UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ

“ION IONESCU DE LA BRAD” IAŞI

FACULTATEA DE ZOOTEHNIE

TĂNASE DUMITRU NACU GHERASIM

BIOTEHNOLOGII
DE REPRODUCŢIE
ANUL III, SEMESTRUL I

MATERIAL DE STUDIU I.D.

IAŞI, 2011
 CUPRINS

CAP.1 BIOTEHNOLOGIA ÎNSĂMÂNŢĂRILOR ARTIFICIALE.........................3

1.1 Importanţa însămânţărilor artificiale ..........................................................................3
1.2 Aspecte organizatorice ale însămânţărilor artificiale în ţara noastră..........................5
1.3 Principiişi metode de recoltare a spermei...................................................................7
1.3.1 Bazele fiziologice ale recoltării spermei ....................................................7
1.3.1.1 Comportamentul sexual al masculilor ........................................7
1.3.1.2 Specificul reflexelor sexuale la principalele specii
de animale .................................................................................10
1.3.1.2.1 Reflexele sexuale la taur.............................................10
1.3.1.2.2 Reflexele sexuale la berbec ........................................12
1.3.1.2.3 Reflexele sexuale la vier.............................................12
1.3.1.2.4 Reflexele sexuale la armăsar ......................................13
1.3.2 Principiişi metode generale de recoltare a spermei ....................................13
1.3.2.1 Recoltarea spermei la taur ..........................................................15
1.3.2.2 Recoltarea spermei la berbecşi ţap .............................................19
1.3.2.3 Recoltarea spermei la vier ..........................................................20
1.3.2.4 Recoltarea spermei la armăsar....................................................22
1.3.2.5. Recoltarea spermei la păsări ......................................................23
1.4 Examenul însuşirilor spermei .....................................................................................24
1.5 Diluarea spermei.........................................................................................................24
1.5.1 Consideraţii generale ..................................................................................24
1.5.2 Principiile diluării, însuşirile generale ale diluanţilor
şi clasificarea acestora ............................................................................25
1.5.3 Tehnica preparării diluanţilor .....................................................................26
1.5.4 Tehnica diluţiei...........................................................................................27
1.5.4.1 Diluarea spermei de taur.............................................................27
1.5.4.2 Diluarea spermei de berbec ........................................................29
1.5.4.3 Diluarea spermei de vier.............................................................31
1.5.4.4 Diluarea spermei de armăsar ......................................................33
1.5.4.5 Diluarea spermei de păsări .........................................................33
1.6.Conservarea spermei ..................................................................................................34
1.6.1 Conservarea spermei de taur ......................................................................38
1.6.2 Conservarea spermei de berbecşi ţap..........................................................44
1.6.3 Conservarea spermei de vier .....................................................................46
1.6.4 Conservarea spermei de armăsar ................................................................48
1.6.5 Conservarea spermei de păsări ...................................................................49
1.7 Inocularea spermei......................................................................................................50
1.7.1 Inocularea spermei la vacă .........................................................................50
1.7.1.1 Punctul de însămânţări artificiale la vaci (P.I.A.V.)...................50
1.7.1.2 Descoperirea femelelor în căldurişi stabilirea
momentului optim al însămânţării.............................................51
1.7.1.3 Pregătirea femelelor pentru însămânţare ....................................52
1.7.1.4 Reanimarea spermatozoizilor .....................................................53
1.7.1.5 Tehnica inoculării spermei .........................................................64
1.8.2 Inocularea spermei la oaieşi capră..............................................................56
1.8.2.1 Organizarea punctului de însămânţări artificiale
la ovine (P.I.A.O.) .....................................................................56
1.8.2.2 Depistarea oilorşi caprelor în călduri .........................................57
1.8.2.3 Inocularea materialului seminal .................................................59
1.7.3 Inocularea spermei la scroafă .....................................................................60
1.8.3.1 Organizareaşi dotarea punctului de însămânţare
artificială (P.I.A.S.) cu activitate complexă ..............................60
1.7.3.2 Descoperirea scroafelor în călduri..............................................61

1
 1.7.3.3 Stabilirea momentului optim de însămânţare .............................61
1.7.3.4 Aparaturaşi instrumentarul folosit pentru
însămânţarea artificială a scroafelor ..........................................62
1.7.3.5 Inocularea spermei......................................................................63
1.7.4 Inocularea spermei la iapă ..........................................................................64
1.7.5 Inocularea spermei la păsări .......................................................................65

CAP. 2 BIOTEHNOLOGIA TRANSFERULUI DE EMBRIONI LA ANIMALE ..67

2.1 Istoriculşi importanţa transferului de embrioni ..........................................................67
2.2 Biotehnologia transferului de embrioni la vacă..........................................................68
2.2.1 Selecţiaşi pregătirea vacilor donatoare .......................................................69
2.2.2 Selecţiaşi pregătirea vacilor primitoare (receptoare) ..................................70
2.2.3 Sincronizarea estruluişi ovulaţiei la vacile donatoare
şi primitoare............................................................................................70
2.3.4 Inducerea poliovulaţieişi însămânţarea artificială
a vacilor donatoare..................................................................................71
2.3.5 Fecundarea ovocitelor.................................................................................74
2.2.6 Recoltarea embrionilor ...............................................................................74
2.2.7 Căutareaşi aprecierea calităţii embrionilor .................................................76
2.2.8 Conservareaşi deconservarea .....................................................................78
2.2.9 Transferul embrionilor ...............................................................................81
2.3 Biotehnologia transferului de embrioni la rumegătoarele mici ..................................82
2.3.1 Alegerea donatoarelorşi receptoarelor ........................................................83
2.3.2 Sincronizarea estruluişi ovulaţiei la femelele donatoare
şi receptoare............................................................................................84
2.3.2.1 Tratamente progestative de sincronizare ....................................85
2.3.2.2 Tratamente de stimulare ovariană...............................................85
2.3.2.3 Inducerea estruluişi ovulaţiei la receptoare ................................86
2.3.3 Însămânţarea femelelor donatoare ..............................................................87
2.3.4 Recoltarea embrionilor ...............................................................................88
2.3.5 Examenulşi aprecierea embrionilor ............................................................89
2.3.6 Congelarea-decongelarea embrionilor........................................................90
2.3.7 Transferul embrionilor la femelele receptoare............................................91
2.3.7.1 Transferul chirurgical .................................................................91
2.3.7.2 Transferul embrionilor sub control endoscopic ....................................................92

CAP. 3 BIOTEHNICI DERIVATE SAU FINALIZATE PRIN TRANSFERUL

DE EMBRIONI..................................................................................................94
3.1 Fecundaţia ,,in vitro“ ..................................................................................................94
3.1.1 Obţinerea ovocitelor ...................................................................................95
3.1.2 Maturarea ,,in vitro“ a ovocitelor ...............................................................95
3.1.3 Capacitarea spermatozoizilor......................................................................96
3.1.4 Fecundaţiaşi cultura ,,in vitro“ a embrionilor .............................................97
3.1.5 Transferul embrionilor obţinuţi ,,in vitro“ ..................................................98
3.1.6 Importanţa, perspectiveleşi aplicaţiile fecundaţiei ,,in vitro“ .....................99
3.2 Bisecţia embrionilor................................................................................................ 100
3.3 Sexarea embrionilor................................................................................................ 102
3.4 Transplantarea nucleilorşi obţinerea de clone ........................................................ 103
3.4.1 Pregătirea ovocitelor receptoare ............................................................. 103
3.4.2 Izolarea nucleilor embrionului donator .................................................. 104
3.4.3 Reconstituirea embrionilor ..................................................................... 104
3.5 Transgeneza ............................................................................................................ 105
BIBLIOGRAFIE………………………………………………………………………107

2
 CAPITOLUL 1

BIOTEHNOLOGIA ÎNSĂMÂNŢĂRILOR ARTIFICIALE

1.1. Importanţa însămânţărilor artificiale

Astăzi, există numeroase ţări care însămânţează artificial întregul efectiv

de vaci realizănd astfel un progres rapid şi substanţial în ameliorarea raselor.
însămânţările artificiale s-au extins în practică datorită avantajelor zoo-
economice şi sanitar-veterinare.
Din punct de vedere zoo-economic, însămânţările artificiale sunt
importante pentru că folosesc intens reproducătorii de valoare, cu potenţă
individuală mare, ceea ce conduce la grăbirea ritmului şi gradului de ameliorare a
efectivelor de animale. La însămânţările artificiale se folosesc masculi testaţi după
descendenţi, astfel încât, pe lângă calitatea superioară a spermei, există şi testarea
reală a valorii de ameliorare.
Prin congelarea materialului seminal, reproducătorul valoros poate fi
folosit la reproducere mai mulţi ani, chiar după moartea acestuia prin constituirea
depozitului cu sperma provenită de la acesta. Datorită congelării materialului
seminal s-a creat posibilitatea schimbului internaţional de material seminal
valoros din puct de vedere genetic, chiar la distanţe intercontinentale, fără
trasportul şi aclimatizarea reproducătorului.
Prin folosirea însămânţărilor artificiale, testarea după descendenţi a
reproducătorilor se poate realiza mult mai repede, iar prin examenul complex,
zootehnic şi sanitar-veterinar, se pot descoperi reproducătorii cu diferite anomalii
congenitale ale aparatului genital sau cu tulburări ereditare ale spermatogenezei.
Se realizează, astfel, o profilaxie genetică a sterilităţii.
Datorită evidenţelor stricte care se ţin pentru toate operaţiile ce se
efectuează, se poate cunoaşte într-o mai mare măsură paternitatea descendenţilor.
Evidenţele sunt completate cu determinarea grupei sanguine a părinţilor şi
descendenţilor.
Reproducătorii masculi fiind grupaţi separat de femele, se pot lua măsuri
specifice de alimentaţie raţională şi îngrijire corespunzătoare şi se poate institui un
regim de recoltare a spermei favorabil obţinerii de produşi la un preţ de cost mai
scăzut şi oferă posibilitatea creării unor nuclee de animale valoroase.
La reproducătorii de elită, concentraţi în unităţi specializate, se practică şi
determinarea genofondului, a structurii imunogenetice, ceea ce dă posibilitatea
cunoaşterii prezenţei sau absenţei echilibrului genetic în cadrul unei populaţii
date.
În condiţiile unor centre mari de însămânţări artificiale unde sunt
concentraţi mulţi reproducători, este posibilă stabilirea valorii de ameliorare în
selecţia concomitentă pentru mai multe caractere productive. Acest lucru se
realizează pentru că se obţine un număr mare de produşi contemporani, masculi şi
femele, care pot fi repartizaţi în mai multe unităţi.
De asemenea, numărul mare de reproducători de diferite vârste,
concentraţi în unităţi specializate, permite alegerea unui moment optim pentru
determinarea performanţelor, respectiv a vârstei la care s-ar putea determina, cu
cea mai mare precizie, valoarea de ameliorare. Lucrările efectuate pe ovine,

3
pentru determinarea valorii de ameliorare în direcţia producţiei de lână, au
demonstrat că selecţia trebuie să se facă pe baza celei de-a doua tunsori.
Sub raport economic, reproducătorii foarte valoroşi din punct de vedere
zootehnic, sunt folosiţi cu mare eficienţă economică. într-un sezon sexual,
numărul femelelor însămânţate artificial cu sperma de la un taur, comparativ cu
monta, este , în medie, de 50-80 de ori mai mare, de 25 de ori mai mare la oi şi de
3-4 ori mai mare la cabaline şi suine. Astfel, în cazul practicării montei, unui taur i
se repartizează anual 50-70 de femele. Dacă se practică însămânţările artificiale,
cu sperma conservată prin refrigerare se pot însămânţa anual 1000-3000 de vaci.
în cazul în care se conservă sperma prin congelare, numărul vacilor însămânţate
cu sperma provenită de la un taur poate ajunge la 10000-30000. în cazul unor tauri
deosebit de valoroşi s-au putut obţine până la 50000 de viţei pe întreaga perioadă
de exploatare a taurului (6-7 ani). Literatura de specialitate citează cazuri în care
de la un taur, într-un an s-au obţinut peste 120000 de doze de însămânţare, iar în
toată perioada de exploatare a acelui taur de peste o jumătate de milion de viţei.
La taurine, pot fi însămânţate dintr-un singur ejaculat până la 1000 de
vaci. La porcine, ovine şi cabaline, dintr-un singur ejaculat se pot însămânţa
numai 5-50 de femele. Acest număr mic de femele însămânţate artificial este
important din punct de vedere economic şi genetic şi a redus răspândirea
însămânţărilor artificiale la aceste specii. Economicitatea procedeului de
congelare a spermei este exemplificată cel mai bine de posibilitatea reducerii
numărului de spermatozoizi în doza de însămânţare fără a scădea rata de concepţie
Dacă aplicarea tehnicilor de însămânţare artificială cu material congelat a
progresat la taurine, nu acelaşi lucru se poate spune şi despre celelalte specii.
Ratele de concepţie şi numărul de produşi la o fătare realizate cu material seminal
congelat sunt mai scăzute la porcine. La ovine şi cabaline, ratele de concepţie sunt
satisfăcătoare. Aceste rezultate demonstrează diferenţe distincte de specie, în
cerinţele pentru supravieţuirea optimă a spermatozoizilor în perioada congelării şi
decongelării. La vier, esenţial este modificarea compoziţiei diluantului după
decongelarea spermatozoizilor pentru a maximaliza rata de fecundare.
Organizarea reţelei de însămânţări artificiale pe baza unor centre
puternice, cu un număr mare de reproducători, creează, prin concentrarea şi
specializarea producţiei, o eficienţă economică sporită în raport cu întreţinerea şi
exploatarea reproducătorilor masculi în fiecare fermă zootehnică.
Din punct de vedere sanitar-veterinar, prin practicarea însămânţărilor
artificiale a efectivelor de femele, se pot preveni şi combate unele boli
transmisibile prin actul montei (iniţial a constituit principala cauză a răspândirii
însămânţărilor artificiale). Totodată, se previn şi combat boli cu etiologie
parazitară (trichomonoza la taurine, durina la cabaline) şi cu etiologie infecţioasă
(bruceloza, campylobacterioza la taurine, ovine, porcine).
Prin practicarea acestei valoroase biotehnologii de reproducere devine
posibilă continuarea reproducerii în unităţile carantinizate. De asemenea, se pot
preveni şi combate unele forme de infecunditate la femele, cum ar fi spasmul
vaginal şi altele.
Metoda actuală de inoculare a spermei permite efectuarea de observaţii
asupra organelor genitale femele, ceea ce influenţează favorabil rezultatul
însămânţărilor.
Concentrarea de reproducători în unităţi specializate permite luarea unor
măsuri riguroase şi ştiinţifice de alimentaţie, adăpostire şi îngrijire a animalelor
precum şi de prevenire a bolilor, care şi ele pot influenţa negativ sau chiar
compromite reproducerea animalelor pe o arie întinsă, egală cu cea deservită de
centrul respectiv de însămânţări artificiale.

4
 Materialul seminal recoltat trebuie să corespundă tuturor criteriilor
zooigienice şi a standardelor internaţionale referitoare la încărcarea cu floră
microbiană, standarde respectate astăzi de toate ţările avansate.
însămânţările artificiale prezintă şi numeroase avantaje ştiinţifice. Astfel,
aplicarea lor a permis dezvoltarea cercetărilor ştiinţifice asupra biochimiei,
histochimiei şi imunologiei reproducţiei în general şi a spermei în special. Gameţii
sunt studiaţi la nivel molecular şi de microscopie electronică. Aceste cercetări au
constituit baza pentru progresul rapid în domeniul metodelor de laborator pentru
testarea capacităţii fecundante a spermei, a congelării materialului seminal şi a
aplicării practice a însămânţărilor artificiale.
Folosindu-se însămânţările artificiale, a devenit posibilă efectuarea unor
hibridări între reproducători din specii care nu se împerechează între ele în
condiţii naturale, ca de exemplu între oaie şi capră, iak şi zebu, iapă şi măgar,
păsări domestice şi sălbatice etc .
Toate aceste avantaje recomandă însămânţările artificiale ca una din cele
mai moderne şi avantajoase metode de reproducere a animalelor domestice. Ea
permite însemnate realizări în zootehnie şi progresul rapid al acestui important
sector al economiei naţionale.

1.2. Aspecte organizatorice ale îsămânţărilor artificiale

în ţara noastră

La nivel naţional, procesul de ameliorare a populaţiilor de animale din

diferite specii, organizarea şi conducerea activităţii pe linia însămânţărilor
artificiale este coordonată de Ministerul Agriculturii şi Alimentaţiei care stabileşte
metodologia şi măsurile de lucru privind aplicarea însămânţărilor artificiale.
Primele Staţiuni de însămânţări artificiale (S.I.A.V.) la vaci au fost înfiinţate în
anul 1953. Cele 42 de S.I.A.V. au fost dotate cu reproducători valoroşi, folosiţi la
însămânţarea artificială a vacilor cu spermă brută.
În perioada anilor 1956-1957 au început să fiinţeze primele Centre de
însămânţări artificiale, dotate cu reproducători (tauri, berbeci) a căror material
seminal -diluat şi conservat prin refrigerare- era difuzat în teritoriu la punctele de
însămânţări atificiale (P.I.A.V.). în unităţile de stat, erau concentraţi reproducători
valoroşi folosiţi la însămânţarea artificială a femelelor de la fiecare unitate
zootehnică, în aşa-numitele ferme de ameliorare şi reproducţie (F.A.R.).
În anul 1965 a luat fiinţă Centrul Naţional de Reproducţie şi Selecţie la
Animale care a contribuit la introducerea metodelor unitare şi practice pe întregul
teritoriu al ţării, excepţie făcând localităţile din zonele greu accesibile. începând
cu anul 1969 s-a introdus şi în ţara noastră conservarea spermei de taur prin
congelare, la început într-un număr restrâns de centre de însămânţări artificiale,
apoi metoda s-a extins o dată cu înfiinţarea, în anul 1976, a Intreprinderii pentru
Testarea Reproducătorilor şi Producerea Materialului Seminal Congelat
(SEMTEST). Până în anul 1990, în conformitate cu prevederile programului de
ameliorare a taurinelor, activităţile menţionate cădeau în sarcina acestei
intreprinderi, care aparţinea de Institutul de Cercetare şi Producţie pentru
Creşterea Bovinelor Baloteşti, având rolul de a coordona activitatea celor 6
complexe teritoriale. Principalele atribuţii care reveneau acestei intreprinderi,
erau:
- organizarea creşterii şi testării reproducătorilor după performanţele
proprii şi descendenţi;
- livrarea produşilor testaţi, disponibili;

5
 - producerea şi livrarea de material seminal congelat pentru însămânţări
artificiale la animale;
- asigurarea şi întreţinerea echipamentului criogenic, aprovizionarea cu
azot lichid a beneficiarilor de material seminal congelat;
- producerea de echipament şi aparatură pentru însămânţările artificiale
şi selecţia animalelor, a diluanţilor pentru material seminal pe specii şi
ai unor biostimulatori ai funcţiei de reproducţie la animale.
După anul 1990, reţeaua „SEMTEST“ a fost reorganizată, cele 6 complexe
teritoriale (Bucureşti, Iaşi, Craiova, Timişoara, Târgu-Mureş şi Baia Mare), fiind
transformate în Societăţi Comerciale cu capital de stat, atribuţiile lor rămânând
aceleaşi. Teritoriul de activitate al celor şase societăţi tip „SEMTEST“ este dictat
de zonarea celor trei rase principale de taurine care se cresc în ţara noastră: Bălţată
românească, Brună de Maramureş, Bălţată cu negru româneasc. în prezent,
denumirea Centrului Republican de Reproducţie şi Selecţie a Animalelor este
Agenţia Naţională pentru Ameliorare şi Reproducţie în Zootehnie „Prof. dr.
G.K.Constantinescu“ subordonată Ministerului Agriculturii şi Alimentaţiei.
Majoritatea vacilor se însămânţează cu spermă congelată în paiete mijlocii
şi mici, metodă care, datorită avantajelor pe care le prezintă, a înlocuit
conservarea în granule şi fiole.
De la taurii în exploatare din unităţile comerciale „SEMTEST“ se
recoltează, controlează, prelucrează, conservă şi livrează sperma către Unităţile de
Ameliorare şi Reproducţie în Zootehnie (fostele Oficii Judeţene de Reproducţie şi
Selecţie la Animale) şi altor unităţi. Activităţile legate de însămânţarea artificială
la animale revine Unităţilor de Ameliorare şi Reproducţie în Zootehnie(U.A.R.Z.)
(fostele O.J.R.S.A.) subordonate direct Direcţiilor Agricole.
Unităţile de Ameliorare şi Reproducţie în Zootehnie au, pe lângă
activitatea de difuzare a materialului seminal congelat sau refrigerat şi obligaţia de
dirijare a întregului proces de reproducţie pe raza lor de difuzare. Fiecare
U.A.R.Z. are în subordonare 1-4 Centre Teritoriale de Ameliorare si Reproducţie
în zootehnie care deservesc crescătorii în ceea ce priveşte asistenţa tehnică de
specialitate în domeniul reproducţiei şi selecţiei animalelor. Pentru aceasta, fiecare
U.A.R.Z. colaborează cu unităţile „SEMTEST“ din zona respectivă şi cu
Asociaţia crescătorilor de animale (taurine, ovine, suine) din judeţ.
Îndeplinirea propriu-zisă a acestor atribuţii se face de către Centrele de
selecţie şi reproducţie la animale, iar subunitatea verigă de bază a reţelei naţionale
de selecţie şi reproducţie este Punctul de însămânţări artificiale (P.I.A.V.), ca
formaţiune tehnico-organizatorică la nivelul fiecărei unităţi zootehnice (de stat sau
particulare), a fiecărei comune, având sarcina să efectueze operaţiunile de
însămânţare artificială a femelelor aparţinând diverselor specii (taurine, ovine,
suine), a supravegherii respectării instrucţiunilor referitoare la activitatea de
ameliorare a animalelor etc. Punctul de însămânţare artificială este subunitatea de
bază a întregii reţele de reproducţie şi selecţie a animalelor, prin a cărei activitate
se materializează şi finalizează întregul proces de reproducţie şi ameliorare a
efectivelor din toate sectoarele zotehnice. Fiecare punct de însămânţare artificială
este dotat cu un minim de aparatură şi instrumentar necesare desfăşurării în
condiţii normale a activităţii specifice, iar persoanele încadrate la aceste puncte
trebuie să participe nemijlocit la coordonarea procesului de reproducţie a
efectivelor din ferma sau localitatea respectivă, să ţină corect evidenţa
evenimentelor de reproducţie şi să cunoască perfect efectivul matcă, produşii şi
destinaţia acestora, contribuind la aplicarea măsurilor de prevenire şi combatere a
stărilor de infecunditate. Pentru îndeplinirea acestor atribuţii, punctul de
însămânţări artificiale trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:

6
 - să fie amplasat în incinta fermelor atunci când asigură în exclusivitate
însămânţarea artificială a femelelor din unitatea respectivă sau la
periferia localităţilor, către locul de păşunat al animalelor din
gospodăriile individuale;
- să permită accesul uşor al mijloacelor de transport;
- să dispună de apă curentă şi să fie conectat la reţeaua electrică;
- să dispună în interior de spaţiul necesar păstrării şi conservării
materialului seminal, a operaţiilor pregătitoare însămânţării artificiale a
femelelor, a documentelor necesare evidenţelor minime, a efectuării
însămânţării artificiale propriu-zise. De regulă, în unităţile zootehnice,
spaţiul necesar punctului de însămânţare artificială se amenajează la
capătul unui grajd.
În condiţiile de stabulaţie a animalelor în sistem de întreţinere legat,
însămânţarea femelelor se face, de regulă, pe linia grajdului, cu respectarea
regulilor de igienă corespunzătoare. în acest caz, punctul de însămânţare artificială
este dotat cu un cărucior special în care este amplasat containerul cu dozele de
însămânţare, vasul cu apă caldă necesară pentru decongelarea paietelor cu
material seminal, mănuşile de protecţie necesare şi pipetele de însămânţare,
menţinute în condiţii aseptice. în situaţia întreţinerii femelelor la păşune sau în
sistem dezlegat, este necesar un stand de contenţie.

1.3. Principii şi metode de recoltare a spermei

Recoltarea este operaţia prin care se obţine sperma de la reproducători prin

intermediul unei aparaturi speciale sau prin alte procedee. Este o operaţie
importantă şi dificilă, succesul ei fiind determinat de cunoaşterea fiziologiei
comportamentului sexual al masculilor în vederea adoptării celor mai adecvate
metode de obţinere a ejaculatului.

1.3.1. Bazele fiziologice ale recoltării spermei

1.3.1.1. Comportamentul sexual al masculilor

Comportamentul sexual al mamiferelor se bazează pe un schimb reciproc

de semnale specifice care, în final se materializează în actul sexual propriu-zis. La
animalele crescute în libertate, întreţinute în padocuri sau boxe comune pentru
ambele sexe, comportamentul sexual se desfăşoară secvenţional:
- căutarea reciprocă a celor doi parteneri;
- sincronizarea comportamentală;
- actul sexual propriu-zis.
La toate speciile, activitatea sexuală începe printr-o căutare reciprocă de
contact între mascul şi femelă. Schimburile de informaţii senzoriale fac posibilă
identificarea receptivităţii sexuale a celor doi parteneri, apoi provoacă
răspunsurile comportamentale care induc reacţiile de atitudine necesare
împerecherii. Semnalele caracteristice emise de femelă indică stadiul receptivităţii
sexuale, femela neacceptând saltul masculului decât în momentul impregnanţei
estrogenice maxime. La toate mamiferele, femela se va imobiliza înaintea
împerecherii, luând o poziţie care să permită masculului intromiterea penisului.
Cunoaşterea particularităţilor fiziologice ale comportamentului sexual este
necesară în momentul obişnuirii reproducătorilor folosiţi la însămânţările

7
artificiale, cu recoltarea materialului seminal. Obişnuirea presupune răbdare şi
tact, astfel încât, să se suprapună peste reflexele necondiţionate, cele condiţionate
pozitive, permiţând o bună recoltare a spermei, fără a stresa masculul respectiv.
După obişnuirea masculului cu recoltarea spermei, datorită reflexelor condiţionate
pozitive, ejaculatul poate fi recoltat uşor, pe o femelă în oricare stadiu al ciclului
sexual, pe un mascul sau pe un manechin adaptat ca formă, mărime şi aspect
speciei respective.
În desfăşurarea reflexelor sexuale necesare recoltării spermei, un rol
deosebit revine corpusculilor senzitivi şi terminaţiilor nervoase existente la nivelul
penisului. Totodată, un rol deosebit revine şi organelor de simţ. Factorii mediului
extern (lumina, temperatura, mirosul specific al femelelor în călduri, efectuarea
montei între alţi parteneri, îmbrăţişarea efectuată de mascul sau femelă etc)
provoacă excitaţii, care ajunse la nivelul hipotalamusului, declanşează
mecanismul neuro-endocrin care stă la baza formării reflexelor sexuale.
Fiziologia actului sexual constă dintr-o succesiune de etape care se
manifestă prin următoarele reflexe sexuale: reflexul de apropiere, reflexul de
erecţie, reflexul de îmbrăţişare, reflexul de intromisiune şi reflexul de ejaculare.
Reflexul de apropiere constă într-o căutare reciprocă de contact între
mascul şi femelă. Schimburile de informaţii senzoriale, care au loc cu acest prilej,
provoacă răspunsuri comportamentale care induc atitudinile caracteristice
desfăşurării actului sexual. Un rol particular în realizarea contactului între mascul
şi femelă îl au semnalele olfactive datorate feromonilor care declanşează reacţii
specifice, de stimulare sau inhibiţie. Fonaţia, audiţia, contactul corporal între
parteneri, jocul, lupta care precede acceptarea masculului, îndeplinesc un rol
deosebit în apropierea partenerilor. Toţi aceşti factori induc excitaţia
precopulatoare. La mamifere, sursa cea mai puternică de excitaţii o constituie
stimularea tactilă astfel încât este posibilă declanşarea excitaţiei precopulatoare
chiar prin simple excitaţii mecanice ale zonei genitale. Excitaţia precopulatoare
se manifestă prin libidou, care este datorat impregnării structurilor necesare de
către hormonii androgeni.
Acest tip de excitare se caracterizează printr-un complex de manifestări
variate ca: accelerarea pulsului, creşterea tensiunii arteriale, modificări ale
circulaţiei periferice cu ridicarea temperaturii tegumentului, aflux sanguin,
creşterea tensiunii nervoase etc.
Reflexul de erecţie. Erecţia constă în schimbarea formei, volumului şi
constituţiei organului copulator. În repaus, penisul este adăpostit în furou, şi la
unele specii este flasc. Din această stare, penisul, prin erecţie, este exteriorizat din
furou şi devine rigid printr-o modificare specială a ţesutului erectil.
Erecţia este consecinţa fenomenelor dilatatoare care se produc la nivelul
corpului spongios şi al corpilor cavernoşi ai penisului, urmată de umplerea
acestora cu sânge. În urma acumulării intense a sângelui, are loc dilatarea
cavernelor, capsula fibroasă se întinde, muşchiul se contractă şi penisul devine
rigid, se alungeşte la maxim şi este propulsat din furou. }esutul erectil al corpului
spongios şi al corpilor cavernoşi reprezintă un sistem spongios de spaţii vasculare,
presărate cu artere şi vene. În stare de repaus, aceste spaţii sunt colabate şi conţin
cantităţi mici de sânge; o dată cu erecţia ele devin cavităţi mari, umplute cu sânge.
Creşterea afluxului de sânge este determinată pe cale neuro-hormonală şi
asigurată de compresiunea căilor venoase de întoarcere prin contracţia muşchilor
bulbo- şi ischiocavernoşi. Afluxul de sânge la nivelul ţesutului cavernos se
produce treptat. La început se umplu cu sânge cavernele care, datorită
vasodilataţiei arteriale, se destind, urmată de erecţia ţesutului spongios din jurul
uretrei. }esutul spongios se încarcă cu sânge venos ca urmare a stării provocate de

8
stimularea nervilor splahnici pelvieni, iar stimularea inervaţiei simpatice
determină constricţia arterelor penisului şi încetarea erecţiei. Erecţia este un reflex
înnăscut provocată pe cale reflexă, centrul fiind situat în măduva sacrală, la
nivelul neuromerelor S1-S2. Arcul reflex include nervii dorsali, ruşinos şi
hipogastric, centrul medular, nervii simpatici şi parasimpatici. Senzaţiile vizuale,
auditive, tactile şi olfactive stimulează sistemul nervos central de la nivelul căruia
porneşte impulsul excitator al centrului erecţiei. Erecţia este determinată şi de
excitarea mecanică a receptorilor penieni, reflex care stă la baza recoltării spermei
prin masturbaţie.
Erecţia este însoţită de eliminarea la nivelul meatului a unei secreţii
mucoase, clare, filante cu rol lubrifiant produsă de glandele Littré şi de glandele
bulbo-uretrale. Această secreţie, împreună cu cele ale glandelor Bartholin,
facilitează intromiterea penisului în conductul vestibulo-vaginal. Erecţia este
însoţită de contracţia tunicii externe a burselor testiculare, în urma căreia
testiculele sunt apropiate de orificiul extern al canalului inghinal.
Durata erecţiei depinde de specia şi vârsta reproducătorului. La masculii
tineri, erecţia se poate menţine un timp mai îndelungat (chiar o jumătate de oră),
însă durata erecţiei scade progresiv cu vârsta. Manifestarea erecţiei este
determinată de nivelul hormonilor androgeni din organism, de tipul de sistem
nervos al masculului, de vârstă, condiţii de exploatare, întreţinere etc. Erecţia
diminuă consecutiv uzurii nervoase, a abuzului sexual, obişnuinţei, oboselii,
alimentaţiei şi întreţinerii necorespunzătoare.
În caz de îmbătrânire, erecţia se produce intermitent, până ce dispare
complet, stare ce se observă la taurii, berbecii şi vierii bătrâni. În diversele boli ca
meningita, turbarea, tetanosul, erecţia este mai pronunţată decât la animalul
sănătos. Toxina tetanică, având o elecţie specială pentru sistemul nervos, scade
centrul de excitabilitate a tuturor centrilor medulari, deci şi a centrului erecţiei.
Substanţele afrodiziace (iohinibina, stricnina etc), cele parasimpatice comimetice
stimulează erecţia peniană, fie prin provocarea vasodilataţiei locale (iohinibina),
fie prin scăderea pragului de excitabilitate a centrului erecţiei (stricnina).
Anafrodiziacele (opiumul, bromurile etc) intoxicaţiile cu diverse săruri de mercur,
potasiu, arseniu etc, inhibă erecţia.
Sunt şi numeroşi centri nervoşi superiori, localizaţi în bulb, hipotalamus şi
centri corticali, ca sediu al reflexelor condiţionate care, în urma excitaţiei,
determină erecţia.
Reflexul de îmbrăţişare. Excitaţiile acumulate în timpul reflexelor de
apropiere şi de erecţie determină necesitatea reflexelor de îmbrăţişare şi
intromisiune. Este un reflex înnăscut, masculii tineri încercând să efectueze saltul
pe orice femelă sau pe alţi masculi. Executarea cu siguranţă a saltului se
transmite ereditar şi este unul din semnele bunei fertilităţi a taurului. Îmbrăţişarea
poate fi normală, când se produce la scurt timp după erecţie, rapidă, când se
produce înaintea erecţiei şi tardivă, când apare mult după erecţie (masculii bătrâni,
bolnavi, subalimentaţi). Cunoaşterea tipului de reactivitate a masculului este
importantă atunci când are loc pregătirea masculului pentru recoltare, de o corectă
pregătire a acestuia depinzând volumul spermei.
Reflexul de împerechere (intromisiune, coit). Este un reflex înnăscut şi
constă în intromiterea organului copulator în conductul vestibulo-vagino-cervical
al femelei în călduri. Intromiterea penisului este facilitată de secreţiile glandelor
Littré, bulbo-uretrale (parţial), glandelor Bartholin şi de smegma prepuţială.
Introducerea penisului are loc la nivelul vaginului la rumegătoare şi carnivore,
până la cervix la cabaline şi până în uter la suine.

9
 Reflexul de ejaculare constă în proiectarea, sacadat şi sub presiune,
spermei în afara căilor genitale mascule.
Ejacularea se produce pe cale reflexă, consecutiv excitaţiilor acumulate în
timpul actului coital şi transmise sistemului nervos. În primul rând sunt excitate
terminaţiile nervoase din penis, reprezentate în special prin corpusculii Vater-
Paccini, Meissner şi genitali. Ejacularea este iniţiată de stimulii genitali şi mediată
de nervii care transmit impulsuri la creier. De la creier, în sens invers, sunt
elaborate impulsuri la nivelul sistemului simpatic lombar (L2-L4-centrul
ejaculator) de unde impulsurile eferente trec prin ganglionii simpatici, de-a lungul
nervului presacral şi a celui pelvin, la toate organele din cavitatea pelvină. Ele dau
fibre motorii pentru muşchii netezi ai tractusului genital (epididim, canale
deferente, canal ejaculator, prostată, glande seminale). Prin contracţia fibrelor
musculare netede de la nivelul acestor organe, conţinutul este împins în uretra
peniană, segmentul prostatic, unde, din amestecul fluidului testicular şi epididimar
cu secreţiile glandelor anexe, se formează sperma. Sperma, o dată formată,
acţionează reflex şi determină închiderea gâtului vezicii urinare şi contracţia
fibrelor musculare netede de la nivelul uretrei pelvine, sporind pesiunea exercitată
de spermă şi împingând-o spre baza penisului. În acest moment intervin şi
muşchii penisului, bulbo- şi ischiocavernoşi şi contracţia ritmică a uretrei,
învingând rezistenţa periferică şi expulzând sperma în jeturi ritmice.
La producerea ejaculării este necesară contracţia sincronă a muşchilor
epididimului, canalelor deferente, canalului ejaculator, uretrei şi penisului. Aceste
contracţii determină ejacularea sacadată la armăsar, vier şi câine şi spontană la
rumegătoare.
Prin excitaţiile electrice produse la nivelul centrului ejaculator din măduva
lombară, se provoacă eliminarea spermei. Acest principiu stă la baza
electroejaculării.
Modul de eliminare a spermei diferă cu specia:
- la taur, berbec şi ţap toţi componenţii spermei se elimină simultan;
- la armăsar, la început se elimină secreţia glandelor Littré şi a celor
bulbo-uretrale, lipsită de spermatozoizi, apoi sunt expulzaţi
spermatozoizii împreună cu secreţia prostatică, la urmă fiind eliminată
secreţia glandelor seminale;
- la vier, ejacularea este multifazică; prefaza, cu o durată de 1-2 minute,
în decursul căreia se elimină secreţiile glandelor uretrale lipsite de
spermatozoizi (2-5% din conţinutul ejaculatului); faza principală, cu o
durată de 2-3 minute, reprezentată de secreţiile epididimului,
veziculelor seminale, prostatei şi glandelor bulbo-uretrale (30-50% din
conţinutul ejaculatului); faza postspermatică, cu o durată de 4-5
minute, şi un conţinut de 50-60% din ejaculat, săracă în spermatozoizi,
compusă în cea mai mare parte din secreţiile veziculelor seminale şi
ale glandelor bulbo-uretrale.

1.3.1.2. Specificul reflexelor sexuale la principalele

specii de animale

1.3.1.2.1. Reflexele sexuale la taur

Reflexul de apropiere este puţin exteriorizat şi se bazează, în principal, pe

excitaţiile vizuale, taurul apropiindu-se de femele, indiferent de stadiul ciclului
sexual în care se află acestea. În cazul recoltării spermei cu ajutorul vaginului

10
artificial, taurul se apropie de partenerul de recoltare, contenţionat în stand
(femelă, mascul) (foto 1).
Reflexul de erecţie este
necondiţionat, peste care se
suprapun reflexe condiţionate,
prin interme-diul cărora acest
reflex poate fi dirijat în sens
pozitiv. Erecţia se produce
chiar din momentul intrării în
sala de recoltare sau numai la
vederea vaginului artificial şi a
operatorului recoltator cu care
s-a obişnuit. Din această cauză,
vaginul artificial trebuie să fie
corect pregătit, în caz contrar
Foto 1 Reflexul de apropiere la taur se formează reflexe
condiţionate inhibitoare ale
acestui reflex.
Reflexul de îmbră-
ţişare (salt, cuprindere) (foto 2)
este bine evidenţiat la taurii
crescuţi în libertate, împreună
cu femelele. În cazul practi-
cării montei, se formează un
reflex condiţionat numai pentru
vacile în călduri. În cazul
recoltării spermei cu ajutorul
vaginului artificial se crează un
reflex condiţionat pentru
masculul partener, recoltarea
Foto 2 Reflexul de îmbrăţişare şi ejaculare la „taur pe taur“ fiind practicată
taur în cvasitotalitatea unităţilor
care se ocupă cu producerea de
material seminal conservat.
La taurii folosiţi la însămânţări artificiale se practică aşa-numitul salt „în gol“ cu
scopul îmbunătăţirii volumului ejaculatului. În cazul unor afecţiuni la nivelul
coloanei vertebrale, membrelor posterioare etc, acest reflex poate fi inhibat .
Reflexul de intromisiune (împerechere, coit) constă în introducerea
penisului în conductul vestibulo-vaginal al femelei în cazul montei, sau în
lumenul vaginului artificial corect pregătit, în cazul practicării însămânţărilor
artificiale. {i acest reflex poate fi inhibat în cazul pregătirii necorespunzătoare a
vaginului artificial: tempera-tură, presiune şi lubrifiere necorespunzătoare, falduri
în spirală etc.
Reflexul de ejaculare se produce având la bază senzaţiile termice, de
presiune şi tactile recepţionate de corpusculii dispuşi la nivelul penisului şi
transformate în stimuli pe calea filetelor nervoase aferente pentru centrul
ejaculator lombar de la nivelul căruia, pe calea filetelor nervoase eferente, sunt
transmise la nivelul musculaturii netede a diverselor segmente ale aparatului
genital şi, prin contracţia acesteia, se produce expulzarea spermei. Reflexul de
ejaculare la taur este foarte rapid, suprapunându-se intromisiunii. În cazul
recoltării spermei cu vaginul artificial, dacă acesta este corect pregătit, ejacularea
este rapidă, fără a influenţa negativ şi în timp desfăşurarea reflexelor sexuale la

11
taurii de reproducţie. Tipul de sistem nervos influenţează manifestarea şi
desfăşurarea reflexelor sexuale.

1.3.1.2.2. Reflexele sexuale la berbec

Pentru animalele în libertate, comportamentul sexual, care se termină în

mod normal printr-o împerechere, se caracterizează printr-o secvenţă specifică a
reflexelor sexuale.
Reflexul de apropiere constă în interesul berbecului pentru oaia în călduri
şi căutarea acesteia. Masculul dirijează parada sexuală (apropieri ritualizate
laterale, însoţite de mişcări ale unui membru anterior). Adulmecă oaia în călduri,
urmând ridicarea capului şi manifestarea unui rictus al buzei superioare.
Abordarea oii în călduri se face prin lovirea acesteia cu capul în regiunea
abdomenului şi apoi cu membrul anterior. Imobilizarea oii constituie semnul
vizual de identificare a stării de estru cu ajutorul unui berbec încercător.
Recunoaşterea olfactivă a acestei stări joacă rolul de „declanşator“ pentru
comportamentul sexual al berbecului. Un berbec tânăr este mai puţin apt să
identifice starea de estru a oilor. Atunci când contactul este stabilit, imobilizarea
femelei constituie semnalul desfăşurării următoarelor reflexe sexuale.
Reflexul de erecţie se realizează prin ştergerea S-ului penian. Caracteristic
erecţiei este întinderea şi îndepărtarea apendicelui uretral al glandului, urmată de
executarea unor mişcări ondulatorii ale acestuia.
Reflexul de îmbrăţişare constă în cuprinderea oii sau a partenerului de
recoltare cu membrele anterioare. Ca şi la taur şi la berbec se formează reflexul
condiţionat şi pentru oile care nu sunt în călduri sau pentru masculi, recoltarea
făcându-se şi „mascul pe mascul“.
Reflexul de intromisiune constă în introducerea penisului în conductul
vestibulo-vaginal al oii în călduri, în cazul montei, sau în lumenul vaginului
artificial, când se practică însămânţarea artificială. În situaţia în care vaginul
artificial este corect pregătit, se produce imediat ejacularea.
Reflexul de ejaculare este foarte rapid şi se evidenţiază printr-o zvâcnire
evidentă a întregului corp şi mai ales a trenului posterior. În cazul recoltării
spermei, aceasta este proiectată în cea mai mare cantitate, direct în paharul
colector, adaptat la vaginul artificial. Când vaginul artificial nu este pregătit
corespunzător, actul sexual se întrerupe la reflexul de intromisiune.

1.3.1.2.3. Reflexele sexuale la vier

Reflexul de apropiere se manifestă prin căutarea reciprocă dintre vier şi

scroafă. Vierul caută scroafa folosind simţul mirosului, văzului şi auzului. Vierul,
introdus într-un lot de scroafe, cu ajutorul mirosului examinează pe rând aproape
toate scroafele, adoptând poziţia „cap la cap“, prin aplicarea unor lovituri uşoare
în regiunea flancurilor şi încercări de salt. Prin acest comportament, vierul
depistează starea de estru a scroafelor, însă nu se opreşte la cele în estru. În
apropierea celor doi parteneri, rolul principal revine scroafelor în călduri. În
prezenţa scroafei în călduri, vierul se plimbă în jurul ei, grohăie caracteristic, o
loveşte în regiunea flancului, adulmecă regiunea vulvară, această agitaţie
permanentă fiind determinată de reflexele olfacto-sexuale. Acest „preludiu“
sexual durează, în medie, 5-10 minute şi este mai evident şi de durată în timp mai
mare la vierii tineri. Se mai remarcă mişcări caracteristice ale maxilarului inferior,

12
urmate de o secreţie abundentă de salivă şi eliminarea ritmică a unor cantităţi mici
de urină (Feredean T., 1969).
Reflexul de erecţie constă în exteriorizarea treptată a penisului prin
ştergerea S-ului de la acest nivel, în urma iniţierii „jocurilor“ descrise.
Reflexul de îmbrăţişare constă în fixarea crupei scroafei sau părţii
posterioare a manechinului cu membrele anterioare, penisul intră în erecţie
deplină, vierul modificându-şi permanent poziţia, căutând insistent fanta vulvară.
Penisul este introdus în conductul vestibulo-vaginal, porţiunea spiralată ajungând
la nivelul conductului cervical, unde stă fixat pe toată durata ejaculării.
Reflexul de ejaculare se caracterizează prin contracţii ritmice ale
musculaturii din regiunea anală, apropierea testiculelor de orificiul extern al
canalului inghinal, concomitent cu retractarea burselor testiculare. Durata
ejaculării este de 4-8 minute şi se realizează fazial: prespermatică, spermatică şi
postspermatică.

1.3.1.2.4. Reflexele sexuale la armăsar

Reflexul de apropiere este evident la armăsar, care, în prezenţa iepei

devine neliniştit.
Reflexul de erecţie se manifestă treptat, începând cu preerecţia la distanţă
de iapă, penisul fiind evidenţiat circa jumătate, întărindu-se şi îngroşându-se
progresiv.
Reflexul de îmbrăţişare se manifestă energic.
Reflexul de intromisiune, de regulă se desfăşoară ajutat de o persoană
aşezată lateral. Armăsarul execută 5-10 mişcări de pistonare în urma cărora
penisul ajunge la momentul maxim al erecţiei. Glandul este puternic tumefiat, cu
diametrul de 10-12 cm, în formă de ciupercă.
Reflexul de ejaculare se desfăşoară la câteva secunde de la intromisiune,
eliminarea spermei făcându-se fazial.

1.3.2. Principii şi metode de recoltare a spermei

Recoltarea este operaţia prin care se obţine sperma de la reproducător cu

ajutorul unei aparaturi speciale sau prin alte procedee.
Recoltarea spermei se bazează pe următoarele principii:
- realizarea, prin mijloace artificiale, a condiţiilor existente în secţiunea
copulatoare a femelei în călduri: temperatură, presiune, lubrifiere,
respectiv recoltarea spermei cu vaginul artificial;
- excitarea artificială a centrului ejaculator din măduva lombară prin
intermediul curentului electric de o anumită tensiune şi intensitate,
respectiv recoltarea spermei prin electroejaculare;
- realizarea artificială a unor excitaţii mecanice prin masaj local, efectuat
manual la diverse niveluri şi anume: masajul penisului prin traversul
tecii furoului, respectiv recoltarea spermei prin masturbaţie;
- recoltarea spermei prin masajul ampulelor canalelor deferente şi ale
glandelor seminale;
- masajul regiunii abdominale la masculii păsărilor, respectiv recoltarea
spermei prin masaj abdominal.

13
 În prezent, metoda cea mai răspândită pentru recoltarea spermei este
metoda cu vaginul artificial, metodă prin care cantitatea şi calităţile ejaculatului
nu sunt modificate.
Vaginul artificial este alcătuit dintr-un tub cilindric, rigid sau semirigid,
confecţionat din cauciuc pânzat, ebonită sau tablă (în raport cu specia) a cărui
formă şi dimensiuni variază de asemenea cu specia; o cămaşă vaginală
confecţionată din cauciuc subţire; un pahar colector confecţionat din sticlă sau
cauciuc, de mărime şi formă diferenţiate cu specia, cu pereţi simpli sau dubli după
cum spermatozoizii speciei sunt mai mult sau mai puţin rezistenţi la variaţiile de
temperatură. Cămaşa vaginală se fixează prin intermediul unor inele de cauciuc la
tubul vaginal, formându-se în acest fel un spaţiu virtual în care se introduce apă
caldă şi aer, în raport cu specia. În momentul recoltării, temperatura interioară
trebuie să fie de 40-420C. Completarea spaţiului virtual se poate face şi cu apă
rece, însă vaginul artificial astfel pregătit trebuie să fie păstrat la termostat reglat
la temperatura de 40-420C. În momentul recoltării se insuflă aerul necesar
realizării presiunii optime.
Presiunea se realizează atât prin intermediul apei cât şi a aerului introdus
în spaţiul dintre tub şi cămaşa vaginală. Lubrifierea se face cu vaselină neutră
sterilizată. Recoltarea spermei prin folosirea vaginului artificial se face fie pe
femele care nu se găsesc în călduri, fie pe manechine, sau mascul pe mascul.
Recoltarea spermei se efectuează în încăperi special amenajate. Operatorul
recoltator, aşezat pe una din laturile partenerului de recoltare, ţine vaginul
artificial pregătit pentru recoltare, înclinat la 35-450 faţă de crupa femelei
(masculului). În momentul în care masculul execută saltul, operatorul prinde cu o
mână prin traversul furoului penisul acestuia şi îl dirijează către lumenul vaginului
artificial. Dacă vaginul artificial este corect pregătit şi manevrat, masculul
ejaculează, sperma fiind proiectată în paharul colector, care se trece în laborator,
unde se face controlul spermei. Timpul scurs între intromisiunea penisului în
lumenul vaginului şi ejaculare este dependent de specie, de condiţiile în care a fost
pregătit vaginul, de tipul de sistem nervos al masculului, de existenţa sau nu a
unor reflexe condiţionate inhibitoare etc.
Recoltarea spermei prin electroejaculare a fost preconizată de Batelli
(1922) citat de I. Dumitrescu şi colab., 1978, ulterior metoda fiind îmbunătăţită de
cercetători din diverse ţări. Metoda se bazează pe excitaţiile produse cu ajutorul
curentului electric, de o anumită tensiune, intensitate şi durată asupra centrului
ejaculator din măduva lombară. În urma excitaţiilor se produc contracţii ale
musculaturii netede din pereţii căilor de eliminare a spermei. Această metodă se
aplică la berbec, taur, păsări. Sperma obţinută nu diferă, cantitativ şi calitativ, de
cea obţinută cu ajutorul vaginului artificial.
Recoltarea spermei prin masajul ampulelor canalelor deferente şi a
glandelor seminale a fost experimentată în anul 1934 în S.U.A., la bovine de
către Miller şi Evans. Metoda se bazează pe provocarea eliminării spermei
consecutiv excitaţiilor mecanice realizate prin masajul acestor formaţiuni, în urma
contracţiilor musculaturii netede.
Recoltarea spermei prin masajul abdominal a fost imaginată de Burrows
şi Quinn în 1937 şi dă bune rezultate la păsări.
Recoltarea spermei prin masturbaţie a fost aplicată pentru prima dată de
Spallazani la câine. Ejacularea are loc în urma excitaţiilor mecanice produse
asupra corpusculilor senzoriali de la nivelul glandului şi prepuţului. Prin acest
procedeu se poate recolta sperma de la câine, vier, vulpoi.

14
 1.3.2.1. Recoltarea spermei la taur

Recoltarea spermei la taur se poate face prin trei metode:

- cu vaginul artificial;
- prin electroejaculare;
- prin masajul ampulelor canalelor deferente şi al veziculelor seminale.
Recoltarea spermei cu vaginul artificial
Este cea mai rapidă şi comodă posibilitate de recoltare a spermei a cărei
reuşită este condiţionată de realizarea optimă a celor trei factori de bază:
temperatură, presiune şi lubrifiere.
Vaginul artificial este alcătuit dintr-un tub rigid sau semirigid, o cămaşă
vaginală şi un pahar colector. Tubul (carcasa) este cilindric, confecţionat din
cauciuc pânzat sau material plastic, prevăzut cu un orificiu, închis cu un dop.
Tubul are o lungime ce diferă cu modelul şi unitatea constructoare, care variază
între 40 şi 50 cm, cu un diametru de 5,5–6 cm.
Cămaşa vaginală este cilindrică, cu o lungime de 65–75 cm, lăţime de 7
cm, confecţionată din cauciuc subţire. Dimensiunile cămăşii vaginale se corelează
cu cele ale tubului la care se adaptează. Paharul colector este reprezentat de un
recipient din sticlă cu pereţii dubli (între care se găseşte apă) sau dintr-o eprubetă
gradată ce se fixează la vagin printr-un con prelungitor din cauciuc (fig. 1, foto 3).
Lungimea vaginului artificial este condiţionată de necesitatea ca materialul
seminal să fie obţinut direct în paharul colector, cu o trecere scurtă prin cămaşa
vaginală sau conul prelungitor din cauciuc spre a evita, pe cât posibil, pierderile
de spermă şi eventualul efect negativ al acestor materiale asupra viabilităţii
spermatozoizilor
Pregătirea
vaginului artificial pentru recoltare
constă în introducerea cămăşii
vaginale în lumenul carcasei
vaginului şi răsfrângerea capetelor
care depăşesc lungimea corpului
peste acesta, astfel încât cămaşa
vaginală să fie moderat de întinsă,
iar faldurile care le face în interior
să fie dispuse longitudinal. Fixarea Fig. 1 Modele de vagin artificial pentru
capetelor cămăşii vaginale la tub se
recoltarea spermei de taur
face prin intermediul a două inele
din cauciuc. Între tub şi cămaşa
vaginală se formează un spaţiu care
va fi umplut cu apă caldă şi aer
pentru realizarea temperaturii şi a
presiunii. În momentul recoltării,
temperatura din interiorul vaginului
artificial trebuie să fie de 40–43oC.
Pentru realizarea presiunii normale,
cantitatea de apă introdusă se
completează cu aer, care se insuflă
cu o pară din cauciuc pe la nivelul
robinetului ce obturează orificiul.
Se introduce aer până când lumenul
vaginului este obturat de faldurile Foto 3 Aparatură de recoltare a spermei
cămăşii vaginale. la armăsar, taur, berbec

15
 Paharul colector se adaptează fie direct la unul din capetele vaginului
artificial şi fixat cu ajutorul unui căpăstru, fie prin intermediul unui tub
prelungitor, temperatura apei dintre cei doi pereţi trebuind să corespundă
temperaturii vaginului artificial.
În cazul folosirii ca recipient de colectare a eprubetei gradate, aceasta se
adaptează la vaginul artificial prin intermediul unui con prelungitor din cauciuc.
La capătul opus paharului colector, cu ajutorul unei baghete de sticlă se lubrifiază
1/3 din lungimea vaginului artificial cu vaselină neutră hidrosolubilă. Excesul de
vaselină neutră determină scurgerea acesteia în spermă, cu efecte negative asupra
mobilităţii spermatozoizilor, insuficienţa vaselinei neasigurând condiţia de
lubrifiere, de unde şi insuccesul în recoltarea spermei prin această metodă.
Crearea presiunii necesare în interiorul vaginului artificial se poate realiza numai
cu aer care se insuflă înaintea recoltării propiu–zise.
Tehnica recoltării
În unităţile specializate, recoltarea spermei se face într-o sală special
amenajată în acest scop, spaţioasă (80–100 m2), luminoasă, aerisită, prevăzută cu
un stand de contenţie şi cu o anexă în care se face spălarea şi dezinfecţia
componentelor vaginului artificial şi în care se găseşte şi termostatul electric la
temperatura de 41–43oC.
Pardoseala sălii de recoltare este din asfalt, care favorizează menţinerea
curăţeniei şi menajează ongloanele membrelor posterioare foarte solicitate în
timpul saltului. Înapoia standului de recoltare, pardoseala se acoperă cu un covor
din cauciuc, rumeguş sau nisip pentru a menaja şi mai bine membrele poste-
rioare. Înainte de introducerea taurului în sala de recoltare într-un stand ce se
găseşte într-o antecameră se efectuează toaleta orificiuluişi a regiunii
periprepuţiale care se spală cu apă caldă şi săpun, se şterge cu un prosop curat,
individual, propriu fiecărui taur
şi se dezinfectează orificiul
prepuţial cu o soluţie de
permanganat de potasiu 1o/oo sau
alt antiseptic uzual (foto 4).
Planificarea taurilor la
recoltare, în unităţile specializate
se face după un grafic lunar.
Pentru aceasta, taurii sunt lotizaţi
pe grupe de recoltare constituite
din 20–30 de tauri (funcţie de
efectivul în exploatare din fiecare
unitate) iar în cadrul grupelor de
recoltare, pe loturi formate din 4– Foto 4 Toaleta regiunii prepuţiale la taur
6 tauri.
Planificarea la recoltare se face pe grupe într-o anumită succesiune (A, B, C, D), într-o zi urmând a
se recolta de la toţi taurii din grupa planificată. Taurii sunt scoşi din grajd pe loturi şi introduşi pe
rând în sala de recoltare, timp în care ceilalţi tauri din lot sunt plimbaţi. Frecvenţa recoltărilor
depinde de vârsta taurilor, de condiţiile de alimentaţie şi întreţinere, de experienţa practică a
unităţilor producătoare de material seminal, funcţie de autori această frecvenţă oscilând de la 1 la 6
ejaculate pe săptămână. Experienţa practică a arătat că cea mai bună eficienţă în obţinerea
unui număr optim de spermatozoizi/săptămână este atunci când se recoltează 4
ejaculate pe săptămână, câte două consecutiv pe ziua de recoltare, cu o pauză de
3–4 zile, sau două ejaculate pe săptămână la interval de 3–4 zile dar cu o atentă
pregătire a taurului înainte de recoltare. Pregătirea taurului constă în gimnastica
funcţională a acestuia înaintea introducerii în sala de recoltare (foto 5), apoi
reţinerea acestuia timp de 2–3 minute înainte de ejaculare, efectuarea a 2–3 salturi
în gol, în raport şi cu vârsta taurului şi tipul de sistem nervos al acestuia.

16
 Foto 5 Gimnastica funcţională a taurilor înaintea recoltării spermei

Pentru obişnuirea taurilor la recoltare se foloseşte ca manechin o vacă în

călduri sau în oricare stadiu al ciclului sexual, un mascul care este, de regulă, unul
din taurii în exploatare, folosiţi prin rotaţie sau un manechin confecţionat din lemn
sau metal, îmbrăcat cu o piele de taurine, prevăzut în partea posterioară cu un
dispozitiv în care se fixează vaginul artificial pregătit corespunzător. În unităţile
specializate recoltarea se face „taur pe taur“, taurul manechin făcând parte din
lotul de recoltare şi se stabileşte prin rotaţie, la sfârşitul recoltării spermei de la
lotul în cauză, urmând a se recolta sperma şi de la taurul folosit ca manechin.
Taurul manechin se contenţionează
într-un stand, iar operatorul recoltator
se plasează pe una din laturile
manechinului, ţinând într-o mână, la o
înclinaţie de 35–45o faţă de orizontală,
vaginul artificial (foto 6). După 2 –3
salturi effectuate în gol, operatorul cu
una din mâini, prin traversul furoului
orientează penisul spre lumenul
vaginului artificial. În cazul în care
vaginul artificial a fost pregătit
corespunzător, ejacularea se produce
la un interval de timp foarte scurt şi
Foto 6 Recoltarea spermei la taur cu se evidenţiază printr-o mişcare bruscă
vaginul artificial de pistonare spre înainte a trenului
posterior (zvâcnire).
Sperma este proiectată direct în paharul colector. Se desprinde cu atenţie
vaginul artificial şi se orientează cu paharul colector în jos în vederea colectării
întregii cantităţi de spermă ejaculată.
Oricare ar fi tipul de vagin artificial (lung sau scurt), pierderile de material
seminal se situează între 10–20%, spermă care aderă de pereţii vaginului artificial.
Indiferent de durata perioadei de reţinere de la săritură sau de numărul săriturilor
în gol, pregătirea sexuală trebuie să preceadă fiecare ejaculare chiar dacă se
recoltează două ejaculate consecutiv. Această pregătire menţine capacitatea
sexuală a taurului pe toată perioada de timp cât se află în exploatare.
După recoltare, paharul colector cu spermă se transmite la laborator pentru
examinare, prelucrare şi conservare.
Recoltarea spermei prin electroejaculare
Se bazează pe excitaţiile produse de curentul electric asupra centrului
ejaculator din măduva lombară. Musculatura netedă de la nivelul căilor de

17
eliminare a spermei se contractă, sperma fiind eliminată la exterior. Se foloseşte
foarte rar, în condiţii de laborator, atunci când eşuează încercările de recoltare cu
vaginul artificial. Se aplică taurilor cu inhibiţii ale reflexului de îmbrăţişare şi
ejaculare, celor fără apetit sexual şi celor care au divesre defecte la nivelul
membrelor posterioare, tauri care au mare valoare de ameliorare.
Electroejaculatorul este constituit dintr-un electrod bipolar conectat la o
sursă de curent, portabilă, circuitele fiind tranzistorizate şi miniaturizate.
Contenţia taurului se face într-un stand sau travaliu.
Pregătirea taurului pentru recoltare constă în înlăturarea materiilor fecale
din rect, prin spălarea acestuia cu câţiva litri de soluţie NaCl 5%, care va uşura
conductibilitatea electrică şi din spălarea regiunii furoului şi tunderea părului de la
nivelul orificiului prepuţial.
Se introduce electrodul în rect, cu precauţie, se aşteaptă 3–5 minute după
care se începe declanşarea impulsurilor electrice.
La început se folosesc 15–20 de excitaţii electrice, fiecare cu o durată de
2–3 secunde şi despărţite de pauze de 50–60 secunde. Intensitatea curentului
creşte treptat cu fiecare excitaţie, pornindu-se de la 100 miliamperi, la 800–1500
miliamperi şi cu tensiunea de 25–30 V, durata excitaţiilor mărindu-se până la 5–6
secunde. La fiecare excitare se obţine ejaculat, format la început de secreţiile
glandelor anexe şi apoi fracţiuni cu un conţinut crescut de spermatozoizi. Durata
totală a recoltării este de 5–10 minute, cantitatea de spermă obţinută fiind egală
sau uşor mai mare decât volumul spermei recoltată cu ajutorul vaginului artificial.
Eliminarea spermei se produce fără ca penisul să intre în erecţie.
Recoltarea spermei prin masajul ampulelor canalelor deferente şi al
glandelor seminale
Metoda prezintă interes numai în cazul taurilor care din diverse motive nu
pot efectua saltul şi la care recoltarea cu vaginul artificial nu se poate aplica.
Taurul se contenţionează într-un stand sau travaliu, se execută toaleta
furoului şi spălarea bursei prepuţiale cu o soluţie izotonică de NaCl, apoi se
videază vezica urinară prin masaj transrectal pentru a se evita amestecul urinei cu
sperma. Când peretele rectal este destins se palpează cu precauţie planşeul
cavităţii pelvine unde, sub forma unui cordon dur–cartilaginos, cu un diametru de
circa 2–3 cm, se identifică uretra intrapelvină. Se palpează gâtul vezicii urinare
apoi, de o parte şi de alta a acesteia, dispuse în unghi ascuţit, formă alungită,
aspect boselat, se palpează glandele seminale. Deasupra vezicii urinare se găsesc
şi dilataţiile canalelor deferente sub forma a două cordoane elastice, ce converg
spre gâtul vezicii urinare în unghi ascuţit, diametrul fiind de 0,8–1,2 cm. Tot la
acest nivel se găseşte prostata. Masajul se face în sens cranio caudal, pe o distanţă
de 20–30 cm, cu atenţie, timp de 3–5 minute, după care începe să se elimine
sperma, picătură cu picătură. Pe timpul masajului taurul este liniştit, testiculele
sunt retrase spre inelul inghinal, glandul este parţial exteriorizat din teaca furoului,
fără ca penisul să intre în erecţie. La început se colectează un lichid alb–apos care
reprezintă secreţia veziculelor seminale, sărac în spermatozoizi, care se
îndepărtează. Urmează eliminarea unei fracţiuni bogată în spermatozoizi, culoare
alb gălbui, consistenţă cremoasă. Unii tauri nu răspund favorabil la colectarea
spermei prin acest procedeu. În cazul în care sperma nu se elimină în decurs de 7–
10 minute, se renunţă la masaj, operaţiunea fiind reluată în ziua următoare.
Metoda prezintă avantajul că nu necesită condiţii speciale de contenţie şi
recoltare şi dezavantajul obţinerii unei sperme inferioare calitativ, în urma
amestecului cu urină şi a venirii în contact cu aerul un timp mai îndelungat.

18
 1.3.2.2. Recoltarea spermei la berbec şi ţap

Două tehnici pot fi utilizate pentru colectarea spermei la masculii

rumegătoarelor mici: cu ajutorul vaginului artificial şi prin electroejaculare.
Recoltarea spermei cu vaginul artificial este cea mai răspândită, uşor
accesibilă centrelor de reproducţie, rezultatele obţinute fiind bune sub aspectul
volumului ejaculatului şi calităţii spermei.
Obişnuirea masculilor la recoltare necesită un anumit interval de timp şi
multă răbdare. Se începe totdeauna în sezonul sexual (sfârşitul verii şi toamna)
folosindu-se pentru obişnuire o oaie în oricare stadiu a ciclului sexual.
Vaginul artificial este dimensionat pentru această specie: 20–21 cm
lungime, 4–5 cm diametru, prevăzut cu un orificiu astupat cu un dop, pe unde se
introduce apa caldă sau apa caldă şi aer pentru a asigura condiţiile de temperatură
şi presiune. Paharul colector este confecţionat din sticlă cu pereţi simpli,
termoizolat cu un manşon din burete, sau din sticlă cu pereţi dubli, pentru a evita
efectul negativ al şocului termic (a frigore) asupra viabilităţii spermatozoizilor.
Temperatura din interiorul lumenului în momentul recoltării trebuie să fie de 40–
43oC. Adaptarea paharului colector se face la unul din capetele deschise ale
vaginului artificial, cu ajutorul acestuia reglându-se presiunea din interiorul
vaginului în funcţie de distanţa pe care se introduce paharul colector. La capătul
opus paharului colector se lubrifiază cu vaselină neutră lumenul pe circa 1/3 din
lungime, evitându-se folosirea în exces a vaselinei sau insuficienţa lubrifierii.
Se consideră bine pregătit vaginul artificial atunci când faldurile formate
de cămaşa vaginală au o dispoziţie longitudinală şi opturează complet lumenul.
Recoltarea se face într-o sală special amenajată în care se găseşte un stand
de contenţie a oii partener. Sala de recoltare trebuie să fie curată, luminoasă, iar
pregătirea berbecului pentru recoltare se face ca şi la taur. Lâna din jurul
orificiului prepuţial se tunde, se spală cu apă şi săpun şi se clăteşte cu soluţie
izotonică de NaCl 0,9% pentru îndepărtarea impurităţilor.
Oaia manechin se contenţionează într-un stand metalic fixat pe un podium
din lemn. Operatorul, cu vaginul artificial pregătit, se aşază în genunchi pe una
din laturile oii, în dreptul crupei, ţinând vaginul artificial înclinat la circa 45o faţă
de orizontală, cu paharul colector în sus.
După efectuarea saltului, operatorul dirijează cu o mână, prin traversul
furoului, penisul spre lumenul vaginului artificial. În cazul în care vaginul
artificial a fost pregătit corespunzător (temperatură, presiune, lubrifiere)
ejacularea coincide cu intromisiunea şi se evidenţiază printr-o mişcare de
propulsie a trenului posterior. După ejaculare, berbecul coboară de pe femelă, iar
vaginul artificial se desprinde cu atenţie şi se orientează cu paharul colectoer în
jos, apoi paharul se scoate şi sperma se transmite la laborator pentru examinare şi
prelucrare. Pentru masculii obişnuiţi cu recoltarea, în sezonul sexual, se prelevă
două ejaculate succesiv la 2–5 minute.
Recoltarea spermei prin electroejaculare
Se bazează pe provocarea ejaculării prin excitarea electrică a ganglionilor
simpatici lombari care determină contracţia musculaturii netede de la nivelul
ampulelor canalelor deferente şi eliminarea spermei, fără ca penisul să intre în
erecţie. Această tehnică necesită un volum mare de muncă prin contenţia
animalului, o sală cu dotare specială, un electroejaculator identic cu cel utilizat la
taur, este dureroasă pentru mascul, iar caracteristicile spermei diferă de a celei
obţinute prin folosirea vaginului artificial, motive pentru care această metodă nu
este răspândită.

19
 Se poate folosi în condiţii de laborator, în cazul unor reproducători de
înaltă valoare zootehnică şi care din diverse motive nu pot efectua saltul.
În prezent se folosesc electroejaculatoare tranzistorizate, portabile care
asigură un curent de 2–5–8 V şi 150 mA prevăzut cu un electrod bipolar.
Pentru recoltare, berbecul se fixează în decubit lateral şi se contenţionează
pe o masă de lucru (sau pe o scară întinsă). Se face o clismă cu o soluţie de NaCl
10% şi toaleta furoului şi apoi se fixează cu o meşă de tifon sterilă trecută pe la
baza porţiunii terminale a glandului. Electrodul bipolar se introduce în rect până
ce acesta ajunge în dreptul regiunii lombare.
Paharul colector, termoizolat şi sterilizat, se menţine în dreptul deschiderii
uretrei. Se stabileşte contactul electric şi se provoacă câteva impulsuri cu o durată
de 2–5 secunde, cu pauze de 5–10 secunde. După 5–7 impulsuri se provoacă
eliminarea spermei care se colectează în pahar. Impulsurile continuă până se
obţine cantitatea normală de spermă.

1.3.2.3. Recoltarea spermei la vier

Se poate realiza prin trei metode: cu vaginul artificial; prin masturbare

(metoda manuală); prin electroejaculare.

Recoltarea spermei cu vaginul artificial

Recoltarea spermei presupune obişnuirea vierului cu partenerul si sala de
recoltare si cu operatorul recoltator.
Pentru recoltarea spermei se foloseşte un partener natural sau artificial.
Partenerul natural poate fi o scroafă în călduri sau alte categorii de porci:
scroafe care nu sunt în călduri, vieri, masculi castraţi. Scroafa în călduri se
foloseşte pentru obişnuirea vierilor. Scroafele care nu sunt în călduri se
contenţionează sub un manechin special construit din bare metalice, iar vierul
partener se contenţionează prin fixarea unei frânghii de maxilarul superior,
obţinându-se astfel starea de imobilitate. Întrucât partenerul natural oboseşte, de
regulă după o recoltare, cel mai folosit este partenerul artificial.
Partenerul artificial, manechinul trebuie să imite conformaţia scroafei,
motiv pentru care se înveleşte cu pile de porc (foto 7).
Vaginul artificial se
compune dintr-un tub (carcasă)
vaginal cu o lungime de circa 20
cm, cămaşa vaginală,
confecţionată din cauciuc subţire,
prelungitorul vaginal confecţionat
din material plastic şi paharul
colector. Paharul colector este
reprezentat dintr-un borcan de
sticlă cu capacitatea de 300–500
ml termoizolat (cu pereţii dubli
sau acoperit de un manşon din
Foto 7 Manechin pentru recoltarea spermei burete fixat într-un recipient
la vier metalic adecvat) (fig.7).

Pentru reţinerea şi îndepărtarea fracţiunii gelatinoase a spermei, la gura

paharului se fixează un filtru confecţionat din tifon steril. Paharul colector se
menţine la termostat reglat la 41–43oC până în momentul recoltării, astfel încât pe

20
toată durata recoltării, temperatura din interiorul paharului colector să nu scadă
sub 35–36oC.
Aparatura, sticlăria şi
ustensilele igienizate şi sterilizate se
menţin la termostat, reglat la 40–
42oC, până la întrebuinţare.
Vierii de la care urmează să
se recolteze se pregătesc, într-o boxă
special amenajată în incinta sălii de
recoltare, prin spălarea cu apă caldă
şi săpun a zonei prepuţiale şi
dezinfectarea cu o soluţie de
permanganat de potasiu 1o/oo… Fig. 2 Schema vaginului artificial pentru
recoltarea spermei la vier

Tehnica recoltării
Pregătirea vaginului pentru recoltare se face ca la rumegătoare, presiunea
şi temperatura necesare realizându-se cu ajutorul apei calde şi a aerului.
Vaginul artificial se fixează într-un suport ce culisează în interiorul
manechinului. După ce vierul a efectuat saltul pe manechin, penisul va fi dirijat
spre lumenul vaginului. Ejacularea la vier durează 5–10 minute, timp în care
presiunea din interiorul vaginului se ridică prin insuflarea aerului sau prin presarea
manuală la nivelul conului prelungitor, în funcţie de tipul de vagin artificial
folosit.
După recoltare, paharul colector se detaşează de vagin şi se trece la
laborator pentru examinare şi prelucrare. Materialul seminal obţinut prin acest
procedeu de recoltare este de bună calitate însă se impune o bună cunoaştere a
exigenţelor fiecărui vier, funcţie de care se pregăteşte corect vaginul artificial.
Recoltarea spermei prin metoda manuală (masturbare)
În prezent este cea mai răspândită, fiind un procedeu de recoltare simplu şi
care nu necesită aparatură complicată, calitatea materialului seminal obţinut fiind
foarte bună.
Vierul este condus în boxa de recoltare, este lăsat să efectueze saltul pe
manechinul artificial, apoi operatorul plasat de regulă pe partea dreaptă a
manechinului, prinde cu mâna stângă penisul exteriorizat din teaca furoului şi-l
trage lateral şi în jos. Această extensie a penisului şi presiunea exercitată cu mâna
la nivelul porţiunii spiralate declanşează reflexul de ejaculare.
Fracţiunea presperma-tică lipsită de spermatozoizi şi cu un conţinut ridicat
în micro-organisme se înlătură. Cu cealaltă mână se menţine paharul colector
termoizolat şi prevăzut cu un filtru de tifon, la nivelul orificiului extremităţii libere
a penisului, pentru recoltarea spermei (foto 8 ).
Primele jeturi de spermă care au un aspect lăptos se colectează în pahar,
recoltarea continuând până la terminarea eliminării spermei. Fracţiunea
gelatinoasă a spermei reţinută pe filtru se înlătură, iar paharul colector se trimite la
laborator pentru evaluare şI prelucrare. Pentru evitarea apariţiei unor reflexe
negative se recomandă ca vierul să fie scos din boxă de acelaşi operator –
recoltator, să urmeze acelaşi traseu până în boxa de recoltare iar boxa să fie
întotdeauna aceeaşi, fără schimbări în interior.

21

Foto 8 Recoltarea spermei la vier prin metoda
manuală (masturbare)
Recoltarea spermei
prin electroejaculare
Oferă posibilitatea
examinării spermei unui vier de
la care nu se obţine ejacularea pe
manechin sau în caz de
impotenţă. Se poate folosi în
lucrările de cercetare pentru
examinarea secreţiilor glandelor
anexe la vierii nematuri sexual.
Se foloseşte un electroejaculator
prevăzut cu un electrod bipolar
şi cu o sursă de curent alternativ
care să asigure o tensiune de 10–
30 V şi o intensitate de 100–
1000 mA. Se contenţionează
vierul, se igienizează prepuţul cu
o soluţie izotonică de NaCl
0,9%, se face o clismă rectală cu
o soluţie de NaCl 10% pentru
eliminarea conţinutului.
Electrodul bipolar se
introduce în rect astfel încât
electrozii să ajungă până în
dreptul regiunii lombare,
vertebrele L2 – L4.

La început se produc şocuri electrice cu o tensiune de 5 V şi o intensitate

de 50–100 mA, apoi tensiunea şi intensitatea cresc progresiv cu fiecare impuls.
După fiecare impuls electric se face pauză de 5–10 secunde. Eliminarea spermei
se produce când tensiunea curentului este de 15–20 V şi intensitatea de 500–1000
mA.

1.3.2.4 Recoltarea spermei la armăsar

Însămânţarea artificială la cabaline nu constituie o practică curentă de

reproducţie, atât la noi în ţară cât şi pe plan mondial.
Recoltarea spermei se face cu ajutorul vaginului artificial. Tubul vaginului
este confecţionat din tablă zincată, material plastic sau aluminiu, având o lungime
de 55 cm, diametrul interior la un capăt, de 12 cm, iar la celălalt de 8,5 cm.
Cămaşa vaginală este confecţionată din cauciuc, cu lungimea de circa 70 cm şi un
diametru de 15–17 cm.
Recipientul pentru spermă, confecţionat din material plastic, este cilindric
şi se fixează la tubul vaginal la extremitatea cu diametrul mai mic, prin
intermediul unui con prelungitor. Paharul colector este termoizolat.
Pregătirea vaginului se face în mod asemănător ca pentru taur. Pentru
recoltare, iapa se contenţionează cu platlonje, se înfăşoară coada iepei cu tifon
pentru a se evita lezionarea penisului. Armăsarul se contenţionează cu două pene
de căpăstru, ţinut lateral de îngrijitori.
În momentul efectuării saltului, operatorul recoltator orientează penisul
armăsarului spre lumenul vaginului artificial, vagin ţinut oblic, la 45o faţă de

22
orizontală şi alăturat de crupa iepei. După executarea unor mişcări de pistonare,
ejacularea se produce după 15–17 secunde şi se evidenţiază prin mişcări ritmice la
baza cozii. La încheierea ejaculării, armăsarul coboară de pe iapă, iar operatorul
desprinde cu atenţie vaginul artificial de pe organul copulator. După recoltare se
spală penisul armăsarului cu apă caldă şi se dezinfectează cu o soluţie de
permanganat de potasiu 1o/oo.

1.3.2.5. Recoltarea spermei la păsări

În perioada anilor 1902–1937 s-au încercat diverse metode de recoltare a

spermei la păsări: interpunerea unei canule din sticlă între cloaca cocoşului şi a
găinii în timpul călcatului, folosirea unui spermocaptator fixat prin intermediul
unor cureluşe la cloaca găinii, folosirea ca spermocaptator a unui prezervativ fixat
la cloaca cocoşului, recoltarea prin electroejaculare, recoltarea prin masaj
abdominal.
Dintre toate aceste variante, cea mai avantajoasă sub aspect practic este
recoltarea spermei prin masaj abdominal şi se poate aplica la toate speciile de
păsări de fermă fiind astăzi cea mai utilizată metodă de recoltare pe plan mondial.
Recoltarea spermei la cocoş
Operatorul se aşază pe un taburet şi menţine cocoşul în decubit sterno –
abdominal imobilizand membrele acestuia prin prinderea intre picioarele
operatorului. Cu mâna stângă se masează uşor regiunea sacrală în direcţie cranio–
caudală iar cu mâna dreaptă regiunea abdominală dinspre apendicele xifoid spre
apofizele pubiene. Cocoşul prolabează cloaca în care se observă cele două papile
mai congestionate (culoare roz-roşietică). Operatorul, cu mâna stângă presează
zona pericloacală, iar cu mâna dreaptă colectează sperma în paharul colector.
Colectarea spermei se mai poate face şi prin aspiraţie într-o fiolă cu capacitatea de
2 ml astupată cu un dop de plută sau cauciuc. Prin dop este trecut un tub din sticlă
îndoit, puţin mai larg la un capăt cu care se va colecta sperma şi un al doilea tub
tot din sticlă, la care se adaptează un prelungitor din cauciuc sau material plastic
pe unde se crează depresiunea prin aspirare. Sperma aspirată va cădea în fiola
respectivă.
Contenţia cocoşului se poate face şi sub braţul drept al unui ajutor, cu
coada înainte şi cu mâna se imobilizează ambele picioare. Operatorul efectueaza
masajul abdominal si recoltarea spermei. În unităţile mari în care cocoşii sunt
întreţinuţi în cuşti, contenţia cocoşului se face direct la uşa cuştii de un ajutor,
operatorul efectuând masajul abdonimal şi apoi colectează sperma. În acest fel,
productivitatea muncii creşte foarte mult.
Recoltarea spermei la curcan
Se face cu bune rezultate de o echipă constituită din două persoane. Pentru
aceasta se foloseşte un scaun dublu cu spătar, în care este practicat un orificiu.
Curcanul se contenţionează în decubit sterno-abdominal, cu capul introdus în
orificiul practicat în spătar. Ajutorul se aşază în partea stângă a curcanului şi cu
spatele imobilizează aripa stângă a acestuia, iar cu piciorul stâng, prin intermediul
unei feşe de tifon imobilizează piciorul stâng al curcanului. Imobilizează aripa
dreaptă a curcanului cu mâna stângă între cotul şi spătarul scaunului imobilizând
totodată şi piciorul drept al curcanului. Cu mâna dreaptă ridică coada şi
evidenţiază orificiul cloacal. Operatorul execută masajul abdominal cu ambele
mâini şi când curcanul este excitat execută pericloacal compresiuni cu degetele
mari de la ambele mâini. Sperma se evidenţiază la nivelul cloacei de unde se
recoltează într-un pahar sterilizat.

23
 1.4. Examenul însuşirilor spermei

Examenul însuşirilor spermei are ca necesitate legată atît de cunoaşterea

fertilităţii reproducătorului cît şI de tehnica diluării şI aprecierii spermei 1n
diferite faze de prelucrare şI conservare.
Compoziţia spermei, variază în funcţie de specie şi chiar reproducător,
calitatea spermei diferă în decursul aceleiaşi zile, funcţia spermatogenetică fiind
dependentă de numeroşi factori exogeni şi endogeni. Metodele care se folosesc
pentru aprecierea calităţii spermei se pot împărţi în următoarele categorii:
examenul însuşirilor fizice; examenul însuşirilor biologice; examenul citologic;
examenul biochimic; examenul bacteriologic şi micotic. Rezultatele obţinute se
consemnează într-un formular oficial denumit spermogramă, hotărîtoare pentru
aprecierea unui reproducător.

1.5. Diluarea spermei

1.5.1. Consideraţii generale

Răspândirea însămânţărilor artificiale s-a datorat posibilităţilor de diluare

şi conservare a spermei. Diluarea spermei reprezintă o etapă premergătoare şi
obligatorie pentru conservarea spermei; în rare situaţii sperma se însămânţează
sub formă brută sau imediat după diluare, fără a fi conservată. Păstrarea spermei
presupune diluarea şi conservarea ei, două etape interdependente ce se aplică
succesiv şi corelat. Diluarea permite:
- creşterea volumului total al masei spermatice;
- posibilitatea fracţionării ejaculatului în mai multe doze şi, deci,
însămânţarea unui număr mult mai mare de femele;
- asigurarea unui mediu favorabil prelungirii viabilităţii şi capacităţii
fecundante a spermatozoizilor, etc.
În cazul în care nu există dotarea tehnică necesară conservării, se poate
folosi sperma diluată, dar numai după scurgerea intervalelor de timp necesare
echilibrării (3-4 ore). Sperma diluată trebuie să fie inoculată femelelor în călduri,
într-un interval de timp cât mai scurt, imediat după echilibrare.
Indiferent de metoda de conservare a spermei, pentru prelungirea
viabilităţii şi a capacităţii fecundante a spermatozoizilor „in vivo“, sunt necesare:
- reducerea formării şi acumulării produşilor rezultaţi din metabolismul
celulelor seminale;
- neutralizarea substanţelor toxice rezultate din metabolism;
- trecerea parţială sau definitivă a spermatozoizilor în anabioză.
Aceste deziderate se realizează prin diluarea spermei, realizarea unui
mediu cu un pH uşor acid (6,2 - 6,4) sau scăderea temperaturii în timpul diluării,
cu menţinerea temperaturii scăzute pe toată durata conservării.

1.5.2. Principiile diluării spermei, însuşirile generale

ale diluanţilor şi clasificarea acestora

Diluţia spermei se bazează pe faptul că din numărul total de spermatozoizi

depuşi prin montă, numai o fracţiune redusă (circa 5%) ajung până la nivelul
treimii anterioare a oviductului, locul unde urmează să se desfăşoare fecundaţia.

24
În acest fel, marea majoritate a spermatozoizilor devin disponibili pentru a fi
inoculaţi altor femele. Experienţele întreprinse au demonstrat faptul că numărul de
spermatozoizi necesari pentru însămânţarea unei vaci este de 10-12 miliioane,
număr care poate fi redus până la 5 milioane, fără a fi diminuat nivelul ratei
fecundaţiei. La ovine, numărul de spermatozoizi mobili pe doză poate fi redus
până la 150- 200 de milioane, la suine, la 2-5 miliarde, iar la cabaline, până la o,5-
1,0 miliarde.
Principiile care stau la baza diluării spermei sunt:
- se diluează numai sperma corespunzătoare calitativ;
- diluantul trebuie să conţină substanţe care să protejeze şi să ajute la
activarea şi menţinerea metabolismului spermatozoizilor;
- materialul seminal diluat trebuie să fie aseptizat prin încorporarea unui
antibiotic cu spectru larg de acţiune.
Pentru îndeplinirea condiţiilor create prin diluarea spermei, mediul de
diluţie trebuie să aibă mai multe însuşiri:
- să conţină substanţe care să favorizeze metabolismul, vitalitatea şi
capacitatea fecundantă a spermatozoizilor (fructoză, glucoză,
galactoză);
- să conţină substanţe care să menţină un timp mai îndelungat pH-ul
spermei în limite fiziologice, numite substanţe tampon, cum ar fi:
citraţii, fosfaţii, tartraţii şi sulfaţii de sodiu şi potasiu (necesare mai ales
pentru diluţia spermei cu concentraţie mare în spermatozoizi);
- să fie izotonic, izotermic şi să aibă acelaşi pH cu sperma;
- să conţină substanţe coloidale care să protejeze spermatozoizii
(gălbenuş de ou, lipoproteine, lecitină etc);
- să aibă încorporate antibiotice cu efect bacteriostatic sau bactericid
într-un spectru cât mai larg;
- să posede însuşiri antioxidante;
- să fie ieftin şi uşor de preparat;
- să se păstreze, nealterat, un timp cât mai îndelungat.
Diluanţii se pot clasifica după compoziţie, scop şi specia la care se
folosesc.
După compoziţie diluanţii se împart în salini, pe bază de lapte şi sintetici.
Diluanţii salini constau în soluţii de concentraţii diverse în săruri de
fosfaţi, citraţi, sulfaţi, tartraţi de sodiu şi potasiu, care au rol de substanţe tampon.
Soluţiile mai conţin zaharuri (glucoză, fructoză, zaharoză etc) şi gălbenuş de ou,
diferenţiat cu specia la care se folosesc.
Diluanţii pe bază de lapte conţin: lapte proaspăt de vacă ecremat sau lapte
praf degresat, cu sau fără adaos de gălbenuş de ou.
Diluanţii pe bază de medii sintetice sunt, în prezent, cei mai răspândiţi,
sunt produşi de firme specializate, având în compoziţia lor diferite combinaţii de
săruri, lapte, cu adaosuri de vitamine, hormoni, extracte tisulare etc, funcţie de
unitatea producătoare, pentru fiecare specie în parte, purtând diferite denumiri
comerciale: Laiciphos, Spermasol, Diploten, Triladyl, Seminan etc.
După scopul lor diluanţii se folosesc pentru sperma conservată prin
refrigerare, congelare sau la temperatura camerei.
După specia de animale la care se folosesc, diluanţii se pot prepara după
aceleaşi formule, pentru o singură specie sau pentru mai multe specii (taur,
berbec, ţap).

25
 1.5.3. Tehnica preparării diluanţilor

Prepararea diluanţilor diferă în funcţie de compoziţia acestora. Diluanţii

salini cu adaos de gălbenuş de ou se pregătesc în doi timpi.
Timpul 1. Se prepară soluţia salină prin adăugarea în apa bidistilată a
cantităţilor de săruri prevăzute prin receptura diluantului respectiv. Apa bidistilată
se obţine în distilatoare de sticlă pentru a nu dăuna viabilităţii spermatozoizilor.
Distilatoarele metalice modifică pH-ul apei distilate prin ionii de metal ce se
formează. Soluţia salină se prepară zilnic,în funcţie de necesar sau pentru mai
multe zile, cand se păstrează în sticle sterilizate la întuneric, la temperatura de
refrigerare. Diluantul salin se prepară la nivelul unor laboratoare zonale sau
naţionale de unde este expediat unităţilor specializate în flacoane închise ermetic
care se păstrează la frigider o perioadă de circa 6 luni.
Timpul 2. Înainte de folosirea diluantului se adaugă gălbenuşul de ou în
cantităţile prevăzute în formulele de preparare a acestora. Se folosesc ouă de găină
proaspete (1-3 zile) provenite de la un efectiv sănătos. Ouăle se spală cu apă
caldă, se dezinfectează coaja cu alcool sanitar, se sparg şi se separă gălbenuşul de
albuş, albuşul netrebuind să ajungă în diluant deoarece are o reacţie acidă şi
modifică pH-ul mediului.
După obţinerea cantităţii necesare de gălbenuş de ou se omogenizează cu o
baghetă din sticlă sau cu un agitator mecanic timp de 5-10 minute, apoi,
gălbenuşul bine omogenizat, se adaugă peste soluţia salină, sub o omogenizare
continuă, fără a se forma spumă. Omogenizarea face globulele de grăsme din
gălbenuş să fie dispersate, evitându-se aglomerarea acestora, ceea ce ar împiedeca
mişcarea spematozoizilor.
Pentru aseptizarea materialului seminal diluat, se adaugă în diluant
antibiotice cu spectru de acţiune cât mai larg, conform reţetelor de preparare.
În ţara noastră, cele mai folosite antibiotice sunt: penicilina, streptomicina
în cantităţi de 500 U.I. şi respectiv 250-500 µg/ml diluant. Se folosesc cele mai
eficiente antibiotice conform antibiogramei. Prepararea diluantului cu gălbenuş de
ou şi antibiotice se face, de regulă, cu 1-2 ore înaintea folosirii, timp necesar ca
sărurile de Na sau K să clarifice sau să facă transparente particulele de globuline
din gălbenuş.
Substanţele care se introduc în diluant trebuie să fie proaspete, nealterate,
chimic pure şi să nu conţină impurităţi toxice pentru spermatozoizi. Sticlăria şi
ustensilele folosite la prepararea diluantului să fie sterilizate.
Diluanţii pe bază de lapte se prepară astfel: laptele de vacă proaspăt,
integral sau ecremat, se fierbe sau se pasteurizează la 90-92oC, se răceşte şi
filtrează printr-o hârtie de filtru, sterilă. Când temperatura laptelui ajunge la 20oC
se adaugă proporţia de gălbenuş de ou, stabilită prin receptură, după tehnica
descrisă.
Laptele praf degresat se prepară cu apă bidistilată în raport de 1/9, apoi se
pasteurizează, se filtrează, se răceşte şi se amestecă cu cantitatea necesară de
gălbenuş de ou (5-10%).
Diluanţii sintetici sunt cei mai întrebuinţaţi în prezent. Ei sunt produşi de
diferite unităţi specializate şi sunt livraţi sub formă de pulberi sau granule. Sunt
însoţiţi de instrucţiunile de folosire. În prezent, aceste medii de diluţie se prepară
pe scară industrială, ceea ce conduce la uniformizarea şi simplificarea tehnicilor
de lucru, obţinerea unor rezultate bune, în condiţiile scăderii preţului de cost.

26
 1.5.4. Tehnica diluţiei

Diluţia propriu-zisă diferă cu specia şi cu modul de conservare a spermei.

1.5.4.1. Diluarea spermei de taur

Pentru conservarea spermei prin refrigerare se folosesc medii pe bază

de soluţii saline cu adaos de gălbenuş de ou, glucoză, sau diluanţii pe bază de
lapte. Cel mai frecvent sunt întrebuinţaţi diluanţii sintetici, livraţi de diverse firme,
cu diferite denumiri, funcţie de ţara şi unitatea producătoare.
Diluantul sintetic este un mediu uscat, pe bază de lapte ecremat, echilibrat
şi sterilizat, la care se adaugă în final 10% gălbenuş de ou şi 7% glicerină cu
densitate 1,25 (de exemplu Laiciphos). Nivelul relativ scăzut de gălbenuş de ou
facilitează examinarea microscopică, fără să influenţeze negativ fecunditatea.
Indiferent de natura diluantului, se adaugă cantităţile necesare de
antibiotice (preferabil în funcţie de antibiogramă), se pasteurizează, se filtrează şi
se răcesc.
Diluarea spermei pentru conservare prin refrigerare se face în două etape:
- diluţia iniţială (prediluţia), la 37oC, în raport de 1/1 şi în condiţii de
izotermie;
- diluţia finală (definitivă), la 18-20oC, tot în condiţii de izotermie,
conform raportului final de diluţie, calculat în funcţie de concentraţia
spermei brute şi a celei diluate în spermatozoizi/mm3 sau pe ml.
Formula de calcul este:

C1
G.D.F. = xMx V în care:
C2

- G.D.F = gradul de diluţie finală;

- C1 = concentraţia spermei brute în spermatozoizi/ml;
- C2 = numărul de spermatozoizi vii pe care dorim să-i avem în
doză;
- M = mobilitatea spermatozoizilor după decongelare, exprimată în
sistemul zecimal;
- V = volumul dozei de spermă exprimat în ml.

Exemplu: C1=109; C2=12x106; M=0,6; V=1,0ml.

G.F.D.=109x0,6x1,0/12x106=50, sau când V=0,5ml rezultă
G.DF.=109x0,6x0,5/12x106=25.

În această situaţie, la un volum de spermă se adaugă 49 volume de diluant

în primul caz, şi respectiv 24 de volume, în cazul al doilea. Precizăm că
mobilitatea spermatozoizilor după deconservare se calculează pentru fiecare taur
în parte pe baza mediei mai multor determinări.
În acest caz, raportul de diluţie final va fi: R.D.F=1/49; R.D.F=1/24.
Pentru calcularea numărului de doze pe care le putem obţine dintr-un ejaculat, se
înmulţeşte volumul ejaculatului cu gradul de diluţie final obţinut şi se împarte la
volumul dozei.

27
 În exemplul dat, dacă volumul ejaculatului este de 5 ml, numărul de doze
va fi; Nr. doze=50x5/1=250; sau N=5x25/0,5=250
Gradul de diluţie pentru sperma de taur, oscilează în medie între 20 şi 40,
astfel încât într-o doză de însămânţare să se asigure 10-12 milioane de
spermatozoizi mobili. Mobilitatea minimă admisă pentru sperma de taur
conservată prin refrigerare este de 60% sau de 0,6, determinată înainte de a fi
însămânţată. După diluare, se apreciază mobilitatea spermatozoizilor şi dacă
aceasta nu a scăzut cu mai mult de 10% faţă de mobilitatea spermei brute, diluţia
se consideră că a fost efectuată în condiţii bune şi se trece la repartizarea în doze a
spermei. Repartizarea spermei în doze se face cu ajutorul unor seringi
semiautomate, în fiole de sticlă care se închid apoi la flacără oxiacetilenică, sau în
fiole care se închid cu dop de plută sau din material plastic.
Pentru conservarea spermei de taur prin congelare se folosesc două
medii de diluţie care se deosebesc numai prin aceea că unul conţine, în plus,
glicerină, substanţă crioprotectoare.
{i în acest caz se pot folosi diluanţi salini, pe bază de lapte sau sintetici (de
exemplu Laiciphos, Tryladil, Seminan etc.) care se prepară după tehnicile
descrise. Cantitatea de diluant necesară se separă în două părţi egale (A şi B).
Diluantul B conţine în plus faţă de diluantul A 14-16% glicerină chimic pură,
astfel încât concentraţia de glicerină, în final, să fie de 7-8%.
Diluantul A se împarte în două părţi inegale: o parte (A1) mai redusă (5-
10%) se păstrează la termostat reglat la 37oC, iar cealaltă parte, (A2) se lasă la
temperatura camerei. Diluantul B se păstrează la frigider sau într-o vitrină
frigorifică la 2-4oC.
Diluţia comportă 3 etape: iniţială, intermediară şi finală.
Diluţia iniţială se face la temperatura de 37oC, în condiţii de izotermie, în
raport de 1/1, cu diluantul A1, direct în paharul sau eprubeta colectoare. După
efectuarea acestei prime diluţii, paharul sau eprubeta cu sperma astfel diluată se
scot de la termostat şi se aşază alături de fracţiunea A2 a diluantului, la
temperatura laboratorului (18-20oC).
Diluţia intermediară se face după circa 20-30 de minute, când cele două
componente ating aceeaşi temperatură, la temperatura laboratorului, adăugându-se
diluantul A2 într-un raport care să asigure jumătate din cantitatea totală de diluant
calculată prin raportul final de diluţie.
După diluţia intermediară, paharul cu sperma se introduce într-o vitrină
frigorifică sau la frigider, alături de fracţiunea B a diluantului.
Diluţia finală se face la temperatura de 2-4oC, tot în condiţii de izotermie,
după 50-60 de minute de la efectuarea diluţiei intermediare. Întrucât glicerina este
o substanţă toxică pentru spermatozoizi, diluantul glicerinat se adaugă treptat,
picătură cu picătură, sub o permanentă agitare a recipien-tului cu spermă (foto 12).
Congelarea spermei sub formă de granule se bazează pe răcirea rapidă a
acesteia, în alveolele unei plăci de zăpadă carbonică rezultând pastile cu un
volum de 0,1 ml.
După recoltarea spermei se examinează însuşirile ejaculatului, în funcţie
de care se determină gradul final de diluţie şi volumul total al spermei diluate. În
acest interval de timp, sperma se diluează în proporţie de 1/1 la temperatura de
37oC, în condiţii de izotermie între diluant şi spermă.
Cel mai frecvent se foloseşte diluant pe bază de lactoză: lactoză 11% în
apă bidistilată - 75,3 ml, gălbenuş de ou - 20 ml, glicerină anhidră - 4,7 ml. După
15 minute de la diluţia iniţială, se adaugă volumul total de diluant glicerinat, cu
ajutorul unui dozator automat, cuplat la un omogenizator. Adăugarea se face la
temperatura laboratorului, raportul de diluţie fiind foarte strâns (1/2, 1/4), datorat

28
volumului redus al granulei şi mobilităţii mai reduse a spermatozoizilor,
comparativ cu alte metode de congelare.
Compoziţia diluanţilor utilizaţi în acţiunea de însămânţări artificiale este
foarte diferită, însă se poate afirma că cea mai mare parte, aparţine diluanţilor
salini, pe bază de lapte sau sintetici.
Fiecare ţară şi unitate specializată în practica însămânţărilor artificiale au
reţete specifice pentru prepararea diluanţilor. Din multitudinea de reţete de
preparare a diluanţilor redăm pe cele mai simple şi mai frecvent folosite:
1) Sulfat de sodiu anhidru (Na2SO4) 13,6 g
Glucoză anhidră 12,0 g
Peptonă 5,0 g
Apă distilată (încălzită) 1000 ml

2) Citrat de sodiu (Na3C6H5O5) 2,9 g

Apă bidistilată 100 ml
Gălbenuş de ou 20%

3) Diluant pe bază de lapte praf

Într-un litru de apă bidistilată se adaugă 100 g lapte degresat apoi se
fierbe 10 minute într-un vas conic. După răcire se completează apa
pierdută prin evaporare, apoi se adaugă antibioticele menţionate la
reţeta 10.
În prezent, pentru diluarea spermei de taur se folosesc diluanţi sintetici,
preparaţi de diverse firme şi care încorporează toate substanţele chimice necesare,
în laborator urmând să se adauge, eventual, gălbenuşul de ou proaspăt preparat şi
apa bidistilată. Funcţie de firma care-i comercializează, diluanţii poartă diverse
denumiri: Laiciphos, Spermasol, Dilapten, Triladyl, Seminan etc.

1.5.4.2. Diluarea spermei de berbec şI ţap

Un mare număr de însămânţări artificiale la ovine, atât pe plan mondial cât

şi în ţara noastră se realizează cu spermă nediluată, imediat după recoltare şi
examinare. Această metodă asigură o fertilitate ridicată, însă necesită prezenţa
masculilor în aceeaşi unitate cu femelele care urmează a fi însămânţate.
Proprietăţile biochimice ale spermei de berbec şi ţap impun anumite precauţii în
folosirea spermei pentru însămânţările artificiale. Astfel, plasma seminală nu
creează un mediu optim pentru supravieţuirea spermatozoizilor „in vivo“.
Cercetările au evidenţiat, spre exemplu, la ţap, atunci când sperma a fost recoltată
din epididim ( care nu a venit în contact cu secreţiile glandelor anexe), a fost
diluată şi congelată, că proporţia de spermatozoizi vii şi mobilitatea lor după
decongelare sunt mult superioare celor din sperma ejaculată, ceea ce indică faptul
că venirea în contact a spermatozoizilor cu secreţiile glandelor anexe reduce
supravieţuirea „in vitro“ a acestora. La berbec, adăugarea plasmei seminale la
spermatozoizii proveniţi din epididim, stimulează mobilitatea acestora timp de 3-7
ore, apoi mobilitatea se reduce brusc, comparativ cu spermatozoizii care nu vin în
contact cu plasma seminală şi care îşi menţin mobilitatea peste 22 de ore. La ţap,
plasma seminală pare nefastă menţinerii calităţii spermatozoizilor, pe durata
stocării îndelungate în azot lichid (G. Baril şi colab., 1993).

29
 La aceste două specii (ovine, caprine), glandele bulbouretrale au
capacitatea de a secreta în cantităţi însemnate o enzimă numită fosfolipaza A, sau
a coagulării gălbenuşului de ou. Această enzimă catalizează hidroliza lecitinelor
din gălbenuşul oului în acizi graşi şi lizolecitină. Lizolecitina, în concentraţie mai
ridicată, este toxică pentru supravieţuirea „in vitro“ a spermatozoizilor. Această
particularitate de specie împiedică folosirea unei cantităţi importante de gălbenuş
de ou sau a unui mediu cu conţinut ridicat în lecitine pentru diluarea spermei.
Totuşi, în cazul aplicării însămânţărilor artificiale la ovine, pe scară mai largă,
diluţia spermei este necesară. Compoziţia diluanţilor şi tehnica diluării spermei de
berbec şi ţap diferă în funcţie de modul în care se face conservarea: sub formă
lichidă (refrigerare) sau solidă (congelare).
Diluţia spermei pentru conservare sub formă lichidă presupune
parcurgerea a două etape principale: prepararea diluantului şi diluţia propriu-zisă.
Diluantul se prepară pe bază de lapte praf, cu o zi înaintea întrebuinţării
(Baril G şi colab.,1993).
Se iau 100 ml de apă bidistilată, sterilizată şi încălzită la 60oC, în care se
dizolvă 0,33 g de sulfamide. Se răceşte amestecul până la 20-25oC, apoi, în acest
amestec se dizolvă 11,1 g lapte praf de vacă, ecremat. Se fierbe într-o baie-marie,
timp de 15 minute, se răceşte la temperatura laboratorului, se adaugă 0,11 g
streptomicină şi 100000 U.I. penicilină. Diluantul astfel preparat se păstrează la 2-
4oC, timp de maxim 2-3 zile. În practica însămânţărilor artificiale din ţara noastră
şi din lume se folosesc multe reţete de preparare a diluanţilor, cel mai frecvent
întrebuinţaţi fiind diluanţii sintetici, produşi de diverse firme specializate.
După recoltarea ejaculatului, acesta se examinează cantitativ şi calitativ,
apreciindu-se cel puţin mobilitatea şi concentraţia spermatozoizilor, pe baza
cărora se determină gradul final de diluţie (raportul final de diluţie - RDF) funcţie
de concentraţia iniţială şi după diluţie a spermei în spermatozoizi/ml.
Diluarea spermei se face în două etape: iniţială şi finală.
Diluţia iniţială se face imediat după recoltare, la temperatura de 32oC, în
raport de 1/1, în condiţii de izotermie, direct în paharul colector menţinut într-un
termostat la 32oC. Paharul colector împreună cu sperma prediluată, se scoate de la
termostat şi se menţine 10-15 minute la temperatura laboratorului, alături de restul
diluantului.
Diluţia finală se face la temperatura ambiantă, în condiţii de izotermie,
adăugându-se restul cantităţii de diluant, calculat prin raportul final de diluţie.
În cazul în care raportul de diluţie este mai larg (1/5-1/7), pentru mărirea
vâscozităţii materialului seminal, se poate adăuga la compoziţia diluantului 2-3%
gelatină sau polivinil pirolidon etc.
Diluarea spermei pentru conservare sub formă solidă (congelare)
Pentru congelare se folosesc numai ejaculate cu mobilitate de cel puţin 0,8.
Aprecierea volumului şi concentraţiei spermei permite calculul gradului diluţiei
finale. Diluantul se prepară cu o zi înainte sau în aceeaşi zi, puţin timp înainte de
folosire. Se folosesc doi diluanţi. Primul poate fi: 100 ml apă bidistilată, 10,3 g
lactoză, 20% gălbenuş de ou. Cel de-al doilea conţine diluantul 1 la care se adaugă
4,0 g de lapte praf ecremat pentru fiecare 100 ml, astfel încât, în final presiunea
osmotică să atingă 450 miliosmoli. Se adaugă la acest diluant glicerol, astfel încât,
în sperma diluată, proporţia de glicerol să fie de 4%.
Tehnica diluţiei include două etape principale:
- diluţia iniţială (prediluţia) care se face cu diluantul 1 la 32oC, în
condiţii de izotermie, direct în paharul colector, menţinut la termostat.
Imediat după prediluţie paharul cu sperma respectivă se menţine la

30
 temperatura laboratorului timp de 10-15 minute apoi se introduce într-
un frigider (2-4oC) unde este menţinut timp de 2,0-2,5 ore;
- diluţia finală se face la temperatura de 2-4oC, în condiţii de izotermie,
adăugându-se cantitatea necesară din diluantul 2 (conform R.D.F)
astfel încât în final, concentraţia spermei în glicerol să fie de 4%.
Exemple de diluanţi folosiţi pentru sperma de berbec:

1) Apă bidistilată 100 ml

Glucoză anhidră 0,8 g
Citrat de sodiu 2,8 g
Streptomicină 50000 mcg
Penicilină 50000 U.I.
Gălbenuş de ou 20%

2) Apă bidistilată 80 ml
Glicocol 0,34 g
Citrat trisodic (cu 2 moli de apă) 2,71 g
Gălbenuş de ou 20%
Când se lucrează cu un raport de diluţie mai larg (1/5-1/7) în vederea
măririi vâscozităţii spermei se mai poate adăuga, de exemplu, 25%
polivinil pirolidon.

1.5.4.3. Diluarea spermei de vier

Pentru sperma de vier, cele mai bune rezultate s-au dovedit a fi date de
mediile de diluţie sintetice. Mediul de diluţie trebuie să conţină neelectroliţi
(zaharuri), substanţe ce conţin şi o sursă exogenă de energie. Pentru menţinerea
pH-ului în limite normale, în mediul de diluţie sunt încorporaţi anioni polivalenţi
(citratul de sodiu), gălbenuş de ou sau lecitină. Pentru a proteja spermatozoizii de
efectul nefavorabil al şocului termic în mediul de diluţie se introduc substanţe
chelatoare (complexon III). Bune rezultate se obţin cu medii pe bază de glucoză-
citrat-bicarbonat-complexon III - cu adaos de antibiotice cu rol bacteriostatic sau
bactericid.
O altă grupă importantă o formează diluanţii pe bază de lapte de vacă,
proaspăt sau preparat din lapte praf, sau din lapte+soluţie glucoză 6%+gălbenuş
de ou 3% şi antibiotice (Feredean şi colab., 1964). Alţi autori recomandă ca
mediul de diluţie pentru sperma de vier, laptele integral cu adaos de soluţie de
glucoză 3,5% şi 2% gălbenuş de ou, iar cercetători din China au obţinut rezultate
satisfăcătoare prin folosirea unui mediu alcătuit din părţi egale de lapte degresat,
soluţie de citrat de sodiu 2,9%, soluţie de glucoză 5%, la care se adaugă 10-20%
gălbenuş de ou şi antibiotice.
De reţinut că laptele poate constitui singur sau în amestec cu alte
substanţe, un bun diluant pentru sperma de vier, fiind un mediu biologic complex,
cu conţinut favorabil de lipide (lecitină, cefalină), proteine (cazeină, lactalbumină,
lactoglobulină) şi aminoacizi esenţiali (metionină, treonină, lizină, triptofan),
glucide (lactoza), substanţe minerale, acid citric, enzime şi vitamine. Acest diluant
este foarte uşor de preparat, laptele trebuind să provină de la vaci sănătoase, să fie
proaspăt şi să se încălzească înainte de folosire, la 85-90oC, timp de 10-15 minute.
Pentru congelarea spermei de vier, mediile de diluţie trebuie să includă
glucoză, citrat de sodiu cu tampon format din soluţie tricină- tris, la care se adaugă

31
gălbenuş de ou, glicerină 3-4% şi antibiotice (Crabo şi colab., 1971; Nouk,
B.A.,1971).
Mediile sintetice produse de unităţi specializate şi care se prezintă sub
formă de pulbere, ambalată în pungi din material plastic, prevăzute şi cu
instrucţiuni de folosire, sunt cele mai folosite în prezent în practica însămânţărilor
artificiale la suine. Mediile sintetice se prepară numai din substanţe chimic pure,
iar apa în care se dizolvă aceste substanţe trebuie să fie bidistilată, fiartă în
prealabil.
Diluanţii pe bază de lapte se prepară numai înainte de recoltarea spermei,
conform celor menţionate anterior.
Tehnica diluării spermei este cât se poate de simplă. Diluţia trebuie să se
facă cât mai repede de la recoltare, la temperatura de 33oC, prin adăugarea treptată
a diluantului peste spermă, în condiţii de izotermie, într-o baie de apă a cărei
temperatură este reglată la acest nivel.
Gradul de diluţie se stabileşte pe baza concentraţiei, mobilităţii
spermatozoizilor şi a numărului de spermatozoizi mobili pe doza de însămânţare
(3-5 miliarde), folosindu-se formula:

9
C x M x10
Vt = − 1, în care:
n

Vt=volumul total al spermei diluate;

C= concentraţia spermei/ml;
M= mobilitatea spermatozoizilor;
n= numărul de spermatozoizi de dorit într-o doză de spermă.

După efectuarea diluţiei iniţiale în raport de 1/1, paharul cu spermă se

menţine 20-30 minute la temperatura laboratorului, apoi se adaugă treptat, în
condiţii de izotermie, restul cantităţii de diluant calculat prin gradul final de
diluţie, apoi sperma se repartizează în doze, constituite din recipiente din material
plastic, având o capacitate de 100 ml, de formă ovală sau cilindrică.
Câteva exemple de formule de diluanţi pentru sperma de vier:

1) Apă bidistilată 1000 ml

Glucoză 30,0 g
Bicarbonat de Na 1,0 g
Gălbenuş de ou 300 ml
Streptomicină 0,5 g
Penicilină 500000 U.I.

2) Apă bidistilată 1000 ml

Glucoză 40,0 g
Bicarbonat de Na 2,0 g
Gălbenuş de ou 250 ml
Streptomicină 0,4 g
Penicilină 240000 U.I.

3) Apă bidistilată 1000 ml

Citrat de Na 30,0 g
Gălbenuş de ou 200 ml
Penicilină 500000 U.I.
Streptomicină 0,5 g

32
 1.5.4.4. Diluarea spermei de armăsar

Sperma de armăsar, după recoltare, oricare ar fi temperatura la care se

păstrează, nu conţine nici un spermatozoid viu după circa o oră. Deci
însămânţarea cu spermă brută trebuie să se facă în primele 5 minute de la
recoltare. Dacă nu este posibil, sperma trebuie să fie diluată în primele două
minute după recoltare, rolul diluantului fiind acela de a neutraliza efectele nefaste
ale plasmei seminale (E. Palmer şi colab., 1984).
Pentru diluarea spermei de armăsar se folosesc mai multe formule de
medii de diluţie: pe bază de tartrat de sodiu şi potasiu, glucoză, peptonă, gălbenuş
de ou şi antibiotice:
Cel mai simplu şi ieftin diluant îl constituie laptele semiecremat, sterilizat,
la care se adaugă penicilină (50000 U.I./l) şi gentamicină(5 mg/l).
Indiferent de mediul de diluţie folosit, la 100 ml se adaugă 500000
U.I.penicilină şi 0,5 g streptomicină.
Sperma se recoltează cu ajutorul vaginului artificial la interval de 48 de
ore, se filtrează, apoi se diluează imediat la 32oC în condiţii de izotermie, astfel
încât după diluţie să se asigure 20 milioane spermatozoizi/ml.

1.5.4.5. Diluarea spermei de păsări

Dozele de spermă pentru însămânţarea artificială a păsărilor trebuie să

conţină 100-120 milioane de spermatozoizi mobili, raportul de diluţie cel mai
frecvent fiind de 1/2-1/3, fără a depăşi 1/5. În cazul practicării însămânţărilor
artificiale în unităţile cu flux tehnologic industrial, nu se recomandă diluarea
spermei, dacă sperma brută se însămânţează într-un interval maxim de 30-45 de
minute după recoltare. În cazul în care acest interval este depăşit, devine utilă şi
necesară diluarea spermei şi conservarea acesteia. Întrucât, spermatozoizii îşi
pierd repede capacitatea fecundantă, diluţia spermei trebuie să se facă pe măsură
ce se recoltează. Indiferent de specie, diluţia spermei nu permite însămânţarea
unui număr prea mare de femele dintr-un ejaculat întrucât, factorul cel mai
important este numărul de spermatozoizi pe doza de însămânţare. De aceea, apare
necesitatea creşterii volumului dozei de spermă diluată în raport invers cu nivelul
de diluţie, pentru a menţine constant numărul de spermatozoizi inseminaţi.
Diluarea spermei la păsări se face cu diluanţi care să prezerve nu numai
mobilitatea spermatozoizilor ci şi fecundanţa acestora. Pentru păsări, un diluant
bun este acela care diminuă de o manieră reversibilă mobilitatea spermatozoizilor,
tamponează tendinţa de acidifiere a mediului consecutiv metabolismului acestora,
chiar la un nivel scăzut de temperatură şi conţine nutrienţi esenţialmente
energetici.
Când sperma diluată nu se congelează, diluanţii pot fi constituiţi din
simple soluţii tampon. Aceste soluţii sunt alcătuite din apă bidistilată la care se
adaugă fosfaţi de sodiu şi potasiu (65 g/l) pentru a asigura o presiune osmotică de
380-400 mosm/l.
Formulele de diluanţi mai cunoscute sunt cele menţionate de Lake şi
colab.(1981) sau Sexton (1977), care au aceleaşi condiţii de osmolaritate şi conţin
unul sau mai multe sisteme tampon (citrat, fosfat, acetat, BES sau TES) şi se
caracterizează prin concentraţii precise în anumiţi electroliţi (Na+, K+, Mg++) şi
chelatanţi (aminoacizi de tip glicină sau glutamat). Aceşti diluanţi mai conţin
glucoză sau fructoză. Gradul de dilutie este cuprins intre 1/2 şi 1/3.
33
 1.6. Conservarea spermei

În prezent, extinderea însămânţărilor artificiale este condiţionată într-o

proporţie însemnată de conservarea spermei. A conserva spermatozoizii animali
înseamnă a conserva celule nu numai în stare vie ci şi funcţională. De aceea
cercetătorii au căutat să pună la punct metode care să fie cât mai adaptate
fiziologic spermatozoidului, în sensul că acesta să-şi reducă metabolismul fără a fi
afectată capacitatea fecundantă.
Tehnicile de conservare a spermei se pot clasifica în trei grupe:
a).- conservarea spermei la temperatura ambiantă (18-20oC);
b).- conservarea spermei la temperatura de refrigerare (2-4oC);
c).- conservarea spermei la temperatura de congelare (-79;-196oC).
a). Conservarea spermei la temperatura ambiantă (18-20oC)
În acest caz, conservarea se bazează pe acţiunea inhibitoare a substanţelor
chimice incluse în diluant şi care pot fi uşor eliminate pentru a reanima
spermatozoizii. În acest scop se foloseşte acidul carbonic, provenit din barbotarea
bioxidului de carbon în masa spermatică cu apa (CO2+H2O=H2CO3).
Spermatozoizii au un metabolism încetinit atât timp cât concentraţia în bioxid de
carbon se menţine la saturaţie. Când bioxidul de carbon este eliminat,
spermatozoizii îşi recapătă mişcarea şi capacitatea lor funcţională.
Rezultatele obţinute prin aceasta tehnica sunt nesatisfăcătoare pentru
conservarea spermei de taur, berbec şi vier. Tehnica nu permite menţinerea puterii
fecundante a spermatozoizilor decât pentru un interval de timp de circa 3-4 zile.
Este necesar ca fiecare doză să fie pusă într-un ambalaj etanş şi separat (fiolă
saturată cu gaz carbonic).
În deceniul şapte s-a propus ca metodă de conservare a spermei la
temperatura camerei, prin folosirea laptelui de nucă de cocos. Experienţele au
arătat că acest mediu permite supravieţuirea şi prelungirea puterii fecundante a
celulelor sexuale mascule de taur timp de circa 3-4 zile la temperatura de 15-20oC,
metoda fiind depăşită tehnologic de conservarea spermei prin refrigerare şi
congelare. Sperma este diluată normal într-un mediu cu lapte de cocos şi
repartizată în tuburi păstrate la temperatura de 15-20oC.
b). Conservarea spermei prin refrigerare (2-4oC)
Această tehnică a fost cea mai folosită până în deceniul opt pentru
conservarea spermei la toate speciile şi se mai foloseşte în prezent pentru
conservarea spermei de vier, armăsar şi păsări cu rezultate mulţumitoare.
Mobilitatea spermatozoizilor şi activitatea lor metabolică descresc
progresiv pe măsură ce temperatura mediului în care se găsesc scade. La un nivel
de temperatură care oscilează între 2oCşi 4oC, într-un mediu de diluţie adecvat,
mobilitatea aproape a încetat. Dacă se încălzeşte mediul, mişcarea
spermatozoizilor reapare, sperma regăsindu-şi activitatea şi puterea de fecundaţie.
În general, pentru conservarea la acest nivel de temperatură, se folosesc diluanţi
salini pe bază de citrat, tartrat de Na şi K sau de lapte ecremat, sau cel mai
eficient, diluanţi sintetici în asociaţie cu gălbenuşul de ou, a cărei principală
funcţie este de a proteja spermatozoizii împotriva şocului „a frigore“.
La ţap şi armăsar se evită includerea în diluant a gălbenuşului de ou care
este nefavorabil pentru supravieţuirea spermatozoizilor.
Pe parcursul conservării, la temperatura de refrigerare, spermatozoidul
îmbătrâneşte progresiv, îmbătrânire care se manifestă printr-o reducere a
capacităţii fecundante. Astfel, dacă se consideră capacitatea fecundantă că este
100 în primele 24 de ore de conservare, se reduce la circa 80 în a doua zi, la 65 în
a treia zi şi la 50 în a patra zi (Parez M.,1969). În acest caz, centrele de

34
reproducţie sunt obligate să reînoiască stocul de spermă la 2-3 zile pentru fiecare
reproducător.
În sperma conservată prin refrigerare, menţinerea şi prelungirea mobilităţii
spermatozoizilor se datoreşte:
- mediului de diluţie, care conţine substanţe nutritive şi protectoare;
- reducerii metabolismului spermatozoizilor, datorită scăderii
temperaturii între 2oC şi 4oC.
Conservarea spermei prin refrigerare prezintă, totuşi, unele avantaje:
- permite difuzarea materialului seminal la punctele de însămânţări
artificiale situate la o oarecare distanţă faţă de unitatea producătoare;
- se pot constitui rezerve de spermă pentru două-trei zile care pot fi
expediate la solicitarea beneficiarilor, în caz de necesitate;
- contribuie la intensivizarea progresului genetic, prin folosirea pe o
scară mai largă a reproducătorilor valoroşi.
Conservarea spermei prin refrigerare prezintă şi următoarele principale
dezavantaje:
- sperma este conservată pe o perioadă limitată de timp (două-trei zile);
- dificultăţi în asigurarea temperaturii scăzute pe timpul transportului şi
pe durata conservării;
- sunt pierderi apreciabile de material seminal, prin înlăturarea dozelor
care nu au fost inoculate în intervalul de timp de două-trei zile;
- cheltuielile mari cu transportul dozelor, care trebuie să se facă în
permanenţă la un interval de două-trei zile, pentru toate punctele de
însămânţări artificiale deservite de centrul respectiv;
- consum crescut de energie pentru menţinerea unei temperaturi scăzute,
constante (2-4oC).
c).Conservarea spermei prin congelare
La temperaturi sub -15oC, modificările biologice pe care le suferă celulele
sexuale mascule în cursul timpului sunt abolite. Conservarea spermatozoizilor se
face cu scopul de a opri metabolismul lor de o manieră reversibilă, ceea ce
permite conservarea acestora pe o durată de timp practic indefinită.
Însămânţarea femelelor cu sperma conservată prin congelare reprezintă un
procedeu cu maximă eficacitate. Această tehnică se bazează pe menţinerea sub
formă solidă a spermei, spermatozoizii fiind aduşi într-o stare de viaţă extrem de
încetinită, nivel la care reacţiile chimice sunt aproape inexistente, motiv pentru
care conservarea mobilităţii şi capacităţii fecundante a spermatozoizilor se poate
face în condiţii optime, timp de zeci sau chiar sute de ani.
Spermatozoizii îşi recapătă mobilitatea şi capacitatea fecundantă în
momentul revenirii la temperatura corporală.
Agenţii criogeni sunt reprezentaţi de zăpada carbonică ce asigură o
temperatură medie scăzută (-79oC), de aerul lichid (-183oC) şi azotul lichid
(-196oC). Cel mai răspândit agent criogen în congelarea spermei este azotul lichid
Pentru congelarea spermei la temperaturi foarte joase s-a mai folosit şi
aerul lichid, un amestec de oxigen şi azot lichid, care asigură o temperatură de -
183oC, care, în contact cu impurităţi organice, prezintă pericol de explozie, motiv
pentru care în prezent nu se mai foloseşte.
Păstrarea azotului lichid la unităţile de producere a materialului seminal, la
unităţile beneficiare cât şi pe timpul transportului se realizează în recipiente
speciale numite containere. După modul de folosire sau destinaţie, containerele
pot fi clasificate astfel:
- containere de punct, cu capacitatea de 5-35 litri;
- containere de stocaj şi transport, cu capacitatea de 35-50 de litri;

35
 - containere de depozit (stocaj), cu capacităţi cuprinse între 100 şi 750
de litri.
Containerele sunt confecţionate din material inoxidabil sau dintr-un aliaj
special pe bază de aluminiu. La marea majoritate a containerelor, construcţia se
realizează după aceleaşi principii tehnice: „vas în vas“ cu pereţi multipli izolatori
în vid (fig 3).
Partea din dop care
pătrunde pe gura sau gâtul
containerului, este
confecţionată din material
plastic rigid, care nu opturează
ieşirea vaporilor de azot,
vapori ce rezultă din fierberea
lentă, dar continuă a azotului
lichid.
Containerele cu care
sunt dotate punctele de
însămânţări artificiale sunt de
capacitate mică, numărul de
doze ce pot fi depozitate
depinzând de forma de
ambalare a materialului
seminal (fiolă, paietă, granulă).
De regulă, aceste, containere
Fig. 3 Schema interioară a containerului de sunt prevăzute cu 6 canistre
punct (după Gh. Liciu şi O. Roşca, 1998) cilindrice confecţionate din
1 – dop container; 2 - şanţ prin care trece tija tablă inoxidabilă, aliaj de
canistrei; 3 – capac; 4 – lojă; 5 – cămaşă aluminiu sau din material
interioară; 6 – cămaşă externă; 7 – izolaţie şi plastic. Pentru uşurinţa
vacuum; canistre; 9 – tijă; 10 – limitator manipulării, canistrele sunt
canistre. prevăzute cu o tijă a cărei
extremitate sub formă de
mâner, se sprijină în locaşuri speciale practicate la gura containerului. Autonomia
containerelor este dată de timpul scurs din momentul efectuării plinului şi până în
momentul când nivelul azotului lichid (cantitatea măsurată în container) nu mai
poate asigura conservarea în condiţii bune a materialului seminal depozitat.
Autonomia containerului este condiţionată de tipul constructiv, frecvenţa
manipulărilor, mod de exploatare şi întreţinere etc şi oscilează între 21 şi 180 de
zile. Pentru determinarea ritmului zilnic de evaporare a azotului lichid, periodic se
efectuează cotarea azotului lichid din container.
Fiecare punct de însămânţări artificiale este dotat cu un container în care
se găsesc dozele de material seminal necesar, repartizat conform planului de
potrivire a perechilor, aprovizionarea cu azot lichid făcându-se de către Unitatile
de Ameliorare si Reproductie in Zootehnie la intervale de timp corespunzătoare
gradului de autonomie a containerelor.
Congelarea spermei prezintă numeroase avantaje:
- testarea reproducătorilor după descendenţi;
- exploatarea intensivă a celor mai valoroşi reproducători;
- depozitarea şi folosirea spermei pentru un interval mare de timp;
- se asigură în permanenţă sperma necesară pentru însămânţarea
femelelor, la momentul optim, existând în acest fel posibilitatea
formării de linii şi familii cu un potenţial productiv ridicat;

36
 - realizarea unor importante economii, prin folosirea raţională,
nelimitată în timp, a spermei congelate, comparativ cu sperma
conservată prin refrigerare;
- se poate transporta la puncte de însămânţare situate la distanţe mari,
fiind nevoie doar de reaprovizionarea periodică cu azot lichid;
- se reduc cheltuielile datorate transportului spermei;
- se reduce preţul de cost pe doza de material seminal;
- permite însămânţarea femelelor la păşune, în taberele de vară şi în
zonele greu accesibile mijloacelor de transport;
- favorizează schimburile internaţionale de spermă.
Primele încercări de conservare a spermei au fost făcute în anul 1949 de
Parkes, Smith şi Polge. Stewart (1951) a însămânţat o vacă cu sperma congelată la
-79oC şi a obţinut un produs (I. Dumitrescu şi colab.,1978). În anul 1952, Polge şi
L.E.A. Rowson au introdus în mediul de diluţie glicerină şi au constatat că această
substanţă are rolul de a proteja, la temperaturi foarte scăzute, spermatozoizii.
Succesul acestei realizări a fost comunicat de Polge şi colab. în 1952, la al II-lea
Congres Internaţional de Reproducţie de la Copenhaga. Schema congelării
spermei propusă de Polge şi colab. în anul 1952, astăzi este mult simplificată,
fiind păstrate totuşi aceleaşi principii:
- congelarea cu un diluant cu glicerol;
- scăderea rapidă a temperaturii până la -196oC;
- menţinerea spermei congelate la această temperatură (-196oC), până în
momentul folosirii;
- decongelarea spermei, în vederea inoculării, se face prin imersiunea
bruscă a dozei într-o baie la 320C, chiar în momentul întrebuinţării.
Până în 1964, metoda congelării spermei nu a suferit decât mici modificări
cu privire la compoziţia diluantului, cronologia diferitelor operaţiuni şi viteza de
răcire. Erau atunci propuse două soluţii: congelarea în fiole de sticlă de 1-2 ml,
congelarea în paiete cu capacitatea de 1,0, 0,5 şi 0,25 ml, ultimul tip de ambalaj
fiind propus de R. Cassou. Extrema simplicitate, rapiditate şi rezultatele foarte
favorabile oferite de această metodă au condus la introducerea congelării spermei
în paiete din material plastic de către numeroase ţări, fiind adoptată congelarea
spermei în azot lichid la temperatura de -196oC, mai uşor de obţinut şi mai eficace
decât temperatura de -79oC, asigurată de zăpada carbonică, folosită până atunci.
În 1964, comunicările lui Nagase şi Niva au repus în discuţie congelarea
spermei bazate pe următoarele principii:
- folosirea diluanţilor pe bază de glucoză şi fructoză, uşor glicerolaţi
(5%);
- congelarea spermei diluată într-un raport strâns (1/3-1/4);
- congelarea rapidă prin simpla depunere de picături de spermă cu
volum redus (0,1-0,2 ml) pe un bloc de gheaţă carbonică (-79oC);
- rediluarea în momentul decongelării într-o simplă soluţie fiziologică de
diluant.

Rolul substanţelor crioprotectoare

Prezenţa glicerinei în mediul de diluţie a spermei, creează condiţiile
congelării spermei, fără modificări majore, care să afecteze viabilitatea şi
capacitatea fecundantă a spermatozoizilor. Prin introducerea glicerinei în diluant,
punctul de congelare a spermei coboară de la 0,53oC la -3oC, iar formarea
cristalelor de gheaţă are loc la -10oC, comparativ cu 1,7oC în sperma brută. Când
începe formarea cristalelor de gheaţă, temperatura tinde către punctul real de
congelare, care se menţine până când congelarea devine completă. În acel moment

37
se stabileşte un echilibru între spermă şi agentul de răcire. O proporţie de circa 7%
glicerină în lichidul de diluţie, determină coborârea punctului de congelare până la
-3oC, iar punctul de formare al cristalelor de gheaţă la -10oC. Când se congelează
sperma într-un mediu lichid, cristalizarea începe în acea parte a lichidului care
este cea mai apropiată de agentul de răcire şi se continuă în masa lichidului
(Dumitrescu I. şi colab., 1978).
Când coborârea se face încet, cristalizarea se desfăşoară lent, cristalele
care se formează sunt mari, ceea ce antrenează o creştere a concentraţiei în săruri
a fracţiunii necristalizate şi provoacă ieşirea unei părţi din apa intracelulară,
diminuând astfel formarea gheţii intracelulare. În cazul în care coborârea
temperaturii se face într-un ritm rapid, cristalele de gheaţă care se formează sunt
mici, rezultând o substanţă destul de omogenă, în care cristalele sunt constituite
numai din apă, fapt ce determină o concentraţie de electroliţi crescută, atât intra-
cât şi extracelular. În această situaţie apa intracelulară nu poate ieşi în cantitate
suficientă, cristalele de gheaţă se formează în cantitate crescută intracelular, iar
aceste cristale îşi vor mări volumul în momentul congelării şi decongelării, fapt
care conduce la alterarea structurii spermatozoizilor.
La un moment dat, această concentraţie în săruri este atât de ridicată încât
lipoproteinele din structura spermatozoidului devin solubile, iar în timpul
decongelării permeabilitatea celulară se alterează în aşa măsură încât
spermatozoidul moare. Acest efect se evidenţiază în reducerea cu circa 50% a
proporţiei de spermatozoizi vii din sperma decongelată, astfel mobilitatea
spermatozoizilor se reduce de la 70-80% înainte de congelare, la 30-40% după
decongelare.
În concluzie, compuşii hidrofili reprezentaţi de diverşi polialcooli,
(glicerol), pătrund uşor în celula seminală prin simpla osmoză, întârziind formarea
cristalelor de gheaţă, prin coborârea punctului de congelare. Pe de altă parte,
glicerina limitează efectele soluţiei, înlocuind o parte din apa intracelulară, atrasă
de creşterea presiunii osmotice extracelulare. Alţi compuşi pot avea rol protector
faţă de membranele celulare (hidraţii de carbon, polivinil, pirolidon etc).

1.6.1. Conservarea spermei de taur

A) Conservarea spermei la temperatura ambiantă (laborator)
La temperatura camerei (laboratorului) sperma de taur se poate conserva
pentru o perioadă scurtă de timp (3-6 ore) şi pentru o perioadă mai îndelungată (3-
4 zile).
Conservarea de scurtă durată se poate face fie sub formă brută, fie sub
formă diluată. Sperma brută s-a folosit în perioada de început a introducerii
însămânţărilor artificiale şi constă în inocularea imediat după recoltare a spermei,
fracţionată în mai multe doze, în condiţii de asepsie. Sperma diluată, păstrată la
temperatura camerei, se poate folosi la însămânţare artificială într-un interval de
maxim 6-8 ore.
Conservarea pentru o perioadă mai îndelungată a fost consemnată sub
numele de anabioză acidă (anabiosis = înviere, revenire la viaţă).
Diluantul preparat, se barbotează timp de circa 10 minute cu un curent de
CO2, în prealabil purificat prin trecerea succesivă printr-o soluţie de bicarbonat de
sodiu 15% şi de permanganat de potasiu 3%, până când pH-ul ajunge la 6,2-6,3.
Acidifierea mediului se datorează formării acidului carbonic: CO2+H2=H2CO3. Se
diluează sperma care se păstrează în ambalaje închise ermetic la temperatura
de18-20oC, timp de 3-4 zile. Datorită dezavantajelor pe care le prezintă, această
metodă de conservare a spermei nu se mai aplică la taur.

38
 B) Conservarea spermei de taur prin refrigerare (2-4oC)
Această tehnică a fost folosită în perioada anilor ’50-’70, la taur, cu
rezultate satisfăcătoare, nivelul scăzut de temperatură fiind asigurat fie de zăpada
hidrică, fie în refrigeratoarele obişnuite.
Tennica de conservare a spermei de taur prin refrigerare este suficient de
simplă. După efectuarea diluţiei finale, cu ajutorul unei seringi semiautomate,
sperma se repartizează, câte 1ml, în fiole cu capacitatea de 1,5-2,0 ml care se
închid la flacără oxiacetilenică. Fiolele se grupează pe tije port-fiole, sau în
recipiente din material plastic, pe ejaculate, care se introduc la frigider în vederea
echilibrării. După 3-4 ore se pot folosi la însămânţarea artificială a femelelor în
călduri, iar pentru transport se folosesc fie frigidere tip, auto, fie termosuri
zootehnice, în care se găseşte gheaţă hidrică, ce trebuie să înconjoare din toate
părţile dozele de spermă. La punctele de însămânţări artificiale, dozele cu spermă
se transferă în frigidere. Expedierea dozelor cu material seminal se face împreună
cu un buletin şi fişă de utilizare.
C) Conservarea spermei de taur prin congelare
Cronologic vorbind, congelarea spermei de taur s-a făcut în două variante,
după ritmul în care se trece peste punctul crioscopic: lentă şi rapidă.
Congelarea lentă s-a făcut la început şi se caracterizează printr-o coborâre
lentă a temperaturii spermei, în special de la 35-37oC la -30oC.
Fiolele cu spermă se introduc într-o baie de alcool etilic, plasată, la rândul
ei, la o temperatură de 2-4oC. În baia de alcool se adăugau la început cantităţi
predeterminate de zăpadă carbonică în scopul reducerii temperaturii după un
anumit ritm. Astfel, răcirea spermei între 5oC şi -15oC se făcea cu un grad pe
minut, iar de la -15oC la -30oC, scăderea temperaturii se făcea cu două grade pe
minut. De la -30oC până la -79oC sau -196oC (funcţie de agentul criogen
întrebuinţat) trecerea fiolelor cu spermă se făcea brusc. În prezent sunt aparate
moderne, numite frizere, care în funcţie de program, asigură un control electronic
al ritmului coborârii temperaturii. În momentul de faţă această metodă nu se mai
foloseşte datorită dezavantajelor pe care le prezintă.
Congelarea rapidă a spermei este folosită în exclusivitate în prezent, fiind
răspândită în cvasitotalitatea ţărilor dezvoltate economic şi în curs de dezvoltare.
În funcţie de repartizarea în doze, congelarea rapidă se poate face în fiole,
paiete şi granule.
a) Congelarea spermei în fiole s-a practicat la începutul folosirii spermei
congelate de taur şi constituie un procedeu care se mai foloseşte cu rezultate bune.
Fiolele sunt fabricate din sticlă neutră, rezistentă la variaţii foarte mari de
temperatură, iar pe corpul lor se imprimă datele necesare identificării
reproducătorului sau codificării necesare în practica de reproducţie.
Volumul util al materialului seminal diluat este de 1 ml, rezervându-se un
spaţiu de dilatare a lichidului în timpul congelării. Acest spaţiu are rolul de a
evita, după decongelare, pierderea de material seminal prin refulare în momentul
introducerii în fiolă a pipetei de însămânţare.
Congelarea spermei
După diluţia finală a spermei se calculează necesarul de fiole pentru
fiecare ejaculat în parte.
Cu ajutorul unui dispozitiv automat sau a unei seringi semiautomate,
sperma se repartizează, câte 1ml, în fiecare fiolă. Fiolele se închid la flacără
oxiacetilenică, apoi se fixează în tije port-fiole, confecţionate din aluminiu, fiecare
tijă fiind prevăzută cu câte 6 locaşuri.
Tijele se grupează pe ejaculate apoi se introduc într-un refrigerator, în
vederea ehilibrării, unde se menţin 3-4 ore, funcţie de specificul fiecărei unităţi
producătoare. În acest interval de timp, spermatozoizii se adaptează cu diluantul

39
folosit şi noul nivel de temperatură, iar antibioticele incluse în diluant îşi fac
efectul specific. După echilibrare, tijele port-fiole se introduc în plan orizontal, în
vapori de azot lichid, care se formează deasupra azotului lichid stocat într-un
container cu gura largă. La circa 3 cm sub nivelul azotului se găseşte o sită
confecţionată din sârmă cu ochiurile mici sau dintr-un capac prevăzut pe toată
suprafaţa cu orificii. Pe acest capac grilant se aşază tijele port-fiole, vaporii de
azot lichid având o temperatură de -120oC până la -130oC, unde se menţin 8-10
minute, operaţiunea fiind denumită precongelare. După acest interval de timp,
tijele port-fiole, grupate pe ejaculate, se introduc în canistre metalice care se
fixeaza in containerele c uazot lichid.. În aceste containere numite de prestocaj,
dozele se menţin până a doua zi, când se verifica mobilitatea spermatozoizilor.
Dacă mobilitatea este de cel puţin 30%, tijele port-fiole se transferă în containere
depozit, cu capacitate de 200-500 l, unde se păstrează, în azot lichid, până în
momentul livrării către diverşii beneficiari. In caz contrar, dozele ejaculatului in
cauza se arunca.
Ambalarea spermei în fiole prezintă trei dezavantaje majore: pot exploda
în timpul decongelării, ocupă un spaţiu de depozitare prea mare, necesită o
tehnologie de umplere cu o productivitate mai scăzută. Din aceste motive,
congelarea spermei în fiole este, în prezent, abandonată în aproape toate ţările.
b) Congelarea spermei de taur în paiete
A fost elaborată în anul 1965 de către R. Cassou, în Franţa şi constituie
una dintre cele mai moderne şi practice forme de ambalare a materialului diluat,
care conferă eficacitate şi productivitate sporite. Paieta este confecţionată din
clorură de polivinil care nu reacţionează chimic cu mediul de diluţie. Paieta are
forma unui tub cilindric şi este confecţionată în două variante:
- paieta mijlocie, cu lungimea de 133 mm, diametrul de 2,5-2,8 mm,
grosimea paietei de 0,14-0,20 mm şi volumul util de 0,54 ml;
- paieta fină, cu lungimea de 133 mm, diametrul de 1,7-2,0 mm şi un
volum util de 0,25 ml.
Indiferent de tip, paietele au un capăt deschis, iar celălalt astupat cu un dop
„uzinal“ constituit din două straturi de bumbac între care s-a pus un strat de pudră
polivinilică preparată cu alcool. Lungimea paietelor este aceeaşi (133 mm) şi
întrucât în timpul umplerii se lasă o bulă de aer de 10 mm lungime, lungimea
coloanei de spermă este de 103 mm. Pudra de alcool polivinilic, în contact cu un
lichid polimerizează şi se transformă într-un gel care obturează complet lumenul,
ceea ce-i conferă garanţia unei protecţii absolute a spermei congelate faţă de
germenii florei banale sau patogene prezente eventual în containerul de
depozitare.
Pentru imprimarea
paietelor se foloseşte o maşină
semiauto-mată, prevăzută cu un
bloc compostor şi un set de
litere şi cifre (foto 9).
Imprimarea se face cu cerneală
specială, rezistentă la azot lichid
şi cu uscare rapidă. Se foloseşte
cerneală de diferite culori în
funcţie de culoarea paietelor
care urmează a fi imprimate,
astfel încât, contrastul să fie cât
mai evident.
Pe fiecare paietă se Foto 9 Maşină semiautomată
imprimă datele necesare pentru pentru imprimarea paietelor
identificarea exactă a probei de

40
spermă congelată, întocmai ca pentru fiole. După umplere, capătul deschis al
paietelor se astupă cu pudră de alcool polivi-nilic (dop de laborator) sau se închide
prin sudarea cu ultrasunete. La ambele tipuri de paiete, se asigură o bulă de aer cu
o lungime de circa 10 mm, absolut necesară pentru a compensa dilatarea coloanei
de material seminal în timpul congelării şi pentru a favoriza omogenizarea
coloanei de spermă după decongelare.

Tehnica de congelare a spermei în paiete

După efectuarea diluţiei spermei, conform raportului final de diluţie, se
calculează necesarul de paiete, care se imprimă cu ajutorul maşinii semiautomate.
Fracţionarea ejaculatului în doze de însămânţare se face, de regulă, la
temperatura de 2-4oC, manual sau automat.

• Umplerea manuală a paietelor. Paietele, imprimate şi uscate se prind în

brăţări metalice căptuşite cu cauciuc striat, dimensionate să cuprindă exact 15
paiete mijlocii. Sperma este aspirată în paiete cu ajutorul unei pompe de vid cu
presiunea coloanei de mercur de 30-50 cm. La cordonul de cauciuc al pompei de
vid se racordează un pieptene de aspirare prevăzut cu 15 locuri, corespunzătoare
numărului de paiete prinse în brăţară. La pieptenele de aspirare se ataşează brăţara
cu paiete, astfel încât, prinderea acestora să se facă cu capătul prevăzut cu dopul
uzinal. La partea superioară a pieptenului se găseşte un orificiu de admisie a
aerului care se obturează cu degetul atunci când paietele sunt introduse cu capătul
deschis în spermă. Umplerea paietelor se face complet, fără a se lăsa bula de aer.
După umplere, paietele se scutură energic, ceea ce îndepărtează surplusul de
spermă pe o lungime de circa 10 mm.
Închiderea paietelor se face prin apăsarea lor cu capătul deschis într-un vas
care conţine pudră de alcool polivinilic. Pudra pătrunde pe lumenul paietelor,
astupându-l. Apoi, paietele se introduc cu capătul astupat de pudra de alcool
polivinilic într-un recipient cu apă distilată, astfel încât pudra polimerizează şi
astupă complet şi acest capăt al paietei. În
acest fel, coloana de spermă este izolată
etanş de mediul exterior, protejând-o de
eventualele contaminări. Paietele se
desprind din brăţara metalică, se şterg cu
un prosop uscat, apoi se aşază pe nişte
rame metalice speciale, cu capacitatea de
40-100 de paiete. Stativele cu paietele
respective se introduc pentru echilibrare
într-un dulap frigorific, la temperatura de
Foto 10 Echilibrarea spermei într-o 2-4oC, unde se menţin circa 3-4 ore (foto
vitrină frigorifică 10).

După echilibrare, ramele cu paiete se introduc în vapori de azot lichid

pentru precongelare, unde sunt menţinute 7-8 minute (foto 11). Apoi se adună, se
introduc în nişte pahare din material plastic cu dimensiuni corespunzătoare
canistrelor, numite goblete, acestea se introduc etajat în canistre, care la rândul
lor, se scufundă în azot lichid în containerele de prestocaj (foto 12). Verificarea
materialului seminal şi depozitarea paietelor cu spermă se face întocmai ca în
cazul fiolelor (foto 13, 14 si 15).

41
Foto 11 Precongelarea spermei în
vapori de azot lichid Foto 12 Containere de prestocaj

Foto 13 Verificarea calităţii materialului Foto 14 Depozitarea dozelor cu sperma

seminal din containerele de prestocaj

O variantă îmbunătăţită a umplerii manuale a paietelor este reprezentată de

umplerea sub clopot de vid. Paietele sunt închise ermetic pri sudare cu
ultrasunete la unul din capete. Sunt apoi individualizate cu toate datele necesare.
Se calculează strict necesarul de paiete, funcţie de capacitatea acestora şi de
volumul total de spermă diluată. Cu capătul deschis, paietele se introduc în
paharul cu spermă diluată. La rândul lui, paharul se plasează sub un clopot de vid.
Se porneşte pompa de vacuum în vederea scoaterii aerului din paiete, (aspect ce se
verifică echinivelmetric cu ajutorul unei paiete introdusă într-un pahar cu lichid
colorat). Apoi se dă drumul la aer, care, datorită presiunii împinge sperma în
paiete (foto 16). Paietele se închid la capătul liber cu ajutorul pulberii de alcool
polivinilic. Următoarele etape ale congelării sunt asemănătoare celor menţionate
mai sus. Folosirea acestei metode impune efectuarea unui calcul precis al
necesarului de paiete pentru fiecare ejaculat. În caz contrar, fie că paietele nu se
umplu, fie că rămâne material seminal neabsorbit în paiete.

Foto 15 Diferite tipuri de containere Foto 16 Umplerea paietelor sub un

pentru depozitarea dozelor cu spermă clopot de vid

42
• Umplerea automată a paietelor se face cu ajutorul unor maşini semiautomate
a căror productivitate se situează la un nivel de 4000-13000 paiete pe oră.
Paietele imprimate cu toate datele necesare, sunt aşezate pe un rastel
adaptat la conveiorul maşinii care transportă paietele până în dreptul orificiilor de
umplere. La acest nivel se găsesc nişte ace (1-3) racordate prin tuburi de material
plastic, la recipientul cu spermă, iar pe partea opusă există acelaşi număr de ace,
mai scurte, racordate la o pompă de vid. După umplere, paietele trec pe rând prin
dreptul unui emiţător (Bronson) de ultrasunete, cu acţionare verticală, care închide
etanş capătul paietelor. Pentru închiderea paietelor se mai pot folosi bile mici,
metalice sau din material plastic care se introduc forţat pe lumenul acestora,
închizându-se etanş.
Echilibrarea, precongelarea, congelarea, verificarea materialului seminal şi
stocarea sunt următoarele etape ale congelării identice celor menţionate la
umplerea manuală.
Ambalarea spermei în paiete prezintă avantajele:
- permite o bună individualizare a dozelor;
- se evită contaminarea spermei cu flora microbiană existentă în azotul
lichid;
- permite folosirea economică a containerului (maxim de doze în minim
de spaţiu), aplicabil mai ales în cazul ambalării spermei în paiete fine;
- necesită o tehnică de conservare şi inoculare a spermei, simplă.

c) Congelarea spermei în granule (pastile)

A fost propusă şi experimentată de Nagase şi Niva, în anul 1964 şi
reprezintă singura formă concentrată sub care se conservă materialul seminal, în
contact direct cu agentul criogen (azotul lichid). Se bazează pe congelarea
ultrarapidă a spermei diluate într-un raport de diluţie strâns, în alveolele unui bloc
de gheaţă carbonică, rezultând granule de spermă congelate, cu volum de circa 0,1
ml.
Sperma se diluează într-un raport de 1/2-1/4, apoi este lăsată să se răcească
pe parcursul a 90 de minute la temperatura de 1-3oC. Echilibrarea spermei se face
în frigider, timp de 4-5 ore. Materialul seminal diluat se depune, cu ajutorul unei
seringi semiautomate, câte 0,1ml, în alveolele practicate în nişte blocuri de zăpadă
carbonică, la temperatura de -79oC.
Placa de zăpadă carbonică se acoperă cu vată sterilă şi se lasă circa 7
minute, timp necesar congelării.. La expirarea timpului de congelare, granulele
sunt scuturate de pe placa de zăpadă carbonică (sunt suflate cu un curent de aer) şi
colectate într-un recipient cu azot lichid. Granulele care provin de la acelaşi
reproducător, se ambalează împreună în recipienţi din material plastic, pe care
sunt trecute toate datele necesare identificării, apoi se aşază suprapus, pe o tijă
care se suspendă în azot lichid. Se depozitează numai granulele provenite din
probe care după decongelare prezintă cel puţin 30% mobilitate şi conţin cel puţin
10 milioane de spermatozoizi vii cu mişcări rectilinii/doză. Recipienţii au o
capacitate de 50-100 de granule.
Acest procedeu de ambalare a materialului seminal are şi unele
dezavantaje legate de imposibilitatea individualizării sigure a granulelor şi a
existenţei riscului de contaminare cu agenţi microbieni proveniţi din azotul lichid
în timpul conservării.

43
 1.6.2. Conservarea spermei de berbec şi ţap

La ovine şi caprine se poate folosi cu bune rezultate pentru însămânţare

sperma brută fracţionată în mai multe doze (circa 10/ejaculat). În acest caz,
însămânţarea femelelor trebuie să se facă imediat după colectarea spermei care nu
se mai diluează. Metoda dă bune rezultate în ceea ce priveşte procentul de
fecunditate al femelelor însămânţate.
Sperma de berbec se conservă sub formă lichidă sau solidă, asemănător
spermei de taur, însă rezultatele obţinute, prin însămânţarea femelelor cu spermă
congelată, sunt mult mai slabe decât la taurine.
Conservarea spermei sub formă lichidă este destul de răspândită,
rezultatele obţinute fiind bune. Temperatura de conservare a spermei diluate este
de +15oC (Baril şi colab.,1993) sau la 2-4oC. În cazul conservării spermei la
aceste niveluri de temperatură, sperma diluată se repartizează în fiole (1 ml), în
flacoane sau în paiete.
Pe timpul efectuării controlului şi diluării spermei, coborârea temperaturii
trebuie să se facă progresiv între +32oC şi +15oC, deoarece spermatozoizii sunt
foarte sensibili la şocul termic, motiv pentru care trebuie evitate fluctuaţiile rapide
ale nivelului de temperatură.
Conservarea şi transportul materialului seminal ambalat în fiole şi flacoane
se fac ca la taur, iar distribuirea la fiecare punct de însămânţare se face la interval
de două zile.
Sperma conservată în stare lichidă poate fi ambalată şi în paiete. După
omogenizarea spermei diluate, umplerea paietelor se face fie manual, fie
semiautomat (dacă numărul de doze este mare), fie prin simpla aspirare bucală
prin traversul dopului uzinal care permite trecerea aerului. Inchiderea paietelor se
face ca la taur. Dozele se păstrează la termostat reglat fie la +15oC, fie la 2-4oC. În
cazul conservării spermei la temperatura de +15oC, sperma trebuie să fie inoculată
la intervalul a maximum 8-10 ore de la recoltare.
Congelarea spermei de berbec până în prezent nu a dat rezultate
mulţumitoare, datorită faptului că nivelul de fecunditate este mai scăzut cu 20%
faţă de folosirea spermei brute, numărul de spermatozoizi necesari este foarte
mare, iar tehnica procesului de congelare este costisitoare şi complicat.
După diluţia finală a spermei, calculându-se un nivel de 4% glicerină,
temperatura se reduce progresiv până la 4oC, temperatură la care condiţionarea se
face în paiete şi practic începe procesul de congelare a spermei.
Imediat după recoltare, se face diluţia iniţială în raport de 1/1 la
temperatura de 28-30oC, care apoi se plasează în partea de jos a unui refrigerator
(6oC). După 30 de minute, temperatura spermei scade până la 13-15oC şi după
circa două ore ajunge la +6oC.
În acest stadiu, sperma se scoate din vasul cu apă şi se plasează direct în
refrigerator sau camera frigorifică, apoi la +4oC se adaugă diluantul cu glicerină,
astfel încât, în final, concentraţia acesteia să fie de 4% (G. Baril şi colab., 1993).
Repartizarea spermei în paiete mijlocii (0,5 ml) se poate face manual,
semiautomat sau chiar prin simpla aspirare bucală. După închiderea paietelor şi
echilibrarea spermei, congelarea se poate realiza fie folosind o maşină automată,
fie menţinând paietele circa 8 minute la 20 cm deasupra nivelului azotului lichid,
în vaporii acestuia (-75oC) apoi prin imersarea directă în azot lichid.
Congelarea spermei în pastile s-a dezvoltat în Australia printr-un procedeu
asemănător congelării spermei de taur. După diluţia finală a spermei, se coboară
temperatura acesteia până la un nivel de +4oC (asemănător celor mai sus
precizate), apoi, picături de 0,1-0,2 ml de spermă la +4oC sunt depuse direct în

44
alveolele practicate pe blocul de zăpadă carbonică (-79oC). După 3-4 minute,
pastilele sunt colectate, introduse într-un recipient de plastic şi apoi se scufundă
direct în azot lichid.
La caprine, existenţa enzimelor în plasma seminală, care acţionează
asupra fosfolipidelor din diluant, cu liberarea de compuşi toxici pentru
spermatozoizi, antrenează etape diferite de conservare a spermei, comparativ cu
ovinele. La ţap, este recomandat de a se separa plasma seminală cât mai repede
posibil după recoltare. Pentru folosirea spermei proaspete, diluţia directă a
ejaculatului într-un diluant pe bază de lapte ecremat de vacă este posibilă, însă se
interzice prezenţa gălbenuşului de ou în mediul de diluţie. Dacă diluantul conţine
gălbenuş de ou este absolut necesar să se facă spălarea spermei înainte de diluţie.
„Spălarea“ spermei de ţap se face prin folosirea unei soluţii Krebs-Ringer-Fosfate
(soluţie de spălare) care conţine glucoză, apoi se centrifughează amestecul pentru
a elimina plasma seminală. Sunt posibile două spălări succesive.
Reducerea temperaturii se face astfel: după recoltare, paharul colector se
plasează într-o baie-marie la 28-30oC, imediat adăugându-se soluţia de spălare;
centrifugare 15 minute, eliminarea supernatantului, adăugarea celei de-a doua
soluţii de spălare şi iarăşi centrifugare timp de 15 minute.
În cazul conservării spermei sub formă lichidă, după circa 35-40 de minute
de la recoltare, urmată de cele două spălări, se face diluţia finală la 20oC. Se
omogenizează, apoi paharul cu spermă se introduce într-un vas plin cu apă (20oC)
în refrigerator (+6oC). După circa 65 de minute, sperma se condiţionează în paiete
ca şi sperma de berbec, însă trebuie să fie întrebuinţată în primele 8 ore de la
recoltare, ceea ce limitează conservarea spermei de ţap prin refrigerare la 13-15oC.
În cazul congelării spermei de ţap, după a doua spălare şi două ore de la
recoltare se adaugă prima parte a diluantului glicerol (+4oC), după 10 minute se
adaugă a doua parte a diluantului glicerol, iar după alte 10 minute se adaugă şi a
treia parte a diluantului glicerol tot la temperatura de +4oC. După 30 de minute,
sperma se condiţionează în paiete de 0,25 ml, se precongelează în vapori de azot
(ca şi sperma de berbec) şi apoi se congelează în azot lichid (-196oC). Sperma de
ţap se poate conserva şi în pastile, întocmai ca sperma de berbec.

1.6.3. Conservarea spermei de vier

Sperma de vier are unele particularităţi, în raport cu cea a rumegătoarelor:

volum mare, concentraţie scăzută în spermatozoizi, sensibilitate crescută la
schimbările de temperatură, plasma seminală bogată în electroliţi, ceea ce
îngreunează posibilităţile tehnice de conservare (Feredean şi colab., 1964).
Dacă sperma corespunde calitativ, imediat după recoltare se diluează, la
temperatura de 33-35oC, în raport de 1/1 şi în condiţii de izotermie. Se păstrează
la 18-20oC, 15-20 de minute pentru echilibrare.
La diluarea spermei de vier, gradul de diluţie variază în limite mai
restrânse decât la rumegătoare, 1/2-1/8.
Sperma de vier diluată, se ambalează în recipiente de sticlă sau de material
plastic, cu capacitatea de 80-100 ml. Dacă sperma se foloseşte imediat după
diluare, aceasta se repartizează direct în recipientul adaptat cateterului de
însămânţare. Dacă sperma diluată se conservă mai multe zile, ambalarea se poate
face pentru cantitatea totală (în sticle cu pereţi dubli) sau în doze a câte 100 ml,
direct în recipiente de material plastic.
În practica însămânţărilor artificiale la porcine, metodele de conservare a
spermei sunt:

45
 - conservarea la temperatura de 15-20oC;
- conservarea în medii uşor acide;
- conservarea la temperatura de 4-5oC;
- conservarea prin congelare.

A) Conservarea spermei la temperatura camerei (15-20oC)

Sperma de vier, diluată şi ambalată se poate păstra una-două zile dacă
temperatura de păstrare este constantă, conţine substanţe saline, energetice şi
antibiotice. Ritmul de coborâre a temperaturii spermei diluate va fi lent, fără
variaţii bruşte, atingerea temperaturii de conservare trebuind să se realizeze în 90-
120 de minute. La această temperatură sperma se păstrează până în momentul
inoculării, când trebuie reîncălzită până la o temperatură apropiată de cea a
corpului (37-40oC) (Feredean T. şi colab., 1961). Conservarea spermei la
temperatura de 15-20oC timp de 48 de ore, asigură un nivel de fecunditate al
scroafelor însămânţate de circa 75% (Feredean T., 1977)
Conservarea spermei în medii uşor acide se bazează pe crearea anabiozei
acide. Diluantul folosit conţine bicarbonat de sodiu la care se adaugă bioxid de
carbon, cu rol în acidifierea mediului, prin formarea acidului carbonic. Această
metodă a fost adoptată pentru conservarea spermei de vier de către du Mesnill, du
Buisson şi Dauzier în anul 1959. Reactivarea spermatozoizilor se face prin simpla
încălzire a spermei ce urmează a fi folosită sau prin adăugarea unei substanţe
chimice alcaline, ambele condiţii regăsindu-se în uterul scroafei.
Diluarea se realizează la temperatura de 31-33oC, în final adăugându-se
circa două-trei volume de diluant la un volum de spermă, astfel încât să se obţină
3-4 miliarde de spermatozoizi într-o doză de 40-50 ml. Sperma diluată se
barbotează cu un curent de CO2, timp de 10 minute, până când pH-ul coboară la
6,2-6,4. Din recipientul în care s-a făcut barbotarea spermei diluate, aceasta se
repartizează în fiole de sticlă de circa 50 ml, care se închid la flacără
oxiacetilenică şi se păstrează la o temperatură constantă de 15oC. În momentul
folosirii, fiecare doză se diluează din nou cu acelaşi diluant ţinut la 30oC, până la
un volum final de 100 ml şi apoi se foloseşte la însămânţarea scroafelor în călduri.
Conservaţi astfel, spermatozoizii îşi prezervă capacitatea fecundantă timp de 4-5
zile. Totuşi, datorită laboriozităţii metodei şi a promovării în prezent a altor
procedee de conservare a spermei nu se mai practică sau se aplică în mod cu totul
sporadic.

B) Conservarea spermei de vier la temperatura de 4-5oC

La noi în ţară, din anii ’90, pe lângă diluantul salin de tip „SEMTEST“
Baloteşti folosit pentru conservarea spermei timp de 48 de ore la temperatura de
15-20oC, se mai utilizează, cu rezultate bune, un mediu de diluţie propus de
Institutul de Biologie şi Nutriţie Animală Baloteşti, pe bază de gălbenuş de ou.
În cazul folosirii acestor medii de diluţie, sperma diluată poate fi folosită la
însămânţarea artificială a scroafelor timp de 4-5 zile de la data diluţiei, cu condiţia
ca sperma să fie păstrată la frigider (+4oC). Înainte de însămânţare, dozele de
spermă se încălzesc până la temperatura de 37oC.

C) Conservarea spermei de vier prin congelare

Congelarea spermei de vier a preocupat cercetătorii în ultimele patru
decenii, însă numai din anii ’70 aceste cercetări s-au amplificat. Primele rezultate
obţinute cu spermă congelată, după însămânţarea transcervicală sunt ale lui Crabo
şi Grinarsson, în 1971, care au folosit ca lichid pentru decongelare plasma
seminală de vier (Dumitrescu I. şi colab., 1978). Crioconservarea spermei are
drept consecinţă un anumit grad de distrugere a biomembranelor spermatozoizilor,
prin trecerea în plasmă a lipidelor, albuminelor, fermenţilor, grupelor sulfhidrice,

46
afectarea echilibrului ionic etc (Nauk B.A., 1991). Gradul de stabilitate a spermei
animalelor domestice la temperaturi foarte scăzute este dependent, în mare
măsură, de comportarea albuminelor. Conţinutul în aminază a membranelor
plasmatice ale spermatozoizilor de vier este mai scăzut comparativ cu
spermatozoizii rumegătoarelor. Experienţele au demonstrat faptul că substanţele
albuminice şi complexele acestora sunt mai stabile la temperaturi scăzute decât
lipidele. Spermatozoizii de vier conţin mai multe fosfolipide comparativ cu
spermatozoizii rumegătoarelor. Experienţele întreprinse au evidenţiat faptul că la
temperaturi ultrascăzute creşte procesul de oxidare peroxidică a lipidelor din
spermatozoizi.
În ceea ce priveşte participarea glicerinei în mediul de diluţie, cele mai
bune rezultate, referitoare la nivelul fecundităţii scroafelor însămânţate, s-au
obţinut atunci când concentraţia crioprotectorului în spermă a fost de circa 2-3%.
O altă problemă care reduce răspândirea însămânţărilor artificiale cu
spermă congelată constă în randamentul slab al acestei metode, supravieţuirea
spermatozoizilor se situează, în medie, între 30% şi 40%, ceea ce înseamnă că
dintr-un ejaculat nu se pot face mai mult de 3-4 însămânţări. De asemenea,
prolificitatea scroafelor însămânţate cu spermă congelată este mai scăzută.
Crioconservarea spermei de vier se practică în mai multe variante,
neconcentrată sau concentrată, fie sub formă de granule, fie sub formă de paiete
mari cu volum de 2,0-2,5 ml etc. Fiecare centru de recoltare, examinare şi
prelucrare îşi are propria metodă de congelare, însă trebuie să precizăm faptul că,
datorită dezavantajelor menţionate, la care se adaugă şi laboriozitatea accentuată a
tehnologiei de congelare a spermei, crioconservarea spermei de vier nu dă
întodeauna rezultate bune şi de aceea nu cunoaşte o răspândire largă.
Dintre metodele folosite în prezent, menţionăm pe cea care este răspândită
în unele centre de însămânţări artificiale din SUA, Canada, Anglia, Germania,
unde se congelează spermă de vier în scopuri comerciale (Dumitrescu I. şi
colab.,1978).
Se foloseşte un diluant constituit din TES, TRIS, glucoză şi gălbenuş de ou
(20%), preparat cu 24 de ore înainte de folosire şi menţinut la frigider. Înainte de
folosire, diluantul se centrifughează, iar supernatantul se foloseşte ca diluant, fiind
împărţit în două părţi egale: o parte este folosită la temperatura camerei pentru
prima diluţie, după ce i s-a adăugat 2% glicerină, iar a doua parte se menţine la
frigider pentru a se realiza cea de a doua diluţie.
Mediul în care se face decongelarea este constituit din glucoză, citrat
trisodic, bicarbonat de sodiu, sare disodică de EDTA, clorură de potasiu.
Sperma, după recoltare şi examinarea calitativă, este lăsată să se răcească
2-3 ore la temperatura laboratorului, timp în care se adaugă antibioticele necesare.
Sperma se transferă în fiole de centrifugă, apoi se centrifughează 10 minute la
1500 rotaţii /minut până când sperma se separă de plasma seminală. Supernatantul
este eliminat apoi se adaugă în eprubete o cantitate mică de diluant fără glicerină,
la 200C. Spermatozoizii sedimentaţi sunt amestecaţi uşor cu o baghetă de sticlă şi
sperma în suspensie se transferă într-un cilindru gradat de 100 ml. Se adaugă din
nou o cantitate de diluant fără glicerină, în aşa fel încât să se ajungă la jumătate
din volumul final.
Cilindrul gradat cu spermă diluată se plasează într-un vas de 250 ml care
conţine circa 50 ml de mediu lichid la 20oC şi amândouă se introduc la frigider
timp de două ore, astfel încât temperatura amestecului de spermă să scadă la 8oC.
Se face a doua diluţie cu diluant ce conţine 2% glicerină, adăugându-se diluantul
până ce se ajunge la volumul final, diluţia făcându-se în condiţii de izotermie.

47
 Sperma se depune în excavaţiile practicate în blocul de zăpadă carbonică,
formându-se pastile de 0,1-0,2 ml fiecare. După 3-5 minute, pastilele din spermă
se colectează într-o pâlnie cu azot lichid, se apreciază calitatea spermei şi dacă
mobilitatea spermatozoizilor este de minimum 20% pastilele se transferă în
eprubete (150/16 mm) marcate cu datele necesare identificării vierului, apoi
fiolele se trec într-un container cu azot lichid. Fiecare fiolă conţine 10 pastile cu
spermă.
La noi în ţară, un colectiv de specialişti de la SEMTEST Baloteşti, a
folosit congelarea spermei de vier în paiete din plastic cu capacitatea de 2,5 ml, cu
2,5 miliarde de spermatozoizi/paietă, care s-a precongelat în vapori de azot lichid.
În ţara noastră încă nu este elaborată o tehnologie specifică de lucru care să
garanteze o fecunditate corespunzătoare a femelelor însămânţate.

1.6.4. Conservarea spermei de armăsar

La armăsar, sperma se recoltează la interval de două zile, se examinează şi
cea care corespunde calitativ se diluează imediat la +32oC, astfel încât să se
asigure o concentraţie de 20X106 spermatozoizi/ml, doza fiind formată din 20 ml,
ceea ce înseamnă că se asigură circa 400 de milioane de spermatozoizi
mobili/doză. Cele mai eficiente antibiotice folosite sunt penicilina şi gentamicina.
Dintr-un ejaculat pot rezulta în medie 30 de doze. Scăderea temperaturii trebuie să
se facă treptat. Astfel, sperma diluată la +32oC se menţine 20-30 de minute la
temperatura laboratorului şi apoi dozele cu spermă se introduc la frigider. Sperma
este distribuită în fiole sau cel mai frecvent în tuburi cu volum de 20 ml. Fiolele
sau tuburile se închid ermetic şi se menţin la frigider, capacitatea fecundantă fiind
asigurată doar pe un interval de 24 de ore (conservarea prin refrigerare).

Conservarea spermei prin congelare

Oricare ar fi mediul de diluţie, se constată o mortalitate ridicată a
spermatozoizilor la congelare, dar şi o reducere a capacităţii fecundante a
spermatozoizilor mobili (Palmer E. şi colab., 1984).
Rezistenţa spermatozoizilor la congelare variază mult cu particularităţile
individuale ale armăsarilor. Cel mai ridicat procent de supravieţuire a
spermatozoizilor la congelare s-a observat la armăsarii care dau o spermă
concentrată şi cu volum redus.
Congelarea spermei se realizează prin diluare şi scăderea temperaturii.
Sperma diluată pentru congelare se ambalează în tuburi metalice sau din material
plastic, păstrate în azot lichid. Tuburile metalice sunt confecţionate din aluminiu,
au o lungime de 12 cm, diametrul de 2,5 cm, închise ermetic.
Mediul de diluţie preconizat de Busch şi colab.,1982 are următoarea
compoziţie: apă bidistilată 10 ml, glucoză 11 g, EDTA (sare de etilen-diamin-
tetraacetil- bisodic) 100 mg, hidrocarbonat de sodiu (soluţie apoasă 2%) 0,2 ml,
soluţie de citrat de sodiu 0,25 ml, gălbenuş de ou 2 ml, glicerină 3,5 ml, 500000
U.I. penicilină şi 0,5 µg streptomicină. Sperma este lăsată să sedimenteze, iar
fracţiunea bogată în spermatozoizi menţinută în baia-marie la 32oC, se amestecă
cu diluantul menţinut la aceeaşi temperatură. Sperma se păstrează la temperatura
camerei timp de 30 minute, apoi se introduce în tuburile de aluminiu cu o
capacitate de 20 ml. După umplere, tuburile se închid ermetic, se ţin la frigider (2-
4o) două ore pentru echilibrare. Sperma se diluează la această temperatură în
raport de 1/3-1/4. Tuburile se introduc în vapori de azot lichid (precongelare) la
temperatura de -120oC, unde se menţin 3-6 minute, apoi sunt scufundate direct în
azot lichid (-196oC).

48
 a) Congelarea spermei în tuburi de material plastic
Martin şi Klug (1979) au folosit tuburi cu o capacitate de 4 ml.
Diluarea se face în doi timpi: în prima etapă se face diluţia în raport de 1/1,
la temperatura de 30-32oC, apoi amestecul se centrifughează 5 minute (1000
rotaţii/minut). Supernatantul se înlătură, apoi sperma rămasă se amestecă cu un alt
diluant la temperatura de 2-4oC, urmează echilibrarea 3-4 ore la acest nivel de
temperatură, apoi sperma se repartizează în tuburi din material plastic care se
închid şi la celălalt capăt cu pudră de alcool polivinilic sau prin alt procedeu.
Congelarea se face în acelaşi fel ca pentru tuburile de aluminiu.

b) Congelarea spermei în granule (pastile) nu a dat rezultate

satisfăcătoare până în prezent, fecunditatea iepelor însămânţate cu spermă
congelată în granule oscilând între limite foarte largi (11-60%, Oshida şi colab.,
1966; Knoop, 1976), fapt ce a dus la aplicarea din ce în ce mai redusă a acestui
procedeu. Tehnologia prevede diluţia şi centrifugarea spermei, înlăturarea
supernatantului, iar sperma rămasă se repartizează în alveole practicate pe un bloc
de zăpadă carbonică şi apoi introducerea în tuburi şi scufundarea în azot lichid
unde se păstrează.

1.6.5. Conservarea spermei de păsări

Sperma diluată îşi poate menţine capacitatea fecundantă circa 24 de ore

dacă temperatura de păstrare se situează la un nivel de 12-15oC, la cocoş şi
curcan, cu condiţia ca oxigenarea spermei să fie menţinută tot timpul păstrării.
Congelarea spermei la păsări întâmpină unele dificultăţi:
- degradarea membranei spermatozoizilor cauzată de apariţia de
microcristale şi deshidratarea care intervine în momentul congelării spermei;
- fenomene de toxicitate datorate creşterii concentraţiei intracelulare a soluţiilor.
Sperma se diluează în raport de 1/1, se răceşte progresiv până la 4oC când
se adaugă restul cantităţii de diluant care conţine substanţă crioprotectoare
(glicerol, DMSO-dimetil sulfat oxid, dimetil acetamid 4%).
Congelarea propriu-zisă se face în azot lichid, sperma fiind ambalată în
fiole, paiete sau pastile. Cele mai bune rezultate s-au obţinut cu sperma conservată
în paiete. Stocajul are loc în azot lichid.
Lake, respectând aceste condiţii, a obţinut o fecunditate de 93%, însă a
efectuat 4 însămânţări artificiale în 10 zile, ceea ce a totalizat 1,2 miliarde de
spermatozoizi, cam de 6-10 ori mai mult decât atunci când se foloseşte sperma
brută. Rezultatele lui Sexton, care a folosit DMSO se situează la un nivel mai
scăzut (40-60%), cu variaţii mari de la un mascul la altul.

1.7. Inocularea spermei

Constituie ultima etapă în biotehnologia însămânţărilor artificiale şi constă

în depunerea materialului seminal, în prealabil recoltat, examinat, prelucrat şi
conservat sau brut, pe traiectul căilor genitale ale femelelor în estru. Inocularea
prin mijloace artificiale trebuie să ţină seama de particularităţile fiziologice ale
locului de depunere a spermei prin montă, sperma urmând a fi depusă cel puţin la
nivelul segmentului genital femel unde este depusă fiziologic.
Prin însămânţare artificială se întrebuinţează numai sperma care a
corespuns unor parametri minimi de calitate şi care provine de la reproducători
valoroşi.

49
 Funcţie de locul unde se depune, inocularea poate fi:
- vaginală, care se aplică la mioare şi viţele;
- cervicală, aplicabilă la oi si vaci;
- uterină, practicată la iapă şi scroafă;
- tubară, se aplică la păsări.

1.7.1. Inocularea spermei la vacă

Indiferent de forma de proprietate a efectivelor de taurine, însămânţarea

artificială presupune existenţa unei scheme organizatorice adecvate, structura
organizatoricăsi atributiile institutiilor fiind prezentate în primul capitol.

1.7.1.1 Punctul de însămânţări artificiale la vaci (P.I.A.V.)

Punctul de însămânţare artificială a vacilor este subunitatea-verigă a

întregii reţele de reproducţie a animalelor, prin a cărei activitate se concretizează
întregul proces de reproducţie la taurine din sectorul de stat, asociativ sau
individual. Punctul de însămânţare artificială a vacilor este amenajat la nivelul
fiecărei comune sau ferme de vaci, este încadrat cu un tehnician sau operator
însămânţător căruia îi revin sarcinile pe linia reproducţiei şi selecţiei efectivelor de
animale arondate punctului de însămânţări artificiale.
În condiţiile extinderii iniţiativei particulare în creşterea şi exploatarea
efectivelor de taurine, funcţionează şi operatori însămânţători, autorizaţi de
instituţiile abilitate în acest sens, care să efectueaza pe cont propriu acţiunile de
însămânţare a animalelor.
De regulă, punctul de însămânţare artificială este amplasat într-un adăpost
al fermei sau pe lângă circumscripţiile sanitar-veterinare, fiind dotat cu
instrumentarul si aparatura necesare aplicarii insamantarii artificiale.
Aprovizionarea cu material seminal congelat la nivelul punctelor de
însămânţare artificială se face prin serviciul specializat la nivelul UARZ sau a
Centrelor de Reproducţie şi Selecţie a Animalelor.

1.7.1.2. Descoperirea femelelor în călduri şi stabilirea

momentului optim al însămânţării

Identificarea femelelor în călduri constituie o acţiune importantă pentru

succesul însămânţării artificiale. Modificarile morfofiziologice ale segmentelor
aparatului genital si de comportament au fost descrise in cadrul disciplinei de
“Reproductie”, capitolul “Ciclul sexual”.
Semnul concludent al stării de estru se consideră atunci când femela
respectivă acceptă, fără tendinţa de a fugi, saltul altor femele sau masculi cu care
stă împreună, acest moment considerându-se a fi optim pentru însămânţarea
artificială. Vulva, vestibulul vaginal şi vaginul sunt congestionate, labiile vulvare
sunt edemaţiate, dispar pliurile vulvare, clitorisul se evidenţiază. Printre labiile
vulvare se scurge un mucus translucid, filant, care poate să se întindă de la
comisura inferioară a vulvei până la pământ. La mijlocul perioadei de estru,
cantitatea de mucus creşte şi are o elasticitate maximă, ceea ce constituie alt semn
specific de călduri (fig. 4).
Descoperirea vacilor în călduri trebuie să se facă cu mult profesionalism
pentru a se evita pierderile de cicluri, care se pot ridica la 20-30%. Depistarea trebuie

50
să se facă de două ori pe zi , dimineaţa şi seara.În complexele de vaci, depistarea
căldurilor ridică unele probleme nu numai datorită efectivului mare de animale care
trebuie urmărite zilnic, dar şi datorită semnelor clinice, deseori mai şterse. Pentru
creşterea eficienţei în descoperirea vacilor în călduri se pot folosi în astfel de unităţi,
masculi biostimulatori (epididimotomizaţi, deferotomizaţi sau cu deviere de penis).În
acest caz se consideră suficient un taur biostimulator pentru 100-200 de vaci.În
majoritatea cazurilor, descoperirea femelelor în călduri se face numai pe baza
modificărilor morfo-fiziologice şi de comportament din stadiul de estru.
De asemenea, în alegerea momentului optim al însămânţării, este necesar
să se urmărească cu atenţie evoluţia perioadei puerperale, astfel încât să se prevină
îmbolnăvirile, care sunt frecvente în această etapă, iar puerperiumul să se
desfăşoare fiziologic. Majoritatea autorilor recomandă ca însămânţarea artificială
să se facă cel mai devreme între 45-50 de zile de la fătare, în funcţie de modul
cum decurge perioada puerperală, de nivelul producţiei de lapte etc, ştiut fiind că
femelele care dau o producţie mare de lapte se însămânţează prima dată după un
interval de cel puţin 60 de zile de la parturiţie.
Însămânţarea vacilor descoperite în estru trebuie să se facă imediat după
depistarea căldurilor şi apoi să se repete după 8-10 ore, având în vedere durata
estrului, momentul ovulaţiei, viabilitatea gameţilor pe traiectul căilor genitale femele.

Fig. 4 Perioada optimă pentru însămânţarea artificială a vacilor

51
 1.7.1.3. Pregătirea femelelor pentru însămânţare

Constă în notarea de către operatorul însămânţător a numărului matricol,

grajdul şi lotul din care fac parte vacile ce urmează a fi însămânţate. Identitatea
femelei este căutată în registru, cu care ocazie este analizată şi interpretată starea
ginecologică a femelei. Cu această ocazie se înscrie însămânţarea în registru şi se
face şi programarea urmăririi peste 18-23 de zile a eventualei reintrări a femelei în
călduri.
Pregătirea instrumentarului pentru însămânţare ţine seama de tehnica de
însămânţare folosită şi de modul în care este ambalat materialul seminal
(refrigerat, congelat în paiete, fiole sau granule).
În cazul în care se practică metoda colposcopică de însămânţare, speculul
va fi sterilizat prin fierbere, timp de 10-15 minute, se verifică funcţionarea sursei
de lumină, se asigură lubrifierea cu vaselină neutră. Pentru însămânţare, speculul
vaginal se încălzeşte până la aproximativ 45-50oC, apoi se lubrifiază cu vaselină
neutră. Se pregăteşte pipeta de însămânţare si registrul de însămânţare, apă caldă,
o soluţie aseptizantă, mănuşile de plastic, etc.
În instituţia în care se practică însămânţarea tactil-recto-cervicală (recto-
vaginală) se pregătesc evidenţele, soluţiile şi substanţele aseptizante,
îmbrăcămintea de lucru şi mănuşile de plastic pentru exploraţie.În funcţie de
materialul seminal folosit, se va pregăti o pipetă din sticlă sau din material plastic,
un pistolet Cassau sau o pipetă universală de tip „SEMTEST“.

1.7.1.4. Reanimarea spermatozoizilor

Presupune scoaterea dozei de însămânţare din cutia care se găseşte în

termosul cu gheaţă şi lăsarea ei la temperatura camerei timp de câteva minute,
într-un stativ de lemn pregătit special în acest scop (în cazul în care se foloseşte
sperma conservată prin refrigerare).
În cazul folosirii spermei conservate prin congelare se recomandă:
- decongelarea cât mai rapidă a dozei cu material seminal;
- între decongelare şi însămânţare curba de temperatură a spermei să fie în
continuă creştere;
- un interval de timp între decongelare şi însămânţare cât mai scurt (maximum 15
minute);
- instrumentarul folosit pentru însămânţare să aibă aceeaşi temperatură ca sperma;
- canistrele din containere să nu fie ridicate la o înălţime mai mare de 3-4 cm sub
nivelul superior al containerului. Extragerea dozei trebuie făcută foarte rapid, prin
intermediul unei pense.
Indiferent de prelucrarea iniţială a spermei congelate şi forma sub care se
găseşte, pentru decongelare este nevoie de un termos cu o baie marină de 36-40oC
şi un termometru.
În funcţie de modul de prezentare a spermei congelate, pentru reanimarea
spermatozoizilor este necesar parcurgerea unor etape de lucru specifice.
În cazul conservării spermei în fiole, se parcurg etapele:
- pregătirea băii marine la 38oC;
- deschiderea containerului, ridicarea canistrei până la gâtul containerului,
extragerea fiolei, cufundarea ei în baia marină;
- decongelarea materialului din fiole durează 2 minute;
- ştergerea şi uscarea fiolei;
52
 - deschiderea fiolei prin secţionarea gâtului acesteia;
- aspirarea spermei în pipetă;
- nu se decongelează în acelaşi timp mai multe fiole, iar absorbţia
materialului seminal decongelat se face cu instrumentarul încălzit.
În cazul conservării spermei în paiete se au în vedere următoarele etape de
lucru:
- pregătirea băii marine la temperatura de 34-37oC;
- deschiderea containerului, ridicarea canistrei până la cel mult 3-4 cm sub
nivelul superior al containerului, scoaterea paietei, scuturarea ei de eventualele
resturi de azot şi cufundarea în baia marină; decongelarea durează 13 secunde
pentru paieta mijlocie şi 8 secunde pentru paieta fină;
- reaşezarea canistrei şi închiderea containerului;
- încălzirea, prin frecare cu hârtie sau vată, a pipetei sau pistoletului de
însămânţare;
- scoaterea paietei din baie, uscarea ei prin ştergere cu tifon sau prosop;
- transferarea bulei de aer către capătul astupat cu dopul de laborator prin
lovirea uşoară a corpului paietei;
- introducerea paietei în pistoletul sau pipeta de însămânţare;
- tăierea capătului paietei cu o secţiune perpendiculară pe axul
longitudinal, la mijlocul bulei de aer. Se recomandă să nu se decongeleze mai
multe paiete în acelaşi timp.
În cazul conservării spermei în granule se parcurg etapele:
-pregătirea băii marine la temperatura de 38-40oC;
aşezarea pe stative, în baia marină a unor fiole goale deschise cu o capacitate de
2,0-2,5 ml, asemănătoare celor folosite la ambalarea materialului seminal
refrigerat;
-introducerea în fiecare fiolă a câte 1,0 ml soluţie de citrat de sodiu 2,9%
sterilă (soluţie extender) în care se decongelează granulele; atât fiolele cu soluţia
extender, cât şi fiolele goale trebuie să fie introduse în baia marină la jumătatea
înălţimilor;
-deschiderea containerului, ridicarea canistrei până la gâtul containerului;
ridicarea ambalajului cu granule până la nivelul de unde se extrage cu pensa dopul
de pânză-tifon (granulele se găsesc tot timpul sub nivelul azotului din container);
-răcirea vârfului pensei sau tijei linguriţă, timp de 10-15 secunde, în azot
lichid;
extragerea cu ajutorul pensei răcite a unei singure granule şi plasarea rapidă a
acesteia în fiola cu soluţie-extender;
-agitarea uşoară a fiolei pentru omogenizarea spermei cu diluantul.

1.7.1.5. Tehnica inoculării spermei

Inocularea materialului seminal se realizează prin două metode:

metoda colposcopică (sau cu speculul vaginal);
metoda tactil-recto-cervicală (sau recto-vaginală).

Metoda colposcopică
Inocularea materialului seminal prin această metodă se bazează pe
introducerea pipetei de însămânţare pe lumenul cervical, prin conductul vestibulo-
vaginal tunelizat cu ajutorul unui specul bivalv, trivalv sau tubar. Unele modele de
specul tubar sunt prevăzute cu surse propri de lumină. La celelalte modele, pentru

53
iluminarea conductului vaginal şi a zonei pericervicale se întrebuinţează o lampă
frontală sau lanternă.
La inocularea spermei prin această metodă se va proceda astfel:
- vaca în călduri se contenţionează într-un stand şi se execută toaleta
organelor genitale externe cu apă şi săpun;
- speculul vaginal, dezinfectat, încălzit şi lubrifiat cu vaselină neutră
sterilizată, se introduce cu partea lăţită în fanta vulvară. Introducerea se face din
jos în sus, într-un unghi de aproximativ 35-40oC, prin mişcări uşoare şi repetate în
plan vertical, asociat cu împingerea prudentă către înainte. După introducerea
completă a speculului, se efectuează o rotire de 90oC (pentru speculul trivalv)
după care se îndepărtează valvele;
- se luminează conductul vestibulo-vaginal cu ajutorul lămpii frontale sau
a sursei proprii de lumină;
- se examinează conductul vestibulo-vaginal, floarea involtă şi se
localizează deschiderea cervicală, după care se introduce pipeta de însămânţare în
conductul cervical;
- depunerea spermei se face în partea anterioară a cervixului prin presarea
între degete a suzetei sau prin apăsarea tijei piston urmată de un uşor masaj
clitoridian.

Avantaje:
- posibilitatea examinării mucoasei vestibulo-vaginale şi cervicale şi buna
observare a caracteristicilor mucusului cervical;
- permite localizarea cu uşurinţă a cervixului;
permite depistarea unor eventuale anomalii sau afecţiuni ale vaginului şi
cervixului;
- este mai estetică şi mai comodă pentru operator.
Dezavantaje:
- necesită contenţionarea femelelor într-un stand special pentru
însămânţare;
- impune dezinfecţia speculului pentru a se evita transmiterea germenilor
patogeni de la un animal la altul;
- prin aplicarea acestei metode nu se obţin informaţii privind starea
uterului şi a ovarelor, stadiul de evoluţie al foliculilor ovarieni etc;
- introducerea speculului cu brutalitate crează reflexe de inhibiţie sau poate
stresa animalul. Datorită acestor dezavantaje, această metodă este mai puţin
folosită în prezent.

Metoda tactil-recto-cervicală (recto vaginală)

Impropriu denumită şi bimanuală, această metodă este aproape
generalizată în practica însămânţărilor artificiale la taurine. Această metodă,
sigură şi eficace, permite executarea însămânţării la animalele legate la iesle, în
grajd, în adăposturi cu stabulaţie liberă sau în padocuri. Se deosebeşte de metoda
colposcopică prin aceea că depunerea materialului seminal în organele genitale
femele se realizează numai cu ajutorul pipetei (pistoletului) de însămânţare, fără a
folosi speculul vaginal.
Metoda tactil-recto-cervicală necesită însă o pregătire corespunzătoare a
personalului autorizat să efectueze însămânţarea, care trebuie să cunoască
topografia şi modificările morfofiziologice ale organelor genitale. Persoanele
neinstruite în acest scop pot cauza, prin manipulări brutale, rupturi, lezionări sau
perforări ale conductului genital, iar datorită necunoaşterii topografiei organelor

54
genitale, materialul seminal poate fi depus într-un fald al mucoasei vaginale sau
pericervicale, ratându-se în acest fel însămânţarea.
Inoculara materialului seminal prin această metodă necesită efectuarea
următoarelor operaţiuni:
- vidarea rectului, cu un uşor masaj pentru eliminarea contracţiilor rectale,
operaţiuni care se efectuează cu mâna protejată de o mănuşă de polietilenă;
- se apreciază forma, topografia, dimensiunile, sensibilitatea şi consistenţa
coarnelor şi corpului uterin;
- se îndepărtează labiile vulvare şi se deschide vestibulul vaginal prin
compresiunea exercitată prin traversul rectului;
- se introduce pipeta printre labiile vulvare sub un unghi de 30-40oC în
conductul vaginal;
- se urmăreşte, cu mâna introdusă în rect, mişcarea de înaintare a pipetei
până la nivelul orificiului vaginal al cervixului, pentru a se preveni introducerea
vârfului pipetei într-un fald al mucoasei vaginale;
- dacă uterul este normal, se continuă înaintarea pipetei prin cervix, după
ce anterior, a fost localizată deschiderea acestuia cu ajutorul degetului mic de la
mâna introdusă în rect;
- se fixează cervixul, urmărind cu degetele trecerea vârfului pipetei până
ce pătrunde în corpul uterin pe o distanţă de 2-3 cm;
- materialul seminal se depune la extremitatea anterioară a cervixului şi în
corpul uterin prin compresarea suzetei între degete sau împingerea tijei-piston;
- inocularea spermei prin
această metodă se încheie prin
efectuarea unui uşor masaj
clitoridian pentru a se preveni
spasmul uterin şi a facilita
descărcările hormonale necesare
ascensiunii spermatozoizilor pe
traiectul căilor genitale femele
(foto. 17).
În unele cazuri se poate
practica însămânţarea tactil-
cervicală, care constă în
introducerea unei mâini protejate
Foto 17 Inocularea spermei la vacă de o mănuşă în conductul
prin metoda tactil recto cervicală vestibulo - vaginal, reperarea
cervixului, iar cu cealaltă mână
se introduce cu precauţie, pipeta de însămânţare până la nivelul orificiului
cervical.

1.7.2. Inocularea spermei la oaie şi capră

1.7.2.1.Organizarea punctului de însămânţare artificială

la ovine (P.I.A.O.)
Organizarea şi desfăşurarea acţiunii de însămânţare artificială la ovine şi
caprine se realizează sub coordonarea şi îndrumarea Direcţiilor Judeţene de
Ameliorare şi Reproducţie şi a Centrelor teritoriale de profil, care asigură dotarea
şi funcţionarea laboratorului de recoltare, prelucrare şi difuzare a materialului
seminal şi a punctelor de însămânţare artificială. (P.I.A.O. şi P.I.A.C.). Punctele
de însămânţări artificiale sunt amplasate astfel încât efectivele de oi pe care le

55
deservesc să nu se deplaseze la păşunat pe o rază mai mare de 1,0-1,5 Km. De
altfel, acţiunea de însămânţare artificială se pregăteşte temeinic cu cel puţin 1,5-
2,0 luni de zile înainte de a fi declanşată campania şi se va desfăşura pe durata a
cel puţin două-trei cicluri de călduri (45-50 de zile).
În ţara noastră, este răspândită însămânţarea artificială cu spermă brută sau
diluată, motiv pentru care, în aceeaşi unitate trebuie să se găsescă, pe lângă
efectivul de femele şi efectivul de berbeci pepinieri, donatori de material seminal
pentru efectuarea însămânţării oilor. Berbecii folosiţi la însămânţări artificiale
sunt aleşi dintre:
- cei proveniţi din import, cu certificat de origine şi productivitate;
- cei testaţi ca amelioratori aparţinând raselor importate şi indigene zonate,
precum şi exemplarele cu performanţe proprii superioare din efectivul valoros,
apreciate la bonitare.
Perioada de pregătire a berbecilor pepinieri durează circa şase săptămâni şi
constă în asigurarea unei raţii de hrană adecvate cerinţelor nutritive pentru
reproducţie, aprecierea comportamentului sexual şi a calităţii spermei. Se asigura
câte un reproducător adult pentru 100 de femele în cazul însămânţării cu spermă
brută şi 300 de femele în cazul folosirii spermei diluate şi conservată prin
refrigerare.
Pregătirea oilor şi caprelor pentru campania de însămânţări artificiale
constă în asigurarea unei furajări stimulative şi diferenţiate, în funcţie cu starea lor
de întreţinere.Înţărcarea oilor şi caprelor mulgătoare se practică cu circa o lună
înaintea declanşării campaniei de însămânţări artificiale prin întreruperea treptată
a mulsului. Se verifică şi individualizarea femelelor, acolo unde este cazul
completându-se crotaliile pierdute. Pe baza examenului individual, zootehnic şi
sanitar-veterinar, se constituie loturile (turmele) pentru însămânţarea artificială,
avându-se în vedere rasa, vârsta, starea de întreţinere. Mărimea unei turme trebuie
să fie de 300-400 oi.
Cu circa o lună înaintea campaniei de însămânţări artificiale, oile şi
caprele vor fi întreţinute pe păşuni bune, raţia de bază fiind suplimentată cu
nutreţuri concentrate, aşa-numitul „flushing“ care influenţează pozitiv nivelul
indicilor de reproducţie.
Efectivul mediu deservit de un P.I.A.O. este de 1000-1200 de femele, cu
durata acţiunii pe perioada a 50-60 de zile. Pentru o bună activitate, P.I.A.O. sau
P.I.A.C. trebuie să dispună de următoarele spaţii şi utilităţi: o cameră pentru
laborator, un spaţiu pentru recoltarea spermei şi însămânţarea artificială a
femelelor descoperite în călduri, padocuri pentru berbeci încercători, oile depistate
în călduri, oile însămânţate artificial, berbecii pepinieri şi ţarcurile în care se face
depistarea oilor şi caprelor în călduri.
Laboratorul va fi dotat cu un minim necesar de aparatură pentru examenul
prelucrarea şi refrigerarea spermei.
Camera de recoltare-însămânţare este dotată cu: un stand pentru contenţia
oilor ce urmează a fi însămânţate, cu dimensiuni şi tipuri constructive adaptate
acestei specii, vaginuri artificiale, autoclave pentru sterilizarea aparaturii folosite,
speculum vaginal, sursă de lumină, materiale consumabile necesare.

1.7.2.2. Depistarea oilor şi caprelor în călduri

Depistarea oilor în călduri constituie o activitate destul de complicată în

aplicarea biotehnologiei însămânţărilor artificiale.

56
 Dificultăţile sunt datorate faptului că oile trăiesc în cârduri mari, în care
sunt greu de urmărit individual. Semnele de estru sunt greu observabile pentru
om, comparativ cu semnele mult mai evidente manifestate la taurine şi cabaline.
Izolarea oilor în călduri şi recunoaşterea lor pentru însămânţare artificială necesită
un mare volum de muncă, dereglări ale activităţii curente din fermă, fapt ce a
îngreunat, în multe ţări, extinderea însămânţărilor artificiale la această specie.
Însămânţarea artificială se bazează pe descoperirea oilor în călduri prin
intermediul berbecilor încercători.
Berbecii şi ţapii încercători trebuie să aparţină aceleiaşi rase cu femelele
care urmează a fi însămânţate. Aceştia sunt autorizaţi şi verificaţi sub raportul
calităţii materialului seminal pentru a putea fi folosiţi şi la monta, după încheierea
campaniei de însămânţări
artificiale, oilor care nu au rămas gestante şi manifestă estrul în afara intervalului
de timp alocat aşa-numitei campanii de însămânţări artificiale. Alegerea oilor şi
caprelor în călduri se face de două ori/zi, dimineaţa şi seara, perioade din zi când
manifestarea căldurilor este mai intensă, iar berbecii şi ţapii sunt mai activi în
căutarea femelelor.
Încercătorul este un mascul cu reflexe sexuale bine exprimate, care este
introdus printre oile care urmează a fi însămânţate, însă este împiedicat să
efectueze depunerea spermatozoizilor pe traiectul căilor genitale femele. Se
consideră că femela este în călduri şi este reţinută pentru însămânţare artificială,
atunci când acceptă saltul berbecului sau ţapului, stând liniştită.
Se folosesc trei feluri de berbeci încercători şi anume:
- berbeci normali, însă echipaţi cu un şorţ care acoperă furoul, împiedicând
pătrunderea penisului în vaginul oilor pe care execută saltul (fig. 5);
- berbeci cu penis deviat, la care, printr-
o intervenţie chirurgicală, s-a schimbat
direcţia penisului spre partea laterală a
corpului, astfel încât, să nu mai
pătrundă în conductul vestibulo-
vaginal; aceştia s-au dovedit a fi mai
puţin eficienţi, deoarece imposibilitatea
ejaculării le conferă un anumit grad de
nervozitate şI o mai slabă eficienţă a
descoperirii oilor în călduri; Fig. 5 Berbec încercător prevăzut cu
şort
- berbeci vasectomizaţi, la care, tot chirurgical, s-a secţionat epididimul sau
canalul deferent, blocându-se astfel eliminarea spermatozoizilor din testicul, încât
pot monta, sperma fiind lipsită de spermatozoizi.
Pentru a asigura o rată optimă de depistare a oilor în călduri, încărcătura
medie va fi de 30-40 de femele pentru un mascul.În vederea unei descoperiri cu
un volum mai redus de muncă, berbecul încercător se echipează, în zona
pectorală, cu un cartuş marcator special ce conţine o vopsea lavabilă, cartuş, care,
în momentul saltului, vine în contact cu crupa femelei, iar la coborâre vopseşte
lâna.În lipsa cartuşului, oile depistate în călduri vor fi marcate cu „ovisemn“ de
către personalul muncitor.
Femela se consideră în călduri atunci când la apropierea berbecului sau
ţapului ia poziţie campată, urinează des şi întoarce capul spre flanc, se
imobilizează când masculul face saltul şi „caută berbecul sau ţapul“.
Pentru descoperirea oilor in calduri, acestea se introduc in padoc impreuna
cu berbecii incercatori, modul de identificare fiind prezentat anterior. După ce
berbecii încercători nu mai sunt activi în descoperirea oilor în călduri, se retrag
din cârd, se închid separat şi oile pornesc la păşunat.
57
 Oile alese în călduri sunt ţinute într-un lot separat până sunt însămânţate,
inclusiv până se repetă însămânţarea.
Un mijloc mai modern pentru provocarea şi evidenţierea estrului este
reprezentat de sincronizarea căldurilor prin diverse procedee prin intermediul
cărora se poate determina inducerea căldurilor la un moment prestabilit (vezi
capitolul „Sincronizarea estrului“).
Aceasta înseamnă că însămânţarea artificială se poate face, la oile supuse
tratamentului de sincronizare, fără a se mai efectua alegerea celor în călduri.În
funcţie de tratamentul de sincronizare aplicat, însămânţarea tuturor oilor
sincronizate, se face după un anumit interval de timp, de la încheierea
tratamentului, strict prestabilit, cu rezultate satisfăcătoare.

1.7.2.3. Inocularea materialului seminal

Inocularea spermei brute, diluată şi consevată prin refrigerare sau

congelare, se face prin trei metode:
- colposcopică (specul vaginal);
- vaginală (pericervicală, fără specul);
- tactil cervicală.
Lucrările pregătitoare se referă la pregătirea aparaturii de inoculare,
inclusiv sterilizarea instrumentarului necesar, pregătirea locului de lucru.
Contenţia oilor se poate realiza într-un stand cu orientare rabatabilă ce permite
ridicarea trenului posterior al oii şi la parapet sau gard, fixarea oii făcându-se
cu/pe genunchiul unui îngrijitor. Mai răspândit este standul orizontal, aşezat la sol
iar pentru mai multă comoditate, operatorul se poate aşeza într-un şanţ practicat în
spatele standului de contenţie.
Pentru inoculare avem nevoie de o seringă, alcătuită dintr-un corp metalic,
piston şi canulă din sticlă, pistonul fiind prevăzut cu un cursor cu ajutorul căruia
se reglează volumul dozei. Se mai folosesc şi alte pipete de însămânţare, cu canula
schimbabilă, semiautomată, cu o singură încărcătură putându-se însămânţa 20-30
de oi.În cazul folosirii paietelor cu material seminal congelat, după decongelarea
acestora, paietele se introduc în pistoletul special construit, asemănător celui
folosit pentru taurine. Aparatura auxiliară constă dintr-un specul vaginal, tri- sau
bivalv şi o sursă de lumină.
Însămânţarea oilor se face imediat după descoperirea în călduri şi se repetă
la interval de 7-12 ore.
Metoda colposcopică
După pregătirea instrumentarului,
femela în călduri se introduce în camera
de însămânţare şi se contenţionează în
stand. Se efectuează toaleta regiunii peri-
şi vulvare şi se aspiră spermă în seringă.
Speculul, sterilizat si încălzit la
temperatura de 38-39oC, se lubrifiază cu
vaselină neutră, se introduce în conductul
vestibulo vaginal cu lăţimea pe direcţia
fantei vulvare. După introducerea cu
atenţie, speculul se roteşte cu 90o, se
deschide şi se reperează orificiul cervica
Fig. 6 Inocularea spermei la oaie (fig. 6).
prin metoda colposcopică

58
 În cazul folosirii spermei diluate, doza de însămânţare este de 0,2 ml, iar
când se face însămânţarea cu spermă brută, doza este de 0,1 ml pentru oi şi capre
şi de 0,2 ml pentru mioare. Numărul de spermatozoizi mobili/doză trebuie să
oscileze între 200-250 de milioane.
Femelele depistate în călduri se însămânţează imediat cu repetare la 8-12
ore. Femelele cu cicluri prelungite (două-trei zile) se însămânţează în fiecare zi,
pe toată durata căldurilor.
Metoda vaginală (pericervicală, fără specul) constă în următoarea
tehnică:
-contenţia femelei se face în
standul cu orientare rabatabilă sau prin
simpla prindere a femelei de către
personalul ajutător şi ridicarea trenului
posterior;
- toaleta regiunii vulvare şi
perivulvare;
-introducerea pipetei de
însămânţare intravaginal şi prin
mişcări de tunelizare, rotire şi
înaintare până la nivelul orificiului
cervical, sperma depunându-se
pericervical (fig. 7).
Fig. 7 Inocularea spermei la oaie Metoda tactil-cervicală, în
prin metoda vaginală care dirijarea canulei seringii de
inoculare spre orificiul cervical se face
cu ajutorul degetului arătător al operatorului, femela fiind ridicată de trenul
posterior.
Când se face însămânţarea artificială cu spermă brută, se foloseşte sperma
cu mobilitate de cel puţin 70%, cu un volum minim al ejaculatului de 0,6 ml şi o
concentraţie de peste un miliard de spermatozoizi/ml.
Însămânţarea artificială cu material seminal congelat se practică foarte
puţin la aceste specii, întrucât rezultatele obţinute sunt slabe. Pentru însămânţarea
artificială a oilor cu material seminal congelat, în prealabil trebuie să se facă
decongelarea, după aceeaşi tehnică descrisă la taurine şi apoi să se
inoculeze.Înainte de însămânţare se face controlul mobilităţii spermei, care trebuie
să fie de minim 35%.
Tehnica de inoculare a spermei decongelate este identică cu cea aplicată la
însămânţarea artificială cu spermă brută sau cu spermă refrigerată.
O paietă conţine 0,5 ml spermă, respectiv două doze de însămânţare, o
fiolă conţine circa 1 ml spermă (4-6 doze) iar o granulă 0,1 ml (o doză).

1.7.3. Inocularea spermei la scroafă

1.7.3.1. Organizarea şi dotarea punctului de însămânţare
artificială (P.I.A.S.) cu activitate complexă

Optimizarea procesului de reproducţie la porcine prin însămânţare

artificială presupune următoarea structură organizatorică:
- centrul de recoltare, prelucrare, conservare şi difuzare a spermei,
organizat în cadrul Centrului de Reproducţie şi Selecţie a Animalelor, atunci când
femelele sunt dispersate pe o zonă mai extinsă, ceea ce necesită transportul
dozelor de spermă până la proprietarul scroafelor;

59
 - punctul de însămânţare artificială cu activitate complexă: recoltare,
prelucrare şi însămânţare artificială, în complexele de creşterea suinelor, în unităţi
şi ferme familiale cu un efectiv de 300-400 de scroafe şi scrofiţe de reproducţie.
În ambele cazuri trebuie să existe spaţii şi utilităţi necesare unei bune
activităţi:
- compartimente comune pentru vierii tineri, candidaţi pepinieri şi cu boxe
individuale pentru vierii folosiţi la reproducţie (pepinieri);
- sala de recoltare, prevăzută cu una sau mai multe boxe de recoltare,
instalaţii cu duşuri de mână cu apă caldă, pentru toaleta generală şi locală a
vierilor;
- laboratorul, dotat cu minim de aparatură şi instrumentar, necesare pentru
operaţiunea de recoltare, examenul, prelucrarea, ambalarea şi conservarea
spermei;
- compartimente comune pentru scroafele în aşteptare şi individuale pentru
cele care trebuie însămânţate şi însămânţate recent (două-trei săptămâni după
însămânţare).
Sperma recoltată se examinează în laborator, se diluează, repartizează în
doze (100 ml) şi se conservă la temperatura de 15oC sau la 4-5oC. Sperma brută
proaspătă, diluată sau diluată-refrigerată, se distribuie beneficiarilor, fiind
transportată în termosuri zootehnice, care menţin o temperatură constantă până la
beneficiar (15oC sau 4-5oC).

1.7.3.2. Descoperirea scroafelor în călduri

Depistarea femelelor în estru se face pe baza semnelor clinice, a

manifestării reflexului de imobilitate în prezenţa vierului încercător sau la
apăsarea pe spate de către om şi prin mijloace electronice bazate pe modificarea
caracteristicilor secreţiilor vestibulo-vaginale (pH-ul şi rezistenţa electrică a
mucoasei vestibulo-vaginale).
Metoda cea mai simplă şi cu bune rezultate constă în prezentarea zilnică a
femelelor cu modificări ale organelor genitale externe şi de comportament,
vierului încercător.În cazul în care scroafa acceptă saltul vierului, este sigur în
perioada de estru. Dacă acceptă acest salt de la prima încercare, momentul
declanşării estrului se stabileşte prin media intervalului scurs de la controlul
anterior. Dacă acceptă saltul vierului după a doua sau a treia încercare, debutul
estrului corespunde acestui moment. Cele mai bune rezultate se obţin atunci când
sunt deplasate scroafele (5-10) în boxa vierului şi nu invers.
În absenţa vierului încercător, starea de estru se poate stabili pe baza
modificărilor de comportament ale scroafelor (nelinişte, grohăituri caracteristice,
poftă de mâncare capricioasă etc.) şi ale organelor genitale externe (edemaţierea şi
congestia vulvei).
Un indiciu sigur al stării de estru este reprezentat de reflexul de imobilitate
al scroafei la presiunea exercitată de îngrijitor în regiunea lombo-sacrală sau a
flancurilor, o proporţie însemnată (20-30%) nemanifestând, totuşi, starea de
imobilitate în absenţa vierului.

1.7.3.3. Stabilirea momentului optim de însămânţare

Însămânţarea scroafelor trebuie să se facă în momentul cel mai prielnic,

încât spermatozoizii să ajungă la locul fecundaţiei înaintea descinderii ovocitelor
în urma dehiscenţei foliculilor maturi. Cum ovulaţia la scroafă are loc, în medie,

60
între 36 şi 44 de ore de la debutul estrului, evidenţiat prin apariţia reflexului de
imobilitate la saltul vierului, însămânţarea cea mai eficace se consideră că trebuie
făcută după un interval de 20-24 de ore de la manifestarea reflexului de
imobilitate. Acest aspect presupune ca acţiunea de descoperire a scroafelor în
călduri să se desfăşoare cel puţin de două ori/zi, dimineaţa şi seara. Repetarea
însămânţării se face cu scopul de a prinde ovulaţiile şi la scroafele cu o durată mai
mare a estrului. Când se fac două însămânţări într-un ciclu de călduri, cel mai bine
este ca prima inoculare să se facă la 15-20 de ore de la depistare, iar a doua la
interval de 10-12 ore de la prima.În cazul depistărilor făcute de două ori/zi (aşa
cum se practică cel mai frecvent) scroafele la care s-a stabilit starea de estru
dimineaţa, se însămânţează în seara aceleiaşi zile, iar scroafele care au fost
depistate seara, prima însămânţare se face în dimineaţa zilei următoare. Repetarea
însămânţării se face, aşa cum am menţionat mai sus, după 8-12 ore de la prima.
Dacă se face o singură depistare/zi (dimineaţa), prima însămânţare artificială
se face imediat după stabilirea reflexului de imobilitate pentru vier şi se repetă după
alte 24 de ore de la prima însămânţare (Feredean T.,1978). A treia însămânţare
artificială nu se recomandă decât în cazul scroafelor cu călduri prelungite până la 4-
5 zile precum şi pentru scroafele la care s-a constatat refularea spermei inoculată în
însămânţările anterioare. Scroafele cu estru prelungit (superestru) se recunosc prin
prelungirea peste limita fiziologică a modificărilor organelor genitale externe şi de
comportament specifice stării estrale, cât şi prin prezenţa reflexului de imobilitate la
vier.În asemenea cazuri, a treia însămânţare artificială se poate face la interval de
10-12 ore de la a doua inoculare a spermei.

1.7.3.4. Aparatura şi instrumentarul folosite pentru

însămânţarea artificială a scroafelor

Acestea sunt relativ simple.

Fig. 8 Instrumentar pentru însămânţarea cateterului este confecţionată dintr-
scroafelor (după O. Roşca, 1994)
La noi în ţară, în marea practică, se
foloseşte instrumentar confecţionat
din material plastic compus dintr-un
rezervor cu capacitate de 100 de ml si
un racord flexibil, care face legătura
cu un cateter (sondă) semirigid, lung
de 35-40 cm, prevăzut cu o olivă, sau
un adaptor tirbuşonat la extremitatea
care se introduce în lumenul cervical.
Acest tip de cateter poate fi
substituit cu unul confecţionat din
cauciuc, cu vârful tirbuşonat
refolosibil după sterilizare (fig.8).
Rezultate bune se obţin şi cu
instrumentarul de provenienţă
japoneză, compus dintr-o seringă de
sticlă cu o garnitură metalică şi cu
piston din cauciuc semirigid cu
capacitate de 80 ml. La seringi se
ataşează un cateter de cauciuc (40cm
lungime, 0,7-1,0 cm diametru). Tija
un cauciuc semirigid, prevăzută la
vârf cu o porţiune mult mai elastică.

61
 1.7.3.5. Inocularea spermei

Pentru însămânţarea artificială a scroafelor nu este necesar ca acestea să fie

contenţionate, mai ales pentru prima inoculare, care, de regulă, corespunde cu
reflexul de imobilitate .În unităţile cu flux tehnologic industrial, după depistare,
scroafele sunt menţinute în boxe individuale, unde se însămânţează şi rămân până la
un eventual ciclu de călduri (21 de zile). În cazul în care se foloseşte sperma brută,
după examinarea mobilităţii spermatozoizilor, se repartizează (prin simpla aspirare)
în recipientele din material plastic, într-un volum de 50 ml, iar recipientul, printr-un
tub de legătură din material plastic se adaptează la un cateter.
Când se foloseşte sperma diluată, după diluţie este aspirată în recipientele
din material plastic, sau în cazul seringilor, aspirată cu ajutorul acestora.
Recipientul cu spermă se păstrează o perioadă scurtă de timp, într-un
termos sau într-o etuvă reglată la 35-37oC. Pentru fiecare scroafă, se foloseşte
sperma dintr-un recipient, care se scoate din termos sau etuvă numai în momentul
inoculării.În cazul folosirii spermei diluate şi conservate la temperatura de 15oC
sau la 4-5oC, dozele cu material seminal se reîncălzesc la 35-37oC şi se menţin în
termos sau în vas cu apă caldă până în momentul inoculării. Operaţiunea se face
cu puţin timp înainte de inoculare, iar dozele se extrag din termos numai în
momentul însămânţării. Se execută toaleta vulvei şi a regiunii perivulvare cu un
tampon de vată îmbibat într-o soluţie
dezinfectantă, cateterul se lubrifiază
cu vaselină neutră şi se introduce în
conductul vestibulo-vaginal, uşor
orientat în sus, pentru a nu fi introdus
în meatul urinar (fig. 9). Când vârful
cateterului ajunge la nivelul
cervixului, se roteşte uşor spre stânga
în vederea fixării cât mai bine în
conductul cervical (mai ales cateterele
tirbuşonate). Recipientul cu spermă
se adaptează la cateter, prin
intermediul tubului de plastic, apoi se
presează uşor pereţii acestuia,
sincronizat cu timpii de relaxare a Fig. 9 Schema inoculării spermei la
musculaturii cervicale, eliminarea scroafă (după O. Roşca, 1994)
întregii doze de spermă durând unu-
două minute. Doza de material seminal este de 100 ml spermă diluată sau de
50 ml spermă brută şi un număr de 3-5 miliarde de spermatozoizi/doză.
În cazul folosirii spermei conservate prin congelare, dozele cu spermă
trebuie decongelate la o temperatură de 37-40oC, asemănător dozelor cu spermă
de la rumegătoare, apoi se inoculează ca atare sau completate cu un diluant înainte
sau imediat după inoculare, funcţie de recomandările care însoţesc dozele de
spermă congelate (paiete, tuburi, granule).

1.7.4. Inocularea spermei la iapă

Sperma de armăsar poate fi inoculată sub formă brută (imediat după
recoltare), diluată, proaspata sau conservată prin refrigerare sau congelare.
Decongelarea tuburilor de spermă se face prin scoaterea lor din container
şi trecerea într-o baie-marie, la temperatura de 40oC, timp de 45-50 de secunde.

62
După deschiderea tubului la unul din capete, se introduce vârful canulei sau
sondei în tub şi se aspiră sperma, care se inoculează într-un interval de timp cât
mai scurt.
Decongelarea granulelor se face prin introducerea lor într-un diluant,
menţinut la temperatura de 40oC. După diluare, se aspiră sperma într-o seringă
specială de însămânţare şi se depune pe traiectul căilor genitale ale iepelor în
călduri.
Instrumentarul pentru inoculare este constituit din sonde, confecţionate din
material plastic şi conectate la seringi sau recipienţi din material plastic. Se mai
pot folosi diverse pipete din sticlă, lungi de 50cm şi cu un diametru de 4cm,
catetere sau canule din cauciuc. Ca instrumentar ajutător este necesar un specul
vaginal şi o sursă de lumin
Inocularea spermei la iapă ridică probleme legate de momentul inoculării
în perioada de călduri, moment care se stabileşte cu multă greutate în practică.
Există numeroase oscilaţii ale duratei ciclului sexual la iapă, funcţie de
rasă, climă, tehnologie de creştere, exploatare, alimentaţie, zooigienă etc.
Iapa în călduri adoptă frecvent poziţia campată (specifică montei),
urinează puţin şi des, deschide şi închide succesiv vulva, cu proiectarea
clitorisului în afară, este neliniştită, foarte sensibilă, uneori devenind retivă.
În herghelii, depistarea iepelor în călduri se face prin intermediul
armăsarilor încercători la bara sau peretele de încercare. Aici, se aduce armăsarul
şi dacă iapa este în călduri, va manifesta comportamentul sexual menţionat şi nu
va încerca lovirea armăsarului. Măsurile de protecţie a muncii şi a armăsarului
impun obligatoriu verificarea iepelor în călduri la bara sau peretele de încercare,
altfel, iapa poate lovi armăsarul cu membrele posterioare, provocând leziuni grave
sau chiar fracturi ale membrelor care impun sacrificarea animalelor.
Iapa care urmează a fi însămânţată, se contenţionează cu ajutorul
platlonjelor şi iavaşalei sau se introduce într-un stand special (travaliu).
Inocularea materialului seminal presupune introducerea extremităţii libere
a sondei cateterului sau pipetei prin canalul cervical până la nivelul cavităţii
uterine unde urmează a fi depusă. Inocularea spermei se face prin două metode:
colposcopică sau cu speculul vaginal;
manuală sau tactil cervicală.
Metoda colposcopică pentru depunerea spermei la nivelul cavităţii uterine
a iepei în călduri, necesită folosirea canulei sau cateterului adaptat la seringă,
speculum vaginal, sursă de lumină.
În prealabil, se face toaleta vulvei şi a regiunii perivulvare cu ajutorul unui
tampon de vată sau tifon îmbibat în soluţie dezinfectantă. Operatorul însămânţător
depărtează pereţii vaginului cu ajutorul specului vaginal şi apoi intruduce cateterul
sau vârful sondei printre valvele speculului vaginal, prin canalul cervical, 10-12
cm şi apoi se depune sperma.
Metoda manuală (tactil-cervicală) presupune dirijarea vârfului sondei sau
canulei în canalul cervical, cu ajutorul mâinii introdusă în vagin, mâna fiind
protejată de o mănuşă din material plastic şi lubrifiată cu vaselină neutră. După
reperarea orificiului vaginal al cervixului, vârful sondei este dirijat în lungul
degetului arătător, pe o lungime de 10-12 cm prin canalul cervical în cavitatea
uterină. Prin apăsarea recipientului cu spermă sau pe pistonul seringii, sperma se
depune în uter. Prin aplicarea acestei metode există riscul infectării mucoaselor
vaginale şi cervicale cu flora microbiană introdusă în timpul explorării vaginale.
Doza de material seminal brut conţine minim 0,5 miliarde spermatozoizi
mobili iar volumul spermei brute este de 20 ml, iar a celei diluate 40-50 ml.
Inocularea spermei se face imediat ce iapa a fost depistată în călduri cu
repetare din două în două zile până la încheierea perioadei estrale, având în vedere

63
că durata medie a estrului este de 4-5 zile cu variaţii cuprinse între 4 şi 9 zile.Într-
o perioadă estrală, de regulă se fac două-trei însămânţări, la intervalul de timp
menţionat.
Sperma proaspătă ca şi cea conservată prin refrigerare se admite pentru
însămânţare artificială numai atunci când are o mobilitate minimă de 60%, iar
sperma congelată, o mobilitate minimă de 35-40%.
Având în vedere scopul creşterii cabalinelor, mai ales pentru curse, în
unele ţări, însămânţarea artificială la această specie este interzisă, fiind acceptată
numai în cazul experienţelor întreprinse în centrele de cercetare (Franţa).

1.7.5. Inocularea spermei la păsări

Inocularea spermei se face cu scop de cercetare, selecţie, ameliorare şi

practic. Păsările pot fi însămânţate artificial numai în perioada de ouat, în afara
acesteia, cloaca şi oviductul neputând fi exteriorizate.
La găini şi curci, însămânţările artificiale pot fi utilizate singure sau
combinate cu împerecherea naturală.
Organizatoric, activitatea de însămânţare artificială la găini, parcurge trei
etape (Sauveur B. şi colab., 1988).
Etapa I-a constă în recoltarea, condiţionarea şi inocularea spermei.
Etapa a II-a necesită mai multe mii de femele şi efectivul de masculi
necesar însămânţărilor artificiale. Prin aceasta se urmăreşte intrarea într-un anumit
program şi ritm de muncă suficient de rapid pentru a însămânţa 250-300 de
femele/oră/persoană, ceea ce presupune o bună organizare a muncii.
Etapa a III-a se referă la extinderea însămânţărilor artificiale la o scară
mai mare cu asigurarea unui ridicat nivel de fecunditate şi permanentizarea
personalului care deja s-a specializat în efectuarea însămânţărilor artificiale.
Dacă se practică însămânţarea cu spermă brută, aceasta se păstrează în
tubul, fiola colectoare iar atunci când se diluează, soluţia cea mai simplă este cea
de a recolta sperma direct în fiolele care conţin cantitatea necesară de diluant.
Inocularea spermei presupune folosirea unei aparaturi extrem de simple,
formată în principiu, dintr-o seringă din material plastic, cu capacitatea de 1 ml,
divizată în 100 de părţi, la care se ataşează o canulă din material plastic, cu o
lungime de 6-8 cm.Însămânţarea artificială poate fi executată şi cu ajutorul unei
seringi gradate, tip insulină şi echipată cu o canulă adecvată, sau sperma poate fi
ambalată în paiete din material plastic care conţin între 10 şi 50 de doze.
Cantitatea de spermă brută care se inoculează este de 0,05-0,1 ml la găini şi de
0,03 ml la curci. Se mai foloseşte şi inocularea cu material seminal diluat şi
congelat, aşa cum s-a specificat la diluarea şi conservarea spermei.
Timpul optim de însămânţare la păsări se referă la perioada sau chiar ora
din zi, în funcţie de ovulaţie şi formarea oului pe traiectul oviductului. Cele mai
bune rezultate la curcă se obţin în cazul însămânţării efectuate în a doua parte a
zilei (orele11-17). La raţe, în schimb, cele mai bune rezultate s-au obţinut în urma
însămânţării efectuate între orele 9-11 dimineaţa (Besulin, 1974; Davtian şi
colab., 1974 citat de I. Dumitrescu şi colab.). Printre factorii care influenţează
rezultatele inoculării spermei la păsări, cei legaţi de organismul femelei au o
importanţă deosebită, în specificul activităţii zilnice şi rolul complex al căilor
genitale la păsări. Rezerva de spermatozoizi în oviductul găinii este utilă pentru
aproximativ o săptămână.

64
 Tehnica inoculării spermei
La găini, inocularea spermei necesită aportul a două persoane: una
contenţionează, iar cealaltă efectuează însămânţarea propriu-zisă. Găina este
prinsă cu mâna stângă de fluiere şi ridicată la nivelul pieptului. Cu mâna dreaptă
se răsfrânge coada pe spate şi prin apropierea păsării de pieptul operatorului,
coapsele găinii presează abdomenul şi provoacă deschiderea cloacei. Cu degetul
mare al mâinii drepte se facilitează deschiderea oviductului pe partea stângă a
cloacei (G. Bâltan şi colab., 1969).
După evidenţierea oviductului, operatorul însămânţător introduce canula
de la seringa de însămânţare pe o adâncime de 2-3 cm şi inoculează întreaga
cantitate de spermă, după care presiunea asupra abdomenului încetează.
Evidenţierea oviductului se mai poate realiza şi prin contenţia găinii sub
braţul stâng şi apăsând abdomenul păsării spre cloacă. Presarea se face până la
ieşirea oviductului afară sub forma unui deget de mănuşă întors spre vârf. Cel de
al doilea operator execută însămânţarea la 1-3 cm de deschiderea oviductului (M.
Pop, 1963).
Pentru găinile crescute în baterii, îngrijitorul prinde pasărea de picioare şi
o contenţionează cu partea posterioară spre deschiderea cuştii sprijinind pieptul
acesteia spre marginea bateriei. Cu mâna stângă îndoaie uşor coada pe spate.
Operatorul însămânţător apasă cu mâna la baza cloacei, provocând prolabarea
oviductului, iar cu mâna dreaptă introduce canula în oviduct şi inoculează doza de
spermă la o distanţă de 5-6 cm (Ştefănescu şi colab.,1974).
La curci, tehnica de inoculare, în general, este asemănătoare cu cea
folosită la însămânţarea găinilor. După contenţionarea curcii şi evidenţierea
deschiderii oviductului, sperma se depune pe lumenul oviductului la 4-5 cm de la
deschiderea posterioară.

65
ÎNTREBĂRI RECAPITULATIVE

1. Care sunt principalele avantaje ale aplicării însămînţărilor artificiale la

animale?
2. În ce constă organizarea şi conducerea activităţii pe linia însămînţărilor
artificiale în ţara noastră?
3. Care sunt etapele selecţiei masculilor de reproducţie?
4. Ce semnifică spermograma?
5. Enunţaţi principiile diluării spermei şi detaliaţi tehnicile de diluare a spermei
animalelor.
6. Care sunt avantajele şi dezavantajele conservării spermei la diferite niveluri de
temperatură?
7. Care sunt metodele de inoculare a spermei la animalele domestice?

TEME

1. Studiul aparaturii de recoltare a materialului seminal la rumegătoare,

cabaline, suine şi păsări
2. Principiile şi tehnicile controlului spermei. Întocmirea spermogramei
3. Diluţia materialului seminal în vederea conservării la temperatura
laboratorului, prin refrigerare şi congelare
4. Modalităţi de conservare a spermei la rumegătoare, cabaline, suine şi
păsări
5. Inocularea spermei

REFERATE

1. Biotehnologia însămânţării artificiale la vacă

2. Biotehnologia însămânţării artificiale la oaie şi capră
3. Biotehnologia însămânţării artificiale la scroafă
4. Biotehnologia însămânţării artificiale la iapă
5. Biotehnologia însămânţării artificiale la păsări

66
 CAPITOLUL II

BIOTEHNOLOGIA TRANSFERULUI DE EMBRIONI LA ANIMALE

2.1. Importanţa transferului de embrioni

Importanţa transferului de embrioni poate fi zooeconomică şi ştiinţifică.

Importanţa zooeconomică. Lucrările de selecţie şi ameliorare a

efectivelor de animale sunt limitate de numărul redus de produşi care se obţin de
la o femelă în cursul vieţii sexuale şi de intervalul dintre generaţii. Transferul de
embrioni dă posibilitatea folosirii cu eficienţă crescută a rezervelor de ovocite de
la animalele de înaltă valoare zootehnică numite donatoare, prin provocarea
maturării şi eliberării mai multor gameţi femeli (poliovulaţie) cu obţinerea unui
număr mai mare de produşi de la aceeaşi femelă prin transferul embrionilor în
uterul femelelor receptoare. Astfel, în decursul vieţii sexuale este valorificată doar
o infimă parte din rezerva de ovocite cu care femela ajunge la maturitatea sexuală.
De exemplu, vaca începe perioada genitală cu o rezervă de circa 150000 de
ovocite ( în ambele ovare), rezervă care diminuă la circa 21000 la vârsta de 2-3
ani şi la circa 2500 la 12-14 ani. Numărul de ovocite eliberate în întreaga viaţă
sexuală nu depăşeşte 50, din care în condiţii normale rezultă maxim 10-12 viţei.
Prin asigurarea numărului corespunzător de animale primitoare, de la vacile
donatoare se pot obţine, în medie 3-4 viţei pe an, fiind cunoscute cazuri când în
condiţii de supraovulaţie, de la o vacă donatoare s-au obţinut 30-35 viţei.
Transferul de embrioni se practică şi pentru scurtarea intervalului dintre
generaţii. Prin instalarea gestaţiei, femela intră în repaus productiv (sub raportul
procreerii) pe întreaga durată a gestaţiei. În cazul practicării transferului de
embrioni, produşii de concepţie sunt transferaţi în alte organisme, ceea ce dă
posibilitatea obţinerii de noi produşi de la aceeaşi femelă în intervalul de timp în
care în mod normal, ar fi trebuit să fie gestantă.
Mai mult, în prezent se pot obţine gameţi şi de la tineretul femel prepuber
prin provocarea prin mijloace hormonale a maturării şi expulzării ovocitelor, care
vor fi apoi transferate în uterul femelelor receptoare. Scurtându-se mult intervalul
dintre generaţii, se accelerează ameliorarea efectivelor de animale.
Transferul de embrioni reduce considerabil costurile de transport, carantină
şi eventualele restricţii sanitar-veterinare în comerţul cu animale, prin conservarea
prin congelare a embrionilor. Totodată, prin practicarea transferului de embrioni,
se pot obţine produşi de la femelele valoroase dar cu diverse afecţiuni genitale
incompatibile cu menţinerea gestaţiei sau cu parturiţia.
De asemenea, prin transferul de embrioni se reduce intervalul de timp
necesar creării de noi rase de animale cu însuşiri morfo-productive performante
care pot forma linii de femele consangvine în vederea folosirii lor la încrucişări
industriale.
În sinteză, în practica de producţie, transferul de embrioni se aplică pentru
rezolvarea următoarelor probleme:
- reproducerea accelerată a animalelor de prăsilă, de calitate superioară, a raselor
rare, a animalelor din rezerva genetică a purtătoarelor unor însuşiri valoroase

67
(producţii ridicate, capacitate de utilizare intensă a furajelor, prolificitate mare,
longevitate productivă, rezistenţă la anumiţi factori nefavorabili etc.);
- obţinerea unui număr mare de descendenţi de la femelele cu producţii ridicate şi
cu durată prelungită de exploatare, în vederea creării de familii cu aceste însuşiri;
- raţionalizarea importului şi exportului animalelor valoroase, ca urmare a
transportului embrionilor congelaţi, înlăturându-se astfel barierele sanitar-
veterinare şi înlesnirea aclimatizării materialului importat, dezvoltarea lui
embrionară având loc în organismul primitoarelor;
- obţinerea de embrioni liberi de leucoză cu posibilitatea transferului acestora
femelelor leuco-negative;
- crearea unor bănci de embrioni în vederea păstrării raţionale a rezervelor
genetice, ceea ce este mai economic decât întreţinerea unor efective numeroase
din rezerva genetică.

Importanţa ştiinţifică
Transferul de embrioni reprezintă o biotehnologie prin intermediul căreia
se poate efectua, în condiţii optime, un aprofundat studiu ştiinţific al proceselor
intime legate de fecundaţie şi de influenţele maternă şi paternă asupra produsului
de concepţie. Totodată, poate fi studiată dezvoltarea embrionară la animale,
diversele abateri de la dezvoltarea normală, cauzele şi factorii care generează
mortalitatea embrionară.
Produşii obţinuţi prin transferul de embrioni permit studierea influenţelor
factorilor genetici şi ai mediului extern asupra dezvoltării embrionilor, ereditatea
grupelor sanguine, obţinerea de animale „mozaic de gene“, a concentrării mai
multor caractere pe acelaşi individ, a instituirii unei profilaxii şi terapeutici
genetice pentru unele boli de metabolism. Pe aceeaşi linie, transferul de embrioni
reprezintă baza unei noi generaţii de biotehnici care derivă din aceasta sau îi sunt
asociate: bisecţia embrionilor, sexajul, fecundaţia „in vitro“ clonarea, transferul de
gene, iar ingineria genetică foloseşte ca verigă importantă, în metodologie, această
biotehnologie.
Micromanipularea şi microchirurgia ovocitelor şi a embrionilor permit
desfăşurarea unei cercetări ştiinţifice interesante, şi obţinerea din punct de vedere
practic a unor înalte performanţe în reuşita transferului de embrioni, prin
transferul jumătăţilor de embrioni.
Sexul embrionului poate fi precizat cu multă acurateţe, baza investigaţiei
fiind dată de transferul embrionilor.
Reproducerea, fără contribuţia genetică a partenerului, se poate realiza prin
ginogeneză, fiind deja obţinuţi primii şoareci homozigoţi, (Groza I., 1996).
Aspecte similare ridică androgeneza în care se poate induce bispermia, adică
pătrunderea în ovul a doi spermatozoizi, cu retragerea ulterioară a pronucleului
femel şi în consecinţă diviziunea va continua numai în zona masculină (Groza I.,
1996).

2.2. Biotehnologia transferului de embrioni la vacă

La bovine, transferul de embrioni a devenit o biotehnologie de reproducţie

larg răspândită în lume. Tehnicile de lucru sunt foarte bine stăpânite, astfel încât
această modernă biotehnologie poate fi extinsă la aproape toate fermele de
creşterea vacilor din lume. Astfel, în Europa se obţin anual circa 100000 de

68
produşi prin transfer de embrioni, iar pe plan mondial circa 300000 de produşi,
extinderea biotehnologiei fiind limitată de costurile destul de ridicate.
Transferul de embrioni constituie, totodată, baza unei noi generaţii de
biotehnici, care derivă din aceasta sau îi sunt asociate, cum ar fi: bisecţia
embrionilor, sexajul, fecundaţia ,,in vitro“, clonarea, transferul de gene.
Transferul de embrioni presupune parcurgerea următoarelor etape (fig. 10):
selecţia şi pregătirea vacilor donatoare; selecţia şi pregătirea vacilor primitoare
(receptoare); sincronizarea estrului şi ovulaţiei la vacile donatoare şi primitoare;
inducerea poliovulaţiei şi însămânţarea artificială a vacilor donatoare; recoltarea
embrionilor; conservarea embrionilor; transferul embrionilor.

SELECŢIA DONATOARELOR SELECŢIA RECEPTOARELOR

TRATAMENTUL DE SUPEROVULARE

PMSG
- tipul
FSH-p
- doza
- schema de administrare
SINCRONIZAREA CICLULUI
SEXUAL CU AL
DONATOARELOR

I.A. A DONATOARELOR

RECOLTAREA EMBRIONILOR

CONSERVAREA EMBRIONILOR TRANSFERUL EMBRIONILOR

Fig. 10 Schema transferului de embrioni la animale

2.2.1. Selecţia şi pregătirea vacilor donatoare

Vacile donatoare de embrioni trebuie să întrunească la cel mai înalt nivel

caracterele zootehnice care interesează. De aceea, când se face selecţia
donatoarelor, se are în vedere evaluarea următoarelor criterii: performanţa
reproductivă, superioritatea genetică şi valoarea produsului obţinut prin transfer
embrionar.
Vaca donatoare va fi mai performantă reproductiv atunci când vârsta se
situează între 3 şi 10 ani, a născut anual câte un viţel, a rămas gestantă în maxim
două cicluri sexuale, ciclurile de călduri au o succesiune fiziologică şi nu a avut
antecedente ginecologice (distocii, retenţii placentare, infecţii genitale etc.).
Practic, criteriile care se au în vedere sunt: o stare ginecologică perfectă, intervalul
dintre parturiţie şi primul estru să fie mai mic de 60 de zile, intervalul parturiţie-

69
însămânţarea fecundă să fie mai redus de 80 zile iar indicele de gestaţie să fie mai
mic de 1,5.
Superioritatea genetică constă într-un ritm superior de creştere, înainte şi
după înţărcare şi un randament ridicat la sacrificare. În cazul vacilor de lapte,
însuşirile cu heritabilitate ridicată se referă la producţia de lapte, procentul de
grăsime din lapte şi conformaţia corporală.
Vacile donatoare trebuie să fie sănătoase, ele suportând mai multe
intervenţii de supraovulare şi recoltare de embrioni. O atenţie deosebită trebuie să
se acorde alimentaţiei raţionale a acestei categorii de vaci.

2.2.2. Selecţia şi pregătirea vacilor primitoare (receptoare)

Vacile receptoare de embrioni trebuie să fie sănătoase, fără afecţiuni

ginecologice, să aibă aceeaşi talie cu donatoarele, să fie apte să nască descendenţi
cu aceeaşi greutate la naştere ca donatoarele, avându-se în vedere că gestaţia
constituie un fenomen morfo-fiziologic complex ce presupune eforturi
suplimentare deosebite din partea organismului matern.
Cele mai bune rezultate se obţin atunci când transferul de embrioni se face
la tineretul femel în vârstă de 18-20 de luni.

2.2.3. Sincronizarea estrului şi ovulaţiei la vacile donatoare şi

primitoare

Sincronizarea ciclului sexual la vacile donatoare şi receptoare de embrioni

se poate realiza pe cale naturală sau medicamentoasă.
În cazul sincronizării femelelor prin mijloace naturale se urmăresc, în lotul
receptoarelor femelele care în mod spontan manifestă estrul în acelaşi timp cu
donatoarele. Principalul dezavantaj constă în fapul că sunt necesare multe animale
receptoare în aşteptare. Această modalitate de sincronizare s-a practicat în
perioada de început a transferului de embrioni, când s-au folosit pentru transfer
embrionii proaspăt recoltaţi. În această situaţie, în aceeaşi unitate trebuia să fie şi
vaci donatoare şi receptoare, iar transferul embrionilor trebuia să se realizeze într-
un timp relativ scurt (4-6 ore de la recoltare).
Sincronizarea estrului prin mijloace medicamentoase se bazează pe faptul
că se urmăresc succesiv două-trei cicluri de călduri la vacile donatoare şi se
stabileşte durata ciclului. În acest fel se poate calcula data apariţiei ciclului care
interesează în transferul de embrioni. În funcţie de data previzibilă, se acţionează
prin tratamente hormonale asupra unui grup de femele primitoare în vederea
inducerii căldurilor, sincronizate cu căldurile naturale ale donatoarei. În acest caz
se acţionează asupra donatoarei numai în ceea ce priveşte inducerea poliovulaţiei.
Sincronizarea medicamentoasă a ciclului estral al femelelor donatoare şi
receptoare de embrioni se realizează pe două căi: blocarea eliberării hormonilor
gonadotropi sau prin inducerea luteolizei.
Prima cale presupune folosirea progesteronului, sau a progestinelor
sintetice care prin retroacţiune îşi exercită efectul negativ asupra hipotalamusului,
diminuând nivelul hormonilor gonadotropi. (Vezi capitolul „Sincronizarea
estrului“).

70
 2.2.4 Inducerea poliovulaţiei şi însămânţarea artificială
a vacilor donatoare

Provocarea eliberării concomitente la aceeaşi perioadă de călduri a unui

număr sporit de ovocite decât cel caracteristic speciei se numeşte poliovulaţie
(supraovulaţie, superovulaţie) si este asigurata prin multiple scheme de tratament.
Tratamentele actuale aplicabile in „vitro“ se sprijină pe cunoaşterea
mecanismelor foliculogenezei, a efectului tonic al hormonilor gonadotropi (FSH,
LH) care intervin îndeosebi în ultima fază a creşterii şi maturării foliculare.
Potenţialul ovarian de foliculi terţiari (cu antrum) rămâne relativ constant (însă
variabil cu individul) de la vârsta de două luni până la 12 ani (Nibart M., 1991).
Fiziologic, la vacă, un singur folicul ajunge la maturitate în preajma ovulaţiei, în
timp ce, în timpul unui ciclu sexual, 10-20 de foliculi degenerează. Injecţia unui
hormon cu activitate de FSH împiedică atrezia unor foliculi şi stimulează
dezvoltarea şi maturarea simultană a mai multor foliculi terţiari, în cursul aceluiaşi
ciclu estral.
În prezent, două scheme clasice de tratament poliovulator sunt aplicate,
ambele bazate pe efectul foliculo stimulant al hormonilor gonadotropi: serul
gonadotrop de iapă gestantă, liofilizat şi standardizat - PMSG (Pregnant Mare
Serum Gonadotropin) denumit şi Ecvin Chorionic Gonadotropin (ECG), produs
de celulele corionice ale iepei gestante si hormonul de stimulare foliculară (FSH)
extras din hipofiza anterioară.
PMSG se extrage din serul sanguin al iepei gestante şi are o dublă
activitate: de tip FSH şi LH, raportul FSH/LH variază de la 1/1 la 1/5 (Saumande
J., 1987). Perioada de înjumătăţire destul de lungă - 120 ore - a acestui hormon
determină o uşurinţă în folosire, o singură injecţie de 2000-2500 U.I. i.m. fiind
eficientă în provocarea poliovulaţiei. La două-trei zile de la injectarea PMSG se
administrează i.m. o doză de 500-750 µg prostaglandină F2α, căldurile apărând la
circa 48-60 de ore de la injectarea prostaglandinei. Folosirea PMSG antrenează şi
unele efecte negative traduse prin creşterea foliculară şi secreţia ridicată de
estradiol şi după descărcarea preovulatorie de LH. Acest efect negativ poate fi
contracarat prin injectarea i.v. a unui anticorp anti PMSG concomitent cu prima
sau cea de a doua însămânţare artificială (de ex. Neutra -PMSG intervet).
Fecundarea ovocitelor se face, de regulă, prin însămânţarea artificială a
vacilor la un interval de 12 ore de la începutul estrului cu repetare la 8-12 ore
interval.
FSH – se prepară din extractele purificate parţial, provenite din hipofiza
mamiferelor - în principal de suine - care conţine FSH şi LH. Conţinutul în cei doi
hormoni şi raportul dintre aceştia variază cu lotul. Perioada de înjumătăţire foarte
scurtă (circa 70 minute a acestui hormon necesită injectarea lui bicotidian timp de
4 zile, în vederea menţinerii unui nivel sanguin suficient de ridicat. Funcţie de
preparatul comercial, raportul dintre FSH şi LH, de regulă variază de la 1 la 0,5.
Dozele totale care se administrează, în vederea producerii poliovulaţiei, variază de
la 28 mg la viţelele de lapte, la 40 mg pentru vaci, injecţiile făcându-se în ritm
descrescător, intramuscular sau subcutanat.
Preparatele care conţin aceşti hormoni au denumiri care diferă cu unitatea
producătoare: FSH-p, Stimufol, Ovaset, Follitropin, Superov, Ovagen, Pluset etc.
Ca şi cealaltă schemă de tratament, injectarea prostaglandinei F2α, în doză
de 500-750 µg se face la 48-72 de ore de la începerea tratamentului, estrul
apărând la circa 50-60 ore de la injectarea prostaglandinei. Fecundarea ovocitelor
se face prin însămânţarea artificială a femelelor supraovulate de două ori, la 12 şi
24 ore de la apariţia estrului.

71
 Scheme de tratament pentru inducerea poliovulaţiei
Preparatele medicamentoase care conţin hormoni gonadotropi sunt
injectate în faza luteală a unui ciclu natural sau indus, cel mai frecvent între ziua a
9-a şi a 13-a. Două zile după injecţia de PMSG sau concomitent cu a 5-a injecţie
de FSH, se injectează un analog de PGF2α (de ex. 0,5-1 mg Cloprostenol) care are
efect luteolitic permiţând ovulaţiile (fig. 11 şi 12).

POLIOVULA}IE
FSH p

ANTILUTEOTROP

2
IMPLANT
NORGESTOMET
9 zile

POLIOVULA}IE
PMSG
ANTI-PMSG

ANTILUTEOTROP

4 IMPLANT
NORGESTOMET
9 zile

Fig. 11 Scheme de inducere a poliovulaţiei la vacile donatoare de

embrioni (după M. Thibier şi M. Nibart, 1991)

O altă schemă de tratament constă în utilizarea progestinelor pe cale orală,

parenterală, intravaginal sau implant subcutanat timp de 9-12 zile. Progestinele
blochează axul hipotalamo-hipofizo-ovarian, prin neeliberarea de FSH dar mai
ales de LH. Cât timp receptorii axului hipotalamo-hipofizar se găsesc sub acţiunea
temporară a progestinelor, femela nu va manifesta estru şi nici nu va ovula. După
suprimarea terapiei cu progestine, se produce o descărcare rapidă, compensatoare
de Gn-RH, ceea ce va determina, în decurs de 5-7 zile, intrarea în călduri
ovulatorii a femelelor tratate. În cursul unui astfel de tratament de blocare a
ciclului se poate injecta hormonul de stimulare (FSH-p) bicotidian, în ritm
descrescător începând cu a 6-a zi de la blocarea ciclului, concomitent cu o injecţie
intramusculară de PGF2α.

72
 PMSG
PGF2α

PMSG
PGF2α
Gn-RH

PMSG
PGF2α
HCG

FSH
PGF2α

Fig. 12 Scheme de inducere a poliovulaţiei la vacile donatoare de embrioni

(după I.C.P.C.B. Baloteşti)

În cazul întrebuinţării preparatelor hormonale pe bază de PMSG, acestea

se injectează, împreună cu o doză de prostaglandină F2α, în a 6-a - a 7-a zi de la
introducerea implantelor, pesariilor etc., urmată de injectarea unei doze de anti
PMSG concomitent cu a 2-a însămânţare artificială (fig. 11 şi fig. 12).
O schemă mai simplă de provocare a poliovulaţiei constă în începerea
tratamentului cu hormoni gonadotropi în a 15-a, a 16-a zi a ciclului estral la viţele
şi în a 16-a, a 17-a zi a ciclului sexual la vaci, însă numărul de embrioni obţinuţi
este mult mai redus.
Rezultate bune în provocarea poliovulaţiei s-au obţinut prin injectarea unei
doze de Gn-RH la vacile poliovulate înainte de prima însămânţare artificială sau
concomitent cu aceasta, în vederea grupării ovulaţiilor.
Prin provocarea poliovulaţiei se pot obţine de circa 8-10 ori mai mulţi
embrioni, decât în cazul recuperării unui singur ou de la femelele nesupuse
tratamentului poliovulator (foto 18).

73
 Există o variaţie
mare în ceea ce priveşte
răspunsul la tratamentul
poliovulator, din partea
vacilor. Această variaţie
pronunţată se datorează
hormonului utilizat,
purităţii acestuia şi de
specificul individual al
femelelor. Cercetările au
relevat faptul că circa 10-
20% dintre vaci nu
răspund la tratamentul
poliovulator, alte 20-25%
răspund slab la un astfelde Foto 18 Ovare superovulate
tratament (1-3 embrioni
transferabili pe vacă tratată) şi doar 30-40% dintre vaci au un răspuns ideal la
tratamentul de superovulaţie furnizând 7-12 embrioni/vacă/tratament iar 5-10%
dintre femelele tratate furnizează mai mult de 20 de embrioni. În prezent,
stimularea ovariană pare a fi atins un anumit plafon întrucât, se colectează, în
medie 9-10 embrioni (limite între 0-50), iar cel al embrionilor viabili este de 5-6
(limite între 0-30), din care 3 congelabili (Nibart, Thibier, Chouke 1988).
În ceea ce priveşte repetarea tratamentelor de superovulaţie la aceeaşi
donatoare, s-a constatat că tratamentele pot fi repetate pe intervalul a mai multor
luni sau a mai multor ani. Producţia totală de embrioni de la aceeaşi donatoare
depinde de aceasta şi de ritmul de colectare .
Este necesar un interval de cel puţin 60 de zile după fătare în vederea
începerii tratamentului poliovulator. Unii cercetători constată o reducere a
numărului de embrioni transferabili o dată cu repetarea tratamentului cu PMSG,
fapt ce se explică prin formarea în organismul femelei tratate a anticorpilor anti-
PMSG şi reducerea categoriilor de foliculi sensibili la stimulare. Pentru a se evita
acest efect negativ, repetarea tratamentului trebuie să se facă la un interval de 54-
60 de zile şi să se intercaleze tratamentele pe bază de PMSG şi FSH-p.
Rezultatele tratamentelor de superovulare sunt influenţate de vârsta
femelelor, rasă, mascul, sezon, nivelul producţiei de lapte, starea generală, etc. De
regulă, viţelele produc un embrion viabil mai puţin decât vacile adulte.

2.2.5. Fecundarea ovocitelor

Ovocitele sunt fecundate în urma însămânţării naturale sau artificiale. De

regulă, se efectuează două însămânţări artificiale la interval de 12-24 de ore de la
începutul căldurilor observate clinic sau, sistematic, după 56 şi 72 de ore de la
injecţia cu PGF2α, sau după 36 şi 48 de ore de la retragerea implantelor sau
pesariilor.

2.2.6. Recoltarea embrionilor

Embrionii sunt colectaţi atunci când se găsesc în cornul uterin, după

ieşirea lor din oviduct (între zilele 4-5). Din motive sanitare şi de congelare se
preferă colectarea embrionilor încă incluşi în zona lor pelucidă (ies în a 9-a zi).

74
Cel mai frecvent, colectarea se realizează între zilele 6-8 după fecundaţie, de
regulă în ziua a 7-a.
Recoltarea embrionilor se face chirurgical şi nechirurgical. Mult timp,
metoda chirurgicală a fost singura utilizată. Tehnica operatorie presupunea
parcurgerea a două etape: laparotomia, cu exteriorizarea aparatului genital în
plagă şi recoltarea propriu-zisă a embrionilor prin spălarea cu un lichid cu o
compoziţie specială, a oviductelor (după un interval de timp mai mic de 3 zile
după însămânţare) sau a coarnelor uterine (după un interval de timp mai mare de 4
zile de la însămânţare). În prezent, metoda chirurgicală de recuperare a
embrionilor la vacă este abandonată, datorită inconvenientelor pe care le prezintă.
Astăzi, este generalizată metoda nechirurgicală de prelevare a embrionilor, a cărei
principiu constă în spălarea coarnelor uterine cu un mediu special preparat,
spălare care se realizează în condiţii de asepsie în a 7-a zi de la însămânţare.
Tehnica nechirurgicală de colectare a embrionilor s-a perfecţionat continuu, firme
specializate produc pe scară industrială mediul de recoltare, congelare,
decongelare şi întreaga aparatură necesară recoltării şi transferului embrionilor.
Tehnicile nechirurgicale de recoltare a embrionilor presupun mai multe
operaţii: contenţia femelei, anestezia, vidarea rectului, toaleta vulvei şi a regiunii
perivulvare, identificarea prezenţei corpilor galbeni pe ovar, introducerea
lichidului de spălare în lumenul coarnelor uterine, spălarea acestora, recuperarea
lichidului împreună cu embrionii, identificarea şi recuperarea embrionilor din
lichidul recuperat şi supus decantării şi aprecierea morfologică a acestora.
În condiţii de fermă, recoltarea embrionilor se face la locul unde se găseşte
femela donatoare,dupa contentia adecvata. Pentru a suprima durerea, se practică
anestezia epidurală cu 4-6 ml procaină 2% sau cu 10 ml ludocaină 1%, care
blochează nervii coccidieni şi ultimele perechi de nervi sacrali (S3, S4, S5). Acul se
introduce între prima şi a doua vertebră coccigiană sau între ultima vertebră
sacrală şi prima vertebră coccigiană, anestezia instalându-se după circa 10-15
minute şi durează în jur de 90 de minute, zonele insensibilizate fiind: coada,
anusul, rectul, vulva, vaginul şi uterul.
Se introduce, cu precauţiile de rigoare, mâna în rect, acesta se videază de
conţinut, apoi se apreciază răspunsul femelei la tratamentul poliovulator,
palpându-se cu atenţie ambele ovare şi numărâdu-se corpii galbeni (foto 19). În
cazul în care răspunsul la tratamentul de superovulare este pozitiv, se procedează
cu precauţie la introducerea cateterului de tip Folley cu două sau trei căi, prin
conductul cervical până în cornul uterin. Pentru rigidizarea cateterului, se
introduce pe lumenul acestuia un mandren (tijă metalică), care se menţine până se
ajunge în lumenul cornului uterin, apoi se retrage. Cateterul este introdus circa 5-8
cm de la bifurcaţia coarnelor uterine, pe unul dintre acestea, apoi se introduce de
la exterior, cu seringa, 8-15 ml de aer în scopul fixării cateterului şi pentru a
împiedica refularea din cervix a lichidului de spălare. Vasul din sticlă, ce conţine
lichidul de spălare se suspendă la 1,5 m de la sol şi, prin cădere, acesta ajunge prin
calea de admisie a cateterului în coarnele uterine. Irigarea acestora se face
continuu, calea de evacuare a lichidului este conectată, printr-un tub de plastic, la
vasul de colectare a mediului recuperat (de spălare).
Recuperarea lichidului de spălare se face prin calea de admisie (în cazul
cateterului cu două căi la care s-a adaptat o piesă în forma literei y) prevăzut cu
canal de admisie şi evacuare al lichidului, ramura de evacuare a lichidului fiind
conectată la un filtru de colectare a cărui orificii au un diametru de 75 µm, care
are rolul de reţinere a embrionilor, lichidul ce traversează filtrul fiind colectat
într-un recipient situat sub filtru.

75
Mediul folosit la spălarea unui corn
uterin se foloseşte la spălarea, în
acelaşi mod, a celui de-al doilea corn
uterin. Cantitatea de mediu care se
foloseşte pentru spălarea unui corn
uterin este de 300-500 ml, efectuându-
se irigări repetate şi un masaj
transrectal permanent al cornului
uterin perfuzat. Există diverse sonde
de recuperare a embrionilor,
imaginate de diverşi cercetători, care
se bazează pe acelaşi principiu
constructiv .
Între momentul recuperării
embrionilor şi cel al inoculări lor în
uterul receptoarelor, zigoţii trebuie să
fie menţinuţi în viaţă în condiţii
speciale şi să fie manipulaţi în cele
mai bune condiţii tehnice şi igienice.
În ultimii ani s-a generalizat folosirea
unei soluţii tampon fosfat - PBS –
(Fosfat bufferet salin) pentru spălarea Foto 19 Recoltarea embrionilor prin
coarnelor uterine şi pentru păstrarea metoda nechirurgicală
embrionilor recuperaţi.
Acest lichid are un pH de 7,2, o presiune osmotică de 290 miliosmoli şi
conţine multe săruri minerale, glucoză şi proteină (albumină bovină serică, 2-4 g/l,
sau ser de viţel fetal decomplementat 10%.
Toate mediile, soluţiile, serurile, enzimele şi substanţele crioprotectoare
care vin în contact cu embrionii trebuie să fie sterile. Tot materialul care nu se
aruncă (sonde colectoare, filtre, recipienţi din sticlă, sonde de transfer, etc.) care
necesită a fi sterilizate, se spală cu o soluţie de detergent netoxic, se clăteşte în apă
distilată, se usucă şi se înveleşte în hârtie în vederea sterilizării. Alegerea metodei
de sterilizare depinde de natura materialului (căldură uscată, căldură umedă,
substanţe antiseptice, vapori de formol etc.). Rezultatele recuperării embrionilor
depind în cea mai mare măsură de abilitatea şi antrenamentul operatorului.
Proporţia embrionilor recuperaţi, oscilează în medie, între 60-70% comparativ cu
numărul de corpi galbeni identificaţi pe ambele ovare. După colectarea
embrionilor se injectează donatoarei o doză de PGF2α, care are rolul de a liza
corpii galbeni, evitându-se astfel gestaţia multiplă.

2.2.7. Căutarea şi aprecierea calităţii embrionilor

După prelevarea embrionilor, vasul cu lichidul recoltat (100-150 ml) este

lăsat timp de 20-30 minute pentru decantare. Se îndepărtează supernatantul iar
stratul inferior în care se regăsesc şi embrionii recoltaţi, se transferă într-o placă
Petri cadrilată cu diametrul de 10 cm, (foto 20) sau se agită în mediu din filtrul
colector şi se toarnă în placa Petri. Recipientele de recoltare a mediului ca şi filtrul
folosit la recuperarea embrionilor se clătesc de două trei ori.
Examenul embrionilor în lichidul recoltat trebuie să se facă în cele mai
bune condiţii de asepsie, curăţenie şi la o temperatură constantă a laboratorului

76
(20o-25o). Embrionii bovinelor au un diametru de 150-190 microni, zona pelucidă
având o grosime de 12-15 µm. Pentru identificarea embrionilor, se examinează la
o stereolupă (grosisment 30-60 uneori 80-200) fiecare pătrat de la nivelul plăcii
Petri. (foto 21).

Foto 20 Placa PETRI cadrilată Foto 21 Căutarea embrionilor în lichidul

folosită la căutarea embrionilor de spălare cu ajutorul stereolupelor

O dată identificaţi, embrionii sunt transferaţi cu ajutorul unei seringi de

aspirare, la care s-a adaptat, printr-un tub de plastic, o micropipetă, în plăci Petri
mai mici, cu diametrul de 5 cm în care se găseşte mediul de spălare la care s-a
adăugat 20% albumină serică bovină (BSA). Operaţiunea se repetă de 3-5 ori,
embrionii fiind transferaţi dintr-o plăcuţă în alta, schimbându-se de fiecare dată
pipeta de aspirare. În cazul în care embrionii sunt destinaţi exportului, aceştia sunt
trecuţi prin zece astfel de băi de spălare. Amestecul crioprotectorului cu mediul de
conservare (PBS ±40% BSA sau 10-20% ser de viţel fetal) provoacă o creştere a
presiunii osmotice. Pentru a reduce şocul osmotic, embrionii sunt trecuţi succesiv
şi pe câte o durată de 5 - 10 minute în două-trei băi cu mediu de conservare cu o
concentraţie crescândă în crioprotector: glicerol 0,7 M şi apoi 1,4 M, DMSO sau
etilen glicol 0,5 M, 1,0 M apoi 1,5 M. Această trecere a embrionilor în mediul de
conservare cu adaos de crioprotector se face la o temperatură cuprinsă între+20oC
şi +30oC.
După ultima baie, adică în momentul în care este atinsă concentraţia finală
în crioprotector (de exemplu: etilen-glicol 1,5 M), embrionii sunt condiţionaţi
pentru congelare, fie în fiole de sticlă de 1,2 ml, fie în paiete de polipropilen de
0,25 ml (de tip paiete fine folosite la conservarea spermei). Paietele sunt
identificate individual. Există bancuri de identificare ce permit pe de o parte
închiderea ermetică a paietei şi care poartă (sunt inscripţionate) toate informaţiile
necesare.
Pentru fiecare paietă trebuie să se menţioneze: identificarea donatoarei,
rasa, data colectării, numărul de embrioni, centrul de producţie.
Procedura de umplere a paietelor comportă trei compartimente lichide
separate de bulele de aer. Aceasta limitează orice risc de pierdere a embrionilor în
momentul manipulărilor efectuate cu umplerea sau evacuarea conţinutului
paietelor.
Embrionii sunt încadraţi în mai multe categorii calitative: excelent, bun,
acceptabil, inferior, degenerat, ovocit nefecundat.
În cursul examenului sub stereolupă la un grosisment mai mic de 80,
embrionul este întors cu ajutorul unei micropipete de sticlă în vederea aprecierii
morfologiei sale din toate unghiurile, unele imperfecţiuni putând scăpa observaţiei
în anumite poziţii ale embrionului.
Zona pelucidă garantează protecţia embrionului, motiv pentru care ea
trebuie să fie perfect integră, fără fisuri şi perfect sferică. Gradul de dezvoltare
embrionară în raport cu ziua colectării este principalul factor luat în considerare.

77
Embrionii care prezintă o întârziere în dezvoltare mai mare de 48 de ore sunt
eliminaţi. Embrionii colectaţi în a şaptea zi de la debutul estrului trebuie să se
găsească în stadiul de morulă compactă/blastocist. Embrionii care conţin 16 celule
sau mai puţin, nu se reţin pentru transfer sau congelare, fiind într-o întârziere mare
a dezvoltării.
În stadiul de morulă compactă, limitele celulare sunt mai puţin distincte
întrucât blastomerele sunt strâns legate între ele şi dau un aspect de mure.
Prezenţa câtorva celule detaşate, în spaţiul perivitelin nu constituie un motiv de
eliminare întrucât majoritatea blastomerelor formează o masă sferică fără
opacitate marcantă.
În stadiul de blastocist, diversele structuri (blastocel, butonul embrionar,
trofoblastul) trebuie să fie vizibile şi să prezinte contururi bine delimitate.
Prezenţa blastomerelor în spaţiul perivitelin şi a unor granulaţii la
suprafaţa celulelor pot fi observate. Aceste anomalii asociate unei întârzieri în
dezvoltare, absenţei contururilor celulare sau unei opacităţi marcante ale
blastomerelor constituie criteriu de eliminare a embrionilor. Embrionii a căror
aspect este îndoielnic sunt conservaţi una-două ore apoi vor fi examinaţi din nou.
Excelent este considerat
embrionul perfect ca aspect morfologic
şi corespunzător vârstei (foto 22).
Embrionul bun calitativ prezintă unele
imperfecţiuni: zona pelucidă ovală,
dimensiuni mai mici ale embrionului,
întârziere în dezvoltare cu o zi, puţine
celule extrudate, mici. Embrionul
acceptabil este cel care este bine
conturat, însă prezintă unele
anormalităţi: un număr moderat de Foto 22 Embrioni buni pentru
celule excluse, dimensiuni mai mici, congelare
unele degenerări şi întârzierea cu o zi. Embrionul inferior prezintă diverse
degradări considerabile: celule veziculate, variabilitate mare în ceea ce priveşte
dimensiunile celulelor, întârzierea în dezvoltare cu două zile, absenţa compactării.
Embrionul degenerat prezintă degenerări evidente, iar ovocitele nefecundate sunt
cele care prezintă structură simplă a gametului femel, fără celulele rezultate din
segmentare (Seidel F.G. şi colab.,1991).

2.2.8. Conservarea şi deconservarea embrionilor

Embrionii pot fi conservaţi câteva ore „in vitro“ la 20oC într-un mediu de
conservare: PBS adiţionat cu 4 g/l albumină serică bovină, sau cu 10% ser de viţel
fetal decomplementat. În acest mediu, embrionii sunt menţinuţi până când sunt
transferaţi la receptoare. În cazul în care transferul nu se realizează în 6-8 ore de la
recoltare, se recomandă congelarea prin refrigerare a embrionilor, la o
temperatură de 0o-4oC într-un mediu de conservare identic. În acest fel embrionii
pot fi conservaţi una-două zile fără ca viabilitatea să fie afectată.
Conservarea de lungă durată a embrionilor – congelarea - rămâne cea mai
avantajoasă metodă de menţinere pentru un interval de timp practic nelimitat a
viabilităţii embrionilor. Pentru aceasta, embrionii, trebuie să fie menţinuţi în stare
solidă, în azot lichid, la temperatura de circa -196oC. La temperaturi mai scăzute
de -100oC, metabolismul celular este complet blocat, singura problemă mai
dificilă constând în atingerea acestor temperaturi fără a omorî embrionii. În timpul

78
congelării, intervin doi factori letali pentru embrioni: formarea gheţii intracelulare
şi concentraţia salină ridicată. Pentru a preîntâmpina efectul negativ al acestor doi
factori, metoda de răcire constă în deshidratarea parţială a celulelor şi evitarea
şocului produs de concentraţiile ridicate în săruri prin utilizarea unui Crioprotector,
în general glicerol cu o
concentraţie de 1,5 M (sau 10%
în volum) în mediul de congelare.
Ca agenţi criopro-tectori se mai
pot folosi: dimetilsulfoxid
(DMSO), etilen-glicol, glicerol,
propilen-glicol. În prezent sunt
numeroase aparate programabile
(freezere) care permit realizarea
unei curbe optimale de răcire (foto
23). Substanţele crioprotectoare (în
general polialcooli) sunt capabile
să pătrundă uşor în celule printr-o
simplă difuziune (osmoză), Foto 23 Model de freezer
întârziind formarea cristalelor de
gheaţă prin coborârea punctului de îngheţ. Totodată, substanţele crioprotectoare
limitează efectele negative ale concentraţiei saline ridicate, înlocuind o parte din
apa intracelulară atrasă prin creşterea presiunii osmotice extracelulare. Alţi
compuşi pot avea un rol protector faţă de membranele celulare (hidraţi de carbon,
polivinilpirolidon), (Baril şi colab., 1993).
Viteza de coborâre a temperaturii are importanţă mare în protejarea
viabilităţii embrionilor. Mediul care conţine embrionii (extracelular) este mai
bogat în apă decât mediul celular. Prin coborârea temperaturii, primele cristale de
gheaţă se produc mai întâi în mediul extracelular, ceea ce va antrena o ridicare a
concentraţiei în soluţie a fracţiunii necristalizate. Această concentraţie salină
ridicată va provoca ieşirea unei părţi din apa celulară, reducând în acest fel
formarea gheţii intracelulare. Dacă ritmul de răcire este prea rapid, apa
intracelulară nu poate ieşi în cantitate suficientă, cristalele de gheaţă se formează
în cantitate mare în interiorul celulelor şi aceste cristale îşi măresc talia lor în
timpul congelării şi decongelării distrugând structurile celulare. În cazul în care
ritmul de răcire este lent, deshidratarea progresivă a celulelor antrenează o
creştere importantă a concentraţiei în electroliţi, în mediul celular, modificând
proprietăţile fizico-chimice (efectul soluţiei), consecinţa fiind totdeauna pierderea
viabilităţii celulelor.
Astfel, integritatea celulelor vii după congelare este strâns legată de
dinamica apei intracelulare în timpul răcirii şi deci de viteza de congelare. În cazul
embrionilor, ritmul de răcire trebuie să corespundă pentru toate tipurile de celule
care-l compun. Rezultatele cercetărilor întreprinse pentru clarificarea aspectelor
referitoare la ritmul de congelare confirmă faptul că acesta trebuie să se
desfăşoare în două etape diferite: o congelare lentă, în două trepte: la început
4oC/min până la –6 –7oC şi 0,3-0,6oC/min între –7oC şi –30 –35oC, apoi o
congelare rapidă (bruscă) de la -35oC până la temperatura de păstrare -196oC.
Timpul de aşteptare al embrionilor din momentul recoltării şi până la
începerea congelării, nu trebuie să depăşească două-trei ore.
Protocolul de congelare a embrionilor bovini prevede următoarele:
- alegerea embrionilor - calitate excelent sau bun;
- timp de la recoltare până la începerea congelării: două-trei ore;

79
 - introducerea embrionilor în mediul de congelare la temperatura
laboratorului (20oC);
- introducerea embrionilor în paiete identificate (mediu, bulă de aer,
embrioni +mediu, bulă de aer, mediu);
- răcirea până la -6oC sau -7oC cu o viteză de 4oC/minut;
- inducerea cristalizării (palier 5-10 minute);
- răcirea până la –30oC sau –35oC cu o viteză de 0,3 - 0,6oC/minut;
- introducerea paietelor ce conţin embrionii, direct în azot lichid şi
stocarea lor (-196oC).
Paietele se vor păstra în permanenţă în azot lichid până în momentul
transferului la femelele receptoare. Durata stocării embrionilor în azot lichid nu
influenţează supravieţuirea ulterioară a acestora.

Decongelarea embrionilor şi înlăturarea crioprotectorului

Embrionii congelaţi la -35oC nu sunt decât parţial deshidrataţi, o anumită
cantitate de gheaţă se formează inevitabil în celule, în momentul imersiei în azot
lichid (-196oC). Pentru a se evita ca prin decongelare să se producă o creştere a
acestor mici cristale de gheaţă care să distrugă celulele, decongelarea trebuie să se
facă în timp, cât mai repede posibil (circa 2000oC/minut). Pentru aceasta, paietele
se scot repede din containerul cu azot lichid şi se introduc direct într-o baie de apă
la 37oC, unde se menţin circa 30 de secunde. Imediat după decongelare,
înlăturarea rapidă a crioprotectorului este indispensabilă supravieţuirii
embrionilor. Totuşi, celulele care conţin o concentraţie ridicată de crioprotector nu
trebuie să fie introduse direct într-un mediu izotonic, întrucât diferenţa mare de
presiune osmotică va provoca pătrunderea prea rapidă a apei în celulă, ceea ce va
risca să explodeze. De aceea, este necesară o îndepărtare progresivă a
crioprotectorului astfel încât ieşirea acestuia şi pătrunderea apei în celulă să fie
compatibile cu permeabilitatea membranei celulare.
Pentru aceasta sunt mai multe metode care realizează o rehidratare lentă a
celulelor embrionare.

Diluţia crioprotectorului pe etape constă în trecerea succesivă a

embrionilor prin băi cu concentraţii descrescânde în crioprotector (de ex: etilen
glicol 1,5 M, apoi 1,0 M, 0,5 M şi 0 M). Menţinerea embrionilor în fiecare baie
este de 5-10 minute. În acest caz concentraţia mediului în crioprotector este
inversă celei din perioada congelării. După înlăturarea lichidului de răcire,
calitatea embrionilor poate fi apreciată printr-un examen morfologic efectuat cu
ajutorul unei stereolupe (grosisment x80). În urma examenului morfologic, de
regulă sunt eliminaţi ca necorespunzători calitativ, 10-30% dintre embrionii
decongelaţi.
Diluţia crioprotectorului prin folosirea unui mediu care conţine sucroză are
la bază accelerarea ieşirii acestuia din celule. Molecula de sucroză având o
greutate moleculară mare (344) nu pătrunde în celule prin simplă difuziune;
prezenţa sa în mediu crează o mărire a presiunii osmotice din mediul extracelular,
ceea ce va determina o difuziune accelerată a crioprotectorului din celule. Pentru
aceasta, embrionii decongelaţi sunt introduşi direct într-o soluţie de PBS care
conţine 0,25-0,5 M sucroză, apoi în două-trei băi succesive de PBS înainte de
examinare şi transfer. Se poate realiza retragerea crioprotectorului prin
intermediul sucrozei, direct în interiorul paietei. Pentru aceasta, în momentul
introducerii embrionilor în paiete pentru congelare, alternanţa diverselor medii din
paietă este: la mijloc embrionul în mediu PBS+ etilenglicol 1,5 M, înconjurat de
bule de aer şi apoi la exterior PBS+sucroză 0,25 M. După decongelare paieta se

80
scutură în vederea amestecării mediilor pe bază de etilen glicol şi cele pe bază de
manoză, ceea ce va permite difuzia crioprotectorului în afara celulei în câteva
minute. Embrionii sunt transferaţi fără selecţie prealabilă, împreună cu conţinutul
paietei direct în uterul femelelor receptoare. Această metodă mai necesită unele
verificări.
Nivelul supravieţuirii embrionilor după decongelare este condiţionat de
mai mulţi factori: stadiul de dezvoltare a embrionilor, calitatea embrionilor înainte
de congelare, femela donatoare etc.
Embrionii transferaţi în stadiul de morulă realizează o proporţie de
supravieţuire „in vitro“ mai redusă (64%), comparativ cu cei transferaţi în stadiul
de blastocist (81%), (Martinez şi colab., 1985).
Congelarea nu trebuie aplicată decât embrionilor de bună calitate, caz în
care procentul de supravieţuire după transfer fiind uşor inferior (10%) faţă de
nivelul supravieţuirii obţinut după transfer direct, fără congelare.
Originea genetică a donatoarei pare a avea un rol însemnat asupra
aptitudinii embrionului de a fi congelat. Acelaşi efect denumit şi „efectul
donatoarei“ a fost demonstrat prin faptul că procentul de supravieţuire a
embrionilor congelaţi în aceleaşi condiţii poate varia de la 0 la 78% în raport cu
donatoarea.

2.2.9. Transferul embrionilor

O atenţie deosebită va fi acordată selecţiei femelelor receptoare, întrucât
condiţionează în mare parte rezultatele după transfer. Aşa cum s-a menţionat în
capitolul anterior, receptoarele trebuie să aibă o activitate sexuală ciclică, să fie
bine dezvoltate corporal, fără afecţiuni ale tractusului genital. Alegerea
receptoarelor poate porni de la viţele în vârstă de 18 luni cu condiţia atingerii a cel
puţin 2/3 din greutatea corporală a adultului. Transferul embrionilor se face cu
foarte bune rezultate şi la vaci adulte în vârstă de 3-6 ani dacă funcţia de
reproducţie s-a desfăşurat normal.
Examenul femelelor receptoare se completează cu aprecierea ultimului
estru, care trebuie să aibă loc între parametrii fiziologici (comportament sexual,
calitatea mucusului cervical, starea de sănătate a conductului vestibulo-vaginal şi
al orificiului vaginal al cervixului).
Pregătirea receptoarelor constă într-o sincronizare cât mai perfectă a
ciclului sexual cu cel al femelei donatoare. Se pot folosi femele receptoare, fie în
călduri naturale fie în călduri induse printr-un tratament de control al ciclurilor
sexuale (vezi cele menţionate anterior). O atenţie specială se va acorda depistării
ciclurilor (dimineaţa, prânz, seara) apoi se determină momentul exact al
începutului estrului. Înaintea transferului propriu-zis se face un examen transrectal
al ovarelor pentru a identifica corpul galben pe unul din ovare. Transferul
embrionului se va face în vârful cornului uterin adiacent ovarului pe suprafaţa
căruia este prezent corpul galben. Rezultate bune s-au obţinut şi prin depunerea
embrionului la circa 10 cm de la bifurcaţia coarnelor uterine în lumenul cornului
uterin ipsilateral ovarului cu corp galben. Înainte şi imediat după transfer se va
evita orice stres: vaccinări, tratamente antiparazitare, ecornări, lotizări,
tuberculinări, recoltări de sânge etc. Se va evita schimbarea bruscă a regimului
alimentar: de exemplu introducerea masei verzi primăvara 4 săptămâni după
transfer. Variaţiile climatice determină o creştere a mortalităţii embrionilor după
transfer. În cazul folosirii embrionilor proaspeţi, receptoarele se ţin într-un grajd
curat şi cât mai aproape de donatoare.
Transferul propriu-zis al embrionilor la femelele receptoare se realizează
prin două metode: chirurgical şi nechirurgical.

81
 Transferul chirurgical s-a aplicat în perioada de început şi a constat în
deschiderea cavităţii abdominale (pe linia albă sau în flanc), exteriorizarea
cornului uterin şi depunerea embrionului pe cornul uterin corespunzător ovarului
cu corp galben prin puncţionarea peretelui acestuia. Este o metodă laborioasă,
costisitoare, traumatizantă pentru femele, ceea ce a condus la abandonarea ei.
Metoda actuală care dă cele mai concludente rezultate este cea
nechirurgicală. Această metodă foloseşte calea vagin-cervix, asemănător
însămânţării artificiale. Pentru transfer se foloseşte un pistolet tip Cassou în care
se introduce paieta cu embrionul deconservat sau proaspăt recoltat. Pentru a se
evita contaminarea învelişului din material plastic al pistoletului Cassou pe timpul
traversării conductului vestibulo-vaginal, se fixează un al doilea înveliş din
material plastic care este secţionat pe toată lungimea sa. După ce pistoletul ajunge
în lumenul cervical, acest înveliş protector se retrage. Pentru a învinge rezisteanţa
cervixului (în această fază cervixul fiind închis) se folosesc uneori dilatatoare. La
circa 10 cm de bifurcaţie, pe cornul uterin corespunzător ovarului ce conţine
corpul galben, se depune embrionul, asemănător însămânţării artificiale. Această
metodă este exclusiv folosită în present. Traversarea cervixului trebuie să se
realizeze cu mare precauţie în vederea evitării lezionării mucoasei acestuia. În
vederea relaxării cervixului, a evitării contracţiilor organelor genitale se
efectuează anestezia epidurală cu 4-6 ml procaină 2%, sau alte preparate
medicamentoase cu efect similar.

2.3. Biotehnologia transferului de embrioni

la rumegătoarele mici

Ca şi la rumegătoarele mari, folosirea transferului de embrioni la

rumegătoarele mici se practică cu scopul multiplicării descendenţei femelelor cu
înalt potenţial genetic, introducerii de noi genotipuri prin importul de embrioni
congelaţi şi asigurării bazei morfo-fiziologice ale unui model modern de cercetări
fundamentale în reproducţia animalelor şi biologia celulară.
Reglarea şi controlul funcţiei de reproducţie la rumegătoarele mici sunt
influenţate considerabil de factorii de mediu. La latitudini mai mari de 35o,
rumegătoarele mici au un sezon de reproducere limitat, care începe către sfârşitul
verii şi se încheie către finele sezonului de toamnă. În decursul unui an, funcţia
sexuală la oaie se caracterizează prin alternarea a două perioade:o perioadă de
anestru fiziologic, cuprinsă între sfârşitul iernii şi începutul verii;o perioadă de
activitate sexuală, cu derularea mai multor cicluri sexuale, cuprinsă între sfârşitul
verii şi începutul iernii (10-14 săptămâni după cea mai lungă zi).
Anestrul fiziologic se datorează atât factorilor materni (anestru de lactaţie),
cât şi factorilor climatici (anestru sezonier), efectul acestor factori suprapunându-
se.
Periodicitatea sexuală sezonieră este atribuită influenţei modulatoare a
fotoperiodismului, temperaturii, umidităţii şi alimentaţiei asupra unui ritm ciclic
anual de bază, condiţionat genetic.
Factorul principal în stimularea funcţiei sexuale la oi este reprezentat de
reducerea progresivă a numărului de ore lumină, iar cel subordonat este scăderea
temperaturii şi schimbarea alimentaţiei.
Din punct de vedere reproductiv oile sunt considerate ca „animalele zilelor
scurte“. Fotoperiodismul reglează funcţia de reproducţie la oi prin intermediul
melatoninei, hormon secretat de glanda epifiză. Epifiza controlează momentul
apariţiei maturităţii sexuale şi sezonul de reproducţie. Melatonina reglează funcţia
de reproducţie prin schimbarea secreţiei hormonilor gonadotropi. O dată cu
micşorarea zilei lumină, secreţia melatoninei creşte şi activează funcţia sexuală.

82
 Factorii de mediu trebuie să aibă un anumit nivel pentru a influenţa pozitiv
funcţia de reproducţie: temperatura aerului 8-18oC, umiditatea relativă 65-85%,
durata zilei lumină - 4-7 ore. Alţi factori ai mediului ambiant (relaţiile dintre
indivizi, masculi/femele, femele/miei, nivelul alimentar) au un rol modulator în
blocarea sau declanşarea activităţii reproductive. Utilizarea acestor factori (de ex.
efectul „mascul“) permite să se controleze mai bine perioadele de reproducţie.
Gradul de ovulaţie variază în timpul sezonului de reproducţie. Nivelul
acestui indice este maxim la mijlocul perioadei sexuale. Oile ţinute la temperaturi
scăzute, în timpul verii, încep sezonul de reproducţie mai devreme decât cele care
în sezonul estival, au fost ţinute la temperaturi obişnuite acestui anotimp.
Oile expuse stresului termic în orele de dinainte sau de după estru, prezintă
tulburări de fecunditate. Variaţiile raţiei de hrană (date de variaţiile
disponibilităţilor alimentare) determină oscilaţii ale nivelului de fertilitate.
La latitudini medii, variaţiile fotoperioadei rămân factorul principal care
declanşează activitatea reproducţiei la oi (Thimonier J. şi colab., 1986).

2.3.1. Alegerea donatoarelor şi receptoarelor

Femelele care intră într-un protocol al transferului de embrioni trebuie să

fie selecţionate înaintea începerii operaţiilor propriu-zise.
Prima selecţie a donatoarelor se face după valoarea lor genetică pa baza
unor criterii apropiate aptitudinilor zootehnice cercetate la rasa respectivă. În
general, în alegerea donatoarelor se are în vedere ca acestea să se fi născut în
sezonul de reproducţie precedent, fără tulburări ginecologice, să nu fie gestante,
cu ovare normale, capabile să răspundă la tratamentul superovulator (examen
făcut prin ecografie sau endoscopie) (laparoscopie).
În cazul repetării tratamentelor de superovulare, se investighează, prin
probe de laborator, prezenţa sau absenţa anticorpilor contra hormonilor folosiţi la
tratamentul de superovulare. Femelele tratate de mai multe ori se pot imuniza
contra gonadotropinelor heterospecifice şi nu mai răspund la administrarea
preparatelor hormonale de acest tip.
În cazul folosirii nuliparelor, acestea trebuie să aibă o greutate corporală
de cel puţin 60% din greutatea femelei adulte şi să fie în vârstă de cel puţin 8-10
luni.
Înaintea lotizării, donatoarele (ca şi receptoarele) se supun mai multor teste
serologice pentru depistarea maladiilor contagioase, susceptibile a le afecta
(bruceloza, febra Q, clamidioza etc.). Acest criteriu este impus şi de legislaţia
sanitar-veterinară din mai multe ţări, care prevede pentru femelele donatoare să fie
indemne de boli contagioase. Lotizarea femelelor donatoare şi receptoare se va
face cu cel puţin două luni înaintea tratamentului, pentru a se evita efectele
negative ale stresului de adaptare la un nou mediu şi pentru a se instala o nouă
ierarhie în interiorul lotului reconstituit.
Donatoarele şi receptoarele trebuie să fie supuse unui tratament
antiparazitar cu spectru larg cu cel puţin o lună înaintea începerii tratamentului. În
cazul examenului coprologic pozitiv, tratamentul va fi în special dirijat contra
infestaţiei constatate.
Alimentaţia donatoarelor şi receptoarelor se va face după norme ştiinţifice.
Creşterea nivelului energetic alimentar pe durata a trei săptămâni care
precede folosirea la reproducţie (flushing) provoacă, la ovine, o creştere a
nivelului ovulaţiei pentru femelele supuse tratamentului de inducere a ovulaţiei şi

83
o diminuare a luteolizei premature pentru oile supuse superovulării. Practica
„flushing“-ului este recomandabilă atât pentru donatoare cât şi pentru receptoare
şi în special când alimentaţia nu acoperă în totalitate nevoile energetice.
La receptoare, nevoile nutriţionale suplimentare datorate gestaţiei, nu sunt
diferite de cele legate de o gestaţie naturală, dar ele trebuie luate în consideraţie
pentru a se evita avortul consecutiv subalimentaţiei.
În preajma fătării, o supraveghere atentă a femelelor previne mortalitatea
perinatală şi erorile de descendenţă (filiaţie).
Alegerea donatoarelor se face pe baza performanţelor genetice, starea
fiziologică şi sanitară. Donatoarele, în general, trebuie să fie de vârstă medie, să
aibă o carieră de reproducţie fără tulburări notabile, să fie sănătoase în urma
examenului clinic general şi ginecologic, făcut la trei luni înaintea transferului de
embrioni. Se respectă un interval de cel puţin 5 luni între ultima fătare şi începutul
tratamentului.
Alegerea receptoarelor se face, în general, după aceleaşi criterii ca
donatoarele, valoarea genetică nefiind luată în consideraţie. Nuliparele sunt cele
mai recomandate. În momentul transferului, receptoarele trebuie să fie în vârstă de
8-10 luni şi cu o greutate de cel puţin 60% din greutatea medie a femelei adulte
din rasa respectivă (30-35 Kg). În cazul în care receptoarele sunt achiziţionate,
acestea se integrează crescătoriei cu cel puţin trei luni înaintea începerii
tratamentului, pentru a se adapta la noile condiţii, după ce au fost alese pe baza
unor criterii stricte, întrucât femelele destinate reformei prezintă adeseori
probleme de reproducţie şi sanitare.
Cu trei luni înaintea transferului embrionar şi până la fătare se evită orice
tip de stres: alimentar, traumatic, profilactic, sanitar, social etc.

2.3.2. Sincronizarea estrului şi ovulaţiei la femelele donatoare

şi receptoare

Tratamentele hormonale specifice donatoarelor şi receptoarelor se fac

pentru a induce estrul şi superovularea (donatoarelor) sau ovulaţia (receptoarelor)
la un moment predeterminat. Aceste tratamente urmăresc de fapt un control
temporar al activităţii ovariene, prin mimarea, mai mult sau mai puţin, a
mecanismelor endocrine care controlează ciclul sexual.
Donatoarele şi receptoarele sunt supuse unei serii de intervenţii,
cronologic precise. Înainte de provocarea hormonală a superovulaţiei se impune
stabilirea cu exactitate a momentului apariţiei ciclului estral. Depistarea
manifestării căldurilor se face de două ori pe zi (dimineaţa şi seara) prin folosirea
berbecilor încercători de calitate. Pentru provocarea superovulaţiei, se folosesc oi
cu ciclu natural sau sincronizat.
Pentru standardizarea stării fiziologice a donatoarelor la începutul
stimulării şi mai ales sincronizarea intrării în estru la terminarea tratamentului
stimulativ, acestea sunt supuse unui tratament progestativ. La sfârşitul
tratamentului progestativ, stimularea creşterii foliculare se face prin administrarea
hormonilor gonadotropi cu scopul creşterii numărului de ovulaţii/femelă
(superovulaţie). Atât pentru sincronizare (tratamente progestative) cât şi pentru
stimularea ovarină (tratament gonadotrop) se folosesc mai multe variante.

84
 2.3.2.1. Tratamente progestative de sincronizare

Diferă prin substanţele progestagene folosite şi prin calea de administrare:

a) injecţii zilnice a câte 12 mg de progesteron intramuscular timp de 17-21
de zile la capră sau 12-14 zile la oaie;
b) implante vaginale, reprezentate de bureţi de poliuretan impregnaţi cu
60 mg acetat de medroxiprogesteron (MAP) sau 30-40 mg acetat de fluorogeston
(FGA) sunt în prezent cele mai folosite;
c) implante cu synchro-mat B (norgestomet-6 mg) care sunt inserate sub
pielea de la nivelul suprafeţei externe a urechii. Eficacitatea acestei căi de
administrare a progesteronului este asemănătoare celei a pesariilor vaginale.
Cel mai folosit tratament de sincronizare este cel care apelează la pesariile
vaginale impregnate cu FGA.
Durata tratamentului diferă în raport cu specia şi cu sezonul.
La ovine, oricare ar fi sistemul de impregnare folosit, durata recomandată
a tratamentului variază în funcţie de perioada anului: 14 zile în timpul sezonului
sexual şi 12 zile înafara sezonului sexual.
La caprine, durata tratamentului trebuie să fie de 17-21 zile (tratament
lung), fie 10-12 zile (tratament scurt) în asociere cu prostaglandinele.
În cazul tratamentului scurt, la caprele donatoare, durata acestuia este mai
scurtă decât cea a unui corp galben ciclic, de aceeea se intervine cu o injecţie de
PGF2α (50 µg Cloprostenol, Estrumate, Flavoliz etc), 48 ore înaintea tratamentului
progestativ pentru a liza corpii galbeni ce pot fi încă activi în momentul retragerii
suportului de progestagen.
d) sincronizarea estrului poate fi făcută fără a se realiza impregnarea
printr-un progestagen. Se poate induce luteoliza sincronă prin două injecţii, la
interval de 10-14 zile, de prostaglandină F2α, (50-100 µg de Cloprostenol etc).
Această metodă nu dă rezultate la femelele neciclice (în afara sezonului sexual),
iar pe de altă parte, procentul ouălor divizate este mai slab la femelele donatoare
decât în cazul unui tratament progestativ.

2.3.2.2. Tratamentele de stimulare ovariană

Stimularea creşterii foliculare pentru inducerea superovulaţiei donatoarelor

sau ovulaţiei receptoarelor survine cel mai adesea la sfârşitul tratamentului
progestativ, şi este realizată prin injecţii intramusculare de gonadotropine
hipofizare sau extrahipofizare.
Tratamentul gonadotrop pentru inducerea superovulaţiei poate fi efectuat
în cursul unui ciclu natural, prin începerea stimulării cu 48 de ore înaintea
momentului prezumat al luteolizei spontane, însă această metodă este ineficace în
perioada anovulatorie şi dificil de aplicat în cazul tratamentului mai multor femele
nesincronizate în prealabil.
Administrarea gonadotropinelor are loc, în general, la finele tratamentului
progestativ (ceea ce corespunde fazei foliculare a ciclului sexual), care va
determina o creştere a numărului de foliculi preovulatori şi la ovulaţia mai multor
foliculi.
Stimularea cu ajutorul PMSG constă într-o injecţie de 750-1500 U.I.
PMSG efectuată 48 de ore înaintea terminării tratamentului progestativ. Durata
relativ lungă a activităţii biologice (circa 4-5 zile), nivelul ridicat de PMSG încă în
circulaţie în preajma estrului provoacă o activitate foliculară anormală în acest
85
stadiu care perturbă mediul hormonal în timpul fecundaţiei şi a primelor faze ale
dezvoltării ouălor. Aceste efecte au drept consecinţă generală o slabă producţie de
embrioni de bună calitate şi ca urmare, acest hormon este din ce în ce mai puţin
folosit pentru inducerea poliovulaţiei. Repetarea tratamentului superovulator cu
PMSG determină o reducere accentuată a răspunsului ovulator.
Stimularea cu ajutorul FSH-ului este cea mai frecventă metodă folosită
pentru provocarea superovulaţiei la rumegătoarele mici.
Cantităţile de FSH care se administrează pentru a obţine superovularea sunt
adesea exprimate în mg standard Armour (1 mg Armour este o unitate a activităţii
unui test biologic ce corespunde a circa 10-14 µg de hormon FSH pur).
Administrarea FSH-p se face în zilele 2, 3 sau 4 după tratamentul
progestativ, în doză de 12-24 mg/femelă. Perioada scurtă de înjumătăţire (3-4
ore), face ca doza să fie repartizată în mai multe injecţii pentru a determina
superovularea. În intervalul de două-patru zile de la încheierea tratamentului
progestativ se injectează FSH-p, 4-8 injecţii, de două ori/zi, la interval de 10-12
ore, în doze descrescânde (trei zile de tratament).
Tratamentul de superovulare se poate face şi cu extracte hipofizare de
cabaline - HAP (horse anterior pituitary) - sau HMG (human menupausal
gonadotropin) care determină un răspuns ovulator şi o producţie de embrioni
similare celor observate după tratamentul cu FSH-p la caprine şi ovine, însă aceste
preparate sunt puţin disponibile.
Pentru provocarea superovulaţiei se poate asocia tratamentul pe bază de
PMSG cu cel pe bază de FSH-p. Pentru aceasta, se asociază 48 de ore înaintea
retragerii spongiilor vaginale cu o injecţie de 12-18 mg de FSH-p ce se
administrează în 6 injecţii sau într-o singură injecţie concomitent cu administrarea
de PMSG.
Răspunsul superovulator este condiţionat de mai mulţi fatori, între care
menţionăm: rasa, individul, apariţia anticorpilor în cazul repetării tratamentului,
tipul de hormon folosit etc.

2.3.2.3. Inducerea estrului şi ovulaţiei la receptoare

Programarea estrului la femelele receptoare se face printr-un tratament

progestativ identic celui folosit la donatoare. Atunci când transferul se face fără
interval (imediat), tratamentul progestativ al donatoarelor şi receptoarelor începe
în acelaşi moment, astfel încât să se găsească în acelaşi stadiu fiziologic în
momentul transferului embrionar.
O injecţie de PMSG se face către sfârşitul tratamentului progestativ:
injecţia cu PMSG se face cu 48 ore înaintea retragerii spongiilor vaginale la capră
şi în momentul retragerii acestora la oaie. Pentru caprele receptoare, injecţia se
face cu 48 ore înaintea retragerii bureţilor vaginali impregnaţi cu progestagene, iar
ovulaţia se produce cu circa 12 ore mai târziu decât la donatoarele supuse
aceluiaşi tratament asociat cu FSH-p. În acest caz, pentru receptoare se întârzie
terminarea tratamentului progestativ cu circa 12 ore în raport cu donatoarele care
au fost tratate cu progesteron asociat cu FSH-p.
La oile receptoare, injecţia de PMSG se face în momentul retragerii
spongiilor vaginale. Oile intră în călduri după circa 36 de ore, cu o întârziere de 12
ore, în raport cu donatoarele tratate cu FSH-p.
Costul total al tratamentului este de circa 150-225 ff.
Dozele de PMSG variază cu sezonul, vârsta şi nivelul producţiei de lapte
(caprine).
86
 La donatoare, variabilitatea momentului ovulaţiei este un factor limitant al
nivelului de fecunditate, mai ales critic în cazul folosirii spermei congelate.
Principalul criteriu folosit pentru depistarea începutului estrului este
manifestarea reflexului de acceptare a saltului masculului. Pentru a determina
practic debutul estrului, se foloseşte un mascul vasectomizat sau prevăzut cu şorţ,
care este pus în prezenţa femelei la interval de 4-6 ore, între 20 şi 60 de ore după
terminarea tratamentului progestativ. Insuficienţa libidoului la mascul poate fi un
factor limitant al eficacităţii detecţiei estrului.

2.3.3. Însămânţarea femelelor donatoare

Fecundarea donatoarelor poate fi făcută fie pe cale naturală, practicându-se

monta liberă sau dirijată, fie prin însămânţare artificială, când se poate întrebuinţa
sperma proaspătă sau congelată care poate fi depusă fie pe cale cervicală sau
direct în uter sub controlul endoscopic.
În toate cazurile este important să folosim masculii cu o fertilitate ridicată.
Monta a fost cea mai întrebuinţată metodă de însămânţare a femelelor
donatoare în cursul sezonului sexual atât la ovine cât şi la caprine, însă nu permite
folosirea raţională a masculilor valoroşi, repartiţia geografică a acestora fiind
neuniformă, aceştia fiind concentraţi în centrele în care se practică însămânţarea
artificială (depozite ORSA), când se practică monta liberă, masculii şi femelele
sunt lăsaţi împreună pe perioada estimată a căldurilor, pentru fiecare mascul
repartizându-se 3-4 femele. În cazul practicării montei dirijate, fiecare femelă
descoperită în călduri trebuie să fie dată la montă de cel puţin două ori la interval
de 10-12 ore. Momentul însămânţării artificiale cea mai eficace este între 12 şi 24
de ore de la începutul estrului.
Când se practică monta în contrasezon, absenţa sau slaba manifestare a
libidoului masculilor sunt cauzele nerealizării procentului de fecunditate normal la
femelele donatoare, la care se adaugă şi puterea fecundantă foarte scăzută a
spermei în această perioadă.
Însămânţarea artificială permite valorificarea spermei masculilor a căror
valoare genetică este cunoscută. Cercetările au demonstrat faptul că transportul şi
supravieţuirea spermatozoizilor în căile genitale femele sunt perturbate după
tratamentul progestativ şi/sau cu prostaglandine asociate şi a inducţiei ovulaţiei
(Evans şi colab., 1984).
Eficacitatea însămânţării artificiale endo- sau exocervicale la
rumegătoarele mici superovulate este sensibil redusă comparativ cu animalele
martor nesuperovulate. Nivelul ouălor divizate obţinute prin această metodă este
adeseori insuficient şi inferior celui obţinut după montă.
Mai mult, nivelul fecundaţiilor este strâns dependent de nivelul răspunsului
ovulator la tratamentul de stimulare.
La ovine, se foloseşte pentru însămânţare numai sperma proaspătă.
Conservarea spermei de berbec reduce sub 40% procentul de fecunditate a oilor
însămânţate pe cale cervicală. Doza de spermă este de 2x400x106 spermatozoizi
total în sperma proaspătă, sperma depunându-se la intrarea în cervix. Anatomia
cervixului nu permite trecerea instrumentelor clasice de însămânţare.
La caprine, conservarea spermei prin congelare este o practică curentă.
Sperma se depune pe canalul cervical la 48 şi 54 de ore (două însămânţări
artificiale) sau la 30, 48 şi 54 de ore (trei însămânţări artificiale) după sfârşitul
tratamentului progestativ. Totuşi, procentul ouălor fertilizate este scăzut, datorită

87
faptului că nivelul ridicat de estrogeni după un răspuns bun la tratamentul
progestativ, inhibă transportul spermatozoizilor pe căile genitale femele.
Însămânţarea artificială intrauterină, sub controlul endoscopic, este destul
de răspândită la rumegătoarele mici. Această tehnică permite folosirea spermei
congelate şi obţinerea unui procent de fecunditate ridicat pentru ovocite. Numărul
de spermatozoizi mobili/doză prin practicarea acestei tehnici poate fi redus la
circa 80-100 milioane şi se face o singură însămânţare artificială.
Însămânţarea artificială intrauterină se face la 48-60 de ore după sfârşitul
tratamentului progestativ sau la 20-24 de ore după începutul estrului la capre sau
la 32 de ore după începutul căldurilor la oi (87% embrioni viabili).

2.3.4. Recoltarea embrionilor

Operaţiile de colectare şi transfer a embrionilor sunt eficiente sub

anestezie generală, femelele fiind supuse, în prealabil, unei diete alimentare şi
hidrice în cursul a 24 de ore care premerg intervenţia chirurgicală.
Embrionii sunt recoltaţi prin „spălări succesive“ a celor două coarne
uterine în a 6-a sau a 7-a zi după începutul estrului.
Acest interval de timp relativ scurt în care embrionii pot fi recoltaţi, este
condiţionat de mai mulţi factori:
- trecerea embrionilor din lumenul oviductului în cel al coarnelor uterine
se produce începând cu a 4-a zi;
- pentru raţiuni sanitare, legislaţia prevede ca embrionul să fie transferat
înainte de a ieşi din zona pelucidă, care poate surveni începând cu a 8-a
zi;
- congelarea embrionilor se poate face cel mai bine când aceştia se găsesc
în stadiile de morulă compactă şi blastocist (a 6-a sau a 7-a zi de la
începutul estrului).
Mediul de colectare este PBS (phosphate buffered saline) cu adaos de 2%
albumină serică bovină sau de 10% ser de viţel fetal menţinut la 37oC.
Embrionii sunt recoltaţi aproape în exclusivitate, fie prin laparotomie
abdominală (metoda chirurgicală), fie sub control endoscopic (colectare prin
endoscopie sau laparoscopie).
S-a încercat colectarea embrionilor şi prin mijloace nechirurgicale, pe cale
cervicală, asemănător ca la rumegătoarele mari sau la cabaline, însă rezultatele
sunt foarte slabe, datorită traversării dificile a conductului cervical şi a
imposibilităţii manipulării coarnelor uterine prin palpare rectală.
Recoltarea prin metoda chirurgicală se face pe femela sub anestezie
generală, contenţionată pe o masă în decubit dorsal, cu o înclinare antero
posterioară de 35-45o.
Se face o incizie lungă de 8-10 cm pe linia albă înaintea ataşării mamelei.
Se exteriorizează coarnele uterine, se numără corpii galbeni de pe ambele ovare,
pentru a se aprecia răspunsul la tratamentul de superovulare (foto 29). În cazul în
care recoltarea se face după două-patru zile de la debutul estrului, majoritatea
embrionilor se regăsesc în lumenul oviductului. Un cateter cu un diametru de 1
mm se introduce circa 2 cm pe lumenul oviductului prin pavilion, apoi 4 ml de
PBS sunt injectaţi cu scopul de a-i antrena în coarnele uterine. Apoi se spală
coarnele uterine sau se recuperează la nivelul pavilionului oviduc-tului perfuzatul
injectat la baza coarnelor uterine .
În cazul în care recoltarea embrionilor se face în zilele 6-7, se spală fiecare
corn uterin cu ajutorul lichidului special introdus la acest nivel. Se face o puncţie

88
la baza coarnelor uterine, la nivelul ligamentului intercornual. Pe la nivelul
puncţiei se introduce o sondă Folley. Lumenul uterin la baza coarnelor uterine este
obturat, prin umflarea balonaşului situat la extremitatea sondei. Printr-un cateter
introdus la nivelul joncţiunii utero-tubare se injectează 40-50 ml de PBS,
recuperarea lichidului care antrenează şi embrionii făcându-se prin sonda Folley.
Mediul de spălare poate fi injectat la nivelul sondei Folley şi recuperat prin
cateterul introdus anterior (perfuzie anterogradă ) legat cu un tub steril plasat într-
o baie marină la 37oC. Se procedează la spălarea succesivă şi separată a celor două
coarne uterine apoi se introduce un antibiotic în cavitatea abdominală şi se închide
plaga de la nivelul coarnelor uterine şi al peretelui abdominal.
Această metodă este cea mai răspândită la rumegătoarele mici. Nivelul de
recuperare a embrionilor oscilează între 70 şi 90%, însă diminuă mult atunci când
se fac recoltări repetate de la acelaşi animal (52-24%) la ovine şi 65-42% la
caprine în cazul colectărilor 2 şi 3.
Recoltarea prin endoscopie (laparoscopie). Femela anesteziată se
contenţionează pe o masă de operaţie, în decubit dorsal, cu o înclinare antero-
posterioară de 30-45oC. O primă puncţie se face la 4-5 cm înaintea glandei
mamare şi la 10-15 cm la stânga liniei albe. Se introduce o canulă cu un diametru
de 7 mm, care poartă endoscopul. Se insuflă aer filtrat în cavitatea abdominală
pentru a separa viscerele de organele genitale. A doua canulă, cu un diametru de 5
mm, se introduce în partea opusă primei, în raport cu linia albă şi prin care se
introduce o pensă atraumatică pentru a manipula tractusul genital. Cu ajutorul
pensei, corpii galbeni de pe fiecare ovar pot fi număraţi. Un corn uterin se prinde
la nivelul ligamentului intercornual şi se puncţionează cu un ac având diametru de
2,5 mm.
A treia canulă, cu diametru de 5 mm, se plasează pe linia albă, la 15 cm de
prinderea glandei mamare. Prin această canulă se introduce o sondă cu trei căi
până în lumenul uterului. Balonaşul fixat la sondă este umflat cu aer prin
intermediul unei seringi cu scopul de a obstrua lumenul uterin la baza coarnelor
uterine. Extremitatea cateterului este deplasată cât mai aproape posibil de
joncţiunea utero-tubară. Pensa se fixează la nivelul istmului pentru a se evita
refularea mediului de colectare în oviduct.
Mediul de colectare se injectează prin corpul sondei (40-50 ml pentru
fiecare corn). Presiunea creată de lichidul introdus permite returul acestuia prin
cateter. Se poate folosi şi o sondă cu două căi. În acest caz, a doua puncţie se face
la vârful cornului uterin pe unde se inseră un cateter de injecţie, fixat la pensa
atraumatică. Mediul de colectare injectat prin cateter este recuperat prin sonda
plasată la baza coarnelor uterine. Proporţia de embrioni recuperaţi prin endoscopie
este inferioară cu 10-15% celei obţinute prin chirurgie, însă repetarea colectărilor
de la aceeaşi femelă prin endoscopie nu provoacă reducerea proporţiei de
embrioni colectaţi.

2.3.5. Examenul şi aprecierea embrionilor

Mediul de colectare recuperat după clătirea coarnelor uterine este turnat

într-o placă Petri cu fundul cadrilat care să uşureze cercetarea embrionilor la o
lupă binoculară. Embrionii depistaţi sunt aspiraţi cu ajutorul unei pipete fine sau a
unei seringi racordată la un tub transparent din plastic şi introduşi într-o cutie Petri
mai mică ce conţine PBS filtrat şi suplimentat cu 4% albumină serică bovină sau
10% ser de oaie sau de capră. Se apreciază calitatea embrionilor recuperaţi.

89
 Mediul de colectare şi examen a embrionilor este menţinut la o
temperatură de +25+27oC, clasificarea embrionilor făcându-se în următoarele
categorii: nefecundaţi, degeneraţi, retardaţi sau morulă compactă, blastocişti
tineri, blastocişti extinşi sau blastocişti ieşiţi din zona pelucidă. Viabili se
consideră embrionii care au o formă regulată, sferică, cu citoplasma omogenă,
înveliă transparent, blastomere de dimensiuni identice distribuite uniform. Foarte
importantă este şi stabilirea nivelului de segmentare, dat fiind că încetinirea
ritmului de diviziune constituie, în majoritatea cazurilor, dovada unui început de
degenerare a embrionilor.
Embrionii sunt clasaţi în excelenţi, buni, de calitate medie sau
necorespunzători. Numărul de embrioni degeneraţi creşte considerabil cu vârsta
acestora, începând cu a 5-a zi de la însămânţarea artificială. Abaterile de la
morfologia normală survin la animalele donatoare sub acţiunea nefavorabilă a
unor concentraţii ridicate de steroizi ovarieni. Majoritatea embrionilor
degenerează în stadiul de morulă până în ziua a 8-a. În practică se poate asigura
un procent ridicat de fătări alegându-se embrioni după atingerea stadiului de
blastocist.
În momentul colectării - în ziua a 7-a - unii embrioni de oaie şi capră pot
prezenta o uşoară întârziere în dezvoltare (morulă compactă) pe când alţii sunt
într-un stadiu de dezvoltare mai avansat (blastocist ieşit din zona pelucidă). La
capre, dezvoltarea embrionară precoce apare cu o întârziere de 12-24 de ore în
raport cu cea observată la oi. În ziua a 7-a după debutul estrului, proporţia
embrionilor în stadiul de blastocist ieşit din zona pelucidă este mai ridicat la oi
decât la capre (oaie: 95%; capră: 63%) (Meineche-Tillman, 1990 citat de G. Baril
şi colab., 1993).
Embrionii care au o întârziere în dezvoltare mai mare de 48 de ore sunt
eliminaţi.
În stadiul de blastocist, diversele structuri (blastocel, trofoblast, buton
embrionar) trebuie să fie vizibile şi să prezinte un contur bine delimitat. Prezenţa
blastomerelor în spaţiul perivitelin, a granulaţiilor la suprafaţa celulelor, absenţa
contururilor celulare vizibile sau prezenţa unei opacităţi evidente a blastomerelor,
constituie criterii de eliminare a embrionilor.
După aprecierea calităţii embrionilor, embrionii transferabili sunt trecuţi
prin 10 băi succesive de PBS în vederea înlăturării eventualelor bacterii sau viruşi.
Această practică este recomandată de Societatea Internaţională de Transfer
Embrionar şi conferă o siguranţă sanitară pentru stocarea sau folosirea unui
embrion sănătos.

2.3.6. Congelarea-decongelarea embrionilor

Într-un interval de timp care nu depăşeşte două ore de la colectare, după

clătire, embrionii sunt trecuţi prin mai multe băi succesive de PBS adiţionat cu
glicerol: 0,7 M (10 minute), apoi 1,4 M (10 minute) sau etilen glicol 0,5 M (5
minute), 1 M (5 minute), 1,5 M (5 minute), asemănător celor precizate la bovine.
Embrionii sunt condiţionaţi în paiete mici (0,25 ml) şi congelaţi treptat, scăderea
temperaturii mediului făcându-se cu circa 1oC/minut până la -7oC. În acest stadiu,
cristalizarea este indusă (vezi cele menţionate la congelarea embrionilor bovini),
apoi scăderea temperaturii se face cu câte 0,3oC/minut până la -35oC, după care
paietele sunt introduse direct în azot lichid.

90
 Decongelarea se face, ca şi la embrionii bovini, prin imersia paietelor cu
embrioni, timp de 30 secunde, într-o baie-marie la 37oC. Apoi embrionii sunt
trecuţi succesiv prin 3-4 băi de PBS, la care s-a adăugat crioprotector în
concentraţie descrescândă (invers decât la congelare): glicerol (1,0 M, 0,7 M, 0,3
M, 0,0 M); etilen-glicol (1,0 M, 0,5 M, 0,0 M). Aceasta permite o rehidratare
progresivă a celulelor embrionare.
Se apreciază iarăşi calitatea embrionilor, cei care au suferit în timpul
acestor operaţii fiind eliminaţi.

2.3.7. Transferul embrionilor la femelele receptoare

Transferul embrionilor trebuie să se facă într-un interval cât mai scurt de

timp de la recoltare (sub 4 ore) sau decongelare (30-40 de minute). Transferul se
realizează aproape în exclusivitate chirurgical, laparoscopic.

2.3.7.1. Transferul chirurgical

După anestezia femelei receptoare, se face o incizie de 7-8 cm în lungul

liniei albe, 3-4 cm înaintea ataşării glandei mamare. Se exteriorizează coarnele
uterine, se examinează ovarele pentru a se alege cornul uterin pe care urmează să
se facă transferul. Embrionii sunt aspiraţi într-un volum mic de PBS (30-50 µl),
aplicând principiul celor trei compartimente (vezi transferul de embrioni la
bovine), de regulă într-un cateter adaptat la o seringă de 1 ml. Diametrul extern al
capilarului-cateter trebuie să fie de circa 1 mm. Se puncţionează cornul cu un ac
cu vârful conic, apoi se introduce 2-3 cm capilarul fără a leza mucoasa şi se
expulzează uşor embrionii către treimea superioară a cornului uterin ipsilateral
ovarului care prezintă un corp galben funcţional.
De regulă, se transferă doi embrioni în acelaşi corn uterin. După transfer se
instilă în cavitatea abdominală 1000000 U.I. penicilină, peritoneul şi pielea fiind
apoi suturate (foto 24).

Foto 24 Transferul embrionilor la oile receptoare

(I.C.P.C.O.C. Palas-Constanţa)

91
 2.3.7.2. Transferul embrionilor sub controlul endoscopic

Receptoarea anesteziată este fixată în decubit dorsal pe o masă de

contenţie înclinată la 30-35oC. Se pregăteşte şi dezinfectează câmpul operator,
înaintea glandei mamare. Se face o puncţie în abdomen pe unde se introduce
canula endoscopului. Se insuflă puţin aer prin canulă pentru a se uşura
vizualizarea tractusului genital.
O a doua canulă este inserată în partea opusă primei, în apropierea liniei
albe, prin care se introduce o pensă de manipulare atraumatică. Cu ajutorul acestei
pense se controlează răspunsul ovulator pe fiecare ovar şi se alege cornul uterin pe
care urmează să fie transferaţi embrionii, corespunzător ovarului care are corpul
galben funcţional. Cornul uterin ales pentru transferul embrionilor este prins în
apropierea joncţiunii utero-tubare şi puncţionat cu un ac lung de 30 cm şi cu un
diametru de 1,5 mm, în prealabil inserat sub linia albă. Embrionii sunt cundiţionaţi
într-un volum de 30-50 µl (sistem cu 3 compartimente: lichid, aer,
lichid+embrion) într-un capilar lung de 70 mm, cu diametrul de 1 mm, adaptat la
o seringă de 1ml printr-un tub lung de 20 de cm. Capilarul şi furtunul sunt
introduse într-un tub metalic care asigură rigiditatea şi maniabilitatea ansamblului.
Printr-o a 3-a canulă plasată pe linia albă la 15 cm de la ataşarea glandei mamare,
capilarul de transfer este introdus în cavitatea abdominală, apoi, prin punctul de
joncţiune în lumenul uterin unde cei doi embrioni sunt depuşi cu atenţie. După
retragerea instrumentelor, se pulverizează un antibiotic la nivelul celor trei locuri
de puncţie a peretelui abdominal. După căpătarea dexterităţii necesare, transferul
prin endoscopie se poate face în 5-10 minute, iar traumatismul provocat este mult
mai redus decât în cazul transferului pe cale chirurgicală.
Procentajul de reuşită a transferului de embrioni prin cele două metode
variază între 70,5% şi 75,6% la caprine şi între 69% şi 74% la ovine.
Pentru reuşita transferului de embrioni la rumegătoarele mici, o condiţie
importantă constă în sincronizarea cât mai bună a ciclurilor estrale la donatoare şi
receptoare, astfel încât, să existe concordanţă între particularităţile dezvoltării
embrionului şi modificările mediului uterin.

92
ÎNTREBĂRI RECAPITULATIVE

1. Definiţi şi detaliaţi importanţa transferului de embrioni la animale.

2. Care sunt etapele transferului de embrioni?
3. Prin ce mijloace se poate realiza sincronizarea estrului şi ovulaţiei la femelele
donatoare şi receptoare de embrioni?
4. Care sunt schemele de tratament poliovulator la vaci?
5. Care sunt schemele de tratament poliovulator la oi?
6. Care sunt particularităţile recoltării embrionilor la vacă?
7. Care sunt particularităţile recoltării embrionilor la oaie?
8. Care sunt criteriile după care sunt evaluaţi calitativ embrionii recoltaţi de la
femelele donatoare?
9. În ce constau tehnicile de conservare a embrionior?
10. Care sunt tehnicile transferului de embrioni la vacă şi oaie?

TEME

1. Folosirea preparatelor hormonale pentru sincronizarea estrului si inducerea

poliovulatiei la rumegatoare
2. Recoltarea embrionilor la taurine
3. Evaluarea embrionilor la rumegatoare
4. Congelarea embrionilor
5. Transferul embrionilor la receptoare

REFERATE

1. Biotehnologia transferului de embrioni la taurine

2. Biotehnologia transferului de embrioni la ovine si caprine

93
 CAPITOLUL III

BIOTEHNICI DERIVATE SAU FINALIZATE PRIN TRANSFER

DE EMBRIONI

3.1. Fecundaţia „in vitro“

Este o biotehnică de actualitate, prin intermediul căreia procesele

fiziologice de maturare a gameţilor femeli şi de capacitare a spermatozoizilor,
fecundaţie şi cultură a embrionilor până la stadiul transferului acestora în
organismul femelelor receptoare, sunt dirijate şi se produc, parţial sau total, în
afara organismului femelei („in vitro“) în diferite medii de cultură. Această
biotehnică, deşi bazele teoretice şi practice au fost puse cu circa 4-5 decenii mai
înainte, a căpătat un interes mai deosebit în ultimele două decenii. Cu toate
preocupările destul de intense în acest domeniu, succesul înregistrat la mamiferele
domestice este destul de limitat.
La mamifere, fecundaţia fiind internă, analiza intimă a mecanismelor
implicate în acest proces biologic este delicată şi costisitoare. Fecundaţia „in
vitro“ constituie o biotehnică ce permite studierea „in vitro“ a interacţiunilor
dintre cei doi gameţi sub rezerva reproducerii artificiale a condiţiilor identice
existente ,,in vivo“. După cum s-a studiat la capitolul „Fecundaţie“, elementele
esenţiale ale acestui interesant şi complex proces, constau dintr-o serie de
interacţiuni între cei doi gameţi care, în final, conduc la unirea lor şi la
combinarea genotipurilor.
Principalele „secvenţe“ ale fecundaţiei se referă la:
- fixarea spermatozoizilor de zona pelucidă, urmată de străbaterea
acestei membrane;
- fuzionarea membranelor plasmatice ale celor doi gameţi;
- încorporarea spermatozoidului în ooplasmă şi activarea ovocitului;
- singamia.
În momentul ovulaţiei, ovocitul este captat de pavilion şi descinde de-a
lungul oviductului. La majoritatea animalelor de fermă, celulele coroanei radiata
sunt eliminate rapid după ovulaţie. Spermatozoizii dobândesc puterea lor
fecundantă în cursul înaintării prin tractusul genital femel. Numărul gameţilor
masculi care ajung la nivelul oviductului, în momentul ovulaţiei, este foarte
restrâns, astfel încât raportul dintre spermatozoizi şi ovocite la rumegătoare
variază de la 1 la 10. De asemenea, reacţia acrozomului spermatozoidului se
produce la nivelul zonei pelucide. În consecinţă, rolul oviductului este de a
asigura dezvoltarea embrionului până la stadiul de 8-16 celule, apoi acesta trece în
vârful cornului uterin.
Cercetările efectuate au relevat faptul că fluidul oviductului (sau lichidul
tubar) nu este un simplu transsudat sanguin, ci este un mediu cu unele însuşiri
fizico-chimice speciale: concentraţie mai ridicată a ionilor de K+ şi un nivel mai
scăzut al concentraţiei ionilor de Mg++, comparativ cu serul sanguin. Volumul
secreţiei tubare este hormono dependent. Lichidul tubar poate suferi unele
schimburi cu lichidul peritoneal.
În condiţii naturale, embrionul părăseşte oviductul, în general, după al 3-
lea clivaj, iar dezvoltarea zigotului la nivelul oviductului nu este strict specifică.

94
Astfel, embrionii bovini se dezvoltă în oviductul ligaturat de oaie sau iepuroaică.
Această dezvoltare a embrionului până la stadiul de blastocist la nivelul
oviductului chiar provenind de la altă specie, constituie un fenomen remarcabil.
Primele rezultate obţinute cu ovocite maturate „in vivo“ au fost obţinute în
anul 1954 la iepuroaică, în 1969 la şoarece şi în 1980 la bovine (Marquant B. şi
colab.,1991). Primul produs obţinut printr-o astfel de biotehnică este consemnat în
anul 1959 la iepure, 1978 la om şi în 1982 la bovine. În ceea ce priveşte produşii
rezultaţi prin fecundaţia cu ovocite maturate „in vitro“, în 1972 s-au obţinut primii
zigoţi de şoarece prin fecundarea ovocitelor cu spermatozoizi recoltaţi de la
nivelul epididimului; în anul 1973 s-au obţinut produşi la iepure prin fecundarea
ovocitelor cu spermatozoizi capacitaţi în uter; în anul 1986 s-au obţinut primii
miei, prin folosirea la fecundarea ovocitelor a spermatozoizilor ejaculaţi; în 1986
s-au obţinut primii viţei folosindu-se pentru fecundarea ovocitelor spermatozoizi
conservaţi prin congelare (Marquant B. şi colab.,1991).
După aceste prime succese înregistrate, fecundaţia „in vitro“ s-a
generalizat, după cum s-a văzut, la toate mamiferele de interes zootehnic, însă
obţinerea unui nivel ridicat de fecundaţie „in vitro“ s-a înregistrat mult mai târziu.
Nivelul relativ scăzut de fecundaţie înregistrat în perioada de început a aplicării
fecundaţiei „in vitro“s-a datorat în special, folosirii unei temperaturi inadecvate
acestei etape. S-a demonstrat că temperatura centrală la mamifere este de 39oC
ceea ce face ca nivelul procentului de fecundaţie înregistrat la incubarea gameţilor
la 37oC să fie extrem de scăzut.
Etapele fecundaţiei „in vitro“ sunt:
- obţinerea ovocitelor;
- maturarea „in vitro“ a ovocitelor;
- capacitarea spermatozoizilor;
- fecundarea şi cultura „in vitro“;
- transferul embrionilor rezultaţi.

3.1.1. Obţinerea ovocitelor

Sursele posibile pentru ovocite sunt:

- ovocite provenite prin puncţia foliculilor maturi de la femele cu estru
spontan sau superovulat, recoltate înainte sau imediat după ovulaţie;
- ovocite obţinute din foliculi imaturi, recoltate din ovarele femelelor
sacrificate sau ovariectomizate;
- ovocite rezultate din oviducte, imediat după ovulaţie. Prima şi a treia
sursă de ovocite sunt limitate, deoarece numai un număr mic de foliculi se
maturează şi ovulează spontan, sau numai un număr relativ restrâns de foliculi pot
fi activaţi prin injectarea hormonilor gonadotropi. Ovocitele mature pot fi
recoltate din foliculi maturi sau din oviduct în primele 6 ore de la ovulaţie, plasate
într-un mediu Krebs-Ringer şi incubate la 38oC, umiditatea relativă de 100% şi
5% atmosferă de CO2.
Ovocitele obţinute prin puncţia ovarelor provenite de la animalele
sacrificate la abator sau a ovarelor obţinute prin ablaţia acestora, constituie o sursă
importantă de gameţi femeli, însă aceste ovocite necesită a fi maturate ,,in vitro“.
Puncţia foliculilor pe animalul viu permite folosirea donatoarelor de ovocite cu
potenţial genetic cunoscut. Pentru recoltarea ovocitelor în astfel de condiţii se mai
poate folosi un endoscop, cuplat la un sistem de aspirare, în vederea prelevării
lichidelor foliculilor cu un diametru de 2-6 mm, de la vaci stimulate sau nu cu

95
hormoni gonadotropi exogeni. De asemenea, puncţia foliculilor, ghidată prin
ecografie transvaginală permite colectarea fluidului folicular şi a complexelor
ovocite-cumulus. Această tehnică poate fi repetată de mai multe ori în cursul
aceluiaşi ciclu, fără a afecta fertilitatea ulterioară a femelei donatoare.

3.1.2. Maturarea „in vitro “ a ovocitelor

Ovocitele prelevate din foliculii antrali, prin laparotomie sau sacrificarea

femelelor, reiau spontan meioza dacă sunt plasate într-un mediu special de cultură,
la 38oC, incubate într-o atmosferă de 5% CO2. Prezenţa unui cumulus compact şi
intact în momentul cultivării ovocitelor favorizează reluarea meiozei pentru
majoritatea ovocitelor. Studii de microscopie electronică au arătat că celulele
cumulus-ului emit numeroase prelungiri ce traversează zona pelucidă şi stabilesc
legături funcţionale complexe cu citoplasma ovocitului. Aceste legături, parţial
sunt întrerupte, după 3 ore de cultură a ovocitului în mediul special, pentru ca
după 16-18 ore de cultură, contactele dintre celulele cumulus-ului şi ovocit să
dispară complet. Ruperea membranei nucleare se produce după 6-12 ore de
cultură şi emiterea primului globul polar după 24 de ore. Aceste transformări
nucleare, ce deosebesc maturarea „in vitro“ a ovocitelor, modificări observabile
prin tehnici histologice, sunt însoţite de modificări citoplasmatice mult mai greu
de decelat prin mijloace actuale de investigare. S-a dovedit, prin multiple
experienţe, că ovocitele cultivate în foliculul lor se maturează asemănător celei
observate ,,in vitro“.
La oaie, Staigmiller şi Moor, 1984 (citaţi de Marquant B., 1991) au arătat
că adăugarea unei suspensii de celule obţinute din granuloasa foliculilor ovarieni
în mediul de cultură, permite o maturare normală a ovocitelor. La vacă, nivelul
maturării ovocitelor în medii cu sau fără adaos de celule din granuloasă, nu
variază mult, însă prezenţa acestor celule permite restabilirea potenţialului de
dezvoltare a ovocitelor după fecundaţia „in vitro“.
Ovocitele obţinute prin puncţia foliculilor dispuşi mai în profunzimea
cortexului ovarian au un potenţial de maturare şi dezvoltare ulterioară mult mai
slabe, comparativ cu ovocitele obţinute prin puncţia foliculilor mari, maturi,
situaţi la suprafaţa ovarului.

3.1.3. Capacitarea spermatozoizilor

Spermatozoizii mamiferelor nu sunt capabili de fecundare a ovocitelor, din

momentul ejaculării. Spermatozoizii trebuie să parcurgă o perioadă de pregătire,
numită „capacitare“, care are loc „in vivo“, în tractusul genital femel. Capacitarea
este o etapă pregătitoare necesară, în urma căreia spermatozoizii dobândesc
capacitatea de a se fixa pe zona pelucidă a ovocitului şi suferă, apoi, reacţia
acrozomului.
Studiile de microscopie electronică au arătat că în decursul etapei de
„capacitare“ au loc două fenomene mai importante:
- modificări la nivelul membranelor spermatozoidului şi acrozomică
externă, precum, migrarea proteinelor de acoperire cu formarea de zone libere de
proteine, ceea ce permite fuziunea membranelor plasmatice şi acrozomică externă,
în momentul reacţiei acrozomului. Prin orificiile create, se elimină o cantitate din

96
colesterolul care antrenează o diminuare a raportului colesterol/fosfolipide,
asociate unei permeabilităţi membranare crescute pentru ionii de calciu. Pe baza
acestei constatări, toate mediile de capacitare folosite au în comun prezenţa
serului albuminic, care este un acceptor de colesterol;
- modificarea mişcării spermatozoidului care, din liniară (prin înşurubare)
traiectoria devine, mai mult sau mai puţin circulară, mişcare ce se datorează
creşterii permeabilităţii pentru ionii de calciu. Amplitudinea mişcărilor cozii se
măreşte, spermatozoidul fiind calificat ca „hipermobil“.
Diversele medii şi tehnici întrebuinţate pentru capacitarea spermatozoizilor
,,in vitro“ au în vedere faptul de a permite spermatozoizilor să sufere toate aceste
modificări şi mai ales să le menţină o mobilitate ridicată.
Capacitarea spermatozoizilor s-a obţinut prin incubarea acestora la 37oC,
timp de una-două ore, într-un mediu cu o forţă ionică crescută, ceea ce a dus la
detaşarea proteinelor de acoperire. Aplicarea acestei tehnici la sperma recoltată
prin ejaculare de la taur, a permis obţinerea unui procent de fecundaţie ridicat şi
naşterea de viţei normali, după transferul embrionilor obţinuţi prin fecundarea
gameţilor în astfel de medii. Diversele studii întreprinse pe această problemă, au
arătat că fenomenul de capacitare a spermatozoizilor ,,in vitro“ este mult diferit de
cea realizată „in vivo“. În oviduct, în condiţii naturale, fecundaţia are loc în
absenţa celulelor din cumulus, pe când „in vitro“ ovocitele nude, în momentul
contactului cu spermatozoizii sunt fecundate într-o proporţie foarte scăzută
comparativ cu ovocitele înconjurate de celule din cumulus. Aceasta presupune că
celulele din cumulus au probabil un rol în capacitarea „in vitro“ a
spermatozoizilor.
Majoritatea cercetătorilor care se ocupă de aspectele fecundaţei „in vitro“
folosesc sperma congelată, cu rezultate bune. Alte medii capacitante pentru
spermatozoizi sunt cele care conţin ionoforul calcic, asociat sau nu cu cafeina.
Totodată, cafeina pare a fi un agent capacitant mai apropiat de condiţiile naturale,
deoarece această substanţă se găseşte pe traiectul căilor genitale după ovulaţie. S-a
dovedit că spermatozoizii de taur posedă receptori pentru heparină, aceştia
acţionând în funcţie de doză şi uşurează pătrunderea calciului în spermatozoid. Se
mai foloseşte, în mediile capacitante, lichidul folicular, care, între altele, conţine şi
heparină.
Un nivel de capacitare satisfăcător se obţine atunci când se practică o
concentraţie ridicată de spermatozoizi în mediu, care trebuie să fie de 3-4 miliarde
spermatozoizi/ml, când nivelul fecundaţiei atinge 87% dintre ovocite.

3.1.4. Fecundaţia şi cultura „in vitro“ a embrionilor

Fecundarea se realizează prin cultura timp de o zi într-un mediu special a

0,1ml suspensie de spermatozoizi, cu concentraţie ridicată, împreună cu ovocite
mature, în atmosferă de 5%CO2, 5%O2 şi 90%N2.
După 24 de ore de cultură împreună cu spermatozoizii, ovocitele fecundate
sunt transferate într-un mediu special în vederea dezvoltării ulterioare. Ovocitele
se examinează la stereolupă şi sunt considerate ca fecundate atunci când se
constată:
- prezenţa spermatozoizilor în spaţiul perivitelin;
- prezenţa spermatozoizilor în ovoplasmă;
- prezenţa pronucleilor şi apariţia segmentaţiei.
„In vivo“, după fecundaţie, embrionul începe dezvoltarea sa în oviduct,
înainte de a ajunge în uter (ziua 4-5 la rumegătoare), în stadiul de morulă tânără.

97
 „In vitro“, oricare este mediul de cultură folosit, zigoţii se blochează în
stadiul de 8 celule. Pentru mult timp, singurul mijloc de a asigura depăşirea
stadiului de blocaj evolutiv l-a constituit transferul tinerilor zigoţi în oviductul
unei gazde intermediare (iepuroaică) şi apoi transferul lor în uterul femelelor
receptoare. Experienţele au dovedit că cultura zigoţilor de rumegătoare pe un strat
de celule tubare a permis obţinerea blastociştilor şi a nou-născuţilor, după
transferul la femelele receptoare. Totodată s-a demonstrat că prin co-cultura
zigoţilor cu vezicule trofoblastice permitea la circa 40% dintre aceştia să
depăşească stadiul de 8 celule (Marquant B. şi colab.,1991).
Ouăle fecundate „in vivo“, apoi cultivate „in vitro“ pe un strat de celule
prelevate din oviduct, unde evoluează până la stadiul de blastocist, au un aspect
morfologic normal. Totuşi, studiul histologic atent a relevat faptul că aceşti
blastocişti, comparativ cu cei prelevaţi „in vivo“ sunt alcătuiţi dintr-un număr
redus de celule, multe dintre ele pe cale de degenerare. Însă cultura embrionilor pe
un strat de celule tubare, apoi uterine şi adiţionarea unui factor de creştere în
mediul de cultură a permis realizarea unui nivel important de dezvoltare până la
stadiul de blastocist ca şi a unui nivel de ecloziune, comparabil cu cel realizat „in
vivo“. Aceste experienţe demonstrează faptul că oviductul nu îndeplineşte un rol
specific în trecerea de la starea de blocaj spre stadiile ulterioare evolutive,
deoarece blastociştii pot fi obţinuţi şi prin co-cultura cu celule trofoblastice, din
cumulus, ca şi cu celule prelevate din oviduct.

3.1.5. Transferul embrionilor obţinuţi „in vitro“

Se face în uterul femelelor receptoare, din aceeaşi specie, a cărei ciclu

sexual a fost sincronizat cu vârsta embrionilor obţinuţi „in vitro“.
Nivelul gestaţiei în urma transferului sincron şi asincron a embrionilor bovini
cultivaţi „in vitro“ arată că nivelul cel mai ridicat de gestaţii s-a obţinut atunci
când femelele receptoare se găsesc în ceea ce priveşte ciclul sexual, în întârziere
cu una-două zile, faţă de vârsta teoretică a embrionilor (tab. 1).
Embrionii obţinuţi conţin un număr mai redus de celule, cu toate că
morfologic apar normali, de aceea nivelul gestaţiei este mai ridicat atunci când
receptoarele sunt din punct de vedere al ciclului sexual în întârziere, în raport cu
vârsta teoretică a embrionului. Aceasta evidenţiază faptul că mediile de cultură
folosite nu sunt adecvate integral. Nivelurile de dezvoltare a embrionilor obţinuţi
„in vitro“ transferaţi receptoarelor şi a gestaţiei sunt mai scăzute comparativ cu cei
obţinuţi după transferul de embrioni „in vivo“.
Tabelul 1
Nivelul gestaţiei după transferul sincron al embrionilor bovini după
maturare, fecundare şi cultură „in vivo“ în condiţiile transferului a câte 2
embrioni/receptoare (Kajihira şi colab.,1990 cit. de Marquant B. şi colab.,
1991)
Sincronism între stadiul de
Număr de Gestaţii
dezvoltare al embrionilor şi stadiul
receptoare (%)
ciclului sexual al receptoarelor
-2,5 8 63
-2,0 22 82
-1,5 17 59
-1,0 27 59
0 la +1 13 46

98
 Pe ansamblul aplicării acestei biotehnici, nivelurile gestaţiei sunt mai slabe
în raport cu numărul ovocitelor folosite, chiar atunci când zigoţii sunt cultivaţi în
oviductul unei gazde intermediare.

3.1.6. Importanţa, perspectivele şi aplicaţiile fecundaţiei

„in vitro“

Contrar ameliorărilor tehnice aduse în ultimii ani acestei biotehnici,

randamentul global rămânea relativ scăzut, fapt ce a încetinit ritmul aplicării în
practică pe o scară mult mai mare. Cercetările ulterioare trebuie să fie orientate,
mai ales, spre creşterea randamentului diverselor etape, în particular cea a culturii
embrionilor.
Cu toate dificultăţile întâmpinate, fecundarea „in vitro“ rămâne un necesar
şi indispensabil stadiu pentru înţelegerea diferitelor fenomene, îndeosebi a
stadiilor dezvoltării iniţiale a embrionului.
La bovine, folosirea pentru fecundaţia „in vitro“ a ovocitelor provenite de
la femele fără valoare genetică (recoltate de la abator) permite stabilirea unui
diagnostic precoce a fertilităţii taurilor folosiţi la însămânţări artificiale. Într-
adevăr, s-a pus în evidenţă o corelaţie între nivelul dezvoltării globale „in vitro“
(numărul de blastocişti/număr ovocite supuse fecundării) şi fertilitatea taurilor „in
vivo“ (nivelul NR% la două-trei luni).
Tehnica maturării „in vitro“ permite producerea la preţuri scăzute a unui
număr mare de ovocite care pot fi utilizate ca receptoare de nuclei ai embrionilor
proveniţi de la vacile cu înalt potenţial genetic, în cursul clonării. Acest aspect
este valorificat comercial de unele firme americane.
Puncţia foliculilor antrali, pe animalul în picioare, prin folosirea metodelor
endoscopice sau ecografice transvaginale permite folosirea femelelor donatoare de
ovocite de un înalt potenţial genetic, într-un număr ridicat. Acest tip de colectare
şi maturare „in vitro“ a ovocitelor va deveni rentabil numai atunci când
randamentele realizate vor permite producerea, pe donatoare, a unui număr de
embrioni superior celui obţinut în prezent prin superovulare, fecundaţie „in vivo“
şi colectare transcervicală a zigoţilor.
Prin practicarea acestei biotehnici există posibilitatea reducerii numărului
necesar de spermatozoizi pentru a obţine o fecundaţie, şi în consecinţă, folosirea
cu intensitate sporită a spermei provenită de la animale valoroase pentru
fecundarea unui număr crescut de ovocite, comparativ cu celelalte biotehnici
(însămânţări artificiale şi transfer de embrioni).
Totodată, fecundaţia „in vitro“ va permite în viitorul apropiat
intensivizarea procesului de ameliorare genetică a efectivelor de animale.
Prin această biotehnică, se pot obţine mai multe ovocite de la aceeaşi
femelă, ovocite care pot fi fecundate cu spermatozoizi proveniţi de la mai mulţi
reproducători, fapt ce ar constitui un mare avantaj pentru testarea reproducătorilor
masculi şi femeli.
Microinjecţia de spermatozoizi în ovocitele maturate „in vitro“ reprezintă
o altă cale de obţinere de embrioni normali. După activarea ovocitei, ouăle au fost
cultivate până la stadiul de morulă-blastocist şi transferate la femele receptoare,
obţinându-se, deja, unele rezultate.
Posibilitatea de a avea, după fecundaţia „in vitro“, un număr crescut de
embrioni într-un stadiu precis de dezvoltare prezintă un mare avantaj pentru o altă
biotehnică de reproducţie, transgeneza. Într-adevăr, microinjecţia artificială a unei
gene se efectuează în stadii precise de dezvoltare, în general în stadiul de doi
pronuclei sau de două blastomere. Deja, unele echipe de cercetători şi-au propus

99
să folosească spermatozoidul ca vector al genei ce urmează a fi transferată, în
cazul fecundaţiei „in vitro“, rezultate încurajatoare obţinându-se pe şoareci.
Oricare ar fi biotehnicile utilizate (clonaj transgeneză), rezultatul este
totdeauna un ou în stadiul de una-două celule pe care trebuie testată dezvoltarea
ulterioară prin tehnici mai puţin costisitoare, comparativ cu transferul pe cale
chirurgicală în oviductul unei femele receptoare.
Maturarea ovocitelor, fecundaţia „in vitro“ şi cultura embrionilor obţinuţi
sunt etape de mare interes pentru mamiferele domestice, însă dirijarea acestor trei
etape prezintă importanţă pentru dezvoltarea tehnicilor de clonare şi transgeneză.

3.2. Bisecţia embrionilor

Tehnicile de micromanipulare perfecţionate şi simplificate în ultimul timp,

au făcut posibilă microchirurgia embrionară. Micromanipulările sunt facilitate de
faptul că ouăle (zigoţii) majorităţii speciilor de mamifere sunt circumscrise de o
zonă pelucidă acelulară. Zona pelucidă îndeplineşte mai mult atribuţii referitoare
la protecţia fizică a zigotului. Rezistenţa acestei membrane permite menţinerea
oului
în depresiunea extremităţii unei micropipete fără a afecta structura internă a oului.
Această însuşire uşurează mult intervenţia microinstrumentelor. Prin practicarea
tehnicilor de micromanipulare, în prezent se poate interveni pe zigot pentru:
- obţinerea jumătăţilor monozigote, prin bisecţie;
- sexarea embrionului;
- producerea de himere;
- obţinerea de indivizi transgenici;
- producerea clonelor.
Bisecţia embrionilor
constă în secţionarea în două
jumătăţi a zigoţilor aflaţi în
stadiul de morulă târzie sau de
blastocist tânăr (6-8 zile) (foto
25). Această biotehnică are ca
bază fiziologică constatarea că la
mamifere, în mod natural, apar
jumătăţi şi uneori chiar triplete
monozigote. Primele studii
făcute pe embrioni de şoareci şi
iepure au arătat că un blastomer
protejat de propria zonă pelucidă
Foto 25 Bisecţia embrionilor este capabil de a se dezvolta şi
de a produce un
individ normal. Însă, un blastomer izolat, transferat fără zona pelucidă sau
reintrodus într-o zonă pelucidă larg deschisă este incapabil de evoluţie (Nibart M.,
1991).
Ozil, 1982 (cit de Nibart M.,1991) a propus secţionarea în două părţi egale
a embrionilor de 6-8 zile, stadiu în care rolul zonei pelucide nu mai prezintă
importanţă. El a dezvoltat un sistem de microchirurgie cu ajutorul mai multor
instrumente, folosite în aşa fel încât să lezioneze cât mai puţin posibil zona
pelucidă şi repunerea fiecărui demiembrion în câte o zonă pelucidă. Rezultatele
obţinute, exprimate în G% după transfer, au fost considerate ca excelente: 27 de
produşi pentru 25 de embrioni secţionaţi. Numeroşi autori au continuat bisecţia

100
embrionilor bovini simplificând tehnica, ce este formată numai din două
microinstrumente.
Voelkel şi colab., (1948), Baker şi Shea (1985), Picard şi colab. (1985, cit.
de Nibart M., 1991) ş.a. au demonstrat că nu mai este necesară repunerea
embrionului într-o zonă pelucidă înaintea transferului, ceea ce a simplificat mult
metoda.
Cu ajutorul a două micromanipulatoare, unul purtând micropipeta, celălalt
microcuţitul, un operator antrenat poate obţine în câteva minute doi
demiembrioni, viabili, în condiţiile bisecţiei unice a embrionilor de bună calitate,
apreciaţi în stadiul de morulă compactă-blastocist tânăr.
După transferul celor două jumătăţi la femelele receptoare, nivelurile
gestaţiei se situează între 50% şi 65%, însă pentru majoritatea autorilor, nivelurile
gemelarităţii au fost de 50%. Nu s-au înregistrat diferenţe în nivelul obţinerii de
gemeni, indiferent dacă aceştia au fost repuşi amândoi în cornul uterin ipsilateral
ovarului cu corp galben sau repus fiecare în câte un corn uterin al aceleiaşi
receptoare.
S-au obţinut unele rezultate (50% gestaţii) după transferul jumătăţilor de
embrion conservate prin refrigerare timp de 24 de ore la 2-4oC. Congelarea în azot
lichid a jumătăţilor de embrion repuse în zona pelucidă, a condus la obţinerea unui
nivel scăzut de gestaţii (20%). Dacă înainte de congelare embrionii sunt menţinuţi
într-un mediu de cultură (2-24 de ore), nivelul gestaţiilor obţinute este mult mai
ridicat.
Rezultatele obţinute arată că embrionii buni de 40-80 de celule, sunt
capabili, prin bisecţie, să dea doi demiembrioni care, transferaţi în uterul
receptoarelor, să evolueze normal, cu toate că au de recuperat circa jumătate din
celulele embrionului iniţial. Rezultate în obţinerea gemenilor monozigoţi, sunt
superioare când se lucrează cu blastocişti tineri, comparativ cu stadiul de morulă
tânără.
Încercarea de a obţine gemeni tripli sau cvadrupli, prin secţionarea
embrionilor în stadiul de 40-80 de celule nu s-a soldat cu rezultate satisfăcătoare,
ceea ce arată că această biotehnică este limitată de numărul restrâns de gemeni (2)
ce pot fi obţinuţi dintr-un singur embrion. Dacă, de exemplu, considerăm în medie
pe donatoare 5 embrioni viabili (trei buni şi doi medii), după transferul acestora se
obţin în principiu trei viţei. Prin bisecţia celor trei embrioni buni şi transferul
fiecărei jumătăţi la câte o receptoare, este posibil să se obţină tot trei viţei (50%
gestaţie) sau, per total 4 viţei. Câştigul de un viţel presupune existenţa a 8
receptoare, în loc de 5. Dacă nivelurile gestaţiei sunt mai scăzute (50%-30%)
sporul de un viţel obţinut pe o donatoare superovulată este anulat. În condiţiile
atingerii unor rezultate normale, prin practicarea bisecţiei embrionilor se pot
obţine, în medie, 4 viţei pe donatoare în loc de trei viţei, ceea ce presupune un
câştig de 33% a numărului descendenţilor proveniţi de la fiecare femelă
superovulată. În aceste condiţii, o selecţie bine dirijată, acceptă cu rezerve
păstrarea a mai mult de un singur exemplar al unei familii clonate, din cauza
reducţiilor majore survenite în varianţa genetică şi în sporirea consangvinităţii. În
aceste circumstanţe, producerea unor familii biclonate pentru toţi indivizii
distincţi genetic se poate face numai prin reducerea la jumătate a numărului unor
astfel de indivizi, prin aceasta scăzând însăşi intensitatea selecţiei. Continuarea
bisecţionării embrionilor (clonării) erodează intensitatea selecţiei prin reducerea
progresului genetic, măreşte consangvinitatea, scăderea intensităţii selecţiei
nefiind compensată prin câştigurile obţinute în precizia selecţiei sau exactităţii
rezultatelor ei (Woolliams G.A., 1989).

101
 Biotehnica bisecţiei embrionilor este totuşi bună pentru producerea
adevăraţilor gemeni, necesari testării unor preparate farmaceutice sau a furajelor,
factorul genetic fiind înlăturat.
Obţinerea himerelor s-a realizat prin microchirurgie, la rumegătoare şi
suine, constând în amestecul de celule embrionare de la specii diferite.

3.3. Sexarea embrionilor

Determinarea sexului embrionului nu este realizabilă decât la vârsta la care

se face transferul acestuia (6-8 zile). Este considerată ca o descoperire economică
de mare importanţă şi constă în prelevarea câtorva celule care sunt investigate
citogenetic, imunologic, enzimologic etc. în vederea determinării sexului
produsului de concepţie încă din acest stadiu incipient de dezvoltare.
Metoda genetică (cariotipică) se bazează pe recunoaşterea citologică a
cromozomului y, specific masculilor. Este vorba de o tehnică ce permite
efectuarea sexării zigoţilor, pornind de la un număr mic de celule prelevate de la
zigoţi şi care să nu compromită dezvoltarea ulterioară a embrionului. Recent,
folosirea unei „sonde“ moleculare specifice cromozomului y la bovine, pare să
răspundă tuturor aşteptărilor. Unele echipe de cercetare acţionează în direcţia
trierii spermatozoizilor purtători ai cromozomului x şi y, pe baza diferenţei
acestora în ce priveşte conţinutul în ADN. Această metodă, împreună cu
fecundaţia „in vitro“ ar furniza un procedeu ideal care să răspundă necesităţilor
zootehnice moderne.
Metoda imunologică constă în căutarea pe suprafaţa celulelor masculine a
antigenului de citocompatibilitate, prin folosirea unor anticorpi monoclonali
specifici pentru acest tip de antigen.
Metoda enzimologică se bazează pe faptul că unele enzime celulare sunt
codificate de către gene aparţinând cromozomului x. Cantitatea acestor enzime
este , deci, de două ori mai mare în celulele femele decât în celulele mascule.
Determinarea activităţii acestor enzime într-un blastomer izolat a permis sexarea
embrionilor într-o proporţie ridicată.
Tehnica amplificării ADN (PCR). După descoperirea posibilităţilor de
amplificare enzimatică dirijate de ADN-ul celular, unii cercetători au dezvoltat o
tehnică de sexare prin amplificarea enzimatică (PCR-Polimerase Chaine Reaction)
a secvenţei lor specifice. Sexajul este efectuat pe 5-10 celule prelevate prin
biopsia embrionilor de bună calitate. Plecând de la aceste celule, determinarea
sexului se sprijină pe detectarea unei secvenţe specifice a ADN-ului
cromozomului y printr-o sondă moleculară complementară. Această secvenţă este
amplificată de PCR. ADN-ul amplificat este separat prin electroforeză şi
vizualizat prin fluorescenţă.
Având în vedere tehnicile pentru sexare (evidenţierea ADN specific) şi
sensibilitatea specifică (amplificarea ADN de ordinul a 105), biopsia trebuie să fie
realizată în cele mai bune condiţii igienice şi tehnice.
Sexarea embrionilor înainte de implantare, oferă posibilitatea stabilirii
raportului de sexe într-o populaţie, în sensul dorit de crescători funcţie de
necesarul de animale de reproducţie, carne, lapte etc.

102
 3.4. Transplantarea nucleilor şi obţinerea de clone

Clonajul embrionar constă în producerea mai multor animale pornind de la

un singur embrion. Acestea pot fi obţinute prin simpla secţiune sau disociere a
unui embrion, în stadiul de preimplantare (bisecţia embrionilor). Prin această
metodă s-au produs numeroase perechi de viţei gemeni, însă foarte rar s-au putut
obţine triplete sau gemeni cvadrupli. Teoretic, tehnica transferului nucleului
permite obţinerea unui număr mare de indivizi plecând de la un singur embrion,
având în vedere faptul că patrimoniul genetic al tuturor nucleilor unui embrion
tânăr este identic, în sensul că poartă aceeaşi informaţie genetică. Transferul
nucleilor celulelor provenite de la acelaşi embrion în mai multe ovocite enucleate
şi activate, este urmat de evoluţia ovocitelor spre indivizi genetic identici.
Posibilitatea obţinerii de serii de animale identice genetic prezintă interese
multiple pentru zootehnie. Astfel, în activitatea de selecţie, folosirea unor clone,
chiar limitate numeric, oferă posibilitatea evaluării cu înaltă precizie a valorii
reproducătorilor. Animale cu acelaşi genotip, întreţinute în ferme diferite, sunt
excelenţi subiecţi de studiere a influenţei factorilor de mediu asupra
performanţelor acestora. Totodată, obţinerea mai multor copii a reproducătorilor
foarte valoroşi va contribui la creşterea şi difuzabilitatea progresului genetic, însă
cu reversul micşorării patrimoniului genetic al efectivelor de animale.
Pentru producţie, plecând de la rasele de carne, embrionii proveniţi de la
un genitor cu o excelentă conformaţie (caracter cu coeficient mare de
heritabilitate) vor putea fi multiplicaţi prin clonare şi transplantaţi, cu producerea
unor loturi de animale cu carcase omogene şi de calitate superioară.
De asemenea, pe termen lung, obţinerea şi comercializarea embrionilor
clonaţi în mari serii, asociată cu maturarea „in vitro“ vor permite scăderea
considerabilă a transferului embrionar.
Briggsi şi King (1952) au arătat că nucleii prelevaţi, în stadiul de blastulă,
la broască şi grefaţi în ovocite, pot să-şi continue dezvoltarea până la stadiul de
blastulă, iar în 1962 Mc Kinnel a obţinut, prin aceeaşi metodă, broaşte adulte.
Pentru embrionul de mamifere, în 1986 Willadsen S., la Cambridge a
obţinut pentru prima dată trei miei după transfer de nuclei, proveniţi de la un
embrion în stadiul de 8 celule (Heyman Y. şi colab., 1991).
La taurine, s-au obţinut de către diferite echipe de cercetători clone
constituite din 8-9 viţei, iar la iepure s-a obţinut o clonă de 6 indivizi, plecând de
la un embrion congelat în stadiul de morulă.
Transferul de nuclei parcurge trei etape (Heyman Y. şi colab., 1991):
- obţinerea de ovocite enucleate destinate de a primi nucleii;
- izolarea nucleilor embrionului donator;
- reconstituirea de serii de embrioni monocelulari.

3.4.1. Pregătirea ovocitelor receptoare

Prima operaţie constă în extragerea genomului maternal al ovocitei

„receptoare“. Pentru aceasta, se folosesc ovocite mature care, în absenţa
fecundaţiei sau a activării, se găsesc blocate în stadiul de metafază II a meiozei.
Retragerea nucleului poate fi realizată prin micromanipulare, pătrunzând cu vârful
unei micropipete în interiorul celulei şi aspirând uşor cromozomii. Pentru a se
evita ruperea membranei viteline a ovocitului, cum se întâmplă cel mai adesea,
ovocitele sunt pretratate cu droguri care inhibă polimerizarea microfilamentelor şi
microfibrilelor scheletului celular.
103
 Ovocitele prelevate „in vivo“, imediat după ovulaţie sau obţinute prin
maturare „in vitro“ sunt debarasate de celulele lor periovocitare printr-un
tratament enzimatic cu hialuronidază şi apoi incubate în prezenţa cytochalasinei B
(5-7 µg/ml). După denudare, fiecare ovocit este enucleat, prin imobilizare în
depresiunea unei micropipete, apoi cu cea de-a doua micropipetă se puncţionează
zona pelucidă, se aspiră globulul polar împreună cu o fracţiune de citoplasmă
adiacentă, conţinând cromozomii metafazici.

3.4.2. Izolarea nucleilor embrionului donator

Embrionul, selecţionat ca donator de nuclei, este prelevat în stadiul de

morulă, când posedă 16-64 de celule, funcţie de specie şi vârsta acestuia. În acest
stadiu evolutiv, punerea în mişcare a genomului embrionar deja s-a produs. Se
folosesc şi embrioni congelaţi şi care se găsesc în stadiul de morulă.
Embrionul donator este debarasat cu multă atenţie de zona pelucidă,
folosind o soluţie de tyrode acid. În acest stadiu, celulele au început deja să
stabilească între ele relaţii funcţionale (de exemplu gap-joncţion). Pentru
disociere, embrionul este incubat timp de treizeci de minute, într-un mediu lipsit
de ioni de calciu, după care blastomerele pot fi separate, fără leziuni, prin
intermediul unor micropipete.

3.4.3. Reconstituirea embrionilor

După separarea blastomerelor, în cel mai scurt timp se introduce fiecare
blastomer în interiorul zonei pelucide a ovocitei „receptoare“, enucleate în
prealabil.
După introducerea blastomerului sub zona pelucidă, fuziunea
membranelor celulei donatoare şi ovocitul receptor se realizează prin
electrofuziune. Pentru aceasta, ovocitul se plasează între doi electrozi şi este supus
la unul sau mai multe impulsuri foarte scurte de curent continuu. Stimulii electrici
provoacă pori membranari, destabilizând straturile de fosfolipide juxtapuse, iar
membranele fuzionate permit astfel nucleului donator să pătrundă în noul său
mediu citoplasmatic. Pe de altă parte, stimularea electrică activează ovocitul
receptor, prin declanşarea mecanismelor de reprogramare a nucleului transplantat.
Electrofuziunea se realizează într-un mediu izotonic şi se observă în următoarele
treizeci de minute de la stimulare şi estimată, fie prin umflarea nucleului donator
în noul său mediu citoplasmatic, fie prin terminarea diviziunii celulare şi apariţia
stadiului de două celule.
În prezent, unul din factorii limitanţi în aplicarea acestei biotehnici îl
reprezintă numărul relativ redus de ovocite „receptoare“. Creşterea numărului de
ovocite ,,receptoare“ se poate obţine prin maturarea „in vitro“ a acestora, pornind
de la ovarele recuperate în abator de la femelele sacrificate. Tot în plan practic,
este de mare interes posibilitatea congelării acestor ovocite, astfel încât să se
dispună în orice moment de necesarul de ovocite receptoare. Un alt factor limitant
este reprezentat de numărul relativ redus de celule ale embrionilor de la care
urmează să se transfere nucleii.
Cu toate dificultăţile pe care le ridică, clonajul embrionilor creează o nouă
cale în optimizarea reproducerii animalelor.

104
 3.5. Transgeneza

Ameliorarea efectivelor de animale s-a bazat, tradiţional, pe progresele

înregistrate în selecţia genetică, dirijarea reproducţiei, echilibrul raţiilor de hrană,
etc. Tehnicile geneticii moleculare oferă, în prezent, noi posibilităţi care încep a fi
exploatate eficient. Astfel, sondele moleculare vor permite cunoaşterea
patrimoniului genetic al animalelor iar multiplele combinaţii rezultate din mutaţie
şi asocierea secvenţelor de ADN oferă multe posibilităţi de reprogramare a unei
celule sau a unui organism întreg. Astfel, dacă o genă izolată este introdusă într-o
celulă, aceasta va sintetiza o nouă proteină şi caracteristicile acestei celule vor
putea fi astfel modificate. De asemenea, dacă o genă izolată este introdusă într-un
organism întreg, însuşirile genetice ale acestuia vor fi modificate. Această operaţie
poartă numele de transgeneză. Gena străină, introdusă în noul organism, va fi
transmisă la descendenţi obţinându-se în acest fel o linie de animale care au
însuşiri biologice noi.
Primele observaţii în acest domeniu s-au făcut în 1981 pe şoareci. Este
posibilă, prin transgeneză, obţinerea de noi animale, perspectivele deschise de
această nouă biotehnică fiind considerabile.
Obţinerea de animale transgenice include mai multe etape:
- izolarea sau construcţia genei de transferat;
- colectarea embrionilor;
- introducerea genei în embrioni;
- transferul embrionului la o femelă receptoare;
- identificarea transgenei la nou-născuţi;
- măsurarea expresiei transgenei;
- stabilirea de linii homozigote, pornind de la animale transgenice
fondatoare.
Izolarea sau construcţia genelor se face prin tehnici genetice adecvate
care permit atât izolarea cât şi mutarea după voinţă a oricărei gene. O genă
funcţională material sau reconstruită conţine totdeauna aceleaşi elemente:
regiunea regulatore, regiunea codantă şi terminatorul. Astfel, regiunile care
participă la reglarea transcripţiei genei se situează în amonte de zona codantă.
Colecţia de embrioni. Transgeneza fiind o operaţie cu randament scăzut,
sunt necesari mai mulţi embrioni pentru a economisi la maximum femele
donatoare. Embrionii pot fi obţinuţi în mai multe moduri:
- prelevând ovare de la femelele sacrificate la abator;
- prin maturarea ovocitelor „in vitro“;
- prin practicarea fecundaţiei „in vitro“.
Introducerea genei în embrion se poate realiza prin microinjecţie, prin
folosirea de vectori retrovirali sau prin folosirea celulelor ES (Embryo stem cels).
Microinjecţia constă în injectarea directă a soluţiei de ADN în pronucleul
mascul, care este mai mare, mai apropiat de periferia zigotului în momentul
injecţiei. Un obstacol important la injectare este dat de opacitatea ouălor, ceea ce
face dificilă vizualizarea celor doi pronuclei.
Virusurile, înainte de a folosi mecanismul celular pentru replicarea lor,
sunt ,,a priori“ excelenţi vectori pentru a introduce gene străine într-o celulă.
Retrovirusurile se încorporează în genomul gazdă, în general, într-o singură copie
şi fără rearanjare, deci sunt extrem de utile pentru introducerea genei străine în
celulele somatice în cultură şi apoi se reintroduc aceste celule în individ.
Utilizarea celulelor ES, constă în izolarea celulelor unui embrion precoce
şi cultivarea lor în condiţii în care celulele nu se diferenţiază. Când aceste celule
ES sunt reintroduse într-un embrion precoce participă la dezvoltarea embrionului,
dând naştere la animale himere. O genă străină poate fi introdusă, prin procedee

105
clasice de transfer, în celule ES, în cultură. Aceste celule reintroduse în embrion
constituie vectorul transgenei. Animalele himere transgenice care rezultă sunt
mozaicate. Descendenţii lor moştenesc sau nu transgena numai dacă celulele
germinale parentale conţin sau nu transgena.
Transgenele introduse, prin una din aceste metode, se inseră în genomul
gazdă în poziţii imprevizibile.
Introducerea transgenelor se mai poate realiza şi prin alte mijloace. Unul
dintre aceste mijloace constă în a pune în contact ADN-ul şi spermatozoizii şi a
proceda apoi la o fecundaţie „in vitro“sau „in vivo“. O altă cale prin care gena
străină poate fi transferată în celule în cultură, cu o eficacitate înaltă, este
electroporaţia. Tehnica aceasta constă în a supune celulele incubate în prezenţa
ADN, la câmpuri electrice care destabilizează membrana şi creează pori prin care
ADN-ul pătrunde în celule. Această tehnică se foloseşte şi pentru spermatozoizii
şi embrionii de mamifere.
Detectarea transgenelor se face prin metode clasice ale geneticii
moleculare. Ele constau în a hibrida un fragment de ADN complementar genei,
radioactivat, cu ADN-ul celular total.
Detecţia produşilor transgenici constă în a evalua expresia transgenelor
prin măsurarea cantităţii de ARN corespondent. Proteinele derivate din transgene
pot fi măsurate în sânge, dacă sunt secretate, cu ajutorul testului RIA
(radioimunoanaliză). Aceste metode permit să se determine în care organ, tip
celular şi moment al dezvoltării, transgena se exprimă.
Tansgeneza a fost încercată pe multe specii de animale, cu anumite
succese. Randamentul biotehnicii, evaluat în număr de celule transgenice obţinute,
raportat la numărul embrionilor microinjectaţi, variază mult cu colectivele de
cercetători. O evaluare sumară a acestui randament arată că este nevoie de circa
10 şoareci adulţi pentru a spera obţinerea unuia transgenic, 40 de oi pentru un miel
transgenic şi 40 de vaci pentru un viţel transgenic. Aceste rezultate arată că preţul
de cost al unui produs transgenic este foarte ridicat.
Prin transgeneză s-a încercat obţinerea de animale cu un ritm de creştere
accelerat, cu o producţie de lapte mai mare şi cu un conţinut în proteină mai
ridicat, cu o producţie de carne mai bună, cantitativ şi calitativ, rezistente la
diverse maladii etc. Cu toate rezultatele încurajatoare obţinute la diverse specii,
această biotehnică se găseşte doar la perioada de început, necesitând multe
ajustări, astfel încât randamentul obţinut să micşoreze preţul de cost al produsului
transgenic şi care să fie conform cu normele sanitare şi sanitar-veterinare
internaţionale etc.

ÎNTREBĂRI RECAPITULATIVE

1. Care sunt etapele fecundaţiei “in vitro”?

2. Care sunt importanţa şi tehnica bisecţiei embrionilor?
3. Care sunt metodele prin intermediul cărora se pot sexa embrionii?
4. Care sunt importanţa şi etapele transferului de nuclei?
5. Care este rolul transgenezei?

TEME
1. Biotehnici moderne de reproductie

REFERAT
1. Realizări moderne în domeniul fecundaţiei “in vitro”
2. Situaţia actuală şi perspectivele clonării şi transgenezei

106
 BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1. Aughtry, S.D., 1987 - Embryo Transfer, 2, 3, p 3-4

2. Baril, G. şi colab., 1993 - Manuel de formation pour l'insémination artificielle
ches les ovins et les caprins. Etude FAO, Roma.
3. Baril, G. şi colab, 1993 - Manuel de formation practique pour la
transplantation embryonnaire chez la brebis et la chevre. Etude FAO,
Roma.
4. Bogdan, Al. şi colab., 1981 - Reproducţia animalelor de fermă. Edit.Scrisul
românesc, Craiova
5. Bogdan, Al. şi colab.,1984,1985 - Fertilitatea, natalitatea şi prolificitatea în
zootehnie, vol I şi II, Edit Dacia, Cluj-Napoca
6. Boitor, I., 1979 - Endocrinologia reproducţiei la animalele de fermă. Edit.
Ceres, Bucureşti
7. Bunaciu, P., 1977 - Însămânţarea artificială a găinilor de reproducţie întreţinute
în baterii. Rev. de creştere a animalelor, nr. 10
8. Cârlan, M., 1982 - Sincronizarea căldurilor şi ovulaţiei la taurine. Redacţia de
propagandă tehnică agricolă, Bucureşti
9. Confederat Margareta, 1998 - Cercetări cu privire la influenţa alimentaţiei
asupra supravieţuirii embrionilor la caprine în condiţiile efectuării
transferului de embrioni. Teză de doctorat, Univ. Agron. şi de Med. Vet.,
Iaşi
10. Drugociu, G. şi colab., 1977 - Patologia reproducţiei şi clinică obstetricală.
Edit. Did. şi Ped., Bucureşti
11. Dumitrescu, I. şi colab., 1976 - Reproducţia la bovine. Edit Ceres, Bucureşti
12. Dumitrescu, I. şi colab., 1978 - Însămânţările artificiale la animale. Edit.
Ceres, Bucureşti
13. Dumitrescu, I., 1987 - Reproducţia la cabaline. Edit. Ceres, Bucureşti
14. Elsden Peter, R., 1987 - Manual for embryo transfer, 6599 Country Rd. 29C,
Bellvue, , USA
15. Feredean, T., 1974 - Reproducţia la porcine. Edit. Ceres, Bucureşti
16. Feredean, T., Drume, Ch., 1977 - Transferul de embrioni la animale. Edit.
Ceres, Bucureşti
17. Gluhovschi, N. şi colab., 1972 - Biologia şi patologia reproducţiei. Edit. Did.
şi Ped.,Bucureşti
18. Groza, {t. I., 1996 - Actualităţi şi perspective în biotehnologia transferului de
embrioni la specia ovină. Edit. Ceres, Bucureşti
19. Halga, P. şi colab., 1999 – Alimentaţia şi reproducţia la erbivore domestice.
Edit. Dosoftei, Iaşi
20. Hansel, W. şi colab.,1983 - Fiziologia ciclului estral. Rev. Soc. de Med. Vet.,
Bucureşti
21. Haubebine, L. M., 1991 - Rec. Med. Vet., 167(314), 323-333
22. Heyman, Y., Chesne, Renard, J.P.,1991 - Rec. Med. Vet., 167(314), 315-
322
23. Liciu, Gh., Roşca, O., 1988 - Ghid tehnic privind însămânţarea la ovine şi
caprine. Edit. Ceres, Bucureşti

107
24. Liciu, GH.,Roşca, O., 1998 – Tehnica însămânţării artificiale la bovine –
Ghid practic. Edit. Ceres, Bucureşti.
25. Liciu, GH., Roşca, O., 1999 - Tehnica însămânţării artificiale la suine - Ghid
practic. Edit. Ceres, Bucureşti.
26. Mantea, {t., 1998 - Contribuţii la biotehnologia transferului de embrioni la
suine. Teză de doctorat, Fac. de Med. Vet., Bucureşti
27. Mapletoft, R. J., 1987 - Embryo Transfer, 2, 3, p. 4-6
28. Marquant, Le Guienne, 1991 Rec. de Med. Vet., Ian. 167, nr. 314, p. 303-
312
29. Nibart, M., 1991 - Rec. de Med. Vet., 167(314), 261-290
30. Paraipan, V., 1982 - Hormonoterapia în reproducţia animalelor. Edit. Ceres,
Bucureşti
31. Paraschivescu, M., 1969 - Reproducţia la ovine. Edit. Agro-Silvică, Bucureşti
32. Peyraud, J. C., 1986 - La transplantion embryonnaire s'implante, Elevage
2000, nr. 1, p. 47-49
33. Roşca, O ., 1994 - Biotehnica reproducţiei la porcine prin însămânţare
artificială. Edit. Ceres, Bucureşti
34. Runceanu, L.,1995 - Reproducţia şi patologia reproducţiei. Lito., Univ.
Agron. Iaşi
35. Sauveur, B., Reviers, M., 1988 - Reproduction des volailles et production
d'oeufs. INRA, Station de Recharches Avicoles, Paris
36. Seiciu, Fl. şi colab.,1989 - Reproducţia normală şi patologică la animalele
domestice, vol. I şi II, Edit. Ceres, Bucureşti
37. Tănase, D.,1993 - Biologia reproducerii animalelor şi transferul de embrioni .
Lito., Univ. Agron. Iaşi
38. Tănase, D.,1995 - Biologia şi patologia reproducerii animalelor. Curs, Lito.,
Univ. Agron. Iaşi
39. Vallet, J. Ch. şi colab., 1991 - Rec. Med. Vet., 167(314), 293-301
40. Woolliams, G. A., 1989 - Animal Production, t 48, partea I, p.31-36, Anglia

108