Aplicaţii practice de

GENETICĂ
pentru
Asistență Medicală Generală

Coordonator: MARIA PUIU

DORINA STOICĂNESCU
CRISTINA GUG
SIMONA FARCAȘ
CRISTINA POPA
NICOLETA ANDREESCU
ADELA CHIRIȚĂ-EMANDI
ANDREEA DOBRESCU

1
 Colecţia: GHIDURI ŞI
ÎNDRUMĂTOARE DE LABORATOR

Tipărit la Imprimeria Universităţii de Medicină şi Farmacie

„Victor Babeş” din Timişoara - 2017
2
UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE “VICTOR BABEŞ” TIMIŞOARA

Aplicaţii practice de
GENETICĂ
pentru
Asistență Medicală Generală

Coordonator: MARIA PUIU

DORINA STOICĂNESCU
CRISTINA GUG
SIMONA FARCAȘ
CRISTINA POPA
NICOLETA ANDREESCU
ADELA CHIRIȚĂ-EMANDI
ANDREEA DOBRESCU

Editura “Victor Babeş”

Timişoara, 2017

3
Editura „Victor Babeş”
Piaţa Eftimie Murgu 2, cam. 316, 300041 Timişoara
Tel./ Fax 0256 495 210
e-mail: evb@umft.ro
www.evb.umft.ro

Director general: Prof. univ. dr. Dan V. Poenaru

Director: Prof. univ. dr. Andrei Motoc

Colecţia: GHIDURI ŞI ÎNDRUMĂTOARE DE LABORATOR

Indicativ CNCSIS: 324

© 2017 Toate drepturile asupra acestei ediţii sunt rezervate.

Reproducerea parţială sau integrală a textului, pe orice suport, fără acordul scris al
autorilor este interzisă şi se va sancţiona conform legilor în vigoare.

Descrierea CIP a Bibliotecii Naţionale a României

Aplicaţii practice de genetică pentru asistenţă medicală generală /
Dorina Stoicănescu, Cristina Gug, Simona Farcaş, ... ; coord.: Maria
Puiu. - Timişoara : Editura Victor Babeş, 2017
Conţine bibliografie
ISBN 978-606-786-044-3

I. Stoicănescu, Dorina
II. Gug, Cristina
III. Farcaş, Simona
IV. Puiu, Maria (coord.)

61

4
 CUPRINS

Introducere 7
Capitolul 1
GLOSAR 9
Capitolul 2
CROMOZOMII UMANI: MORFOLOGIE, METODE DE EVIDENŢIERE 23
2.1 Structura şi morfologia cromozomilor umani 23
2.2 Metode de evidenţiere a cromozomilor umani 26
Capitolul 3
INDICAŢIILE EFECTUĂRII ANALIZELOR CITOGENETICE 27
Capitolul 4
BANDAREA. NOMENCLATURA CROMOZOMILOR UMANI 29
4.1. Tehnici de bandare cromozomială 29
4.2. Polimorfismele cromozomiale 34
4.3. Morfologia grupelor de cromozomi 34
4.4. Norme pentru scrierea formulei citogenetice 36
4.5. Analiza citogenetică moleculară 38
Capitolul 5
IMPORTANŢA TESTĂRII ADN. EXEMPLIFICĂRI 47
5.1. Metoda PCR 47
5.2. Analiza RFLP 51
5.3. Secvenţializarea ADN 54
5.4. Tehnica MLPA 56
5.5. Tehnica microarray 57
5.6. Secvențierea de nouă generație 57
Capitolul 6
MITOZA ŞI MEIOZA 59
6.1. Diviziunea mitotică 59
6.2. Aspecte comparative între mitoză şi meioză 62
6.3. Diviziuni mitotice anormale 64
6.4. Diviziuni meiotice anormale 64
Capitolul 7
GAMETOGENEZA 67
7.1. Spermatogeneza 67
7.2. Ovogeneza 69
7.3. Modificările materialului genetic în procesul de gametogeneză 72

5
 7.4. Fecundaţia 74
7. 5. Procedee pentru inducerea fecundaţiei în stările de infertilitate sau
sterilitate 76
Capitolul 8
EREDITATEA CARACTERELOR FIZIOLOGICE 79
8.1. Sistemele genetice sanguine eritrocitare (grupa sanguină AB0 și Rh) 79
Capitolul 9
BOLI CROMOZOMIALE AUTOZOMALE 85
9.1. Trisomia 21 (Sindromul Down) 86
9.2. Trisomia 18 (Sindromul Edwards) 88
9.3. Trisomia 13 (Sindromul Patau) 89
Capitolul 10
BOLI CROMOZOMIALE GONOZOMALE 91
10.1. Abateri de la cariotipul 46,XX 91
10.2. Abateri de la cariotipul 46,XY 94
Capitolul 11
ASPECTE CITOGENETICE ȘI MOLECULARE ÎN CANCER 99
11.1. Anomalii cromozomiale întâlnite în procesele maligne 99
11.2. Aspecte citogenetice şi moleculare în leucemii 102
11.3. Aspecte citogenetice şi moleculare în tumori maligne 105
Capitolul 12
CONSULTUL GENETIC (I) 111
12.1. Circumstanţele consultului genetic 111
12.2. Obiectivele consultului genetic 111
12.3. Etapele consultului genetic 112
12.4. Acordarea sfatului genetic 117
Capitolul 13
SCREENINGUL BOLILOR GENETICE. TESTE BIOCHIMICE 119
13.1. Tipuri de teste screening 120
13.2. Depistarea mucoviscidozei (fibroza chistică) 121
13.3. Depistarea fenilcetonuriei 121
13.4. Depistarea hipotiroidismului 123
13.5. Depistarea hiperplaziei congenitale de suprarenală prin deficit de 21
β-hidroxilază 124
13.6. Testarea auditivă 124
Capitolul 14
DIAGNOSTICUL ANTENATAL 127
Bibliografie 149

6
 Introducere

De la primele încercări de a pătrunde în universul fiinţei umane şi

până la descifrarea mecanismelor eredităţii a trecut mai puţin de un secol.
Astăzi termeni precum cromozomi, gene, ADN, mutaţie, fac parte din
limbajul ştiinţific curent şi nu mai suntem uimiţi că întreaga noastră viaţă
este condiţionată genetic.
Toate aceste descoperiri au revoluţionat medicina transformând-o
într-o medicină genetică. Nenumărate boli au putut fi înţelese ca mecanism,
iar terapia lor s-a îmbogăţit cu o nouă perspectivă, terapia genică.
Întreaga patologie umană şi-a schimbat clasificarea. Şi evoluţia
cunoaşterii în domeniul geneticii nu pare să se oprească aici. Mai alert ca în
alte discipline, informaţiile se succed rapid şi ele încep să fie aplicate în
practica medicală curentă, in beneficiul bolnavului şi a familiei sale.
Din aceste motive, Cursul de Genetică pentru Asistență Medicală
Generală ca şi curs al disciplinei de Genetică medicală a apărut din dorinţa
de a aduce studenţilor informaţii noi, actualizate şi ordonate în maniera cea
mai adecvata procesului de învățământ. El include tematicile necesare unei
pregătiri teoretice şi practice adecvate.
Bogat ilustrat, elaborat conform programei analitice specifice
Asistenței Medicale Generale, națională și internațională, cursul reprezintă,
în egală măsură, un îndreptar extrem de util rezidenţilor şi specialiştilor,
tineri asistenți medicali care se întâlnesc în practica curentă cu patologia
genetică, cu bolile rare, despre care au mai puţine informaţii.
Sper ca lucrarea propusă studenţilor să permită o creştere a nivelului
de pregătire şi în egală măsură, prin ei şi prin tinerii absolvenţi o creştere a
nivelului de adresabilitate a bolnavilor către cabinetele de consult genetic, în
speranţa unui diagnostic genetic mai exact, a unei profilaxii genetice
adecvate şi a unei terapii cât mai eficiente.

7
8
 Capitolul 1
GLOSAR

Genetica medicală: domeniul din medicină care se ocupă cu descifrarea şi

cunoaşterea naturii genetice a bolilor umane. Ea studiază structurile,
mecanismele şi legile de bază ale transmiterii eredităţii, a mesajului genetic
de la o generaţie la alta, atât pentru caracterele normale cât mai ales pentru
cele patologice.

Ereditate: ansamblul caracterelor transmise de la părinţi la copii

(moştenirea biologică). Moştenirea biologică poate fi apreciată prin studiul
mai multor nivele: nivel molecular al eredităţii (studiul acizilor nucleici, a
genelor normale sau cu mutaţii, a relaţiilor gene-proteine), nivelul
citogenetic al eredităţii (studiul cromozomilor), nivelul fenotipic al
eredităţii (aspectele morfologice, funcţionale, psihice ale pacientului) și
nivelul statistic populaţional (studiul membrilor familiei și/sau studiul unui
grup, al unei comunităţi de indivizi).

Agregare familială: Prezența în cadrul aceleiași familii a mai multor

persoane cu un același caracter patologic, în aceiași generație sau în
generații succesive.

Acizii nucleici: reprezintă materialul genetic cu elementele constituţionale

primare, denumite nucleotide.

ADN: înlănţuire de nucleotide formate fiecare dintr-un glucid (dezoxiriboză),

dintr-o grupare fosfat şi dintr-o bază azotată (A, C, G, T).

ARN: înlănţuire de nucleotide. Deosebit de ADN prin glucidul care este

riboza (la ADN este dezoxiriboza) și de baza azotată uracil (la ADN este
timina).

ARN de transfer sau de transport (ARNt): ARN cu o configuraţie

specială, care transportă aminoacizii pentru sinteza proteică.

9
ARN mesager (ARNm): moleculă de ARN transcrisă de pe ADN, care
conţine secvenţa ce codifică sinteza de proteine.

ARN ribozomal (ARNr): familie de molecule care servesc la compunerea

ribozomilor şi care participă la sinteza de proteine.

Fig. 1

Alele: genele pereche din locusuri omoloage.

Alelă: variantă structurală normală sau patologică a unei gene de pe un

locus dat.

Alelie multiplă: prezența unor alele diferite, pe același locus, la indivizi

diferiți, determinând variante intermediare ale aceluiași fenotip (vezi
sistemul de grup sangvin ABO).

Autozomi: cromozomii perechilor 1-22, alții decât cromozomii X și Y.

Aneuploid: aneuploidie – deviaţie numerică a cromozomilor din celulă:

= hiperploidie (2n+1; n+1)
= hipoploidie (2n -1; n -1)

10
Alterare genetică: expresie care desemnează orice modificare a structurii
(deleţie, schimbare de secvenţă, inversie etc.) unei gene sau a unui
cromozom.

Atrezie: organ sau parte de organ care lipseşte sau este rudimentar
dezvoltat.

Ataxie: tulburare a coordonării mişcărilor voluntare din cauza lezării unor

căi şi/sau centri nervoşi.

Atrofie: regresie morfologică ori funcţională a unui ţesut sau organ.

Aminoacizi (Acizi aminaţi): elemente chimice care intră în constituţia

proteinelor, determinate prin informaţia genetică. Modificarea materialului
genetic determină anomalii în sinteza aminoacizilor şi construirea unor
proteine anormale ca structură şi/sau funcţie.

B
Baze azotate: literele alfabetului chimic care servesc la scrierea mesajului
genetic. Informaţia în ADN este scrisă prin 4 astfel de litere (baze azotate: A
= adenină, T = timină, G = guanină şi C = citozină). Informaţia genetică este
înscrisă în ARN tot prin 4 litere (baze azotate: A = adenină, U= uracil, G =
guanină şi C = citozină).

Boală genetică: boală cauzată prin alterarea materialului genetic (genă,

gene, cromozom, genom).

Boală ereditară: boală cauzată de o modificare a materialului genetic,

moştenită de la genitori şi transmisă în succesiunea generaţiilor, dacă nu
are prognostic infaust letal.

Boală congenitală: anomalie instalată în viaţa intrauterină şi prezentă la

naştere, detectabilă imediat sau mai tardiv.

Brahicefalie: forma anormală, aproape rotundă a craniului.

11
 C
Cariotip: este o reprezentare şi o clasificare a ansamblului cromozomilor
umani. Prin extindere, cariotipul reprezintă examenul sau investigaţia care
vizează acest rezultat la un anumit individ, pentru stabilirea numărului şi a
aspectului cromozomilor.

Fig. 2

Cromozom: forma de organizare a materialului genetic în timpul diviziunii

celulare.
Cromozomi omologi (cromozomi pereche): cromozomi identici ca formă,
mărime şi origine diferită (unul matern, celălalt patern).

Centromer: porțiunea cea mai condensată a cromozomului, care unește cele

două cromatide, până la sfârșitul metafazei. Poziția centromerului permite
clasificarea cromozomilor în metacentrici, submetacentrici și acrocentrici.

Cromatide: filamente rezultate prin dedublarea unui cromozom înainte de

diviziunea celulei și care vor deveni, după această diviziune, câte un
cromozom al celulei fiice.

12
Cromatină: Substanţă care reprezintă componenta chimică de bază a
nucleului celular, având o mare afinitate pentru coloranţii bazici, constituită
din acizi nucleici asociați cu proteine.

Clonă celulară: totalitatea celulelor identice genetic care derivă dintr-o

celulă iniţială, prin mitoze succesive. Fiecare diviziune produce o nouă
generaţie celulară.

Cod genetic: fiecare genă conţine informaţia necesară pentru sinteza unei
proteine. Informaţia este conţinută în secvenţa celor 4 baze azotate (A,T, C,
G) care se aliniază pe fragmentul de ADN. O proteină este constituită dintr-
o înşiruire liniară de aminoacizi. Secvenţializarea (aşezarea) aminoacizilor
în proteină este determinată de secvenţializarea genei care codifică această
proteină. Există, deci, o corespondenţă între bazele azotate din ADN (genă)
şi aminoacizi. Această corespondenţă constituie codul genetic.

Citogenetica: parte a geneticii care se ocupă cu studiul cromozomilor.

Congenital: prezent la naștere

D
Distanţă genetică: distanţa dintre două gene pe un cromozom.

Diploidie: starea celulei somatice, care posedă două seturi cromozomiale (2n).

Disomie: starea celulei somatice ce posedă doi cromozomi omologi. Dacă

aceştia provin de la un părinte, dar au gene diferite, de la ambii bunici se
foloseşte termenul de heterodisomie uniparentală, iar dacă genele sunt
identice, provin de la un/o bunic/ă , izodisomie sau disomie uniparentală.

Deleţia: anomalie structurală nebalansată (dezechilibrată), constând în

pierderea unei porțiuni cromozomiale.

Dominantă: genă care se exprimă şi în homozigoţie şi în heterozigoţie

Duplicaţia de braţ: anomalie structurală nebalansată (dezechilibrată),

trisomie parţială, sau surplusul unui braţ regăsit liber în cariotip sau
translocat pe un alt cromozom.

13
 E
Ectopie Poziţie anormală a unui organ.

Eucariote: organisme vii având specific faţă de procariote nucleul

înconjurat de o membrană nucleară.

Euploid: număr normal de cromozomi caracteristic celulei şi speciei.

Expresivitate: aspect calitativ al genei dominante, referindu-se la gradul de

severitate al unei boli determinate de această genă/gene. Expresivitatea
variabilă se referă la manifestarea variabilă a acestei boli la diferiți bolnavi,
chiar în cadrul aceleiași familii.

F
Fenotip: totalitatea caracteristicilor (morfologice, anatomice, psihice şi
fiziologice) determinate de ansamblul genelor (genotipul) organismului şi
de factorii externi nongenetici (factori de mediu).

Fig. 3

Fenocopie caracter fenotipic cauzat de mediu asupra produsului de

concepţie în viaţa intrauterină, imită un caracter determinat genetic.

Fibroblast: celulă a ţesutului conjunctiv, nediferenţiată, utilizată pentru

analiza citogenetică, în diagnosticul antenatal.

14
 G
Genă: segment din molecula de ADN sau ARN (numai la retrovirusuri), cu
lungime variabilă, cu rol în sinteza de produşi specifici.

Fig. 4

Genom: totalitatea informaţiei genetice aparţinând unei celule. Genomul

este identic în toate celulele organismului respectiv.

Genomica: parte a geneticii care studiază genomul. Metodele de studiu

ale genomicii necesită o abordare multidisciplinară.

Genomica funcțională: parte a genomicii care studiază funcția genelor,

reglarea lor și interacțiunile produșilor lor de expresie, ARN și proteine.

Genomica structurală: parte a genomicii care studiază structura fizică și

organizarea genomului și a proteomului.

Genotip: totalitatea genelor unui organism. În practica geneticii se

utilizează şi pentru a desemna combinaţia de gene care realizează un anumit
caracter.

15
Genealogie: filiație a membrilor unei familii, pe diferite generații, în funcție
de gradul lor de rudenie. Reprezentarea într-un tablou, grafic al unei astfel
de filiații.

Gonozomi: cromozomi sexuali (X,Y).

Genitor: părinte, individ care a dat naştere la descendenţi.

Ginandrie: prezenţa la femei a caracterelor sexuale secundare masculine.

Gamet: celulă sexuală matură cu n cromozomi (23), masculină

(spermatozoid) sau feminină (ovul), obţinută prin diviziune meiotică, din
celule precursoare cu 2n (46) cromozomi.

Genă candidat: genă care este suspectată de a fi cauza apariţiei unei

afecţiuni.

Gena de predispoziţie la o boală: genă care are tendinţa de a favoriza dez-

voltarea unei boli, în asociere cu alte gene şi/sau cu diverşi factori de mediu.
Sunt cunoscute, de exemplu, numeroase gene de predispoziţie la cancer.

H
Haploidie: starea celulei sexuale mature (gameţi), care posedă un singur set
cromozomial (n).

Heterozigoţie: starea în care alelele sunt diferite pe locusuri omoloage.

Homozigoţie: starea în care alele identice ocupă locusuri omoloage.

Hărţi genetice: un fel de atlase ale genomului unei specii, în care sunt
poziţionate, de-a lungul cromozomului, numeroase repere care facilitează
localizarea genelor.

I
Inversia: anomalie structurală balansată (echilibrată) ce constă în ruperea
unui fragment de cromozom şi realipirea lui în acelaşi loc după o rotire cu
180º.

16
Inginerie genică: totalitatea instrumentelor care permit izolarea, purificarea
şi obţinerea în cantitate suficientă a unei gene, cu scopul studierii structurii,
funcţiei şi reglării ei. Aceste instrumente au revoluţionat biologia şi au
furnizat metodologii pentru cercetările de genetică moleculară.

L
Locus: poziţia ocupată de genă la nivelul cromozomului.

Legile lui Mendel: legile de bază ale transmiterii ereditare, stabilite de

Gregor Mendel prin 1860, valabile şi astăzi. Aceste legi stipulează
modelele transmiterii monogenice, precizând riscul recurenţei unei
afecţiuni determinate de genele autozomal dominante, autozomal
recesive, recesiv sau dominant legate de X.

M
Metafază: etapă a diviziunii celulare care permite studiul numeric şi
morfologic al cromozomilor.

Fig. 5

17
Monosomie: anomalie cromozomială numerică în care un cromozom dintr-
o pereche este prezent într-un singur exemplar.

Mozaicism: prezenţa în acelaşi organism a două sau mai multe linii

celulare.

Mutaţie: modificare a materialului genetic (cel mai frecvent al genei)

cauzată de factorii de mediu mutageni.

Marker: indicator al cărui dozare permite explorarea unei patologii

specifice.

Meioza: proces de diviziune celulară prin care se maturează gameţii (ovul şi

spermatozoid), cu înjumătăţirea numărului de cromozomi (n cromozomi).

Mitoza: proces dinamic prin care o celulă somatică se divide în două celule
noi, având conţinut genetic identic (2n cromozomi).

Mişcari stereotipe: mişcări care se repetă în aceleaşi condiţii, care sunt

mereu la fel, neschimbate.

Malformaţie: viciu de conformaţie a unui segment, organ, de cauză

mezologică (prin factorii de mediu), care acţionează în perioada de formare
a fătului şi este, de obicei, congenital (prezent la naştere).

N
Nanism Creştere insuficientă în înălţime.

Nucleotid: unitatea de bază a acizilor nucleici, compusă din asocierea unei

baze azotate (A, C, G, T în ADN, A, C, G, U în ARN), a unui glucid
(dezoxiriboză în ADN, riboză în ARN) şi a unei grupări fosfat.

O
Oncogenetică: Specialitate medicală care se ocupă cu studiul genetic al
diferitelor forme de cancer.

18
Ontogeneză: dezvoltarea individului, de la oul fecundat până la stadiul de
adult; ontogenie.

Oogeneză/Ovogeneză: formarea oocitului în ovar, în vederea maturării

ovulului, în cadrul procesului gametogenezei feminine.

Ovul: gametul feminin, produs de ovar.

Oncogenă: genă care, în urma unei mutaţii survenite la nivelul său, codifică
o proteină care va stimula o diviziune celulară excesivă. Aceasta determină
o proliferare celulară anarhică, proces ce stă la baza cancerelor.

Onicofagie: obicei de a-şi mânca unghiile; roadere a unghiilor.

P
Patern: care aparţine tatălui, privitor la tată, moştenit de la tată.

Penetranță: aspect cantitativ al genei dominante, constând în procentul de

manifestare în fenotip a genei aflate în stare de heterozigoție.

Plică simiană: pliu palmar de flexie unic, mai frecvent în sindromul Down.
În proporţie de 1-4% apare şi la indivizi sănătoşi.

Proteom: ansamblul proteinelor codificate de un genom, la un moment

determinat și caracterizat prin cantitatea și conformația lor.

Proteomică: disciplină care identifică și caracterizează proteinele unei

celule sau a unuia dintre compartimentele sale și analizează expresia,
funcția și interacțiunile lor.

Prenatal: anterior naşterii.

Prognatism: proeminenţa maxilarelor.

Prolaps: căderea sau ieşirea anormală a unui organ din cavitatea în care se
găseşte în mod normal.

19
Proteină: substanţă organică, cu rol important în celula vie, rezultând prin
polimerizarea unui mare număr de aminoacizi. Structura proteinei este
determinată de informaţia genetică, iar modificările ei sunt cauzate de
mutaţii la nivelul unor gene.

R
Recesivă: genă care se exprimă numai în stare de homozigoţie (obligatoriu
alele identice).

S
Simptom: manifestare a unei boli; indiciu, semn clinic.

Simptomatologie: totalitatea simptomelor unei boli.

Spermatogeneză: formarea spermatozoizilor, gameţii masculini.

Sindrom: complex de simptome care caracterizează o anumită boală,

afecţiune.

T
Translocaţia: anomalie structurală balansată (echilibrată), caracterizată prin
ruperea unui fragment de cromozom şi realipirea sa pe alt cromozom.

Transcriptom: ansamblul de ARN mesager care traduce expresia genică a

unei celule, a unui țesut sau a unui organism, la un moment dat.

Trisomie: anomalie cromozomială numerică în care un cromozom este

prezent suplimentar perechii normale.

Teratogen: agent de mediu care produce malformaţii.

Terapie genică: formă nouă de tratament, încă experimentală, constând în

introducerea unei gene normale, în organismul purtător al unui defect
genetic, cu scopul de a corecta acest defect.

20
Tonus muscular: stare permanentă de uşoară tensiune a muşchilor unui
organism sănătos (aflat în repaus). Hipotonie musculară = tonus muscular
scăzut. Hipertonie musculară = tonus muscular crescut.

V
Vector (Terapie genetică): vehicul servind pentru transportul genei
corectoare şi introducerea ei în celulele ţintă bolnave, cu scopul reparării
defectului genetic pe care acestea îl prezintă. Aceşti vectori sunt în general
virusuri devenite inofensive, adenovirusuri sau retrovirusuri, plasmide sau
construcţii artificiale asociind lipide (lipozomi).

Z
Zigot: celula rezultată din unirea a doi gameţi; celulă ou.

21
22
 Capitolul 2
CROMOZOMII UMANI: MORFOLOGIE,
METODE DE EVIDENŢIERE

Nivelul citogenetic de studiu al materialului ereditar cuprinde câteva

metode care se folosesc pentru evidenţierea cromozomilor umani atunci
când fenotipic există modificări care indică o boală cromozomială, respectiv
afectarea informaţiei ereditare la acest nivel.
Metodele constau în efectuarea de culturi celulare in vitro (din
limfocite, celule fetale din lichidul amniotic, fibroblaste inclusiv din ţesutul
embrionar, celule din măduva hematogenă etc), pentru evidenţierea
cromozomilor sau studiul direct al cromozomilor, fără realizarea de culturi,
de exemplu din celulele maligne sau din măduva hematogenă (puncţie
sternală - boli mieloproliferative), după blocarea diviziunii celulare în
metafază.

2.1 Structura şi morfologia cromozomilor umani

Noţiunea de cromozom a fost introdusă de Waldeyer in 1888 pentru
a defini corpusculii cu afinitate pentru coloranţii bazici, observaţi la
microscop în timpul diviziunii celulare.
Cromozomii sunt formaţiuni microscopice a căror morfologie
caracteristică este descrisă în metafaza mitozei prin blocarea diviziunii
celulare cu o substanţă statmokinetică - colcemid (colchicină).
Cromozomii sunt deţinătorii informaţiei ereditare, fiind constituiţi
din ADN şi proteine. Ei conţin gene aşezate liniar.
Metafaza este momentul optim de studiu al cromozomilor din punct
de vedere citogenetic deoarece aceştia sunt maxim condensaţi şi spiralizaţi,
respectiv sunt bicromatidici, datorită replicării semiconservative a ADN-ului
din faza S a interfazei.
Ca număr, structură şi morfologie, cromozomii sunt caracteristici
fiecărei specii. La om, în celulele somatice (diploide), cei 46 cromozomi
sunt dispuşi în 23 de perechi (două garnituri 2n = 46). Cromozomii unei
perechi se numesc omologi, având aceeaşi mărime, structură, distribuţie de

23
benzi, morfologie, poziţie a centromerului, conţinut în gene alele dar, origini
diferite: unul matern (provenit prin ovul), celălalt patern (provenit prin
spermatozoid). În celulele somatice la om există 22 de perechi de
cromozomi autozomi şi o pereche de cromozomi sexuali (heterosomi sau
gonozomi): perechea XX la sexul feminin şi XY la sexul masculin.
Cromozomii din perechea de gonozomi XY nu sunt cromozomi
omologi, deoarece cromozomul Y are o talie mult mai mică (aprox. 1/3 din
cromozomul X) şi în evoluţia filogenetică a pierdut majoritatea materialului
genetic, păstrând gene implicate în sexualizarea de tip masculin şi doar
câteva gene somatice.

Morfologia cromozomilor metafazici

Elemente structurale obligatorii

1. cromatidele surori: sunt două subunităţi longitudinale genetic

identice reprezentând fiecare câte o cromatidă şi conţinând în structura
intimă câte o moleculă de ADN rezultată prin replicarea semiconservativă.
2. telomerele: extremităţile terminale rotunjite ale cromatidelor care
conţin ADN înalt repetitiv şi au rol în menţinerea structurii cromozomilor, a
individualităţii lor. Telomerele previn fuzionarea capetelor cromozomilor în
cazul deleţiei terminale şi apariţia de cromozomi dicentrici sau policentrici.
Dacă în urma deleţiei nu se mai reface structura telomerelor unui
cromozom, capetele cromatidelor se pot uni, rezultând o structură anormală,
cromozom cu aspect de ring.
3. centromerul: locul de unire al celor două cromatide surori la
nivelul constricţiei primare (cromatidele sunt mai îngustate). La cromozomii
coloraţi prin tehnicile convenţionale, constricţiile primare sunt slab colorate
sau acromatice.
Datorită poziţiei constante, centromerul constituie unul din markerii
caracteristici pentru descrierea tipurilor morfologice de cromozomi.
Centromerul împarte cromozomul în două braţe: braţul “p” mai scurt,
orientat în partea superioară faţă de un plan imaginar ce trece prin centromer
şi braţul “q “, mai lung, situat în partea inferioară a planului de referinţă.

24
 În funcţie de poziţia centromerului s-au descris trei tipuri
morfologice de cromozomi umani (Fig. 6):
 metacentrici, cu centromerul situat în regiunea mediană a cromozomului
şi braţe egale;

Fig. 6. Morfologia cromozomilor umani

 submetacentrici, cu centromerul situat submedian şi braţe inegale (p < q);

 acrocentrici,cu centromerul situat în regiunea terminală a cromozomului
şi braţe mult inegale (p << q).

Fig. 7. Reprezentarea schematică a unui cromozom acrocentric

4. Kinetocorii: structuri mici, rotund ovalare, plasată la nivelul

centromerului (câte unul pentru fiecare cromatidă), de care se leagă fibrele
fusului mitotic şi care se evidenţiază numai prin folosirea unor tehnici
speciale de fixare şi colorare.

25
 Elemente structurale neobligatorii

Constricţiile secundare (îngustări secundare ale cromatidelor) sunt

prezente numai la unii cromozomi umani. Pentru cromozomii acrocentrici,
constricţiile secundare sunt localizate terminal, în regiunea distală a braţelor
scurte, la nivelul pedunculului satelifer, filament de cromatină care uneşte
satelitul cu segmentul proximal al braţului scurt (p).
Constricţiile secundare proximale, se găsesc în porţiunea proximală a
braţelor lungi cromozomiale (braţul “q”, mai aproape de centromer), la
cromozomii 1, 9, 16. S-a demonstrat că la cromozomii acrocentrici
construcţiile secundare au rol de organizatori nucleolari.

Sateliţii sunt situaţi în porţiunea distală a braţului scurt al

cromozomilor acrocentrici, au formă rotundă sau ovală şi conţin ADN înalt
repetitiv. Cromozomii acrocentrici se pot ataşa prin sateliţi, realizând o
asociaţie satelitică
Această asociere constituie un factor predispozant pentru
nondisjuncţii cromozomiale în gametogeneză, cu apariţia de gameţi
aneuploizi, mecanism implicat în eşecurile de reproducere.

2.2 Metode de evidenţiere a cromozomilor umani

Cariotipul este aranjamentul standard al cromozomilor unei celule

şi este realizat cu scopul de a detecta aberaţiile cromozomiale numerice sau
structurale, omogene sau în mozaic, ale autozomilor sau ale gonozomilor.
Cromozomii sunt fotografiaţi şi dispuşi după criterii standard. Acest examen
se poate realiza folosind diferite tipuri de celule: limfocite sangvine, celule
tumorale (şi cele din măduva hematogenă), fibroblaşti, celule germinale,
celule amniotice sau trofoblast, în funcţie de indicaţie.

26
 Capitolul 3
INDICAŢIILE EFECTUĂRII ANALIZELOR CITOGENETICE

Stabilirea indicaţiei de cariotip presupune un examen clinic precis,

care permite adesea suspectarea anomaliei, întrucât pierderea sau câştigarea
unui segment cromozomic determină un tablou clinic adesea stereotip, cu o
dismorfie caracteristică.
În general anomaliile autozomilor au consecinţe grave şi difuze
asociind: o dismorfie cranio-facială, tulburări de tonus, un retard mental,
anomalii ale dermatoglifelor şi malformaţii viscerale, frecventa dar
nespecifice. In practica medicală curentă indicaţiile cariotipului sunt relativ
restrânse: cele mai multe boli genetice nu sunt în general explorate prin
cariotip şi o malformaşie viscerală izolată se acompaniază foarte rar de o
anomalie cromosomică.

Pricipalele indicaţii ale cariotipului sunt:

La copil:
 fenotip evocator al unui sindrom cromozomic
 asocierea : hipotonie neonatală / dismorfism/ malformaţii
 ambiguitate sexuală
 retard mental/ tulburări de comportament/ dismorfie/ malformaţii
 tulburări ale dezvoltării sexuale şi de creştere
 fenotip evocator pentru un sindrom cu microdeleţie/ duplicaţie

La adult:
 Părinţi/ familia copilului purtător al unei anomalii cromozomiale
 Cupluri cu avorturi spontane repetate
 Antecedente personale sau familiale de moarte fetală sau de
malformaţii recurente
 Bilanţ înainte de a recurge la procreerea asistată medical
 Amenoree/ menopauză precoce
 Azoospermie sau oligospermie severă.

27
28
 Capitolul 4
BANDAREA. NOMENCLATURA CROMOZOMILOR UMANI

4.1. Tehnici de bandare cromozomială

Prin anumite procedee tehnice (denaturare termică şi enzimatică) urmate
de colorare, cromozomii din preparatele microscopice obţinute după fixare pot fi
coloraţi neomogen, cu benzi care alternează, mai intens colorate şi mai puţin
colorate, într-un model caracteristic şi constant pentru fiecare pereche.
Bandarea cromozomială permite astfel recunoaşterea exactă a
perechilor de omologi, identificarea aneuploidiilor, dar mai ales identificarea
modificărilor structurale cromozomiale.
Prima tehnică de bandare a fost introdusă în 1958 de către
Caspersson, care descrie utilizarea quinacrinei pentru a banda preparatele
cromozomiale şi a inaugurat o nouă eră a bandării cromozomului. În 1971,
bandarea a fost definită ca metoda prin care la nivelul unui cromozom se pot
distinge clar segmentele adiacente, datorită colorării diferite a acestora.
Există mai multe tehnici ce utilizează diferite substanţe chimice
pentru a identifica anumite regiuni cromozomiale, prin realizarea unui
model tipic de benzi cromozomiale. De exemplu benzile intens colorate
sunt, în general, pericentromeric sau la nivelul telomerelor.
Benzile intens colorate corespund, în general heterocromatinei, în
timp ce benzile decolorate sau slab colorate reprezintă eucromatină.
În funcţie de gradul de condensare al cromozomilor (în metafază sau
prometafază), numărul benzilor variază şi defineşte rezoluţia analizei
citogenetice. Un cariotip standard are o rezoluţie de aproximativ 350-550
benzi / set haploid, iar un cariotip prin înaltă rezoluţie o rezoluţie de 800 sau
1000 de benzi per set haploid (fig. 8).

Fig. 8. Diferite nivele de rezoluţie în bandarea cromozomilor

29
 ISCN reprezintă Sistemul Internaţional de Nomenclatură
Citogenetică Umană. Conform normelor ISCN numerotarea benzilor
cromozomiale începe de la nivelul centromerului spre telomere. Braţul p
reprezintă brațul superior, iar braţul q reprezintă brațul de sub centromer.
Precizarea unor părţi din cromozomi, benzi sau subdiviziuni de benzi
(pentru cromozomii profazici din înalta rezoluţie) se realizează cu ajutorul
unor repere care împart fiecare braţ în regiuni. Regiunile cuprind mai multe
benzi, numerotate de la centromer spre telomere, separat de-a lungul fiecărei
cromatide, începând cu cifra 1. Numerotarea benzilor se face după ce s-a
notat numărul cromozomului, braţul cromozomului, numărul regiunii şi
benzii şi/sau sub-benzii. De exemplu, 18q12.3 semnifică cromozomul 18,
braţul lung, regiunea1, banda 2, sub-banda 3 (fig. 9).

Fig. 9. Cromozomul 18:

regiuni şi benzi pe ambele braţe

Există patru metode principale de

bandare pentru a identifica cromozomii:
 bandarea G,
 bandarea Q,
 bandarea R,
 bandarea C.

Bandarea G (G=Giemsa)
În cadrul acestei tehnici de bandare cromozomii sunt tratați cu
tripsină, apoi coloraţi cu soluţie Giemsa, apărând un sistem de benzi
colorate (întunecate) şi decolorate (luminoase). Benzile decolorate
corespund regiunilor eucromatice a cromozomilor iar cele colorate
corespund regiunilor heterocromatice (fig. 10).
Benzile G intens colorate sunt echivalente celor Q fluorescente.

Tehnica bandării
Preparatele microscopice sunt introduse într-o soluţie de tripsină
EDTA – tampon buffer 1:250 pentru 25-30 de secunde. Lamele sunt apoi
trecute printr-o baie tampon buffer şi apoi colorate cu o soluţie Giemsa 5%
pentru aproximativ 5 minute.

30
 Fig. 10. Cariotip în care cromozomii sunt bandaţi G

Aplicaţiile bandării G:
 identificarea benzilor eucromatice;
 identificarea cromozomilor, a anomaliilor cromozomiale,
aneuploidiilor, rearanjamentelor structurale;
 vizualizarea regiunilor omogen colorate din cancere.

Dezavantaje:
 imposibilitatea detectării translocaţiilor mici, detectarea
microdeleţiilor;
 ineficientă pentru caracterizarea cromozomilor în cadrul unor
rearanjamente complexe.

Bandarea C (C=centromer)
Acest tip de bandare permite evidențierea heterocromatinei
constitutive, fiind folosită pentru a identifica centromerele şi regiunile
heterocromatice (fig. 11). Metoda implică tratamente de denaturare-
renaturare ale cromozomilor și colorare cu Giemsa, obținând colorația
intensă a regiunilor centromerice.

31
 Fig. 11. Metafază în care cromozomii sunt bandaţi C

Aplicaţii ale bandării C

 identificarea cromozomilor;
 identificarea bivalenţilor în diakineză;
 testarea paternităţii şi cartografierea genică.

Bandarea Q (Q=quinacrină) a fost prima tehnică utilizată pentru

bandarea cromozomială. Caspersson şi colegii săi, care au dezvoltat tehnică,
au observat că benzile fluorescente luminoase şi palide au apărut după ce
cromozomii au fost trataţi cu agenți fluorescenți (quinacrină) şi i-au putut
observa în microscopul cu fluorescenţă. Benzile alternante luminoase şi
palide au fost numite benzi Q (fig. 12).

Fig. 12. Metafază în care cromozomii sunt bandaţi Q

32
 Avantajele bandării Q:
 utilizată în cazul în care bandarea G nu este acceptabilă;
 identificarea cromozomilor;
 studiul heteromorfismului cromozomului Y uman.

Dezavantaje:
 pierderea semnalului fluorescent în timp.

Bandarea R (R= de reversie)

Benzile R au fost obținute inițial prin denaturare termică menajată a
cromozomilor și colorare cu acridină orange. Ulterior, marcajul a fost
obținut prin adăugarea unor substanțe chimice în cultură cu câteva ore
înainte de efectuarea preparatelor cromozomiale.
Prin examinarea cromozomilor se observă benzi care au o distribuţie
inversă celor Q și G (fig. 13).

Fig. 13. Cariotip în care cromozomii sunt bandaţi R

Avantaje:
 este utilă pentru a analiza structura telomerelor cromozomilor.

33
 Tehnici pentru evidențierea situsurilor fragile
Sunt necesare condiţii speciale de cultură. De exemplu, pentru
detectarea situsului fragil al cromozomului X (fig. 14), celulele necesită un
mediu de cultură fără acid folic sau adăugarea de metotrexat cu câteva ore
înaintea recolorării cromozomilor.

Fig. 14. Săgeata indică situsul fragil al cromozomului X

4.2. Polimorfismele cromozomiale

Reprezintă variante morfologice normale, fără nici o semnificaţie
patologică, apărând în cariotip datorită cantităţii şi statusului diferit de
condensare al heterocromatinei, modificărilor în plasarea ADN-ului
repetitiv.
Astfel de polimorfisme cromozomiale pot fi:
 alungirea regiunii subcentromerice a braţului q la cromozomii 1, 9 şi
16 (constricţie secundară alungită 9qh+);
 lungime variabilă a braţelor scurte la cromozomii acrocentrici;
 variaţii de mărime şi formă a sateliţilor (sateliţi dubli);
 variaţii ale benzilor heterocromatice.

4.3. Morfologia grupelor de cromozomi

Clasificarea cromozomilor se face conform normelor Sistemului
Internaţional pentru Nomenclatură în Citogenetica Umană (ISCN), ce a fost
reactualizat în 2016.
Sunt luate în considerare mai multe criterii morfologice: lungimea cromo-
zomilor, pozitia centromerului, modelul de benzi cromozomiale. Cele 23 de
perechi de cromozomi au fost incluse în 7 grupe numerotate de la A la G (fig. 15):

34
 Fig. 15. Grupele de cromozomi

Grupa A: include perechile 1-3, cromozomi de talie mare, perechile

1 şi 3 metacentrici, perechea 2 submetacentrici. Cromozomii din perechea 1
pot prezenta constricție secundară proximală.
Grupa B: este formată din perechile 4 şi 5, cromozomi mari și
submetacentrici.
Grupa C: include perechile 6-12, cromozomi de talie mijlocie,
submetacentrici, greu de diferenţiat. Cromozomii din perechea 9 pot
prezenta constricție secundară proximală. Cromozomul X este situat ca
mărime între cromozomii 6 și 8.
Grupa D: este reprezentată de perechile 13-15, cromozomi mijlocii,
acrocentrici, ce prezintă frecvent sateliţi.
Grupa E: este formată din perechile 16-18, cromozomi mici,
perechea 16 este metacentrică, iar perechile 17 şi 18 sunt submetacentrice.
Grupa F: include perechile 19-20, cromozomi mici, metacentrici.
Grupa G: este formată din perechile 21și 22 , cromozomi mici,
acrocentrici, pot prezenta sateliţi. Cromozomul Y aparţine acestei grupe, cu
brațele lungi paralele și nu prezintă sateliţi.

35
4.4. Norme pentru scrierea formulei citogenetice
Există o serie de semne şi simboluri internaţionale utilizate pentru
scrierea formulei citognetice corespunzătoare cariotipului uman normal şi
patologic.
Cazurile care nu prezintă anomalii numerice sau structurale sunt
clasificate ca fiind normale. Se definesc clone celulare atunci când există:
două sau mai multe metafaze cu anomalii structurale identice; două sau
mai multe metafaze cu extracromozomi identici; trei sau mai multe metafaze
cu monosomia aceluiaşi cromozom.

Pentru scrierea formulei citogenetice trebuie înscrise:

 numărul total de cromozomi;
 constituţia în cromozomi sexuali;
 anomaliile decelate.

Pentru trisomiile autozomale, se notează numărul total de

cromozomi (47), perechea de gonozomi, semnul "+" plasat în faţa cifrei care
indică cromozomul supranumerar.
Pentru monosomiile autozomale, se notează numărul total de
cromozomi (45), perechea de gonozomi, semnul semnul "-" plasat în faţa
cifrei care indică cromozomul absent.
Pentru anomaliile numerice gonozomale, se notează numărul total
de cromozomi urmat de virgulă şi de enumerarea tuturor cromozomilor
sexuali existenţi.
Pentru anomaliile cromozomiale structurale, se trec în ordine
numerică anomaliile care implică un singur cromozom, urmat de
translocaţii, rearanjamente nebalansate, markeri neidentificabili, cromozomi
ring.
Pentru trisomiile/monosomiile parţiale se folosesc semnele "plus"
sau "minus" plasate după litera "p" sau "q" indicând o adiţie, respectiv o
reducere a braţelor cromozomiale.
Dacă într-o anomalie de structură sunt implicaţi mai mulţi
cromozomi, ei vor fi înscrişi în paranteză, în ordinea mărimii şi vor fi
separaţi prin punct şi virgulă (;).

Exemplificări:
 formula citogenetică normală:
 sex feminin 46,XX şi
 sex masculin 46,XY;

36
  anomalii numerice cromozomiale:
 47,XY,+21 = trisomie 21 la sexul masculin;
 45,X = monosomie X;
 47,XXY = trisomie gonozomală;
 46,XX/47,XX,+18 = mozaicism cu două clone celulare;
 anomalii structurale:
 translocaţie nebalansată robertsoniană între cromozomii 13 şi 21:
 46,XX,-13,+trob(13;21)
 translocaţie balansată între cromozomii 9 şi 22:
 t(9;22)(q34;q11).
 translocaţie robertsoniană balansată (echilibrată) între cromozomii
14 şi 15:
 45, XX, rob(14, 15)(q10; q10).

Alte exemple de simboluri folosite în nomenclatură cuprind:

del = deleţie;
dup = duplicaţie;
inv = inversie;
ins = inserţie;
i = izocromozom;
t = translocaţie;
trob = translocaţie robertsoniană;
der = cromozom derivat;
r = cromozom ring;
s = sateliţi;
ss = sateliţi dubli;
h = constricţie secundară.
dic = cromozom dicentric;
fra = situs fragil;
mar = marker;
mat = cromozom de origine maternă;
pat = cromozom de origine paternă;
tel = telomere;
cen = centromer;
ace = acentric;
: = ruptură; :: = ruptură şi reunire;
pter = capătul brațului scurt;
qter = capătul brațului lung;
/ = linia diagonală indică mozaicismul.

37
4.5. Analiza citogenetică moleculară
Hibridizarea in situ cu fluorescență (FISH) este o metodă
modernă de citogenetică moleculară, rapidă și simplă utilizată atât pentru
diagnosticul uzual, cât și în scop de cercetare.

Exemple de metode:
 hibridizare in situ cu fluorescenţă (FISH) şi variantele acesteia (CGH,
M-FISH, fibre FISH);
 array CGH, ADN microarray etc;
 QF-PCR, PCR în timp real;
 metode bazate pe amplificarea sondei ataşate secvenţei ţintă (MAPL).

Principiul tehnicii FISH constă în hibridizarea prin

complementaritate, a unei sonde de ADN monocatenar, marcată fluorescent,
cu o anumită regiune a unui cromozom. Cu ajutorul microscopului cu
fluorescenţă se identifică dacă proba fluorescentă s-a legat de segmentul
specific țintă din cromozom (fig. 16 și 17 ).

Fig. 16. Tehnica FISH

38
 Situații care indică tehnica FISH:
 neobţinerea metafazelor datorită:
 insuccesului culturii
 imposibilitatea iniţierii culturii celulare.
 analiza rearanjamentelor cromozomiale complexe;
 identificarea cromozomilor marker;
 diagnosticul anomaliilor cromozomiale criptice (microdeleţii,
amplificarea/deleţia genelor de supresie tumorală).

Etapele tehnicii FISH:

 realizarea preparatelor cromozomiale folosind celule cultivate sau
necultivate prin metodele citogenetice standard;
 adăugarea sondelor;
 denaturarea ADN-ului de studiu şi a sondelor;
 hibridizarea ADN-ului de studiat cu secvenţele complementare ale
sondelor marcate fluorescent;
 vizualizarea preparatelor la microscopul cu fluorescenţă.

Fig. 17. FISH cu probe specifice de locus

39
 Avantaje
 Tehnica FISH reprezintă o metodă moleculară care permite un
diagnostic rapid şi simplu al aneuploidiilor, se poate utiliza folosind
celule necultivate sau cultivate (interfază, metafază).
 Contribuie la diagnosticul sindroamelor cu microdeleție sau
microduplicație, nedecelabile prin metodele clasice.
 Este extrem de utilă pentru detectarea bolii minime reziduale.
 Poate fi utilizată în diagnosticul antenatal pentru stabilirea sexului dar și
a altor anomalii.
 Permite identificarea punctelor de ruptură în cazul rearanjamentelor
cromozomiale.
 Detectează translocaţiile subtile şi permite caracterizarea
rearanjamentelor complexe.
 Este o tehnică utilă pentru identificarea regiunilor omogen colorate, a
cromozomilor minusculi şi a cromozomilor marker.

Dezavantaje
 Analiza FISH interfazic oferă informaţii doar cu privire la loci specifici
pentru sondele folosite şi nu are puterea de a detecta rearanjamente
cromozomiale sau disomia.
 Artefactele tehnice pot provoca interpretarea greşită a rezultatelor. Cele
mai frecvente artefacte sunt suprapunerea sau divizarea semnalelor.
Suprapunerea semnalelor este de obicei rezultatul suprapunerii
cromozomilor, iar divizarea semnalelor se datorează separării
cromatidelor.
 Dezavantajul major al acestei tehnici constă în faptul că preparatele nu
sunt permanente, se descompun la lumină şi intensitatea semnalului
luminos scade în timp.

Multiplex-FISH (M-FISH) şi SKY-FISH

Pentru studiul simultan al tuturor cromozomilor umani s-a introdus o
tehnică bazată pe principiul analizei FISH, în care fiecare cromozom este
marcat cu sonde specifice folosindu-se diferite amestecuri de fluorocromi
(3-5 fluorocromi diferiţi) (fig. 18).

40
 Fig. 18. Tehnica M-FISH

Tehnica M-FISH sau SKY se bazează pe acelaşi principiu dar, diferă

prin metodologia procesării imaginilor după captarea fluorocromilor.
Această tehnică îşi găseşte aplicabilitate mai ales în detectarea
anomaliilor cromozomiale din cancere, tumori solide şi hematologie, pentru
caracterizarea cromozomilor marker şi derivaţi. Reprezintă un mijloc util
pentru verificarea imbalanţei genomice la pacienţii la care au fost detectate
prin cariotipul standard deleţii, inserţii sau translocaţii.

Hibridizarea genomică comparativă (CGH)

Pentru tehnica CGH, ADN-ul de la pacient este etichetat fluorescent
într-o singură culoare (roşu) şi co-hibridizat cu ADN de referinţă normal
etichetat cu altă culoare (verde) pe preparatele metafazice (fig. 19).

41
 Fig. 19. Tehnica CGH

În cazul în care există număr egal de copii pentru cele două

genomuri, cantităţi egale de ADN pentru testare şi ADN de referinţă,
regiunea hibridizată apare ca un amestec de roşu şi verde (galben). În cazul
în care o regiune a ADN-ului de testare lipseşte, pentru regiunea
corespunzătoare, ADN-ul de referinţă hibridizează mai mult decât ADN-ul
de testare, astfel încât regiunea apare verde.
În cazul în care o regiune a ADN-ului de testare este amplificată,
pentru regiunea corespunzătoare, ADN-ul pentru testare hibridizează mai
mult decât ADN de referinţă şi astfel apare roşu. Prin măsurarea raportului
dintre fluorescencenţe, de-a lungul fiecărui cromozom metafazic, sunt
generate rapoarte între profile.
Raportul crescut indică numărul de amplificări pentru o copie şi un
nivel scăzut al acestui raport indică numărul de pierderi pentru o anumită
copie.

42
 Aplicaţii:
 Principala aplicaţie a acestei tehnologii a fost în studiul tumorilor
solide, în cazul în care sunt dificil sau imposibil de vizualizat
cromozomii în metafază pentru analiza rearanjamentelor
cromozomiale complexe.
 CGH este util în analiza anomaliilor constituţionale în special în
cazul rearanjamentelor nerecurente permiţând identificarea
anomaliilor de novo.

Dezavantaje:
 Rezoluţia cu care câştigul şi pierderea de material genetic pot fi
identificate este restricţionată prin utilizarea de cromozomi
metafazici ca substrat pentru hibridizarea comparativă. În utilizarea
de rutină această rezoluţie este limitată la 3-5 MB.

Cariotiparea moleculară (Array sau matrix CGH)

Analiza rapidă de înaltă rezoluţie a rearanjamentelor genomice a
devenit posibilă prin utilizarea aCGH, o combinaţie între CGH şi tehnologia
microarray.
Folosind aCGH, modificările genomice (numărul de copii şi
rearanjamentele cromozomiale nebalansate) pot fi acum mapate şi analizate
la rezoluţii de până la 1 kilobază sau chiar mai puţin într-o reacţie de
hibridizare. Această tehnologie permite identificarea rearanjamentelor
criptice la pacienţii pentru care, prin analiza citogenetică convenţională, nu
ar putea fi identificate aberaţii cromozomiale. În plus, folosind această
tehnică s-au identificat rearanjamente complexe la pacienţii cu translocaţii
aparent echilibrate.
Tehnica aCGH se efectuează, în esenţă, în acelaşi mod ca şi analiza
CGH metafazic, ADN-ul de testare şi ADN de referinţă sunt etichetate
diferenţiat şi apoi hibridizate pe un suport solid. După spălare, preparatul
este scanat şi intensitatea fluorescenţei pentru fiecare clonă de ADN este
măsurată. Raportul între fluorescenţe este apoi trasat de-a lungul fiecărui
cromozom. Câştigurile de material genetic sunt reprezentate de raporturile
crescute şi pierderile prin raporturi scăzute. Rezoluţia aCGH este
determinată de dimensiunea şi densitatea sondelor folosite.

43
 Fig. 20. Tehnica aCGH

Întrebări

1. Cariotipul conţine în grupa D de cromozomi:

a. perechile 13, 14, 15, cromozomi mijlocii ca talie,
b. perechile 5-12 şi cromozomul X;
c. perechile 16-18;
d. perechile 4-5.

2. Tehnicile de bandare cromozomială:

a. permit identificarea tuturor cromozomilor;
b. se folosesc uzual când se analizează cariotipul constituţional;
c. permit identificarea rapidă a cromozomilor în diagnosticul antenatal, fără
culturi celulare;
d. se utilizează pentru marcarea specifică a unui cromozom.

44
3. Bandarea G:
a. este cea mai utilizată tehnică de bandare cromozomială;
b. permite analiza întregului genom într-o singură hibridizare;
c. poate fi aplicată atât pentru nuclei interfazici cât şi pentru cromozomii
metafazici;
d. permite evidenţierea anomaliilor cromozomiale numerice.

4. Bandarea C:
a. reprezintă o metodă de evidenţiere a heterocromatinei constitutive;
b. este folosită pentru a identifica centromerele şi regiunile heterocromatice;
c. evidenţiază eucromatina;
d. se realizează de rutină înaintea bandării G.

5. Tehnica aCGH:
a. reprezintă o analiza rapidă de înaltă rezoluţie a rearanjamentelor
genomice;
b. este o combinaţie între CGH şi tehnologia microarray;
c. nu permite identificarea rearanjamentelor criptice;
d. are o rezoluţie scăzută.

45
46
 Capitolul 5
IMPORTANŢA TESTĂRII ADN. EXEMPLIFICĂRI

Medicina moleculară modernă utilizează variate tehnici moleculare

pentru a analiza structura şi expresia diferitelor gene implicate în determi-
nismul unor boli. Acordarea a opt premii Nobel, în perioada 1975-1993,
demonstrează interesul major pentru tehnologiile biologiei moleculare;
dintre acestea menţionăm descoperirea enzimelor de restricţie, a revers-
transcriptazei, a metodei PCR (Polymerase Chain Reaction), a vectorilor de
tip plasmidic folosiţi pentru clonare, precum şi secvenţializarea moleculei de
ADN.
Pentru studiul acizilor nucleici se folosesc mai multe tehnici.
Extracţia ADN-ului precede celelalte metode de genetică moleculară şi se
efectuează prin diferite metode chimice.
Aplicații:
 Screening al purtătorilor (identificarea persoanelor care posedă o genă
din două necesare transmiterii unei boli genetice)
 Diagnostic prenatal
 Teste în perioada presimptomatică la persoanele cu risc pentru boli
genetice (Coree Huntington, Alzheimer, cancer de sân etc.)
 Medicina legală.

5.1. Metoda PCR

Amplificarea ADN se referă la obţinerea a multiple copii identice a
unor secvenţe de ADN. Prin tehnica PCR (polymerase chain reaction,
respectiv reacţia de polimerizare a catenelor) molecula de ADN poate fi
multiplicată de milioane de ori, prin replicarea repetată a unei secvenţe
nucleotidice care serveşte ca matriţă, într-o perioadă scurtă de timp.
Procesul de amplificare este mediat de primeri oligonucleotidici,
monocatenari, care au secvenţe complementare cu regiunile care flanchează
secvenţa de interes. Primerii se leagă de acestea în mod complementar, prin
legături de hidrogen.

47
 Procesul de amplificare are loc prin mai multe cicluri (de obicei 20 - 50):
 de creştere a temperaturii şi desfacere a legăturilor de hidrogen dintre
cele 2 catene ale secvenţei de interes;
 legarea primerilor de secvenţele complementare ale moleculei de interes;
 reducerea temperaturii şi replicarea cu ajutorul ADN polimerazei.

În timpul primei runde de replicare o moleculă de ADN este

multiplicată în două, ulterior amplificarea are loc exponenţial. După 20 de
runde, o moleculă este amplificată de peste 2000000 ori. După această
reacţie, produsul de amplificare poate fi detectat prin ELFO în gel.

Aplicaţiile metodei PCR:

 Obţinerea colecţiilor de ADN;
 Obţinerea de probe de ADN;
 Producerea de multiple copii de ADN utilizate pentru secvenţializare;
 Analiza mutaţiilor.

Astfel, metoda PCR permite:

 Diagnosticul bolilor monogenice;
 Detectarea microorganismelor;
 Identificarea persoanelor.

48
Fig. 21. Etapele metodei PCR

49
 Fig. 22. Amplificarea exponenţială a secvenţei de ADN

Real Time PCR

Real time PCR permite detectarea produşilor specifici care se
acumulează, în timp real, pe parcursul procesului de amplificare PCR. Real
time PCR poate detecta acumularea şi cuantifică numărul de substraturi
prezente în mixul iniţial care se foloseşte pentru amplificare. Secvenţele
folosite pentru amplificare sunt marcate cu fluorocromi. Acumularea de
secvenţe amplificate determină o creştere liniară a semnalului fluorescent.
Metoda real time PCR poate fi folosită şi în format multiplex, ceea
ce înseamnă că mai mulţi produşi pot fi detectaţi în acelaşi tub de reacţie.
Pentru fiecare secvenţă se va folosi un fluorocrom de o anumită culoare,
care va fi înregistrată de către aparatul pentru real time PCR.

50
5.2. Analiza RFLP
Această metodă permite evidenţierea transmiterii unor secvenţe de
ADN. ADN-ul fiecărui individ este moştenit de la cei doi genitori. În fiecare
generaţie are loc replicarea ADN-ului, oricare secvenţă de ADN poate fi
transmisă în generaţia următoare. RFLP reprezintă o secvenţă de ADN
delimitată de două locusuri de restricţie. Această secvenţă de ADN
hibridizează cu o probă specifică datorită complementarităţii bazelor
perechi. Probele specifice sunt reprezentate de secvenţe monocatenare de
ADN care au ataşate substanţe radioactive ce pot fi detectate.

Importanţa:
- teste de paternitate;
- criminalistică;
- diagnosticul de boală genică.

Fig. 23. Metoda analizei RFLP, utilizată pentru diagnosticul anemiei

sicklice. O mutaţie a genei care codifică lanţul beta-globinic a
determinat apariţia unui nou sit de restricţie în cadrul genei, astfel
încat în locul unui singur fragment de restricţie de 376 pb, vor exista 2
fragmente de restricţie, mai mici, cu175, respectiv 201 pb.

51
Fig. 24. Metoda PCR-RFLP: Situl de restricţie din gena fără mutaţie e
notat cu +. În urma unei mutaţii un sit de restricţie a fost abolit, în
figură fiind notat cu -. După clivarea ADN-ului cu enzime de restricţie
şi amplificarea prin metoda PCR, urmează ELFO în gel. Se notează cu
N alela normală şi cu M alela cu mutaţie. Sunt prezentate profilurile
migrării în gel pentru homozigoţii pentru alela normală, homozigoţii
pentru alela patologică şi pentru heterozigoţi.

52
Aplicaţii practice
Diagnosticul de boală genică sau a statusului de purtător

Fig. 25
Fibroza chistică este o boală cu transmitere recesiv autozomală, orice
persoană bolnavă este homozigotă pentru alelele cu mutaţie. Fragmentele
RFLP pentru fibroza chistică sunt cunoscute şi se poate determina dacă o
persoană este homozigotă pentru alela normală (tipul sălbatic, WT),
heterozigotă (purtătoare), sau homozigotă pentru alela cu mutaţie (CF).

Fig. 26

53
 Dacă ambii părinţi sunt homozigoţi pentru gena normală WT, vor
avea copii sănătoşi. În cazul în care părinţii sunt heterozigoţi, ei pot avea
atât copii sănătoşi, cât şi copii bolnavi.

5.3. Secvenţializarea ADN

Metoda standard de secvenţializare folosită este denumită:
„didezoxinucleotide terminatoare ale lanţului".

Definiţie şi etape:
1. se izolează o cantitate de ADN pur folosind ADN recombinat şi
multiplicat.
2. se separă cele 2 catene ale ADN-ului.
3. un primer este legat (hibridizat) de un sit specific la capătul 5 al ADN-
ului.
4. se adaugă enzimele care vor sintetiza o catenă nouă (ADN-polimeraza).
5. se adaugă o cantitate mică de didezoxinucleotide care sunt marcate.
Acestea nu au capătul hidroxiterminal 3 necesar pentru formarea
legăturilor fosfodiesterice. Odată încorporate, sinteza moleculei nu va
continua (se termină lanţul). Moleculele nou formate vor avea astfel
lungimi diferite, toate terminându-se cu un didezoxinucleotid. Important
este faptul că fiecare didezoxinucleotid este marcat cu un fluorocrom de
o anumită culoare.
6. catenele nou sintetizate au capătul 5 identic, dar diferă ca lungime la
capătul 3. Toate se termină cu o substanţă marcată fluorescent. ADN-ul
se denaturează din nou, rezultând ADN monocatenar şi se separă pe
baza lungimii prin electroforeză. Vor rezulta astfel mai multe benzi. Un
detector activat prin laser va citi secvenţa ADN-ului, verificând culoarea
fluorocromului fiecărei benzi în ordinea migrării în gel.

Prin această metodă se pot detecta toate mutaţiile cunoscute.

54
Fig. 27. Secvenţializarea ADN folosind didezoxinucleotide
marcate cu fluorocromi

55
Aplicaţii practice
Identificarea exactă a mutaţiei punctiforme prin citirea secvenţei de baze
azotate

Fig. 28

5.4. Tehnica MLPA

Tehnica MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)

este o variantă a reacției de polimerizare în lanț de tip multiplex care
permite amplificarea mai multor secvențe ţintă folosind un singur primer. Se
utilizează pentru a stabili numărul copiilor unor secvențe de acid nucleic
(până la 45) într-o singură reacție multiplex. Metoda poate fi folosită pentru
studiul ADN-ului genomic precum și pentru ARNm.

Avantaj: MLPA facilitează amplificarea si detectarea unor secvenţe

multiple cu un singur primer, spre deosebire de reacţiile PCR multiplex care
necesită câte un primer diferit pentru fiecare secvenţă amplificată.

Aplicabilitate în diagnosticul postnatal şi prenatal pentru:

 detectarea mutațiilor și polimorfismelor mononucleotidice,
 analiza de metilare a ADN-ului,
 caracterizarea cromozomială a unor linii celulare,
 detectarea numărului de copii genice,
 detectarea amplificărilor sau deleţiilor genelor umane pentru
predispoziția la cancer.

56
5.5. Tehnica microarray
Tehnica microarray (ADN chip) reprezintă o modalitate nouă de
investigare moleculară care permite studierea simultană a mii de gene sau a
produşilor lor de expresie, al ARN-ului, oferind o imagine exactă a ceea ce
se întamplă în celulă la momentul respectiv. Se pot analiza un număr mare
de fragmente care se vor lega complementar de probe de ADN marcate cu
fluorocromi de diferite culori (de obicei roşu şi verde).

Aplicaţii:
 identificarea secvenţelor genice;
 determinarea nivelului de expresie a genelor.

5.6. Secvențierea de nouă generație

Aceasta tehnica permite secvențierea genomurilor, re-secvențierea
acestora, secvențierea transcriptomurilor. Secvențierea este necesară pentru
că genomul unui singur individ nu este reprezentativ pentru întreaga specie.
NGS, sau ”secvențierea de a doua generație” atunci când este
comparată cu metoda Sanger, oferă posibilitatea de a realiza secvențieri de
genomuri complete, secvențiere țintită, cu costuri ce continuă să scadă, în
timp ce performanța crește. În timp ce NGS este în mare parte direcționat
spre identificarea și caracterizarea variațiilor structurale, tehnologia
microarray este folosită în principal pentru a efectua studii funcționale,
precum expresia genică sau cuantificarea microARN. Astfel, este posibilă
identificarea de anomalii moleculare de la nivelul întregului genom.

57
58
 Capitolul 6
MITOZA ŞI MEIOZA

Celulele pot parcurge două forme de diviziune: mitoza sau meioza.

6.1. Diviziunea mitotică

Din punct de vedere genetic mitoza reprezintă copierea în dublu
exemplar a mesajului genetic în interfază şi distribuirea sa, în câte o copie,
pentru fiecare celulă fiică.
Mitoza (diviziunea equaţională) distribuie celulelor nou formate
mesajul ereditar în mod egal, datorită mecanismului dedublării
semiconservative a ADN-ului care are loc înaintea diviziunii mitotice şi
ulterior, al separării cromatidelor
În timpul diviziunii mitotice au loc 2 evenimente:
1. un eveniment reproductiv, prin care se dublează materialul
cromozomial;
2. un eveniment distributiv, prin care se asigură repartizarea egală a
cromozomilor.
Înainte de începerea diviziunii mitotice a celulei, fiecare cromozom
îşi replică ADN-ul şi devine, de fapt, bicromatidic. În timpul fazei de
replicare a ADN-ului, cromozomii sunt extrem de lungi, desfăşuraţi în mod
difuz în nucleu şi nu pot fi recunoscuţi la microscopul optic. În această
etapă, denumită interfază, materialul genetic este organizat sub forma unei
reţele de cromatină.

Fig. 29. Aspectul celulei în interfază

59
 Odată cu debutul diviziunii mitotice, cromozomii încep să se
condenseze, spiralizeze, marcând începutul profazei. Fiecare cromozom este
constituit din două subunităţi paralele (cromatide) care se unesc la nivelul
unei regiuni mai înguste, comună ambelor cromatide, regiune numită
centromer.
În timpul profazei, cromozomii vor continua să se condenseze şi vor
deveni mai scurţi şi mai groşi, dar numai în prometafază vor putea fi distinse
cele două cromatide.

Fig. 30. Aspectul celulei în profază

În timpul metafazei, cromozomii se aliniază în centrul celulei,
formând placa ecuatorială, iar structura lor bicromatidică este clar vizibilă.
Fiecare cromozom este prins pe câte un microtubul al fusului de diviziune.
Metafaza reprezintă momentul optim pentru studiul cromozomilor.

Fig. 31. Aspectul celulei în metafază

60
 În continuare, fiecare centromer clivează longitudinal, marcând
începutul anafazei, clivarea fiind urmată de migrarea cromatidelor spre polii
opuşi ai celulei.

Fig. 32. Aspectul celulei în anafază

În final, în timpul telofazei, cromozomii se despiralizează se
alungesc, se reface membrana nucleară şi are loc diviziunea citoplasmei.
Fiecare celulă fiică va primi câte o jumătate din totalul
materialului cromozomial dublat şi astfel se menţine acelaşi număr de
cromozomi ca şi în celula mamă.

Fig. 33. Aspectul celulei în telofază

61
 Mitoza reprezintă diviziunea caracteristică celulelor somatice, în
timp ce meioza este diviziunea prin care se formează gameţii maturi.
În urma diviziunii mitotice, dintr-o celulă mamă rezultă 2 celule
fiice, fiecare având un număr diploid de cromozomi (2n), identic cu al
celulei mamă (conservatorism ereditar).
În urma diviziunii meiotice din celula iniţială se formează 4 celule,
fiecare având un număr haploid de cromozomi (n), care sunt diferiţi de
cromozomii celulei mamă şi diferiţi între ei (au loc recombinările genetice
în decursul primei diviziuni meiotice, respectiv în profaza şi anafaza
primară, precum şi recombinările din perioada celei de a doua diviziuni
meiotice, recombinări care asigură variabilitatea ereditară).

6.2. Aspecte comparative între mitoză şi meioză

În timp ce mitoza se realizează într-o singură etapă, meioza cuprinde
două etape succesive:
o diviziune meiotică primară (reducţională, heterotipică);
o diviziune meiotică secundară (equaţională, homotipică)

Prima diviziune meiotică (meioza I)

 La fel ca în cazul diviziunii mitotice, celulele sexuale iniţiale,
feminină şi masculină, îşi replică ADN-ul înainte de începerea primei
diviziuni meiotice. Astfel, la începutul diviziunilor care conduc la maturarea
gameţilor celulele primordiale conţin o cantitate dublă de ADN şi fiecare
cromozom este bicromatidic.
 O trăsătură caracteristică a diviziunii meiotice este formarea
perechilor de cromozomi omologi sau bivalenţi. Suprapunerea este exactă,
punct cu punct, cu excepţia cromozomilor X şi Y. Aceştia prezintă câte o
regiune denumită “pseudoautozomală”, la nivelul căreia cromozomii X şi Y
se pot suprapune şi schimba porţiuni omoloage. Regiunile centromerice ale
cromozomilor omologi nu se suprapun. Deoarece fiecare cromozom este
bicromatidic, perechea de omologi va consta din patru cromatide. În timpul
diviziunii mitotice, cromozomii omologi nu se suprapun (nu formează
perechi niciodată).
 A doua trăsătură caracteristică primei diviziuni meiotice este
crossing-over-ul (recombinarea intracromozomială) şi constă din
interschimburi de segmente cromatidiene între 2 cromozomi omologi care
se suprapun. Când, ulterior, fiecare membru (bicromatidic) al perechii de
omologi clivează longitudinal, apar unul sau mai multe puncte de ruptură

62
transversale în cromatide şi un interschimb de segmente cromatidiene între
cei doi cromozomi omologi. În timpul separării acestora, punctele de
interschimb rămân temporar unite şi astfel, structura cromozomială are un
aspect de X (cruce), cunoscută sub denumirea de chiasmă.
În timpul stadiului de chiasmă, blocuri de gene sunt schimbate între
cromozomii omologi. În acelaşi timp, separarea continuă şi cei doi membri
ai fiecărei perechi se aşează la nivelul fusului de diviziune. Ulterior,
cromozomii omologi se despart, fiecare migrând spre un pol al celulei, la
întâmplare. La sfârşitul primei diviziuni meiotice fiecare celulă fiică deţine
23 de cromozomi, câte unul din fiecare pereche, bicromatidici şi recombinaţi.
Din moment ce fiecare cromozom a rămas bicromatidic, din punct de vedere
cantitativ, celulele fiice vor avea o cantitate de ADN egală cu a unei celule
somatice normale, dar cu număr înjumătăţit de cromozomi.

Fig. 34. Recombinările intracromozomiale în meioza I (crossing over)

A doua diviziune meiotică (meioza II)

La scurt timp după prima diviziune meiotică, celule rezultate încep a
doua diviziune, fără a mai avea loc sinteza ADN-ului. Cei 23 de cromozomi
bicromatidici îşi clivează centromerul în timpul anafazei secundare,
cromozomii monocromatici suferă recombinări intercromozomiale (amestec
din punct de vedere al originii şi migrare la întâmplare spre polii celulei),
astfel că, în final fiecare din celulele fiice (nou formate) va primi câte 23 de
cromozomi monocromatidici şi recombinaţi, cantitatea de ADN reducându-
se astfel la jumătate faţă de cea a unei celule somatice.

63
6.3. Diviziuni mitotice anormale
Abaterile de la desfăşurarea normală a diviziunii mitotice au loc în
timpul anafazei, prin procesul numit nondisjuncţie, generând apariţia de
celule cu număr inegal de cromozomi, respectiv starea de mozaicism.
Mozaicismul reprezintă starea în care, în acelaşi organism, coexistă
două sau mai multe clone celulare cu număr diferit de cromozomi.
Nondisjuncţia poate fi rezultatul neclivării centromerului sau/şi
neseparării cromatidelor, cu formarea unei celule trisomice (2n+1), respectiv
a unei celule monosomice (2n-1).
Un alt accident care poate avea loc în timpul diviziunii poate fi “lag-
ul” anafazic (întârzierea unei cromatide în timpul migrării spre poli, urmată
de refacerea membranei nucleare, excluzându-se din viitorul nucleu
cromozomul monocromatidian întârziat. Rezultatul va fi formarea unei
celule cu monosomie şi a uneia cu număr normal de cromozomi (euploidă).
Clivarea transversală a centromerului este mecanismul prin care în
timpul diviziunii celulare rezultă izocromozomii. Aceştia sunt cromozomi
perfect metacentrici care au acelaşi material genetic, deasupra şi sub centromer.

6.4. Diviziuni meiotice anormale

Anomaliile cromozomiale omogene (prezente în toate celulele
organismului), îşi au originea în timpul diviziunii meiotice.
Nedisjuncţia cromozomilor omologi din anafaza primei meioze sau
nedisjuncţia cromatidelor din anafaza II precum şi “lag-ul” anafazic, vor
conduce la formarea de gameţi aneuploizi. Aceştia, prin fecundare, vor forma
organisme cu anomalii cromozomiale numerice moştenite, omogene.
Accidentele din timpul meiozei sau al mitozei, apar sub acţiunea
factorilor mutageni şi pot implica oricare din perechile de cromozomi.
Efectele vor fi variabile, în funcţie de tipul cromozomului implicat, de
momentul acţiunii factorului mutagen, de tipul diviziunii în desfăşurare.
Abaterile în gametogeneza feminină (ovogeneza) sau masculină
(spermatogeneza) stau la baza determinismului bolilor cromozomiale
înnăscute şi omogene.
Prin desfăşurarea normală a disjuncţiei se vor forma gameţi euploizi,
fiecare conţinând un set haploid (n) de cromozomi recombinaţi.

64
 În cursul proceselor de gametogeneză, materialul genetic poate suferi
modificări datorate:
 nondisjuncţiei cromozomiale;
 neseparării celulelor fiice după diviziune;
 crossing-over-ului patologic între X şi Y;
 mutaţiilor "de novo";
 mutaţiilor dinamice.

Nondisjuncţia cromozomică prin nesepararea cromozomilor omologi

(anafaza I) (fig. 35) predomină faţă de nondisjuncţia cromatidiană (anafaza
II). Datorită nondisjuncţiei se formează gameţi aneuploizi de tip nulisomic
(n-1) sau de tip disomic (n+1).
S-a constatat că, datorită dictiotenului, mecanismele nondisjuncţiei
afectează preponderent ovogeneza şi astfel, vârsta maternă înaintată este
frecvent incriminată pentru apariţia trisomiilor autozomale (21, 18, 13) şi a
sindromului Klinefelter. Nondisjuncţia în spermatogeneză este de regulă
cauză a monosomiei X şi întotdeauna mecanismul patogenic pentru apariţia
sindromului XYY.

Fig. 35. Gametogeneză cu mecanisme normale de disjuncţie

şi cu nondisjunjuncţie cromozomică (în meioza I şi II)

Nesepararea celulelor fiice după diviziune conduce la formarea de

gameţi diploizi (2n), fie ovule diploide (diginie) sau spermatozoizi diploizi
(diandrie) care, după fecundare cu gameţi normali (n) determină apariţia
zigoţilor cu triploidie (3n).

65
 Recombinările genice patologice din spermatogeneză cu crossing-
over în afara regiunilor pseudoautozomale ale cromozomilor X şi Y
antrenează translocarea de gene sexualizante masculine de pe cromozomul
Y pe X. Consecinţa este apariţia unei patologii specifice în cadrul defectelor
de sexualizare cum ar fi "bărbaţii XX" (X cu translocaţii de gene Y-
masculinizante) sau "femei XY" (Y care a pierdut genele sexualizante
masculine).

Mutaţia "de novo" este o modificare a informaţiei genetice apărută la

nivelul materialului genetic în timpul procesului de formare a gameţilor.
Deoarece prin spermatogeneză se formează numeroase celule
sexuale mature pe tot parcursul vieţii fertile o mutaţie apărută este copiată
într-o multitudine de spermatozoizi. Generarea acestui tip de mutaţii este
condiţionată de vârsta paternă înaintată şi este responsabilă de apariţia la
descendenţi a unor boli genice: acondroplazia, osteogeneza imperfecta,
neurofibromatoza, rinichiul polichistic etc.

66
 Capitolul 7
GAMETOGENEZA

Gametogeneza reprezintă procesul prin care se formează gameţii

maturi feminini şi masculini. Aceștia dețin un singur set cromozomial (n = 23
cromozomi), sunt celule haploide ce rezultă prin diviziune meiotică.
Variabilitatea genetică a gameţilor este asigurată de procesul de
recombinare din timpul diviziunii.
Transmiterea şi conservarea informaţiei genetice de la o generaţie la
alta este asigurată de gametogeneză, fecundarea gameţilor şi formarea
zigotului cu set diploid de cromozomi (2n=46) cu configuraţie genetică
nouă, unică şi constantă.

7.1. Spermatogeneza
Gametogeneza masculină este un proces continuu, care începe la
pubertate şi se termină la senescenţă. Gonocitele primordiale sau celulele
sexuale cap de serie, provin din pereţii sacului vitelin, de unde migrează în
primordiile de gonade încă din săpt. 4 – 5, iar dacă embrionul are cariotipul
XY se transformă în spermatogonii.
Spermatogeneza este un proces ce se desfăşoară în tubii seminiferi în
2 etape:
1. Spermocitogeneza.
2. Spermiogeneza.

Spermatocitogeneza
La nivelul tubilor seminiferi:
- spermatogoniile se divid mitotic, o parte asigură linia spermatogenetică, iar
restul acumulează material nutritiv şi devin spermatocite de ordinul I;
- spermatocitele de ordinul I, parcurg prima diviziune meiotică, formându-se
astfel două spermatocite de ordinul II, fiecare prezentând câte 23 de
cromozomi bicromatidici şi recombinaţi (deoarece nu s-a produs clivarea
centromerului şi a avut loc crossing-over între cromozomii omologi);
- cele 2 spermatocite de ordinul II participă la cea de-a doua diviziune
meiotică fără replicarea ADN-ului (se desfăşoară ca în mitoză), rezultând 4
spermatide, fiecare având 23 de cromozomi monocromatidici şi
recombinaţi.

67
 Spermiogeneza
Procesul de transformarea morfologică (metaplazie) a
spermatidelor în spermatozoizi capabili de fecundare constă în:
- condensarea cromatinei nucleare;
- formarea acromozomului şi a enzimelor acestuia;
- pierderea unei părţi din citoplasmă;
- aranjarea mitocondriilor;
- formarea flagelului, în componenţa citoscheletului flagelului vor intra centriolii.
Se vor forma astfel 4 spermatozoizi, capabili să participe la procesul
de fecundare. În mod normal, un număr mare de spermatide prezintă diferite
modificări, care afectează acrozomul, nucleul sau flagelul. Aceste celule nu
sunt viabile.
Un ciclu complet spermatogonie-spermatozoid durează aproximativ
74 de zile. Spermatozoizii vor fi transportaţi prin ductul epididimal, conco-
mitent se maturează şi dobândesc mobilitate (aproximativ 12 zile). Tot
procesul de la sper-
matogonie-sperma-
tozoid funcţional
necesită 86 de zile.

Fig. 36.
Spermatogeneza

68
 Datorită apoptozei şi a procesului de degenerare, doar aproximativ
25% dintre gameţi vor fi prezenţi în lichidul spermatic, iar dintre aceştia
jumătate vor prezenta malformaţii, ceea ce a condus la concluzia că
potenţialul reproductiv reprezintă doar 12% din potenţialul spermatogenetic.
Evaluarea spermatogenezei se realizează prin analiza lichidului
seminal. Examenul microscopic al lichidului spermatic - spermograma - dă
indicii despre fertilitatea masculină. Prin spermogramă se urmăresc:
1. numărul de spermatozoizi/mm3 din lichidul spermatic (peste 20 de
milioane spermatozoizi / ml);
- scăderea numărului de spermatozoizi = oligospermie;
- absenţa spermatozoizilor din lichidul spermatic = azoospermie;
2. mobilitatea spermatozoizilor (peste 50% din spermatozoizi în mişcare de
agitaţie continuă şi progresivă);
3. modificările morfologice (peste 30% cu forme normale ale capului, cozii,
piesei intermediare).
Modificările de număr, mobilitate (astenospermie) şi morfologie a
spermatozoizilor (teratospermie) pot constitui unele dintre cauzele sterilităţii
masculine.

7.2. Ovogeneza
Gametogeneza feminină este un proces ciclic, discontinu, începe în
perioada fetală şi se termină la menopauză.
Gonocitele primordiale migrează în primordiile de gonade XX, între
săptămânile 4 – 5 de sarcină formând ovogoniile.
- între lunile a 2-a şi a 7-a ovogoniile se divid rapid, formându-se
aproximativ 7 milioane de celule germinale (ovocite I, celule diploide).
- după luna a 7-a de viaţă intrauterină, numărul acestora scade, multe
mor, iar restul (aproximativ 1 milion) încep prima diviziune meiotică în
interiorul foliculilor primari. Important: nu desăvârşesc diviziunea,
rămânând în profază până la ovulaţie (fenomen care se produce în perioada
reproductivă a femeii -14-50 ani). Dintre cele aproximativ 1 milion de
ovocite prezente la naştere, doar 400 se vor matura în timpul perioadei
reproductive a femeii. Restul ovocitelor vor suferi un proces de involuţie,
numit atrezie foliculară.
- de la pubertate, în fiecare lună, în ziua a 14-a a ciclului ovarian se
maturează un folicul ovarian, cu desăvârşirea diviziunii meiotice
intrauterine, din faza de profază până la telofază, iar în momentul ovulaţiei
(ruperea foliculului) se formează ovocitul de ordinul II şi primul globul
polar. Ovocitul II şi primul globul polar au 23 de cromozomi bicromatidici,

69
recombinaţi, dar sunt inegale ca mărime, ovocitul II păstrează toată
citoplasma, iar globulul polar este fără citoplasmă şi rămâne în spaţiul
perivitelin al ovocitului II (spaţiul dintre zona pellucida şi membrana
ovocitului).
- ovocitul II:
- se elimină la ciclul menstrual;
- în cazul fecundării, prin a doua diviziune meiotică se formează
ovulul şi globulul polar secund, celule cu încărcătură cromozomială
haploidă, conţin 23 de cromozomi monocromatidici şi recombinaţi.
Perioada de latenţă a ovocitelor I, din viaţa intrauterină până la
formarea ovocitului II în viaţa extrauterină se numeşte dictioten. În perioada
reproductivă desăvârşirea primei meioze are loc la pubertate, iar ultima
meioză are loc la menopauză. În cursul dictiotenului, diviziunea ovocitului I
poate fi perturbată favorizându-se procesul de nedisjuncţie cromozomică şi
formarea unui ovocit II aneuploid, pe măsură ce vârsta femeii este mai
înaintată.

Fig. 37. Ovogeneza

70
Fig. 38. Diferenţe între spermatogeneză şi ovogeneză

71
Tabel 1
Spermatogeneza
Se desfășoară în tubii seminiferi
testiculari
Spermatogoniile se divid
O celulă diploidă dă naştere la 4
spermatozoizi funcţionali
Meioza se termină cu formarea
spermatidelor
Spermatidele suferă un proces de
metaplazie
Spermatozoizii sunt mobili
Este un proces ciclic continuu
Începe la pubertate şi se termină la
bătrâneţe
Ovogeneza
Începe în ovar şi se termină în
trompă
Ovogoniile nu se mai multiplică
după naştere
Se formează o singură celulă
funcţională, celelalte 3 degenerează
Meioza este prelungită, se termină
după pătrunderea spermatozoidului
Nu are loc nici o diferenţiere,
celulele doar cresc în dimensiune
prin achiziţie de nutrienţi
Ovocitele secundare nu sunt
mobile, sunt adaptate să permită
pătrunderea spermatozoidului.
Este un proces ciclic discontinuu
Durează încă din perioada fetală a
viitoarei fetiţe până la menopauză

7.3. Modificările materialului genetic în procesul de

gametogeneză
În cursul proceselor de gametogeneză, materialul genetic poate
suferi modificări datorate:
• nedisjuncţiei cromozomiale;
• neseparării celulelor fiice după diviziune;
• crossing-over-ului patologic între X şi Y;
• mutaţiilor de novo;
• mutaţiilor dinamice.
Nedisjuncţia cromozomială prin nesepararea cromozomilor
omologi (anafaza I) predomină faţă de nedisjuncţia cromatidiană (anafaza
II). Datorită nedisjuncţiei se formează gameţi aneuploizi de tip nulisomic (n-
1) sau de tip disomic (n+1). Datorită dictiotenu-lui, mecanismele
nedisjuncţiei afectează preponderent ovogeneza astfel, vârsta maternă
înaintată fiind frecvent incriminată pentru apariţia trisomiilor autozomale
(21, 18, 13) şi a sindromului Klinefelter. Nedisjuncţia în spermatogeneză
este de regulă cauză a monosomiei X şi întotdeauna mecanismul patogenic
pentru apariţia sindromului XYY.

72
 Fig. 39. Nedisjunţie cromozomială

Nesepararea celulelor fiice după diviziune duce la formarea

gameţilor diploizi (2n), ovule diploide (diginie) sau spermatozoizi diploizi
(diandrie) care, după fecundare cu gameţi normali (n) determină apariţia
zigoţilor cu triploidie (3n).
Recombinările genice patologice din spermatogeneză cu crossing-
over în afara regiunilor pseudoautozomale ale cromozomilor X şi Y
antrenează translocarea genelor sexualizante masculine de pe cromozomul
Y pe X. Consecinţa este apariţia unei patologii specifice în cadrul defectelor
de sexualizare cum ar fi "bărbaţii XX" (X cu translocaţii de gene Y-
masculinizante) sau "femei XY" (Y care a pierdut genele sexualizante
masculine).
Mutaţia de novo este o modificare a informaţiei genetice apărută la
nivelul materialului genetic în timpul procesului de formare a gameţilor.
Deoarece prin spermatogeneză se formează numeroase celule
sexuale mature pe tot parcursul vieţii fertile o mutaţie apărută este copiată în
numeroși spermatozoizi. Generarea acestui tip de mutaţii este condiţionată
de vârsta paternă înaintată fiind responsabilă de apariţia unor boli genice
(exemplu: acondroplazia, osteogeneza imperfecta, neurofibromatoza,
rinichiul polichistic etc.) la descendenţi.

73
 Mutaţiile dinamice sunt mutaţii care nu se transmit ca atare din
generaţie în generaţie. Aceste mutaţii se caracterizează prin instabilitate,
deoarece cu ocazia diviziunilor se amplifică în cadrul genei numărul de
copii (peste pragul critic) a unei unităţi trinucleotidice specifice unei
tulburări clinice.
În acest sens, este posibil ca în timpul ovogenezei o genă de pe
cromozomul X să sufere un proces de expansiune - repetare de trinucleotide.
Spre exemplu, dacă gena răspunzătoare de sindromul cu X fragil
(FRM1=Fragile X syndrome) se află în stare de premutaţie (cu câteva zeci
de repetări nucleotidice) şi suferă o nouă mutaţie, ea va deţine sute de
repetări nucleotidice şi se va exprima fenotipic la descendenţi prin
manifestări clinice caracteristice.

7.4. Fecundaţia
Fecundaţia este fenomenul de amfimixie, de contopire a celor doi
gameţi, masculin şi feminin, fenomen ce are loc în treimea externă a trompei
uterine.
Fecundaţia se desfăşoară în mai multe etape:
- contactul spermatozoidului cu ovocitul: spermatozoidul „acceptat” va
penetra ovocitul, reacţia fiind una mediată enzimatic. În căile genitale
feminine ajung aproximativ 250 milioane de spermatozoizi, din care un
număr de 300 - 500 ajung la locul fecundaţiei, dar numai unul va participa la
fecundaţie;
- reacţia acrozomului constă în eliberarea unor enzime (hialuronidaze,
fertilizina, substanţe asemănătoare tripsinei, acrosina) de către spermatozoid
care vor uşura pătrunderea în ovocit;
- pătrunderea zonei pelucida a ovocitului;
- penetraţia ovocitului: comportă trei faze: ataşarea, fuziunea şi
încorporarea spermatozoidului în ovocit;
- reacţia corticală – blocarea polispermiei: după pătrunderea unui
spermatozoid în ovocit, acesta nu mai permite o altă penetrare;
- pronucleul spermatozoidului pătrunde în ovocit fără a fi încorporate
celelalte structuri citoplasmatice. Acest moment coincide cu desăvârşirea
celei de a II-a diviziuni meiotice şi eliberarea celui de al II-lea globul polar.
Ambii pronuclei îşi pierd membranele şi seturile cromozomiale se dispun pe
linia mediană rezultând prima placă ecuatorială metafazică formată din 46
cromozomi.

74
 - noua celulă diploidă se divide mitotic. Prima diviziune mitotică are
loc după 35-38 ore de la penetraţia spermatozoidului în ovocit, se formează
astfel 2 blastomere. Mitozele următoare se succed rapid, astfel zigotul:
- la 45 de ore va avea 4 celule;
- la 66 de ore - 8 celule;
- la sfârşitul celei de a 3-a zi va avea 16 celule.

Nidaţia şi fenomenele premergătoare:

• transportul zigotului: acesta rămâne în 1/3 externă a trompei
uterine aproximativ 72 de ore, după care începe să migreze spre uter. La
sfarşitul zilei a 3-a, când ajunge la cavitatea uterină este în fază de morulă,
având 8-16 celule. Trecerea oului prin trompă ( 3-4 zile ) este favorizată de
către secreţia hormonilor estrogeni care cresc peristaltismul şi de lichidul
secretat la acest nivel (unele prostaglandine). Dacă fecundaţia a avut loc în
ziua 15 - 16 a ciclului ovarian, atunci către ziua 20 - 22 morula ajunge în
apropierea cavităţii uterine.
• nidarea: zigotul nu se implantează imediat, el stă lipit de
endometru, timp de 3-4 zile, timp în care evoluţia lui continuă de la stadiul
de morulă la blastocist. Nidarea are loc în ziua 24 - 25 a ciclului ovarian.

Tulburări de fecundaţie
În cazuri rare, doi spermatozoizi penetrează simultan gametul
feminin şi se formează un embrion cu 69 de cromozomi. Zigoţii triploizi
(3n) sunt neviabili. Excepţional, în zigot prin replicare nucleară neurmată de
diviziune celulară (endomitoză), apare starea de tetraploidie a zigotului (4n).
Starea de tetraploidie poate fi şi consecinţa fecundării unui ovul diploid de
către un spermatozoid 2n.

75
 Fig. 40. Tulburări ale fecundaţiei

7. 5. Procedee pentru inducerea fecundaţiei în stările de

infertilitate sau sterilitate
Cauze de infertilitate masculină:
- hormonale;
- insuficienţă testiculară prezentă la naştere sau datorată expunerii la
mutageni;
- anticorpi antispermatici;
- probleme structurale: varicocel, absenţa vaselor deferente, tulburări de
ejaculare;
- anomalii cromozomiale (sindrom Klinefelter, rearanjamente cromozomiale);
- boli genice (fibroza chistică, determinată de mutaţii ale genei CFTR-
absenţa congenitală bilaterală a canalului deferent, sindromul Noonan,
microdeleţii ale unor gene de pe cromozomul Y);
- idiopatice.

76
 Cauze de infertilitate feminină:
- hormonale (ovare polichistice, tulburări ale secreţiei glandei pituitare, a
hipotalamusului);
- infecţii anterioare;
- malformaţii uterine (congenitale sau post intervenţionale);
- expunere la substanţe cu potenţial mutagen;
- anticorpi antispermatici prezenţi în mucusul cervical;
- anomalii cromozomiale (sindrom Turner, rearanjamente cromozomiale);
- boli genice (galactozemia).

Tehnicile utilizate pentru inducerea fecundaţiei în stările de

infertilitate sau sterilitate sunt:
1. Inseminarea artificială intrauterină;
2. Stimularea ovulaţiei şi inseminarea artificială;
3. Fertilizarea in vitro;
4. Fertilizarea in vitro prin injectare intra-citoplasmatică a
spermatozoizilor în ovul.

Fig. 41. Procedee pentru inducerea fecundaţiei

După procedee de fertilizare in vitro sau injectare intracitoplasmatică

a spermatozoidului în ovul, care predispun la apariţia unor anomalii
cromozomiale, este util diagnosticul genetic preimplantaţional.

77
78
 Capitolul 8
EREDITATEA CARACTERELOR FIZIOLOGICE

8.1. Sistemele genetice sanguine eritrocitare (grupa sanguină

AB0 și Rh)
Sistemul genetic cuprinde genele, produsul activităţii lor şi relaţia de
determinare stabilită între ele.
Sistemele genetice sanguine eritrocitare au determinare 100%
ereditară, nefiind influenţate de mediu. Datorită polialeliei prezintă un larg
polimorfism populaţional.
Grupele sanguine au ca substrat determinanții antigenici de pe
suprafața eritrocitelor, trombocitelor și granulocitelor, dar utilizarea
termenului este adesea limitată la antigenele de pe suprafața hematiilor.
Sistemul AB0 este unul dintre cele mai importante sisteme sanguine.
Cele patru fenotipuri de bază AB0 sunt 0, A, B, AB.
Grupul sanguin 0 este cel mai frecvent fenotip în majoritatea
populațiilor:
Caucazieni: grup 0, 44%; A, 43%; B, 9%; AB, 4%.
Rasa neagră: grup 0, 49%, A, 27%, B, 20%; AB, 4%.
Asiatici: grup 0, 43%; A, 27%, B, 25%; AB, 5%.
Antigenele grupului sanguin AB0 sunt codificate de un locus
genetic, locusul AB0, care are trei variante alelice: A, B, și 0. Un copil poate
primi una din cele trei alele de la fiecare părinte, existând astfel șase
genotipuri posibile și patru tipuri posibile de grup sanguin (fenotipuri).
Locusul AB0 este situat pe cromozomul 9q34.1-q34.2. Alelele A și
B diferă una de cealaltă prin șapte substituții de nucleotide, dintre care patru
se traduc în aminoacizi diferiți în produsul genei. Cele două gene alele care
specifică antigenul A, respectiv B sunt gene dominante, iar când se găsesc la
același individ, se vor exprima ambele datorită fenomenului de
codominanță. Gena care specifică antigenul 0 este recesivă și se exprimă
fenotipic doar în stare de homozigoție.

Genotip Fenotip
AA, A0 A
BB, B0 B
00 0
AB AB

79
 Genele alele ce specifică fenotipurile A și B determină formarea a
două aglutinogene distincte (un tip de antigen) ce se regăsesc la suprafața
eritrocitelor. Indivizii care prezintă antigenul A vor prezenta în plasma
anticorpi anti B, indivizii care prezintă antigenul B vor avea anticorpi anti
A, persoanele cu grup sanguin 0 nu prezintă nici un aglutinogen, dar are
anticorpi anti A și anti B, iar persoanele cu grup AB au ambele aglutinogene
(A Și B), dar nu prezintă anticorpi A sau B în plasmă.

Fig. 42. Grupele sangvine

S-a constatat că indivizii cu grupul sanguin A reacționează diferit la

un anumit anticorp (mai târziu numit anti-A1) ca urmare, grupul sangvin A
a fost împărțit în două fenotipuri, A1 și A2. Hematiile cu fenotip A1
reacționează cu anticorpii anti-A1 și constituie aproximativ 80% dintre
fenotipurile A. Eritrocitele cu fenotipul A2 nu reacționează cu anticorpii

80
anti-A1 și constituie aproximativ 20% din fenotipul A. Eritrocitele cu
fenotip A1 exprimă de 5 ori mai mult antigen A comparativ cu eritrocitele
A2, dar ambele tipuri reacționează cu anticorpii anti-A și în transfuzie,
grupurile A1 și A2 sunt interschimbabile.

Importanța cunoașterii grupului sanguin

Grupul sanguin trebuie determinat înainte de transplantul de organe,
de o transfuzie sanguină pentru a preveni reacțiile adverse ale administrării
unui grup sanguin eronat.
Exemplu: în cazul în care un pacient cu grup sanguin 0 primește o
transfuzie cu sânge de grup, A, B sau AB, anticorpii prezenți în plasma
pacientului vor lega antigenele aflate pe suprafața eritrocitelor transfuzate
(A, B sau AB). Consecința acestei reacții este hemoliza intravasculară
rapidă ce poate duce chiar la coagulare intravasculară diseminată,
insuficiență renală acută și moarte.
O situație particulară este boala hemolitică a nou-născutului care
apare ca o consecință a incompatibilității AB0 materno-fetal. Cazurile de
hemoliză severă care necesită transfuzii sunt rare. Boala hemolitică a nou-
născutului apare aproape exclusiv la copiii de grupa de sange A sau B, care
sunt născuți de mame cu grup 0. Acest lucru se datorează faptului că
anticorpii anti-A și anti-B, din plasma mamelor cu grup 0 sunt IgG (și, prin
urmare, pot traversa placenta), în timp ce anticorpii anti-A și anti-B din serul
persoanelor de grupă B și A sunt de tip IgM. Deși mai puțin frecvente,
cazurile de boala hemolitică a nou-născutului au fost raportate și la sugarii
nascuți din mame cu grup A2 și tată de grup B.
Boala hemolitică a nou-născutului tinde să fie relativ ușoară, în
principal datorită faptului că hematiile fetale nu exprimă un nivel de
antigeni A și B la fel de mare ca și adulții. Cu toate acestea, puterea
antigenelor grupului AB0 poate varia, și, prin urmare, gradul de hemoliză,
iar severitatea bolii hemolitice a nou-născutului poate fi imprevizibilă.
Un număr de boli pot modifica fenotipul AB0 al unei persoane.
Pacientii pot „dobândi" antigenul B, în timpul unei infecţii necrotice în care
bacteria eliberează o enzimă în circulaţie care convertește antigenul A1 într-
un antigen B-ca. În acest timp, pacienții nu trebuie să primească transfuzii
cu sânge care conţin antigenul B, deoarece serul lor va conține în continuare
anticorpi anti-B. Odată ce infecţia subiacentă este tratată, grupul sanguin va
reveni la normal.
Boala poate provoca „pierderea" antigenelor AB0. Orice boală care
creşte cererea organismului de eritrocite poate slăbi expresia antigenelor de
grup AB0 (exemplu talasemia). În plus, antigenele AB0 pot fi modificate în

81
diferite tipuri de cancer hematologic, care pot modifica lanțurile glucidice
care leagă antigenele AB0. Astfel antigenele A și B pot fi utilizate ca
markeri tumorali în leucemia acută, tulburări mieloproliferative și
mielodisplazie.

Sistemul Rh
Rh este cel mai complex sistem uman sanguin, cu 45 de antigene
bine definite. Cel mai imunogen și important component din puct de vedere
clinic al sistemului Rh este antigenul D. 82%-88% dintre caucazieni,
aproximativ 95% dintre africani și aproape 100% din populația din Orientul
Îndepărtat sunt D pozitivi. Alte componente importante ale sistemului Rh
sunt variantele alelice C/c respectiv E/e ce ocupa locuri adiacente locusului
antigenului D/d.
Pentru stabilirea Rh-ului unei persoane, în cazul în care este necesară
transfuzarea, se ia în considerare exclusiv antigenul specificat de locusul
D/d, celelalte locusuri neprezentând implicații clinice în ceea ce privește
transfuzia sanguină.
Antigenele sistemului Rh sunt codificate de doua gene RHCE și
RHD. Aceste gene sunt localizate pe cromozomul 1, fiind strâns linkate. Ele
au organizarea genomică asemănătoare, fiecare conținând 10 exoni.
RHCE codifică antigenele C/c și E/e. RHD specifică mai mulți
epitopi ai antigenului D. Antigenul D prezintă numeroși epitopi, dar există și
multe variante fenotipice în care unii epitopi D lipsesc și în acest caz este
posibilă producera unui anticorp D-like. La caucazieni fenotipul D-negativ
este rezultatul stării de homozigoție a unei variante a genei RHD ce prezintă
o deleție și este notată d. Fenotipul D negativ se caracterizează prin absența
proteinelor antigenice la nivelul membranei.

Fenotip Genotip
Rh+ DD sau Dd
Rh- Dd

Antigenele Rh sunt proteine transmembranare cu bucle expuse la

suprafața celulelor roșii din sânge. Sunt utilizate pentru transportul de dioxid
de carbon și / sau amoniac de-a lungul membranei plasmatice. Acestea sunt
numite după maimuța rhesus la care au au fost descoperite.
Hematiile care sunt „Rh pozitiv" exprimă antigenul D la suprafața
lor.

82
 Boala hemolitică a nou-născutului
Anticorpii Rh pot traversa bariera placentară. Acest fapt are
importanță clinică și stă la baza fenomenului de incompatibilitate materno-
fetală. Cazurile de incompatibilitate materno-fetală apar în situațiile în care
mama este Rh-, iar produsul de concepție Rh+ (tatăl Rh+). În această
situație, la prima sarcină, sau dacă mama nu a avut în antecedente transfuzii
cu sânge Rh+, titrul anticorpilor antiD este mic şi sarcina decurge normal.
Dacă mama Rh- nu se află la prima sarcină sau a primit transfuzie cu sânge
Rh+, titrul anticorpilor Rh este mare și se va declanșa distrucția eritrocitelor
fetale (izoimunizare feto-maternă).

Fig. 43 Incompatibilitatea materno-fetală

În funcție de titrul anticorpilor Rh afectarea fetală poate varia de la

anemie uşoară la anemie gravă cu hepatosplenomegalie, în cazurile grave
poate apărea chiar anasarcă feto-placentară cu moarte fetală.

83
 Fig. 44. Evoluția titrului de anticorpi la gravidele Rh- cu făt Rh+

În prezent este disponibilă gama-globulina anti D ce poate fi

administrată în următoarele situații:
- puncție de vilozități coriale,
- amniocenteză,
- cordocenteză,
- placenta praevia,
- metroragie,
- avort,
- moarte fetală intrauterină,
- după prima sarcină a femeilor Rh- cu făt Rh+.

84
 Capitolul 9
BOLI CROMOZOMIALE AUTOZOMALE

Anomaliile cromozomiale constituie o cauză majoră a bolilor

genetice.
Anomaliile cromozomiale se împart în funcţie de tipul cromozomilor
implicaţi în: anomalii numerice şi anomalii structurale.

Anomaliile cromozomiale numerice (aneuploidie)

 trisomie/monosomie, în mozaicism sau omogenă

Anomalii structurale cromozomiale care pot fi prezente în toate

celulele (omogen), sau în formă mozaicată;

Anomalii structurale balansate (echilibrate) şi care nu produc

tulburări fenotipice:
 Inversiile: ruperea unui fragment din cromozom şi reataşarea lui
inversat, de obicei fără pierdere de material cromozomial.
 Translocaţiile: schimburi de fragmente între cromozomii
neomologi. Pot fi reciproce sau robertsoniene.
Translocaţia robertsoniană a cromozomilor 21 spre exemplu, purtată
de o persoană fenotipic sănătoasă, constituie unul din riscurile majore
pentru naşterea de copii cu sindrom Down (trisomie 21).

Anomalii structurale nebalansate (dezechilibrate), care sunt însoţite

de tulburări fenotipice.
Rearanjamentele structurale nebalansate sunt reprezentate de: deleţii,
duplicaţii, cromozomi ring (în inel), izocromozomi, cromozomi dicentrici,
acentrici, cromozomi derivaţi etc.

85
 Corelaţii între tipul anomaliei cromozomiale şi efectele asupra
dezvoltării ontogenetice în diferite etape

Anomaliile cromozomiale, în funcţie de cromozomul implicat şi de

tipul anomaliei perturbă dezvoltarea ontogenetică cu consecinţe de cele mai
multe ori grave.
Prezenţa unor aberaţii cromozomiale în gameţii maturi poate
determina:
- incapacitatea acestora pentru fecundare (deci sterilitate) sau
- constituirea unui produs de concepţie cu aberaţii cromozomiale grosiere,
în funcţie de tipul cromozomului implicat se poate produce avort,
- dismorfogenezii majore care pot influenţa negativ viabilitatea postnatală,
- tulburări ale dezvoltării SNC,
- retard mental în grade variabile (de la debilitate mentală uşoară până la
encefalopatie) şi alte tulburări neurologice.

9.1. Trisomia 21 (Sindromul Down)

Incidenţa: aproximativ 1 din 800 nou-născuţi creşte cu vârsta mamei.
Tabloul clinic: dismorfii caracteristice: facies rotund, fante
palpebrale oblice (mongoloide), pleoape edemaţiate, epicant, hipertelorism,
rădăcina nasului lărgită, pseudo-macroglosie, urechi displazice şi mai jos
implantate, gât scurt şi gros, hipotonie musculară marcată (Fig. 45).
Pe parcursul copilăriei devin foarte evidente retardul mental,
coeficientul de inteligenţă (IQ) prezentând valori situate între 25 şi 40,
precum şi un grad de subdezvoltare staturală.

Cariotipul poate evidenţia:

 trisomia liberă (95%) (Fig. 46),
 translocaţia robertsoniană (4%),
 sindrom Down cu mozaicism (1%).

86
Fig. 45. Fenotipuri specifice sindromului Down

Fig. 46. Cariotip 47, XY + 21, trisomie 21 liberă

87
9.2. Trisomia 18 (Sindromul Edwards)
Rar întâlnit la nou-născut (trisomia afectează sever viabilitatea
fetală), perioadă scurtă de supravieţuire postnatală (4-6 luni) (Fig. 47).
Cariotipul:
 trisomie liberă omogenă,
 trisomie în mozaicism (cu o expresie fenotipică mai blândă) sau
 trisomie cu diferite variante de translocaţii.
Semne clinice:
 hipertonie musculară pronunţată,
 malformaţii scheletale occipitale,
 malformaţii de calcaneu (calcaneu proeminent),
 stern înfundat,
 malformaţii ale degetelor,
 malformaţii cardiace,
 facies dismorfic,
 retard mental,
 dermatoglife modificate ş.a.

Fig. 47. Fenotip şi cariotip în Sindromul Edwards

88
9.3. Trisomia 13 (Sindromul Patau)
Antrenează un tablou clinic sever, letal în majoritatea cazurilor după
primele 3-4 luni de viaţă.
Fenotipul trisomiei 13, cuprinde (Fig. 48):
 malformaţii grave ale SNC, retard mental,
 dismorfii faciale cu frunte teşită, microftalmie, colobomă,
hipertelorism, despicătura labială şi/sau palatină,
 malformaţii cardiace,
 polidactilie, alte malformaţii scheletice,
 anomalii ale organelor genitale externe şi interne.
Cariotipul:
 trisomie liberă omogenă,
 trisomie în mozaicism.

Fig. 48. Fenotip şi cariotip în Sindromul Patau

89
90
 Capitolul 10
BOLI CROMOZOMIALE GONOZOMALE

10.1. Abateri de la cariotipul 46,XX

10.1.1 Sindromul Turner (Monosomia X)

Monosomia X este cea mai frecventă anomalie a cromozomilor
sexuali.
Incidența bolii: 1/2500 născuţi-vii de sex feminin.
Sindromul Turner apare datorită absenţei unui cromozom X la sexul
feminin. Studiile moleculare au arătat că pacientele cu sindrom Turner au
cromozomul X de origine maternă. Mai mult de jumătate dintre toate
cazurile cu sindrom Turner au un mozaic cromozomial (de exemplu
45,X/46,XX).
Fenotipic este caracterizat la nou-născut (fig. 49) prin:
 gât scurt şi palmat;
 limfedeme dorsale la mâini şi picioare;
 urechi displazice şi jos implantate;
 implantarea joasă a părului dorsocervical.

Fig. 49. Fenotip sindrom Turner Fig. 50. Fenotip sindrom Turner
la nou-născut

91
Fenotipic este caracterizat la pubertate (fig. 50).
 statură mică (nanism);
 gât scurt cu pterigium coli,
 inserţie posterioară joasă a părului;
 cubitus valgus
 torace lăţit (în formă de scut)
 nedezvoltarea glandei mamare şi areole mamare situate lateral de
linia medio-claviculară;
 disgenezie gonadală (gonade fibrozate cu foliculi atrofici);
 amenoree primară;
 sterilitate;
 pilozitate pubiană şi axilară slab reprezentată;
 anomalii cardio-vasculare (coarctaţia aortei).
Cariotip:
 45,X omogen (fig. 51);
 mozaicism 45,X/46,XX sau
 mozaicism cu aberaţii structurale la al doilea cromozom X.

Fig. 51. Cariotip monosomie X

92
 Analiza FISH s-a dovedit utilă pentru detectarea gradului de
mozaicism la pacientele cu sindrom Turner și cariotip 45, X/46, XY.
Sindromul poate fi suspicionat antenatal, ecografia fetală poate
evidenţia hidrops fetal sau transclucenţă nucală crescută, iar diagnosticul
antenatal prin puncţie de vilozităţi coriale sau amniocenteză permite
confirmarea suspiciunii clinice prin identificarea anomaliei cromozomiale.

Variante de sindrom Turner

Aberaţii structurale ale cromozomului X

1. Izocromozom pentru braţele “q”al cromozomului X, notat,i(Xq)
- disgenezie gonadică şi statură scundă;
- neinstalarea pubertăţii.
2. Deleţia braţelor “q” interesând mai ales regiunea critică Xq13-Xq27,
determină constant un aspect fenotipic turnerian şi infertilitate.
3. Translocaţii între cromozomul X şi unul dintre autozomi;
4. Cromozom X cu aspect de ring (fig. 52.) etc.

Fig. 52. Cromozom X cu aspect de ring

93
 10.1.2 Trisomia X (47,XXX)
Se constată prezenţa unui cromozom X în plus, la sexul feminin
Incidenţa: 1/1000 femei.
Fenotipic caracterizat prin:
 dismorfii minore
 în unele cazuri, infertilitate
 în tetrasomia X (48,XXXX) şi pentasomia X (49,XXXXX)
retard mental mai evident.
Cariotip:
 47,XXX omogen (fig. 53.);
 mozaicism 46,XX/47,XXX

Fig. 53. Cariotip 47,XXX omogen

10.2. Abateri de la cariotipul 46,XY

10.2.1 Sindromul Klinefelter
Sindromul apare datorită prezenţei unui cromozom X în plus la sexul
masculine, fiind cea mai frecventă anomalie cromozomială asociată cu
hipogonadism și sterilitate la sexul masculine.
Incidenţă: 1/1.000 nou-născuţi de sex masculin.
În copilărie semnele sunt nespecifice şi poate să nu fie diagnosticat.

94
Fenotipic (fig. 54) caracterizat prin:
 talie înaltă, membrele inferioare mai lungi;
 hipogonadism evident la pubertate: testiculi hipotrofici, organe
genitale externe subdezvoltate, caracterele sexuale secundare lipsesc,
se remarcă un aspect eunucoid;
 infertilitate cu azoospermie datorită sclerozării tubilor seminiferi;
 ginecomastie frecventă, cu risc crescut de malignizare;
 coeficient de inteligenţă cu valori mai reduse, dislexie.

Fig. 54. Fenotipul în sindromul Klinefelter

Cariotip:
 47,XXY în 80% cazuri, omogen (fig. 55) sau,
 în mozaic, cu o clonă normală 47,XXY/46,XY.
În sindromul Klinefelter şi cariotip 48,XXXY şi 49,XXXXY se pot întâlni:
 mai multe dismorfii;
 reducerea notabilă a dezvoltării sexuale;
 tulburări evidente ale intelectului.

95
 Fig. 55. Cariotip 47,XXY

La fel ca în cazul monosomiei X în mozaic şi în cazul abaterilor de

la cariotipul XY analiza FISH este utilă în detectarea mozaicismelor.
Diagnosticul antenatal se poate stabili prin analiza citogenetică sau
tehnica FISH, prin puncţia vilozităţilor coriale sau amniocenteză.

10.2.2 Sindromul 47,XYY

Sindromul apare datorită prezenţei unui cromozom Y în plus la sexul
masculin, datorită nondisjuncţiei în meioza II paternă.
Incidenţa: 1/500 - 1/1000 bărbaţi.
Sindromul 47,XYY nu se asociază cu un fenotip specific.
Efectul prezenţei unui cromozom Y suplimentar poate fi foarte
variat, dar majoritatea cazurilor cu sindromul XYY au o viață normală. Se
estimează că boala este subdiagnosticată.
Fenotipic caracterizat prin:
 talie mai înaltă,
 dificultăți de învățare sau tulburări de comportament,
 fertilitatea fiind în genere normală, rareori apare infertilitate.
Cariotip:
 omogen: 47,XYY (fig. 56);
 cariotip în mozaic 47,XYY/46,XY.

96
 Fig. 56. Cariotip 47, XYY

Analiză FISH poate detecta mozaicismul și în acest sindrom.

Diagnosticul antenatal se poate efectua prin puncţie de vilozităţi
coriale sau amniocenteză pentru efectuarea cariotipului sau a analizei FISH.

97
98
 Capitolul 11
ASPECTE CITOGENETICE ȘI MOLECULARE ÎN CANCER

Cancerul este o boală genetică în care pot fi puse în evidenţă diferite

anomalii cromozomiale sau mutaţii genice. Predispoziţia ereditară şi
carcinogenii au fiecare contribuţia lor. Nu toate celulele sunt la fel de
sensibile la acţiunea factorilor mutageni, cele mai afectate fiind cele cu
indice mitotic mare.

11.1. Anomalii cromozomiale întâlnite în procesele maligne

Anomaliile cromozomiale numerice respectiv aneuploidiile sunt
frecvente şi se datorează, în marea majoritate a cazurilor, nedisjuncţiei
mitotice. Se pot întâlni următoarele situaţii:
 Pseudodiploidie = deşi numărul de cromozomi este 2n, cariotipul
nu este normal, deoarece există monosomii totale pentru unii
cromozomi, iar pentru alţii trisomii totale;
 Hiperdiploidie = numărul de cromozomi este cuprins între 46-50;
 Trisomiile autozomale (2n+1) întâlnite în celulele maligne nu
diminuează viabilitatea ci, prin dezechilibrele genice pe care le
produc, pot chiar să confere avantaj selectiv celulelor purtătoare;
 Hipodiploidie = numărul de cromozomi este mai mic decât 2n;
 Monosomiile autozomilor, (2n+1) în celulele maligne nu par a
afecta funcţiile vitale;
 Poliploidie = numărul cromozomilor este multiplu de n (3n, 4n).
Acest fenomen este posibil datorită endomitozei, adică o mitoză
fără citokineză. Blocarea totală a mitozei sub influenţa agenţilor
mutageni duce la o stare poliploidă.

99
Fig. 57. Cariotip cu hipodiploidie, număr modal de cromozomi 42 la un
caz cu leucemie acută limfoblastică (Colecţia Dr. Cristina Gug)

Fig. 58. Cariotip cu poliploidie și cromozomi marker (metoda SKY)

Anomalii cromozomiale structurale considerate sugestive pentru

celulele canceroase:
 fragmente acentrice;
 cromozomi dicentrici (au 2 centromeri) sau multicentrici;

100
Fig. 59. Stg: Cromozom dicentric. Dr: Cromozom în ring gigant

 cromozomi în ring.
 cromozomii marker; au formă şi mărime deosebită şi se găsesc de
obicei, în adiţie la un număr cromozomial normal şi de aceea sunt
numiţi cromozomi supranumerari. Cu toate că la prima vedere pare a
fi o anomalie numerică, cromozomul marker este un rearanjament
structural.
 cromozomii minusculi (duble minutes) sunt mici fragmente de
ADN extracromozomial observate care reprezintă manifestări ale
amplificării genice în timpul dezvoltării tumorale ce dă celulelor un
avantaj selectiv de creştere şi supravieţuire pentru celulele tumorale.
 regiuni omogen colorate, sunt manifestări ale amplificării genice

Fig. 60. Cromozomii minusculi (duble minutes)

și regiuni omogen colorate (ROC)

101
11.2. Aspecte citogenetice şi moleculare în leucemii
În toate leucemiile acute sau cronice precum şi în sindroamele
mielo-displazice apar modificări cromozomiale care se corelează cu
prognosticul bolii. Pentru exemplificare am ales două situaţii.

Leucemia mieloidă cronică (LMC)

LMC este o formă de leucemie caracterizată de o creştere a unor
celule precursoare mieloide în măduva hematogenă şi acumularea acestora
în sânge.

Fig. 61. Schema formării translocaţiei t(9;22)(q34;q11)

din care rezultă cromozomul Ph1 (stânga) şi cariotipul parţial (dreapta)

LMC este un tip de boală mieloproliferativă asociată cu o

translocaţie caracteristică t(9,22)(q34;q11) din care rezultă cromozomul
Ph1, markerul citogenetic al bolii. Oncogena abl de pe cromozomul 9 se
translocă pe cromozomul 22 la nivelul regiunii şi se formează o nouă genă
hibridă bcr/abl (Fig. 62) cu rol în leucemogeneză.
Identificarea şi detecţia cantitativă prin metoda PCR a produşilor
genei de fuziune BCR-ABL1 are utilitate în diagnosticul şi monitorizarea
tratamentului la pacienţii cu leucemie granulocitară cronică.

102
 Fig. 62. Gena de fuziune bcr/abl (metoda PCR)

Se descriu 3 faze clinice caracterizate de modificări cromozomiale

caracteristice:
 faza cronică: apare translocaţia caracteristică t(9;22)(q34;q11) şi
cromozomul Ph1, modificare considerată patognomonică pentru
leukemia mieloidă cronică (Fig. 61)
 faza accelerată: apar modificări cromozomiale adiţionale: duplicaţia
Ph1 (Ph1, Ph1), trisomia 8 (+8), izocromozomul braţului lung al
cromozomului 17, respectiv i(17q), trisomia 19.

Fig. 63. Izocromozom i(17q)

 faza acută (puseul blastic), la majoritatea pacienţilor se constată o

instabilitate genomică tradusă citogenetic prin existenţa de diverse
clone celulare cu anomalii cromozomiale variate, caracterizate în
special prin aneuploidie sau cariotipuri complexe.

103
 Leucemia mieloblastică acută (LMA)
Apare o proliferare neoplazică care determină o creştere excesivă a
mieloblaştilor (celule mieloide imature). În leucemiile de novo, se identifică
translocaţii balansate, iar în leucemiile secundare sau post-terapie apar mai
ales deleţii sau monosomii 5 (-5) sau 7 (-7).

Fig. 64. Deleţa cromozomului 5 (bandare GTG)

Modificările citogenetice dau indicaţii în privinţa prognosticului astfel:

 aspecte citogenetice favorabile inv(16);

Fig. 65. Inversia cromozomului 16

(bandare GTG)

 aspecte citogenetice intermediare t(15;17);

Fig. 66. Translocaţia t(15;17)

(bandare GTG)

 aspecte citogenetice nefavorabile -7, -5, del 7q, +8, t(9;22).

Fig. 67. Trisomie 8 evidenţiată cu ajutotul sondei

colorată în roşu; în verde este o sondă pentru
cromozomul 7 (metoda FISH interfazic).

104
11.3. Aspecte citogenetice şi moleculare în tumori maligne

Cancerul este o boală clonală, la originea lui fiind o singură celulă

care a devenit anormală prin achiziţionarea unor mutaţii somatice.

Retinoblastom
În tumora blastică a retinei, se observă modificări structurale la
cromozomul 13 (microdeleţie 13q14). Starea de heterozigoţie (primul pas în
evoluţia cancerului) se realizează prin inactivarea preferenţială a alelei
paterne. Dezvoltarea tumorii este condiţionată de pierderea sau inactivarea
antioncogenei RB1 în homozigoţie.

Fig. 68. Localizarea RB1 la nivelul 13q14.2 (stg)

și a genei NF1 pe cromozomul 17q11.2 (dr)

Neurofibromatoza tip 1 (NF1) Von Recklinghausen

Neurofibromatoza tip 1 este derminată de mutaţia genei NF-1
(17q11.2) care codifică proteina neurofibrină cu rol reglator negativ al
oncogenei Ras. Dacă există o mutație patogenă în NF1 riscul de apariţie al
neoplaziei este 5%.

Cancerul pulmonar
Procesul de iniţiere este dat de activarea unor oncogene sau
inactivarea unor gene de supresie tumorală. Se consideră că
protooncogenele se transformă în oncogene când organismul este expus la
anumiţi carcinogeni. Mutaţia protooncogenei K-ras este responsabilă de
30% dintre cancerele cu celule mici.
Deleţiile cromozomiale de tipul: 3p-, 5q-, 13q- şi 17p- determină
pierderea heterozigoţiei, cauză a inactivării genelor de supresie tumorală
localizate în aceste regiuni. Cea mai frecventă modificare moleculară este
pierderea genei p53 localizată la nivelul 17p.

105
Fig. 69. Anomalii citogenetice apărute în evoluţia cancerului pulmonar:
regiuni omogen colorate (în dreptul săgeţii) şi double minutes

Cancerul de sân
Defectele moştenite în genele care repară ADN-ul, în genele
BRCA1, BRCA2 şi p53 reprezintă cauza pentru 95% dintre cancerele de sân
iar restul 5% din cazuri sunt atribuite unor sindroame ereditare. Indivizii
purtători ai mutaţiilor în genele BRCA1 and BRCA2 au un risc crescut de
cancer de sân şi de ovar.

Fig. 70. Gena BRCA1 localizată pe 17q21 şi gena BRCA2

localizată pe 13q12 cu rol etiologic în cancerul de sân ereditar

106
 Testarea BRCA1/BRCA2 are utilitate:
 în scop diagnostic la persoanele cu suspiciune clinică de cancer
ereditar de sân/ovar
 testarea predispoziţiei la rudele cu risc crescut; dacă rezultatul este
pozitiv este necesar o consiliere adecvată privind opţiunile de
screening şi profilaxie primară.

Au fost identificate peste 1200 mutaţii BRCA1 şi 900 mutaţii

BRCA2.
Testarea moleculară presupune secvenţierea tuturor exonilor genelor.
Cariotipurile obţinute din tumorile la sân evidenţiază multiclonali-
tatea, sugerând existenţa unui grad înalt de heterogenitate intratumorală.

Figura 71. Sus: secvenţa normală a genei BRCA1;

Jos: mutaţia în poziţia 196 prin deleţia unei Adenine determină
formarea unui codon STOP.

Cancerul ovarian
Predispoziţia genetică a fost demonstrată în tumorile ovariene
epiteliale şi reprezintă 5-10%. Există 3 sindroame ereditare asociate cu
carcinomul ovarian, toate cu transmitere de tip dominant autozomal:
 sindromul ereditar al cancerului de sân şi ovar;
 cancerul colorectal ereditar nonpolipozic (cancerul familial Lynch II);
 sindromul cancerului specific ovarian.
Citogenetic s-au identificat aneuploidii, pseudo-triploidii, dar nu s-au
identificat rearanjamente patognomonice. Mutaţia p53 este frecvent identificată.

107
 Cancerul de colon
Cancerul colorectal apare în celulele epiteliale ale tractului gastro-
intestinal. Poate fi ereditar sau determinat prin mutaţii somatice apărute
 în genele implicate în replicarea ADN
 în genele implicate în repararea ADN cât şi în
 în genele de supresie tumorală: APC, K-Ras, p53
care au ca efect diviziunea celulară necontrolată.
Genele asociate cu risc mare de cancer de colon sunt rare.
Doar 10% din cancerele de colon sunt legate de gene moştenite.

Cancerele colorectale ereditare sunt clasificate în următoarele tipuri:

1. Polipoza adenomatoasă familială (Familial adenomatous polyposis-

FAP): caracterizată de dezvoltarea a sute de polipi datorită mutaţiilor în
gena APC. Fiecare polip poate duce la un carcinom. Indivizii cu polipoză au
o probabilitate de 90% de a dezvolta un cancer de colon.
Testarea moleculară constă în secvenţierea tuturor exonilor APC şi
este metoda cu acurateţea cea mai mare. Majoritatea sunt mutaţii nonsens
sau de tip frameshift (ale cadrului de citire). Testarea APC are utilitate în:
 diagnosticul precoce al membrilor familiei cu risc crescut
 diagnosticul FAP la pacienţii cu semne clinice la debut (<100
polipi).


Fig. 72. Schema dezvoltării unui polip până la stadiul de cancer

metastatic

108
2. Cancer colorectal nonplipozic ereditar (Hereditary nonpolyposis colon
cancer - HNPCC) sau sindromul Lynch cauzat de o mutaţie la nivelul unei
gene „de reparare ADN” (mismatch repair- MMR).

Fig. 73. Arborele genealogic al unei familii cu cancer colorectal

nonpolipozic ereditar

Testarea HNPCC se face prin secvenţiere ADN şi are utilitate la:

 persoanele cu suspiciune clinică pentru precizarea diagnosticului;
 testarea predispoziţiei la membrii de familie asimptomatici;
 testare prenatală.

Neoplazie endocrină multiplă tip 1 - MEN1

Sindromul MEN1 include o combinaţie de tumori endocrine şi non-
endocrine transmise autozomal dominant.
Prezenţa a 2 tumori endocrine (paratiroidiene, hipofizare sau ale
tractului gastro-entero-pancreatic) constituie criteriul de diagnostic clinic.
Gena MEN1 (11q13) este alcătuită din 10 exoni şi sunt descrise
peste 400 mutaţii. Cea mai bună metodă de analiză este secvenţializarea
genei.

109
 Testarea APC are utilitate în:
 confirmarea diagnosticului
 screening familial prospectiv
 diagnostic prenatal.

Fig. 74. Secvenţa normală a genei MEN1 cu profilul exonului 10 (stg),

Și cu porţiunea deletă între liniile verticale (dr). Deleţia cuprinde 7
baze azotate (GTCGCTG) în exonul 10

110
 Capitolul 12
CONSULTUL GENETIC (I)

Consultul genetic este un act medical care constă in informarea

cuplului asupra riscului sau de a aduce pe lume un copil afectat de o boala
gravă. El constă de asemenea în abordarea împreună cu cuplul a aspectelor
mai mult sau mai puţin invalidante ale afecţiunii, ţinând cont de eventuala
variabilitate clinică de la un individ la altul, prognosticul vital, posibilităţile
terapeutice actuale şi perspectivele lor de viitor, existenţa unui diagnostic
prenatal (sensibilitatea acestuia şi precocitatea lui în cursul sarcinii) şi
eventuala cerere de întrerupere a sarcinii în caz de diagnostic pozitiv.

12.1. Circumstanţele consultului genetic

Consulturile genetice pot fi:

 Consultul prenupţial (premarital) se adresează partenerilor unui viitor
cuplu conjugal, care fie că ei înşişi, sau numai unul dintre ei, prezintă o tară
ereditară, fie că în familiile lor au existat unul sau mai multe cazuri de boli
ereditare.
 Consultul acordat cuplurilor sterile, prin care se poate depista sau
exclude existenţa unor anomalii cromozomice gonozomale (monosomii,
trisomii, deleţii, translocaţii etc.).
 Consultul solicitat în urma naşterii unui copil malformat sau făt mort.
 Consult în urma naşterii unui copil cu boală moleculară sau cu un
sindrom cromozomic.
 Consultul acordat cuplurilor cu avorturi spontane multiple.
 Consult în cazul familiilor care prezintă un copil cu o tară ereditară şi
doresc o nouă sarcină.

12.2. Obiectivele consultului genetic

Consultul genetic urmăreşte:
 depistarea bolilor cromozomiale (inclusiv a translocaţiilor echilibrate);
 depistarea bolilor genice (genopatii);
 depistarea purtătorilor (heterozigoţilor);
 depistarea mozaicurilor cromozomiale;
 diagnosticul disgeneziilor gonadale;
 diagnosticarea corectă a fenocopiilor.

111
12.3. Etapele consultului genetic
I. Consultaţia propriu-zisă care include:
Înregistrarea datelor personale şi a motivelor consultului
Ancheta familială
Examenul clinic
Examene paraclinice
Analiza datelor şi stabilirea exactă a diagnosticului

Fig. 75. Etapele consultului genetic

112
II. Evaluarea prognosticului şi a riscului genetic
1. Calcularea frecvenţei (concentraţiei) genei patologice într-o
populaţie = frecvenţa heterozigoţilor prin aplicarea legii Hardy- Weinberg.
2. Calcularea riscului recurenţei pe baza legilor eredităţii folosind
calculul probabilităţilor.

III. Acordarea sfatului genetic

Comunicarea rezultatelor
Monitorizarea pacientului

I. Consultaţia propriu-zisă

1. Ancheta familială şi alcătuirea arborelui genealogic.

Ancheta familială include date anamnestice antenatale şi/sau
postnatale, în funcție de aspectele clinice prezente în familie, de boala
suspectată şi de vârsta probantului.
Datele obţinute se înregistrează grafic, alcătuindu-se arborele
genealogic, folosind anumite semne convenţionale.
Informaţiile obţinute prin anamneză se vor referi la existenţa unor
avorturi spontane, naşteri premature, naşteri de feţi morţi, eventual căsătorii în
consangvinitate, date despre perioada pubertăţii, funcţia de reproducere etc.
Este deosebit de importantă urmărirea şi aprecierea transmiterii
genealogice, din generaţie în generaţie, precum şi distribuţia familială a unor
caractere normale sau patologice.
Ancheta familială porneşte de la cazul primar, denumit consultând sau
probant şi notat cu P sau cu o săgeată în dreptul semnului său convenţional
în arborele genealogic.

113
 Fig. 76. Arbore genealogic cuprinzând 4 generaţii;
săgeata indică probantul

Ancheta familială trebuie făcută cu multă minuţiozitate, consemnând

toate afecţiunile decelate, indiferent dacă acestea au sau nu o legătură
aparentă cu boala probantului.
Se vor nota, de asemenea:
 naşterile spontane, naşterile premature; naşterile de feţi morţi;
cuplurile fără descendenţi;
 consangvinitatea; cazurile de deces etc.

În realizarea unei anchete familiale este nevoie de mult tact şi

înţelegere, iar informaţiile vor fi cerute cât mai pe înţelesul probantului sau
familiei sale.

Când simultan în familie există mai multe anomalii (genice, genetice

comune) se pot folosi şi alte semne specificate în legendă (haşurări, culori
diferite).
Uneori se pot ivi impedimente determinate de dispersia geografică a
membrilor familiei, nesinceritatea în prezentarea datelor şi chiar lipsa de
colaborare generată de jena faţă de cazurile patologice şi de fenomenul de
culpabilitate pe care îl poate prezenta partenerul în a cărui familie există o
patologie bogată.

114
 Semne şi simboluri utilizate pentru construirea unui arbore genealogic

- anomalie cromosomială

Fig. 77. Semne şi simboluri folosite pentru construirea arborelui

genealogic

2. Examenul clinic constă în examinarea completă de către medic a

probantului, urmărind şi înregistrând toate caracterele ereditare morfologice,
uneori chiar şi la genitori; această etapă cuprinde şi examinarea
dermatoglifelor.

3. Investigaţii paraclinice: generale (Rx, EKG, EEG, EMG, Echografii,

biopsii, investigații biochimice etc.) şi specializate (citogenetică clasică,
FISH, teste ADN).

115
Investigaţii specializate:
Cariotipul: examenul cromozomic este indicat în următoarele situaţii:
 Dismorfogenezii somtice şi disfuncţii organice;
 Retard mental de etiologie neprecizată;
 Subdezvoltare staturo-ponderală la copii şi adolescenţi;
 Disgenezii gonadice;
 Pubertate întârziată;
 Amenoree primară şi secundară;
 Eşecuri de reproducere:
 avorturi spontane repetate;
 naştere prematură, cu făt mort;
 sterilitate feminină şi masculină;
 Genitori care au (sau au avut în antecedente) copil cu malformaţii
congenitale sau cu sindrom cromozomic;
 Sindroame cu instabilitate cromozomială;
 Persoane care lucrează în mediu cu factori mutageni şi doresc să
procreeze.
 categorie aparte o constituie hemopatiile maligne, în care sunt
necesare evidenţierea şi studiul cromozomilor, a modificărilor
cromozomice ce apar în funcţie de perioada evolutivă.

II. Evaluarea prognosticului şi a riscului genetic

Elaborarea prognosticului cuprinde 2 etape:

1. Calculul frecvenţei genei patologice (prin metodologii puse la dispoziţie
de studiile de Genetica populaţiilor)
2. Calculul riscului genetic (riscul de recurenţă).

Calcularea riscului genetic

Aplicaţiile legii Hardy-Weinberg în bolile monogenice

Bolile autozomal dominante (AD)

În cazul bolilor AD legea Hardy-Weinberg se aplică ţinând cont de
următoarele aspecte:
- frecvenţa p a genei mutante A este foarte mică faţă de frecvenţa q a
genei normale a
- frecvenţa heterozigoţilor Aa (2pq) este mult mai mare decât frecvenţa
homozigoţilor anormali AA (p2)

116
 Întrucât p2 << 2pq, numărul homozigoţilor afectaţi este foarte mic. În
acelaşi timp, deoarece p este foarte mic iar q se aproximează cu 1, frecvenţa
bolii va fi de aproximativ două ori frecvenţa genei mutante (2p). Aşadar,
aplicaţiile practice ale legii Hardy-Weinberg în bolile AD sunt mai reduse,
frecvenţa unei boli dominante fiind practic egală cu frecvenţa
heterozigoţilor.

Bolile autozomal recesive (AR)

În cazul bolilor AR, legea H-W permite calcularea frecvenţei
heterozigotilor (probabilitatea fiecărui părinte de a fi purtător de genă
patologică = Aa) folosind frecvenţa genei anormale sau a bolii în populaţie
(indivizi homozigoţi pentru gena recesivă patologică = aa), frecvenţa bolii
va fi egală cu frecvenţa heterozigoților = q2. Întrucât în bolile AR q este
foarte mic, iar p este aproximat cu 1, frecvenţa heterozigoților este
aproximativ 2q, deci mult mai mare decât frecvenţa bolii (2pq >> q2).

Bolile recesive legate de cromozomul X

Frecvenţa genotipurilor pentru un anumit locus de pe cromosomul X
este diferită la cele două sexe, bărbaţii având numai o copie a fiecărei gene
de pe cromosomul X, iar femeile două copii. Astfel la bărbaţi frecvenţa
genei anormale (q) este egală cu frecvenţa bolii. Numărul de femei afectate
(Xa Xa) este mult mai mic decât al bărbaților afectați (Xa Y) deoarece q>q2
dar numărul purtătoarelor sănătoase XN Xa (2q) este dublu faţă de bărbații
afectați (q).

12.4. Acordarea sfatului genetic

Sfaturile genetice preliminare pot fi date de orice medic practician, cu
condiţia să posede o pregătire genetică de bază şi să cunoască în suficientă
măsură consultandul şi familia acestuia.
În situaţii mai complexe sau ori de câte ori există dubii asupra
diagnosticului consultanzii vor fi îndrumaţi spre centrele specializate
(cabinetele de genetică care deţin posibilităţi mai largi de investigare).
Pentru formularea sfatului genetic medicul genetician este obligat să
cunoască şi să elucideze o multitudine de probleme:
 Să stabilească dacă boala (tulburarea sau defectul) este ereditară
sau determinată postconcepţional;
 Să urmărească în cadrul consultului prezenţa unor elemente ce pot
preciza caracterul congenital şi / sau familial al bolii;

117
  Dacă boala este ereditară, să precizeze modul său de transmitere
(autozomal sau gonozomal, dominant sau recesiv);
 Dacă o anomalie congenitală a fost determinată de un factor de mediu
(mediu toxic, boli materne preexistente sarcinii), prognoza pentru
sarcina următoare depinde de posibilitatea înlăturării sau neutralizării
factorului de mediu incriminat;
Precizarea riscului de recurenţă necesită toate aceste date, alături de
cele obţinute printr-o anchetă familială laborioasă şi va ţine cont de o serie
de aspecte particulare ale afecţiunilor genetice, cum ar fi: heterogenitatea
genetică, expresivitatea şi penetranţa variabile, apariţia mutaţiilor de novo
etc.
Adeseori sfatul genetic acordat este rodul unui consult
interdisciplinar care are menirea de a stabili cu maximum de corectitudine
diagnosticul şi prognosticul bolii, precum şi riscul genetic.
Analiza tuturor datelor care decurg din consultul genetic, privind
riscul recurenţei unei boli ereditare, va fi prezentată întocmai celor în cauză,
folosind în continuare mult tact şi înţelegere, dar şi un limbaj adecvat
posibilităţilor de înţelegere a celor interesaţi.
Datoria medicului este să ofere un răspuns asupra riscului, să
sfătuiască dar nu trebuie să influenţeze decizia care va aparţine celor în
cauză.

118
 Capitolul 13
SCREENINGUL BOLILOR GENETICE. TESTE BIOCHIMICE

Unele boli monogenice beneficiază de metode de laborator care

permit depistarea lor imediat după naştere. În situaţia în care metoda este
uşor interpretabilă, are sensibilitate mare şi este uşor de efectuat, poate fi
folosită ca test de depistare în masă, incluzându-se în programele de
screening ale nou născuţilor.
Screening-ul neonatal este utilizat pentru a se detecta la sugari
anumite afecţiuni congenitale, care beneficiază de tratament doar atunci
când sunt diagnosticate imediat după naştere, în primele zile de viaţă.
Screening-ul neonatal efectuat pentru a detecta tulburări tratabile este
astăzi o componentă de rutină în cadrul serviciilor de sănătate în aproape toate
ţările. Recomandările detaliate privind politica de screening vor varia de la
ţară la ţară şi de la regiune la regiune, în funcţie de factorii locali economici,
politici, medicali şi organizarea serviciilor de sănătate publică.
Sunt publicate linii directoare pentru screening-ul neonatal, în
general, precum şi pentru afecţiuni specifice.

Componentele sistemului de screening neonatal

 Educaţie (interesând: personalul medical, inspectorii de sănătate publică
şi părinţii)
 Screening-ul propriu-zis (colectare de probe, analize de laborator)
 Depistare precoce
 Diagnostic (examen clinic şi evaluare biochimică)
 Management (consiliere, instituirea terapiei, monitorizarea terapiei, cu
respectarea unei metodologii clare)
 Evaluare (monitorizare şi controlul calităţii probelor şi a activităţii în
interiorul sistemului de screening)

Principiile screening-ului pentru nou-născuţi:

 afecţiuni în care simptomatologia nu este prezentă clinic până când nu se
produce o alterare ireversibilă, şi pentru care ar fi existat un tratament;
 prevalenţa leziunii sau afecţiunii în populaţie;
 metodă simplă de recoltare;
 repetabilitatea probei cu puţine rezultate fals-pozitive sau fals-negative;
 copii sub 72 ore de la naştere şi preferabil la 24 ore după alimentaţia cu
proteine;
 evitarea contaminării încrucişate.

119
13.1. Tipuri de teste screening
Un anumit test folosit pentru screening este un test simplu, care
identifică riscul existenţei unor posibile afecţiuni înnăscute de metabolism
sau a altor boli genetice, boli endocrinologice etc., care nu sunt evidente de
la naştere.

Efectuarea testării neonatale:

În prezent testul se efectuează după 24 ore de la naştere, la 48-72
ore, după informarea părinţilor (fig. 78).

Fig. 78. Model de screening neonatal

Pentru testarea biochimică sunt necesare câteva picături de sânge

obţinute din calcaneul nou-născutului, recoltate pe o hârtie specială.

Testul se repetă:
 când sângele a fost recoltat înainte de 24 ore după naştere
 când copilul este născut prematur
 când primul test sugerează că ar fi posibilă o afecţiune care trebuie confirmată.

120
 Sunt foarte multe afecţiuni la care se aplică programe de depistare
imediat după naştere, de exemplu:
 fenilcetonuria;
 fibroza chistică;
 hipotiroidismul congenital;
 toxoplasmoza congenitală;
 hiperplazia adrenaliniană congenitală;
 galactosemia;
 homocistinuria;
 hemoglobinopatii;
 tirozinemia;
 deficitul de glucozo 6-fosfat dehidrogenaza

13.2. Depistarea mucoviscidozei (fibroza chistică)

Mucoviscidoza este cea mai frecventă boală metabolică, având o
incidenţă de 1/2000 în populaţia caucaziană.
Diagnosticul de laborator al mucoviscidozei poate fi stabilit şi prin:
 evidenţierea concentraţiei electroliţilor în sudoare (mai ales Na care
depăşeşte 60 mEq/l);
 determinarea amilazemiei;
 determinarea enzimelor pancreatice în scaun;
 determinarea prezenţei albuminei în meconiu; aceasta se face prin
precipitare cu acid sulfosalicilic sau acid tricloracetic. În peste 90% din
cazurile de mucoviscidoză, reacţia este pozitivă.

13.3. Depistarea fenilcetonuriei

Fenilcetonuria este o tulburare în metabolismul fenilalaninei datorat
deficienţei enzimei fenilalanin-hidroxilaza. Incidenţa: 1/12.000 naşteri vii.

a) determinarea acidului fenilpiruvic în urină (reacţia Fölling)

Principiu: ionul de Fe din perclorura ferică se combină cu acidul
fenilpiruvic din urină, dând în câteva minute o culoare verde. La sugar, la
care recoltarea urinii este dificilă, reactivul se poate pune direct, între
scutece sau cu ajutorul unei bandelete de hârtie de filtru impregnată în
prealabil cu reactiv. Când este posibilă recoltarea, 1 ml reactiv se adaugă
peste 10 picături de urină proaspătă şi se agită puternic; după 2-3 minute
apare culoarea verde care indică prezenţa acidului fenilpiruvic în urină.

121
 Pentru a evita erorile de ordin tehnic se va recolta întotdeauna urină
proaspătă. Reacţiile fals negative sunt date de urini conservate, vechi.
Reacţii fals pozitive pot să apară după administrarea unor medicamente ca:
aspirina, antibioticele ş.a. De notat că testul este pozitiv doar atunci când
fenilalanina în sânge depăşeşte concentraţia de 15 mg%.

b) determinarea fenilalaninei în sânge (testul Guthrie)

La bolnavii cu fenilcetonurie deficitul enzimatic duce la acumularea
în sânge a fenilalaninei. Dozarea acesteia poate fi făcută prin metoda
microbiologică - testul Guthrie; metoda este mai sensibilă decât reacţia cu
perclorură ferică şi asigură un diagnostic precoce, în prima săptămână de
viaţă; deşi este complexă şi costisitoare, metoda se foloseşte cu success
pentru depistarea în cadrul programelor de screening neonatal.
Principiu: creşterea bacilului subtilis (tulpină standard) în mediu de
cultură poate fi inhibată de o substanţă antagonică pentru fenilalanină (2-
betathienilalanină); dacă în mediu există fenilalanină, inhibiţia dispare,
remarcându-se o bogată cultură de bacili subtilis.
Metodă: se prelevează câteva picături de sânge pe o hârtie de filtru
specială; se usucă. O rondelă mică din centrul petei se depune pe mediul de
cultură Difco PKU. Se incubează 16 ore la termostat. Dacă rondela conţine
sânge cu fenilalanină inhibiţia creşterii germenilor este înlăturată, iar în jurul
rondelei se observă un halou albicios dat de cultura de bacili. Zona de
creştere este proporţională cu cantitatea de fenilalanină din eşantion.

c) Detectarea heterozigoţilor (proba de supraîncărcare cu fenilalanină)

Metodă: se recoltează o probă de sânge dimineaţa (proba martor),
apoi se administrează per os 100 mg fenilalanină /kg corp, după care se
recoltează din nou câte o probă de sânge la 2 şi la 4 ore.
Probele sunt supuse cromatografiei pentru determinarea cantitativă a
fenilalaninei, iar valorile se compară cu normalul (proba martor). De mare
precizie diagnostică este spectrofluorimetria; tehnica este însă laborioasă şi
necesită dotare corespunzătoare.

122
13.4. Depistarea hipotiroidismului
Incidenţa: 1/3600-5000 naşteri.
Utilizând un test screening, se poate realiza depistarea
hipotiroidismului congenital imediat la naştere.
Principiu:

sânge

reactiv

Fig. 79

1. se pun 2 picături (50µl) de sânge;

2. se aşteaptă 90 de secunde;
3. se adaugă 4 picături de reactiv (soluţie buffer);
4. se citeşte după 10 minute.

Interpretarea testului:
Pozitiv(+): Prezenţa unei linii roz orizontale atât în dreptul poziţiei T
(test) cât şi în dreptul poziţiei C (control) din fereastra casetei, indică în ser
TSH>20µlU/ml. Intensitatea culorii din dreptul poziţiei T reflectă
concentraţia TSH. Prezenţa unei linii în poziţia T (test) a cărei culoare poate
varia (de la roz slab la roz intens) semnifică test pozitiv.
Negativ(-): Prezenţa unei singure linii roz în dreptul poziţiei C din
fereastra casetei indică în ser TSH<20µlU/ml.
Eronat(ø): Testul nu se poate folosi dacă nu apare o linie roz în
dreptul poziţiei C (control) după 10 min de la adăugarea reactivului.

123
13.5. Depistarea hiperplaziei congenitale de suprarenală prin
deficit de 21 β-hidroxilază
Hiperplazia congenitală de suprarenală este secundară unui deficit
enzimatic care afectează biosinteza steroidiană. Cea mai frecventă formă
este cauzată de un deficit de 21 β-hidroxilază. Frecvenţa diferită, în funcţie
de regiune, de la 1/12500 la 1/23000.
La naştere deficitul combinat de aldosteon şi cortizol poate antrena o
deshidratare cu pierdere de sare, cu risc de colaps şi deces foarte rapid. În
absenţa depistării neonatale cei mai expuşi sunt băieţii, deoarece la fetiţe
ambiguitatea sexuală conduce rapid la stabilirea diagnosticului.
Modalitatea de depistare constă în dozarea de 17OH progesteron din
sângele uscat de pe hârtia de filtru. Valoarea normală este mai mică de 60
nmol/l. Nou născuţii afectaţi prezintă nivel crescut. Prematuritatea induce
rezultate fals pozitive prin imaturitate enzimatică. De asemenea rezultate
fals pozitive apar în caz de greutate mică la naştere, unele afecţiuni,
determinare în primele 24 ore.

13.6. Testarea auditivă

În afară de testele biochimice, în perioada neonatală se testează și
funcția auditivă, în program screening.
Pentru testare se pot folosi 2 metode, care durează 5-10 minute,
ambele fără riscuri:
 emisiile otoacustice. Acest test determină dacă anumite părţi ale
urechii copilului răspund la sunet. O cască şi un microfon miniatural sunt
plasate în ureche şi sunt redate sunetele. Dacă nou-născutul are auzul
normal, microfonul preia un ecou reflectat înapoi în canalul auditiv.
Imposibilitatea de a detecta un ecou înseamnă că ar putea fi o pierdere a
auzului.
 răspunsul auditiv al creierului. Acest test evaluează o parte a
nervului auditiv care transportă sunetul de la ureche la creier şi răspunsul
creierului la sunet.

124
Întrebări

1. Bolile care se pretează screeningului neonatal sunt:

a. Fenilcetonuria;
b. Diabetul zaharat;
c. Hipotiroidismul congenital;
d. Toxoplasmoza congenitală;
e. Hipertensiunea arterială.

2. Depistarea mucoviscidozei se realizează prin:

a. evidenţierea concentraţiei electroliţilor în sudoare;
b. teste citogenetice;
c. cercetarea amilazemiei;
d. teste moleculare;
e. cercetarea enzimelor pancreatice în scaun;

3. Depistarea fenilcetonuriei se realizează prin:

a. Cercetarea acidului fenilpiruvic în urină;
b. Cercetarea fenilalaninei în sânge;
c. Metode cantitative;
d. Metode calitative;
e. Toate răspunsurile sunt corecte.

4. Fenilcetonuria:
a. boală monogenică cu alele p=patologică şi N=normală;
b. bolnavii sunt homozigoţi pp;
c. în arborele genealogic există un număr mic de afectaţi.

5. Care sunt situatiile/bolile care care se pretează la screening neonatal:

a. unele boli monogenice (produse prin mutaţii genice);
b. erorile de metabolism;
c. infectiile recurente;
d. greutatea mică la naştere.

6. Care sunt beneficiile screening-ului neonatal:

a. permite un tratamentul eficient;
b. face posibilă luarea unor măsuri terapeutice simptomatice sau de
susţinere;
c. facilitează consultul genetic şi formularea sfatului genetic adecvat;
d. permite stabilirea prevalenţei bolii in populaţie.

125
7. Care sunt criteriile sau principiile screening-ului pentru nou-născuţi:
a. prevalenţa leziunii sau afecţiunii în populaţie;
b. metodă simplă de recoltare;
c. repetabilitatea probei cu puţine rezultate fals-pozitive sau fals-negative;
d. costuri realiste;
e. toate raspunsurile sunt corecte;

8. Dintre următoarele afirmaţii, legate de mucoviscidoză, care sunt

corecte:
a. este cea mai frecventă boală metabolică;
b. are o incidenţă de 1/10000 în populaţia caucaziană;
c. beneficiază de metode de laborator care permit depistarea ei imediat după
naştere;
d. debutează la adultul vârstnic.

9. Dintre următoarele afirmaţii, legate de fenilcetonurie, care sunt

corecte:
a. este o tulburare în metabolismul fenilalaninei datorat deficienţei enzimei
fenilalanin-hidroxilaza;
b. are o incidenţă de 1/100000 în populaţia generală;
c. beneficiază de metode de laborator care permit depistarea ei imediat după
naştere;
d. diagnosticul precoce permite evitarea manifestărilor bolii.

10. Dintre următoarele afirmaţii, legate de hiperplazia congenitală de

suprarenală, care sunt corecte:
a. este secundară unui deficit enzimatic care afectează biosinteza
steroidiană;
b. cea mai frecventă formă este cauzată de un deficit de 21 β-hidroxilază;
c. frecvenţa diferă, în funcţie de regiune, de la 1/12500 la 1/23000;
d. toate răspunsurile sunt corecte.

126
 Capitolul 14
DIAGNOSTICUL ANTENATAL

Diagnosticul antenatal reprezintă una dintre cele mai actuale şi

eficiente metode de profilaxie a tulburărilor ereditare deoarece permite
depistarea acestor afecţiuni şi este urmat de luarea unei decizii terapeutice
adecvate; stabilirea unui diagnostic precoce este necesar pentru instituirea
rapidă a unui tratament eficace imediat după naştere sau - după caz -
recomandarea unui avort terapeutic care să se realizeze în timp util.
Teoretic, diagnosticul prenatal poate fi realizat pentru orice
suspiciune legată de o afecţiune genetică sau non genetică (eroare înnăscută
de metabolism, malformaţii congenitale, anomalii cromozomiale).
Diagnosticul antenatal constă în efectuarea unui consult genetic în
care se realizează examenul clinic al părinţilor (preconcepţional sau în
timpul sarcinii), anchetarea trecutului reproductiv al mamei în vârstă
(avorturi spontane, naşteri de feţi morţi sau malformaţi), expunerea la
anumiţi factori de mediu toxici, cu potenţial teratogen. Prin consultul
genetic se va stabili investigaţia necesară pentru diagnosticul afecţiunii
respective, estimarea riscului fetal pentru o boală cromozomială, genică,
malformaţii, sau infecţii fetale intrauterine.
Stabilirea unui diagnostic antenatal necesită o colaborare strânsă
între activitatea clinică şi cea de laborator. Metodele de screening antenatal
vor fi aplicate gradual, începând cu cele neinvazive şi, în funcţie de
rezultatele lor, continuând cu unele invazive. Astfel, sarcinile în care se
detectează modificări ecografice sau valori anormale pentru screening-ul
markerilor biochimici (ex. alfa-fetoproteina - AFP), precum şi cel în care
există antecedente obstetricale negative sunt considerate sarcini cu risc.
În funcţie de afecţiunea care trebuie diagnosticată antenatal, se va
stabili momentul şi ţesutul fetal care va fi prelevat prin anumite manevre şi
investigaţii specifice: vilozităţi coriale, celule fetale din lichidul amniotic,
biopsie de ţesut fetal sau sânge fetal.
Indicaţiile diagnosticului antenatal
 Mama în vârstă de peste 35 ani;
 După naşterea unui copil cu aberaţie cromozomială;
 Aberaţii cromozomiale structurale balansate la unul din părinţi;
 După naşterea unui copil malformat şi cariotip necunoscut;
 Dismorfogenezii evidenţiate ecografic în timpul sarcinii;
 Risc crescut pentru aneuploidii fetale indicat de teste screening materne;

127
 Avorturi spontane multiple în antecedente;
 Boli X-linkate în familie;
 Boli ereditare în familie şi care pot fi diagnosticate biochimic sau molecular.
În funcţie de rezultatul diagnosticului, la indicaţia medicului
genetician, cuplul respectiv va putea opta şi apoi decide menţinerea sarcinii
sau avortul terapeutic.
Tehnici de screening prenatal
1. Triplu test
Triplu test este cel mai important test neinvaziv efectuat in scopul
detectarii unor anomalii fetale şi reprezintă o metoda de screening pentru
trei markeri din serul matern şi anume determinarea nivelurilor serice ale
alfa- fetoproteinei (AFP), estriolului neconjugat (uE3) şi ale gonadotrofinei
chorionice (hCG).
Triplu test compară diferiţi factori (vârstă, etnie, rezultatele testelor
sangvine etc) şi apreciază care este şansa ca fătul să prezinte o anomalie.
Acest test nu stabileşte un diagnostic ci reprezintă doar un semnal de alarmă
şi sugerează necesitatea utilizării unor alte teste diagnostice.
Indicaţii
Metoda se foloseşte ca test screening la gravidele cu risc de a da
naştere unor copii cu defecte de tub neural, sindrom Down, sindrom
Eduards, alte boli cromozomiale.
Suspiciunea trebuie confirmată ulterior prin ecografie şi investigaţii
citogenetice din vilozităţi choriale sau lichid amniotic.
Triplu test se recomandă:
- în cazul familiilor cu istoric pozitiv pentru defecte de tub neural
- gravidelor cu vârsta de peste 35 de ani
- in cazul utilizării unor medicamente dăunătoare în perioada de sarcină
- gravidelor cu DZ tratat cu insulină
- celor care au prezentat o viroză în primele săptămâni de sarcină
- gravidelor expuse la nivele crescute de radiaţii
Principii
Testul necesită o cantitate minimă de sânge venos şi se efectuează
între săptămânile 15-20 de gestaţie, cu un interval optim 16-18 săptămâni.
Pentru ca testul să fie concludent, el bazându-se pe corelaţia dintre vârsta
sarcinii şi determinarea cantitativă a markerilor serici, este important ca el să
fie precedat de o ecografie care va stabili corect vârsta gestaţională, prin
biometrie fetală.

128
Alfa fetoproteina (AFP)
Este o proteină produsă de ficatul fetal. Atinge un nivel maxim în
sângele fetal în săptămânile 10-13 de sarcină. Trece în lichidul amniotic
(fig. 80 ), apoi în sângele matern, unde concentraţia creşte aproximativ
constant şi atinge un maxim în trimestrul III de sarcină.

Fig. 80. Valoarea AFP în lichidul amniotic în trimestrul doi de sarcină

Studiile au arătat că există mai multe cauze pentru valori crescute

sau scăzute ale AFP-ului în sângele matern.
Cauze de AFP crescut:
 Spina bifida;
 Anencefalia;
 Defecte congenitale ale tegumentului,
 Defecte ale peretelui abdominal;
 Malformații gastro-intestinale;
 Teratom sacrococcigeal;
 Anomalii reno-urinare (obstrucţie, rinichi polichistic, agenezie renală);
 Osteogeneza imperfecta;
 Distrofie fetală;
 Oligohidramnios;
 Sarcina multiplă;
 Greutate mică a gravidei.

129
 Cauze de AFP scăzut:
 Vârsta gestațională mai mică decât cea calculată;
 Trisomii cromozomiale;
 Mola hidatiformă;
 Moarte fetală;
 Greutate mare a gravidei.
AFP-ul singur sau în triplul test poate determina 80-90% din
defectele de tub neural.

Gonadotrofina corionică umană (hCG)

Este un hormon produs de sinciţiotrofoblastul placentei, începând cu
momentul nidării în peretele uterin. Valoarea sa creşte rapid în primele 8
săptămâni, apoi scade aproximativ constant până în săptămâna 20,
rămânând apoi constant.
Nivelul crescut de hCG pare să fie cel mai sensibil marker pentru
trisomia 21, iar nivelul scăzut hCG poate să fie asociat cu trisomia 18.

Estriolul neconjugat (uE3)

Este un estrogen produs de placentă, din precursori furnizaţi de către
ficatul fetal. Nivel scăzut poate apărea în trisomiile 21 şi 18.

Interpretarea rezultatelor
Valorile obţinute prin determinările celor 3 markeri serici sunt
interpretate în funcţie de valorile mediane pentru respectiva vârstă
gestaţională, iar rezultatul a fost formulat ca MoM (Multiply of Median) şi
comparat cu intervalul acceptat pentru risc, de 0.4 - 2.5 x MoM.
Se pot folosi programe specializate (Prisca) care determină valori ale
MoM corectate în funcţie de vârsta gravidei, greutatea ei, grupul etnic, statusul
de fumător /nefumător, multiplicitatea sarcinii, eventualele afecţiuni (diabet
zaharat). Aceste programe pot calcula şi riscul pentru anomaliile urmărite.
Testul are valoare orientativă. Majoritatea gravidelor la care se
obţine un rezultat pozitiv pentru trisomie 21 ( sindrom Down), trisomie 18
(sindrom Eduards) sau defecte de tub neural poate avea un copil normal. De
aceea, un rezultat pozitiv necesită testări diagnostice suplimentare
(amniocenteza).

Variante ale metodei

Pentru a creşte sensibilitatea testului screening de depistare a
anomaliilor fetale, pe lângă cei trei markeri (AFP, uE3 şi hCG) s-a propus şi
un al patrulea marker: inhibitina A.

130
 Este un test mai nou, suplimentar (de aici denumirea de test
cvadruplu). Acest test creşte sensibilitatea pentru trisomiile 13, 18. 21.
S-au propus diferite combinaţii între markerii serici şi semne de apel
ecografice. Astfel, un depistaj precoce, până în săptămâna 13 de sarcină, se
poate baza pe măsurarea pliului nucal, valoarea hCG şi a proteinei
placentare PAPP-A (pliu nucal mai mare de 3 mm în săptămâna 12 de
sarcină). Această variantă este fiabilă şi permite depistarea în peste 80 % din
cazurile de trisomie 21, putând ridica suspiciuni şi pentru alte patologii
fetale.

Avantaje şi dezavantaje
Importanţa determinării riscului malformativ prin triplul test constă
în reducerea numărului de persoane care se încadrează în grupele de risc şi
care ar trebui să facă puncţie amniotică şi cariotipare (investigaţie exactă,
dar invazivă, cu un anumit grad de risc şi mult mai costisitoare).

Cele mai importante avantaje sunt:

- economice (triplu test este o metodă relativ ieftină, comparativ cu alte
tehnici de screening şi diagnostic antenatal),
- legate de timp (rezultatul este posibil în 1-2 săptămâni).
- metoda este neinvazivă, lipsită de riscuri pentru mamă şi făt.

Dezavantajele metodei constau în sensibilitatea scăzută şi valoarea

orientativă şi nu diagnostică.
Cele trei substanţe par să fie diferite în cazul sarcinilor cu feţi
trisomici. Două substanţe au valori crescute, în timp ce a treia are valori
scăzute. Aceste variaţii nu sunt regăsite la toate gravidele care prezintă feţi
trisomici. Dacă se urmăreşte modificarea unei singure substanţe ea va fi
evidentă la 45 - 50% dintre gravidele cu feţi trisomici. Dacă se combină
creşterea a doi markeri cu diminuarea celui de-al treilea anomalia va fi
depistată la 60 -70% dintre gravidele cu feţi trisomici.
Există şi situaţia în care prin efectuarea testului, persoane aparent
fără nici un risc pot fi incluse în grupul de risc. Totuşi repetarea ecografiei şi
chiar a triplului test poate elimina cazurile de rezultate fals pozitive.
Este important să se păstreze regulile generale de recomandare a
triplului test pentru a nu expune persoane cu risc scăzut la stresul unor valori
de cele mai multe ori fals pozitive.

131
2. Ecografia fetală – varianta de screening

Ecografia fetală este o tehnică de investigare, neivazivă, atât pentru

făt, cât şi pentru mamă.
Undele cu frecvenţă crescută (ultrasunetele) sunt utilizate pentru a
produce imagini vizibile ale diferitelor ţesuturi şi organe, inclusiv ale fătului
în cavitatea amniotică (fig. 81).

Fig. 81. Ecografia unui făt în săptămâna 16 de sarcină

Indicații
Se consideră că o sarcină clinic şi biologic normală are nevoie de 3
ecografii de urmărire:
 ecografia din primul trimestru (săptămâna 12 de sarcină);
 ecografia de al II-lea trimestru (săptămâna 21 de sarcină), numită
ecografia morfologică.
 ecografia din trimestrul III (săptămâna 32 de sarcină).

Ecografia din primul trimestru de sarcină

Dacă sarcina se derulează normal se recomandă între 11-13 SA. Se
poate realiza pe cale abdominală sau endovaginală. Calea abdominală este
suficientă atunci când uterul este anteversat, iar morfologia şi calitatea
transmiterii maternale o permite.

132
 Această ecografie permite:
 confirmarea sarcinii
 localizarea sarcinii (intra sau extrauterin);
 stabilirea vârstei sarcinii: ecografia permite datarea exactă a sarcinii,
necesară altor evaluări (markerii serici, PVC, amniocenteză).
 biometria fetală: stabileşte viabilitatea embrionului (activitate cardiacă
prezentă). La 11 SA se măsoară lungimea cranio-caudală (30 mm) şi
diametrul BIP (biparietal) de 10 mm. Sunt vizibile cele 4 membre şi
mişcările fetale;
 depistarea malformaţiilor: între 11-14 SA ecografia permite realizarea
unei prime depistări. Această depistare se realizează prin:
 măsurarea clarităţii (translucenţei) nucale. Acest element se dovedeşte un
bun marker al anomaliilor cromozomice (valoare normală: sub 3 mm pe
o secţiune sagitală a embrionului).
 observarea primelor structuri fetale separabile: bolta craniană, emisferele
cerebrale,, talamusul, faţa, cu distanţa interorbitală, stomacul şi vezica
urinară, cele 4 membre, fiecare cu 3 segmente şi 5 structuri la extremităţi.

Această ecografie mai permite detectarea sarcinilor multiple

(precizarea tipului de sarcină: mono sau bicorială, mono sau biamniotică).

Ecografia din al II-lea trimestru de sarcină

Realizată obişnuit între 22 şi 24 SA.
Permite:
 evaluarea creşterii fetale prin măsurători la nivelul fătului, în special la
nivelul polului cefalic: diametrul BIP, perimetrul cefalic (PC).
 unele măsurători pot pune în evidenţă anomalii morfologice fetale: DFO
(diametrul fronto-occipital), DIO (diametrul inter-orbital extern, intern şi
mediu), DAT (diametru abdominal transvers), PA (perimetru abdominal),
LF (lungimea femurală).
 studierea mobilităţii fetale
 studierea anexelor fetale:placenta (ecostructură, nivel de inserţie), lichid
amniotic ( volum).

133
Ecografia din trimestrul al III-lea de sarcină
Realizată de obicei între 32 şi 34 SA.
Ea permite:
 Depistarea şi diagnosticarea unor anomalii morfologice fetale cu apariţie
tardivă ;
 Evaluarea stării de creştere fetală, pe baza măsurătorilor care permit acest
studiu (BIP, PC, DAT, PA şi LF) ;
 Studierea mobilităţii fetale;
 Determinarea poziţiei fetale;
 Determinarea poziţiei de inserţie a placentei şi gradul său de maturitate ;
 Evaluarea cantităţii de lichid amniotic.

Principii
Explorarea ecografică este bazată pe principiul emisiei de ultrasunete
de către o sondă. Aceste ultrasunete vor penetra în organele care sunt
explorate, apoi, prin mai multe fenomene fizice, în special prin reflexie, o
parte din aceste ultrasunete vor reveni la sondă, care le va transforma în
semnale electrice. Aceste semnale sunt tratate prin aparatul ecografic şi vor
apare pe ecran sub formă de clişee ecografice în formă de imagini. Aceste
imagini nu sunt decât umbre ale organelor explorate iar ecografia este un
studiu al acestor umbre. In timpul explorării pot apare puncte de umbre
invizibile sau imposibil de interpretat ceea ce explică faptul că nu se poate
vedea totul la ecografie sau că o ecografie fetală normală nu este
întotdeauna echivalentă cu un copil normal

Interpretarea rezultatelor
Punerea în evidenţă a unor anomalii morfologice fetale minore
(markeri minori) pot conduce la indicarea şi realizarea unui cariotip fetal
prin amniocenteză, ghidată şi ea ecografic. Cercetarea acestor semne nu
permite diagnosticarea decât în 75 % din cazurile de trisomie 21, chiar dacă
depistarea a fost efectuată de cei mai buni ecografişti, utilizând cele mai
performante ecografe. Există deci feţi cu trisomie 21 cu ecografie
morfologică normală (un trisomic din patru).
Pornind de la faptul că ecografia fetală este o metodă de screening şi
poate releva unele semnale (semne de apel ecografic) privind anomaliile
fetale, aceste semnale vor determina iniţierea unor metode suplimentare de
investigare, care să stabilească diagnosticul de certitudine.

134
Avantaje si dezavantaje
Principalele avantaje sunt legate de faptul că este o metodă
neinvazivă, relativ ieftină, care s-a extins în toate spitalele şi reprezintă o
metodă de depistare pentru anomaliile fetale, aflată la îndemâna tuturor
specialiştilor şi deci şi a gravidelor.
Dezavantajul major al ecografiei fetale este acela că uneori nu se iau
în calcul limitele metodei.

Limitele ecografiei obstetricale

O ecografie obstetricală normală nu poate asigura că la naştere
copilul va fi normal pentru că examenul ecografic nu permite întotdeauna
diagnosticarea tuturor anomaliilor morfologice şi este incapabil să pună în
evidenţă anomaliile funcţionale ale organelor studiate dacă acestea sunt
morfologic normale.

Studiile arată că ecografia obstetricală nu detectează decât:

 60 % din malformaţiile fetale şi
 75% din feţii cu trisomie 21.

Pentru a creşte sensibilitatea diagnosticului antenatal se propun

metode combinate de screening (markeri serici + ecografie), evaluări
ecografice specializate şi repetate, tehnici ecografice 3D, 4D.

3. Biopsia de vilozităţi coriale (chorion villus sampling - CVS)

Intervenţia se realizează sub control ecografic, în săptămânile 10 -
12 de sarcină.
Se recoltează 10-20 mg vilozităţi coriale de obicei prin puncţie
transabdominală sau prin aspiraţie transcervicală şi mai rar, prin puncţie
transvaginală.
Materialul biologic prelevat oferă avantajul unui diagnostic
citogenetic rapid, prin metoda directă sau utilizând FISH. Analiza ţintită
pentru aneuploidiile fetale (de exemplu trisomiile 13, 18, 21), utilizând
sonde specifice marcate cu fluorocromi face posibil diagnosticul în 24-48 h.
Limitele metodei constau în riscul contaminării cu ţesut matern şi astfel
compromiterea probei sau existenţa unui mozaicism placentar cu rezultate
fals pozitive sau fals negative în cazul anomaliilor numerice cromozomiale.
Complicaţiile care pot interveni constau în: hemoragii, infecţii,
defecte congenitale ale extremităţilor prin mecanism teratogenic sau, avort
spontan.

135
Indicaţii:
 diagnosticul antenatal al bolilor cromozomiale şi al sexului genetic prin
evidenţierea cariotipului fetal;
 diagnosticul antenatal molecular al bolilor metabolice, izolând ADN-ul
embrio-fetal din vilozităţile coriale.

4. Amniocenteza
Amniocenteza este o procedură chirurgicală utilizată în cadrul
diagnosticului prenatal, care constă în aspirarea unui eşantion de lichid
amniotic, în care se găsesc celule fetale, prin intermediul unui ac foarte fin,
introdus în cavitatea amniotică, traversând peretele abdominal, sub anestezie
locală.
Cu ajutorul amniocentezei medicii pot stabili starea de sănătate şi de
maturitate a fătusului şi pot diagnostica eventualele anomalii fetale.
Amniocenteza poate fi practicată din momentul în care lichidul
amniotic care înconjură fătul este în cantitate suficientă şi eşantionul de care
este nevoie poate fi extras în siguranţă. Vârsta de sarcină la care se practică
puncţia amniotică este de regulă 14-20 de săptămâni de amenoree. Unele
clinici şi laboratoare de citogenetică recomandă intervenţia chiar la vârste
mai precoce (13-15 săptămâni de amenoree).
Ea face parte, împreună cu biopsia de trofoblast sau biopsia de
vilozităţi coriale (coriocenteza) şi puncţia cordonului ombilical fetal
(cordocenteza) din metodele invazive de diagnostic prenatal.

136
 Fig. 82. Ilustrarea diverselor căi posibile de acces spre embrion,
pentru necesităţi diagnostice

1. Embrion
2. Cavitate amniotică
3. Cavitate corială
4. Cavitate uterină
5. Vilozităţi coriale

A. Amniocenteză
B. Puncţie de vilozităţi coriale (PCV) traversând peretele abdominal
C. Puncţie a cordonului ombilical (V. ombilicală)
D. Puncţie de vilozităţi coriale (PCV) pe cale vaginală

Indicaţii
Amniocenteza permite:
- Stabilirea cariotipului standard al fătului
- Cercetarea unor infecţii fetale (toxoplasmoză, Citomegalovirus), a unor
anomalii cromozomice şi a unor boli ereditare.

137
 Ea este indicată sistematic în următoarele situaţii:
 când gravida se apropie sau depăşeşte vârsta de 40 de ani (în unele ţări
investigaţia este propusă gravidelor peste 35 de ani, în altele celor peste 38
de ani), întrucât riscul de trisomie 21 este mult mai mare la această vârstă.
Riscul de a avea un copil cu anomalie cromozomică, în special trisomie 21
sau sindrom Down este prezent la femeile de orice vârstă. Inainte de 35 de
ani acest risc este considerat scăzut. După vârsta de 35 de ani riscul creşte
semnificativ şi relative rapid. O mamă de 35 de ani are un risc de 1/240 de a
avea un copil cu trisomie 21; la 40 ani, acest risc este de 1/70.
Acest examen depistează în egală măsură şi anomaliile altor perechi
de cromozomi, riscul fiind de asemenea corelat cu vârsta gravidei:

Vârsta
Trisomie 21 Trisomie 18 Trisomie 13
maternă

15 - 19 1:1600 1:17000 1:33000

20 - 24 1:1400 1:14000 1:25000

25 - 29 1:1100 1:11000 1:20000

30 - 34 1:700 1:7100 1:14000

35 - 39 1:240 1:2400 1:4800

40 - 44 1:70 1:700 1:1600

45 - 49 1:20 1:650 1:1500

 când unul din părinţi prezintă o anomalie cromozomică

Unii părinţi sunt purtători ai unei remanieri cromozomice (anomalie
cromozomică echilibrată), fără consecinţe pentru ei dar care pot conduce la
o anomalie cromozomială dezechilibrată la copiii lor, manifestările clinice
specifice. În general este vorba de o situaţie cunoscută de familie, depistată
în urma naşterii unui copil cu anomalie cromozomială şi cariotip anormal,
sau cu ocazia investigaţiilor efectuate pentru precizarea etiologiei unor
avorturi spontane repetate sau a sterilităţii cuplului.
 când ecografia antenatală screening evidenţiază la făt o malformaţie
sugestivă pentru o anomalie cromozomială Feţii purtători ai unei anomalii
cromozomice prezintă mai frecvent malformaţii vizibile la ultrasunete şi
asta pentru că dacă o malformaţie este detectată ecografic, va fi indicată

138
efectuarea unei amniocenteze. Astfel, screeningul ecografic antenatal
urmăreşte aspecte morfologice sugestive pentru anomaliile cromozomiale,
cum este claritatea (translucenţa) nucală fetală, măsurată în săptămâna 12 şi
care este mai mare de 3mm.
 dozarea unor substanţe în sângele matern, care pot sugera o eventuală
anomalie cromozomială la făt. În 5-8 % din cazuri testele indică o creştere a
riscului şi justifică investigaţii suplimentare, printre care şi amniocenteza.
Valorile anormale ale marcherilor sangvini nu vor fi confirmate în 99% din
cazuri şi cariotipul fătului va fi normal dar în 1% din cazuri fătul va prezenta
trisomie 21. Trebuie menţionat faptul că triplu test nu este patologic decât la
70-80 % din copiii cu trisomie 21, restul cazurilor nu vor beneficia de
investigaţii suplimentare care să confirme suspiciunea dată de riscul crescut.
Amniocenteza tardivă, efectuată în cursul celui de-al treilea trimestru
de sarcină permite urmărirea evoluţiei unei sarcini cu risc crescut
(incompatibilitate Rh etc.) sau dacă se suspectează o malformaţie digestivă,
neurologică sau pentru identificarea unei eventuale suferinţe fetale care
necesită o intervenţie:
- nivelul celulelor liniei eozinofile denotă gradul de maturitate a
tegumentelor
- nivelul creatininei relevă gradul de maturitate a rinichilor
- raporturile lecitină/sfingomielină sau acid palmitic/acid stearic relevă
gradul de maturitate a plămânilor.

Principii
Principiul diagnosticului prenatal constă în prelevarea celulelor
fetale şi efectuarea investigaţiilor în scopul decelării eventualelor boli
genetice, cum ar fi trisomia 21.
Ginecologul prelevează, cu o seringă şi sub control ecografic,
aproximativ 15 - 20 ml de lichid amniotic. Acesastă intervenţie durează
câteva secunde şi uneori se renunţă chiar şi la anestezia locală. După
prelevare viitoarea mamă se poate reîntoarce acasă, fiind sfătuită să evite
pentru câteva ore efortul şi să se odihnească.

139
 Fig. 83. Ecografia permite reperarea poziţiei fătului şi prelevarea de
lichid amniotic în bune condiţii. Imaginea prezintă poziţia acului de
puncţie, ghidat ecografic

Interpretarea rezultatelor
Amniocenteza permite realizarea unui cariotip, pornind de la celulele
prezente în lichidul amniotic şi verificarea cromozomilor copilului care se
va naşte.
Legat de lichidul amniotic în care fătul înoată se urmăresc şi alţi
parametri:
- Ecografic, medicul poate aprecia cantitatea de lichid amniotic. Pe ecran
lichidul formează o zonă neagră. Un exces de lichid (hidramnios) poate
anunţa o infecţie virală. Acest exces de lichid amniotic este o cauză a
contracţiilor uterine şi ameninţă naşterea prematură.
- Dacă lichidul amniotic este în cantitate mică (oligoamnios), sau chiar
lipseşte (anamnios), fătul nu va putea creşte corespunzător: dezvoltare
pulmonară insuficientă, poziţie anormală a membrelor etc.
- Efectuând amniocenteza, medicul poate observa lichidul amniotic: dacă
este colorat, semnifică o suferinţă fetală iar obstetricianul poate decide
declanşarea naşterii.
Dacă rezultatele sunt normale ele liniştesc şi încurajează gravida,
excluzând un anumit număr de probleme. În acelaşi timp, nu toate
malformaţiile şi anomaliile sunt legate de modificări vizibile ale
cromozomilor. Şi în ultimă instanţă, dacă este descoperită o anomalie

140
cromozomială, de exemplu trisomia 21, decizia unei eventuale întreruperi a
sarcinii aparţine doar părinţilor. Din acest motiv, se recomandă ca
amniocenteza să fie practicată doar gravidelor care intenţionează să înrerupă
sarcina dacă suspiciunea care a recomandat amniocenteza se confirmă şi
fătul este afectat.

Variante ale metodei

Principalele investigaţii efectuate din lichidul amniotic sunt:
1. Analiza cromozomilor utilizând cultura de lungă durată.
Celulele fetale conţinute în lichidul amniotic sunt cultivate şi
păstrate în incubator timp de 7-10 zile. Cariotipul poate fi efectuat când
celulele s-au multiplicat suficient. Se analizează cel puţin 16-20 de celule
obţinute din culturi diferite ale aceluiaşi produs. Este nevoie în medie de 10-
14 zile pentru a obţine un rezultat definitiv. În cazuri foarte rare poate fi
necesară o nouă prelevare (confirmarea unui rezultat, eşec de cultură).
Această metodă permite în egală măsură evidenţierea unor anomalii
cromozomice structurale, suspectate sau nu.

2. Metoda de analiză directă, prin FISH (Hybridation in situ Fluorescente)

Această investigaţie, chiar dacă este parţială şi preliminară, permite
obţinerea rezultatelor definitive şi mult mai precise. Metoda FISH
depistează 70% dintre anomalii în mai puţin de 48 de ore. Gravida va obţine
un rezultat privind anomaliile cromozomice grosiere cum sunt trisomiile 21,
18, 13 sau trisomiile cromozomilor sexuali (Klinefelter, triple X sau XYY),
respectiv monosoma X (sindromul Turner), în 24 de ore.

3. Dozarea alfa-fetoproteinei
Creşterea alfa-fetoproteinei, prezentă normal în cantitate mică în
lichidul amniotic atrage atenţia asupra unei posibile malformaţii fetale la
nivelul sistemului nervos sau a peretelui abdominal. Dozarea alfa-
fetoproteinei în lichidul amniotic prelevat prin amniocenteză se efectuează
sistematic, chiar în absenţa unui risc particular.
Concluziile studiilor cromozomice sunt de o fiabilitate aproape
absolută dacă numărul şi calitatea celulelor amniotice obţinute sunt
suficiente. Nu se cunosc decât câteva rare cazuri în care celulele provenite
de la mamă se pot regăsi în proba prelevată şi substituindu-se celulelor
fetale pot antrena o eroare de interpretare.

141
Avantaje şi dezavantaje
Un test ca amniocenteza, prin consecinţele pe care le implică, nu
poate fi impus. Avantajele şi inconvenientele testului trebuie să fie discutate
în prealabil, cu ambii parteneri, în prezenţa medicului ginecolog care
urmăreşte gravida sau care a recomandat consultul genetic. Decizia
amniocentezei aparţine gravidei dar obligatoriu în urma consultării
geneticianului care va pune la dispoziţie cuplului toate informaţiile necesare
unei bune înţelegeri a testului şi va acorda sfatul genetic adecvat. Cu această
ocazie gravida va semna consimţământul de a se supune acestei intervenţii,
informată fiind asupra interesului medical al investigaţiei, asupra limitelor
sale, a complicaţiilor şi riscurilor intervenţiei.
Complicaţiile posibile ale amniocentezei sunt extrem de mici.
Lezarea fătului este imposibilă şi nu intră în discuţie în decizia recurgerii la
test. În schimb se poate produce o pierdere de lichid amniotic cu sau fără
contracţie uterină, ceea ce poate antrena avort spontan la 1 puncţie
amniotică din 200.
Limitele testului constau în faptul că el nu depistează decât
anomaliile cromozomiale şi nu pe cele ale genelor. Nu există la ora actuală
nici un depistaj de rutină al bolilor genice (cum ar fi mucoviscidoza sau
miopatiile). Dacă acest tip de boală este prezent în într-o familie,
diagnosticul este adesea posibil utilizând lichidul amniotic dar la nivel
molecular (pe ADN). În aceste condiţii este important să se recurgă la
consultul genetic care va permite să se stabilească cea mai adecvată metoda
de diagnostic prenatal, în funcţie de boala şi mutaţia genică suspectată.

5. Ecografia fetala: în scop diagnostic

Ecografia fetală este o înregistrarea neinvazivă, bazată pe

proprietăţile ultrasunetelor, practicată de specialişti şi interpretată împreună
cu perinatologul. Această înregistrare urmăreşte şi aprofundează “semnele
de apel ecografic” sau modificările markerilor serici, încercând să
stabileasca cu certitudine existenţa unei anomalii fetale şi diagnosticarea ei.

Indicații
Ecografiile din trimestrul II şi III de sarcină pot fi utile când pacienta
prezintă antecedente familiale sau dacă la sarcinile anterioare au fost
observate diverse anomalii.
În general pentru aceste indicaţii ecografiile sunt propuse şi realizate
sistematic între 20 şi 32 SA.
Acest examen permite obţinerea informaţiilor privind morfologia
fătului, creşterea sa şi informaţii asupra placentei.

142
 Dintre aspectele patologice depistate şi diagnosticate prin ecografie
fetală enumerăm:
 Anomalii cromozomice (trisomia 13, 18, 21)
 Anomalii cardiovasculare, malformaţii cardiace
 Displazii scheletale
 Malformaţii renale
 Diverse boli genetice
 Infecţii congenitale
În cazul infecţiilor, ecografia permite cercetarea şi diagnosticarea
expresiei morfologice şi repercursiunile funcţionale ale unor infecţii fetale.
Agenţii infecţioşi pentru care riscul embrio-fetopatiilor este mai bine
cunoscut sunt: toxoplasma, virusul rubeolic, citomegalovirusul, parvovirusul
B19 şi virusul varicelei. Unele semne ecografice sunt puţin specifice dar
identificarea lor poate conduce la căutarea sistematică a unei posibile
infecţii fetale (retard de creştere intrauterină, anomalii ale cantităţii de LA).
În acelaşi timp, fiecare infecţie poate antrena unele manifestări patologice
specifice, care permit diagnosticul, chiar dacă nici un semn ecografic nu este
patognomonic pentru un anumit agent infecţios:
 RCIU
 Calcificările intra-craniene sau intra-abdominale
 Hidrocefalia
 Anasarca
 Oligo-hidramnios
 Placentomegalia
În ceea ce priveşte morfologia fătului, eventualele patologii ce pot fi
descoperite prin ecografie sunt:
- Hidrocefalia: acumularea excesivă de lichid cefalorahidian (LCR) în
interiorul cavităţilor craniene, datorită circulaţiei şi/sau absorbţiei
defectuoase a LCR. In acest caz, diametrul biparietal (BIP) al fătului este cu
2-3 cm peste limita normală şi specialistul constată un aspect pe care îl
numeşte “alunecarea ecoului median”.
- Malformaţiile de tub neural, în special spina bifida. Această malformaţie
congenitală a coloanei vertebrale constă în absenţa sudării la nivelul arcului
posterior şi a apofizei spinoase, la nivelul unei sau mai multor vertebre,
lăsând un spaţiu mai mult sau mai puţin important, şi prin care măduva
spinării poate hernia, dând aspectul unei tumori.
- Anencefalia: absenţa encefalului, adică a structurii nervoase conţinute în
cutia craniană.
- Malformaţii ale liniei mediane

143
 Holoprozencefalia
Agenezia de corp calos (ACC). Descoperirea unei ACC impune un
bilanţ eco-morfologic complet, pentru cercetarea de anomalii cerebrale
frecvent asociate (60 - 75%) : Dandy-Walker, microcefalie, chiste
interemisferice, lipoame. Vor fi căutate sistematic şi anomalii extra-
cerebrale: cardiovasculare, genito-urinare, digestive, musculo-scheletice.
Formaţiunile chistice cerebrale – markerul ecografic este o imagine
lichidiană non-vasculară.
Alte anomalii susceptibile de a fi puse în evidenţă sunt anomaliile de
membre, de perete abdominal (omfalocel, laparoschizis), anomalii de
viscere, cum ar fi rinichii, inima, duodenul. Aceste organe pot prezenta fie o
malformaţie, fie o insuficienţă de funcţionare. De exemplu, rinichiul poate fi
polikistic sau se poate constata prezenţa unei uretero-hidronefroze.
Stabilirea sexului fetal este uneori utilă pentru depistarea anomaliilor
în relaţie directă cu sexul. Fiabilitatea acestui examen este valabilă începând
cu vârsta de la 22 de săptămâni.

Principii
În funcţie de suspiciunea sesizată la ecografia screening, poate fi
nevoie de o investigare ecografică suplimentară, realizată în cadrul
consultaţiilor specializate de medicină fetală:
 Consultaţia din sarcina cu risc matern sau fetal (printre care vârsta
înaintată a gravidei)
 Consultaţia de cardiologie fetală
 Consultaţia din sarcinile multiple
 Consultaţia din centrele de Reproducere asistată (FIV).
Aceste consultaţii sunt realizate în cadrul unei colaborări
interdisciplinare.
Indicaţiile pentru ecocardiografia fetală includ:
 Copil anterior cu defect cardiac congenital
 Istorie maternă/paternă de boală cardiovasculară
 Diabet natern pregestaţional
 Aritmie fetală
 Boli materne (lupus)
 Medicamente administrate în primul trimestru de sarcină sau expunerea
la factori teratogeni
 Făt cu anomalii extracardiace
 Făt cu anomalii cromozomiale
 Anomalii ale cavităţilor cardiace evidenţiate ecografic

144
Interpretarea rezultatelor
Ecografia fetală de depistare şi diagnostic are ca obiective de
sănătate publică:
 Diminuarea mortalităţii şi morbidităţii perinatale
 Reducerea handicapurilor de origine perinatală
 Reducerea mortalităţii materne
 Depistarea retardului de creştere intrauterină (RCI).
 Depistarea macrosomiei fetale.
 Depistarea malformaţiilor şi anomaliilor cromozomice
O anomalie depistată prin ecografia screening, susţinută de
modificări ale markerilor serici, examinată prin ecografii diagnostice
specializate va fi confirmată, dacă este cazul prin metode invazive de
diagnostic antenatal (amniocenteză: cariotip, metode moleculare), pentru un
diagnostic precoce şi exact.
Ecografia din trimestrele II dar mai ales III de sarcină, în afară de
evidenţierea anomaliilor morfologice ale fătului, poate avea ca scop
stabilirea momentului întreruperii sarcinii sau stabilirea necesităţii ca
naşterea să se realizeze într-un serviciu specializat (dotat cu unitate
performantă de chirurgie neonatală).

Variante ale metodei

Creşterea performanţelor ecografiei a dus la delimitarea mai multor
tipuri de investigare:
 ecografia de primă intenţie, de depistare
 ecografia de a doua intenţie, de diagnostic: ea este indicată când
anamneza a relevat un risc crescut de anomalie morfologică, când
ecografia de depistaj a evidenţiat o imagine anormală. Obiectivul acestei
ecografii este acela de a infirma sau confirma realitatea unei patologii
fetale. Acest examen ecografic contribuie astfel la precizarea gravităţii
patologiei fetale şi ghidează conduita terapeutică.
 ecografiile “focalizate” sunt realizate pentru indicaţii precise, altele decât
cele ale ecografiilor de depistaj şi diagnostic şi nu au aceleaşi obiective.
Acestea sunt limitate dar bine definite. Este vorba de examene vizând
anumite aspecte specifice, de exemplu urmărirea cantităţii de lichid
amniotic la sfârşitul sarcinii, evaluarea stării fetale în cadrul urmăririi
unui retard de creştere intrauterină (Doppler), examinarea colului uterin.
Ecografiile de depistare, de diagnostic şi focalizate nu constituie
“nivele”, dar modalităţile diferite şi complementare de aplicare contribuie la
calitatea urmăririi mamei şi fătului.

145
Avantaje şi dezavantaje
Realizarea unui studiu morfologic aprofundat are ca sop evidenţierea
unor anomalii morfologice detectabile prin ecografie, având în vedere că
ecografia fetală are încă limite, indiferent de performanţele aparatului şi
experienţa specialistului: doar 86 % din malformaţiile cervicale şi de
coloană vertebrală sunt detectabile prin ecografie, doar 42 % din
malformaţiile grave de cord, doar 25 % din fantele labiale, doar 85 % din
malformaţiile grave de rinichi şi vezică urinară, doar 67 % din absenţele
complete ale unui membru iar nivelul de depistare globală a malformaţiilor
fetale prin ecografie este de ordinul a 60 %.
Aplicarea metodelor de diagnostic antenatal are un impact psihologic
asupra gravidei, a cuplului, a familiei acestora. Descoperirea prin ecografie
a unei anomalii minore poate avea un impact benific. Pentru malformaţiile
care nu antrenează risc vital imediat, diagnosticul prenatal ajută la pregătirea
părinţilor pentru primirea şi acceptarea copilului, favorizând abordarea
pediatrilor, chirurgilor şi o mai bună integrare familială şi socială. Un
exemplu este acela al depistării unei fante labiale perfect operabile la
naştere.
Impactul diagnosticului poate fi şi negativ, antrenând o mare
anxietate la părinţi, ce poate duce la practicarea unor gesturi invazive ca
amniocenteza sau chiar la deciderea întreruperii sarcinii.
Solicitarea în exces a amniocentezei nu este binevenită, ceea ce
subliniază importanţa calităţii ecografiei diagnostice şi rolul examenelor
specializate.
Dacă screeningul ecografic de rutină este posibil şi se efectuează
obişnuit cu aparate de ecografie bidimensională, unităţile cu specific de
diagnostic fetal dispun de un parc de aparate de generaţie mai nouă,
ecografie Doppler, ecografie tridimensională (3D) şi chiar 4D.

Tehnici citogenetice

Investigaţia citogenetică din celule amniotice

Cariotipul fetal este realizat din celule amniotice, obţinute prin
amniocenteză, la indicaţiile furnizate de celelalte metode de
screening/diagnostic antenatal.
El are scopul de a detecta aberaţiile cromozomiale numerice sau
structurale, omogene sau în mozaic, ale autozomilor sau ale gonozomilor.
Cromozomii sunt fotografiaţi şi dispuşi după criterii standard.

146
Indicaţii
Stabilirea indicaţiei de cariotip presupune un examen clinic precis,
care permite adesea suspectarea anomaliei, întrucât pierderea sau câştigarea
unui segment cromozomic determină un tablou clinic adesea stereotip, cu o
dismorfie caracteristică.
În general anomaliile autozomilor au consecinţe grave şi difuze
asociind: o dismorfie cranio-facială, tulburări de tonus, un retard mental,
anomalii ale dermatoglifelor şi malformaţii viscerale, frecventa dar
nespecifice. In practica medicală curentă indicaţiile cariotipului sunt relativ
restrânse: cele mai multe boli genetice nu sunt în general explorate prin
cariotip şi o malformaţie viscerală izolată se acompaniază foarte rar de o
anomalie cromozomică.
Principiile metodei
Sunt similare cu cele descrise la Metode de investigare a
cromozomilor umani. În cazul celulelor amniotice culturile celulare au
nevoie de o perioadă mai lungă (Cultivarea celulelor in vitro, împreună cu
un stimulator al diviziunii (fitohemaglutinina – PHA), 10-12 zile la 370C.
Odată cu apariţia, punerea la punct a metodei FISH (hibridizare in
situ) şi dezvoltarea sa rapidă, astăzi ea oferă o multitudine de posibilităţi,
mai ales în diagnosticul antenatal, unde perioada de aşteptare este scurtă.
Cordocenteza
Cordocenteza - constă în puncţia cordonului ombilical sub control
ecografic, la emergenţa acestuia cu placenta, la aprox.18 săptămâni de
sarcină, cel mai adesea cu scopul recoltării de sânge fetal, direct din
circulaţia feto-placentară.
Principalele complicaţii pot fi cauzate de hemoragii sau infecţii
intrauterine, izoimunizări Rh, avorturi spontane, moartea fatului sau
declanşarea prematură a naşterii, anemie fetală etc.
Analiza cromozomilor obţinuţi prin cultivarea sângelul fetal poate fi
utilă pentru a clarifica cazurile de mozaicism detectat în urma
amniocentezei, însă cel mai adesea metoda este aplicată pentru diagnosticul
unor boli hematologice fetale. Astfel, se pot diagnostica hemoglobinopatii
de tip talasemie sau anemia dată de hemoglobina Hb S, hemofilia A sau B,
boala von Willebrand etc.
Prin folosirea sângelui fetal pot fi diagnosticate boli recesiv
autozomale sau deficite imunologice legate de X, cum ar fi:
 imunodeficienţa combinată severă (SCID),
 sindromul Chediak-Higashi,
 granulomatoza cronică etc.

147
 De asemenea, folosirea sângelui fetal permite diagnosticul infecţiilor
fetale virale, bacteriene sau parazitare, prin determinarea titrului de anticorpi
din serul fetal sau direct, în celulele fetale sanguine cultivate in vitro. Prin
cordocenteză se pot realiza şi transfuzii de produse sanguine la făt "in
utero".

Biopsia de ţesut fetal

Metoda este utilizată în cadrul diagnosticului antenatal pentru a
obţine celule fetale din anumite ţesuturi cum sunt: tegumentul, ţesutul
muscular sau ţesutul hepatic şi se realizează sub control ecografic. Scopul
este diagnosticul unor boli grave, care pot conduce la moartea fătului şi pentru
care analiza curentă a ADN-ului izolat din vilozităţi sau celule amniotice nu
este posibilă.
Biopsia de tegument fetal permite diagnosticul antenatal al unor
genodermatoze între săptămâna 17-20 de gestaţie, incluzând displazia
anhidrotică ectodermală, epidermoliza hiperkeratozică, displazia
hipohidrotică, epidermoliza buloasă letală, ichtioza etc. Materialul bioptic
trebuie să aibe aproximativ 1mm mărime şi se practică de obicei multiplu, în
regiunea gâtului, a organelor genitale externe sau în vecinătatea cordonului
ombilical.
Puncţia biopsie de ţesut hepatic fetal este practicată rar; ea se indică
pentru diagnosticul unor erori înnăscute de metabolism care se limitează la
deficienţe enzimatice parenchimatoase fetale, inaccesibile diagnosticului
molecular, cum ar fi deficitele enzimatice ale ciclului ureic, diagnosticul
deficitului de G6PDH, glicogenoza de tip IA, hiperoxaluria tip 1 etc.
Complicaţiile includ hemoragii, avort spontan, infecţii materne etc.
Puncţia biopsie de ţesut muscular fetal poate fi utilă pentru studii
imunohistochimice cu anticorpi antidistrofină, în diagnosticul antenatal
al miodistrofiilor Becker şi Duchenne.

148
Bibliografie

149