 Antibiograma: testarea sensibilităţii in

vitro a microorganismelor faţă de

antibiotice .
 Termenii de antibiotic si chimioterapic se folosesc
ca sinonimi.
 Introducerea unui antibiotic in terapie este o
mare responsabilitate medicala, cerind
respectarea unor conditii.
o Antibiograma se face dupa stabilirea
diagnosticului etiologic, prin izolarea in
cultura pura si prin identificarea agentului
patogen.
o In cazuri de extrema urgenta, se poate
administra un antibiotic (inainte de
efectuarea antibiogramei) dar numai dupa
recoltarea produselor patologice.
o Tratamentul se realizeaza in functie de
rezultatele date de antibiograma, alegand
antibioticul cel mai eficace, adica fata de care
bacteria izolata are cea mai mare sensibilitate.
o Antibiograma trebuie repetata daca tratamentul
cu antibiotice este de durata mai lunga; aceasta
deoarece agentul patogen poate sa cistige rezistenta
fata de antibioticul utilizat.

o Apoi in cursul tratamentului datorita

dezechilibrului din populatiile microbiocenozelor,
poate sa se produca o infectie supraadaugata cu o
bacterie din aceste microbiocenoze.
metode calitative
 metoda difuzimetrica Kirby Bauer - clasica
 metoda cu antibiotic incorporat in mediu semisolid
- moderna
metode cantitative
 metoda dilutiilor in mediu lichid - clasica
 metoda E test – moderna
 se bazeaza pe efectul bactericid sau bacteriostatic
al antibioticelor fata de microorganism.
 în cazul tuturor bacteriilor semnificative clinic a
căror susceptibilitate nu este predictibilă
condiţie:existenţa standardizării privind specia,
antibioticul de testat)
 se decide de către microbiolog în funcţie de:
 - felul produsului din care s-a izolat germenul,
 - specia bacteriană
 Când relevanţa unui izolat este incertă, medicul
microbiolog se consultă cu medicul
curant si se ia o decizie în comun pe baza datelor
clinice.
 Se testează sensibilitatea unei tulpini bacteriene
izolate în cultură pură si identificate.
 Este metoda utilizată de rutină pentru testarea
susceptibilităţii izolatelor clinice.
 Fiind o metodă calitativă, nu permite
cuantificarea nivelului de rezistenţă, rezultatele
fiind exprimate in:sensibil,intermediar si
rezistent.
 Aceasta se efectueaza pe medii solide, in placi
Petri, pe care s-a insamintat in panza cultura
bacteriana; apoi pe suprafata mediului se
dispun discuri cu antibiotice astfel ca in jurul
acestora se va realiza un gradient de
concentratie prin difuziunea locala a
antibioticului ( in imediata vecinatate a
discului realizindu-se o concentratie mai mare
de antibiotic care descreste pe masura
indepartarii de acesta ).
 Metoda difuzimetrica, cu toate ca nu stabileste
concentratia minima infibitorie (CMI), da
informatii pretioase asupra sensibilitatii speciei
testate fata de antibioticele utilizate si este
folosita mai frecvent in laboratorele clinice.
 În efectuarea si interpretarea antibiogramelor
calitative se urmăresc standarde internaţionale.
 În prezent standardul acceptat în cele mai multe
ţări inclusiv România este cel american,
elaborat de CLSI (Clinical Laboratory Standards
Institute) dar unele laboratoare folosesc
standardul european Eucast.
 Mediul de testare universal recomandat este Muller-
Hinton agar.
 Acest mediu nesuplimentat a fost ales pentru mai
multe motive:
 a demonstrat o bună reproductibilitate de la un lot la
altul
 conţine puţini inhibitori de sulfonamide şi
trimetoprim
 este un bun mediu de cultură pentru majoritatea
germenilor nepretenţioşi, patogeni
 este folosit cu succes de mulţi ani, demonstându-şi
calităţile.
 Formula mediului este:
 Extract de carne…………………….. , g
 Hidrolizat de cazeină………………… , g
 Amidon………………………………… , g
 AD…………………………………….. ml
 Germenii pretenţioşi, cum sunt Haemophilus,
Neisseria şi Streptococcus nu pot creşte
satisfăcător pe acest mediu nesuplimentat, dar ei
pot fi testaţi prin metoda difuzimetrică, prin
suplimentarea mediului de bază Muller-Hinton
cu factori de creştere specifici adăugarea de
sânge defibrinat sau chocolatizat, adăugarea de
factori X şi V , incubarea în atmosferă de CO şi
prelungirea perioadei de incubaţie.
 Pt. Mycobacterium tuberculosis se foloseste
mediul Lowenstein Jensen
 Grosimea mediului, de 4 mm, este importantă,
deoarece AB difuzează în mediu atât în suprafaţă
cât şi în profunzime, deci, o grosime mai mare
duce la false rezistenţe zone de inhibiţie eronat
mai mici , în timp ce o grosime mai mică de mm
duce la creşteri false ale zonelor de inhibiţie, deci
false sensibilităţi.
 Fiecare lot de mediu nou preparat trebuie
testat pentru asigurarea unui pH mediu de
7,2-7,4 la temperatura camerei; valori scăzute
ale pH-ului pot altera rezultatele pentru
aminoglicozide şi macrolide false rezistenţe ,
sau ale penicilinelor false sensibilităţi .
 Plăcile cu mediu pot fi stocate la frigider mai
multe zile, în pungi de plastic pentru a evita
deshidratarea, iar înainte de utilizare vor fi
introduse în incubator (10-30 min) pentru
echilibrare termică şi îndepărtarea
condensului format.
 se suspensionează -3 colonii izolate în ser
fiziologic
 turbiditatea suspensiei se controlează
nefelometric sau comparând cu tuburi etalon
conţin suspensii de particule latex/sulfat de Ba
având turbiditate determinată ;
 se ajustează la . McFarland , x ufc/ml .
 Inocularea gelozei Muller-Hinton cu această
suspensie se va realiza în răstimpul a min. de la
preparare, pentru a preveni modificarea turbidităţii
prin începerea creşterii bacteriene.
 se alege un mediu corespunzător speciei
bacteriene testate
 · Mueller-Hinton pentru majoritatea bacteriilor
 · Mueller-Hinton cu sânge pentru pretenţiosi de
ex. streptococi)
 · medii speciale (pentru Haemophilus spp .
neisserii)
 se introduce un tampon în suspensia bacteriană,
se stoarce pentru îndepărtarea excesului de lichid
 se sterge uniform toată suprafaţa mediului de x
 Scopul final al inoculării mediului este
realizarea unei creşteri bacteriene uniforme,
sub formă de colonii confluente sau
semiconfluente după standardul francez, ce
utilizează un inocul mai slab .
 se aleg antibioticele care trebuie testate in
funcţie de specia bacteriană testată si în funcţie
delocalizarea infecţiei –
 se depun discurile de antibiotic la l . cm distanţă
de marginea cutiei Petri si la 2.5- cm distanţă
unul faţă de celălalt .
 15 min. temperatura camerei
 Unele antibiotice încep să difuzeze în mediu
imediat după aplicare, astfel că odată
aplicate pe mediu ele nu mai pot fi mutate.
 Aplicarea discurilor se poate face fie
individual, cu pense sterile, fie cu
dispensere speciale care permit aplicarea
concomitentă a 8-16 discuri, în funcţie de
mărimea placii Petri utilizate (pe o placă
Petri rotundă de 90 mm încap 6 discuri, pe
una de 100 mm, 8 discuri, pe cea de 150 mm,
12 discuri, iar pe plăcile pătrate de 120/120
mm, 16 discuri).
 în funcţie de specia bacteriană: în atmosfera
obisnuită sau in atmosferă de CO de ex.
 streptococi, neisserii.)
 35°C-37°C
 16- ore în cazul germenilor pretenţiosi până la
20-24 de ore)
 de ore în cazul testării vancomicinei
 apare o cultură bacteriană confluentă, în jurul
microcomprimatelor apar zone de inhibiţie
lipsa creșterii bacteriene
 se citesc diametrele zonelor de inhibiţie
 se compară diametrele citite cu diametre
standard in funcţie de antibiotic, cantitatea de
antibiotic din comprimat, specia bacteriană
testată
 Diametrul zonei de inhibiţie completă este măsurat,
incluzând şi diametrul discului, cu ajutorul unei rigle
gradate, sau şubler.
 Aspectul zonei de inhibitie trebuie sa fie clar
si cu contur net.
 In situatia in care se observa chiar si o singura
colonie in interiorul zonei de inhibitie, se va
considera rezistenta la acel antibiotic,
indiferent de diametrul zonei de inhibitie .
 rezultatul se raportează:
 sensibil (S),
 intermediar sensibil (IS)
 sau rezistent (R) la antibioticul testat
 fiecare rezultat de antibiogramă se interpretează!
 nu se comunică diametrele citite metodă
calitativă
 compoziţia mediului (conţinut de cationi, timidină)
 pH (optim: 7,2-7,4)
 grosimea gelozei (standard: 4 mm)
 inoculul - 0,5 McFarland
 microcomprimate (valabilitate, conţinut, condiţii de
păstrare)
 timpul, temperatura de incubare
 citirea diametrelor (lumină refractată/reflectată,
colonii izolate, prezenţa unui văl, margini
crenelate)
 loturile noi de medii de cultură se testează cu tulpini
de referinţă.
 Principiu
 Galeria ATB permite determinarea
sensibilităţii microbiene la un set de agenti
antibacterieni / antifungici , incorporate într-
un mediu semisolid. Este alcătuită din
perechi de godeuri, din care / nu conţin
antibiotice/antifungice şi sunt martori de
creştere.
 Celelalte perechi de godeuri conţin diferite
antibiotice în cite două concentraţii c =
concentratie mai mica şi C = concentratie mai
mare pentru a putea eticheta fiecare tulpină
testată ca fiind sensibilă, intermediară sau
rezistentă.
 Din tulpina de testat este preparată o
suspensie care este transferată în mediul de
cultură cu care este inoculată galeria ATB.
- Rezultatele se citesc vizual sau automat dupa
24-48 ore de incubare la 37C.
 Citire si interpretare
Dacă nu există creştere la nici o concentraţie
înseamnă tulpină sensibilă, daca exista
creştere numai în godeul cu concentraţia mai
mică c înseamnă sensibilitate intermediară,
daca exista creştere în ambele godeuri c şi C)
semnifică rezistenţă la respectivul agent
antimicrobian.
 Urmareste derminarea limitei de sensibilitate a
germenului fata de substanta data, indicand cc.
de antibiotic necesara pentru inhibarea
dezvoltarii sale.
 Tehnica-la dilutii crescande de AB facute direct in
mediu de cultura lichid, se insamanteaza
cantitati egale de cultura bacteriana , stabilindu-
se dilutia maxima de antibiotic in prezenta careia
tulpina este inhibata.
 -pentru fiecare AB se face o dilutie de pornire
 - mediul de cultura utilizat este bulionul glucozat
2%
 Se utilizeaza 10 tuburi cu bulion glucozat 1 ml in
fiecare tub. In primul tub se adauga 1 ml din sol de
antibiotic , se omogenizeaza si se trece 1 ml in al
doi-lea tub si asa mai departe pana pana in tubul
9 din care se arunca 1 ml.
 Se insamanteaza tuburile cu cate o picatura din
cultura de testat.
 Tubul 10 este martor
 Incubare 18-20 h la 370C
 Citire
 Ultimul tub limpede reprezinta limita
sensibilitatii germenului fata de antibioticul
utilizat sau CMI= Concentratia Minima
Inhibitorie.
 Daca se adauga un indicator de ph cresterea
bacteriana este pusa in evidenta in 4 h prin
virarea culorii indicatorului de ph-ului.
 Metoda dilutiilor in medii lichide este tehnica cea
mai precisa de determinare a sensibilitatii
microorganismelor la antibiotice si
chimioterapice si in plus permite determinarea
concentratiilor bacteriostatice si bactericide ale
substantelor testate
 Se realizeaza cu analizorul MiniAPI conform
indicatiilor din prospect specifice fiecarui tip
de germene, respectiv utilizandu-se
urmatoarele galerii de antibiograma: ATB
Staph, ATB Strep, ATB GN, ATB Enterococ. Se
urmaresc indicatiile de realizare a inocului, de
incubare si de interpretare specifice, descrise
in inserturi.
 Principiul este cel al unei antibiograme prin
microdilutii cu puncte de ruptura.
 Citirea se face automat prin softul
analizorului MiniAPI, inclusiv interpretarea
in sistem Expert.
 Este varianta perfectionata a metodei
difuzimetrice prin care se determina CMI a unui
antibiotic.
 Metoda foloseste in locul microcomprimatelor cu
antibiotic cate un epsilometru pentru fiecare
antibiotic ( fasii de material plastic, gadate,
imbibate cu cate un antibiotic). Gradatiile indica
valorile CMI in mcg/ml. Pe suprafata mediului
insamantat se depun radial la distante
convenabile epsilometrele si se incubeaza.
 Zonele de inhibitie apar de-a lungul
epsilometrului si au forma ovalara. Valoarea CMI
se citeste pe epsilometru si corespunde gradatiei
aflate la intersectia cu limita de inhibitie.
 Testarea sensibilităţii la antifungice este în prezent
standardizată numai pentru metodele cu macro şi
microdiluţie şi respectiv E-test. Deaceea în
laboratoarele clinice obişnuite se practică fie
antifungigrama pe galerii automate de tipul
Candifast, ce au ca principiu metoda microdilutiilor,
fie E-testul.
 Dozarea chimioterapicelor si antibioticelor
din umorile organismului este necesara
pentru evaluarea in vivo a eficientei unui
tratament cu chimioterapice sau antibiotice.
 Astfel se poate stabili daca concentratia
substantei se mentine in umorile
organismului la un nivel activ, permite
controlul modului si ritmului de administrare
ajuta la aprecierea corespondentei intre
eficacitatea in vivo si in vitro a substantei
utilizate, etc.
 Antibiograma este una dintre cele mai utile
determinari de laborator care aduce informatii
pretioase privind atitudinea medicului in terapia
cu antibiotice.
 Antibiogramele se vor repeta ori de cite ori o
dicteaza evolutia clinica dupa tratamentul cu
antibiotice si eventual se vor utiliza asociatii de
antibiotice pentru a obtine un efect terapeutic
mai promt si prevenirea instalarii rezistentei
bacteriei la antibiotice si chimioterapice.