (breakpoint) trebuie setată în funcţie de următoarele
date: distribuţia CMI, evaluarea raportului PK/PD (farmacocinetic/farmacodinamic) şi
rezultatele obţinute în clinică în tratamentul pacienţilor. PD reprezintă studiul efectelor
medicamentului de-a lungul timpului şi este în strânsă legătură cu PK care reprezintă
modificările concentraţiilor medicamentului în timp.
”Punctele de ruptură” trebuie stabilite înainte ca un antibiotic să fie folosit în
clinică şi trebuie să fie revăzute când apar cazuri de rezistenţă la antibiotice. Totuşi
setarea de ”puncte de ruptură” nu este perfectă. Metoda este utilă şi în realizarea unor
studii epidemiologice în ceea ce priveşte modificarea rezistenţei la antibiotice în anumite
zone geografice.

7.1.7. Testul E; Determinarea CMI prin „E test”

„E test” reprezintă o metodă de testare in vitro a sensibilităţii la antibiotice pentru
diferite microorganisme, inclusiv pentru bacteriile pretenţioase şi germenii anaerobi.

4
„E test” se aseamănă metodei diluţiei în agar combinând principiile metodei
difuzimetrice cu cele de diluţie. „E test” este uşor de utilizat şi spre deosebire de metoda
difuzimetrică permite determinarea valorii CMI.
Din punct de vedere tehnic sunt necesare: o placă Petri cu agar Mueller-Hinton, inoculul
standardizat şi langhetele din plastic pe care au fost fixate antibiotice în gradient, de ex. la
un capăt 256 mg/ml ajungând la celălalt capăt la 0,016 mg/ml (câte o langhetă pentru
fiecare antibiotic, câte 15 diluţii marcate pe fiecare langhetă). Însămânţăm
microorganismul care urmează a fi testat în condiţii standardizate şi depunem radiar
langhetele cu antibiotice.
Principiu:
Asemănător metodei difuzimetrice, „E test” necesită un inocul bacterian ajustat ca
turbiditate (standardizat), ce urmează a fi depus pe mediul de cultură potrivit
microorganismului studiat (ex. mediul Mueller-Hinton, geloză-sânge etc), în plăci Petri.
Benzile „E test” conţin un gradient de agent antimicrobian şi se aplică după însămânţare.
În funcţie de antibiotic, gradientul „acoperă” un şir continuu de concentraţii între
0,002-32 mg/ml; 0,016-256 mg/ml sau 0,064-1024 mg/ml. După incubare (timp de 16-18
ore la 35-37°C) se formează o zonă eliptică de inhibiţie. Valoarea CMI se citeşte acolo
unde creşterea bacteriană intersectează banda „E test”.
Materiale şi reactivi necesari:
- plăci Petri cu agar Mueller-Hinton (păstrate la 2-8ºC până în momentul
utilizării);
- bulion Mueller-Hinton (cu 20-25 mg Ca2+ şi 10-12,5 mg Mg2+/litru; se
repartizează câte 5 ml în tuburi sterile cu capac; se păstrează la 2-8ºC);
- medii de cultură pentru menţinerea în stare viabilă a tulpinilor bacteriene
necesare efectuării controlului de calitate ;
- tulpini martor;
- inocul bacterian;
- soluţie salină sterilă (0,85% NaCl) sau bulion Mueller-Hinton, pentru ajustarea
inoculului bacterian;
- benzi „E test” (a. cu agenţi antimicrobieni cu nucleu β lactam, b. cu alţi agenţi
antimicrobieni); se păstrează în congelator la -20ºC până în momentul utilizării; au o
durată de utilizare de 1-2 ani (pentru prima grupă) şi respectiv de 2-3 ani
- tampoane sterile;
- standard de turbiditate McFarland de 0,5 şi 1,0;
- pipete Pasteur sterile;
- foarfece;
- plăci Petri sterile cu diametrul de 90 mm şi respectiv de 150 mm;
- incubator cu atmosferă obişnuită reglat la 34-35ºC; incubarea în atmosferă
îmbogăţită cu CO2 este necesară în cazul testării anumitor microorganisme;
- sursă de lumină;
- aplicator „E test”şi bandă adezivă (opţional).
Tehnica de lucru:
A. Benzile „E test”
- scoatem plăcile cu mediul de cultură şi benzile „E test”din congelator, le lăsăm la
temperatura camerei pentru echilibrare termică timp de 20 minute sau până când nu mai
observăm nici o urmă de umezeală

5
- înainte de a deschide folia care include benzile, inspectăm pentru a observa dacă există
perforări; dacă folia respectivă nu este intactă, atunci benzile din interiorul ei nu se mai
pot folosi; dacă nu sunt probleme, pentru a deschide o folie mai întâi tăiem cu o foarfecă
de-a lungul liniei întrerupte apoi între compartimentele ce conţin benzile
- scoatem benzile din folie cu ajutorul unei pensete şi le punem în plăci Petri sterile; apoi
le putem aplica pe mediul de cultură care conţine inoculul microbian de testat
- păstrăm restul benzilor în tuburi în care introducem o substanţă desicantă pentru a le
proteja faţă de umezeală; este necesară protecţia şi faţă de căldură şi expunerea directă la
lumină (punem tuburile în congelator, la -20°C)
B. Inoculul bacterian:
- cu ajutorul ansei sau a unei pipete, transferăm mai multe colonii dintr-o cultură
bacteriană de 18-24 de ore într-un tub cu soluţie salină sterilă sau bulion; omogenizăm
(există şi varianta să transferăm mai multe colonii în bulion, să incubăm timp de 2-8 ore
până când obţinem densitatea dorită)
- ajustăm (vizual) densitatea folosind soluţie salină sterilă 0,85% sau bulion, la un
standard de turbiditate echivalent cu 0.5 McFarland; alternativ, suspensia se poate ajusta
la standardul dorit cu ajutorul unui nefelometru (aprecierea vizuală a turbidităţii
inoculului nu garantează numărul corect al unităţilor formatoare de colonii).
C. Inocularea plăcilor:
- introducem tamponul steril în tubul care conţine suspensia bacteriană de testat, rotim de
câteva ori, apoi eliminăm excesul de lichid prin presarea tamponului de pereţii interiori ai
tubului;
- depunem inoculul pe suprafaţa plăcii cu mediul de cultură având grijă să acoperim
complet suprafaţa mediului (ex. inoculăm pe 3 direcţii diferite, rotind placa cu câte o
treime);
- lăsăm placa timp de circa 10 minute, ca să se usuce, înainte de a aplica benzile „E test”.
D. Aplicarea benzilor „E test”:
- luăm cu grijă o bandă fără să atingem sau zgâriem partea pe care este depus agentul
antimicrobian; dacă folosim pensa sterilă, apucăm cu grijă de capătul benzii notat cu E
(benzile trebuie să fie complet separate una de cealaltă înainte de a le aplica pe suprafaţa
mediului de cultură inoculat cu tulpina de testat); dacă se foloseşte aplicatorul „E test”,
banda adezivă trebuie să fie în poziţia corectă (la fiecare capăt al aplicatorului);
- aplicăm banda „E test” pe suprafaţa mediului de cultură, cu capătul ce conţine
concentraţia cea mai mare aproape de marginea plăcii;
- dacă lucrăm cu plăci cu diametrul de 90 mm, aplicăm una sau două benzi; dacă lucrăm
cu plăci cu diametrul de 150 mm, putem aplica şase benzi „E test” (benzile se pun la
distanţe egale, radial, pornind din centrul plăcii; marginea capătului benzii notată cu E
trebuie să atingă marginea plăcii);
- banda trebuie să fie în contact cu suprafaţa agarului; eliminăm eventualele bule de aer
de sub bandă cu ajutorul unei pense începând de la marginea bulei şi mutând-o în sus pe
gradient până la capătul notat cu E (prezenţa bulelor mici nu va afecta rezultatul testării);
- banda aplicată pe suprafaţa agarului nu se mută în altă poziţie (luând contact cu mediul
de cultură, agentul antimicrobian de pe partea posterioară se eliberează imediat); dacă
banda a fost aplicată cu partea posterioară în sus atunci se apucă cu grijă, se întoarce şi se
pune corect pe suprafaţa mediului; dacă banda a atins suprafaţa mesei de lucru sau un alt
obiect, se poate folosi în continuare atât timp cât nu a luat contact cu o substanţă lichidă.

6
E. Incubarea:
- timpul şi temperatura de incubare depind de variantele de microorganism-agent
antimicrobian ce urmează a fi testate;
- incubarea în atmosferă de CO 2 modifică pH-ul mediului de cultură şi poate afecta
activitatea agenţilor antimicrobieni; se foloseşte numai în cazul în care microorganismele
supuse testării necesită pentru multiplicare CO2 (Haemophilus spp., Neisseria
gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae etc).
Interpretarea rezultatelor:
- putem citi rezultatul în cazul în care creşterea bacteriană este confluentă sau aproape
confluentă;
- ţinem placa lângă o sursă de lumină (atunci când mediul este Mueller-Hinton); citim
valoarea CMI în punctul în care creşterea bacteriană intersectează banda „E test”; dacă
am utilizat agar Mueller-Hinton suplimentat cu 5% sânge de oaie, sau geloză-chocolate
Mueller-Hinton sau alt mediu opac, vom utiliza pentru citirea rezultatului o sursă de
lumină reflectantă şi o lupă;
- pe geloză-sânge citim zona de inhibiţie a creşterii bacteriene nu zona de inhibiţie a
hemolizei;
în cazul în care nu apare nicio zonă de inhibiţie, raportăm valoarea CMI ca fiind mai
mare decât cea mai mare concentraţie a agentului antimicrobian de pe banda „E test”;
dacă zona de inhibiţie nu intersectează banda (zona de inhibiţie se află sub banda
„E test”), valoarea CMI se raportează ca fiind mai mică decât concentraţia cea mai
scăzută a agentului antimicrobian de pe banda „E test”;
- în cazul unei valori CMI situată între două marcaje ale gradientului benzii, rezultatul pe
care îl notăm va fi valoarea cea mai mare;
- raportăm rezultatul obţinut pentru tulpina studiată după ce verificăm rezultatul obţinut
pentru tulpina de referinţă (control de calitate);
- rezultatele CMI se interpretează conform criteriilor stabilite de NCCLS (National
Committee for Clinical Laboratory Standards).
7.1.8. Alte tehnici de testare clasice
Testarea sensibilităţii la antibiotice a bacteriilor anaerobe:
 metodele sunt utile în special din punct de vedere al supravegherii
epidemiologice, dar sunt rezervate pentru laboratoarele de referinţă
 se pot utiliza tehnici de diluţie în mediu lichid sau solid, tehnici de microdiluţii în
mediu lichid, teste pentru producerea de β-lactamază etc.
Testarea sensibilităţii mycobacteriilor
 se efectuează respectând prevederile Programului Naţional de Control al
Tuberculozei (care indică situaţiile în care vor fi efectuate aceste testări)
 se pot utiliza metoda concentraţiilor absolute, metoda proporţiilor, metoda
rapoartelor de rezistenţă, metode radiometrice etc.
Testarea sensibilităţii altor bacterii
 există şi alte bacterii pentru care trebuie respectate condiţii particulare
 spre exemplu pentru testarea sensibilităţii stafilococilor la oxacilină/meticilină se
recomandă ca mediul să conţină 4% NaCl, pentru testarea sensibilităţii la
antibiotice a streptococilor se recomandă ca mediul să conţină 5% sânge
defibrinat de berbec etc.

7
Testarea sensibilităţii fungilor (antifungigrama)
 ţine cont de temperatura şi durata de incubare, care diferă faţă de cele pentru
bacterii, mediul utilizat fiind mediul Sabouraud
 se pot utiliza tehnici de diluţie în mediu lichid sau solid
Testarea producerii de β-lactamaze
 este utilă atunci când se verifică sensibilitatea la antibiotice a microorganismelor
care pot produce β-lactamază (ex. Haemophilus spp., Staphylococcus aureus etc.)
 se pot utiliza teste iodometrice, teste acidimetrice, teste cu cefalosporine
cromogene etc; există şi metode puse la punct pentru testarea sintezei de
β-lactamaze cu spectru extins (ESBL).
Există şi sisteme automate (ex. ATB şi rapid ATB) sau sisteme semiautomate (ex.
ATB Expression sau miniAPI), pentru testarea sensibilităţii la antibiotice şi
chimioterapice, utilizând criteriile de interpretare NCCLS.

7.1.9. Tehnici de biologie moleculară utilizate în testarea sensibilităţii la antibiotice şi

chimioterapice
Au fost imaginate o serie de metode semi-automatizate sau automatizate pentru a
optimiza obţinerea unor rezultate corecte şi în timp cât mai scurt, cu privire la
sensibilitatea/rezistenţa microorganismelor la antibiotice şi chimioterapice. Metodele care
au la bază tehnicile de biologie moleculară pot fi foarte utile (chiar dacă costurile sunt
mai ridicate). De ex. se cunoaşte că agentul etiologic al tuberculozei se multiplică lent pe
medii de cultură şi în aceste condiţii rezultatele vor fi obţinute în circa 2 săptămâni prin
metodele clasice. Se pot utiliza diferite tehnici şi în final hibridizarea moleculară pentru a
studia diferite mutaţii care pot să dea informaţii cu privire la sensibilitatea/rezistenţa
tulpinilor studiate. Spre ex. INNO-LIPA Rif. TB (LIPA= Line Probe Assay), se realizează
cu ajutorul unei truse comerciale puse la punct în USA. Metoda permite concomitent
identificarea M. tuberculosis precum şi testarea sensibilităţii la rifampicină, după o
amplificare genetică a unui material (ADN) provenit fie din culturi mycobacteriene, fie
chiar din produse clinice.
Principiul INNO-LIPA este hibridizarea ADN rezultat dintr-o amplificare prin PCR
(Polymerase Chain Reaction) cu sonde nucleotidice specifice, imobilizate sub forma unor
linii (benzi) paralele, pe fâşii de nitroceluloză. Sondele nucleotidice (S1-S5) sunt
biotinilate (cuplate cu biotină). După hibridizare se adaugă streptavidină conjugată cu
fosfatază alcalină, acest conjugat ataşându-se de produşii de hibridizare rezultaţi anterior.
Incubarea în prezenţa unui reactiv cromogen conduce, în cazul existenţei hibridizării, la
apariţia unor benzi colorate, vizibile. În cazul testării rezistenţei la rifampicină, se
urmăreşte apariţia unei/unor mutaţii la nivelul genei care codifică pentru subunitatea β a
ARN polimerazei (gena rpoB).
Identificarea apartenenţei tulpinii testate la specia M. tuberculosis, este certificată cu
ajutorul unei oligonucleotide specifice, situată în poziţia a 3-a, după linia care marchează
fiecare fâşie-test şi respectiv linia care permite verificarea calităţii conjugatului
(conjugate control).
Produsul unei tulpini sensibile la rifampicină deţine fragmente amplificate, care
hibridizează cu sondele specifice S1, S2, S3, S4 şi respectiv S5. Absenţa uneia sau a mai
multor benzi demonstrează că tulpina este rezistentă la rifampicină.

8
Pentru tulpinile rezistente la rifampicină, trusa comercială INNO-LIPA permite
suplimentar aprecierea locusului mutaţiei. De exemplu, o tulpină poate prezenta o mutaţie
în regiunea R5 (serină-leucină) în timp ce altă tulpină prezintă o mutaţie în regiunea R4a
(histidină), aceste mutaţii apărute la nivelul genei rpoB fiind dintre cele mai frecvente şi
pot fi identificate prin această metodă.

7.2. Metode de testare a sensibilităţii in vivo şi de apreciere a eficienţei terapeutice

Eficienţa terapeutică poate fi apreciată clinic, paraclinic şi prin teste de laborator. Există
unele criterii nespecifice de laborator care sunt utile în aprecierea eficienţei terapeutice,
precum leucograma, examenul sedimentului urinar, examenul citologic al LCR, VSH,
proteina C reactivă etc.
Dintre metodele specifice utilizate pentru aprecierea eficacităţii terapeutice sau pentru
evaluarea eventualei nocivităţi a medicamentelor folosite, vom enumera:
 determinarea NEI (nivel de eficienţă inhibitorie) pentru ser, LCR sau alte
umori;
 determinarea NEB (nivel de eficienţă bactericidă) pentru ser, LCR sau alte
umori; puterea bactericidă a serului celor trataţi (NEB) măsoară capacitatea
diluţiilor din serul unui bolnav tratat cu antibiotice de a inactiva un inocul
conţinând germenul infectant; se determină diluţia cea mai înaltă de ser care mai
manifestă capacitate bactericidă;
 utilizarea acestor metode a fost indicată în cazul endocarditelor bacteriene,
osteomielitelor, fibrozei chistice sau sepsisului la pacienţi cu variate grade de
imunodepresie; produsele se recoltează de obicei la o oră după administrarea unei
doze şi cu câteva minute înainte de administrarea următoarei doze de antibiotic;
 determinarea nivelului de antibiotic realizat în sânge, LCR sau în alte umori (prin
metode microbiologice, enzimatice, HPLC etc).

- Sfârşit curs -

BIBLIOGRAFIE
Popa M.I., Popa G.L., Antibiotice şi chimioterapice, în Popa M.I. (coord.), Microbiologie
Medicală, vol 1 - curs UMF „Carol Davila”, 2010.