LP 10

Dozarea proteinelor totale. Electroforeza proteinelor. / 3 ore

Proteine Plasmatice

Introducere

Plasma umană cuprinde între 6-8 g proteine la 100 ml. Proteinele

plasmatice constituie un amestec heterogen de componenţi, cu greutăţi
moleculare variind între 70 – 1500 kdal.

Utilizându-se diverse metode, proteinele plasmatice au fost separate in

fracţiuni mai mult sau mai puţin omogene, în funcţie de rezoluţia metodei
utilizate. Cel mai vechi procedeu de separare, aplicat proteinelor
plasmatice sau serice, este salifierea, precipitarea proteinelor din soluţii
prin adăugarea de cantităţi mari de săruri neutre: (NH4)2SO4, MgSO4,
NaCl, Na2SO4. Prin adăugarea de sulfat de amoniu se deosebesc două
fracţiuni majore: globulinele care precipită când concentraţia în sulfat de
amoniu a soluţiei care le cuprinde a atins semisaturaţia şi albumina care
precipită când soluţia este saturată cu sulfat de amoniu.

Prin aplicarea unor metode mai fine de separare s-au individualizat în

plasmă până la 35 fracţiuni proteice iar din aceste fracţiuni puţine sunt
omogene din punct de vedere fizico-chimic.

Activitatea Experimentală

Dozarea proteinelor totale (metoda colorimetrică bazată pe reacţia

biuretului)

Principiul metodei

În soluţie alcalină grupările peptidice ale proteinelor

plasmatice complexează ionii de Cu din reactivul biuret, dând
naştere unui compus colorat albastru - violet. Alături de proteine
se dozează şi peptidele mai mici prezente în ser.

Reactivi:
1. Reactiv biuret: format din 2 componente – sol. A si sol. B
Solutia A (stoc): 4,5 g tartrat de sodiu si potasiu (sare Seignette) se
dizolva in 40 ml NaOH 0,2N. Se adauga agitand puternic 1,5 g CuSO 4 x
5H2O dizolvat in 10ml a.d., apoi 0,5g KI si se completeaza la 100 ml cu
NaOH 0,2N. Se conserva in sticla bruna la temp. Laboratorului cateva
saptamani.
Solutia B (diluant): se dizolva 5g KI in 1000ml NaOH 0,2N. Se conserva
in sticla bruna la temp. Laboratorului cateva saptamani.
Solutia de lucru (rv biuret): se dilueaza 1 vol (20 ml) de solutie A cu 4
vol (100ml) solutie B. Se utilizeaza 1 saptamana, pastrata in sticla bruna.
2. Soluţie standard. Poate fi utilizat un ser standard cu conţinut bine
determinat de proteine sau soluţie albumină umană cristalizată cu
concentraţia de 5 - 7g/dl in solutie de NaCl 0,9%. Se conserva in
stare congelata iar la intrebuintare se decongeleaza si se utilizeaza o
singura data.
3. Solutie NaCl 0,9%. 9g sare se dizolva in a.d. si se aduce la
1000ml.

Proba: ser

Modul de lucru:

În 3 eprubete: proba, standard şi blanc (martor) se pipetează:

P (ml) S (ml) B (ml)

Reactiv biuret 5 (1) 5 (1) 5 (1)
Ser 0,1 (0,01) - -
nehemolizat
Soluţie - 0,1 (0,01) -
standard
Solutie NaCl - - 0,1 (0,01)
0,9%

Se agită. Se lasă în repaus 30 minute. Se citesc extincţiile probei E p

şi standardului Es faţă de blanc la lungimea de undă 546 nm.

Calcul:

Cp = x (concentraţia standard) = g proteine/dl ser.

Proba în alb (B) corespunzătoare fiecărei probe de analizat (P), ce

serveşte la eliminarea unei coloraţii proprii a serului cu proprietăţi de
absorbţie asemănătoare complexului colorat al proteinelor, este necesara
numai pentru serurile icterice sau hemolitice.

Valori normale
Nou nascuti: 5,2 – 9,0 g/100ml ser
Copii sub 3 ani: 5,6 – 8,6 g/100ml ser
Copii peste 3 ani si adulti: 6,6 – 8,6 g/100ml ser
Interpretare.

Proteinele plasmatice fiind heterogene se pot produce variaţii

independente ale diverşilor componenţi, sau diversele fracţiuni proteice
pot suferi modificări în sensuri opuse, astfel încât cantitatea totală de
proteine să nu sufere mari modificări. În general, creşterea albuminemiei
şi scăderea globulinemiei sunt situaţii rar întâlnite. Sunt însă frecvente
situaţiile opuse, de scădere a concentraţiei albuminei sau creştere a
concentraţiei unor fracţiuni globulinice.

Starea de hidratare a organismului influenţează valorile concentraţiei

proteinelor totale în ser prin modificarea volumului sanguin. Deshidratarea
poate simula o hiperproteinemie, în timp ce hiperhidratarea determină o
falsă hipoproteinemie. În cazurile incerte se recomandă coroborarea
rezultatului proteinemiei cu valoarea hematocritului (raportul între
volumul celulelor sanguine şi volumul sanguin).

Hipoproteinemiile sunt cauzate de pierderi de proteine prin:

 rinichi: pot fi eliminate cantităţi mari de proteine, în special

albumina, în afectiuni ca sindrom nefrotic, glomerulonefrite, infecţii
acute sau cronice, tulburări circulatorii, intoxicaţii;
 tubul digestiv: enteropatii diverse (colite, enterite, fistule);
 piele: arsuri şi inflamaţii exdutive sever.

Hipoproteinemia se mai întâlneşte în stările de subnutriţie, tulburări

ale digestiei şi absorbţiei aminoacizilor. De asemenea, diminuarea
capacităţii funcţionale a ficatului, sediul sintezei albuminei şi a unor
globuline, determină hipoproteinimia. Sarcina şi lactaţia sunt situaţii
fiziologice care pot determina hipoproteinemie.
Globulinele plasmatice se modifică în general în sensul creşterii
concentraţiei lor, fiind mai puţin întâlnite scăderi ale globulinemiei.
Hipoglobulinemia poate însoţi hipoalbuminemia consecutivă subnutriţiei.
De asemenea a fost descrisă o boală genetică caracterizată printr-un
defect al sintezei gamaglobulinelor (agamaglobulinemie).

Hiperproteinemiile sunt datorate în special creşterii globulinelor şi se

întâlnesc în inflamaţiile cronice, infecţii, viroze. Sunt foarte accentuate în
plasmocitom şi în macroglobulinemia Waldenström, prin dezvoltarea
malignă a unor linii celulare sanguine secretante de globuline.

Variaţii patologice
Valori scăzute (hipoproteinemii): malnutriţie, malabsorbţie,
maldigestie, inaniţie, tumori, peritonită, arsuri, hemoragii, ciroza,
insuficiență renală cronică, etc.
 Valori crescute (hiperproteinemii): diabet insipid, infecţii acute
şi cronice, deshidratare, diaree, stari febrile, TBC

SEPARAREA ELECTROFORETICĂ A PROTEINELOR SERICE

Principiu: Prin electroforeză se înţelege transportul particulelor încărcate

electric sub acţiunea câmpului electric continuu.

Viteza cu care se deplasează o particula într-un camp electric depinde de o

serie de factori ca:
- densitatea de sarcină electric la suprafaţa particulei (care este
funcţie de mărime sarcinii şi volumul particulei),
- densitatea particulei,
- gradientul de potenţial (dat de raportul dintre diferenţa de
potenţial dintre electrozi şi distanţa dintre aceştia),
- forţa ionică a mediului,
- vâscozitatea mediului,
- temperatura.

Dacă este supusă electroforezei o soluţie heterogenă, diversele tipuri de

particule din soluţie vor parcurge în acelaşi timp (şi în condiţii identice)
distanţe diferite, corespunzător sarcinii şi mărimii fiecăreia.

Proteinele, fiind compuse din resturi aminoacidice vor prezenta la

un anumit pH, diferit de punctul izoelectric, o sarcină electrică
netă, pozitivă sau negativă, determinată de suma algebrică a
sarcinilor electrice ale catenelor ataşate fiecărui aminoacid
component (ionizarea capetelor N- şi C- terminale având o
influenţă redusă), ceea ce va determina migrarea în câmp electric
continuu spre polul corespunzător.

Astfel, la valori ale pH-ului mediului sub punctul izoelectric proteina va fi

încărcată pozitiv şi va migra spre catod, iar la valori ale pH-ului mediului
peste punctul izoelectric, proteina va fi încărcată negativ şi va migra spre
anod. Datorită acestei proprietăţi este posibilă separarea proteinelor din
amestecuri complexe (cum este cazul serului uman), utilizând metoda
electroforetică.

Electroforeza proteinelor serice se efectuează în mod standardizat la pH

alcalin 8,6, pH la care amfionii macromoleculari proteici poartă o
încărcătură netă negativă şi se vor deplasa dinspre catod către
anod.

Vizualizarea benzilor rezultate în urma migrării diferitelor proteine se face

cu ajutorul coloranţilor ce au afinitate pentru proteine. Prin această
metodă în mod normal sunt obţinute 5 - 6 benzi definite: albumina,
alfa1-globuline, afla2-globuline, beta-globuline (fracţie ce în cazul
anumitor tehnici este subdivizată în beta1-globuline şi beta2-globuline)
şi gama-globuline.

Benzile colorate sunt eluate apoi individual cu o soluţie de NaOH şi ulterior

se măsoară extincţia fiecărui eluat la colorimetru sau benzile sunt citite
direct la densitometru.

Se calculează în procente ponderea fiecărei fracţii şi ulterior se face

raportarea la concentraţia proteinelor totale serice determinată separat.

Fractiunile proteice prin scanare densitometrica traseaza o

diagrama cu diferite varfuri ce corespund fractiilor proteice:

- primul varf reprezinta albumina

- al doilea varf reprezinta alfa 1 globulina
- al treilea varf reprezinta alfa 2 globulina
- al patrulea varf reprezinta beta globulina
- al cincilea varf reprezinta gama globulina

In functie de suportul de migrare, electroforeza poate fi:

- pe hârtie de filtru Whatman

- pe folii de acetat de celuloză
- electroforeza în gel de amidon
- electroforeza în gel de poliacriamidă

Valori normale

Fracţiune Valoare Valoare absolută

electroforetică (%) (g%)
Albumină 50-62 3,5 - 5,5
Globuline 38 - 50 2,5 – 3,5
Alfa1-globuline 4-8 0,2 - 0,4
Alfa2-globuline 6 - 10 0,5 – 0,9
Beta-globuline 8 - 15 0,6 - 1,1
Gama-globuline 10 - 20 0,7 - 1,7
Raport A/G 1,2 – 1,5
Proteine serice totale 100 6-8

Variații fiziologice

Variațiile electroforegramei sunt in funcție de vârstă, alimentatie, sarcina,

etc.
Variații patologice

Albumine

Scaderi: malnutritie, malabsorbtie, hepatita cronica, ciroza, sindrom

nefrptic

Cresteri (f. rare): leucemii, hipogamaglobulinemii

Globuline

Scaderi (foarte importante in prognosticul hepatitelor) – hipoglobulinemii

- hepatite cronice, ciroze, pierderi proteice (digestive, renale,
arsuri..)

Valori crescute - hiperglobulinemii

- infectii si imflamatii cronice, nefropatii cronice, hepatite acute și

cronice, perioada convalescenta boli acute,