MARIA PRISECARU TINA OANA CRISTEA

ROXANA VOICU

BIOLOGIE CELULARĂ
ŞI MOLECULARĂ
Curs universitar

Editura „ ALMA MATER ” Bacău

2011
Referenţi ştiinţifici:

Š Prof.univ.dr. BARABAŞ NECULAI

Š Prof.univ.dr. BATTES KLAUS WERNER

Descrierea CIP a Bibliotecii Naţionale a României

PRISECARU, MARIA
Biologie celulară şi moleculară / Prisecaru Maria, Cristea Oana Tina, Voicu Roxana. -
Bacău : Alma Mater, 2011
Bibliogr.
ISBN 978-606-527-116-6

I. Cristea, Oana Tina

II. Voicu, Roxana Elena

576.3
577.2

Tipar executat la: UNIVERSITATEA

„VASILE ALECSANDRI” DIN BACĂU

Calea Mărăşeşti, Nr. 157, 600115

Tel. ++40-234-542411,
tel./ fax ++40-234-516345
e-mai: www.ub.ro; stiinte@ub.ro

ISBN 978-606-527-116-6
 Prezenta lucrare se adresează în primul rând studenţilor şi cercetărilor din
diferite domenii ale ştiinţelor biologice, oferind cunoştinţele de bază în
domeniul biologiei celulare şi moleculare, făcându-se însă frecvente referiri la
cele mai recente descoperiri şi interpretări, cunoscut fiind faptul că Biologia este
o ştiinţă dinamică, care se bazează în principal pe teorii susţinute de rezultate
experimentale obţinute din cercetare şi experimentare.
 CUPRINS

Introducere 11
1. Consideraţii generale privind domeniul de studiu al biologiei celulare şi 12
moleculare
1.1. Definiţie şi caracteristici 13
1.2. Scurt istoric 14
1.3. Contribuţii româneşti în studiul celulei 15
1.4. Principalele teorii care au condus la modul actual de gândire despre natura 17
materiei vii
1.4.1. Teoria celulară 17
1.4.2. Teoria cromozomială a eredităţii 18
1.4.3. Teoria moleculară a materiei vii 22
1.4.4. Teoria biostructurală a materiei vii 22
1.4.5. Teoria evoluţionistă, originea vieţii şi a omului 24
2. Membranele celulare 26
2.1. Definiţia şi clasificarea membranelor celulare 26
2.2. Organizarea membranelor celulare 27
2.2.1. Caracterizarea componentelor lipidice ale membranelor celulare 28
2.2.2. Componenta proteică a membranelor celulare 30
2.2.3. Mobilitatea lipidelor şi proteinelor de membrană 30
2.2.4. Componenta glucidică membranară 31
2.2.5. Glicocalixul. 31
2.2.6. Apa. 32
2.2.7. Asimetria distribuţiei componentelor membranare 32
2.3. Mecanismele de transport prin membranele celulare 33
2.3.1. Procesul calitativ al traversării membranelor 33
2.3.2. Transportul ionilor şi moleculelor mici prin membranele celulare 34
2.3.2.1. Transportul pasiv 34
2.3.2.2. Transportul activ 36
2.3.3. Transportul macromoleculelor şi particulelor prin membrana plasmatică 41
2.4. Receptorii din membrană 44
2.4.1. Tipuri de receptori 45
2.4.2. Modalităţi de comunicare intercelulară. 46
2.4.2.1. Comunicarea intercelulară la distanţă 46
2.4.2.2. Contactul intracelular direct 46
2.4.3. Receptorii celulelor nervoase. 46
2.4.4. Receptorii care controlează permeabilitatea ionică 48
2.4.5. Cuplajul celular metabolic şi electric 50
2.5. Schimburile energetice în celula vie 51
2.5.1. Noţiuni generale de termodinamică 51
2.5.2. Transformări de energie în celula vie (energetica celulară) 53
2.5.2.1. Molecula ATP şi proprietăţile sale 54
2.5.2.2. Alţi compuşi fosforilaţi 56
2.6. Membrane care cuplează energie 56
 2.6.1. Cloroplastele 56
2.6.1.1. Procesul general al fotosintezei 57
2.6.1.2. Reacţiile de lumină 59
2.6.1.3. Reacţiile de întuneric 63
2.6.2. Mitocondriile 67
2.6.2.1. Degradarea glucozei de către mitocondrii 67
2.6.2.2. Ciclul glioxalatului 70
2.6.2.3. β oxidarea acizilor graşi 70
2.6.2.4. Sistemul transportor de electroni (lanţul respirator) 71
2.6.2.5. Fosforilarea oxidativă 72
2.6.2.6. Fermentaţiile 73
2.6.3. Comparaţie între fotosinteză şi respiraţie 73
3. Adeziunea celulară. Joncţiunile celulare şi matricea extracelulară 75
3.1. Molecule implicate în aderarea celulă-celulă 75
3.1.1. Selectinele 75
3.2.2. Domenii imunoglobulinice 76
3.2.3. Caderinele 76
3.2. Joncţiunea celulară 76
3.2.1. Joncţiunile de ocluzie 77
3.2.2. Joncţiunile de ancorare 78
3.2.2.1. Joncţiunile de adeziune intercelulară 78
3.2.2.2. Joncţiunile de adeziune celulă-matrice extracelulară 79
3.2.2.3. Desmozomii 79
3.2.2.4. Hemidesmozomii 80
3.2.3. Joncţiunile de comunicare 80
3.2.3.1. Structura joncţiunilor de comunicare 81
3.2.3.2. Reglarea permeabilităţii joncţiunilor de comunicare 81
3.2.4. Joncţiunile sinaptice 82
3.3. Matricea extracelulară 82
3.3.1. Componentele matricei extracelulare 83
3.3.1.1. Glicozaminoglicanii 83
3.3.1.2. Proteoglicanii 84
3.3.1.3. Colagenul 86
3.3.1.4. Elastina 88
3.3.1.5. Fibronectinele 89
3.3.2. Lamina bazală 91
3.3.2.1. Structura laminei bazale 91
3.3.2.2. Funcţiile lamnei bazale 92
4. Citoscheletul 93
4.1. Microtubulii 93
4.1.1. Microtubulii – semnificaţia biologică 93
4.1.2. Structura microtubulilor 94
4.1.3. Polaritatea şi dinamica microtubulilor. 95
4.1.4. Bazele diversităţii structurilor microtubulilor 96
4.1.5. Centrii organizatorici ai microtubulilor 96
4.1.5.1. Centriolii şi corpusculii bazali 97
4.1.5.2. Ultrastructura centriolilor şi a corpusculilor bazali. 97
4.1.5.3. Replicarea centriolilor şi a corpusculilor bazali. 98
4.1.6. Mişcările cililor şi flagelilor 99
4.1.6.1. Structura cililor şi a flagelilor 100
4.1.6.2. Mecanismul molecular al mişcări cililor şi flagelilor. 101
4.1.7. Implicarea microtubulilor în diviziunea celulară 101
 4.1.7.1. Formarea fusului de diviziune 101
4.1.7.2. Deplasarea cromozomilor spre regiune ecuatorială a celulei şi 103
alinierea lor în placa metafazică
4.1.7.3. Translocarea cromozomilor anafazici. 103
4.1.8. Transportul intracelular mediat de microtubuli. 104
4.2. Microfilamentele 105
4.2.1. Microfilamentele de actină 106
4.2.2.Miozina 107
4.2.3. Rolul actinei şi miozinei în contracţia musculară 108
4.2.4. Actina şi miozina în celule nemusculare 108
4.2.4.1.Microvilii 109
4.2.4.2. Rolul actinei şi miozinei în citokineza 110
4.2.4.3. Mişcarea ameboidala. 111
4.2.4.4. Fibrele de stress 112
4.3. Filamente intermediare 112
4.3.1. Proteine ce alcătuiesc filamentele intermediare 112
4.3.2. Tipuri de filamente intermediare şi semnificatia lor funcţională 114
4.4. Reţeaua microtrabeculară 114
4.5. Proteinele asociate citoscheletului 114
5. Organizarea nucleului şi expresia activităţii genelor 115
5.1. Morfologia şi structura nucleului 115
5.1.1. Învelişul nuclear 116
5.1.2. Matricea nucleului 118
5.1.3. Proteinele contractile nucleare 119
5.1.4. Cromatina 119
5.1.5. Organizarea moleculară a fibrelor de cromatina. Nucleozomii 121
5.2. Replicarea ADN la eucariote 123
5.2.1. Complexul de enzime polimerazice implicate în replicare 125
5.2.2. Iniţierea replicării 126
5.2.3. Primarea replicării 127
5.2.4. Alungirea lanţului de ADN nou - sintetizat şi terminarea replicării 127
5.2.5. Corectarea erorilor de replicare 128
5.2.6. Unităţile de replicare 129
5.3. Transcripţia ADN sau sinteza ARN 130
5.3.1. Mecanismul general 130
5.3.2. Elemente implicate în transcripţie 131
5.3.3. Aparatul enzimatic de transcripţie 132
5.3.4. Factorii de transcripţie 133
5.3.5. Elemente de control în expresia genetică 133
5.4. Mecanismul transcripţiei 134
5.5. ARN splicing 136
5.6. Asigurarea necesarului de ARNm 137
6. Transportul intracelular 138
6.1. Sistemul vacuolar intracitoplasmatic 138
6.2. Rolul citomembranelor granulare în sinteza proteică 139
6.3. Biosinteza proteinelor sau translaţia ARNm 139
6.3.1. Decodificarea informaţiilor genetice 140
6.3.2. Iniţierea catenei polipeptidice 143
6.3.3. Alungirea sau elongarea catenei polipeptidice 146
6.3.4. Terminarea sintezei catenei polipeptidice 146
6.3.5. Particularităţile decodificării la procariote şi eurocariote 149
6.4. Mecanismul compartimentării celulare a proteinelor nou-sintetizate 149
 6.5. Corelaţia particularităţilor structurale şi funcţionale ale reticulului 151
endoplasmatic neted cu heterogenitatea funcţională a celulelor
6.6. Segregarea şi concentrarea proteinelor 153
6.7. Sinteza şi secreţia polizaharidelor 154
6.8. Lizozomii 155
6.8.1. Funcţiile lizozomilor 155
6.9. Peroxizomii 158
6.10. Proteinele chaperone 158
7. Reproducerea celulară 161
7.1. Ciclul celular 161
7.1.1. Ciclul celular la plante 161
7.1.2. Ciclul celular la animale 161
7.1.3. Ciclinelor şi protein - kinazele dependente de cicline 164
7.1.3.1. Protein - kinazele dependente de cicline (cdk) 165
7.1.3.2. Ciclinele 165
7.1.4. Interacţiunea cicline- proteina Rb - mecanism de reglare pozitivă a 168
ciclului celular
7.1.5. Reglarea ciclului celular prin mecanisme feed-back 168
7.1.6. Alţi factori responsabili de controlul proliferării celulare în 170
organismele pluricelulare
7.1.7. Ciclul cromozomial şi creşterea celulară 170
7.1.8. Implicarea factorilor de creştere în reglarea diviziunii celulare 171
7.1.8.1. Competiţia celulelor pentru factorii de creştere 173
7.1.9. Influenţa adeziunii celulare asupra proliferării 173
7.2. Diviziunea celulară 175
7.2.1. Mitoza (diviziunea mitotică) 175
7.2.2. Meioza (diviziunea meiotică) 181
8. Apoptoza 187
8.1. Mecanismele de producere a apoptozei 187
8.2. Necroza. 188
8.3. Frecvenţa procesului de apoptoză 188
8.4. Gene implicate în procesul apoptotic 189
8.4.1. Gene letale 189
8.4.2. Genele supravieţuirii (gene antiapoptotice) 189
8.5. Rolul apoptozei în embriogeneză şi dezvoltare 190
8.6. Aspecte de reglare a apoptozei 190
8.6.1. Factori implicaţi în reglarea apoptozei 190
8.7. Apoptoză – îmbătrânire – senescenţă 192
8.8. Apoptoza şi starea de boală. 193
9. Procesul de îmbatrînire-senescenţa 195
9.1. Gene implicate în controlul senescenţei 195
9.2. Principalele mecanisme (ipotetice) implicate în senescenţă 196
10. Răspunsul imunitar 201
10.1. Noţiuni generale despre imunitate şi sistem imunitar 201
10.2. Organizarea sistemului imunitar 202
10.3. Molecule cu rol esenţial în cadrul sistemului imunitar 203
10.3.1. Antigenii 203
10.3.2. Anticorpii. 204
10.3.3. Celule T 205
10.3.4. Antigeni de histocompatibilitate 205
10.3.5. Citokinele 205
10.4. Relaţii de cooperare între componentele sistemului imun 210
 10.5. Baza umorală a răspunsului imun 213
10.5.1. Prezentarea antigenilor 214
10.5.2. Producerea de anticorpi 214
10.6. Răspunsul imunitar mediat de celule 215
10.7. Interacţiuni celulare în răspunsul imun 216
10.7.1. Unele mecanisme de apărare imună în infecţiile bacteriene 218
10.7.1.1. Mijloace de apărare imună mediate umoral 218
10.7.1.2. Mijloace de apărare imună mediată celular 218
10.8. Reglarea imunologică 219
10.8.1. Reglarea normală. 219
10.8.2. Reglarea alterată 219
10.9. Intensificarea răspunsului imun 219
10.9.1. Sistemul complement 220
10.9.2. Alte categorii celulare implicate în imunitate 220
10.10. Finalitatea răspunsurilor imune 221
10.10.1. Funcţia directă a anticorpilor 221
10.10.2. Funcţia indirectă a anticorpilor 221
10.10.3. Uciderea celulelor ţintă 222
10.10.4. Procesul inflamator 222
10.10.5. Controlul prin reacţie inversă 222
10.11. Genetica sistemului imunitar 222
10.11.1. Imunodeficienţa dobandită 223
10.11.2. Grupele sanguine 224
10.12. Interacţiunea între peptidele sistemului imun şi peptidele sistemului nervos 225
şi endocrin
10.13. Relaţiile virusuri-celule gazdă. Relaţiile virusuri-membrane celulare 227
10.13.1. Receptorii virali 227
10.13.2. Penetrarea virusului în celulă 228
10.13.3. Tipuri de efect citopatic 229
10.13.4. Leziuni cromozomale determinate de virusuri 229
10.13.5. Natura şi funcţia unor structuri virus-like: prionii 230
10.14. Relaţiile bacterii-celulele gazdei 233
11. Biotehnologia 235
11.1. Ingineria genetică 235
11.1.1. Tipuri de transfer de gene 235
11.1.2. Terapie cu gene ţintă (Gene Targeting) 238
11.1.3. Aplicarea metodelor de biotehnologie în agricultură în vederea obţinerii 241
de organisme transgenice
11.1.4. Ingineria genetică utilizată în prepararea de noi conservanţi alimentari 245
11.1.5. Ingineria genetică şi rezolvarea unor probleme de ecologie 245
11.2. Alte aspecte ale biotehnologiei moderne şi perspectivele secolului XXI 245
12. Metode şi tehnici moderne molecular - biologice şi aplicaţiile lor 252
12.1. Recombinarea ADN - ului 252
12.1.1. Principiul recombinării 252
12.1.2. Procese artificiale de recombinare ADN (Genetic Engineering) 253
12.1.3. Elemente de lucru utilizate în tehnologia ADN recombinat 254
12.1.3.1. Enzimele de restricţie 254
12.1.3.2. ADN-ligazele (polinucleoid-ligazele) 255
12.1.3.3. Vectorii 256
12.2. Hibridarea 266
12.2.1. Principiu 266
12.2.2. Denaturarea 266
 12.2.3. Renaturarea (annealing/reannealing) 267
12.2.4. Factorul stringent 267
12.2.5. Tipuri de hibridări 267
12.2.6. Hibridizare in situ 272
12.2.7. Importanţa reacţiei de hibridare pentru medicină şi biologie 273
12.3. Sonde genetice 274
12.4. Clonarea ADN – ului 279
12. 5. Reacţia de polimerizare în lanţ (PCR) 282
12. 6. Secvenţierea ADN- ului 285
12.7. Fingerprinting genomic (amprente de ADN) 286
13. Biosenzorii 288
13.1. Biosenzorii – sisteme de coantificare a informaţiilor viului 288
13.2. Impactul informaţional al biosenzorilor 289
13.3. Metodologia de cercetare a proprietăţilor senzorilor biologici 290
13.4. Aparatura de măsurare 291
13.5. Posibilităţi de folosire a biosenzorilor în biotehnologie 292
Bibliografia 296
 INTRODUCERE

Informaţia a fost întotdeauna preţioasă în orice domeniu de activitate, ea devenind cu

atât mai necesară în domeniul ştiinţelor biologice, astăzi când trăim o adevărată explozie a
cunoştinţelor ştiinţifice cunoscut unei revoluţii ştiinţifice.
Biologia celulară a evoluat în ultimii zece ani datorită progreselor realizate în
cercetări de biochimie, genetică şi biologie moleculară, care au folosit metode şi tehnici
diferite, pentru investigarea unui substrat comun,celula. Tehnicile avansate de microscopie
electonică, folosirea culturilor celulare, realizarea anticorpilor monoclinali, tehnologia ADN-
ului recombinat, manipularea genetică, sunt numai cateva din aceste tehnici care şi-au dovedit
puterea analitică şi au permis unificarea experimentului biologic, a substratului molecular şi a
terminologiei în biologia celulară. Viaţa se manifestă numai în cadrul organizării celulare a
materiei vii, astfel că biologia celulară, care studiază fenomenele vieţii la acest nivel de
organizare, este o ştiinţă fundamentală. În acelaşi timp, face parte dintre ştiinţele
„nerestrictive” deoarece nici un fenomen biologic nu poate fi studiat separat, fără a se lua în
consideraţie complexitatea lui, interacţiunile cu alte structuri precum şi diversitatea sistemelor
de ordin superior, cu proprietăţile lor emergente.
Cercetările de biologie celulară şi moleculară au acumulat deja un bagaj de date care
au permis progrese uriaşe în medicină, ştiinţele ecologice, agricultură, industrie alimentară,
lăsând să se întrevadă pentru viitor noi perspective fascinante de cercetare în diferite alte
ramuri.
Progresele ultrarapide ale biologiei celulare şi moleculare au dus la dezvoltarea
biotehnologiei moderne care se anunţă a devenii marea forţă industrială a secolului al XXI-lea
şi în care se pune speranţa că va reuşi să rezolve problemele cele mai spinoase ale societăţii
omeneşti (alimentaţia, starea de sănătate, sursele de energie, poluarea ) la nivelul Terrei.
La ora actuală, cercetările de biologie moleculară se află în faza clasificării
mecanismelor care stau la baza formării şi asamblării structurilor din organismele vii, atenţia
fiind concentrată asupra momentului când se produce tranziţia informaţiei de la nivelul
molecular către nivelul diferitelor sisteme şi structuri intermediare ale acestor organisme; este
vorba de o etapă de analiză a funcţiilor celulare la nivel molecular (de ex. procesul respiraţiei
celulare, al producerii de substanţe energetice celulare, al transportului intracelular la nivelul
organitelor, al proceselor de reînnoire celulară, al fenomenelor de adaptabilitate).
În contextul revoluţiei ştiinţelor biologice pe care o trăim astăzi, se impune tot mai
mult o reconsiderare a concepţiei şi comportării cercetătorului ştiinţific în raport cu poziţia
omului în ciclul evolutiv al naturii.
După cum arată Lederberg (de două ori laureat al premiului Nobel pentru descoperiri
fundamentale în domeniul geneticii bacteriene), greşeala cea mai mare a oamenilor este aceea
de a se supraestima şi de a se considera exceptaţi de la legile generale ale evoluţiei, când de
fapt ei nu reprezintă decât un element în circuitul evolutiv al vieţii în natură. Tocmai din
cauza acestei mari erori comise de oameni, cuceririle ştiinţei şi civilizaţiei umane s-au întors
de foarte multe ori, până astăzi, împotriva omului, periclitând viaţa pe Terra. Într-adevăr,
istoria societăţii omeneşti a demonstrat deja că impactul noilor tehnologii şi cel al dezvoltării
ştiinţelor în general nu a fost totdeauna benefic pentru războaiele atomice şi bacteriologice,
accidentele de laborator soldate cu moartea experimentatorilor, microorganisme scăpate de
sub control etc.
Alte consecinţe nefaste ale tehnologiilor moderne asupra ecosistemelor în general şi
stării de sănătate a oamenilor în particular sunt: creşterea radioactivităţii mediului înconjurător
(în urma accidentelor de la termocentralele nucleare), îngustarea stratului de ozon atmosferic

11
(prin folosirea în exces a freonilor), care a favorizat creşterea cantităţilor de radiaţii
ultraviolete în atmosfera terestră şi implicit a frecvenţei cancerelor (de piele, ochi, pulmon),
creşterea riscului de răspândire ultrarapidă a unor boli infecţioase (holera, meningita
meningococică, difteria) prin creşterea aglomeraţiei în centrele urbane şi prin deplasările
rapide şi masive de populaţie datorită mijloacelor ultrarapide de transport. De asemenea,
defrişarea unor zone de pe glob (păduri tropicale) în scopul creării de mari aşezări umane şi
centre industriale a determinat, pe lângă dezechilibrele grave (prin scăderea spaţiului verde),
expunerea concomitentă a populaţiei la noi agenţi patogeni; au apărut astfel şi sau răspândit
pe glob: virusul febrei galbene, virusul imunodeficienţei umane (HIV – transmis la om foarte
probabil de la primatele junglei africane), virusul Ebola (agentul febrei hemoragice), adus
pentru întâia oară din Africa în Europa (la Marburg în 1967).
Omul de ştiinţă trebuie să ţină cont de faptul că, în natură, diversitatea foarte mare de
specii este tributară în mare măsură condiţiilor de mediu extern; modificări majore ale acestor
condiţii de mediu pot declanşa potenţiale nebănuite ale ecosistemelor cu influenţe posibil
nocive, neintuite încă astăzi, asupra echilibrului vieţii pe Terra.
Conştient de toate aceste posibilităţi,un adevărat om de ştiinţă, trebuie să militeze ca în
viitor cuceririle ştiinţifice să fie folosite cu mai mult discernământ, doar în slujba binelui,
pentru un grad tot mai înalt de civilizaţie în societatea umană.

12
 Capitolul 1

CONSIDERAŢII GENERALE PRIVIND DOMENIUL DE

STUDIU AL BIOLOGIEI CELULARE ŞI MOLECULARE

1.1. Definiţie şi caracteristici

BIOLOGIA CELULARĂ este o ramură a ştiinţelor biologice care studiază structurile
funcţionale şi fenomenele biologice generale comune tuturor celulelor.
Se mai poate spune că biologia celulară are ca obiect studiul legilor generale de
desfăşurare a proceselor vitale la nivelul de organizare celulară.
Celula poate fi definită şi ca unitate elementară a lumii vii, cu o ordine internă
complexă, ce-i conferă capacitatea de creştere, dezvoltare şi reproducere, precum şi cu
organizare dinamică, aflată în relaţii de echilibru cu mediul înconjurător (Diculescu şi colab.,
1983).
În ierarhia nivelurilor de organizare a materiei vii, celula este considerată primul sistem
biologic, deoarece nivelurile inferioare (atomi, molecule etc) nu sunt considerate „vii”. Orice
manifestare vitală are loc pe fundamentul organizării celulare. Viaţa începe de la celulă.
Din punct de vedere termodinamic, celula este un sistem deschis, adică un sistem care
schimbă atât energie cât şi substanţă cu mediul înconjurător. Ca oricărui alt sistem biologic,
sistemul celular i se pot descrie mai multe caracteristici : caracterul informaţional, programul,
echilibrul dinamic, autoreglarea şi integralitate.
Caracterul informaţional constă în aceea că în orice moment celulele recepţionează,
acumulează, prelucrează şi transmit informaţii de tot felul.
Programul este o trăsătură legată de capacităţile structurale şi funcţionale ale sistemului.
În orice sistem (deci şi cel celular) putem distinge trei categorii de programe:
a) programe “pentru sine”, care asigură autoconservare sistemului dat;
b) programe inferioare, adică programele subsistemelor componente; în cazul celulei acestea
sunt programele organitelor, ale complexelor moleculare;
c) programe superioare, care asigură existenţa sistemului superior, în care este integrat
sistemul considerat (ţesuturi, organe, individ pluricelular).
O ilustrare a ierarhiei programelor o constituie modificările celulelor scoase dintr-un
ţesut (sistem superior) şi cultivate în mod izolat, care se diferenţiază devenind asemănătoare
indiferent de sursa din care provin (piele, os, ficat,rinichi etc). În cultură se menţin programele
“pentru sine”, care asigură persistenţa celulelor, în schimb dispare programul superior ce
reflectă specificul celulei în cadrul ţesutului şi al organismului.
Echilibrul dinamic sau starea staţionară este caracteristică sistemelor biologice, deci şi
celulei; aceasta nu este niciodată într-un adevărat echilibru, ci într-un schimb continuu de
materie şi energie cu mediul exterior, tinzând mereu spre un regim constant de activitate
numit stare staţionară sau echilibru dinamic. În timp ce sistemele nebiologice evoluează
întotdeauna în sensul creşterii entropiei , deci în sensul creşterii dezordinii lor şi al realizării
echilibrului termodinamic, sistemele biologice au capacitatea de a compensa creşterea
entropiei şi de a o depăşi pe seama surselor de energie exterioare sistemului, deci au un
comportament antientropic. Organismele vii evită creşterea entropiei prin preluarea din mediu
a unei entropii negative, negentropia.
Autoreglarea este caracteristica sistemelor biologice prin care acestea îşi controlează
procesele interne în funcţie de relaţiile cu mediul. Influenţele mediului tind permanent să
dezechilibreze sistemul, care contracarează acţiunile mediului reglându-şi permanent
procesele interne într-un sens favorabil persistenţei sale în timp şi spaţii.

13
 Celula, ca orice sistem biologic, posedă mecanisme de autoreglare de tipul celor descrise
în cibernetică. Autoreglarea presupune existenţa a minimum două elemente: unul care
comandă (centrul de comandă) şi unul efector, precum şi legăturilor de comunicare dintre ele.
Pentru ca răspunsul să fie corespunzător cu necesităţile sistemului, valoarea răspunsului
trebuie comparată cu comanda. Răspunsul dat de efector trebuie comunicat receptorului pe o
cale inversă conexiunea inversă (feed-back), pentru a avea loc compararea cu comanda
primită de efector, spre deosebire de legătura de la receptor la efector care poartă numele de
conexiune directă. Conexiunea inversă este obligatorie pentru orice sistem de autoreglare şi
oferă posibilitatea sistemului să fie informat despre valoarea răspunsului. Dacă răspunsul nu
corespunde necesităţilor sistemului, se dă o nouă comandă, un nou răspuns, o nouă
comparaţie.
Integralitatea constă în faptul că un sistem nu se reduce la suma însuşirilor părţilor sale
componente; sistemul privit ca un întreg, prezintă însuşiri structurale şi funcţionale noi, pe
care nu le au părţile lui componente luate izolat. Nucleul sau citoplasma nu trăiesc izolate,
celula nu poate supravieţui după distrugerea mitocondriilor etc. Datorită integralităţii sunt
posibile funcţiile biologice fundamentale: metabolismul, reproducerea, adaptarea, menţinerea
stabilităţii stării diferenţiate.
Autonomia celulelor ce compun organismele pluricelulare nu este absolută şi se poate
spune că sănătatea organismului depinde în mare măsură de sistemele de comunicaţie şi de
mecanismele de coordonare dintre celule.
Biologia celulară s-a conturat ca o disciplină nouă mai cu seamă în ultimii 50 de ani ca
urmare a progreselor revoluţionare înregistrate în studiul celulei, pe plan metodologic şi
conceptual, când s-a produs fuziunea dintre citologie, biochimie celulară, fiziologie celulară şi
genetică moleculară.
În ultimii 20 de ani s-a accentuat tendinţa de interpretare a tuturor proceselor celulare la
nivel molecular, ceea ce justifică denumirea actuală de biologie celulară şi moleculară, care a
devenit una dintre cele mai noi şi de perspectivă ramuri ale biologiei. Ea concepe celula ca un
adevărat microcosmos ,în care structurile şi funcţiile se îmbină armonios; activitatea acestui
microcosmos este determinată şi reglată genetic, astfel că funcţionarea sa se realizează cu o
mare eficienţă.

1.2. Scurt istoric

Începând cu secolul XX, se înregistrează progrese însemnate în studiul celulei, atât sub
raport metodologic, cât şi sub raport conceptual. Printre progresele metodologice sunt de
menţionat: introducerea tehnicii culturilor de ţesuturi “ în vitro “ (Harrison, 1909), ulterior a
culturilor de celule, care permit studierea comportării celulelor prin microscopia cu contrast
de fază; coloraţie vitală şi microvitală şi microcinematografie; microchirurgia (Kite,1911),
prin care se introduc micropipete fine în interiorul celulelor şi se studiază la microscopul optic
proprietăţile fizico-chimice ale citoplasmei; introducerea microscopul electronic (inventat în
1937, dar utilizat în biologie după 1954) a dus la descoperirea unei noi lumi a organizării
celulare, descifrarea ultrastructurii celulei, a detaliilor fine de organizare submicroscopică.
Aceasta a marcat şi trecerea de la citologia clasică la citologia modernă.
Dezvoltarea impetuoasă a biochimiei, la începutul secolului XX, aduce descoperirea şi
descifrarea oxidărilor celulare (Wieland, 1903; Warburg, 1908) şi se fac primele încercări de a
le localiza în particule citoplasmatice.
Punctul de convergenţă între citologie şi biochimie îl constituie dezvoltarea tehnicilor
biochimice de fracţionare a celulei prin centrifugare diferenţială. Această linie de cercetare a
fost iniţiată în 1934 de Bensley şi Hoerr şi apoi dezvoltată cu succes de Claude, Hogeboom şi
alţii în deceniul al V-lea. Prin centrifugare diferenţială s-a realizat separarea componentelor
citoplasmatice, urmată de studiul ultrastructurii şi a proprietăţilor metabolice ale acestora. În
acest fel s-au putut localiza precis anumite căi metasolice în celulă (de pildă ciclul Krebs,

14
oxidările celulare şi sinteza de ATP în mitocondtii) şi s-au descoperit şi caracterizat noi
organite celulare (lizozomii şi peroxizomii de către Christian de Dure).
Introducerea microscopiei electronice şi a fracţionării celulei prin centrifugare sunt cele
două tehnici majore care au revoluţionat studiul celulei, ducând la apariţia unei noi ramuri a
ştiinţelor biologice şi anume biologia celulară.
Studiul celulei a progresat şi în măsura perfecţionării tehnicilor de citochimie şi
histochimie, prin care se decelează anumite componente ale celulei (acizii nucleici, proteine,
glucide, lipide) se localizează enzime în celulă sau în organite.
Aceste metode se pot utiliza la microscopul optic sau la microscopul electronic. Un
punct de referinţă la constituit citofotometria acizilor nucleici (Caspersson, 1938). De
asemenea, s-au aprofundat aspectele funcţionale ca urmare a progreselor înregistrate în
fiziologia celulară. Pe de altă parte, pornind de la structurile nucleare s-a ajuns la interpretarea
şi explicarea fenomenelor eredităţii.
Sub raport conceptual biologia celulară a rezultat din fuziunea disciplinelor de citologie,
biochimie celulară, fiziologie celulară, genetică moleculară. Prin anii ’60 exista deja o
disciplină formată, cu metodologie complexă de cercetare, ilustrată de savanţi de renume
mondial dintre care Albert Claude, George Palade, Christian de Duve, laureaţi ai Premiului
Nobel în 1974, Keith Porter şi alţii.
Dar progresele spectaculare în studiul celulei au continuat cu repeziciune şi în scurta
vreme s-a înregistrat o nouă schimbare radicală. Odată cu realizările excepţionale înregistrate
în descifrarea structurii proteinelor şi acizilor nucleici prin folosirea în special a difracţiei cu
raze X, a elucidării mecanismului replicării ADN, a biosintezei proteinelor, deci a transmiterii
informaţiei genetice şi a expresiei genei s-a născut biologia moleculară, al cărui scop este
interpretarea fenomenelor biologice la nivel molecular.
Cercetările de biologie moleculară au acumulat deja un bagaj de care au permis progrese
uriaşe în diferite domenii, lăsând să se întrevadă, pentru viitor, noi perspective fascinante de
cercetare (medicină, industrie alimentară, agricultură, ecologie etc).
Progresele ultrarapide ale biologiei moleculare au dus la dezvoltarea biotehnologiei
moderne care se anunţă a deveni marea forţă industrială a secolului al XX -lea şi în care se
pune speranţa că va reuşi să rezolve problemele cele mai spinoase ale societăţii omeneşti
(alimentaţia şi starea de sănătate).
După cum se ştie, majoritatea cercetărilor şi descoperirilor epocale din biologia
moleculară au fost făcute în SUA, Japonia şi Germania; tot în aceste ţări s-a dezvoltat şi
biotehnologia modernă. La ora actuală, în SUA există 1000 de firme specializate în probleme
de biotehnologie, care lucrează produse pentru laboratoarele de genetică şi biologie
moleculară din întreaga lume; în Japonia există 300 de firme, iar în Germania 36.

1.3. Contribuţii româneşti în studiul celulei

În secolul al XIX-lea s-a impus şcoala de microscopie de la Facultatea de medicină din
Bucureşti (Diculescu şi colab., 1983). Încă din 1839 Nicolae Kretzulescu publică la Paris
rezultatele cercetărilor sale asupra structurii microscopice a dinţilor şi a mediilor transparente
ale globului ocular. Învăţământul disciplinelor microscopice apare la şcoala de medicină din
Bucureşti în anul 1859, reprezentat succesiv de Ludovic Fiala, Gh. Polizu şi Mihail
Obedenaru, care predau histologia şi citologia până în anul 1897, când ia fiinţă o catedră
independentă de histologie, citologie şi tehnică microscopică. La această catedră, printre
primele de acest fel din Europa, după acela din Franţa, se succed, în curs de circa 100 de ani,
reprezentanţi de seamă ca: Mihail Petrini-Galaţi, Alexandru Obredja, Ion Bruckner, Ştefan
Besnea, I. T. Niculescu.
Pe plan internaţional se impun în mod cu totul deosebit, Gheorghe Marinescu ( 1863-
1939), Victor Babeş (1854-1926) şi Ion Cantacuzino (1863-1934). Contribuţiile lui Gheorghe
Marinescu în neurocitologie sunt sintetizate în cartea “Celulă nervoasă” (publicată la Paris în

15
1909) care a rămas mai multe decenii o carte de bază a domeniului. Victor Babeş (coautor
împreună cu francezul A. V. Cornil al primului tratat de microbiologie din lume, publicat la
Paris în 1886) a descoperit peste 40 de microorganisme, unele constituind clasa Babesia
(Babesiozele sunt cele mai răspândite parazite ale animalelor).
Victor Babeş a mai descoperit corpii Babeş-Negri în neuron în turbare, corpusculii
Babeş-Erust în bacilul difteric. Încă din 1885 a prevăzut că între microorganisme se pot stabili
relaţii antagoniste, cu posibilităţi de aplicare a fenomenului în terapie, concepţie confirmată
ulterior prin antibiotice. Ion Cantacuzino, pe lângă contribuţiile sale de imunologie
comparată, de microbiologie şi de medicină experimentală, a descoperit factorul stimulator al
secreţiei celulare în diferite lichide biologice (de exemplu, lacrimile).
Şcoala de citofiziologie a lui Ioan Athanasiu şi Ion Drăgoi de la facultăţile de ştiinţe
naturale şi medicină veterinară din Bucureşti aduc valoroase contribuţii de citofiziologie
musculară, dintre care se remarcă descoperirea tubilor transverşi din celulele musculare
cardiace şi cele striate, lucrări publicate încă înainte de primul război mondial.
În perioada dintre cele două războaie mondiale şcoala de citologie de la Facultatea de
Ştiinţe naturale din Bucureşti este reprezentată strălucit de Dimitrie Voinov (şi continuată de
Theodor Dornescu şi I. Steopoe), iar cea de la Cluj de către I. Scriban, care s-au impus prin
descoperiri legate de aparatul Golgi şi lucrări de citologie animală (Ionescu-Varo şi colab.,
1981).
În aceeaşi perioadă Ion Drăgoi, conducând şcoala de histologie şi citologie de la
Facultatea de medicină din Cluj a efectuat cercetări deosebit de valoroase privind rolul
presiunii osmotice asupra diviziunii celulare, precum şi asupra respiraţiei ovicitelor de
mamifere.
Învăţământul superior şi cercetarea ştiinţifică din România au depus eforturi de
reorganizare în concordanţă cu evoluţia biologiei celulare în ultimele decenii. Începând cu
anul 1969 M. Ionescu – Varo iniţiază la Facultatea de biologie din Bucureşti primele cursuri
şi lucrări practice de biologie celulară, publicând totodată şi primul manual de profil din ţară.
I. Diculescu şi colaboratorii de la catedra de histologie şi citologie a Facultăţii de
medicină din Bucureşti publică prima monografie de biologie celulară din literatura română
(Diculescu şi colab., 1971).
Începând cu anul universitar 1978-1979 se introduce biologia celulară ca materie
obligatorie în planul de învăţământ la facultăţile de medicină, disciplinele de profil fiind
conduse de I. Diculescu la Bucureşti, O. Chita la Craiova, G. Cotrutz la Iaşi, Silvia Andreicuţ
la Tg. Mureş, N. Frăsinel la Timişoara şi Gh. Benga la Cluj-Napoca.
Se redactează cursuri litografiate pentru studenţii de la medicină (Benga, 1980;
Diculescu şi colab., 1981; Andreicuţ, 1982) şi un manual unic ( Diculescu şi colab, 1983 ).
Sunt, de asemenea, de menţionat laboratoarele de microscopie electronică şi biologie
celulară şi moleculară din cadrul unor institute de învăţământ superior (Universitatea din Cluj-
Napoca – dr. C. Crăciun, laboratorul de microscopie electronică ) şi de cercetare: Institutul “
Dr. I. Cantacuzino “ (microscopie electronică – dr. A. Petrovici, biologie celulară – dr. Gh.
Gancevici), Institutul “ Dr. V. Babeş ” (biologie celulară – dr. C. Dragomir), Institutul “L.
Pasteur” (microscopie electronică cu baleiaj – dr. N. Manolescu), Institutul “Ştefan S.
Nicolau” (biologie moleculară – dr. L. Popa, dr. S. Antohi), Institutul Oncologic Bucureşti (
biologie moleculară – dr. I. Voiculeţ), Institutul de ştiinţe biologice, Bucureşti ( microscopie
electronică – dr. H. Tiţu şi colab.) şi altele.
Din 1979 a luat fiinţă “Institutul de Biologie şi Patologie Celulară” din Bucureşti, aflat
în legătură permanentă cu secţia de biologie celulară a Facultăţii de medicină din Yale, S.U.A
(profesor George Emil Palade).
Merită subliniat în acest context, descoperirile de o valoare inestimabilă a lui G. E.
Palade, primul român laureat al Premiului Nobel. Aprecierile de “principal cartograf al
celulei” sau “cel mai mare biolog al secolului XX” (Blobel, 1980) sunt justificate nu numai de
multiplele sale descoperiri, ci şi de orizonturile noi deschise în biologia celulară. Palade este

16
unul din pionierii elaborării tehnicilor de microscopie electronică (a pus la punct metoda de
fixare şi secţionare ultrafină, ce i-a permis observarea pentru prima dată a multor structuri
celulare) şi de centrifugare diferenţială ( a introdus zaharoza ca mediu de fracţionare). A
descoperit ribozomii (numiţi şi “granulele lui Palade”) şi a precizat rolul lor în sinteza
proteinelor, a elucidat calea secţiei celulare, a descoperit transportul pe calea veziculelor prin
endoteliul capilar şi reciclarea membranelor celulare; a studiat biogeneza membranelor, şi aici
fiind un deschizător de drumuri.
Biologia celulară şi moleculară reprezintă nu numai unul din cele mai dinamice domenii
în care avansează frontierele cunoaşterii umane, ci şi pilonul fundamental ce stă la baza
revoluţiei ştiinţifice, pe care o trăim în prezent, cu implicaţii de maximă importanţă
economică, medicală, ecologică şi în ultimă analiză, filozofică.

1.4. Principalele teorii care au condus la modul actual de gândire despre

natura materiei vii
Secolul al XIX-lea a reprezentat un salt în cunoaşterea organizării materiei vii.
Acumularea de date şi cunoştinţe a permis şi fundamentarea unor teorii care au condus la
modul actual de gândire despre natura materiei vii, printre care:
- Teoria celulară, care a stabilit că la baza structurii ţesuturilor, organelor şi a întregului
organism, vegetal şi animal, stă celula;
- Teoria cromozomială a eredităţii, care consideră că la baza controlului şi transmiterii
caracterelor ereditare stau cromozomii (şi în ultimul timp ADN);
- Teoria moleculară, care consideră că viul este constituit din materia moleculară (ca şi
neviul);
- Teoria biostructurală, de dată mai recentă (sec XX-lea) ce aparţine academicianului E.
Macovschi şi care consideră viul materie biostructurată, superior organizată
(biostructura), formă cu totul specială a materiei, purtătoarea însuşirilor biologice pe
care le imprimă viului şi care include materia moleculară.
- Teoria evoluţionistă, ipoteză care afirmă că toate speciile de animale s-au transformat
unele în altele, de la primele vietăţi unicelulare, până la maimuţă şi om, în miliarde de
ani, mai afirmă că speciile de plante auevoluat de la forme unicelulare până la plantele
cu flori şi că acest proces evolutiv s-a desfăşurat pe cale naturală, prin factori
întâmplători.

1.4.1. Teoria celulară

La sfârşitul secolului al XVIII-lea, epoca de invenţie a primelor microscoape, R. Hooke

(1665) observă că pluta este alcătuită din numeroase „cămăruţe”, asemănătoare unor faguri de
albine, pe care le-a denumit „celule” (de la lat. cellula – cameră mică). În aceeaşi perioadă
Leuwenhoeck (1674), descoperă celulele libere şi identifică şi nucleul în eritrocite.
Importanţa acestor noţiuni nu a fost înţeleasă decât mai târziu. La începutul secolului al
XIX-lea, dispunând de microscoape mai perfecţionate, numeroşi cercetători descriu celulele
în diferite organisme vii. Puţin câte puţin, se desprinde ideea că toate fiinţele sunt alcătuite
din celule şi din substanţe ce provin din activitatea lor. Schleiden (1838) şi apoi Schwann
(1839), exprimă această concepţie, care reprezintă o sinteză fundamentală a cunoştinţelor
despre celulă până la acea dată şi care este încă una dintre concepţiile de bază ale biologiei
actuale.
Observarea şi studiul diviziunii celulare de către mulţi autori, conduc pe Virchow (1855)
să enunţe o nouă idee: omnis cellula e cellula (toate celulele provin dintr-o celulă
preexistentă).

17
 Fiecare celulă posedă un nucleu (Brown, 1831), care derivă tot dintr-un nucleu
preexistent (Strasburger, 1876). Celula conţine o substanţă „gelatinoasă, diafană, insolubilă în
apă, care se contractă într-o masă globuloasă, se ataşează de suprafaţa de secţiune şi se lasă
întinsă asemănător unui mucus” (Dujardin, 1835). Această substanţă reprezintă protoplasma
(Purkinje; Von Mohl, 1840).
Schneider (1873), apoi Strasburger (1876) descoperă diviziunea indirectă în celulele
vegetale; Fleming (1880)o observă în celulele animale şi o numeşte mitoza,; Schneider
(1878) adaugă termenul de cariochineză, în timpul căreia cromozomii se repartizează în mod
egal între celulele-fiice.
În cursul fecundării ovulului de către spermatozoid cei doi pronuclei fuzionează în oul
fecundat (Hertwig, 1875). Oul (celula-ou) dă naştere unui nou organism.
De la o generaţie la alta, viaţa se caracterizează printr-o succesiune neîntreruptă de
celule. Studiul creşterii şi dezvoltării organismului, a maladiilor sale, a reproducerii şi a
fenomenelor de transmitere ereditară, sunt în raport cu structura şi funcţia celulelor sale.
Descoperirile recente pot provoca unele dificultăţi, referitoare la generalizarea teoriei
celulare. Este cazul virusurilor care au o organizare foarte particulară. Totuşi, teoria celulară
se evidenţiază ca fiind extrem de aplicabilă. Nu numai celulele, dar şi organitele, cum sunt
cromozomii, sau moleculele ca cele de ADN (acid dezoxiribonucleic) preced structuri
preexistente analoge; ele au o continuitate genetică.
După A Lwoff (1962), teoria celulară implică o unitate de plan de organizare, dar de
asemenea o unitate de funcţionare şi o unitate de compoziţie. Celulele sunt organizate după un
plan foarte general comun, ele funcţionează după aceleaşi legi şi sunt constituite din molecule,
care cu toată marea lor diversitate, sunt constituite dintr-un număr foarte limitat de materiale.

1.4.2. Teoria cromozomială a eredităţii

Caracterul esenţial al unei celule vii constă în capacitatea de a transmite în mod ereditar
trăsăturile sale de la o generaţie la alta.
Deşi fenomenul a fost remarcat cu foarte mult timp în urmă, el nu a putut fi descifrat
decât spre sfârşitul secolului XIX-lea şi începutul secolului al XX-lea.
Meritul îi revine naturalistului ceh Gregor Mendel care elaborează (1866) două
importante legi ale geneticii, cunoscute sub numele de legile lui Mendel.
În scopul de a descifra mecanismele ce determină exprimarea anumitor caractere, cât şi
transmiterea lor de-a lungul generaţiilor, Mendel utilizează metoda analizei genetice
(hibridologică). Principiul acestei metode constă în încrucişarea unor indivizi ai aceleaşi
specii care se deosebesc între ei prin una sau mai multe caractere (trăsături) individuale, bine
conturate şi analiza descendenţilor obţinuţi. Cel mai important factor ce poate influenţa
rezultatele furnizate prin metoda analizei genetice îl constituie puritatea genetică a genitorilor.
Indivizii folosiţi în încrucişări trebuie să manifeste o mare constanţă a caracterelor ereditare.
Un material biologic adecvat acestui scop este mazărea (Pisum sativum), plantă folosită
în experimentele efectuate de Mendel.
Prima lege mendeliană este legea purităţii gameţilor. Sub denumirea de „legea purităţii
gameţilor ” sunt unite de fapt două legi sau două principii: a uniformităţii hibrizilor din prima
generaţie şi cea a segregării. Această lege se bazează pe rezultatele unui experiment de
monohibridare (indivizii încrucişaţi se deosebesc printr-o singură pereche de caractere
ereditare) Mendel a încrucişat un soi de mazăre cu boabe de culoare galbenă (G) cu un alt soi
ale cărui boabe erau verzi (v). În urma acestei încrucişări s-a obţinut prima generaţie hibridă
F1. Toţi hibrizii din F1 prezentau boabe de culoare galbenă, moştenind caracterul ereditar al
unui singur genitor. Caracterul alternativ (culoare verde) nu a fost exprimat de nici unul din
indivizii primei generaţii.

18
 Mendel introduce termenul de dominanţă pentru a definii fenomenul de exprimare, la
hibrizii din F1, numai a unuia dintre caracterele parentale alternative. Caracterul ce se
manifestă la descendenţii din prima generaţie a fost numit dominant, în timp ce caracterul
alternativ, nemanifestat i s-a atribuit termenul de recesiv.
În urma autopolenizării (sau încrucişării) hibrizilor din F1 s-a obţinut a doua generaţie
de descendenţi , F2.
Unii dintre aceştia prezentau caracterul dominant, în timp ce alţii manifestau caracterul
recesiv. Diferenţiere caracterelor parentale la indivizii din a doua generaţie a fost numită
segregare.
În urma unui studiu statistic al segregării, Mendel a obţinut raportul de 3:1 între
caracterul dominant şi cel recesiv (fig. 1).
Mendel şi-a extins cercetările şi asupra generaţiilor următoare. El a remarcat faptul că
plantele cu boabe verzi au descendenţi identici. Din plantele cu boabe galbene doar o treime
exprimă constant caracterul ereditar, restul de două treimi manifestând o segregare similară
generaţiei F2 (3 dominant : 1 recesiv)

♂
Gameţi F1 G g
♀

G GG Gg

G gG gg

Fig.1. – Schema care reprezintă prima lege a lui Mendel ( legea purităţii
gameţilor ). Se poate observa că în generaţie F2 raportul fenotipului dominant şi cel
recesiv este de 3/1. G = gena dominantă; g = gena recesivă.

Mendel explică rezultatele obţinute lansând ipoteza factorială care are drept suport
presupunerea existenţei unor factori interni materiali ce stau la baza exprimării caracterelor
ereditare. Aceşti factori, intuiţi de Mendel, sunt cunoscuţi azi sun numele de gene (termen
introdus în 1909 de către Wolhelm Johanerson). În toate organismele, factorii se găsesc în
pereche, fiecare conţinând un factor dominant şi altul recesiv.
Astfel de cupluri au primit ulterior numele de perechi alele.
Factorii sunt transmişi descendenţilor prin intermediul gameţilor parentali (matern şi
patern) ce conţin câte unul din factorii ce alcătuiesc cuplul(sunt puri din punct de vedere
genetic).
În urma fecundării, gameţii se combină în moduri diferite ceea ce explică fenomenul de
segregare manifestat în F2.
În cazul experimentului de monohibridare se constată existenţa unei duble segregări, atât
fenotipică, cât şi genotipică. Din punct de vedere fenotipic (al aspectului exterior al
individului), raportul de segregare este de 3:1 (dominant/recesiv). Segregarea genotipică
constă în redistribuirea factorilor în cupluri diferite, în generaţia F2.
Analizând diagrama lui Punnett, se constată formarea, în a doua generaţie, a două
cupluri identice cu cele ale genitorilor şi altor două similare hibrizilor din F1, stabilit fiind de
1:2:1 (fig. 2).

19
 Fig. 2. Diagrama factorilor ereditari aleloformi în experimentul de
monohibridare. P = generaţie parentală; F1, F2 , F3 = generaţiile filiale (hibrizii); =
genitorul parental femel; = genitorul parental masculin; G = caracterul dominant
(culoarea galbenă); g = caracterul recesiv (culoarea verde).

Studiul posibilităţilor de combinare a factorilor ereditari în cupluri stă la baza unei noi
clasificări a organismelor. Se disting, astfel, două tipuri de organisme: homozigote (la care
factorii ce alcătuiesc cuplul sunt identici) şi heterozigoze sau hibride (la care factorii ereditari
pereche sunt diferiţi).
Legea segregării (disjuncţiei) independente a perechilor de factori ereditari respectiv a
perechilor de caractere este a doua lege elaborată de Mendel. Ea este fundamentată pe un
experiment de dihibridare (genitorii se deosebesc între ei prin două perechi de caractere
constante). Mendel a încrucişat un soi de mazăre cu boabe galbene şi netede (GN) cu un alt
soi cu boabe verzi şi zbârcite (vr)
Experienţele preliminare au demonstrat că atât culoarea galbenă, cât şi aspectul neted al
boabelor sunt dominante asupra caracterelor alternative. În urma încrucişării celor doi genitori
s-a obţinut prima generaţie de descendenţi F1, în care manifestate erau doar caracterele
dominante.

20
 Cei 16 descendenţi din a doua generaţie F2 rezultaţi prin autopolenizarea (sau
încrucişarea) hibrizilor din F1, se pot încadra în patru clase genotipice, raportul de segregare
fiind de 9:3:3:1 astfel:
Š 9 plante prezentau ambele caractere dominante (boabe galbene şi netede);
Š 3 plante manifestau primul caracter dominant (boabe galbene şi zbârcite);
Š 3 plante exprimau al doilea caracter dominant (boabe verzi şi netede);
Š 1 plantă nu prezenta nici unul din caracterele dominate (boabe verzi şi zbârcite).
Cei şase (3+3) indivizi ce exprimă genotipuri noi, diferite de cele ale genotipurilor, sunt
numiţi recombinanţi.
Din modul de segregare a fiecărui caracter în parte, se constată că fiecare pereche de
caractere, segregă independent într-un raport de 3:1. Atât raportul se segregare fenotipică, cât
şi exprimarea fenotipurilor noi se explică admiţând prezenţa în genomul hibrizilor din F1 a
tuturor genelor parentale (fig.3)

Fig. 3. Schema dihibridării şi a segregării factorilor în F1, reprezentând cea de-a

doua lege a lui Mendel. Un părinte este homozigot pentru două gene dominante: GG
care determină culoarea şi RR care determină forma. Cel de-al doilea părinte este
homozigot pentru alelele recesive gg şi rr. Generaţia F1 este uniformă pentru
caracterele dominante. Fecundarea produce un număr egal de 4 x 4 = 16 combinaţii
prezentate în pătratele figurii (generaţia F2 ). Aceste 16 combinaţii se găsesc în 4 clase de
genitori.
21
 Anterior experimentelor mendeliene, studiile citologice subliniau implicarea
cromozomilor în procesul transmiterii ereditare a caracterelor. Corelând datele genetice cu
cele furnizate de citologie, W.S.Sutton (1903)şi T. Boveri (1904) ajung la concluzia că
factorii ereditari (genele) sunt localizaţi în cromozomi, segregarea perechilor alele, într-un
heterozigot, explicându-se prin segregarea cromozomilor ce conţin genele în procesul de
formare a celulelor sexuale (gametogeneza).
Orice tip de celulă diploidă conţine cromozomi de provenienţă maternă şi paternă ce
formează cupluri de cromozomi omologi. În timpul meiozei atât ataşarea cromozomilor de
fibrele fusului de diviziune, cât şi deplasarea lor spre polii celulei sunt fenomene ce se
desfăşoară la întâmplare. Acest lucru explică de ce gameţii rezultaţi în urma meiozei pot
conţine orice combinaţie a factorilor ereditari parentali.
Punerea în discuţie, din perspectiva citologică, a universalităţii legilor mendeliene a
condus la concluzia că libera combinare a factorilor ereditari are loc numai când factorii ce
determină exprimarea perechilor de caractere sunt localizaţi în perechi de cromozomi omologi
diferiţi. Deci numărul factorilor ce segregă, independent între ei, poate fi cel mult egal cu
numărul de perechi de cromozomi omologi prezenţi într-un organism dat.
Corelaţia rezultatelor cercetării fenomenului ereditar s-a finalizat prin elaborarea, în
1920, a Teoriei cromozomiale a eredităţii, teorie preluată şi dusă la apogeu de Thomas
Morgan (Drosophila melanogaster, analiza genetică, hărţi genetice) teorie susţinută azi de
informaţiile furnizate de biologia moleculară.

1.4.3. Teoria moleculară a materiei vii

Conform modului actual de gândire despre natura viului, oglindit în cercetare şi în

programul de învăţământ, viul este constituit din materie moleculară; (Bauley, 1970; Orten,
Neuhaus, 1975; Tamaş ,1975); însuşirile biologice sunt condiţionate de metabolism (Oparin,
1960; Watson 1974); moartea este consecinţa încetării metabolismului; natura materiei vii şi
natura materiei moarte sunt calitativ identice (Haas; 1964).
S-a ajuns la convingerea că acest mod de gândire reflectă natura vie aşa cum este ea,
deci întru-totul realităţii. Se mai consideră ca numeroasele descoperiri de mare importanţă
pentru biologie, făcute la nivel molecular ca şi cele ce privesc codul genetic, mecanismul de
biosinteză a proteinelor, autoreglarea şi coordonarea reacţiilor enzimatice, sinteza genelor şi
altele, vin în sprijinul actualului mod de gândire despre natura materiei vii, demonstrând
valabilitatea lui. Datorită acestei situaţii cercetarea viului se orientează tot mai mult spre
aspecte legate de structura chimică a substanţelor din organisme şi de interrelaţiile chimice şi
fizice dintre moleculele acestor substanţe. De aici abordarea tot mai frecventă a fenomenelor
biologice în termeni moleculari, tendinţă de „chimizare” a diferitelor ramuri ale biologiei şi
apariţia disciplinelor biologice noi, numite moleculare, cum sunt biologia moleculară,
genetica moleculară, patologia moleculară şi chiar biochimia moleculară. Astfel asistăm la un
adevărat triumf al „molecularismului” în biologie.
Deci, conform modului actual de gândire, materia vie, în totalitatea ei, are natură
moleculară, iar descifrarea fenomenelor biologice, la nivel molecular va permite cunoaşterea
vieţii, cunoaşterea sistemelor vii (Karlson, 1967; Manta, 1968; Watson, 1974).

1.4.4. Teoria biostructurală a materiei vii

Plecând de la unele deficienţe de ordin teoretic, experimental şi filosofic ale teoriei

moleculare acad. român Eugen Macovschi elaborează o nouă teorie despre natura şi structura
viului, teorie publicată în diverse articole şi cărţi, între anii 1958-1976.

22
 Conform concepţiei lui Macovschi, principalele idei deficiente ale teoriei moleculare
sunt următoarele:
- Materia vie şi materia moartă sunt calitativ identice, dar nu se explică de ce cele două
forme ale materiei, vie şi moartă, au totuşi însuşiri atât de diferite; se ştie doar că formele
materiei identice calitativ trebuie să aibă şi însuşiri de aceeaşi natură.
- În materia vie toate reacţiile chimice sunt coordonate şi constituie metabolismul, viaţa,
fiind forma chimică de mişcare a materiei, dar nu se arată cum anume se realizează
această coordonare a reacţiilor chimice şi nu se indică modul cum, de la chimismul
obişnuit coordonat, se ajunge la manifestările vieţii. Afirmaţia că fenomenele biologice,
manifestările însuşirilor biologice ale materiei vii se reduc la chimismul obişnuit este
greu de înţeles. Se ştie doar că însuşirile sunt ale materiei şi depind de natura, de calitatea
ei şi nu sunt ale reacţiilor chimice care se desfăşoară în materie, indiferent dacă sunt sau
nu coordonate.
- Moartea este consecinţa încetării metabolismului adică a încetării coordonării reacţiilor
chimice, dar nu se precizează cum se ajunge la încetarea metabolismului. Părerea că
odată cu moartea manifestarea însuşirilor biologice ale materiei vii încetează datorită
încetării metabolismului este greu de înţeles. Se ştie doar că încetarea manifestării unor
însuşiri este condiţionată de transformarea materiei purtătoare a însuşirilor respective şi
nicidecum de încetarea desfăşurării sau coordonării unor reacţii chimice.
- Fenomenele şi legile biologice derivă, se reduc şi se deduc din fenomene şi legi chimice
şi fizice, dar nu explică în ce constă şi cum se realizează (Macovschi, 1969). Conform
teoriei biostructurale, materia vie (viul) constă din materie biostructurală şi din materie
moleculară coexistentă. Materia biostructurală este o formă cu totul specială a materiei,
prin alcătuirea sa specifică, ea se deosebeşte de materia moleculară obişnuită, iar, prin
structură, este purtătoarea însuşirilor biologice pe care le imprimă viului din care face
parte.
- Materia biostructurală este alcătuită din componente. Acestea provin din molecule
normale, obişnuite, ale combinaţiilor chimice adecvate, care printr-un schimb de energie,
realizabil numai în condiţiile viului, se încarcă cu energie şi trec într-o stare specială,
specifică viului, integrându-se în biostructură. Datorită stării speciale, componentele
materiei biostructurale nu se mai comportă ca molecule, iar datorită surplusului de
energie ele exercită în cadrul materiei biostructurate anumite funcţii elementare
(biologice, bioritmice, cibernetice, genetice, informaţionale etc.) pe care nu le pot
exercita atunci când se află în afara acestei materii, ca simple molecule. Exercitarea
funcţiilor duce la manifestarea anumitor microfenomene, din a căror însumare derivă
fenomenele biologice, manifestarea vieţii.
Prin acumulări, cedări, şi consumuri de energie, componentele pot suferi modificări care
nu implică obligatoriu, dar nici nu exclud, manifestarea structurii chimice a componentelor
respective. Modificările componentelor se deosebesc profund de transformările chimice
obişnuite, nu pot fi înţelese şi cercetate de pe poziţiile chimice şi reprezintă modificări sau
reacţii biostructurale, totalitatea cărora constituie biostructurismul materiei vii.
Componentele materiei biostructurale se leagă prin anumite forţe corelative,
biovalenţele, care acţionează numai în viul. Datorită acestor forţe şi stării speciale a
componentelor, materia biostructurală se prezintă ca un întreg continuu în care o modificare
provocată în starea unei componente se transmite şi se repercutează asupra stării celorlalte.
Prin alcătuirea, natura şi funcţiile sale speciale, materia biostructurală reprezintă o
structură biologică dinamică, în continuă dezvoltare, care reflectă stadiul superior de
dezvoltare şi organizare a materiei, prezintă particularităţi dependente de specie, individ,
organ, ţesut, vârstă etc., are însuşiri de semiconductor şi de corp solid şi se comportă ca un
sistem informaţional, cibernetic, cuantificabil, cvadridimensional, purtător al bioplasmei şi
programului genetic, ce depăşeşte posibilităţile de înţelegere şi de investigaţie de pe poziţiile
moleculare.

23
 Odată cu moartea, biostructura se destramă, ceea ce duce nu numai la eliberarea unora
din componentele ei sub formă de molecule, dar şi la apariţia unor fragmente polinucleare
mai mari sau mai mici, care includ enzime şi alţi compuşi chimici. Aceste fragmente, cu
aspect de membrane, nu preexistă ca atare în biostructură ci se formează ca artefacte pe
măsura destrămării acesteia.
Materia moleculară coexistă, formează materia nevie şi ca atare nu este purtătoarea
însuşirilor biologice, dar participă la manifestarea acesteia în carul coexistenţei cu materia
biostructurală. Biochimismul care se desfăşoară în materia moleculară coexistentă furnizează
energia necesară atât schimbării moleculelor în componente, cât şi menţinerea integrităţii şi
stării funcţionale normale a materiei biostructurale. La rândul ei, materia biostructurală, prin
fenomenele care se desfăşoară la nivelul ei, contribuie atât la coordonarea biochimismului din
materia moleculară coexistentă, cât şi la asigurarea compoziţiei chimice normale a acesteia.
Astfel, cele două forme ale materiei, biostructurată şi moleculară coexistă şi formează
acea unitate morfo-funcţională care constituie însăşi materia vie.
Teoria biostructurală reprezintă un mod de gândire despre natura materiei vii care
prezintă o serie de aspecte ipotetice, dar care deschide noi căi de cercetare ce vor confirma,
modifica sau chiar abandona unele dintre aceste aspecte.

1.4.5. Teoria evoluţionistă, originea vieţii şi a omului

Pentru omul de cultură, evoluţionismul a devenit o certitudine. Nimeni nu îşi pune

problema originii omului decât din această unică perspectivă, cea a lui Darwin.
În anul 1859 cercetătorul britanic, Charles Darwin lansa o teorie care încerca să explice
originea speciilor de plante şi animale altfel decât prin creaţie. Conform acestei teorii, speciile
ar evolua în mod naural unele din altele, de la forme simple la forme mai complexe şi astfel ar
fi luat naştere toate vieţuitoarele existente astăzi, inclusiv omu, despre care se afirmă că ar fi
provenit dintr-o specie de maimuţă.
Acestă teorie, nu a fost demonstrată niciodată şi au existat numeroase dicuţii chiar în
timpul lui Darwin, dar unele partide politice, fiind interesate mai ales de aspectul moral al
problemei (dacă omul se trage din maimuţă, atunci suntem liberi să ne purtăm ca animalele ),
au preluat ideea şi au reuşit să o impună ca teorie oficială. Astfel s-a ajuns ca în toate ţările
guvernate de asemenea partide să se înveţe că omul se trage din maimuţă.Şi în şcolile din
România, la toate nivele continuă să se predea teoria evoluţionistă, deşi au trecut 18 ani de la
căderea comunismului. Din nefericire, subiectul evoluţionismului este încă încărcat de reacţii
emoţionale, ceea ce face ca o mulţime de oameni să nu dorească să-l discute.

Iată care sunt în prezent concepţiile cu privire la originea vieţii şi a omului:

Š Evoluţionismul ateist este ipoteza care afirmă că speciile de animale s-au transformat
unele în altele, de la primele vietăţi unicelulare până la maimuţă şi om, în mai multe
miliarde de ani, mai afirmă că speciile de plante au evoluat de la forma unicelulară până la
plantele cu flori şi că acest proces evolutiv s-a desfăşurat pe cale naturală, prin factori
întâmplători. Dar, până în prezent, nu există nici o dovadă a evoluţiei speciilor, mai mult,
raţionamentele evoluţioniste conţin erori de logică şi ştiinţa actuală respinge ipoteza
evoluţiei.
Š Evoluţionismul teist este ipoteza care afirmă că evoluţia speciilor este un fapt real, că ea
a parcurs etapele prezenate de evoluţionismul ateist, dar că este rezultatul lucrarii directe a
lui Dumnezeu. Aici sunt de facut două precizări, mai întâi, cât rămâne în domeniul ştiinţie,
ipoteza evoluţiei rămâca o simplă ipoteză, însă, în momentul în care este inclusă în
învăţătura de credinţă, ipoteza devine o erezie.Teoria susţine că Dumnezeu a creat doar
două vietăţi unicelulare pe care le-a ajutat apoi să evolueze până la maimuţă şi om, în
miliarde de ani.

24
Š Creaţionismul fixist, este doctrina conform căreia speciile nu suferă nici o schimbare, ci
rămân exact cum au fost create. Realitatea arată că în cadrul speciilor pot apărea rase sau
soiuri, fără a depăşi graniţile speciei.
Š Creaţionismul ştiinţific este teoria ştiinţifică(bazată pe genetică, pe teoria probabilităţilor
şi pe teoria informaţiei) ce demonstrează că este imposibil ca speciile să apară spontan
(din întâmplare) şi să evolueze, transformându-se una în alta. Din această imposibilitate
rezultă că speciile au fost create de un Creator.
Referitor la fenomenul „evoluţiei” se acceptă un proces evolutiv numit microvoluţie,
prin care, pornind de la populaţii, rase şi soiuri, prin mutaţii genetice pot să apară populaţii,
rase şi soiuri noi de plante şi animale în cadrul aceleiaşi specii (indivizii deci, se pot încrucişa
între ei dând naştere la urmaşi fertili).
Prin extensia acestui fenomen evolutiv – microevoluţie – desfăşurat la nivelul speciilor
(care se pot încrucişa între ele) s-a ajuns la macroevoluţie, fenomen ipotetic care încearcă să
explice originea speciilor de plante şi animale conform teoriei lui Darwin, teorie aflată în
contradicţie cu creaţionismul, care afirmă că speciile de plante şi animale, inclusiv omul, au
fost create de Dumnezeu.
Unul dintre cei mai mari biologi, Piere P. Grassé, fost preşedinte al Academiei Franceze
de Ştiinţe, îşi încheie cartea sa Ľ Évolution du vivant (Evoluţia organismelor vii,1973) cu
acest nimicitor rechizitoriu al evoluţiei darwiniste:
„ Prin uzul şi abuzul unor postulate ascunse, al unor îndrăzneţe şi adesea neîntemeiate
extrapolări, s-a creat o pseudo – ştiinţă. Ea prinde rădăcini în chiar miezul biologiei, făcând
să rătăcească numeroşi biochimişti şi biologi, ce cred în mod sincer că acurateţea
conceptelor fundamentale a fost demonstrată, ceea ce este departe de realitate.”
Începând cu anii optzeci, tot mai mulţi savanţi necreaţionişti au făcut cunoscut că teoria
neodarwinistă (modelul evoluţionist actual), nu poate explica noile date din domeniul
geologiei, paleontologiei, astronomiei, geneticii, fizicii, biochimiei şi a altor ştiinţe.
Astfel, în anul 1985 a apărut cartea lui Michael Denton, cercetător australian în
domeniul biologiei moleculare, Evolution: A Theory in Crisis (Evoluţia: criza unei teorii), ce
oferă o critică sistematică a modelului evoluţionist actual din perspectiva mai multor
discipline ştiinţifice.Din punctul de vedere al propriei discipline, Denton arată că descoperirile
specialiştilor în biologie moleculară aruncă din ce în ce mai multe îndoieli asupra pretenţiilor
darwiniste.
În anul 1996 apare cartea renumitului profesor de biochimie de la Berkeley University
din California, Michael Behe, Darwin's Black Box (Cutia neagră a lui Darwin), în care se
arată că uimitoarele descoperiri ale biochimiei nu se împacă deloc cu nici un fel de
darwinism.
În 1997 o altă carte ce dădea de gândit a constituit o puternică lovitură împotriva
darwinismului: Not By Chance !( Nu întâmplător !) de Dr.Lee Spetner. Biofizician evreu,
specializat în codul genetic, Spetner şi-a petrecut 30 de ani cercetând posibilitatea evoluţiei la
nivel genetic. El arată nu numai de ce mutaţiile întâmplătoare nu vor produce niciodată
schimbările pretinse de evoluţionişti, ci oferă şi noi căi ştiinţifice de investigare a felului cum
are loc variaţia în limitele genetice ale fiecărui fel de organism.
În ultimii ani, savanţi reputaţi au început să ridice serioase îndoieli asupra evoluţiei,
darwiniste, astfel că până în prezent a apărut o mare cantitate de literatură ştiinţifică extrem
de critică la adresa teoriei evoluţioniste. Unii caută un nou model, deşi nu prea ştiu unde să-l
găsească.
Ar fi desigur prea mult să socotim că toţi aceştia se vor întoarce către „modelul
creaţionist”, întrucât, nici creaţia, nici evoluţia nu pot fi dovedite în chip definitiv: de fapt,
amândouă ţin de credinţă şi filozofie, de o alegere iniţială.

25
 Capitolul 2

MEMBRANELE CELULARE
O ramură aparte a biologiei moleculare – biomembranologia - a fost oficializată în anul
1977, cu ocazia unui simpozion desfăşurat în Germania, la Karlsruhe. Această nouă ramură a
biologiei, care se ocupă cu studiul membranelor celulare, a reuşit să se contureze prin
colaborarea interdisciplinară a unui număr foarte mare de specialişti în domeniul biologiei,
medicinii, biofizicii, biochimiei.
În 1950 erau descrise doar două membrane: cea plasmatică şi cea nucleară. În cursul
anilor 60, datorită posibilităţilor de investigaţie oferite de microscopia electronică, au putut fi
evidenţiate şi studiate în detaliu un număr tot mai mare de structuri membranare (tip organite
permanente celulare: reticul endoplasmatic, mitocondrii, complex Golgi, cât şi structuri cu
viaţă limitată, tip vezicule de condensare şi lipozomi).
Orice pătrundere din mediul exterior în interiorul organismului implică un schimb
transmembranar. Prin urmare, substanţele exogene trebuie să traverseze una sau mai multe
membrane biologice înainte de a ajunge la centrii activi.
Traversarea membranelor este condiţionată de: natura chimică şi organizarea
moleculelor constitutive ale membranei; proprietăţile fizico-chimice ale substanţei, structura
fizico-chimică a moleculelor mediului de o parte şi de cealaltă a membranei.

2.1. Definiţia şi clasificarea membranelor celulare

Membranele celulare reprezintă structuri complexe ce delimitează şi compartimentează
conţinutul celular. Arhitectura tuturor membranelor celulare (membrana plasmatică şi
membranele organitelor) prezintă drept caracteristică comună asamblarea prin legături
necovalente a biomoleculelor componente (lipide şi proteine) într-o structură dinamică şi
fluidă.
Elementul structural fundamental al membranelor celulare, dublul strat lipidic, defineşte
modul de organizare al lipidelor şi se comportă ca o barieră impenetrabilă pentru majoritatea
moleculelor hidrofile (aqua-solubile). Proteinele membranare, asociate dublului strat lipidic,
asigură funcţionalitatea membranelor, ele fiind implicate în multiple procese:
Š transportul molecular şi ionic transmembranar;
Š realizarea conexiunilor intercelulare şi a ancorării celulelor în matricea extracelulară;
Š desfăşurarea reacţiilor enzimatice asociate structurilor membranare;
Š controlul fluxului de informaţie dintre celulă şi mediul înconjurător prin recunoaşterea,
legarea şi transmiterea moleculelor-semnal;
Š imunitatea celulară.
Grefarea seturilor distincte de proteine în dublul strat lipidic, cât şi stabilirea unui
anumit raport între principalele molecule componente conduc la clasificarea membranelor
celulare în trei tipuri:
Membrana citoplasmatică (membrana plasmatică, plasmalema) este o structură
bidimensională continuă (grosimea 6-10 nm), cu proprietăţi caracteristice de permeabilitate
selectivă, ce conferă individualitate celulei, separând-o de mediul înconjurător.
Membranele interne ale celulelor eucariote – endomembranele - (grosimea 6 nm)
compartimentează spaţiul intracelular, delimitează organitele celulare (nucleu, reticul
endoplasmatic, aparat Golgi, mitocondrii, lizozomi, peroxizomi), creând astfel spaţii adecvate
reacţiilor enzimatice celulare.
Membranele speciale prezintă particularităţi structurale, în această categorie
încadrându-se: teaca de mielină, o structură multimembranară derivată din membrana

26
plasmatică a celulelor Schwann ce înconjoară şi izolează axonul celulelor nervoase; discurile
suprapuse localizate în regiunea externă a celulelor fotoreceptoare din retină.

Fig. 4. Structura
inframicroscopică a celulei

1-membrana celulară; 2-
endoplasma (hialoplasma); 3-
ergastoplasmă; a-reţea
endoplasmatică (membrane cu
dublu contur); b-granulaţii fine
(microzomi); 4-filamente
intracelulare (descoperite în celule
epiteliale, fibroblaşti, în celule
nervoase); 5-vacuolă; 6-granule
lipidice; 7-centrul celular; 8-
centrosferă; 9-nucleu; c-membrana
nucleului; d-pori în membrana
nucleului; 10-nucleol; 11-aparatul
Golgi; 12-mitocondrii

2. 2. Organizarea membranelor celulare

În prezent se bucură de acceptare unanimă modelul în „mozaic fluid” lipido-proteic

elaborat în 1971-1972 de către Singer şi Nicolson care satisface condiţiile de stabilitate
termodinamică ale sistemelor membranare.
Elementele care l-au impus constau pe de o parte, în confirmarea dublului strat lipidic ca
element fundamental al structurii membranelor şi pe de altă parte, în definirea modului de
asamblare a proteinelor în dublul strat lipidic.
Autorii concep membrana celulară ca pe un fluid structurat alcătuit dintr-un bistrat
lipidic aflat într-o stare de cristal lichid şi care este penetrat local sau parţial de proteine
globulare cu caracter insular (fig. 5).
Lipidele şi proteinele membranare, relativ libere prezintă mobilitate în planul
membranei executând mişcări de difuziune şi rotaţie în jurul propriilor axe. La componentele
de bază ale membranelor - lipidele şi proteinele - se adaugă constant carbohidraţii, apa şi o
serie de ioni.
Pe partea citoplasmatică membrana este susţinută (în numeroase cazuri) de o reţea de
proteine fibrilare ce constituie un citoschelet.

27
 Fig. 5. Structura unei membrane biologice (Stryr, 1991)
a şi b = proteine periferice de membrană; c = proteină de membrană (tip lecitinic): traversează
bistratul lipidic; d = proteină de membrană (tip Ig): traversează bistratul lipidic

Modelul „mozaicului fluid” oferă cadrul conceptual adecvat pentru explicarea atât a
funcţiilor de transport, cât şi a plasticităţii conformaţionale a celulelor, a proceselor
imunologice şi a efectelor produse asupra membranelor de diferiţi agenţi chimici (hormoni,
mediatori chimici, medicamente, toxine etc.).
Membranele biologice au structuri fluide dinamice în continuă modificare; în fiecare
moment, proteinele şi lipidele din structura membranelor sunt înlocuite cu altele noi.
Ribozomii şi reticulul endoplasmatic, care sintetizează aceste proteine de membrană, le
înzestrează cu capacitatea de a se îndrepta spre anumite ţinte, către anumite sedii celulare
(transport vectorial).
În celula vie, sinteza de membrane se face prin extensia membranelor preexistente
(pattern-uri de membrană) în cursul procesului de multiplicare celulară (mitoza sau meioza),
când celula mamă transmite celor două celule fiice o dată cu zestrea celulară şi o anumită
zestre de membrană. Această moştenire a pattern-urilor de membrană de către celulele fiice de
la celula mamă reprezintă un aspect al continuităţii în timp şi spaţiu a sistemului de
membrane. Aceste aspecte de continuitate asigură de fapt continuitatea de funcţionare a
celulei şi implicit, desfăşurarea normală a metabolismului celular.
S-a dovedit că toate moleculele proteice din structurile de membrane vegetale sau
animale au viaţă relativ scurtă, fiind înlocuite mai rapid (rapid turnover) sau mai puţin rapid
(slow turnover). Din acest aspect reiese că orice tip de membrană biologică are o continuitate
de organizare, dar nu şi continuitate de substanţă, deoarece din stratul proteic sunt înlocuite în
permanenţă un număr de molecule de aminoacizi vechi cu molecule noi corespunzătoare, deşi
funcţia respectivei proteine rămâne în permanenţă nemodificată.

2.2.1. Caracterizarea componentelor lipidice ale membranelor celulare

Lipidele membranare formează un dublu strat cu grosimea de 4-5 nm: un strat extern,
orientat spre faţa externă a membranei şi un strat intern, orientat spre faţa internă
citoplasmatică a membranei. Lipidele sunt molecule insolubile în apă, dar înalt solubile în
solvenţi organici (cloroform).
Într-un µm2 de dublu strat lipidic se găsesc 5 x 106 molecule lipidice. Deşi compoziţia
lipidică a diferitelor membrane variază mult, fosfolipidele, colesterolul şi glicolipidele
reprezintă clasele de lipide cel mai frecvent întâlnite în structura membranelor biologice
(tabelul 1).
28
 Tabelul 1. Procent din greutatea moleculară totală a lipidelor membranare

Membrana Membrana Membrana externă Membrana

Teaca de
plasmatică a plasmatică a şi internă a reticulului
Lipide mielină
celulei hepatice eritrocitului mitocondriei endoplasmatic
(%)
(%) (%) (%) (%)
Colesterol 17 23 22 3 6
Fosfolipide 54 60 42 76 67
Glicolipide 7 3 28 urme urme
Alte lipide 22 13 8 21 27

Bistraturile lipidice membranare sunt formate din fosfo- şi glicolipide, ele reprezentând
bariere de permeabilitate pentru moleculele hidrosolubile, deşi straturile sunt aproape fluide.
Aceste lipide de membrană sunt amfipatice, conţin un cap hidrofilic, care are o varietate
de structură relativ mică şi poartă sarcini electrice şi o coadă hidrofobă, formată din 12-24
atomi de carbon, lipsită de sarcini electrice şi cu o mare varietate de structură care se
datorează unor acizi graşi deosebiţi. Acizii graşi pot fi saturaţi sau nesaturaţi, ei diferă
cantitativ şi calitativ în raport cu specia, vârsta, condiţiile de viaţă etc. Cu cât gradul de
nesaturare al acizilor este mai mare, cu atât fluiditatea structurilor membranare este mai mare.
Datorită acestui caracter amfipatic, lipidele, în mediu lichid, pot forma: micelii (fig. 6a), strat
dublu linear (fig. 6b), strat dublu circular (lipozomi, fig. 6c).

Fig. 6. Cele trei forme pe care le pot lua moleculele de lipide în mediu lichid datorită
proprietăţilor lor amfipatice

În acest strat dublu, capul hidrofilic este orientat spre exterior, iar coada hidrofobă este
orientată spre interior.
Moleculele de lipide se deplasează foarte rapid rotindu-se în jurul propriului lor ax şi
difuzând lateral, în acest fel asigurând fluiditate de membrană. Fluiditatea este asigurată de
prezenţa acizilor graşi şi a colesterolului.
La eucariote, proporţia fosfolipide/colesterol în membrana plasmatică este de 1/1,
colesterolul aflându-se la extremitatea hidrofilă, prevenind scăderea fluidităţii membranelor.
Procesul de formare a acestui bistrat lipidic în mediu apos este un proces de autoasamblare,
rolul major avându-l forţa de interacţiune hidrofobă (interacţiune necovalentă).
Straturile bilipidice sunt înalt impermeabile pentru ioni şi pentru cele mai multe
molecule polare (cu excepţia apei, care traversează foarte rapid această membrană). Pentru
traversarea stratului bilipidic, bistratificat, o moleculă necesită o cantitate foarte mare de
energie.

29
 2.2.2. Componenta proteică a membranelor celulare

În stratul lipidic plutesc proteine rigide hidrofobe. Proteinele reprezintă 50% din
volumul de membrană. În timp ce lipidele au rol de barieră de permeabilitate şi de delimitare
a componentelor biologice, proteinele mediază aproape toate funcţiile, de exemplu, proteinele
din membrana plasmatică au rol de pompe în transportul transmembranar, receptori, enzime,
antigene de membrană, iar proteinele din membrana internă a mitocondriilor şi cloroplastelor
au rol de transductori de energie. Membranele care îndeplinesc funcţii diferite conţin în
structura lor şi proteine diferite.
Proteinele pot fi inserate în dublul strat lipidic în diferite moduri; acestea pătrund adânc
sau chiar traversează stratul de lipide al membranei, numindu-se proteine integrale sau
intrinseci (tip Ig), altele pot fi implantate la nivelul unui singur strat din cele două ale
membranei lipidice (tip lecitinic), iar altele pot fi ataşate doar covalent (adsorbite) la
extremitatea polară hidrofilă a lipidelor şi se numesc periferice sau extrinseci.
Proteinele sunt amfipatice, conţinând o regiune hidrofobă care reacţionează cu regiunea
hidrofilă lipidică (din interiorul stratului lipidic) şi o regiune hidrofilă situată la suprafaţa
internă şi respectiv externă a membranei. În acest fel cele două suprafeţe de membrană diferă
între ele prin cantitatea de lipide şi proteine, realizând o asimetrie funcţională. În regiunea
transmembranară, proteinele de membrană conţin predominant regiuni hidrofobe cu structură
secundară tip α-helix şi structuri terţiare şi cvaternare compacte.
Proteinele de membrană pot forma pete difuze, se pot deplasa spre polii celulei unde
sunt eliminate sau pot fi blocate în mişcarea lor laterală, rămânând fixe în plan orizontal
(formând agregate care se ancorează de alte structuri ale citosolului sau de proteine din
membranele celulare vecine).
Proteinele periferice (extrinseci) pot fi eliberate prin simpla spălare cu soluţii saline sau
prin modificări de pH (de exemplu, spectrina, localizată pe suprafaţa citoplasmei eritrocitelor,
sau actina, cu rol în contracţia musculară). Proteinele integrale (intrinseci) interacţionează
strâns cu hidrocarbonaţii din lipidele de membrană şi nu pot fi disociate decât în prezenţa
detergenţilor şi a solvenţilor organici.

2.2.3. Mobilitatea lipidelor şi proteinelor de membrană

Lipidele şi proteinele de membrană difuzează rapid în planul membranar, având o

mişcare laterală constantă, ceea ce face ca o membrană biologică să nu fie o structură rigidă.
Proteinele prezintă numai difuziune laterală; lipsa difuziei transverse face posibilă păstrarea
timp îndelungat a asimetriei de membrană.
O moleculă lipidică poate călători de la un capăt la altul al celulei bacteriene în timp de
o secundă. Unele proteine de membrană difuzează în timp de un minut la distanţă de câţiva
microni; alte proteine (rodopsina) sunt la fel de mobile ca şi lipidele, altele sunt virtual
imobile (fibronectina).
Lipidele prezintă difuziune laterală - mişcare paralelă cu planul bistratului (difuziune în
planul membranei) sau transversă (tip fleep - flop), adică rotaţie spontană a moleculei lipidice
de pe o faţă a membranei pe cealaltă. Este un proces foarte lent. Se produce o rotaţie la câteva
ore (de exemplu, fosfolipide, urmărite prin tehnica de rezonanţă magnetică).
Pe baza datelor prezentate se poate considera că atât fluiditatea dublului strat lipidic, cât
şi liberă deplasare a lipidelor şi proteinelor în structurile membranare, constituie principalele
elemente ce stau la baza caracterului dinamic al membranelor celulare.

30
 2.2.4. Componenta glucidică membranară

Carbohidraţii se întâlnesc pe suprafaţa tuturor membranelor plasmatice ale celulelor

eucariote şi reprezintă 2-10% din greutatea componentelor membranare. Carbohidraţii, sub
forma oligo- şi polizaharidelor se leagă covalent de proteine şi lipide formând glicoproteinele
şi respectiv, glicolipidele. Dacă majoritate proteinelor aflate pe suprafaţa celulară sunt
glicoproteine, numai una din 10 molecule lipidice ale monostratului extern conţine
carbohidraţi.
Carbohidraţii se întâlnesc şi în structura proteoglicanilor, molecule membranare
integrale alcătuite din lanţuri polizaharidice lungi legate de un miez proteic. Proteina din
structura proteoglicanilor traversează dublul strat lipidic, în timp ce lanţurile polizaharidice
rămân în afara celulei, constituind parte componentă a matrixului extracelular.
Zaharurile sunt foarte hidrolitice, ele preferă să se orienteze spre suprafaţa apoasă a
membranei (şi nu spre miezul hidrofob), deoarece orientarea inversă ar cere un consum foarte
mare de energie; deci absenţa respectivei cantităţi de energie reprezintă o barieră puternică în
calea rotirii de tip fleep-flop a moleculei de hidrocarbonat. Hidrocarbonaţii de pe suprafaţa
celulară au o mare densitate de structură şi au rol în recunoaşterea intercelulară (faţă de
celulele sistemului imunitar).
Structurile de glicoproteine au funcţie de receptori, ele primesc informaţia din mediul
extern şi o transmit spre interiorul celulei sub forma unor cascade de reacţii biochimice, care
au drept consecinţă modificări ale activităţii celulare (activitatea secretorie, de multiplicare,
etc).

2.2.5. Glicocalixul

Suprafaţa celulară este alcătuită din trei elemente: cortexul celular (zona periferică
citoplasmei), membrana plasmatică şi glicocalixul, în cazul celulelor animale.
Glicocalixul reprezintă zona periferică a suprafeţei celulei animale. În structura sa intră
atât lanţurile oligo- şi poliglucidice ale glicolipidelor şi glioproteinelor membranare, cât şi
glicoproteine sintetizate de celulă şi apoi absorbite pe suprafaţa celulară (Fig. 7).
Faptul că cele două componente ale glicocalixului sunt în acelaşi timp şi elemente ale
matricei extracelulare face dificilă stabilirea unei linii clare de demarcaţie între suprafaţa
celulară şi matrice.
Rolul glicocalixului nu este pe deplin elucidat. Concentraţia mare de oligozaharide
complexe la suprafaţa celulară poate sprijini ipoteza implicării acestei structuri în procese de
recunoaştere celulă-celulă sau celulă-matrice. De asemenea, majoritatea lanţurilor
oligozaharidice conţin unul sau mai multe reziduuri de acid sialic, moleculă cu sarcină
electrică negativă. Glicocalixul realizează deci, distribuţia sarcinilor electrice pe suprafaţa
celulei. În plus, datorită încărcării electrice negative, glicocalixul poate funcţiona ca depozit
de cationi (Ca2+) ce sunt mobilizaţi în celulă în funcţie de necesităţile exprimate la un moment
dat.

Fig. 7. Prezentarea schematică a

glicocalixului

31
 2.2.6. Apa

Apa deţine un loc important în structura membranară alături de celelalte componente

chimice. Se găseşte în proporţie de 30-50 % asociată intim fie structurilor de la suprafaţă, fie
sub formă foarte ordonată, structural asemănătoare gheţii (apa legată chimic). Într-o astfel de
stare, apa joacă un rol precumpănitor în procesele de organizare moleculară a membranei,
intervenind în stabilitatea structurilor proteice şi fosfolipidice bistratificate, ca un liant.
Permeabilitatea selectivă poate fi privită ca fiind în raport cu apa structuralizată din
membrană. Modificările de permeabilitate determinate de procesul de excitaţie poate fi
consecinţa „topirii” structurii hidrice în anumite regiuni.

2.2.7. Asimetria distribuţiei componentelor membranare

Imaginea membranei celulare ca o „soluţie lipidică” în care plutesc moleculele proteice

pare astăzi simplistă. În multe celule proteinele şi lipidele sunt menţinute în regiuni bine
delimitate ale membranelor. Distribuţia asimetrică a moleculelor membranare joacă un rol
esenţial în realizarea funcţiilor celulare.
Distribuţia asimetrică a compartimentului lipidic pe cele două feţe ale dublului strat
lipidic a fost pusă în evidenţă pentru prima dată în membranele eritrocitelor. Astfel, în timp ce
în monostratul extern al membranei predomină fosfatidilcolina şi sfingomielina, stratul intern
conţine fosfotidiletanolamina şi fosfatidilserina drept componente lipidice majore. Deosebirile
dintre aceste lipide nu se limitează doar la natura grupărilor polare, ea se referă şi la gradul de
nesaturare a lanţurilor hidrocarbonate, ceea ce, în planul membranei, determină o fluiditate
diferită a celor două straturi lipidice. În acest context este de remarcat faptul că există şi o
distribuţie asimetrică a sarcinilor electrice. Singurul fosfolipid cu sarcină electrică negativă,
fosfatidilserina, este localizat în monostratul intern al membranei eritrocitare.
Implicaţiile asimetriei lipidelor la nivel funcţional nu sunt încă pe deplin cunoscute. Este
posibil ca activitatea diferitelor proteine membranare să fie dependentă de microclimatul creat
prin prezenţa fosfolipidelor specifice. De asemenea, activitatea enzimatică a proteinelor
asociate structurilor membranare poate fi condiţionată de sarcina electrică a fosfolipidelor.
Localizarea glicolipidelor în monostratul extern al membranelor plasmatice, cât şi
caracterul lor special sugerează implicarea acestor molecule ca receptori în procesele de
comunicare intercelulară.
În acelaşi timp, toate proteinele membranare integrale au o orientare strictă în raport cu
faţa citoplasmatică şi cea externă a membranei celulare. În plus, proteinele transmembranare
sunt în majoritate molecule glicolizate. În membranele plasmatice lanţurile oligozaharidice
marchează faţa exoplasmatică, în timp ce, în membranele organitelor celulare (reticul
endoplasmatic, aparat Golgi) ele se găsesc pe faţa citoplasmatică. Stricta orientare a
glicoproteinelor este corelată cu funcţiile celor două feţe ale membranelor celulare.
Moleculele proteice transmembranare ce conţin cisteină cunosc şi ele o orientare strictă. Mai
mult, grupările sulfhidril ale cisteinei formează punţi disulfurice inter şi/sau intra-catenare,
doar pe faţă externă a membranei.
În anumite celule, distribuţia asimetrică a lipidelor şi proteinelor conduce la delimitarea
unor domenii specifice în membranele plasmatice. Astfel, membrana celulelor epiteliale este
împărţită în domenii distincte: apical şi latero-bazal, ambele având un conţinut proteic şi
lipidic diferit. Ca urmare, celulele epiteliale sunt capabile să împiedice difuzia moleculelor
membranare. Acest lucru se realizează prin intermediul joncţiunilor strânse ce funcţionează ca
o barieră între cele două domenii membranare.

32
2. 3. Mecanismele de transport prin membranele celulare

Celula, din punct de vedere termodinamic, este un sistem deschis, existenţa sa fiind
condiţionată de stabilirea unei permanente comunicări cu mediul înconjurător. Abordând
această problemă din perspectiva schimbului de substanţe pe care celula îl realizează cu
mediul extern, un rol major revine membranei plasmatice datorită caracteristicii sale
fundamentale, permeabilitatea selectivă. Aceasta face posibilă alimentarea celulei cu molecule
esenţiale (glucoză, aminoacizi, lipide) şi eliminarea atât a produşilor fiziologic activi (enzime,
hormoni), cât şi a celor rezultaţi ca „deşeuri” în urma metabolismului celular (CO2, săruri de
amoniu, uree). În paralel cu asigurarea continuităţii acestor schimburi, permeabilitatea
selectivă creează cadrul favorabil desfăşurării unei activităţi metabolice stabile, atât prin
menţinerea în spaţiul intracelular a unei concentraţii relativ constante de substanţe organice,
metaboliţi şi electroliţi, cât şi prin reglarea volumului celular ca rezultat al relaţiilor osmotice
celulă-mediu.
Permeabilitatea selectivă se modifică dinamic aflându-se sub influenţa modificărilor
mediului extracelular şi a metabolismului celulei. Această caracteristică a membranelor
celulare prezintă particularităţi în raport cu diferenţierea funcţională a celulelor. Selectivitatea
diferenţiată se manifestă atât la trecerea substanţelor din exterior în celulă, cât şi în sens
invers. Deci, la baza noţiunii de permeabilitate selectivă stă conceptul de membrană ca barieră
a schimburilor celulare.
Traficul de substanţe ce se desfăşoară atât prin membrana plasmatică cât şi prin
membranele interne ce delimitează organitele celulare antrenează diferite mecanisme de
transport.

2.3.1. Procesul calitativ al traversării membranelor

Se consideră că au loc următoarele etape (fig. 8):

ƒ molecula trebuie să avanseze în zona apoasă (mediu şi zona periferică a membranei), ceea
ce se realizează după legile difuziei simple în mediu apos. Fiecare moleculă formează
legături de hidrogen cu apa din interiorul celulei. Agitaţia termică a moleculelor asigură
moleculei energia de activare necesară ruperii unor legături de hidrogen, cu refacerea lor
spontană şi imediată. În momentul când molecula atinge stratul hidrofil al membranei,
acesta având conţinut de apă apropiat de cel al mediului, permite continuarea mişcării
libere a moleculei.
Prin urmare, traversarea stratului exterior hidrofil se realizează fără consum de energie
(fig. 8, porţiunea a);
ƒ în etapa următoare, molecula trebuie să se desprindă de stratul hidrofil şi să treacă în
stratul lipofil, ceea ce necesită o energie de activare moleculară (fig. 8, porţiunea b).
ƒ În raport cu caracteristicile moleculare, variază şi intensitatea energiei necesare pentru
intrarea moleculei în stratul hidrofob;
ƒ continuarea difuziei în startul hidrofob nu reclamă energie de activare suplimentară
pentru că trebuie să se desfacă legături de hidrogen (fig. 8, porţiunea c);
ƒ în fine, molecula părăseşte stratul hidrofob (fig. 8, porţiunea d), fenomen facilitat de
formarea legăturilor de hidrogen cu moleculele de apă din stratul membranar proteic
hidrofil interior, de unde trece prin acelaşi fenomen, în citoplasmă (fig. 8, porţiunea e).

33
 Fig. 8. Modificările energetice care
însoţesc traversarea unei molecule
hidrosolubile printr-o membrană biologică
(după Maziliak).

Se descriu următoarele posibilităţi de traversare

a unei membrane:
ƒ proces pasiv: transfer pasiv, care asigură
trecerea moleculelor mici hidrosolubile,
inclusiv apa, prin simpla filtrare prin pori
(filtrarea) şi a moleculelor mari liposolubile
prin dizolvare în membrană (difuzia
simplă);
ƒ proces biochimic: transport specializat, fie activ, fie facilitat;
ƒ proces biologic: endocitoză, când particulele de substanţă sunt înglobate de membrana
celulară prin mişcări de invaginare şi transfer astfel spre interior.

2. 3 .2. Transportul ionilor şi moleculelor mici prin membranele celulare

Maniera în care substanţele trec prin membranele celulare este determinată pe de o parte
de caracteristicile substanţelor (greutate moleculară, dimensiuni, formă, grad de hidratare
(grad de ionizare) iar pe de altă parte, de compoziţia chimică a membranelor.
Principalul criteriu de clasificare a tipurilor de transport îl reprezintă dimensiunile
substanţelor ce străbat membrana. Astfel, în timp ce ionii şi moleculele mici traversează
dublul strat lipidic prin difuziune sau implicând proteinele membranare, transportul
macromoleculelor şi al particulelor necesită sechestrarea lor în vezicule delimitate de
membrane. Un alt criteriu de clasificare este consumul de energie metabolică sub formă de
ATP. Din acest punct de vedere se disting două tipuri de transport: pasiv şi activ.

2.3.2.1.Transportul pasiv
Traversarea membranelor celulare de către molecule şi ioni în sensul gradientului de
concentraţie sau electrochimic (compus din gradientul de concentraţie şi gradientul electric)
poartă numele de transport pasiv. Procesul nu implică consum de energie (ATP), dimpotrivă,
el decurge cu pierdere de energie liberă.
Unele gaze (O2, CO2) şi unele molecule mici cu caracter hidrofob sunt capabile să
străbată dublul strat lipidic membranar prin difuziune simplă. Transportul moleculelor
solubile în apă (glucoză, nucleotide, amonoacizi) şi al unor ioni (H+, K+, Na+, Ca2+) nu poate
fi realizat în aceeaşi manieră, necesitând participarea unor proteine membranare specifice.
Acest tip de transport este denumit difuziune facilitată.

a. Difuzia simplă
Cel mai simplu tip de transport pasiv constă în difuzia fizică a moleculelor determinată
de gradientul lor de concentraţie sau electrochimic. În difuzia simplă moleculele nu sunt
modificate chimic sau asociate altor specii moleculare în timpul trecerii lor prin membrană.
Viteza cu care se desfăşoară etapa trecerii moleculelor din mediul apos
extracelular/intracelular în interiorul hidrofob al membranei este dependentă de coeficientul
de partiţie (K) al moleculei. Acesta măsoară afinitatea relativă a moleculei pentru mediul
lipidic în raport cu apa, ilustrând gradul de hidrofobicitate al moleculei.
Astfel, cu cât valoarea sa este mai mare, cu atât molecula are un mai pronunţat caracter
hidrofob, deci este mai liposolubilă şi pătrunde mai repede în celulă. Se constată existenţa
unei relaţii de directă proporţionalitate între coeficientul de partiţie al unei molecule şi

34
constanta de permeabilitate (P) a membranei celulare. Datorită vâscozităţii dublului strat
lipidic, viteza de difuziune a moleculei prin interiorul membranei este mult inferioară vitezei
sale de difuziune printr-un mediu apos. În cazul transportului prin difuzie simplă a
moleculelor fără sarcini electrice, se respectă legea lui Fick. Aceasta enunţă că viteza de
difuziune (dn/dt) a unei molecule este proporţională cu diferenţa de concentraţie, suprafaţa (S)
şi coeficientul de permeabilitate (P). Deci, viteza de difuziune a unei molecule prin membrană
conform legii lui Fick este:
(dn/dt)= PxS (C1aq – C2aq)
unde:
S - reprezintă suprafaţa membranei P este coeficientul de permeabilitate al membranei;
C1aq, C2aq - sunt concentraţiile mediilor apoase separate de membrana celulară.

Difuzia simplă prin membranele celulare se realizează cu pierdere de energie liberă.

Calculele termodinamice demonstrează că la deplasarea unui mol de substanţă fără sarcină
electrică, de la o concentraţie de 1M la o concentraţie de 0,1M (la 250C) sistemul pierde o
energie liberă de 1,359 kcal/mol. În difuzia moleculelor încărcate electric legea lui Fick nu
mai are aplicabilitate, procesul fiind exclusiv determinat de gradientul electrochimic.

b. Difuzia facilitată
În procesul de difuziune facilitată, transportul pasiv al moleculelor prin membrană este
mediat de proteine membranare numite permeaze. Spre deosebire de difuzia simplă, difuzia
facilitată se caracterizează prin specificitate faţă de molecula transportată. Permeaza leagă
reversibil şi complementar la un situs activ o singură specie moleculară sau molecule
aparţinând unei singure familii. În urma legăturii ce are loc pe o faţă a membranei se formează
un complex moleculă-permează ce traversează dublul strat lipidic, disociindu-se pe cealaltă
faţă a membranei cu eliberarea moleculei transportate.
Unul din modelele care au încercat să explice maniera în care se desfăşoară difuzia
facilitată este modelul transportorilor cărăuşi (carrier model). În acest model se consideră că
transportorul exercită o mişcare de navetare sau rotaţie în dublul strat lipidic, fiind astfel
capabil să treacă molecula transportată de pe o faţă pe alta a membranei celulare.
Deoarece difuzia facilitată este un tip de transport pasiv, iar rotirea unei molecule
proteice în planul membranei este defavorizată din punct de vedere energetic, modelul
„carrier” rămâne aplicabil numai pentru transportul anumitor ioni de către polipeptide
antibiotice (de exemplu, transportul ionului de K+ de către valinomicină).
Cea mai bine caracterizată permează, D-gluco-permează (sau D-hexozo-permează),
catalizează difuzia facilitată a glucozei prin membrana eritrocitelor (Fig. 6). D-gluco-
permeaza este o proteină transmembranară alcătuită de 12 α-helixuri care au în majoritate un
caracter hidrofob. Are o greutate moleculară de 45.000 Da.

Fig. 9. Mecanismul
transportului mediat de D-
gluco-permează

În parte, permeabilitatea
selectivă a membranelor
plasmatice poate fi explicită prin
existenţa proteinelor canal.
Aceste proteine
transmembranare, străbătute de un canal delimitat de aminoacizi hidrofili, formează porii
membranari. Proteinele canal specializate în transportul selectiv al diferitelor specii ionice se

35
numesc proteine canal de ioni. Transportul mediat de aceste proteine nu necesită consum de
energie, ionii difuzând cu viteze diferite prin membrană în sensul gradientelor de concentraţie.
Proteinele canal de ioni se deschid tranzitoriu, caracteristică ce a sugerat denumirea lor
de proteine canal cu poartă (gate channels). De regulă, deschiderea canalelor reprezintă un
răspuns celular la diferite semnale recepţionate de membrana plasmatică. În funcţie de factorii
ce comandă deschiderea porţilor, se deosebesc trei tipuri de proteine canal:
ƒ cu poartă comandată de stimuli mecanici;
ƒ cu poartă comandată de liganzi.
ƒ cu poartă comandată de voltaj (dependente de valoarea potenţialului de membrană)
(Fig. 12).
În acest caz canalele se deschid în urma legării la un receptor a unei molecule semnal ce
poate fi un mediator extracelular (neurotransmiţător) sau un mediator intracelular (ion,
nucleotid, proteină de legare a GTP) (Fig. 10, 11);

A B
Fig. 10. Modificarea conformaţională a Fig. 11. Schema joncţiunii neuromusculare
receptorului acetilcolinic - proteină canal şi principalele proteine canal de ioni
de Na+ cu poartă comandată de ligand. implicate de declanşarea contracţiei
musculare sub acţiunea impulsului nervos.
A - starea de repaus; B - starea activată

Fig. 12. Structura canalului de Na+ cu poartă comandată de voltaj

2.3.2.2. Transportul activ

Deplasarea moleculelor şi ionilor prin transport pasiv evoluează spre egalarea
concentraţiilor de o parte şi de alta a membranei şi, implicit, dispariţia potenţialului

36
membranar. Pentru a menţine homeostazia mediului intracelular, celula şi-a creat mecanisme
de transport activ capabile să deplaseze moleculele şi ionii în sens invers gradientelor lor de
concentraţie şi electrochimic.
Acest tip de transport este mediat de proteine specifice şi prezintă toate caracteristicile
cinetice ale difuziei facilitate. Plusul de independenţă faţă de compoziţia mediului
înconjurător, pe care transportul activ îl oferă celulei, implică consum de energie metabolică.
Astfel, eritrocitele utilizează 50% din energia stocată în moleculele de ATP pentru a menţine
o concentraţie ionică relativ constantă a mediului intracelular.
În funcţie de modul în care este utilizată energia se deosebesc două tipuri de transport
activ. În transportul activ propriu-zis, molecula transportoare are funcţie ATP-azică, fiind
capabilă să utilizeze direct energia rezultată în urma hidrolizei ATP în procesul de transport
(pompele ionice).
Al doilea tip de transport activ poartă numele de cotransport. În cadrul acestui transport
moleculele şi ionii sunt deplasaţi împotriva gradientelor lor de concentraţie pe seama energiei
eliberate în transportul pasiv al altor molecule şi ioni. În unele cazuri de cotransport, energia
moleculelor de ATP este utilizată indirect prin intermediul gradientelor ionice.

a. Pompele ionice
Se cunosc trei clase de proteine ce cuplează direct transportul ionilor împotriva
gradietelor lor electrochimice cu desfacerea legăturilor fosfodiesterice din molecula de ATP şi
formarea de ADP (adenozin difosfat) şi fosfor anorganic (P): clasa ATP-azelor P; clasa ATP-
azelor V (H+-ATP-aze); clasa ATP-azelor F.
Clasa ATP-azelor P conţine trei reprezentanţi. Primul reprezentant al acestei clase şi cel
mai răspândit - Na -K+-ATP-aza (pompa de Na+-K+) prezentă în membranele plasmatice ale
tuturor celulelor animale este unul dintre cele mai studiate sisteme de transport activ. Na+ -
K+-ATP-aza pompează Na+ în mediul extracelular şi introduce K+ cu sarcină în celulă.
Mecanismul de acţiune Na+-K+-ATP-aza, deşi insuficient cunoscut, are la bază
modificarea conformaţională a enzimei. Astfel, este posibilă formarea unor canale în proteina
transportoare ce permite trecerea ionilor de Na+ şi K+ prin membrana plasmatică. Energia ce
asigură conversia conformaţiei enzimei (E1 → E2) cât şi pomparea ionilor împotriva
gradientului lor de concentraţie este furnizată de hidroliza moleculelor de ATP (Fig. 13).
Funcţionarea Na+-K+-ATP-aza asigură menţinerea unei concentraţii intracelulare relativ
ridicată a ionilor de K+ ce condiţionează desfăşurarea normală a unor procese celulare vitale
cum sunt: biosinteza proteică, activitatea catalitică a unor enzime (piruvat-kinaza) şi
menţinerea potenţialului de membrană a celulelor excitabile.
Al doilea reprezentat al clasei de ATP-azei P este Ca2+-ATP-aza (pompa de Ca2+). Este
localizată în membranele plasmatice asigurând menţinerea unei concentraţii intracelulare
scăzute a ionilor de Ca2+. În celulele musculare enzima este prezentă în membrana reticulului
sarcoplasmic, fiind implicată în transportul ionilor de Ca2+ din citosol în acest organit celular.
Traficul Ca2+ prin membrana reticulului sarcoplasmic în celulele musculare, mediat de Ca2+-
ATP-aza, este esenţial în procesul de contracţie – relaxare musculară. Pomparea ionilor din
reticulul sarcoplasmic în citosol determină contracţia musculară, în timp ce înlăturarea ionilor
din citosol permite relaxarea musculară.
O proteină capabilă să lege specific ionii de Ca2+ a fost identificată şi în citosol. Proteina
numită calmodulină este alcătuită dintr-un singur lanţ polipeptidic şi are o funcţie reglatoare
modificând viteza de pompare a ionilor de Ca2+ în raport cu concentraţia citosolică a acestora.
Ultimul constituient al ATP-azelor P transportă ionii de H+, în unele cazuri împreună cu K+.

37
 Fig. 13. Schema funcţionării Na+ - K
ATP-azei

a. proteina aflată în conformaţie E1 leagă

Na+ la situsurile aflate pe faţa
citoplasmatică a subunităţii α;
b. legarea ATP este urmată de hidroliza
acestuia şi fosforilarea unui rest de Asp
din structura proteinei (E1~P);
c. energia legăturii macroenergice E1~P
asigură modificarea conformaţională a
proteinei (E1-P) şi transportul Na+ în
spaţiul extracelular;
d. K+ se leagă la situsurile de pe faţa
exoplasmatică ale subunităţii α;
e. defosforilarea proteinei transportoare
conduce la modificarea conformaţiei
(E2);
f. transportul K+ prin membrana plasmatică şi eliberarea lui în citosol are loc simultan cu
revenirea proteinei transportoare la conformaţia iniţială (E1).

Clasa ATP-azelor V (H+ - ATP-aze) este reprezentată de proteine transportoare ce

realizează deplasarea protonilor în sens invers gradientului lor de concentraţie.
H+-ATP-aza este prezentă în membranele plasmatice ale celulelor ce secretă produşi
acizi (membrana apicală a celulelor epiteliale ce mărginesc lumenul vezicii urinare) şi în
membranele lizozomale. Pompa de H+ dependentă de ATP din membranele lizozomale are
rolul de a menţine un pH scăzut (4,5-5) în interiorul acestui organit celular.
Clasa ATP-azelor F, ca şi cele ale clasei V sunt responsabile de transportul protonilor.
Ceea ce caracterizează ATP-azele din clasa F, localizate în membrana mitocondrială, este
faptul că acţionează în sensul cuplării-deplasării H+ de la o concentraţie mai mare la una mică
cu sinteza ATP din ADP şi P.

b. Cotransportul activ al ionilor şi al moleculelor prin membrana plasmatică nu

utilizează în toate cazurile direct energia eliberată prin hidroliza ATP. Folosirea energiei
gradientelor ionice în transportul transmembranelor activ constituie o cale indirectă de
utilizare a energiei stocate în ATP.
Deplasarea ionilor şi moleculelor împotriva gradientelor lor de concentraţie cuplată
obligatoriu cu transportul pasiv al altor ioni - numiţi ioni cotransportaţi - defineşte procesul de
cotransport. În acest transport activ, ionii de Na+ au un rol important în transportul zaharurilor
şi aminoacizilor în celulă.
Sunt descrise trei aspecte ale cotransportului: 1) uniport; 2) sinport; 3) antiport.
Transportul uniport reprezintă trecerea prin membrană, la un moment dat, a unei
singure specii moleculare sau ionice, fără a fi cuplată cu mişcarea altei specii moleculare. În
acest caz, moleculele neutre nu se acumulează împotriva gradienţilor de concentraţie, ci
transportul lor prin membrană este facilitat de gradientul de concentraţie scăzută şi catalizat
de o proteină de import numită importer (fig. 14 a).

38
 Fig. 14. Mecanisme de cotransport

Fig. 15. Proteina ce

realizează simportul glucoză - Na+
asigură acumularea glucozei,
împotriva gradientului de
concentraţie, în celulele epiteliale ce
delimitează lumenul intestinal. Na+-
K+-ATP-aza menţine gradientul
electrochimic al Na+ prin pomparea
ionilor în afara celulei epiteliale.
Cooperarea celor două proteine
transportoare face posibilă
preluarea continuă a glucozei din
lumenul intestinal.

Tipul simport reprezintă cotransportul a două specii deosebite (o structură chimică

solvită şi union încărcat H+) în aceeaşi direcţie, purtaţi fiind de către o proteină porter (fig. 14,
b1). Dintre toate sistemele de simport cel mai bine cunoscut este simportul de lactoză în
celula bacteriană (Escherichia coli) (fig. 14, b2).
Antrenarea în circulaţie sanguină a glucozei absorbită din lumenul intestinal şi
deplasarea aminoacizilor din tubii renali în sânge reprezintă procese cu o desfăşurare similară,
în care un rol important îl joacă celulele epiteliale intestinale şi respectiv, tubulare.
Pătrunderea acestor molecule în celulele epiteliale este cuplată obligatoriu cu intrarea ionilor
de Na+. Simportul este asigurat de proteine specifice localizate în regiunea apicală (cu
microvili) a membranei plasmatice (fig. 15).

39
 Sistemul antiport reprezintă transportul de interschimb (fig. 14, c) între două substraturi
solubizante în două direcţii opuse, transport catalizat de o proteină antiporter. Are loc
schimbarea unei specii moleculare cu alta, de exemplu Na+ în locul ionului de H+, sau Cl- în
locul grupării HCO3-.
Prin acest tip de transport activ, Na+ este transportat intracelular, iar concomitent Ca2+
este scos în spaţiul extracelular; acest antiport reuşeşte să menţină scăzut nivelul citosolic al
calciului în multe celule.
Majoritatea acestor tipuri de transport activ simport/antiport, în celulele animale, sunt
declanşate de gradienţi de Na+, generaţi, la rândul lor, de pompe ionice de Na+- K+-ATP-ază.
Proteinele uniporter, simporter şi antiporter au structuri asemănătoare şi funcţionează
prin mecanisme similare. Cele trei tipuri de transport , uniport, simport şi antiport au fost
descrise întâi la bacterii (Escherichia coli), ulterior dovedindu-şi valabilitatea în toate celulele
organismelor vii (fungi, plante, animale).

c. Transportul apei şi reglarea volumului celular

Presiunea osmotică - factor critic în transportul molecular de apă
Deplasare moleculelor de apă prin membrana plasmatică sau printr-un strat de celule
este rezultatul acţiunii diferenţei de concentraţie a celor două soluţii separate de membrană
(stratul de celule) şi /sau gradientul de presiune hidrostatică.
Mecanismul transportului molecular de apă prin dublul strat lipidic nu este încă
cunoscut. Studii recente sugerează posibilitatea existenţei unor proteine canal de apă la nivelul
membranelor plasmatice.
Reglarea volumului celular şi a presiunii osmotice interne
În anumite limite, celulele sunt capabile de a-şi modula tensiunea osmotică internă şi
prin aceasta îşi pot menţine volumul relativ constant. Introducerea unei celule într-un mediu
hipertonic (cu o concentraţie salină superioară conţinutului celular) este urmată de scăderea
pH-ului citosolic, fapt ce determină activarea sistemului antiport Na+-H+ şi Cl-HCO3-.
Primul sistem asigură intrarea în celulă a Na+ în schimbul ieşirii H+. Al doilea sistem
acţionează în sensul deplasării Cl- în celulă şi exportul de HCO3-. Speciile ionice exportate în
mediul extracelular (H+ şi HCO3-) sunt generate în celulă ca rezultat al acţiunii anhidrazei
carbonice asupra produsului final al metabolismului celular CO2. Influxul de Na+ şi Cl-
conduce la creşterea concentraţiei saline şi a tensiunii osmotice celulare ce fac posibilă
intrarea moleculelor de apă în celulă şi în unele cazuri restabilirea volumului celular iniţial
(fig. 16).

Fig. 16. Principalele proteine

transportoare implicate în
reglarea volumului celular, în
condiţiile în care celula se
găseşte într-un mediu hiperton
(0,25 M NaCl)

40
 2.3.3. Transportul macromoleculelor şi particulelor prin membrana
plasmatică

Schimbul de substanţe pe care îl realizează celula cu mediul înconjurător nu este limitat

numai la ioni, molecule mici şi apă. Diferitele macromolecule (proteine, polinucleotide,
poliglucide) şi particule traversează membrana plasmatică prin mecanisme de transport
mediate de vezicule.
Se disting două tipuri de transport: exocitoza şi endocitoza. Prin exocitoză
macromoleculele sintetizate în celulă sunt excretate în spaţiul extracelular. Endocitoza este
implicată în transportul în celulă a diverselor molecule, cât şi a fracţiunilor din fluidul
interstiţial (pinocitoza).
Deşi decurg după mecanisme diferite, cele două procese de transport menţionate
prezintă unele caracteristici comune:
ƒ sechestrarea moleculelor şi a particulelor transportate în vezicule;
ƒ asigurarea unui transport strict direcţionat;
ƒ rolul critic al procesului de fuziune membranară.
Materialele ce pătrund în celulă prin endocitoză sunt fie supuse acţiunii enzimelor
hidrolitice lizozomale, fie eliberate din nou în mediul extracelular. De cele mai multe ori
macromoleculele de secreţie sunt eliberate din celulă prin aceeaşi regiune a membranei
plasmatice prin care ele au pătruns.
Există însă situaţii în care macromoleculele traversează spaţiul celular fiind secretate
printr-o altă regiune membranară. Acest ultim tip de transport poartă numele de transcitoză.
Procesul de exocitoză stă la baza desfăşurării secreţiei celulare (fig. 17). Studiul
transportului macromoleculelor din celulă în mediul extracelular sugerează existenţa a două
tipuri de exocitoză: constitutivă şi reglată (fig. 18).
Exocitoza constitutivă este comună tuturor celulelor şi asigură eliminarea continuă a
macromoleculelor sintetizate în spaţiul extracelular. Secreţia celulară de hormoni,
neurotransmiţători şi enzime digestive este realizată prin exocitoză reglată. În acest caz
moleculele sunt împachetate în vezicule de secreţii, iar fuziunea lor cu membrana plasmatică
este comandată de un semnal extracelular, de cele mai multe ori, un mesager chimic.

Fig. 17. Calea clasică de transport a moleculelor de secreţie în spaţiul extracelular

41
 Fig. 18. Prezentarea schematică
a exocitozei constitutive şi
reglate
Endocitoza defineşte
transportul mediat de vezicule din
mediul extracelular în celulă al
unor macromolecule, cât şi a
substanţelor dizolvate în lichidul
interstiţial (fig. 19). În funcţie de
mecanismul procesului de
endocitoză distingem: endocitoza
mediată de receptori şi pinocitoza.
Endocitoza mediată de
receptori, reprezintă un tip de transport specific şi eficient al macromoleculelor. În urma
recunoaşteri şi legării lor la receptori de membrană, macromoleculele intră în celule sub
forma complexului de ligand-receptor, fără a fi însoţite de fluidul extracelular. De exemplu,
colesterolul circulă în sânge legat de o proteină cu care formează complexe numite
lipoproteine cu densitate scăzută (LDL) (fig. 20).

Fig. 19. Calea urmată de particulele ce au pătruns în celulă prin endocitoză

Fig. 20. Endocitoza mediată de receptori pentru LDL

42
 Procesul de endocitoză mediată de receptoriare o semnificaţie biologică foarte largă,
prezentând câteva aspecte particulare deosebit de importante şi anume:
- eliberarea metaboliţilor esenţiali către celule a colesterolului, a complexelor vitaminice
B12, a ionilor de fier, care sunt recunoscuţi de către receptorii de suprafaţă ai celulelor,
fiind fixaţi şi importaţi intracelular;
- modularea răspunsului la mulşi hormoni de natură proteică şi factori de creştere (de ex
insulina, factorul de creştere epidermic, etc). Endocitoza îndepărtează aceşti hormoni din
circulaţie şi fie celula, temporar, mai puţin receptivă la aceştia, prin scăderea numărului
de receptori celulari;
- captarea proteinelor ţintite pentru distrugere şi eliberarea acestora către lizozomi(de ex
celulele hepatice captează şi distrug glicoproteinele plasmatice senescente).
Majoritatea receptorilor de pe suprafaţa celulelor care mediază endocitoza sunt
glicoproteine transmembranare.
Aceşti receptori au:
ƒ un domeniu extracelular;
ƒ 1-2, helixuri transmembranare;
ƒ mică regiune citosolică.
Mulţi dintre aceşti receptori sunt localizaţi în anumite regiuni ale membranei
plasmatice, care ulterior invaginându-se vor forma cavele (coate pita).
Partea citosolică a acestor zone, constituie un strat gros de clatrină (proteină ce va
forma o reţea în jurul veziculelor membranare). Caveolele reprezină 2% din suprafaţa unei
celule animale.

Mecanismul endocitozei
Endocitoza începe cu invaginarea unei asemenea regiuni din membrana plasmatică, cu
formarea unei caveole; clatrina formează o reţea în jurul acesteia pe care apoi o închide
rezultând în final o veziculă cu manta de clatrină(diametrul de 800Aº). Vezicule prinde rapid
clatrina şi devine endozom (receptozom). Endozomii fuzionează şi formează vezicule mai
mari cu diametrul de 2000-6000Aº (în circa 20 de secunde).Caracteristic pentru endozomi
este pH-ul acid care determină disocierea celor mai multe complexe receptor – proteine;
rezultă deci că soarta substratului este decisivă la acest nivel.
Eliberarea clatrinei din vezicule reprezintă un moment cheie în endocitoză deoarece
prezenţa acestei mantale proteice în jurul veziculei ar împiedica transmiterea proteinelor
importate şi a receptorilor către destinaţiile lor. Clatrina este reciclată de către o enzimă
activată de ATP. Acidifierea endozomilor prin acţiunilor unor pompe protonice (activate de
ATP) duce la disocierea complexelor receptor-proteine, etapă absolut necesară pentru sortarea
proteinelor şi dirijarea lor către destinaţii specifice.
În raport cu mărimea şi complexitatea particulelor endocitate, se disting două variante
particulare ale endocitozei şi anume: fagocitoza: endocitoza macromoleculelor sau a
particulelor mici, corpusculare (virusuri, bacterii, fragmente de celule eucariote sau chiar
celule întregi); pinocitoza: endocitarea moleculelor solubile (toxinele bacteriene).
Fagocitoza (gr. fagiere=a mânca) este un proces de transport mediat de vezicule prin
care celulele sunt capabile să ingere diverse particule din spaţiul extracelular. Dacă la
organismele unicelulare fagocitoza reprezintă principala cale de nutriţie, la mamifere procesul
joacă un rol important în apărarea organismului. Celule specializate numite fagocite sunt
capabile să înglobeze şi să distrugă substanţe străine, microorganisme, celule îmbătrânite şi
maligne, resturi celulare etc.
În organismele animale se disting două tipuri de celule sanguine ce acţionează ca
fagocite: monocitele (ce migrează în ţesuturi dând naştere macrofagelor şi ele celule cu
funcţie fagocitară) şi neutrofilele.
Legarea particulelor de fagocit - prima etapă a fagocitozei - implică participarea
receptorilor de membrană ce recunosc specific liganzii aflaţi pe suprafaţa particulei ţintă.

43
Pentru a putea fi fagocitate, bacteriile sunt supuse unui proces de opsonizare (gr. opsonein=a
pregăti pentru mâncare) ce constă în acoperirea suprafeţei bacteriene cu anticorpi şi/sau
componente ale complementului.
Anticorpii se ataşează pe suprafaţa bacteriilor în aşa fel încât regiunea prin care
aceştia se leagă la receptori, numită regiune Fc, este expusă spre exterior. Receptorul Fc din
membrana plasmatică a fagocitelor interacţionează cu anticorpii legând cele două suprafeţe
membranare printr-un mecanism tip fermoar (membrane-zippering-mechanism) ce face
posibilă fagocitoza (fig. 21).
Există posibilitatea stabilirii unor legături încrucişate între anticorpii ataşaţi pe
suprafaţa celulei ţintă cu formarea unor aglomerări (clusterii), proces numit patching. După un
scurt timp de la formarea cluster-ilor, anticorpii se deplasează spre un pol al celulei-ţintă
generând o structură de tip calotă ce împiedică fagocitarea celulei ţintă (fig 21). Procesul de
calotare (capping) este energo-dependent necesitând prezenţa moleculelor de ATP.
Activarea receptorilor specifici de către anticorpi, componente ale complementului sau
diverse oligozaharide de pe suprafaţa microorganismelor, prin formarea complexului ligand-
receptor, generează un semnal intracelular ce declanşează ingestia.

Fig. 21. Fagocitoza se realizează printr-un

mecanism „membrane-zipper”
A – distribuirea uniformă a anticorpilor
pe suprafaţa celulei - ţintă face posibilă
fagocitarea acesteia
B – procesul de „capping” împiedică
fagocitarea celulei-ţintă

Pinocitoza este un fenomen observat la

macrofage şi reprezentat de invaginarea unei
părţi a membranei celulare, sub influenţa unor
particule mici, solubile (picături),cu formarea
în final a unor vezicule citoplasmatice (cu
dimensiuni de 1-2µm).
Această veziculă migrează de la membrana celulară spre regiunea perinucleară, unde
fuzionează cu lizozomii, conţinutul veziculei fiind hidrolizat.
Transcitoza defineşte un tip de transport specific transcelular, al diferitelor
microelemente. Procesul este întâlnit în celule (epiteliale) ale căror membrane plasmatice sunt
împărţite în domenii distincte (apical şi latero-bazal) datorită pronunţatei asimetriei în
distribuţia elementelor lipidice şi proteice componente. Un exemplu de transcitoză îl
reprezintă transportul din stomac în circuitul sanguin al anticorpilor la nou-născut, anticorpi
primiţi odată cu laptele matern.

2.4. RECEPTORII DIN MEMBRANĂ

Receptorii membranari sunt glicoproteine transmembranare, având funcţia de legare
specifică şi cu afinitate mare a unor molecule extracelulare numite liganzi (hormoni,
neurotransmiţători, etc.) prin legarea cărora se induc răspunsuri celulare caracteristice.
Unii dintre aceşti liganzi sunt numiţi mesageri de ordinul I. În interiorul plasmalemei,
receptorul activat interacţionează apoi cu un sistem enzimatic care generează în citosol un
mesager de ordin II, de obicei cAMP (adenozin-monofosfatul ciclic). Al doilea mesager
declanşează un lanţ de reacţii intracelulare care provoacă în ultimă instanţă răspunsul celulei
ţintă la ligantul fiziologic în cauză (fig. 22, 23, 24, 25).

44
 În cazurile când interacţiunile moleculă semnal receptorul generează un nucleotid ciclic
(adenozin sau guanozin- monofosfat ciclic) ci provoacă un influx rapid de ioni de calciu
(Ca+2), în matricea citoplasmatică, datorită deschiderii canalelor de calciu ale membranelor
celulare, atunci Ca+2, este considerat ca un mesager de ordinul II. Ligantul de care se leagă de
receptor prin forţe slabe (hidrofobe,legături de hidrogen), într-o zonă specifică din molecula
receptorului.
Prin legarea de receptor apar diferite modificări ale plasmalemei ce induc apoi efecte
intracelulare. Exemple de modificări ale plasmalemei pot fi:
Redistribuirea receptorilor cu agregarea lor în anumite zone ale plasmalemei urmată de
endocitoză;
Modificări de permeabilitate a membranei, se produc la legarea neurotransmiţătorilor de
membrana postsinaptică şi au rol în transmiterea şi generarea impulsului nervos
Activarea unor enzime din plasmalemă (activarea adenilatciclazei de către hormonii
polipeptidicihidrosolubili).
Creşterea intracelulară a Ca+2 (prin deschiderea unor canale din plasmalemă care permit
pătrunderea calciului extracelular ce se leagă în citosol de proteine specifice, de ex
calmodulina).
De remarcat că folosirea mesagerilor de ordin I şi activarea multor proteine şi enzime
prin legarea unei singure molecule de ligand au ca rezultat creşterea extrem de mare a
eficienţei receptorilor al căror procent nu depăşeşte 1% din totalul proteinelor de membrană.

2.4.1.Tipuri de receptori

Se pot distinge două categorii mari de receptori după originea ligandului pe care îl leagă:
receptori pentru substanţe endogene şi receptori pentru substanţe exogene.
a. Receptorii pentru neurotransmiţători sunt situaţi în membrana postsinaptică a celulei
nervoase, musculare sau alte celule efectuare (de ex, receptorii pentru acetilcolină, adrenalină,
noradrenalină, dopamină, serotonină, histamină, acid gamma-amino-butiric, acid glutamic,
glicină, acid aspartic, peptide mici ca encefalina).Unele dintre aceste molecule acţionează
strict numai asupra unei celule postsinaptice, altele pot difuza local,influenţând mai multe
celule, deci având efecte de mediatori chimici locali.
b. Receptori pentru hormoni sunt localizaţi diferit în celulă,după cum hormonul este
hidrofil sau hidrofos (cum este cazul hormonilor steroizi şi tiroidieni), el pătrunde uşor prin
plasmalema celulei ţintă şi se leagă de receptorii intracelulari.
Dimpotrivă, hormonii hidrofili se leagă de receptorii din plasmalemă şi aceşti receptori
transmit celulei informaţia necesară spre a-şi modifica metabolismul. În acesta categorie intră
receptorii pentru insulină, glucagon, adrenalină, hormoni ai hipofizei, parathormonul.
c. Receptori implicaţi în reacţii imunitare sunt receptori pentru antigene endogene
(foarte numeroşi în plasmalema unor limfocite), receptori pentru anticorpi, receptori pentru
complement.

Receptorii pentru substanţe exogene (vehiculate de obicei pe cale umorală) includ:

ƒ receptori pentru virusuri;
ƒ receptori pentru antigene străine de organism
ƒ receptori pentru toxine bacteriene
ƒ receptori pentru medicamente
ƒ receptori pentru lecitine

Deşi conceptul de receptor a fost enunţat de mai bine de 100 de ani de către P Erlich
şi M. Hangley, pentru a explica mecanismul de acţiune al medicamentelor şi toxinelor numai
recent, datorită progreselor tehnicii, au putut fi vizualizaţi unii receptori în ţesuturi umane
obţinute post-mortem.

45
 2.4.2. Modalităţi de comunicare intercelulară

Sistemele de comunicare intercelulară reprezintă cheia înţelegerii funcţionării

armonioase a celor aproximativ1x 1015celule din organismul uman.
Comunicarea între celule este necesară începând cu dezvoltarea şi organizarea acestora
în ţesuturi,continuând cu controlul creşterii şi diviziunii, ca şi pentru coordonarea diverselor
activităţi ale celulelor mature. Pe de altă parte, într-o serie de boli alterarea comunicării are un
rol patogenic important.
Căile principale prin care se realizează schimbul mesajelor sunt:
a) transmiterea indirectă la distanţă
b) transmiterea directă între celulele aflate în contact.

2.4.2.1.Comunicarea intercelulară la distanţă

Celulele pot schimba între ele, la distanţă,mesaje care difuzează în spaţiul extracelular.
Acesta este cazul a două mecanisme fundamentale de transmitere a informaţiei:
- transmiterea nervoasă, adaptată comunicării rapide şi selective a mesajelor şi,
- transmiterea umorală, consecutiv eliberării unui mesager chimic în torentul circulator
fiind adecvată transmiterii de informaţii generale, de exemplu metabolice.
În ambele cazuri membranele celulare au un rol principal îndeosebi prin existenţa
receptorilor specifici

2.4.2.2.Contactul intracelular direct

Contactul celular direct, când mesajele se transmit fără o difuziune semnificativă în
spaţiile extracelulare pot fi:
ƒ permanente
ƒ tranzitorii
ƒ episodice
Contactul direct permanent se realizează de obicei prin intermediul joncţiunilor
permeabile de tip „gap” care leagă direct compartimentele citoplasmatice ale celulelor ce se
influenţează reciproc şi prin care trec molecule mici. Contacul intercelular direct cu caracter
efemer, tranzitoriu este exemplificat tipic de cooperarea celulelor sistemului imunitar a cărui
organizare este astăzi comparată cu aceea a sistemului nervos elaborându-se conceptul de
„reţea imunitară”. De asemenea există şi cazul conjugării celor două posibilităţi de
comunicare anterioară când mesajele se transmit la distanţă prin contacte interpuse (de
exemplu, cazul reţelei nervoase dintre celulele senzoriale şi cele musculare).
Principalele sisteme de mesageri şi semnale intercelulare sunt hormonii (care nu mai
sunt consideraţi produşi exclusiv ai glandelor endocrine), neurohormonii şi neuromediatorii,
ionii şi nucleotidele, polinucleotidele şi ARN, virusurile şi interferonii, factorii de creştere,
anticorpii şi antigenele, semnalele bioelectrice, etc.

2.4.3. Receptorii celulelor nervoase

Când informaţia circula rapid de la şi către anumite locuri, mesajele sunt vehiculate
printr-un mecanism electric de către nervi prin transmisie chimică între neuroni şi între aceştia
şi celulele receptoare senzoriale sau efectuare. Pe plan celular, legătura este stabilizată prin
contacte sinaptice intercelulare de 15 nm dintre celulele care participă la transmiterea
mesajelor. Odată cu apariţia potenţialului de acţiune, capătul nervului eliberează
neurotransmiţătorii în spaţiul sinaptic de unde o parte sunt distruşi şi o alta se prinde de
receptorii specifici. Astfel de neurotransmiţători sunt: acetilcolina, noradrenalina, dopamina,
glutamatul, glicina, ATP, substanţa P (un decapeptid), etc . Dintre receptorii şi antigoniştii lor,
fac parte: receptorul colinergic, sensibil la nicotină (α-bungarotoxina); receptorul colinergic,
sensibil la muscarină cu antagonist atropina; α-adrenergic (fentolamina); β-adrenergic –
46
(propanolul); si alţii . Axonul unui neuron motor de la broască, parcurgând câteva sute de
micrometrii pe suprafaţa unui muşchi, formează câteva sute de contacte sinaptice la 1µm . În
fiecare regiune presinaptică se găsesc vezicule presinaptice la capătul terminaţiei nervoase.
Fiecare terminaţie conţine aproximativ 10000 molecule de acetilcolina. Fuziunea veziculelor
cu acetilcolina cu membrana presinaptice este declanşată de o creştere rapidă şi trecătoare a
concentraţiei Ca2+ în butonul terminal al axonului. Probabil că exocitoza se realizează prin
filamentele mecanocontractile membranare, sub influenţa Ca2+, dar imediat acest Ca2+ liber
dispare în momentul contopirii veziculelor cu membrana presinaptica. Ataşarea veziculelor cu
acetilcolina de membrana presinaptica se face pe unele proteine intrinseci membranare,
aşezate pe doua şiruri la fiecare sinapsa. În mai puţin de 100ms conţinutul de circa 10000
molecule de acetil-colina iese prin exocitoza în spaţiul sinaptic, legându-se de receptorii
membranari postsinaptici. Receptorii membranari postsinaptici sunt concepuţi ca nişte canale
proteice care se deschid la neurotransmiţător. Când doua molecule dintr-un neuro-transmitaţor
(acetilcolina) se leagă de un receptor postsinaptic, scade energia stadiului conformaţional
deschis şi, în acest mod, canalul proteic al respectivului receptor se va deschide; aceasta se
face la întâmplare, într-o ms, cele 10000 molecule de acetilcolina trecând prin cele circa 2000
de canale în acelaşi timp cu 20000 ioni de Na+ într-un sens si tot atâţia de potasiu (K+) în sens
invers. Diferenţa de voltaj între K+ care iese în spaţiul sinaptic si Na+ care intra în celula este
aproape 0 (zero). Asemenea apropiere de zero depinde de numărul canalelor deschise şi de
durata acestui stadiu. Deci, acetilcolina se descărca prin impuls nervos (impulsul nervos este
acela care deschide canalele proteice) şi realizează în membrana postsinaptică prin mediaţie
chimica un potenţial de membrana cu ajutorul canalelor receptoare de acetilcolina care
transporta K+ şi Na+.
Propagarea mai departe a influxului nervos depinde de existenta în membrana
neuronului a unor canale ce se deschid pentru Na+ la o modificare a voltajului membranar şi a
căror funcţionare de ,,poarta închisă şi deschisă” pentru Na+ este cauza, de fapt a potenţialului
de acţiune (P.A.) (fig. 22).

Fig. 22. Influxul nervos (schemă)

În momentul aplicării unui stimul

are loc o depolarizare locala slabă
caracterizată printr-o mică modificare de
voltaj care deschide canalele pentru Na+,
transferând voltajul mai departe.
Pătrunderea Na+, se accelerează,
pana ce suprafaţa interna a membranei
se pozitivează pe o unica porţiune. Ieşirea ionilor de K+ restabileşte repede potenţialul negativ
al membranei .
Inversarea voltajului determină potenţialul de acţiune ce se propagă de-a lungul axonului (fig.
23).

Fig. 23. Canalele de Na+ şi K+ (schemă)

47
 Canalul Na+ este o proteină de circa 300000 daltoni, cu un por de 0,4-0,6 nm prin care
trec ioni de Na+ cu o moleculă de apă. Pe suprafaţa sa canalul are grupări încărcate electric în
poziţii bine determinate. Asemenea sarcini conferă canalului un moment dipol electric mare,
care variază în direcţie şi mărime de câte ori se schimbă conformaţia moleculară a canalului,
după cum el se închide şi apoi se deschide.
Diferenţa de potenţial a membranei în repaus este, după cum se ştie, 70mV între
incarcatura pozitivă de la exterior şi cea negativă de la interior, ceea ce înseamnă un câmp
electric mare membranar, de aproximativ 100KV/cm. În consecinţa, dipolii electrici ai
proteinelor canalului Na+ se aliniază cu câmpul electric membranar.
Modificările în intensitatea câmpului membranar pot, să schimbe conformaţia proteinei
canalului din ,,închisă” în ,,deschisă”, astfel că faţa internă (sau citoplasmatică) devine
pozitivă prin pătrunderea Na+.
Diferenţa de voltaj transmembranar care deschide canalul Na+ acţionează de asemenea,
asupra canalului, determinându-i o stare conformaţională ,,închisă”, diferită de aceea din
starea de repaus; este starea de inactivare ce apare mult mai lent ca procesul de activare, aşa
fel încât canalele rămân deschise scurt timp, pentru ca apoi sa se închidă prin inactivare.
Canalele rămân în stare de inactivare câteva ms şi abia apoi se închid trecând în starea de
repaus. Deschiderea canalelor Na+ se face în modul ,,totul sau nimic”, deoarece fiecare canal
deschizându-se face să crească conductanţa membranei de 8x10-12ohmi (Ω).
Apoi, prin scoaterea K+ de câtre canalele K+ în afara fibrei nervoase, se stabileşte
incarcatura negativă a feţei citoplasmatice a membranei; contracarând canalul Na+. Este de
remarcat că, în axon se generează un singur impuls care se propagă de-a lungul sau în urma
unui singur stimul, spre deosebire de corpul neuronului care, produce o serie de impulsuri la
diferite intensităţi ale aceluiaşi stimul.

2.4.4. Receptorii care controlează permeabilitatea ionică

Ţesuturile electrogene ale peştilor electrici au puţine joncţiuni neuromusculare.

Membranele lor postsinaptice sunt foarte bogate însa într-un receptor colinergic reglat de
nicotina .
Cantităţile mici de nicotina sensibilizează receptorii, iar cele mari îl blochează . Este
vorba de un complex de 3-4 polipeptide cu o greutate moleculară de 200000-300000 fiecare
polipeptid având o GM=40000-65000 . Receptorul este relativ hidrofob şi glicolizat cu
manoza şi galactoza. De un asemenea complex se pot lega, experimental, 4 molecule de α-
bungarotoxina marcată, constatându-se, după izolarea membranelor postsinaptice, asistentă a
30000 molecule de toxina marcată pe un µm2, deci aproximativ 7500 receptori dispuşi în arii
hexagonale la suprafaţa membranei.
Fiecare complex are 250000 daltoni, fiind compus din 3-4 tipuri de polipeptide de 50000
daltoni, hidrofobe şi glicolizate cu manoza şi galactoza. Un complex prezintă patru situsuri de
legare pentru acetilcolina. Aceşti receptori, care se găsesc şi în creierul mamiferelor, sunt
blocaţi când în sângele circulant apare un anticorp al sau datorită unei condiţii autoimunitare.
În acest caz, nu se mai poate realiza transmisia neuromusculara şi apare o maladie musculară
degenerativă.

48
 Fig. 24. Transmisia chimică prin sinapse

O caracteristică a receptorilor este că prezintă întotdeauna trei stări conformaţionale ale

proteinelor constitutive, şi anume, o stare de repaus, una de activitate marcată prin
conductanţei Na+ şi alta de desensibilizare (sau un stadiu rezistent la activare).
Exista o multitudine de receptori a căror funcţionare este legată de canalele ionofore ale
membranei celulare, funcţionând cu ,,porţi”care se deschid şi se închid sub influenţele
chimice sau datorită variaţiilor de voltaj transmembranar. Receptorul acetilcolinei
(antagonistul lui fiind bungarotoxina) acţionează când captează neurotransmitătorul,
deschizând canalul Na+ ce pătrunde astfel înăuntru (Na+). Şi invers sunt inhibitori ai
49
neurotransmiţătorilor care au efecte de hiperpolarizare prin intermediul receptorilor specifici
(ex. stricnina care sensibilizează specific receptorul pentru glicina), creşte permeabilitatea
pentru Cl- şi K+ .
Modificările în conductanţa membranei pentru Na+ şi K+ se datoresc unor canale care
se închid şi se deschid selectiv faţă de ioni, ca în fibra nervoasă. Aşa, de exemplu sunt
canalele ce lasă să treacă Na+, nu şi K+, altele care permit trecerea K+ nu şi a Na+ , unele lasă
pentru 100 ioni K+ să mai treacă şi 85 Na+, altele pentru ≈100 K+ lasă să treacă doar 7 Na+.
Canalele prin care trec 100 K+ şi 85 Na+ sunt activate de acetilcolina, având un por de
0,8nm diametru, destul de apos. Canalele K+ sunt mult mai mici şi au foarte puţina apă, cu
toate că molecula de K+ este de 30 de ori mai mare decât Na+; densitatea unor asemenea
canale este cuprinsă între 0- 10000µm2 (fig. 24).
Procesul acesta de control a permeabilităţii ionice prin receptori este foarte vechi, datând
de la infuzorii ciliaţi la care există receptori de presiune. Astfel, când un parameci înoată şi
întâlneşte un obstacol, brusc se inversează bătaia cililor şi el înoată atunci înapoi.
Experimental, aceasta inversare a bătăii ciliare se realizează în prezenta unei soluţii de KCl
datorită unui influx al Ca2+ în infuzor, ca răspuns la presiune sau depolarizare.
Celulele sunt foarte sensibile la o variaţie citoplasmatică a Ca2+, deoarece Ca2+
intracelular este într-o mică cantitate (0,01-1µ M), faţă de cel extracelular (1m M). Chiar cel
mai mic influx de Ca2+ care trece prin canalele sale membranare produce perturbări în
concentraţia sa intracelulară, cu modificările fiziologice corespunzătoare.
Aşa de exemplu, discurile membranare ale celulelor cu bastonaşe din retina conţin ,,porţi”
ionice de Ca2+, care sunt activate de către interacţiunea luminii cu rodopsina. Creşterea Ca2+
citoplasmatic de la 10-8 M la 10-6 M, ca răspuns la lumina, inhiba mişcarea Na+ prin
membrana, hiperpolarizand celula şi inhibând sinapsele de la baza celulei. Tot astfel, activarea
unei serii de receptori produce mobilizarea Ca2+ (receptorii colinergici, α-adrenergici,
angiotensinici, β-glucozei, etc) în celula ţinta. Ca2+, ajuns în celule ,,cooperează” la realizarea
exocitozei, contracţiei musculare, glicogenolizei, creşterii cantităţii de c GMP etc.
Asemenea procese mediate de Ca2+ se realizează printr-o proteina ce leagă Ca intrat în
celula, denumită calmodulina. Ea se leagă cu patru ioni de Ca modificându-si conformaţia,
după care reacţionează cu o apoenzima sau cu o proteina receptoare, luând o noua
conformaţie şi participând la tot felul de activităţi moleculare, cu diferite răspunsuri
fiziologice. Calmodulina interacţionând ireversibil cu Ca2+ formează complexul proteina
+4Ca2+ a cărui activitate este reglată de fluxul deschiderii canalelor de Ca2+.

2.4.5. Cuplajul celular metabolic şi electric

Cuplajul celular se realizează structural prin joncţiuni strânse (,,cu gol” şi

,,scalariforme”), care solidarizează celulele adiacente pe anumite porţiuni. Astfel, orice cuplaj
prin joncţiuni dintre celulele adiacente face posibilă ca o modificare a potenţialului de
membrana într-o celula să se propage şi în celelalte. De exemplu, conductanţa electrică
realizata la nivelul joncţiunilor ,,cu gol” dintre celulele adiacente este de 106 ori mai mare ca
în restul membranelor celulare nelegate între ele.
Trecerea diferitelor molecule prin joncţiunile cu gol depind de menţinerea în
hialoplasma a unei concentraţii de Ca2+ sub 10-5 M. Când concentraţia Ca2+ creşte în celula,
atunci scade şi permeabilitatea joncţiunilor şi creşte iar când scade nivelul Ca2+.
Studiile electrofiziologice şi de microinjecţii au presupus existenţa unor canale la nivelul
joncţiunilor, de 2nm diametru şi 20nm lungime. Aceste canale au fost confirmate de ME care
a arătat că la nivelul acestor joncţiuni există nişte particule intramembranare care formează
suprafeţe mozaicate în hexagoane şi care reprezintă proteinele cu canalele moleculare.

50
2.5. Schimburile energetice în celula vie

Descoperirile ştiinţifice au permis omului să utilizeze cantităţi considerabile de energie.

Această energie se prezintă sub mai multe forme: mecanică, hidraulică, calorică, electrică,
nucleară etc. Energia este utilizată în maniere foarte variate, suferind numeroase transformări
în instrumente sau maşini pe care le utilizăm zilnic. Astfel, motoarele, care funcţionează cu
benzină sau electricitate, produc energie mecanică. Un receptor radio utilizează energia
radiaţiilor electromagnetice şi transformă energia electrică în energie acustică.
În celulele vii există, de asemenea, sisteme capabile de a converti energie dintr-o formă
în alta. Astfel, radiaţiile solare ( energia luminoasă ) sunt transformate în energie chimică;
transformarea are loc în cloroplaste. Energia astfel recuperată poate, în continuare, să
servească la biosinteze sau activităţi fizice sau mecanice, graţie unor dispozitive care asigură
conversia necesară. Aceste transformări au loc în sisteme constituite din ansambluri de
molecule specifice.
Înainte de a studia sistemele biologice care asigură transferul sau conversia energiei,
este util să ne amintim câteva noţiuni fundamentale de termodinamică.

2.5.1. Noţiuni generale de termodinamică

Studiul energiei şi transformările sale reprezintă o ramură a fizicii denumită

termodinamică. Noţiunile generale de termodinamică sunt aplicabile şi la sistemele vii.
NOTIUNEA DE ENTALPIE. Să considerăm un sistem, ca acela al unui fenomen fizic
sau reacţie chimică. Sistemul se caracterizează prin stadiul său iniţial şi stadiul său final.
Trecând de la stadiu iniţial la stadiul final, sistemul poate elibera energie în mediul său
înconjurător. Astfel, dacă sistemul emite căldură, el va fi exotermic. Invers, dacă sistemul
consumă căldură (energie calorică ), preluată din mediul ambiant, el este endotermic.
Pare dificil, dacă nu chiar imposibil, de a evalua energia care există într-un sistem izolat,
considerat la un stadiu dat. Din contra, putem măsura destul de uşor schimburile energetice
care afectează sistemul când acesta trece de la un stadiu la altul. Astfel, schimburile de
energie internă ∆E , pe care le suferă sistemul, este egal cu cantitatea de căldură Q pe care o
primeşte din mediul exterior, mai puţin lucrul mecanic ( travaliul ) pe care îl realizează, W:
∆E = Q – W
Această relaţie demonstrează capacitatea de conservare a energiei. Conform primului
principiu al termodinamicii, energia totală a Universului rămâne constantă. Energia nu se
pierde, ci suferă transformări.
Într-o reacţie chimică ce se derulează sub presiune constantă ( de exemplu, presiunea
atmosferică ), schimbul caloric care afectează sistemul ( căldura de reacţie ), constituie, prin
definiţie, un schimb de entalpie ∆H:
∆E = ∆H - W
Dacă sistemul nu produce nici un lucru mecanic, atunci relaţia este:

∆E = ∆H
Această relaţie permite evaluarea schimburilor energetice interne ale unei reacţii care se
derulează sub presiune constantă, cu un volum constant. Putem măsura schimburile de
entalpie cu ajutorul unui calorimetru. Astfel, căldura de combustie a glucozei se ridică la
673.000 cal/mol, la 20 0 C, la presiune atmosferică:
∆H = - 673.000 cal/mol

51
Valoarea sa este negativă deoarece energia calorică produsă de sistem este cedată mediului
înconjurător.
VARIAŢIA ENTALPIEI LIBERE. Să considerăm o reacţie reversibilă în condiţii
izoterme. Această reacţie tinde să dobândească un statut de echilibru. Dacă o altă reacţie se va
opune, prima va realiza un efort (lucru mecanic, travaliu ), pentru a-şi obţine statutul de
echilibru. Energia cheltuită pentru acest efort reprezintă un potenţial chimic. Această energie (
potenţialul chimic ), numită şi energie liberă, este desemnată astăzi prin expresia entalpie
liberă. Când reacţia realizează un lucru mecanic, variaţia entalpiei libere ( ∆G ) este negativă
şi reacţia este exergonică. Diminuarea entalpiei libere a sistemului reprezintă cantitatea
maximă de energie disponibilă care ar putea fi transformată în energie chimică.
Dacă, la o temperatură şi presiune constantă, variaţia entalpiei libere între stadiul iniţial
şi stadiul final al reacţiei este negativă (∆F< 0), reacţia se poate realiza spontan. Ea va avea
loc foarte rapid în prezenţa unor enzime specifice. Enzima diminuează energia de activare,
care , pe de altă parte, nu depinde de variaţia entalpiei libere.
În cazul unei variaţii de entalpie liberă pozitivă (∆F> 0 ), reacţia nu se mai poate realiza
spontan. Se spune că este o reacţie endergonică (endoergonică)., pentru că ea are loc cu un
aport exterior de energie care îi este necesară. Acest aport exterior de energie poate proveni
din energia radiaţiilor luminoase sau din cuplajul cu o altă reacţie, în mod obligatoriu,
exergonică. Pentru a se putea realiza cuplarea cu o altă reacţie, este necesar ca diminuarea
entalpiei libere a sistemului exergonic să fie mai ridicată decât consumul sistemului
endergonic.
Variaţiei entalpiei libere este semnificativă prin posibilitatea de a şti dacă o reacţie are
sau nu loc spontan.
VARIAŢIA ENTALPIEI LIBERE ŞI VARIAŢIA ENTROPIEI. În toate sistemele se
pot distinge două forme de energie, una numită energie internă, alta numită entropie. În
sistemul reprezentat de o reacţie chimică, energia internă corespunde celei are este
reprezentată de diferite legături chimice şi care poate fi convertită într-o altă formă de
energie: mecanică, chimică, fizică. Entropia reprezintă energia cinetică a atomilor şi
moleculelor, energie care se exprimă sub formă de vibraţii, rotaţii sau translaţii.
Entropia este nulă într-un cristal perfect la 0 absolut şi, relativ scăzută, într-un solid. Ea
este foarte ridicată într-un gaz, unde dezordinea moleculară este foarte accentuată. Entropia
creşte odată cu temperatura, în măsura în care se accentuează (creşte) caracterul dezordonat al
moleculelor. Fie o reacţie chimică care evoluează spontan, de-o manieră reversibilă faţă de
poziţia sa de echilibru. Reacţia următoare leagă variaţia entalpiei libere ∆G, variaţia entalpiei
∆H şi variaţia entropiei ∆S :
∆G = ∆H – T ∆S

T, reprezintă temperatura absolută a reacţiei. O scădere a schimbului de energie liberă este

totdeauna asociată cu o creştere de entropie. Schimbul de entropie al sistemului, ∆S, la o
valoare pozitivă se exprimă în calorii/grad/mol.
După al doilea principiu al termodinamicii, entropia totală a unui sistem trebuie să
crească. Stadiul dezordonat al energiei componenţilor săi are totdeauna tendinţa de acreşte.
Totuşi, entropia poate să scadă într-un sistem unde au loc reacţii de sinteză şi, în mod
particular, în fotosinteză.
RAPORTUL ÎNTRE VARIAŢIA ENTALPIEI LIBERE ŞI CONSTANŢA DE
ECHILIBRU. Să considerăm următoarea reacţie chimică reversibilă: A ↔ B. Ea atinge
nivelul său de echilibru când survin modificările reacţiei. În egalitatea :

Keq = B [ ] /A [ ]

52
Keq, reprezintă constanta de echilibru pentru o temperatură şi o presiune determinată.
Constanta de echilibru este legată de schimburile entalpiei libere prin reacţia:
∆G0 = - RT In Keq

Unde R este constanta gazelor perfecte ( 1,987 cal/mol/grad ), T este temperatura absolută,
Keq este logaritmul cu semn schimbat al constantei de echilibru iar ∆G0 schimbul standard al
entropiei libere. În cazuri diferite se determină ∆G, reacţia efectuându-se la un pH = 7.
determinând constanta de echilibru Keq, plecând de la analiza chimică, putem, în continuare,
să calculăm variaţia entropiei libere a sistemului ∆G0.
Să considerăm echilibrul:

Glucoză – 1 – fosfat ↔ glucoză – 6 – fosfat,

catalizat de enzima fosfoglucomutază. La 250 C, la pH = 7, soluţia are 0,001 M de glucoză – 1

– fosfat la stadiul iniţial. La stadiul final, analiza chimică indică un echilibru între 0,001 M de
glucoză – 1 – fosfat şi 0,019 M de glucoză – 6 – fosfat.

Keq = 0,019 / 0,001 = 19

∆G = - 1,987 x 298 x In 19
= - 1745 cal / mol.

Un asemenea echilibru, unde variaţia entalpiei libere este negativă, se efectuează

spontan, de la stânga la dreapta; reacţia este exergonică. Dacă ∆G este pozitiv, reacţia va avea
loc spontan, de la dreapta la stânga.

2.5.2. Transformări de energie în celula vie (energetica celulară)

Celula este sediul activităţilor mecanice, cum sunt mişcările intracitoplasmatice,

deformările, deplasările, creşterea etc. Ea efectuează, de asemenea, activităţi fizice: absoarbe
activ substanţe, transportă molecule, concentrează soluţii, menţine un anumit echilibru
osmotic etc. Celula realizează şi activităţi chimice : sinteze de macromolecule ( glucide,
lipide, protide, acizi nucleici ), plecând de la numeroase molecule mici. De exemplu, pentru a
forma o singură legătură peptidică, sunt necesare 4000 calorii/mol. Această valoare reprezintă
schimbul de entalpie liberă (∆G) care aici este pozitiv. Ori, pentru a construi o singură
macromoleculă de proteină este necesar să se stabilească sute sau chiar mii de legături
peptidice şi, deci, de o mare cantitate de energie. Pentru a face faţă acestui necesar imens de
energie celula dispune de mecanisme complexe proprii. Intre nevoia şi aportul de energie
există intermediari capabili să efectueze multiple transformări. Aceşti intermediari sunt
derivaţi fosforilaţi ai nucleotidelor, un rol aparte dintre aceşti compuşi îl are molecula de ATP
( adenozin trifosfatul sau acidul adenozin trifosforic).
Deşi orice molecula care participa la metabolismul celular conţine o anumită cantitate de
energie, doar un număr foarte redus din ele au o importanţă în stocarea şi vehicularea energiei
chimice celulare. Aceşti compuşi trebuie să poată îngloba o cantitate apreciabilă de energie şi
să poată ceda acolo unde şi când este necesar.
Compuşii care fac parte din această categorie îşi datorează numele de macroergici
(bogaţi în energie) faptului că hidroliza lor se soldează totdeauna cu eliberarea unei
importante cantităţi de energie.
Principalul izvor al energiei celulelor aerobe este procentul de respiraţie celulară:

AH2+ 1/2O2→H 2 O + energie

53
 În care A simbolizează un substrat oarecare, iar AH2-substrat redus. Energia degajată în
cursul respiraţiei celulare este un mod normal parţial recuperată în cadrul unui proces biologic
cuplat.
Recuperarea se face prin stocarea energiei în molecule de ATP (adenozin trifosfatul sau
acidul adenozintrifosforic), care se formează prin fosforilarea moleculelor de ADP (adenozin
difosfat sau acidul adenozindifosforic).
Întrucât această fosforilare este cuplată cu oxidările din cadrul respiraţiei procesul de
recuperare a energiei respiratorii se numeşte fosforilare oxidativă:

nADP + nPa+ energie→ n ATP

Astfel, reprezentarea simbolică a proceselor cuplate generatoare şi recuperatoare de energie

poate fi următoarea:

AH2 + nADP + nPa + ½ O2 → A+ n ATP + H 2O

Organismul utilizează în permanenţă mari cantităţi de energie atât pentru sinteza

compuşilor cu structuri complexe (proteine, lipide, polizaharide) cât şi pentru susţinerea unor
procese cum sunt: contracţia musculară, excitaţia nervoasă, transportul activ şi altele.
De aceea, transferul energiei libere rezultată din reacţiile exergonice ale căilor
degradative către aceste procese, trebuie să se realizeze eficient. Constanţa temperaturii face
ca transferul energiei în sistemele biologice să fie posibil numai prin reacţii cuplate: două
reacţii sunt cuplate dacă energia liberă a uneia care este exergonică, cedează energiei
determină desfăşurarea celeilalte care este endergonică (consumă energie).
În organism există numeroase reacţii cuplate prin intermediul acidului acetic a cărei
formare întro reacţie puternic exergonică asigură desfăşurarea celei de-a doua, endergonică.
Cuplarea celor două reacţii e redată în figura 25.

Fig. 25. Schema unei reacţii cuplate

Mecanismul acestui sistem de cuplaj asigură

transferul energiei libere de la reacţiile degradative ale
glucidelor, lipidelor şi protidelor către cale mai diverse
reacţii consumatoare de energie.
Sistemul ATP↔ADP constituie intermediarul
energetic comun în majoritatea reacţiilor cuplate. Caracterul macroenergetic al legăturilor
P≈O, din molecula ATP care scindează hidrolitic e reprezentat de energia G.

2.5.2.1. Molecula ATP şi proprietăţile sale

Toate celulele, vegetale, animale şi bacteriene depind de ATP, compus izolat în anul
1930, din extracte acide de muşchi. Materia vie conţine 0,5 – 2,5 mg ATP/mol. Poate fi
obţinut în stare pură prin cromatografie pe schimbători de ioni.
Molecula de ATP este alcătuită dintr-o bază azotată purinică – adenina, un zahăr –
pentoză – şi trei radicali fosfat (Fig. 26).

Fig. 26. Structura moleculei de

ATP (a); complexul ATP cu ionul de
Mg 2+ (b).

54
 În celulă, cea mai mare parte a ATP- ului formează un complex cu ionul de Mg 2+. În
moleculă, fosfatul terminal este stereochimic vecin cu un grup aminat al adeninei (fig. 30, b).
Magneziul stabileşte legătura cu adenina şi cu cei doi fosfaţi terminali. Fosfaţii poartă patru
sarcini negative, apropiate unele de altele şi care se resping. ATP este un polifosfat puternic
încărcat electric. Prin hidroliză el se descompune în ADP şi acid fosforic.
Aceşti doi copuşi, ATP şi ADP, sunt sediul unor reanjamente ale atomilor, care se
realizează în maniera în care nivelul de energie al moleculelor este cel mai scăzut posibil.
Ambii poartă încărcătură negativă. Hidroloza produce o importantă scădere a energiei libere a
sistemului:
∆G = - 7000 cal/mol (pH 7; 25oC)

Putem spune că legătura fosfat este bogată în energie, ceea ce este, de fapt, o
neconcordanţă. Energia considerabilă de aici nu corespunde celei de la legătura covalentă
dintre P şi O. Ea provine din hidroliza legăturii anhidrid fosforică.
ADP poate, de asemenea, să se disocieze eliberând o cantitate de energie egală cu
precedenta. Compuşii formaţi prin hidroliză sunt AMP (adenozin monofosfatul sau acidul
adenozinmonofosforic) şi acidul fosforic. AMP poate, la rândul său să fie descompus, dar
hidroliza legăturii ester care reţine fosfatul generează mult mai puţină energie.
Reacţiile de transfer de fosfat (fosforilare →defosforilare) se fac totdeauna de la un
compus cu potenţial de transfer ridicat către unul cu potenţial de transfer scăzut.
Deci, compuşii cu fosfor pot fi donatori sau acceptori de fosfat după cum potenţialul lor
de transfer e mai ridicat sau mai scăzut.
Dacă luăm ecuaţia ATP ↔ADP +Pa, dacă ea se desfăşoară spre stânga ATP e donator de
Pa în sens opus, ADP devine acceptor de Pa transformându-se în ATP.
Grupările fosfat cedate de compuşii macroergici ajung la acceptori nu direct, ci prin
intermediul sistemului ATP↔ADP. Acest sistem face legătura dintre compuşi macroergici (P-
enolpiruvat, 3-diP-glicerat şi P-creatina) spre compuşi microergici (glucoza, glicerol).
Sistemul ATP↔ ADP funcţionează astfel ca o baterie de energie (dinam
celular).(fig.27).

Fig. 27. Schema „dinamului

celular” (Florkin,modificat
de Lippman)

Sistemul ATP↔ADP ca
donator de energie este
implicat într-o serie de procese
biochimice importante cum ar
fi: contracţia musculară
(sistemul creatinkinazic) al
celui de-al doilea mesager
implicat în pătrunderea unor hormoni prin membrana celulară (sistemul adenilatkinazic), dar
şi în procesele de glicoliză sau de oxidare aerobă a glucidelor. (fig. 28).

55
 Fig. 28. - Implicarea sistemului ATP↔ADP în unele procese biochimice celulare

Aceste diverse reacţii sunt reversibile. Este permanent necesar să se furnizeze energie
pentru refacerea AMP, ADP şi ATP- ului. Disocierea sau recombinarea unui compus
fosforilat ca ATP se realizează în prezenţa enzimei adenozin trifosfataza (ATP-aza).

2.5.2.2. Alţi compuşi fosforilaţi

Celula conţine o multitudine de compuşi fosforilaţi. Printre aceştia, PEP
(fosfoenolpiruvatul) conţine o energie liberă de hidroliză considerabilă (∆G = - 12 800
cal/mol), mult mai ridicată decât cea a ATP –ului (∆G = - 7000 cal/mol). Aceşti compuşi au
tendinţa de a se descompune cedând o moleculă de acid fosforic şi energie, favorizând sinteza
de ATP din ADP şi fosfaţi liberi, prezenţi în mediu.
Alţi compuşi au o energie liberă de hidroliză mult mai mică decât ATP-ul. Un exemplu
este glucozo -1-fosfat, ∆G = 5000 cal/mol. Aceşti compuşi se formează în prezenţa ATP-ului
care se descompune cedând energie şi o moleculă de acid fosforic.
Între aceste două exemple extreme de potenţial energetic, PEP şi glucozo -1- fosfat,
există numeroşi compuşi intermediari . Diferiţii compuşi fasfaraţi pot fi repartizaţi pe o scară,
după potenţialul lor de transfer al grupului fosfat. Grupul fosfat tinde să treacă de la compusul
cu potenţial de transfer ridicat, spre cel cu potenţial mai scăzut. Sistemul ADP – ATP, care are
un potenţial de transfer de valoare medie, reglează transferul între cele două tipuri de
compuşi.
Există şi compuşi fosfaraţi, derivaţi de nucleotide, analogi ATP ului, dar în cantităţi
mult mai scăzute. Astfel sunt: uridintrifosfatul (UTP), citidintrifosfatul (CTP),
guanozintrifosfatul (GTP) etc. Aceste substanţe posedă, de asemenea, legături macroergice
fosfat cu un înalt potenţial de energie.

2.6. Membrane care cuplează energie

Membranele capabile de captarea şi conversia energiei aparţin cloroplastelor şi
mitocondriilor.

2.6.1. Cloroplastele

Viaţa pe Pământ depinde de energia produsă de steaua noastră apropiată, soarele.

Energia solară traversează spaţiul sub formă de lumină. Aici, pe Pământ, lumina solară este
captată de numeroasele frunze sau organe verzi ale plantelor. Acestea sunt capabile nu
numai să capteze lumina solară ci să o şi prelucreze în „hrană”.

56
 Cloroplastele sau plastidele verzi, prezente în toate organele verzi ale plantelor, sunt
responsabile de conversia energiei luminoase în energie chimică, datorită clorofilei pe care o
conţin.
Studiile de microscopie electronică au evidenţiat pe suprafaţa lamelor stromatice şi
granare, particule globulare cu dimensiuni de 100-200A0, considerate unităţile funcţionale ale
fotosintezei şi care au fost numite cuantosomi (Park şi Pon,1963) .
Un cuantosom este format, se pare, dintr-un strat de substanţe proteice îmbibate cu apă
şi o componentă lipidică Molecula bipolară a clorofilei se orientează cu polul hidrofil (inelul
porfirinic) spre stratul proteic, în timp ce polul hidrofob (reprezentat de fitol) se îndreaptă spre
lipoizii de structură ai lamelei granare.
S-a stabilit că un cuantosom conţine: circa 160molecule de clorofila-a, 70 molecule de
clorofila-b, 48 molecule de carotenoizi, sute de molecule de lipide, circa 9500 atomi de azot
proteic, precum şi doi atomi de mangan, doisprezece atomi de fier şi sase atomi de cupru.
Membranele tilacoidelor, conţin 12% pigmenţi de două categorii: clorofile 10% şi
carotenoizi 2%. Culorea verde a frunzelor este dată de prezenţa clorofilelor care maschează
culoarea galben portocalie a carotenoizilor. Dintr-un extract brut de pigmenţi (extract in
acetonă sau în alcool) poate fi separat prin cromatografie pe hârtie, placă sau coloană fiecare
pigment din amestec.

a. Pigmenţii clorofilieni
Există două tipuri de clorofile a şi b, la plantele superioare, clorofila a, de culoare verde
albastră, este mai frecventă decât clorofila b, de culoare verde gălbui. Structura chimică a
celor două clorofile este apropiată. Se disting două regiuni: o regiune porfirinică (inel
porfirinic) cu un atom de magneziu în centru şi cu o coadă „fitol”alcool cu C20.
Majoritatea moleculelor de clorofilă sunt asociate proteinelor membranare
(cromoproteine).
Sineza clorofilelor se face în interiorul cloroplastelor. La plantele superioare, una dintre
multiplele etape de sinteză necesită lumină şi fier, de unde sindromul de
„cloroză”(îngălbenire) în cazul carenţei de fier sau lumină (etiolarea).

b. Pigmenţii carotenoidici
Sunt pigmenţi lipofili derivaţi de la izopren. Aceştia sunt: licopenul de culoare roşie şi
carotenul de culoare portocalie; xantofilele, derivaţi hidroxilaţi ai pigmenţilor carotenoidici
sau oxicaroteni.

2.6.1.1. Procesul general al fotosintezei

Cloroplastele reprezintă suportul material, adică sediul la nivelul căruia se desfăşoară
grandiosul proces al fotosintezei, în timpul căruia se sintetizează, în prezenţa luminii,
substanţe organice din CO2 şi apă.
Aceasta transformare de substanţă realizată în celula vegetală este dublată de conversia,
la fel de intensă de energie, pentru ca sinteza moleculelor organice înseamnă înmagazinarea
de energie chimică provenită din conversia energiei solare.
S-a stabilit ca în procesul de fotosinteza, exista doua tipuri de reacţii: reacţii de lumina
(faza de lumina, faza lui Hill) si faza de întuneric (faza obscura sau faza lui Blackman sau
ciclul Calvin) (fig. 29).

57
 Fig. 29 - Schema fotosintezei: A - reacţiile de lumină;
B - reacţiile de întuneric (după P. Sitte, 1965)

În reacţiile de lumina, care au loc în tilacoidele cloroplastului, hidrogenul este smuls de

la moleculele de apă şi dus de o serie de transformări la NADP, cu degajare de O2 în afara
celulei. Acest transfer este posibil graţie aportului de energie libera-energie luminoasa-, care
provoacă starea de excitaţie electronica a moleculei de clorofila. Concomitent cu acest
transport de H2 (sau de electroni), are loc convertirea energiei luminoase în energie chimică,
prin reacţia de fotofosforilare, cu sinteza moleculei macroergice de ATP . Se pare ca pentru
fiecare doi electroni transportaţi revin două (sau fracţiuni între 1 şi 2) molecule de ATP.
Reacţiile de lumina pot fi sintetizate astfel:

H2O + NADP → ½ O2 + NADPH2;

2ADP + Pi → 2 ATP

În reacţiile de întuneric, care se petrec în stroma cloroplastului, NADPH2 produc în

reacţiile de lumina este folosit pentru reducerea CO2. Aceste reacţii sunt asociate cu o creştere
în energia libera a sistemului celular, provenită din descompunerea ATP rezultat în fotofaza.
Reacţiile de întuneric pot fi sintetizate astfel:
CO2 + 2NADPH2 → (CH2O) + H2O + 2NADP
3ATP → 3ADP + 3Pi
Astfel, procesele generale ale fotosintezei pot fi reprezentate prin reacţia:

lumină
CO2 + H2O → (CH2O) + O
Hv

58
 2.6.1.2. Reacţiile de lumină
a. Fotonul
Lumina este un fenomen de natură ondulatorie şi corpusculară. Fiecare corpuscul sau
foton, transportă o energie W(un quantum) care are o valoare dată de lungimea de undă
asociată relaţiei W=hν; h este o constantă, (constanta lui Planck) iar ν este frecvenţa
undei(numărul de vibraţii /secundă), ν=c/χ, c-viteza luminii în vid. Astfel, un foton de lumină
albastră cu o lungime mică a undei, transportă mai multă energie decât un foton de lumină
roşie cu lungime de undă înaltă.

b. Procesul de absorbţie a energiei luminoase

Posibilitatea de a utiliza radiaţiile luminoase de către celulele plantelor verzi se
datorează faptului că ele conţin în cloroplaste molecule de clorofila capabile de aşa numitul
efect fotoelectric, care consta în emisiunea de electroni din atomul unei molecule, sub
acţiunea luminii. Astfel, sub acţiunea radiaţiilor luminoase cu lungimea de unda între 380-
770nm, molecula de clorofila intra în starea de ,,excitaţie electronica” (stare activa),care se
caracterizează fata de starea fundamentală printr-un exces de energie. Molecula de clorofila
poate atinge trei niveluri de excitaţie electronica:
1. Adsorbind radiaţii cu lungimea de unda de 430nm (radiaţii albastre), un electron al
moleculei este dizolvat şi trece pe orbita liberă, menţinându-şi sensul spinului. Energia
înmagazinata în acest caz este egala cu 65Kcal/mol/gram. Aceasta reprezintă o stare de
excitaţie singletică a moleculei de clorofila, având cel mai înalt nivel energetic faţa de
starea fundamentala, ca urmare a duratei foarte scurte de viaţa (10-12 – 10-11s) este
incapabilă să inducă reacţie fotochimică. Dezactivarea, ce aduce revenirea la starea
fundamentală a moleculei se face prin pierdere de căldura (24Kcal/ mol/gram) şi molecula
cade la un alt nivel energetic de excitaţie singlatica, cu 41Kcal/mol/gram.
2. Când molecula de clorofila este bombardată cu fotoni de lumina roşie (cu lungimea undei
670nm), ea atinge acelaşi nivel energetic (41Kcal/mol/gram) . Durata de viaţa a acestei
stări de excitaţie electronica este puţin mai mare (10-9s), totuşi încă insuficientă pentru
inducerea reacţiei fotochimice. Molecula ajunsă la acest nivel se dezactivează prin emisie
de fluorescenta, sau prin pierdere de căldură, în valoare de 10Kcal/mol/gram. Cu aceasta
ocazie se poate întâmpla să aibă loc şi răsturnarea spinului (care se face cu cheltuiala de
energie de excitaţie) molecula cazând la un al treilea nivel energetic de excitaţie
electronică, numită stare tripletica (sau metastabila).
-4 -2
3. Starea de excitaţie tripletica are o durata de viaţa mai lungă (10 -10 s) şi, datorită ei, deşi
are cel mai scăzut nivel energetic (31Kcal/mol/gram), se poate dezactiva prin inducerea
unei reacţii fotochimice (fig.30).

Fig. 30. Stările de excitaţie electronică a unei molecule de clorofilă (după Libbert, 1974)
59
 Există mai multe forme ale clorofilei-a, în funcţie de molecula proteică cu care este
complexată şi care nu sunt echivalente funcţional.
B. Kok si G. Hoch (1961) au descoperit o clorofila-a, care absoarbe radiaţii cu lungime
de unda de 700nm; iar G. Doring şi colab. (1967) o altă formă activă a clorofilei-a, cu
maximum de absorbţie la 682nm. Aceste forme au fost notate convenţional ,,P700” pentru
fotosistemul I şi ,,P680” pentru fotosistemul II şi numai electronul dizlocat de pe aceste
molecule este atât de bogat în energie, încât provoacă reacţia fotochimica.
Celelalte forme de clorofila-a şi clorofila-b, carotenoizii, ficoeritrina şi ficocianina (de la
alge)transfera energia luminoasă pe care o absoarbe pigmentul P700, care reprezintă ,,centrul
fotochimic” al fotosistemului I, energia având tendinţa să migreze spre molecule care absorb
radiaţii cu lungime de unda mai mare.

c. Fotosistemul I si II
Bazându-se pe observaţii începute din 1941 Emerson a arătat (în 1957) ca daca alga
Chlorella este expusa la radiaţii roşii cu λ =680nm, se constata ca procesul fotosintetic
decurge mult mai slab decât atunci când este expusa acţiunii întregului spectru luminos. De
asemenea, acest cercetător a mai stabilit ca daca radiaţiile de lungime de unda (λ) de 680nm
sunt asociate cu radiaţiile de mai mica, procesul fotosintetic arata un efect global superior
sumei celor doua efecte parţiale produse de cele doua lungimi de unda aplicate independent.
Acest fenomen a fost denumit ,,efectul Emerson” si a dus la ideea ca fotosinteza implica doua
reacţii fotochimice în care lumina este absorbita de pigmenţi diferiţi.
Studii ulterioare au confirmat existenţa celor doua reacţii fotochimice, după unii
,,înseriate”, dar contrar supoziţii originale a lui Emerson s-a stabilit de către E. Rabinowith si
colab. (1969) că clorofila-a participa la ambele reacţii.
Cercetări mai recente au stabilit ca unitatea procesului fotosintetic este compusa din
doua fotosisteme (fotosistemul I şi fotosistemul II), fiecare fiind responsabil pentru anumite
reacţii fotochimice având fiecare câte un centru fotochimic. Cele doua sisteme sunt
individualizata funcţional si structural, dar sunt legate între ele prin intermediul lanţului
transportorilor de electroni. Pigmenţii care absorb lumina sunt distribuiţi între cele doua
sisteme.

Fotosistemul I este reprezentat de particule mai mici si conţine ca ,,centru fotochimic”

molecule de P700 (clorofila-a cu maxim de absorbţie la 700nm) sau clorofila-a I, reprezintă
deci pigmentul fotochimic activ al acestui sistem. Alături de P700 mai exista si clorofila cu
maxim de absorbţie la 680nm si o molecula de citocrom f . Se pare ca PS I nu conţine sau
conţine o cantitate foarte mica de clorofila-b.

Fotosistemul II este reprezentat de particule mai mari. El conţine clorofila-a cu maxim

de absorbţie la 680nm (sau după alţii la 672), cunoscuta sub denumirea de P680 sau clorofila-a
II si care reprezintă pigmentul activ al acestui sistem. Alături de P680 sistemul mai conţine
clorofila-b si pigmenţi accesorii (clorofila-c şi fucoxantina la algele brune, proteinele
ficobilinice la algele roşii si albastre). Energia luminoasa pe care o absorb aceşti pigmenţi este
mai mica sau egala 680nm si apoi transferata centrului fotochimic al sistemului I.
Atât clorofila-a I cât si clorofila-a II, socotite ca sensibilizatori optici, sunt singurii
pigmenţi specializaţi în transformarea energiei luminoase în energie chimica. De asemenea,
fiecărui sistem îi corespund reacţii fotochimice diferite, PS I fiind raspunzător de formarea
NADPH2, iar PS II de degajarea O2.
La bacteriile fotosintetizatoare nu exista decât un singur sistem pigmentar, echivalent cu
PS I. Se pare ca pigmenţii β-carotenoizi sunt prezenţi în ambele fotosisteme .

60
 d. Secvenţa transferului de electroni
Transferul de electroni de la moleculele de apă (donor de e- ) la NADP (acceptor final)
implica o serie de transportori de e- cu o secvenţa specifică.
Transferul de e- se poate face spontan dacă are loc între un sistem foarte reducător, cu
potenţial redox scăzut şi un sistem mai puţin reducător, cu potenţial redox ridicat..
În procesul de fotosinteza potenţialul redox al sistemului O2/H2o este foarte ridicat (+0,8
volţi la pH=7) iar cel al sistemului CO2/CH2O este foarte scăzut (-0.42 volţi la un pH=7). Deci
fotosinteza este un proces constituit dintr-o serie de reacţii de oxido-reducere, care evoluează
între un oxidant (CO2) cu potenţial redox –0.4 V şi un reductant (H2O), cu potenţial redox
+0.8 V, deci în sens invers gradientului de potenţial redox.
Migrarea protonilor de la H2O la CO2 nu se realizează spontan, ci cu aport de energie
liberă, care este adusă de molecula clorofilei. Ea accepta fotoni incidenţi, induce oxidarea apei
şi transporta H+ (respectiv electroni) între cele două sisteme redox .

e. Fotoliza apei (oxidarea H2O)

Provocată de molecula de clorofila excitată, este etapa esenţiala a fazei de lumina.
Reacţia a fost descoperită în anul 1973 de câtre R. Hill şi ea se desfăşoară probabil în doua
etapa:

hv
H2O → H+ + e- + OH
2OH → H2O ½ O2

Deci din fotoliza apei rezulta H+ legat (sau agentul reducător) pentru ca ea se efectuează
cu intervenţia unui transportor, apoi a unui acceptor de H+ şi un radical (OH-) care va fi oxidat
în prezenta unei enzime cu eliberare de O2.
Mecanismul eliberării O2 este incomplet cunoscut . Se presupune că radicalul OH- se
fixează pe un acceptor organic care se izomerizează într-un peroxid, din care O2 va fi eliberat
de o peroxidoza (catalaza).
catalaza
-
4OH → 2H2O2 → 2H2O + O2

Rolul de acceptor pare să fie jucat de carotenoizi şi de acidul tioctic.

f. Lanţul transferului de electroni

Reacţia de oxidare a apei este legată direct de FS II, în care funcţionează ca un centru
de reacţii P680, care absorb radiaţiile luminii mai mici sau egale cu 680nm . Aceste radiaţii
produc excitarea moleculelor de clorofila-a care cedează energie sub forma de e-, pentru a
reveni la starea fundamentală.
Ca donator de e- pentru P680 functioneaza molecule de apa. Electronul de la molecula de
P680 este transferat unui acceptor cu natura chimica încă necunoscută, denumit Q.
La rândul său, Q pierde electronul în favoarea unei molecule de plastochinona, care se
reduce . Prin intermediul unei plastocianine, molecula de plastochinona transfera e- la
citocromul b6 care, la rândul sau, îl cedează citocromului f.

61
 Electronul eliberat de
citocromul f furnizează clorofilei
P700 (centrul de reacţie al PS I),
electronul pe care acesta l-a pierdut
sub acţiunea radiaţiilor luminoase
cu λ = 680nm.
Electronul pierdut de P700
este imediat preluat de un acceptor
de e-, necunoscut denumit X, de la
care apoi este cedat ferredoxinei,
pe care o reduce şi căreia îi
transfera energie. Ferredoxina
redusă transferă e- primit moleculei
de NADP, care apoi este redusă la
NADPH2, reacţia fiind catalizată
de o ferredoxin – NADP –
reductoza.
Pe parcursul transferului de
-
e , la fiecare treapta a transportului
se pierde energie, adică există o
cădere a nivelului energetic al
electronului cu fiecare nou
acceptor al său, astfel încât
electronul ajunge ,,descărcat de
energie” la molecula de clorofila
P700 şi aceasta se dezactivează
trecând în starea ei fundamentala.
Datorita cedării de energie pe
parcursul transportului de e-, este Fig. 31. Schema transferului de electroni în
posibilă sinteza de ATP (rezervorul fotosinteză
energetic celular), printr-o reacţie
de fotofosforilare (fig.31).

g. Fotofosforilarea
Capacitatea de fosforilare a
cloroplastelor a fost descoperită de D.
Arnon şi colab. (1954).
Transportul de e-, de la apă la NDAP
este însoţit de expulsia a doi protoni H+(la
nivelul plastochinonei) din stroma
cloroplastului, către spaţiul intratilacoidal,
care se adaugă protonilor rezultaţi din
fotoliza apei.
Încărcătura pozitivă se acumulează
deci în spaţiul tilacoidal. Membrana
tilacoidală fiind impermeabilă pentru
protoni, se crează un gradient
electrochimic de protoni care va permite
funcţionarea ATP-azei membranare.

Fig. 32. Schema fosforilării lineare (I) şi

ciclice (II)
62
 S-a precizat ca fosforilarea se poate realiza pe două căi: fotofosforilarea ciclica şi
aciclica (lineară). Pentru ambele căi există locuri de fosforilare situate pe lanţurile
transportoare între citocromi .
Fosforilarea aciclica. În aceasta reacţie formarea ATP este asociată cu reducerea NADP
şi este implicat şi fotosistemul II, deci şi fotoliza apei. În transferul electronilor proveniţi de la
apă, energia necesară sintezei moleculelor de ATP se eliberează între citocromul-b şi
citocromul-f.
Cercetări recente, bazate pe studiul spectrelor de absorbţie a luminii, precum şi pe
determinarea potenţialului redox al sistemelor transportoare de e-, implică în fosforilarea
lineară citocromul b559 asociat cu plastochinona, locul fosforilarii fiind sistemul între
citocromul-b559-plastochinona şi citocromul-f + plastochinona.
Fosforilarea ciclica. Are loc în prezenţa unor sisteme redox şi a luminii . Electronul
trasferat de P700 ferredoxinei, în loc sa fie cedat în final, NADP, poate fi transportat enzimatic
pe citocromi, de unde este dus înapoi la molecula de clorofila-a din fotosistemul I, energia
pentru sinteza ATP fiind eliberată între citocromul-b6 şi citocromul (fig. 32).

2.6.1.3. Reacţiile de întuneric

a. Ciclul Calvin (calea C3 de reducerea CO2)
NADPH2 şi ATP produşi în faza de lumina sunt utilizaţi în stroma cloroplastului, la
încorporarea CO2 în compuşi organici (fig. 33).
Cu ajutorul izotopului marcat 14C, furnizat Ca14CO2 unei culturi de Chlorella, Calvin şi
Benson (1949-1950) au reuşit să elucideze calea urmată de CO2 în cloroplaste.
După numai 5 sec, izotopul radioactiv a fost găsit în proporţie de 87% în acid
fosfogliceric, 10% în acid fosfopiruvic şi 3% în acid malic.
Deci primul produs după absorbţia CO2 este acidul fosfogliceric (APG), marcat în
funcţia sa carboxilică.
Încorporarea moleculei de CO2 se face prin carboxilarea unui acceptor al său, care s-a
găsit că este un ester fosforic al unei pentoze: ribulozo -1,5 – difosfatul (RIDP), reacţia fiind
catalizată de carboxidismutaza.
Ribuloza – difosfatul adiţionând CO2 formează un compus intermediar instabil, cu 6
atomi de C, care se descompune hidrolitic, rezultând două molecule de acid fosfogliceric.
Imediat după formarea acidului fosfogliceric apar trioze fosforilate, marcate la funcţia
aldehidica.
Reacţia de reducere a funcţiei carboxilice din molecula de acid fosfogliceric se petrece
în două etape, sub acţiunea NADPH2 şi a energiei sincronizate în molecula de ATP.
Astfel ,,agentul reducator” (NADPH2) şi ,, energia de asimilaţie” (ATP) leagă cele două
faze ale procesului de fotosinteză. Deci, reducerea CO2 nu se face în mod direct, ci el este
încorporat mai întâi în ribulozo- difosfat, apoi în acid fosfogliceric, care se reduce formând
aldehida fosfoglicerică.

63
Fig. 33. Localizarea activităţii biochimice în cloroplast (după
Binet şi Brunel, 1968)

64
 Fig. 34 Schema reducerii CO2

Triozele obţinute sunt antrenate într-o serie de transformări, desfăşurate într-o

secvenţa ciclica (ciclul Calvin) pe parcursul căruia, în urma unor serii de condensări, se
formează hexozele şi în final, amidonul. Din totalul moleculelor de trioze, numai a VI-a parte
parcurge această cale, iar celelalte cinci molecule ajung, prin faze intermediare la regenerarea
moleculelor de ribozo-difosfat, capabile să accepte noi molecule de CO2 (fig. 34).
Există însa plante la care celulele mezofilului foliar sunt incapabile să fixeze CO2 în hidraţii
de C, dar el se încorporează activ în fosfoenol- piruvat (PEP) rezultând acizii tetracarbonici :
malic şi aspartic. Astfel, CO2 ajunge pe ribulozo-difosfat intermediat de fosfoenol piruvat,
prin transcarboxilare.

65
 După acest criteriu, plantele se împart în două grupe mari, notate prescurtat cu C3-
fotosintetizante şi respectiv C4- fotosintetizante . Calea C4 s-a găsit la specii aparţinând mai
multor familii de plante, în majoritate tropicale şi subtropicale. Unele genuri, ca de exemplu
Atriplex, conţin atât specii C3 cât şi C4.

b. Calea C4 - de reducere a CO2

În structura frunzei la speciile de plante tropicale şi subtropicale, apar unele
particularitaţi anatomice şi de ultrastructură. Astfel, în jurul nervurilor se formează o teacă de
celule parenchimatice mari, adesea lipsite de grana, care sunt singurele capabile sa reducă
CO2 pe calea ciclului Calvin. Restul celulelor din mezofil sunt mai mici, au cloroplaste mai
mărunte cu ultrastructura normală, în ele desfasurându-se ciclul Hatch – Stac (Calvin).
Între aceste două tipuri de celule existând un schimb intens de substanţe . Speciile de
plante C4 fotosintetizante au fost împărţite la rândul lor, după reacţiile particulare care duc la
eliberarea CO2, în trei grupe.
Grupa plantelor ,,NADP-ME”, în care intervine enzima malica, dependenţa de NADP (de ex.
Triticum sp.);
Grupa plantelor ,,PCK”, în care activează o fosfoenolpiruvat-carboxikinaza (de ex. Panicum
maximum);
Grupa ,,NAD-ME” în care este activată enzima malica dependenţa de NAD (de ex. Atriplex
spongiosa).
În desfăşurarea ciclului Calvin, la toate cele trei tipuri există momente comune. Astfel
este momentul fixării CO2 pe oxalocetat, reacţie catalizată de fosfoenol-piruvat carboxilaza şi
care se petrece în citoplasma celulelor mezofilului frunzelor. Mai departe, desfăşurarea
ciclului diferă la cele trei tipuri de plante.
În plantele din grupa NADP-ME, oxalatul este redus la malat în cloroplastele
celulelor mezofilului, iar acesta este translocat în celulele tecii perifasciculare, unde este
descompus (în cloroplastul acestora), eliberându-se CO2 care parcurge ciclul Calvin,
formându-se în final, amidonul. Agentul reducător îl constituie NADPH2, format din malat
prin intervenţia enzimei malice dependenţa de NADP . Cloroplastele celulelor tecii
fasciculare furnizează ATP în ele având loc fosforilarea. Este de notat faptul că plantele C4
utilizează o moleculă de ATP în plus, fată de plantele C3, pentru fiecare moleculă de CO2
fixata de hidraţi de carbon (fig. 35A).

Fig. 35. A. Fixarea CO2 pe calea C4: A - plante "NADP - ME"; B - plante "PCK";
C - plante "NAD-ME"; ciclul FRC - ciclul fotosintetic de reducere a CO2

66
 În celelalte două tipuri de plante C4 (PCK si NAD-ME) oxalatul format de
fosfoenolpiruvat-carboxilaza, în primul moment al fixării CO2, este convertit prin
transaminare, în afara cloroplastului, la aspartat, care migrează apoi în teaca perifasciculara de
celule, unde din nou, este convertit prin transaminare înapoi la oxalacetat.
Aceasta noua transaminare este localizată la tipul de plante ,,PCK” în citoplasma
celulelor perifasciculare, iar la tipul de plante ,,NAD-ME” în mitocondriile lor.
În plantele ,,PCK” oxalatul este decarboxilat de o PEP-carboxilaza citoplasmatică
formându-se acid PEP, care este apoi convertit la piruvat (fig. 35 B).
În plantele NAD-ME, oxalatul este mai întâi redus de către NAD-malat dehidrogenază
în mitocondrii, apoi suferă în aceleaşi organite o decarboxilare oxidativă prin intervenţia
enzimei malice, dependentă de NAD.
Piruvatul eliberat la ambele tipuri de plante, este convertit în alanina prin
transformare, iar alanina se întoarce în celulele mezofilului unde este transaminată din nou
producându-se piruvat, care este reconvertit în cloroplaste la PEP (fig. 35 C).
Astfel, calea C4 se caracterizează prin transportul unor mari cantitaţi de malat sau
aspartat din celulele mezofilului în celulele tecii perifasciculare şi cantitaţi corespunzătoare
de piruvat sau alanina în direcţie opusă. Acest flux, intercelular are loc, se crede prin
plasmodesmele din pereţii celor două tipuri de celule.

2.6.2. Mitocondriile
Mitocondria este considerată ,,centrul respiraţiei celulare” funcţia principală constă în
înglobarea energiei sub forma de legături macroergice de ATP. Mitocondriile, datorită
echipamentului lor enzimatic, localizat atât în membrane, cât şi în matrice, îndeplinesc în
biologia celulei următoarele roluri: asigură în parte degradarea glucozei, sunt sediul efectuării
ciclului Krebs şi al lanţului respirator ce derivă din acest ciclu, asigura efectuarea ciclului
glicoxalatului şi sunt sediul unor sinteze şi degradări de substanţe.

2.6.2.1.Degradarea glucozei de către mitocondrii

Se admite în general, că degradarea glucozei are loc în două etape: una extra-
mitocondriala, care ia sfârşit cu formarea a două molecule de acid piruvic dintr-o molecula de
glucoza şi alta intramitocondrială în care are loc oxidarea totală a acidului piruvic în CO2 si
H2O. Prima serie de reacţii este cunoscută sub denumirea de glicoliza, calea Emden-
Meyerhof, faza anaeroba a oxidării glucozei sau calea formării piruvatului.

În linii mari, procesul de degradare anaerobă a glucozei se desfasoară astfel:

ATP fosforilare ADP izomerizare

glucoza glucoza-6-fosfat fructoza-6-fosfat
fosfokinaza hexozoizomeraza

ATP fosforilare ADP

fructoza-6-fosfat fructoza-1.6-difosfat
fosfofructokinaza

dihidroizi-acetona 3-fosfat NADH→H+NAD acid-3-fosfogliceric

aldehida-3-fosfoglicerina ambele sunt reduse de NADH
aldolaza

acid piruvic (2 molecule)

piruvatkinaza

67
 Deci, în etapa extramitocondriala dintr-o moleculă de glucoza rezultă două molecule de
acid piruvic (glicoliza), urmând ca oxidarea completă a acidului piruvic, în CO2 si H2O să
aibă loc intramitocondrial, în ciclul Krebs. În acest scop acidul piruvic este convertit în
prezenţa coenzimei-A (Co-A) în acetil-Co-A, când are loc o reacţie complexă de
decarboxilare oxidativa, la care participă NAD+ ca acceptor de H+ şi enzima piruvat-
decarboxilaza.

Ciclul Krebs

Denumit şi ciclul citric sau ciclul tricarboxilic (deoarece în desfăşurarea lui intervin
acizi cu trei grupări –COOH), se desfăşoară în exclusivitate în matrice, iar reacţia lui
fundamentală este oxidarea completa a grupării acetil a acetil-Co-A. Aceasta oxidare este
realizată numai dacă în mediu se găseşte în exces altă substanţă– acidul oxalacetic, care ia
naştere în urma carboxilarii în hialoplasma a acidului piruvic, în prezenta oxalacetal-
carboxilazei şi a ionilor de Mn2+, cofactor:

Mn2+
acidul piruvic acid oxalacetic
oxalacetal-carboxilaza.

Dacă în legătura cu producerea glucolizei mai există încă deosebire de vederi în ceea
ce priveşte nivelul celular la care are loc, în schimb toţi biochimiştii, bazându-se pe date
experimentale, sunt de acord ca ciclul Krebs se desfăşoară exclusiv în mitocondrie şi constitue
cea mai importantă cale catabolica aeroba a oxidării hidraţilor de C, a acizilor graşi şi a
majorităţii aminoacizilor până la CO2 şi H2O, cu punerea în libertate a unei importante
cantitaţi de energie.
Fazele de desfăşurare a acestui ciclu, stabilite de Krebs încă din 1930, au putut fi
urmărite şi controlate în ultimele decenii cu ajutorul suspensiilor de mitocondrii. Acest ciclu
are loc în mai multe etape, reacţiile fiecărei etape fiind catalizate de câte o enzimă.
Prima etapă, considerată cea mai importantă, constă în pătrunderea acidului oxalacetic
în matricea mitocondriei, pătrundere înlesnită de acetil-Co-A-sintetaza, identificată recent în
membrană mitocondriala externă, prin condensare cu acetil-Co-A, aceasta va da naştere
acidului citric, reacţie catalizată de citrat-sintetaza.

Acid oxalacetc + acetil - Co-A Citrat-sintetaza acid citric + HS – Co-A

Mg2+

Acidul citric astfel format, în urma unor izomerizări şi decarboxilari dă naştere la o serie
de acizi tri şi dicarboxilici ca acizii: izocitric, aconitic, cetoglutaric, succinic, fumaric, malic,
acizi cu 6,5 şi 4 atomi de carbon şi, în sfârşit acidul oxalacetic de la care s-a plecat în tot acest
timp, acidul acetic provenit din acidul piruvic iniţial, s-a degradat în CO2 si H2O, iar acidul
oxalacetic activat, rezultat din transformarea altei molecule de acid piruvic (provenit dintr-o
nouă molecula de glucoza), reluând ciclul Krebs (fig. 36).

68
Fig. 36. Ciclul Krebs

69
 În cadrul ciclului Krebs se disting opt grupe, în urma cărora rezultă două molecule de
CO2 (reacţiile III şi IV) şi opt atomi de H+. Ciclul Krebs este conectat cu lanţul respirator şi,
împreună eliberează 216Kcal, din care 191 provin din lanţul respirator . Energia chimică
rezultată este stocată în ATP (38 de molecule).
În afara de oxidarea completa a radicalului acetil şi de stocarea energiei, ciclul Krebs
asigură formarea a numeroase substanţe, cum sunt: α-cetogentaratul, care poate da prin
aminare glutamat, care la rândul său este precursorul argininei, prolinei şi hidroxiprolinei;
acidul oxalacetic dă prin transformare acid aspartic care este precursorul β-alaninei, treoninei,
metioninei, lizinei; acidul succinic este precursorul nucleelor tetrapirolice care intra în
constituia citocromilor.

2.6.2.2.Ciclul glioxalatului
Studiile efectuate în special în ultimele decenii au demonstrat că numeroşi mutanţi de
bacterii şi ciuperci cresc şi se dezvoltă mult mai bine pe mediile de cultură
cărora li s-a adăugat acetat .
Căutându-se explicarea acţiunii ionului acetat, s-a constatat printre altele, că prezenţa
acestuia în mediul de cultură determină producerea de zahăr şi de proteine prin intermediul
ciclului glicoxalatului datorită izocitrazei şi malat-sintetazei, enzime care lipsesc din celulele
animale, bacteriile şi ciupercile întrerup ciclul Krebs la nivelul acizilor izocitric şi malic.
Izocitraza descompune acidul izocitric în acizii glicoxalic şi succinic, iar malat-sintetaza, în
urma condensării acidului glicoxalic cu o moleculă de acetat, dă naştere la malat, totul are loc
ca şi când două molecule de acetat au dat naştere prin convertire unei molecule de succinat,
care intervine în sinteza zaharurilor şi proteinelor ce apar în mediul de cultură.

2.6.2.3. β oxidarea acizilor graşi

Lipidele se metabolizează direct sub acţiunea lipazei în glicerol şi acizi graşi. Acizii
graşi sunt oxidaţi la nivelul mitocondriei. Schema procesului de oxidare a acizilor graşi a fost
elaborată de Lynen şi este reprezentată de o elice în care fiecare spiră corespunde formării
unui acetil-Co-A.
În prezenţa ATP, intervin sisteme enzimatice în frunte cu HS-Co-A, producând treptat
pierderea unui acid gras cu doi atomi de carbon mai puţin .
Molecula de CH3-COOH rezultată nu rămâne liberă, ca atare, ci se combină imediat cu
SH-Co-A, dând acetil- Co-A care intra în combinaţie cu acidul oxalacetic, cu formare de acid
citric care trece în ciclul Krebs unde va fi complet degradat în apă şi CO2. În felul acesta,
întregul lanţ lung al acidului gras este transformat integral în CO2 şi H2O şi energie .
Formarea fiecărei molecule de acetil-Co-A reprezentată în urma acestei β oxidări este însoţită
de reducerea unei molecule de NAD la NADH2 şi a unei molecule de FAD la FADH2.
De asemenea, cercetările au arătat ca acizii aminati rezultaţi din hidroliza proteidelor
în urma unui proces de dezaminare oxidativă dau naştere la acizi cetonici, care pot intra în
diverse etape ale ciclului Krebs atât în mitocondria animală, cât şi în cea vegetală (fig. 37).

70
 Fig. 37. β- oxidarea acizilor graşi

2.6.2.4. Sistemul transportor de electroni (lanţul respirator)

Lanţul respirator denumit şi lanţul citocromic sau sistemul transportor de electroni,
reprezintă ansamblul de reacţii care au loc în mitocondrie, prin care electronii pierduţi de
substanţe (glucide, lipide sau protide), în timpul dehidrogenarii lor în matrice sunt transportaţi
până la oxigen acţionându-l; oxigenul astfel activat devine acceptor de protoni (H+), dând
naştere la H2O.
Studiile biochimice ,,în situ” şi ,,în vitro” au demonstrat că acceptorii de H+ eliberat de
substrat sunt NAD, NADP, FAD, iar cei de electroni sunt citocromii, derivaţi ai hematinei, în
care fierul poate exista fie sub forma de Fe2+, fie Fe3+.
Din mitocondrii au fost izolaţi mai mulţi citocromi care aparţin claselor a, b, c; de
asemenea s-a mai precizat că citocromii mitocondriali a şi b sunt insolubili în apa şi sunt
activi numai asociaţi cu fosfolipide, iar citocromul c este foarte solubil în apa. Transportul
protonilor (H+) şi electronilor ⎯e până la O2 se face prin intermediul nucleotidelor şi
citocromului.
Unele din aceste nucleotide, ca FAD sunt în realitate coenzimele hidrogenazelor şi
anume NADH2-dehidrogenazei şi succin-dehidrogenazei. Aceste dehidrogenaze cu coenzime
flavinice, colorate în galben, sunt denumite flavo-proteine.

71
 Cercetările biochimice din ultimele decenii au dus la concluzia că în procesul de
trecere al H+ pe NAD şi NADP, care la rândul lor îl transportă pe FAD, intervine ubichinona
sau coenzima Q. Din punct de vedere structural coenzima Q este o chinona cu un lanţ lateral
poliizoprenic.
Studiile de chimie ultrastructurală şi tehnicile de fragmentare a mitocondriei, au
stabilit ca întregul lanţ respirator se afla localizat în membrana mitocondriei interne, în
oxizomi, activitatea lui fiind în funcţie de integrarea structurală a oxizomilor. Green (1964) a
reuşit să izoleze din oxizomi patru complexe enzimatice, denumite convenţional I , II, III si
IV . Două din acestea, I şi II sunt dehidrogenaze şi sunt localizate la baza oxizomului,
complexul III, localizat în regiunea mediana, catalizează reacţiile ce au loc de la coenzima Q
până la citocromul C, iar complexul IV, care se găseşte la vârful oxizomului, catalizează
reacţiile terminale ale lanţului respirator, adică transferul electronilor de la citocromul că la
O2, în vederea activării lui.

2.6.2.5. Fosforilarea oxidativă

Electronii în lungul lanţului respirator suferă o scădere de potenţial, materializată printr-
o eliberare de energie, care are loc în etape şi care serveşte pentru regenerarea moleculelor de

Fig. 38. Conceptul fosforilării oxidative

72
ATP prin fosforilarea ADP cu fosfat anorganic (Pi) existent în matricea mitocondriei (fig. 38).
Formarea ATP are loc în trei etape si anume: o prima etapa o constitue oxidarea NADH2
de câtre FAD, o a doua oxidarea citocromului b de către citocromul c şi a treia, oxidarea
citocromului a, rezultând în final trei molecule de ATP.
Ansamblul acestor reacţii de oxidare şi fosforilare a fost denumit fosforilare oxidativa.
Energia astfel stocată sub forma de ATP serveşte în majoritatea cazurilor la biosinteza unor
substanţe de mare importanţă.
Fosforilarea oxidativă, denumită şi fosforilare cuplată, are un rol deosebit de important
în reglarea numeroaselor etape ale metabolismului celular şi justificş denumirea de ,, centrală
energetică” a celulei care se dă mitocondriei. Oxidarea completă a unei molecule de glucoză
(glicoliză + ciclul Krebs) permite sinteza a 38 de molecule de ATP. Ecuaţia globală a
respiraţiei unei molecule de glucoză se poate scrie astfel:

C 6 H 12O 6 + 6O2 + 6 H2O→ 6CO2+ 12H2O + 38 ATP

2.6.2.6. Fermentaţiile
Exigenţa organismelor faţă de oxigen nu sunt identice. Astfel se disting următoarele trei
grupe:
Organismele strict aerobe, care nu pot trăi decât în prezenţa oxigenului (animalele,
plantele, unele microorganisme)
Organismele strict anaerobe, care nu pot trăi decât în absenţa oxigenului liber, care le
este nociv (numeroase microorganisme, de ex Clostridium)
Organisme aerobe facultative, care pot trăi atât în prezenţa cât şi în absenţa oxigenului
din mediu. Astfel, levurile aparţin acestei categorii dar şi unele plante superioare care sunt
capabile să reziste la asfixie, adoptând o activitate metabolică diferită de respiraţie, numită
fermentaţie.
Fermentaţia este oxidarea incompletă a unui substrat organic în absenţa oxigenului
(metabolism anaerob); acest substrat organic este transformat într-un produs rezidual organic.
Reacţiile enzimatice care transformă substratul organic sunt cele de la glicoliză
(localizate în citoplasma citoplasma celulară). Substratul este deci degradat până la acid
piruvic.
NADH2 format – neoxidat de oxigenul atmosferică din mitocondrie, va reduce acidul
piruvic, transformându-l întrun „produs rezidual” produs ultim rezidual din procesul
fermentaţiei. După natura acestui produs rezidual şi a echipamentului enzimatic al
organismului fermentativ, pot exista mai multe tipuri de fermentaţie (alcoolică, lactică, acetică
etc).
Metabolismul anaerob este mult mai puţin eficace în ceea ce priveşte producerea de
energie, decât respiraţia, deoarece fermentaţia nu utilizează în totalitate energia substratului
degradat pentru sinteza ATP, de la o moleculă de glucoză fermentată se formează doar două
molecule de ATP, în timp ce în cursul oxidării complete dintr-o moleculă de glucoză rezultă
38 molecule de ATP. Randamentul fermentaţiei este de 2%, faţă de 45% cât este pentru
respiraţie. Organismele care îşi obţin energia din fermentaţie trebuie să descompună cantităţi
considerabile de substrat; aceste organisme se numesc ,,descompunători”.

2.6.3.Comparaţie între fotosinteză şi respiraţie

Fotosinteza şi respiraţia sunt două procese antagonice dar complementare:

- din punct de vedere energetic, fotosinteza transformă energia luminoasă în energie
chimic, acumulată în legăturile carbon-hidrogen; respiraţia rupe această legătură şi
eliberează energie;
- din punct de vedere metabolic, fotosinteza construieşte materie organică prin fixarea şi
reducerea carbonului mineral, astfel că plantele cresc în greutate. Dar respiraţia

73
 degradează rezervele organice (derivaţi de carbon) prin oxidare şi greutatea plantelor
scade prin pierderea carbon mineral;
- schimburile gazoase sunt în sens invers: fotosinteza absoarbe CO2 şi apă şi degajă O2.
Oxigenul fotosintetic degajat în biosferă asigură viaţa organismelor superioare
(eucariote) care respiră acest oxigen, degajând CO2 şi apă;
- fotosinteza se manifestă numai în prezenţa luminii. Intensitatea respiraţiei este identică
atât în condiţii de obscuritate cât şi de lumină;
- mecanismele biochimice sunt antagonice: lanţurile transportorilor de electroni
funcţionează în sens opus. Lanţul fotosintetic, permite transportul electronilor de la apă
la NADH2, lanţul respirator invers, electronii sunt transportaţi de la NADH2 la oxigen,
rezultând apă.
- glucoza construită în cursul ciclului Calvin (faza de întuneric a fotosintezei) prin
carboxilare, hidrogenare şi condensare, este „tăiată” de glicoliză, dehidrogenată şi
decarboxilată de ciclul Krebs.
Respiraţia şi fotosinteza sunt procese care se opun reciproc, dar, ambele participă la
menţinerea vieţii şi creşterea organismelor vegetale sau animale. Formula generală pentru
fotosinteză este următoarea:

Energie (lumina) + 6CO2 + 6H2O →C6 H 12O6 + 6 O2

Formula generală pentru respiraţie conţine aceeaşi compuşi :

C 6H 12 O 6 + 6 O2 → 6 CO2 + 6 H 2 O + energie (ATP)

După cum se observă din formulele generale ale fotosintezei şi respiraţiei celulare,
aceste reacţii sunt exact în opoziţie una cu alta, respiraţia eliberând energia captată (de la
soare) de fotosinteză.
Cele două procese au şi etape similare. Astfel, ambele implică conversia energiei
dintr-o formă în alta. În fotosinteză, energia, (lumina) solară este convertită în energie
chimică. În respiraţie, energia chimică este convertită în ATP. În ambele procese energia
electronilor ce se deplasează de-a lungul unui lanţ este folosită pentru sinteza ATP-ului. Atât
cloroplastul cât şi mitocondria au o ultrastructură asemănătoare, ceea ce reflectă şi funcţii
asemănătoare (transformatori de energie). Lanţul transportatorilor de electroni, prezent atât în
mitocondrie cât şi în cloroplast, se datorează aranjamentului membranelor interne, care este
foarte asemănător, în aceste două organite.
Toate organismele scindează molecule organice pentru a-şi asigura „combustibilul”
necesar proceselor vitale, dar numai plantele autotrofe sunt capabile să capteze energia solară
şi să o transforme în „hrană” .
Conversia energiei este procesul de bază de care depind toate fiinţele vii.

74
 Capitolul 3
ADEZIUNEA CELULARĂ. JONCŢIUNILE CELULARE ŞI
MATRICEA EXTRACELULARĂ
În organismele pluricelulare, celulele specializate în realizarea unei anumite funcţii se
recunosc şi interacţionează specific formând ţesuturi, care prin asociere dau naştere unităţilor
funcţionale, numite organe. Interacţiunea dintre celule poate fi joncţională ( prin intermediul
unor structuri specializate numite joncţiuni celulare) sau non-jonctională ( prin intermediul
moleculelor suprafeţei celulare). Astfel, recunoaşterea şi aderarea intercelulară este posibilă
datorită moleculelor de pe suprafaţa celulară, care pot fi diferite calitativ şi cantitativ,
manifestând specificitate celulară. Suprafaţa celulară poate media trei tipuri de aderare: a)
homofilică, dacă moleculele suprafeţei celulară care interacţionează sunt identice; b)
heterofilică, dacă moleculele suprafeţei celulare sunt diferite dar complementare şi c) prin
moleculă linker, moleculă extracelulară, ce nu aparţine suprafeţei celulare. Un rol important în
stabilirea structurilor tisulare îl are matricea extracelulară, o reţea complexă de
macromolecule prezentă în spaţiile interstiţiale şi care se află într-o permanentă interrelaţie cu
celulele. Ancorarea celulelor în matricea extracelulară se realizează prin joncţiunile celulă-
matrice, regiuni specializate din membrana plasmatică.
Implicarea joncţiunilor intercelulare şi a matricei, în adeziunea celulară, variază funcţie
de tipul celular. În ţesutul epitelial, celulele sunt strâns unite între ele, iar matricea
extracelulară este slab reprezentată. Rezistenţa ţesutului epitelial la forţele la forţele mecanice
ce acţionează asupra sa este conferită de proteine fibrilare intracelulare (elemente de
citoschelet), care se aşează pe faţa internă a membranei plasmatice, unde se formează
joncţiuni specializate cu suprafaţa altor celule sau cu matricea extracelulară. În ţesutul
conjunctiv, celulele sunt dispersate în matricea extracelulară, care ocupă cea mai mare parte a
volumului tisular. În acest caz, elementele componente ale matricei asigură stabilitatea
tisulară preluând aproape în totalitate stress-ul mecanic.

3.1. Molecule implicate în aderarea celulă-celulă

Din categoria moleculelor suprafeţei celulare implicate în aderarea celulară non-
joncţională fac parte: selectinele, domeniile imunoglobulinice şi caderinele.

3.1.1. Selectinele

Sunt proteine identificate pe suprafaţa membranară a leucocitelor, plachetelor sanguine,

celulelor endoteliale. Sunt implicate în medierea interacţiunii limfocitelor cu peretele
venulelor sau cu nodulii limfatici, fapt pentru care se numesc şi proteine transmembranare
limfocitare.
Selectinele recunosc şi leagă formaţiuni specifice de oligozaharide care aparţin altei
celulei. Ele posedă un domeniu citoplasmatic care traversează membrana plasmatică şi un
segment extracelular de lungimi variabile care se termină cu un domeniu pentru lectină.
Acest domeniu terminal leagă lectine, proteine de legare care recunosc şi leagă specific
moleculele de carbohidraţi de la suprafaţa celulei învecinate. Legarea selectinelor la
carbohidraţi este Ca2+ dependentă.
Selectinele sunt importante în răspunsul inflamator. Ele mediază legarea neutrofilelor de
peretele vasului de sânge, favorizând invazia neutrofilelor prin peretele vasului la locul
infecţiei sau leziunii. Pentru procesul invaziei neutrofilelor sunt necesare integrine (proteine -
receptori membranari de recunoaştere).

75
 3.1.2. Domenii imunoglobulinice

Unele domenii imunoglobulinice care nu aparţin structurii unui anticorp pot media
interacţiuni non-joncţionale celulă-celulă Ca2+ dependete, homo- sau heterofilică.
Interacţiunea heterofilică presupune prezenţa integrinelor.
Proteinele care conţin domenii imunoglobulinice aparţin IgSF (superfamiliei
imunoglobulinelor). Aderarea celor două celule adiacente se realizează prin suprapunerea
domeniului Ig al unei celule cu domeniul Ig al celulei vecine. Membrii numeroşi ai IgSF
mediază interacţiunea celulară în elaborarea răspunsului imun. Unul dintre aceştia, numit
VCAMs (vascular cell- adhesion molecules) – factorul de adeziune vasculară – este important
în dezvoltarea sistemului circulator la embrion şi în legarea neutrofilelor de peretele vascular
înainte de invazie. Alţi doi reprezentanţi al IgSF sunt NCAMs (neural cell- adhesion
molecules) sau factorul de adeziune neurală şi L1, ambii foarte importanţi în dezvoltarea
sistemului nervos la embrion. NCAMs mediază interacţiunea celulă-celulă, iar L1 mediază
alungirea conului de creştere în timpul dezvoltării neuronilor.
Un domeniu Ig conţine proteine de suprafaţă ale unei celule care pot interacţiona cu o
moleculă de integrină ale altei celule (de exemplu, aderarea neutrofilului la peretele vascular,
interacţiune mediată de NCAMs celulelor endoteliale şi integrinele neutrofilelor).

3.1.3. Caderinele

Sunt reprezentate de o largă familie de glicoproteine de adeziune, Ca2+ dependente. Ele

mediază interacţiuni celulare homotipice non-joncţionale şi joncţionale şi transmit semnale
din matrixul extracelular în citoplasmă.
Caderinele au fost identificate în diferite părţi ale corpului (N-caderina în sistemul
nervos, P- caderina în placentă, E- caderina în ţesutul epitelial). Caracteristic acestui tip de
glicoproteine este faptul că ele leagă intre ele celule de acelaşi tip şi, deci şi caderine de
acelaşi tip.
Caderinele sunt alcătuite dintr-un segment lung extracelular ce conţine 5 domenii de
legare, un segment transmembranar şi un mic domeniu citoplasmatic. Domeniul citoplasmatic
interacţionează cu proteine din citosol care fixează caderine ce aparţin citoscheletului şi
transmit informaţii în citoplasmă. Caderinele de pe aceeaşi suprafaţă celulară se asociază
formând dimeri.
Segmentele extracelulare ce aparţin la două celule adiacente pot interacţiona prin
juxtapoziţia porţiunilor terminale sau a segmentului în totalitate. Ca2+ leagă segmentele în
tandem menţinându-le într-o stare rigidă, stare necesară legării unei caderine de caderina
celulei alăturate.
Caderinele sunt molecule implicate în recunoaşterea celulelor de acelaşi tip, aderarea şi
menţinerea lor într-un ţesut, respectiv alcătuirea unui ţesut la embrion şi menţinerea
integrităţii unui ţesut la adult. În cancer, se produc modificări conformaţionale ale caderinelor
care duc la scăderea adezivităţii celulare, eliberarea celulelor oncogene din ţesut şi migrarea
lor, cu posibilitatea iniţierii metastazelor.

3.2. Joncţiunea celulară

Joncţiunile celulare (joncţiunile intercelulare şi joncţiunile celulă-matrice extracelulară),
structuri specializate şi stabile, permit sau împiedică schimburile intercelulare şi mediază
contactele celulă-celulă şi celulă-matrice. Din punct de vedere funcţional se deosebesc trei
categorii principale de joncţiuni:
ƒ Joncţiunile de ocluzie sudează membranele plasmatice ale celulelor epiteliale, blocând
fluxul de molecule şi ioni dintre lumenul organelor cavitare şi spaţiile interstiţiale;

76
 ƒ Joncţiunile de ancorare asigură legarea strânsă a celulelor unele de altele şi a acestora
cu matricea extracelulară;
ƒ Joncţiunile de comunicare sunt implicate în cuplarea electrică şi metabolică a celulelor
ce îndeplinesc aceeaşi funcţie.
ƒ Joncţiuni sinaptice conectează partea terminală a unui axon neuronal ( butonul
terminal) cu celula – ţintă.

3.2.1. Joncţiunile de ocluzie

Joncţiunile de ocluzie („zonulae occludens” – numite şi joncţiuni strânse sau

impermeabile (tight jonction) sunt reprezentate la polul apical al celulelor epiteliale ce
delimitează lumenul unor cavităţi.
Observarea la microscopul electronic a unei secţiuni prin joncţiunile de ocluzie oferă
imaginea a două membrane plasmatice adiacente care din loc în loc se găsesc în contact
direct. Aceste puncte de „sudură”, separate de mici spaţii interstiţiale, sunt rezultatul
anastomozei proteinelor joncţionale prezente în membranele plasmatice ale celulelor
învecinate. Deşi proteinele nu au fost încă izolate, substratul molecular proteic al joncţiunilor
de ocluzie este sugerat de acţiunea denaturantă pe care proteazele o au asupra acestor
structuri. Proteinele joncţionale sunt ordonat depuse în mai multe şiruri ce înconjoară celula în
regiunea apicală. Joncţiunile de ocluzie se formează în urma stabilirii contactului între şirurile
de proteine aparţinând celulelor alăturate, oferind, în ansamblu, imaginea unei centuri situate
imediat sub suprafaţa cu microvili a
celulei epiteliale (fig.39)

Fig. 39 – Joncţiunile strânse

sunt formate din mai multe şiruri de
perechi de proteine joncţionale
situate în regiunea apicală a
membranei plasmatice.

Aceste structuri joncţionale

împiedică deplasarea moleculelor şi a
ionilor din lumenul organelor cavitare
în spaţiile interstiţiale. Capacitatea de
ocluzie variază funcţie de tipul de ţesut
epitelial. În plus, se sugerează existenţa
unei relaţii logaritmice între numărul
şirurilor de proteine joncţionale şi
gradul de impermeabilitate al
joncţiunilor pentru diferite specii ionice.
În celulele epiteliale sunt pompate
selectiv substanţe nutritive care, în urma unui transport transcelular, difuzează în ţesutul
conjunctiv de unde sunt preluate, în circulaţia sangvină. Acest flux unidirecţional al
moleculelor, din lumen prin celulele epiteliale în sânge, este condiţionat de distribuirea
asimetrică a componentelor membranare, care determină apariţia unor domenii distincte –
apical şi laterobazal – în membrana plasmatică a celulelor epiteliale. Un exemplu concret îl
constituie absorbţia glucozei din lumenul intestinal, proces care implică două tipuri de
proteine cu o strictă localizare membranară. Proteinele din domeniul apical (faţa luminală a
membranei), transportă activ glucoza pompând-o din lumen în celulele epiteliale. Eliberarea
glucozei în spaţiile interstiţiale se realizează prin difuziune mediată de un set de permeaze,
prezent în domeniul laterobazal. Prezenţa joncţiunilor de ocluzie la polul apical al celulelor
face imposibilă retrodifuziunea glucozei din interstiţii în lumenul intestinal. (fig. 40).

77
 Fig. 40 – Transportul glucozei în
celulele epiteliale ce delimitează lumenul
intestinal. Joncţiunile strânse sunt
implicate în menţinerea priorităţii
celulelor epiteliale împiedicând difuzia
proteinelor transportoare în planul
membranei plasmatice

Menţinerea polarităţii celulelor

epiteliale constituie a doua funcţie a
joncţiunilor de ocluzie. Acestea acţionează
în sensul împiedicării difuziei prin dublul
strat lipidic al moleculelor ce compun
domeniile membranare. Un argument în
favoarea acestei afirmaţii este pierderea
polarităţii celulare, datorită migrării
lipidelor din stratul exoplasmatic şi al
proteinelor în membrana plasmatică, ca
urmare a scăderii concentraţiei Ca2+ în
mediul extracelular, element esenţial în
menţinerea integrităţii joncţiunilor de ocluzie.
Atât prin împiedicarea schimburilor lumen-interstiţiu, cât şi prin menţinerea stabilităţii
domeniilor membranare, joncţiunile de ocluzie permit ţesutului epitelial să se comporte ca o
barieră cu o permeabilitate selectivă.

3.2.2 Joncţiunile de ancorare

Joncţiunile de ancorare asigură contactul celulă-celulă şi celulă-matrice extracelulă.

Acest tip de joncţiune antrenează elementele de citoschelet creând structuri de rezistenţă în
celulele supuse stress-ului mecanic (epitelii, miocard, miometru etc). Din punct de vedere
structural, joncţiunile de ancorare sunt alcătuite din două clase de proteine: proteine de ataşare
intracelulară şi glicoproteine transmembranare de legare. Proteinele de ataşare intracelulară
leagă elementele de citoschelet de complexul joncţional, în timp ce, glicoproteinele
transmembranare interacţionează prin domeniile lor intracelulare cu proteinele de ataşare, iar
prin cele extracelulare cu glicoproteine transmembranare din celulele adiacente.
Ţinând cont de tipul elementelor de citoschelet asociate - filamente de actină sau
filamente intermediare – joncţiunile de ancorare se clasifică în joncţiuni de adeziune şi
structuri desmozomale.
Atât joncţiunile de adeziune, cât şi structurile desmozomale se subdivid în joncţiuni de
adeziune intercelulare şi joncţiuni de adeziune celulă-matrice şi respectiv, desmozomi şi
hemidesmozomi, funcţie de tipul de contact pe care îl mediază.
Toate cele patru tipuri de joncţiuni de ancorare coexistă în celulele ţesutului epitelial.

3.2.2.1 Joncţiunile de adeziune intercelulară

În celulele epiteliale, joncţiunile de adeziune intercelulară sunt localizate la polul apical,
imediat sub joncţiunile de ocluzie. Aceste structuri constituie situsuri de ancorare ale
filamentelor de actină dispuse în mănunchiuri. Orientate paralel cu membrana plasmatică
mănunchiurile de filamente de actină înconjoară polul apical al celulei formând o bandă de
adeziune continuă („zonulae adherens”). Benzile de adeziune aparţinând celulelor învecinate
se găsesc în opoziţie directă, contactul acestora fiind mediat de structurile joncţionale de
adeziune intercelulară. Datorită aspectului lor, aceste joncţiuni au fost numite desmozomi în

78
bandă (belt desmosomes), denumire eronată, deoarece din punct de vedere chimic cele două
structuri joncţionale sunt deosebite.
Filamentele de actină interacţionează cu complexul joncţional printr-un set de proteine
de ataşare dintre care cel mai bine caracterizate sunt vinculina şi α-actinina. Proteinele de
ataşare se leagă de domeniul intracelular al unei glicoproteine transmembranare, ancorând
astfel filamentele de actină în embrana plasmatică. Glicoproteina (uvomorulina) este un
membru al familiei moleculelor de adeziune intracelulară calciu dependente, numite
caderine. Domeniul extracelular al glicoproteinei interacţionează cu domeniile extracelulare
ale glicoproteinelor din membrana plasmatică a celulelor învecinate. Ca rezultat al acestor
interacţii, ce au la bază un mecanism Ca2+ dependent, membranele plasmatice adiacente sunt
menţinute la o distanţă de 15-20 nm una de cealălantă (fig. 41).
Conectarea reţelelor transcelulare de filamente de actină asigură adeziunea celulelor
epiteliale conferind totodată rigiditate structurii tisulare.

Fig. 41 – Distribuţia
proteinelor de legare a
actinei şi uvomorulinei la
nivelul joncţiunilor de
adeziune intercelulară din
celulele epiteliale

3.2.2.2 Joncţiunile de
adeziune celulă-matrice
extracelulară
Joncţiunile de adeziune
celulă-matrice asigură
contactul dintre celulă şi
matricea extracelulară prin
conectarea filamentelor de
actină, ce alcătuiesc
citoscheletul, cu elemente
componente ale matricei.
Aderarea celulelor la matrice implică regiuni specializate ale membranei plasmatice,
numite contacte focale sau plăci de adeziune. La nivelul plăcilor de adeziune se stabileşte
contactul dintre mănunchiurile de filamente de actină şi un element al matricei, prin
intermediul unei glicoproteine transmembranare, ce aparţine familiei integrinelor. De cele
mai multe ori, elementul matriceal este fibronectina, iar glicoproteina transmembranară este
receptorul pentru fibrobnectină. Legarea filamentelor de actină de domeniul intracelular al
receptorului este indirectă, fiind mediată de cel puţin pentru tipuri de proteine de ataşare: o
proteină ce leagă capul filamentelor de actină („actin-filament-capping protein”), α-actinina,
vinculina şi talina.

3.2.2.3 Desmozomii
Dependent (fig. 42). desmozomii (desmozomii în pată) constituie regiuni de cimentare
intercelulară. Aceste structuri joncţionale realizează contactul dintre filamentele intermediare
ale celulelor adiacente, în urma cărora se formează o reţea transtisulară continuă. Tipul
filamentelor intermediare antrenate de desmozomii în adeziunea intercelulară diferă funcţie de
tipul celular. În celulele epiteliale, structurile desmozomale le sunt asociate filamentele de
cheratină, în celulele musculare ale inimii, filamentele de desmină, în celulele mezenchimale,
filamentele de vimentină etc.
Vizualizarea la microscopul electronic a desmozomilor oferă imaginea a două discuri
dense (15-20 nm grosime), situate pe faţa citoplasmatică a membranelor celulelor adiacente,

79
numite plăci citoplasmatice. Placa citoplasmatică este alcătuită dintr-un complex de proteine
de ataşare – desmoplachine – ce leagă tangenţial filamentele intermediare şi o glicoproteină
transmembranară – desmoglina-care interacţionează prin domeniul său intracelular cu
proteine de ataşare. Cele două plăci citoplasmatice din membranele adiacente sunt conectate
ca urmare a interacţiunii domeniilor extracelulare ale desmoglinelor printr-un mecanism Ca2+

Fig. 42 – Structuri desmozomale în

ţesutul epitelial.

(a) Desmozomul este alcătuit din

două plăci citoplasmatice situate pe
feţele citoplasmatice ale plasmalemelor
celor două celule adiacente. Filamentele
intermediare se ataşează tangenţial de
plăcile citoplasmatice. Glicoproteinele
transmembranare interacţionează prin
domeniile lor extracelulare, consolidând
structura desmozomală.
(b) Hemidesmozomul asigură
ancorarea celulelor în matricea
extracelulară. Este alcătuit dintr-o
singură placă citoplasmaticăde care
filamentele intermediare sunt legate prin capete.
În boala Penfigus se sintetizează anticorpi împotriva propriilor glicoproteine
transmembranare. Legarea anticorpilor de desmoglină afectează structura desmozomilor
responsabili de aderarea intercelulară a celulelor ţesutului epitelial din piele. Devenit lax,
ţesutul epitelial este incapabil de a mai funcţiona ca barieră. Moleculele aflate în soluţie
difuzează printre celulele epiteliale spre exterior, fapt ce conferă pielii un aspect vezicular. De
vreme ce anticorpii afectează doar desmozomii din piele se presupune existenţa unor
deosebiri biochimice între aceştia şi cei prezenţi în alte ţesuturi.
Studiul desmozomilor a pus în evidenţă implicaţiile funcţionale pe care aceste structuri
le au în alte ţesuturi decât cel epitelial. Astfel, în celulele ce alcătuiesc ţesutul muscular
cardiac, filamentele de desmină asociate desmozomilor constituie o cale de transmitere a
forţei de contracţie, iar în muşchii netezi desmozomii sunt consideraţi echivalenţi funcţionali
ai discurilor „Z” din muşchii scheletici.

3.2.2.4 Hemidesmozomii
Hemidesmozomii, similari desmozomilor din punct de vedere morfologic, asigură
contactul dintre regiunea bazală a membranei celulelor epiteliale şi o structură specializată a
matricei extracelulare, numită lamina bazală.
Placa citoplasmatică constituie situsul de ancorare a filamentelor de cheratină ce intră în
alcătuirea citoscheletului celulei epiteliale. Legarea plăcii citoplasmatice de lamina bazală este
mediată de o glicoproteină transmembranară.
În ţesuturile epiteliale, unde de regulă se semnalează prezenţa ambelor structuri
desmozomale (desmozomi în pată şi hemidesmozomi), acestea sunt implicate atât în
asigurarea adeziunii celulare, cât şi în distribuirea forţelor mecanice în întregul ţesut epitelial
şi ţesutul conjunctiv adiacent.

3.2.3 Joncţiunile de comunicare

Joncţiunile de comunicare (permeabile, „gap junction”) au o largă răspândire, regăsindu-

se în toate ţesuturile organismelor animale. În regiunea joncţiunilor de comunicare,

80
membranele plasmatice adiacente sunt separate de un spaţiu îngust (2-4 nm grosime) întrerupt
din loc în loc de particule cilindrice. Aceste particule sunt străbătute de un canal ce face
posibil contactul dintre citoplasmele celulelor cuplate prin joncţiunile de comunicare. Canalul,
cu un diametru de 1,5-2nm, permite trecerea liberă, dintr-o celulă în alta, a moleculelor cu
greutăţi moleculare sub 1500 -2000 Dar (glucide, aminoacizi, nucleotide, hormoni etc.)şi a
diferitelor specii ionice.
Prin stabilirea acestui tip de comunicare intercelulară, joncţiunile permeabile constituie
elementul-cheie al cuplării electrice şi metabolice celulare, proces, ce stă la baza coordonării
activităţii celulelor într-un ţesut. Cuplarea electrică mediată de joncţiunile de comunicare
asigură:
ƒ sincronizarea contracţiilor celulelor ce alcătuiesc ţesutul muscular;
ƒ peristaltismul intestinal;
ƒ propagarea potenţialului de acţiune de la un neuron la altul.
Prin cuplarea metabolică, celulele sunt capabile să transfere diferite molecule celulelor
învecinate incapabile să le sintetizeze. De asemenea, prin canalele joncţiunilor de comunicare
pot trece mediatori intracelulari (ioni de Ca, AMP-ciclicetc.), implicaţi în reglarea
numeroaselor procese metabolice celulare. Deplasarea mediatorilor intracelulari de la o celulă
la alta prin joncţiunile de comunicare, explică activarea diferiţilor stimuli hormonali (vezi
subcap.1.3.2).
Joncţiunile de comunicare au un rol important în procesul de embriogeneză. Se
presupune că primele etape ce urmează fecundării majoritatea celulelor sunt cuplate electric.
Pe parcursul proceselor de diferenţiere, grupuri de celule cu o entitate distinctă se decuplează
de restul celulelor urmând o cale comună de dezvoltare. Apariţia defectelor în dezvoltarea
embrionului ca urmare a injectării, în etapele timpurii ale embriogenezei, a unor inhibitori ai
joncţiunilor de comunicare sprijină această ipoteză.

3.2.3.1 Structura joncţiunilor de comunicare

În alcătuirea joncţiunilor de comunicare intră un singur tip de proteină transmembra-
nară, numită conexină (280000-320000Da). Lanţul polipeptidic (280 aminoacizi) străbate de
patru ori membrana plasmatică. Cele patru domenii membranare prezintă o conformaţie α-
helix. Al treilea domeniu α-helix al conexinei are un caracter amfipatic. Prin asocierea a şase
molecule de conexină ia naştere o structură conexon. În interiorul conexonului, domeniile α-
helix amfipatice, ale fiecărei proteine componente delimitează un canal ce străbate membrana
plasmatică (fig.43).

Fig. 43 – a) Joncţiunile de
comunicare. Conexonii, complexe
proteice prezente în membranele
plasmatice sunt poziţionaţi cap la cap,
dând naştere unor canale de
comunicare intercelulară. b)
Poziţionarea în membrana plasmatică a
conexinei-subunitate a conexonului.

În regiunea membranară implicată în

joncţiunile de comunicare, sute de conexoni se aglomerează formând cluster-i (mănunchiuri)
Conexonii din membranele celulelor învecinate se aşează cap la cap formând un canal de
comunicare continuu între citoplasmele celor celule.

3.2.3.2 Reglarea permeabilităţii joncţiunilor de comunicare

Joncţiunile de comunicare sunt structuri cu caracter dinamic, permeabilitatea lor fiind
dependentă de diverşi factori:

81
 ƒ Scăderea pH-ului citosolic;
ƒ creşterea concentraţiei Ca2+ liber în citosol;
ƒ valoarea potenţialului de membrană la nivelul joncţiunilor;
ƒ semnale chimice extracelulare etc.
Modificarea permeabilităţii are la bază capacitatea joncţiunilor de comunicare de a
adoptă două conformaţii distincte: închisă şi deschisă (fig. 44)

Fig. 44 – Schema modificării

conformaţionale a conexonilor

Existenţa unui mecanism de

reglare a permeabilităţii structurilor
joncţionale dependentă de concentraţia
de Ca2+din citosol are o importanţă
vitală pentru funcţionarea normală a celulelor asociate din ţesuturi. Alterarea gravă a structurii
celulare (ruperea membranei plasmatice, moarte celulară etc.) este însoţită de pierderea unor
cantităţii însemnate de metaboliţi celulari, în paralel cu creşterea influxului de ioni de Na şi
Ca. În acest caz, concentraţia mare a ionilor de Ca impune închiderea joncţiunilor de
comunicare dintre celulele deteriorate şi cele şi cele normale. Prin această decuplare, sunt
izolate regiunile tisulare afectate, ceea ce face posibilă funcţionarea normală a celulelor în
restul ţesutului.
Creştere permeabilităţii joncţiunilor de comunicare, în prezenţa unui semnal chimic
extracelular, stă la baza activităţii celulare în cascadă. Un exemplu concret îl constituie
răspunsul celular la acţiunea hormonului glucagon, ce comandă oprirea sintezei de glicogen în
celulele hepatice şi eliberarea glucozei în sânge. În celulele hepatice stimulate de glucagon,
are loc creşterea concentraţiei de AMP-c, care activează protein kinazele AMP-c dependente.
Ele fosforilează atât enzimele, cât şi conexina din structura joncţiunilor de comunicare.
Fosforilarea conexinei impune adoptarea conformaţiei deschisă de către joncţiuni, ceea ce
permite trecerea AMP-c din celula activată în celulele învecinate. Activarea acestora nu
necesită contactul direct cu hormonul, transmiterea semnalului realizându-se prin AMP-c.

3.2.4. Joncţiunile sinaptice

Sunt structuri specializate de legătură între neuroni. Prin joncţiunea sinaptică, un axon în
creştere se ataşează la celula-ţintă Acest tip de joncţiune este mediat de protocaderine
(glicoproteine ce aparţin familiei caderinelor; conţin 6 domenii extracelulare de legare în
tandem). Există mai mult de 50 de gene ce controlează sinteza diferitelor protocaderine.
Numărul mare de protocaderine asociate în diferite combinaţii dau specificitatea sinaptică.
Rolul protocaderinelor este acela de a ţine la distanţa optimă cele două componenete
membranare ale sinapsei – membrana presinaptică şi cea postsinaptică, pentru a facilita
transmiterea sinaptică.

3. 3. Matricea extracelulară

Matricea extracelulară reprezintă o reţea complexă de carbohidraţi şi proteine ce ocupă

spaţiile interstiţiale. Considerată un suport inert ce oferă doar stabilitate fizică ţesuturilor,
matricea extracelulară se relevă, azi, ca o structură dinamică ce joacă un rol esenţial în
dezvoltarea, migrarea, proliferarea, forma şi funcţiile metabolice ale celulelor cu care se află
într-un contact permanent.
Arhitectura, elementele componente, cât şi rolul matricei extracelulare diferă funcţie de
tipul tisular. La interfaţa dintre ţesutul epitelial şi ţesutul conjunctiv subadiacent, se află o
structură specializată a matricei extracelulare, numită lamină bazală, care mediază contactul

82
dintre cele două ţesuturi. În glomerulii renali, lamina bazală se comportă ca un filtru
permiţând trecerea apei, ionilor şi a moleculelor mici din sânge în spaţiul urinar. În ţesutul
conjunctiv lax, pe care se sprijină ţesutul epitelial şi diferitele glande. În ţesutul conjunctiv ce
înconjoară capilarele sangvine, reţeaua intricată de macromolecule din spaţiile interstiţiale
permite difuzia liberă a nutrienţilor şi a oxigenului din sânge în celulele ţesuturilor periferice.
În ţesutul conjunctiv dens, prezent în cartilaje, tendoane şi oase, matricea extracelulară este
responsabilă de elasticitatea şi rezistenţa mecanică ale acestor structuri.

3.3.1 Componentele matricei extracelulare

Macromoleculele ce alcătuiesc matricea extracelulară sunt secretate de către celulele ce

se găsesc dispersate în matrice şi care aparţin clasei fibroblastelor. În matricea extracelulară
sunt prezente polizaharide de tipul glicozaminoglicanilor (GAG) care, de regulă, sunt legate
covalent de moleculele proteice, formând proteoglicani.
Proteinele fibrilare constituie cea de-a doua componentă a matricei. Se disting două
tipuri de proteine fibrilare: proteine structurale (colagenul şi elastina) şi proteine de adeziune
(fibronectina şi laminina). Proteinele fibrilare, dispuse în reţea, sunt responsabile de
organizarea matricei, conferindu-i totodată rezistenţă mecanică. Această reţea proteică este
înglobată în gelul hidrat de polizaharide.
Faza apoasă a gelului permite difuzia metaboliţilor, hormonilor etc. în spaţiul dintre
celule şi în capilarele sangvine.

3.3.1.1 Glicozaminoglicanii
Glicozaminoglicanii reprezintă lanţuri poliglucidice lineare a căror unitate structurală
este un diglucid. În mod obligatoriu, unul din componentele diglucidului este un amino-glucid
de tipul N-acetilglucozaminei, al doilea rest glucidic este, de cele mai multe ori, acidul uronic.
Aminoglucidul din unitatea diglucidică poartă grupări sulfat. Atât grupările sulfat, cât şi
grupările carboxil ale acidului uronic conferă glicozaminoglicanilor încărcare electrică
negativă. Ca rezultat al acţiunii forţelor de electrostatică, moleculele leagă diferiţi cationi (în
special Na+).
Specii ionice osmotice active, cationii cresc gradul de hidratare al matricei. Aceasta
determină creşterea turgescenţei matricei extracelulare, factor ce conferă structurii rezistenţă
la forţele de compresie.
Lanţurile poliglucidice hidrofile, adoptă o conformaţie de tip „random coil” („încolăcire
aleatorie”). Deşi glicozaminoglicanii reprezintă 10% din masa proteinelor fibrilare, datorită
conformaţiei adoptate, aceste molecule ocupă cea mai mare parte a spaţiului interstiţial.
Funcţie de tipul de reziduuri glucidice, a legăturilor ce se stabilesc între acestea, a
numărului şi a localizării grupărilor sulfat, se disting patru clase de glicozaminoglicani:
1. acidul hialuronic;
2. condroitin sulfat şi dermatan sulfat;
3. heparan sulfat şi heparină;
4. cheratan sulfat.
Cu excepţia acidului hialuronic, toate celelalte clase ale glicozaminoglicanilor prezintă
caracteristici comune:
ƒ conţin grupări sulfat legate de reziduuri glucidice;
ƒ conţin unităţi diglucidice diferite dispuse într-o secvenţă complexă.
ƒ sunt molecule scurte (mai puţin de 300 reziduuri glucidice)
ƒ formează proteoglicani.
Atât lanţul poliglucidic lung (câteva sute de reziduuri glucidice), cât şi unităţile
diglucidice nesulfatate, ce se repetă regulat, definesc acidul hialuronic drept un reprezentant
atipic al glicozaminoglicanilor.

83
 Structura simplă a acestei molecule, prezenţa şi implicarea sa în fazele timpurii ale
embriogenezei sugerează faptul că acidul hialuronic este primul reprezentant al
glicozaminoglicanilor, din el derivând celelalte clase.
Moleculele de acid hialuronic se leagă de suprafaţa celulelor care migrează,acoperindu-
le ca o „haina”. Acest fapt, împiedică adeziunea intracelulară, făcând posibilă deplasarea
liberă a celulelor şi favorizând proliferarea lor. Prin acest mecanism, acidul hialuronic joacă
un rol important în migrarea celulelor pe parcursul morfogenezei şi al reparării structurilor
tisulare.

3. 3.1.2 Proteoglicanii
Proteoglicanii sunt reprezentaţi în toate ţesuturile conjunctive şi matricele extracelulare.
Aceste molecule conţin un miez proteic (core) în care sunt ancorate lanţuri de
glicozaminoglicani. Structuri heterogene,
proteoglicanii diferă prin greutatea moleculară,
componenta proteică, numărul şi tipul lanţurilor de
glicozaminoglicani, aranjarea grupărilor hidroxil,
sulfat şi carboxil în lanţurile poliglucidice.
Componenta proteică a proteoglicanilor
este sintetizată la nivelul ribozomilor ataşaţi de RE
rugos. Concomitent cu procesul de translaţie
proteică are loc translocarea proteinei în aparatul
Golgi unde este asamblată în proteoglicani. În
prima etapă a sintezei proteglicanilor, o secvenţă
tricglucidică se leagă covalent de un rest de serină
din molecula proteică (fig. 45).

Fig. 45 - Structura proteoglicanilor.

Glicozaminoglicanii se leagă prin
intermediul unei secvenţe triglucidice de un
rest de Ser prezent în structura
componentei proteice a proteoglicanilor.
Restul de Ser este frecvent localizat în
interiorul unei secvenţe specifice de
aminoacizi: Asp(Glu)-Asp(Gky)-X-Ser-Gly-
X-Gly, unde X poate fi oricare aminoacid.

La această secvenţă ce serveşte drept „primer” se leagă unul câte unul reziduurile
glucidice printr-o reacţie catalizată de glicozil-transferaza. Simultan cu elongarea lanţurilor
poliglucidice are loc în aparatul Golgi procesarea acestora, reacţii de sulfatare şi epimerizare.
Eliminaţi în spaţiul interstiţial, proteoglicanii formează geluri hidratate, cu densităţi
diferite şi pori de mărime variabilă, ce reglează traficul molecular şi deplasarea celulelor
funcţie de mărimea sau/şi sarcina lor electrică. Structura heterogenă a proteoglicanilor
sugerează faptul că aceasta nu constituie unica lor funcţie. Cercetări în acest sens au pus în
evidenţă capacitatea proteoglicanilor de a lega molecule semnal (ex. factorul de creştere al
fibroblaştilor – FGF). Organizarea acestor molecule în matricea extracelulară este încă un
subiect controversat. În cartilaje, proteoglicanii formează agregate ce pot atinge o lungime de
4µm şi o masă moleculară de aproximativ 2 x 108 Da. Componenta centrală a acestor agregate
o constituie acidul hialuronic. Miezul proteic al proteoglicanilor, de care sunt ataşate multiple
lanţuri condroitin sulfat şi cheratan sulfat se leagă, necovalent de acidul hialuronic. Lanţurile
sunt stabilizate de proteine de legare (fig. 46).

84
 Fig. 46 – Proteoglicanii
din cartilagii conţin şi acid
hialuronic legat necovalent,
prin intermediul unor
proteine liker de miezul
proteic.

Pe o singură moleculă
de acid hialuronic se pot lega
o sută de monomeri de
proteoglicani. Acest tip de
organizare a proteoglicanilor
conferă elasticitate
cartilajelor.
Proteoglicanii sunt
prezenţi şi la nivelul
membranelor plasmatice ale
multor tipuri celulare. De
miezul integrat în membrana
plasmatică şi care proemină în
spaţiul extracelular este ataşat
un număr mic de lanţuri de
glicozaminoglicani (fig. 47).

Fig. 47 – a) Proteoglicani
prezenţi la nivel la nivelul
membranelor plasmatice.
Miezul proteic de care sunt
ataşate patru lanţuri de
heparan sulfat şi două de
condroitin sulfat
traversează integral
membrana plasmatică; b)
Legarea lanţurilor de
condroitin sulfat la miezul
proteic al proteoglicanilor
din membrană.

În acest caz
proteoglicanii sunt implicaţi
în legarea celulelor de
matricea extracelulară şi în
organizarea acromoleculelor
ce compun matricea.

85
 3.3.1.3 Colagenul
Colagenul reprezintă o familie de proteine fibrilare insolubile, sintetizate în fibroblaste
şi reprezentate în toate organismele animale la nivelul matricei extracelulare şi a ţesutului
conjunctiv.
Este principala componentă a matricei extracelulare. Se cunosc poate 12 tipuri de
colagen. Dintre acestea tipurile I, II, şi III întâlnite în special în ţesutul conjunctiv, au
capacitate de autoasamblare, formând polimeri ce poartă numele de fibrile de colagen. Tipul
IV constituie comportamentul principal al laminei bazale, unde formează o reţea
bidimensională.
a. Structura moleculelor de colagen
Unitatea structurală fundamentală a colagenului este o moleculă proteică cu o lungime
de 300nm şi un diametru de 1,5 nm, alcătuită din trei subunităţi: două lanţuri α1 şi un lanţ α2.
Celelalte trei tipuri polipeptidice, ce conţin fiecare 1050 aminoacizi, se înfăşoară unul în jurul
celorlalte, de la stânga spre dreapta, formând o structură de tipul triplu helix.
Fiecare rotaţie completă (tur) a helixuluide faptul că conţine trei aminoacizi (fig. 48)

Fig. 48 - a) Modelul lanţului

polipeptidic alfa din molecula de
colagen. Gly ocupă a treia poziţie în
secvenţa repetitivă: Gly-X-Y, unde X
şi Y reprezintă oricare alt aminoacid.
b) Modelul moleculei de colagen. Cele
trei lanţuri alfa formează un triplu-
helix.

Repetiţia glicinei (Gly) la fiecare a

treia poziţie, este justificată de faptul că
aceasta este singurul aminoacid suficient
de mic pentru a ocupa spaţiul din
interiorul triplu-helixului. Molecula de
colagen este bogată în prolină, lizină,
aminoacizi ce apar de cele mai multe ori
sub formă hidroxilată. Grupările hidroxil
ale hidroxiprolinei participă la formarea
legăturilor de hidrogen ce stabilizează
triplu-helixul.
În boala numită scorbut, datorat
deficienţei de vitamina C, este inhibată
reacţia de hidroxilare a prolinei, ceea ce
împiedică organizarea lanţurilor
polipeptidice în triplu-helix.
Acestea sunt rapid degradate sub
acţiunea unei enzime, numită
colagenază.
În consecinţă, matricea extracelulară şi vasele sangvine devin extrem de fragile, iar
dinţii se desprind din alveolele dentare.
Grupările hidroxil ale hidroxilizinei sunt implicate într-o reacţie de glicozilare.
Glicozilarea colagenului conferă acestei molecule capacitatea de a se autoasambla în spaţiul
extracelular.

86
 b. Sinteza colagenului
Prezenţa secvenţei repetitive – Gly-X-Y (unde X,Y reprezintă diferiţi aminoacizi cu
excepţia glicinei)în structura colagenului, reflectă organizarea genelor ce îl codifică, sugerând
faptul că evoluţia acestor gene are la bază fenomenul de duplicare genică.
Gena ce codifică lanţul α1 conţine 41 de exoni. Cea mai mare parte a exonilor este
alcătuită din 54 perechi de baze (pb) sau multipli de doi sau trei ai acestui număr, sintetizând
1,2 sau 3 unităţi primordiale. O unitate primordială conţine 6 secvenţe repetitive Gly-X-Y. Un
număr mic de exoni din structura genei au pierdut, pe parcursul evoluţiei 9pb, unităţile
primordiale codificate de către aceştia fiind mai scurte cu o secvenţă Gly-X-Y.
Locul de sinteză al lanţurilor polipeptidice ce formează colagenul îl constituie ribozomii
ataşaţi de RE rugos. Ca rezultat al translaţiei la nivel ribozomal sunt sintetizate lanţurile pro-α.
Acestea sunt introduse în lumenul RE rugos, datorită prezenţei în structura lor a secvenţei
semnal („signal peptide”).
În regiunile carboxil- şi amino- terminale lanţurile pro-α conţin alte două secvenţe,
numite propeptide. Aceste două secvenţe formează domenii globulare, în timp ce restul
lanţului adoptă o conformaţie de tip helix.
În lumenul RE reziduurile de lizină şi prolină sunt hidroxilate, iar între secvenţele
propeptidice a trei lanţuri pro-α se stabilesc punţi disulfurice intercatenare. Ulterior formării
legăturilor disulfurice, lanţurile se unesc (direcţia C - N), generând molecula de procolagen.
Din RE, procolagenul este transportat în aparatul Golgi, unde se desfăşoară mai multe
runde de procesare ce constau, în principal, în adaosul de reziduuri glucidice la hidroxilizină.
Moleculele de procolagen sunt eliminate din aparatul Golgi în spaţiul extracelular. Sub
acţiunea procolagen peptidazelor, secvenţele sunt clivate proteolitic, molecula de procolagen
fiind convertită în colagen. Proteoliza secvenţelor propeptidice în spaţiul extracelular
împiedică autoasamblarea colagenului în interiorul celulei,ceea ce ar avea drept consecinţă
distrugerea celulară.
c. Asamblarea moleculelor de colagen în spaţiul extracelular
În spaţiul extracelular, moleculele de colagen (numit şi tropocolagen) de tip I, II şi III se
asociază spontan formând polimeri ordonaţi ce poartă numele de fibrile de colagen (50nm în
diametru). În fibrile, moleculele sunt dispuse în şiruri longitudinale. Între moleculele
învecinate ale aceluiaşi şir există o distanţă („gap”) de 35 nm. Moleculele de colagen din
şirurile adiacente sunt deplasate unele faţă de altele cu 67 nm, ceea ce reprezintă mai puţin de
o pătrime din lungimea totală a moleculei. Se constată că din cinci în cinci molecule de
colagen sunt aliniate identic (fig. 49).
Spaţierea colagenului în fibrile conferă aceştia o maximă elasticitate.
În regiunile amino-şi carboxil-terminale ale colagenului există segmente scurte ce au o
conformaţie triplu-helix.
Resturile de lizină sau/şi hidroxilizină din aceste regiuni participă la legături covalente
încrucişate ce se stabilesc între extremitatea carboxilică a unei molecule adiacente. Aceste
legături au rolul de a stabiliza asamblarea colagenului în fibrile.
Organizarea fibrilelor diferă de la ţesut la altul. În piele, acestea se întretaie creând o
reţea laxă. În oase şi în cornee, fibrilele de colagen sunt dispuse în plăci ordonat aranjate;
fibrilele aceleiaşi plăci sunt paralele între ele şi perpendiculare pe cale ale plăcilor adiacente.
În tendoane fibrilelor formează mănunchiuri, numite fibre. Fibrele sunt dispuse paralel şi
orientate pe direcţia forţei ce acţionează asupra tendonului.

87
 Fig. 49 – a) Sinteza colagenului şi asamblarea sa în fibre în spaţiul extracelular.

3.3.1.4. Elastina
Elastina este o proteină neglicozilată, puternic hidrofobă, a cărei secvenţă de aminoacizi
(830) este bogată în glicină şi prolină. Este proteina majoră a reţelelor de fibre elastice din
matricea extracelulară. Spre deosebire de colagen, are un conţinut scăzut de lizină. În matricea
extracelulară, resturile de lizină ale moleculei proteice participă la formarea legăturilor
covalente încrucişate ce stabilizează elastina într-o reţea (filamente sau foiţe) ale cărei ochiuri
îşi modifică forma în raport cu direcţia forţei ce acţionează asupra sa. Elasticitatea reţelei se
datorează capacitaţii moleculelor de elastină de a adopta mai multe conformaţii random-coil.
Oscilarea între conformaţii caracterizate de diferite grade de relaxare a moleculelor de elastină
asamblate în reţea, conferă acestei proteine proprietăţi elastice similare cauciucului.
Filamentele de elastină reprezintă constituenţi principali ai reţelei de fibre elastice
prezente în matricea extracelulară din piele, vase sangvine sau plămâni. Componentul minor
al fibrelor elastice este o glicoproteină. Dispusă pe suprafaţa fibrelor, glicoproteina intervine
în organizarea moleculelor de elastină.

88
 3.3.1.5. Fibronectinele
Fibronectinele aparţin clasei glicoproteinelor de adeziune, a căror funcţie principală este
de a media adeziunea celulă-matrice extracelulară. Fibronectinele au un rol important în
menţinerea formei celulelor, în organizarea citoscheletului, iar pe parcursul embriogenezei
sunt implicate în migrarea şi diferenţierea celulară.
În organismele animale, fibronectinele sunt întâlnite în:
ƒ sânge şi alte fluide, sub formă de dimeri solubili, favorizând fagocitoza, migrarea
celulelor imune (în special macrofage), ataşarea trombocitelor de regiunile alterate ale
vaselor sangvine;
ƒ ataşate tranzitoriu pe suprafaţa celulară, ca oligomeri de fibronectină;
ƒ în matricea extracelulară, unde formează fibre insolubile.
a) Structura fibronectinelor
Se cunosc mai multe tipuri de fibronectine. Codificate de către o unică genă (70 kb),
fibronectinele sunt rezultatul splicing-ului alternativ al moleculei de ARN-m. Funcţie de tipul
celular, pot fi generate una până la 20 molecule diferite de ARN-m pentru fibronectină ce dau
naştere unui număr echivalent de lanţuri polipeptidice. Din punct de vedere structural,
fibronectina este un dimer alcătuit din două subunităţi identice. Regiunile carboxiterminale
ale celor două lanţuri polipeptidice (2500 aminoacizi fiecare) ce formează dimerul sunt legate
printr-o pereche de punţi disulfurice. Fiecare subunitate prezintă şase domenii globulare, unite
prin regiuni flexibile ale lanţului polipeptidic. Fiecare domeniu globular asigură legarea
specifică a fibronectinei la receptori celulari, colagen, fibrină şi proteoglicani sulfataţi (figura
50). Identificarea, izolarea şi secvenţializarea domeniului prin care fibronectina se leagă la
suprafaţa celulară au condus la evidenţierea unei secvenţe tetrapeptidice-Arg-Gly-Asp-Ser-
(RGDS). Secvenţa RGD este comună mai multor proteine extracelulare de adeziune. Ea
permite recunoaşterea şi legarea proteinelor de către integrine, o familie de receptori de
membrană omologi. Dată fiind specificitatea recunoaşterii receptor-ligand, se sugerează
implicarea, în acest proces, şi a altor secvenţe din structura proteinelor de adeziune.

Fig. 50 – a) Structura
fibronectinei.

Cele două lanţuri

polipeptidice sunt legate prin
punţi disulfurice. Fiecare lanţ
prezintă domenii globulare ce
leagă specific molecule din
matricea extracelulară sau
receptori de membrană;
b) domeniile de legare
specifică au fost puse în
evidenţă prin digestie cu
proteaze. Se cunosc şase
domenii:
• două pentru heparan
sulfat;
• două pentru fibrină;
• unul pentru colagen;
• unul pentru receptorul
fibronectinei.

89
 b) Receptorul pentru fibronectină-reprezentant al familiei integrinelor
Receptorul pentru fibronectină este un heteromer alcătuit din două lanţuri polipeptidice
.α şi β, asociate prin legături necovalente. Lanţul α (140.000 Da) este scindat în două
segmente; unul transmembranar şi altul extracelular. Segmentele sunt legate între ele printr-o
punte disulfurică . Lanţul β conţine secvenţe repetitive bogate în cisteină. Ambele lanţuri
polipeptidice ale receptorului sunt glicozilate (figura 51).

Fig. 51 – Structura receptorului pentru

fibronectină

Rolul moleculei receptor este de a media

contactul dintre fibronectină (recunoaşte secvenţa
RGDS) şi elementele din structura citoscheletului
(filamentele de actină).
Receptorul pentru fibronectină este un
membru al familiei integrinelor. Din această familie
mai fac parte receptorul pentru laminină, o parte
din receptorii pentru colagen, etc. Toate aceste
molecule au o structură similară, fiind implicate în
legarea componentelor matriceale de elementele
citoscheletului. Nu toţi receptorii pentru
constituenţii matricei extracelulare aparţin familiei
integrinelor. Mai mult, în anumite celule, receptorul pentru colagen este reprezentat de o
glicoproteină transmembranară cu o structură diferită de cea a integrinelor.
c) Migrarea şi aderarea fibroblastelor în matricea extracelulară – proces ce implică
recunoaşterea fibronectină – receptor
În organismele animale adulte, migrarea celulară este un fenomen rar întâlnit. O
excepţie o constituie procesul de reparare a leziunilor, în care fibroblaştii şi celulele
sistemului imun migrează spre zona afectată. Aceste celule traversează cheagurile sangvine al
căror element constituent principal este fibrina. Fibronectina, secretată de către fibroblaşti se
leagă printr-unul din domeniile sale globulare la fibrină. Pe de altă parte, prezentând secvenţa
specifică RGD, fibronectina este recunoscută şi legată de receptorul pentru fibronectină din
membrana plasmatică a fibroblastelor. Datorită mobilităţii laterale a receptorului în membrana
plasmatică, pe parcursul migrării fibroblastelor, se stabilesc şi se desfac succesiv contactele
celulă-matrice. În momentul în care deplasarea încetează, în citoplasmă se organizează fibrele
de stres bogate în actină. Aceste fibre se leagă de receptor prin intermediul proteinelor de
ataşare intracelulare (vinculina şi talină), imobilizându-l în membrana plasmatică (fig. 52).

Fig. 52 – Modelul regiunii de contact

fibroblast-substrat.

Fibrele de actină se ataşează prin

intermediul vinculinei şi a talinei de receptorul
pentru fibronectină. Receptorul leagă fibronectina
care, la rândul săau, interacţionează cu alte
elemente ale matricei extracelulare (colagen,
proteoglicani). Contactul dintre fibronectine, din
spaţiul extracelular şi mănunchiurile de fibre de
actină, din interiorul celulei, mediat de receptorul
pentru fibronectină, asigură aderarea celulei la
matricea extracelulară.

90
 3.3.2. Lamina bazală

Lamina bazală, structură specializată a matricei extracelulare, delimitează suprafaţa

bazală a celulelor epiteliate şi endoteliale, separând aceste celule de ţesutul conjunctiv
subadiacent. Ea înconjoară celule individuale (musculare, adipoase, celule Schwann) sau se
află interpusă între două straturi unicelulare în glomerulii renali şi în alveolele pulmonare.
La microscopul electronic, lamila bazală apare din trei straturi:
ƒ un strat electrono-transparent (lamina lucida sau lamina rara) situat în imediata vecinătate
a membranei plastice a celulelor ce se sprijină pe lamila bazală;
ƒ un strat electrono-dens (lamina densa);
ƒ un strat cu aspect reticular (lamina reticularis) alcătuit din colagen şi care are rolul de a
lega lamila bazală de ţesutul conjunctiv.

3.3.2.1. Structura laminei bazale

Moleculele componente ale lamilei bazale sunt sintetizate sunt sintetizate de către
celulele epiteliate, endoteliale şi mezenchimale.
Deşi compoziţia lamilei bazale variază de la un ţesut la altul, colagenul de tip IV,
proteoglicanii (heparan sulfat) şi laminina sunt elemente comune tuturor acestor structuri.
a) Colagenul de tip IV
Moleculele de colagen de tip IV sunt prezentate în exclusivitate în lamila bazală. Ele
reprezintă elementul constituient major al lamilei densa ce compune lamila bazală.
Similar moleculelor de colagen fibrilar, colagenul de tip IV este alcătuit din trei lanţuri
polipeptidice ce formează un truplu helix (40 nm lungime). Secvenţa repetitivă Gly-X-Y,
caracteristică tuturor moleculelor de colagen, este întreruptă de aproximativ 20 de ori în
molecula de tip IV, ceea ce justifică apariţia unor discontinuităţi în structura truplu-helixului.
Existenţa zonelor de discontinuitate conferă întregii molecule o mai mare flexibilitate.
Spre deosebire de moleculele de colagen interstiţial, secvenţele propeptidice amino-şi
carboxi-terminale ale colagenului IV nu sunt scindate proteolitic după eliberarea sa în mediul
extracelular. Secvenţele propeptidice carboxi-terminale formează domenii prin intermediul
cărora monomerii interacţionează formând dimeri lineari. Dimerii se asociază lateral prin
regiunile cu conformaţie triplu-helix dând naştere unei reţele plane cu ochiuri hexagonale.
Regiunile amino terminale ce predomină de o parte şi de alta a planului reţelei se asociază
prin legături covalente generând o reţea
multistratificată (figura 53).

Fig. 53 – Modelul asocierii

moleculelor de colagen de tip IV şi
formarea reţelei multistratificate. În
această reţea, moleculele de colagen
sunt stabilizate prin legături covalente
încrucişate şi punţi disulfurice.

b) Laminina-glicoproteină
majoră a lamilei bazale
Laminina este localizată pe faţa
dinspre membrana plasmatică a lamilei
densa mediind legarea lamilei bazale de
suprafaţa celulară. Molecula (850.000
Da) este alcătuită din trei lanţuri
polipeptidice; un lanţ lung A şi două
lanţuri mai scurte B. lanţurile sunt unite
prin punţi disulfurice într-o structură

91
cruciformă. Cele trei braţe scurte ale moleculei de laminină prezintă câte o pereche de
domenii globulare, iar braţul scurt are un singur domeniu (figura 54).

Fig. 54 – Structura lamininei

Proteina prezintă trei lanţuri

polipeptidice (A, B1 şi B2) şi conţine
mai multe domenii funcţionale:
- un situs de legare a colagenului IV;
- un situs de legare a proteoglicanilor
sulfataţi;
- două sau mai multe situsuri de
legare la receptori de membrană.
Ca şi fibrotectina, laminina
conţine mai multe domenii
funcţionale: câte un domeniu leagă
colagenul IV şi heparan sulfatul, iar
unul sau mai multe domenii sunt
implicate în legarea receptorului prin
laminină. Receptorii pentru laminină
diferă funcţie de tipul celular, dar cel
puţin o parte a acestora aparţin familiei
integrinelor.

3.3.2.2. Funcţiile laminei bazale

Lamina bazală se caracterizează printr-o pronunţată heterogenitate funcţională
determinată de necesităţile fiziologice ale diferitelor ţesuturi.
Interpusă între ţesutul epitelial şi ţesutul conjunctiv subadiacent, lamina bazală susţine
celulele epiteliale şi totodată funcţionează ca un filtru molecular şi celular între cele două
compartimente tisulare. În glomerii renali, rolul laminei bazale constă în reglarea traficului de
molecule din sânge în urină.
La nivelul joncţiunilor neuromusculare, lamina bazală prezintă o compoziţie chimică
particulară ceea ce-i permite exercitarea funcţiei de coordonare a organizării spaţiale a
componentelor joncţionale de o parte şi de alta a sinapsei.
În regenerarea tisulară, lamina bazală constituie eşafodul pe care celulele migrează
îndreptându-se spre zona afectată.
Reglarea funcţiilor celulare vitale: adeziunea, creşterea şi diferenţierea celulară sunt
independente de legarea receptorilor celulari la elementele componente ale laminei bazale.

92
 Capitolul 4

CITOSCHELETUL
Citoscheletul este alcătuit din microtubuli, filamente de actină, filamente intermediare, o
reţea microtrabeculară şi din proteine asociate.
Citoscheletul este o structură dinamică. Capacitatea sa de a-şi modifica structura, funcţie
de necesitaţile celulare,are la baza reacţiile de polimerizare şi depolimerizare ale
microfilamentelor şi ale microtubuliilor.
Proteinele asociate au rol de a regla procesele de polimerizare şi depolimerizare ale
filamentelor,de a interconecta elementele de citoschelet în reţea şi de a le lega de organitele
celular şi/sau membrana plasmatică.
Implicat în inducerea şi menţinerea formei celulei şi a prelungirilor celulare
(cili,flageli,microvili,axoni),citoscheletul are în principal o funcţie de susţinere. Acesteia i se
adaugă o funcţie motilă. Principalele mişcări celulare asigurate de elementele de citoschelet
sunt:
ƒ mişcarea cililor şi a flagelilor;
ƒ deplasarea celulelor ce prezintă un tip de locomoţie ameboidal;
ƒ transportul intracelular de particule materiale, vezicule de transport şi organite
celulare;
ƒ translocarea cromozomilor în timpul diviziunii celulare;
ƒ desfaşurarea citokinezei;
ƒ contracţia musculară;
Interacţiunea elementelor de citoschelet cu membrana plasmatică, la nivelul structurilor
joncţionale, prin intermediul proteinelor de adeziune intracelulară, solidarizează celule în
ţesuturi, conferind acestora rezistenţă.
Se apreciază că realizarea acestora funcţii constituie rezultatul cooperării citoscheletului
cu reţeaua microtrabeculară.

4.1. Microtubulii

Au fost evidenţiaţi pentru prima dată, cu ajutorul microscopului electronic, în celulele

animale de către d. Slauttersack (1963), care a introdus şi termenul de microtubul.

4.1.1. Microtubulii – semnificaţia biologică

Microtubulii sunt substructuri celulare omniprezente în citoplasma celulelor eucariote.

În citoplasmă, ei se găsesc fie izolaţi – microtubuli citoplasmatici, fie fasciculaţi, dând naştere
unor formaţiuni cu caracter efemer – fibrele fusului de diviziune, sau permanent – centrioli,
corpusculi bazali şi axonemele organitelor locomotorii (cili, flageli). Microtubulii îndeplinesc
în celulă un rol structural, intervenind ca parte componentă a citoscheletului, în inducerea şi
menţinerea geometria spaţială a celulelor, şi un rol dinamic, aceste structuri coordonând
motilitatea celulară.
Principalele mişcări asociate microtubulilor sunt:
ƒ mişcările cililor şi flagelilor ce asigură deplasarea celulelor libere, mobile;
ƒ transportul intracelular de particule, vezicule şi organite celulare (nucleu, plastide,
mitocondrii)
ƒ translocarea anafazică a cromozomilor.
Studiul comparativ al microtululilor din diferite compartimente celulare a arătat că
tratamentul cu colchicină, temperaturile scăzute şi presiune hidrostatică mare determină
degradarea microtubulilor citoplasmatici şi a celor ce alcătuiesc fusul mitotic, dar nu afectează

93
structurile microtubulare stabile (cetrioli, corpusculi bazali, microtubuli din organitele
locomotorii). Aceste rezultate demonstrează existenţa unei populaţii heterogene de
microtubuli.

4.1.2. Structura microtubulilor

În imaginile electronomicroscopice, microtubulii se disting ca structuri cilindroide de

lungimi variabile (până la zeci de nm) şi cu un diametru relativ constant de 24 nm.
Fiecare microtubul este alcătuit din 13 protofilamente dispuse paralel cu axul
longitudinal şi care delimitează un lumen. Protofilamentele sunt rezultatul asocierii cap la
coadă a unui număr variabil de heterodimeri, ce poartă numele de tubulină (100.000 Da).
Orientarea dimerilor, de tubulină în protofilamente, conferă microtubulilor un caracter polar,
ce este conservant în toate structurile microtubulare.
Unitatea fundamentală a microtubulilor, tubulina, este alcătuită din două proteine
distincte: alfa şi beta tubulina (fiecare 50.000 Da). Cele două componente proteice ce
compun heterodimerul sunt dispune heicoidal în peretele microtubulului. (fig. 55).

Fig. 55 – Modelul structurii

tridimensionale a microtubulilor.
(Fiecare din cele 13 protofilamente ce
alcătuiesc peretele microtubulului este
formată din heterodimeri de tubulină α şi
β, aşezaţi cap la coadă.

În preparatele pure de microtubuli, în

afara heterodimerilor de tubulină, s-a observat
prezenţa unor proteine cu mase moleculare
diferite. Deoarece, diversele structuri
microtubulare conţin diferite tipuri de
molecule proteice, iniţial, s-a considerat că
acestea sunt proteine de contaminare. Dar
raportul cantitativ constant dintre proteine şi
subunităţile de tubulină, observat pe parcursul
mai multor cicluri de polimerizare şi
depolimerizare, a condus la concluzia că
proteinele sunt asociate specific tubulinelor,
motiv pentru care au fost numite proteine
asociate microtubulilor (microtubule associated proteins - MAP).
Cele mai bine caracterizate proteine asociate sunt proteinele tau, localizate exclusiv în
structurile microtubulare din axonii celulelor nervoase. Codificate de o unică genă, cele cinci
proteine tau cunoscute astăzi, sunt rezultatul unui proces de splicing (combinare) alternativ.
Alte proteine asociate prezente în celulele nervoase sunt MAP1-MAP2. MAP1 este
asociată microtubulilor din axoni şi dendrite, în timp ce MAP2 este întâlnită doar în
structurile microtubulare din dendrite.
Proteinele asociate au rol de a consolida structurile microtubulare prin interconectarea
microtubulilor adiacenţi şi de a stabiliza edificiul arhitectural al citoscheletului prin legarea
filamentelor intermediare.
Majoritatea proteinelor asociate sunt fosforilate. Ciclurile de fosforilare şi defosforilare
ale acestora pot constitui o etapă importantă în reglarea asamblării microtubulilor. Această
presupunere este confirmată în cazul proteinei tau ce prezintă activitatea ATP - azică şi care
acţionează în sensul accelerării polimerizării microtubulilor.

94
 4.1.3. Polaritatea şi dinamica microtubulilor

Geneza microtubulilor este un proces de autoasamblare a tubulului. Studiile în vitro au

demonstrat formarea microtubulilor într-o soluţie pură de dimeri, la 37ºC, în prezenţa GTP
(guanozin trifosfat) şi a ionilor bivalenţi. Sinteza microtubului primer, prima etapă a
polimerizării, se desfăşoară lent, dar alungirea primer-ului, prin adăugarea de noi dimeri de
tubulină, este un proces mult mai rapid.
Expunerea unei soluţii de microtubuli la temperaturi scăzute (0ºC) are un rezultat
contrar, determinând depolimerizarea cu eliberarea dimerilor αβ stabili. Creşterea temperaturii
la 37ºC este însoţită de reasamblarea microtubulilor. Se demonstrează astfel caracterul
dinamic al microtubulilor, structuri ce-şi modifică lungimea ca rezultatul a reacţiilor de
polimerizare şi depolimerizare.
Deşi adăugarea sau pierderea subunităţilor de tubulină poate avea loc în oricare din
capetele microtubului, observaţiile electrono-microscopice subliniază funcţionalitatea diferită
a extremităţilor acestor structuri. Viteza reacţiilor de polimerizare şi depolimerizare este de
două ori mai mare la unul din capete, simbolizat cu plus (+). Capătul opus a fost notat cu
minus (-).
In vitro, la o anumită concentraţie a dimerilor liberi de tubulină se atinge o stare de
echilibru (steady state), numărul dimerilor adăugaţi fiind egal cu cel al subunităţilor disociate
de microtubuli. Această concentraţie a fost numită concentraţie critică (Cc). Când concentraţia
dimerilor liberi depăşeşte valoarea critică predomină procesul de polimerizare, în timp ce,
scăderea concentraţiei de tubulină, sub concentraţia critică, are ca rezultat depolimerizarea
microtubulilor. În consecinţă, concentraţia dimerilor liberi reprezintă principalul factor
implicat în reglarea polimerizării şi depolimerizării microtubulilor.
Studiul dinamicii microtubulilor, în culturi de celule, a evidenţiat aspecte surprinzătoare
şi aparent contrare rezultatelor, experimentelor in vitro. Se constată astfel, că, în timp ce unii
microtubuli sunt subiectul unor repetate şi rapide procese de polimerizare şi depolimerizare,
în aceeaşi celulă (la aceeaşi concentraţie a dimerilor liberi) alţi microtubuli se alungesc
continuu sau rămân la o lungime constantă pe parcursul perioadei de observaţie.
Manifestarea simultană a fenomenelor de creştere şi descreştere în lungime a
microtubulior este explicată prin modelul dinamic (dynamic instability model). Acest model
sugerează că o anumită structură a extremităţilor microtubulilor de determină adăugarea sau
disocierea subunităţilor proteice. Fiecare dimer de tubulină conţine două molecule de GTP. Pe
parcursul polimerizării sau în etapa imediat următoare încorporării dimerului (preferenţial la
capătul +), GTP este hidrolizat la GDP (guanozin difosfat). Stabilitatea microtubulului apare
reglată de doi factori concentraţia de tubulină liberă şi viteza reacţiei de hidroliză a GTP.
Dacă, concentraţia dimerilor liberi este superioară valorii critice, polimerizarea
microtubulilor este favorizată, iar viteza acestei reacţii este mai mare decât cea a hidrolizei
GTP. În consecinţă, la extremitatea + se formează un cap GTP. Microtubulii care au o
strucrură cap GTP, sunt stabili şi pot servi ca primer-i în procesul de polimerizare; se pot
alungi. La o concentraţie scăzută a tubulinei libere (C < C C ), viteza de disociere a dimerilor
depăşeşte viteza de polimerizare, ceea ce conduce la formare GDP. Prezenţa structurii GDP
este asociată cu instabilitatea microtubulilor, determinând o accelerare a depolimerizării.
În ceea ce priveşte influenţa celui de-al doilea factor, asupra stabilităţii microtubulilor,
se constată că, cu cât viteza de hidroliză a GTP este mai mică, cu atât este mai favorizată
formarea unui cap GTP şi deci, alungirea microtubulului. Viteza mare a hidrolizei GTP are un
efect contrar.
Modelul susţine că variaţiile locale ale celor doi factori pot determina evoluţia diferită a
microtubulilor dintr-o celulă; în timp ce unii microtubuli se alungesc, alţii suferă un proces de
depolimerizare.

95
 4.1.4. Bazele diversităţii structurilor microtubulilor

Deşi toţi microtubulii prezintă o organizare fundamentală comună, structurile rezultate

prin asocierea acestora sunt foarte diferite, chiar şi în cadrul aceleiaşi celule.
Iniţial, diversitatea structurilor microtubulare a fost pusă pe seama existenţei, la
organismele eucariote, a subtipurilor de alfa şi beta tubulină. Aceste proteine sunt codificate
de aceleaşi gene sau de gene diferite, caz în care poartă numele de izotipuri. Secvenţele de
aminoacizi ale izotipurilor de alfa şi beta tubulină sunt aproape identice la păsări şi rozătoare.
Diferenţele dintre subtipuri sunt, în mare parte, rezultatul modificărilor
posttranslaţionale. Astfel, tubulinele alfa sunt antrenate într-o reacţie de acetilare a unui rest
de lizină şi suferă adiţia sau deleţia unei tirozine carboxi-terminale. La tubulinele beta se
remarcă modificări ale segmentelor carboxi –terminale. Este posibil că aceste modificări
structurale să condiţioneze încorporarea subunităţilor în diferite structuri microtubulare şi
legarea lor la proteinele asociate. Recent, s-a demonstrat că heterogenitatea subunităţilor de
tubulină nu poate explica diversitatea structurilor microtubulare, deoarece modificările
posttranslaţionale nu afectează semnificativ funcţionalitatea microtuburilor.
Cercetări efectuate pe structurile microtubulare din neuron au condus la concluzia că
fiecare microtubul conţine subunităţi alfa şi beta echivalente funcţional, particularităţile
acestor structuri fiind dictate de tipul proteinelor asociate ce copolimerizează cu tubulinele
sau se leagă de microtubuli ulterior polimerizării.

4.1.5. Centrii organizatorici ai microtubulilor

Distribuţia nealeatorie a microtubulilor în celulă a condus la ipoteza existenţei unor

factori ce controlează nucleaţia, diferenţierea şi dispunerea acestor formaţiuni celulare. Aceşti
factori a căror existenţă a fost demonstrată prin cercetări experimentale poartă numele de
centrii organizatori ai microtubulilor (MTOC) sau centrii de nucleaţie.
Astăzi, dispunem de numeroase argumente ce atestă faptul că cel puţin centriolii şi
corpusculii bazali acţionează ca centrii organizatorici ai micritubulilor. Microtubuli au o
orientare strictă în raport cu centrele de nucleaţie (fig. 56).

Fig. 56 – Orientarea
microtubulilor în raport cu centrele
de nucleaţie:
A – Celulă ciliată aflată în
interfază.Microtubulii citopasmatici au
capătul (-) ancorat în regiunea
pericentriolară.Microtubulii ce intră în
structura axonemei au capătul poziţionat
proximal faţă de corpusculul bazal;
B – Celulă nervoasă.Microtubulii din
axon sunt orientaţi cu capătul spre
corpusculul bazal.Microtubulii din
dendrite nu au o orientare fixă;
C – Celulă aflată în
mitoză.Microtubulii fasciculaţi dau
naştere fibrelor fusului de diviziune ce
se diferenţiază între cei doi centrii
celulari prezenţi la polii opuşi ai celulei.

96
 Capetele (-) sunt inserate în centrul organizator şi stabilizate de proteinele asociate, în
timp ce, capetele (+) distale sunt libere. Sechestrarea şi stabilizarea capetelor explică de ce în
vivo adăugarea şi disocierea dimerilor are loc doar la capetele (+) libere.
De la această orientate fac excepţie microtubulii din dendritele şi axonii neuronilor.
Datorită absenţei centrului organizator în dendrite, microtubulii nu păstrează aceeaşi
polaritate; ei sunt dispuşi fie cu capătul (+), fie cu capătul (-) spre corpul celular.
La baza axonului se remarcă prezenţa unui centru organizator, dar nu toţi microtubulii
radiază din aceasta. Microtubulii ce au ca punct de plecare centrul de nucleaţie prezintă o
orientare obişnuită (capătul (+) liber). Este posibil ca aceştia să dicteze şi poziţionarea
microtubulilor liberi de vreme ce, în axon toţi microtubulii au aceeaşi polaritate; capătul (-)
este orientat spre corpul celular.

4.1.5.1. Centriolii şi corpusculii bazali

În coordonare asamblării microtubulilor şi a motilităţi celulare un rol-cheie îl joacă
structurile microtubulare specializate.
Microtubulii din celulele aflate în interfaza şi cei care alcătuiesc fibrele fusului mitotic
îşi au originea într-o regiune perinucleară, numită centrul celular. Structura centrului celular
este complexă, ea constând dintr-o pereche de centrioli situaţi central, înconjuraţi de o zonă
citoplasmatică amorfă, numită centrozom sau regiune pericentriolară, delimitată, la rândul
său, de o zonă mai puţin densă şi relativ omogenă, centrosfera. Cercetările experimentale au
demonstrat faptul că centriolii izolaţi sau însoţiţi de materialul pericentriolar sun capabili să
iniţieze polimerizarea tubulinei in vitro şi să coordoneze nucleaţia microtubulilor in vivo. În
imaginile electronomicroscopice se observă însă că microtubulii nu au ca punct de plecare
centriolii, ei radiind din regiunea pericentriolară. Un argument în plus, în favoarea rolului de
centru organizator al centrozomului, îl constituie păstrarea capacităţii de organizare a
microtubulilor în celulele eucariote, din care lipsesc centriolii.
Se presupune că în celulele în care atât centriolii, cât şi centrozomul sunt prezenţi
ambele structuri coordonează formarea microtubulilor din celulele aflate în interfază şi acelor
din fibrele fusului mitotic.
În formarea microtubulilor ce alcătuiesc axonemele cililor şi flagelilor sunt implicate
alte structuri microtubulare, localizate la baza organitelor locomotorii şi care poartă numele de
corpusculi bazali.
Pe lângă rolul de centri organizatori ai microtubulilor, centriolii stau la baza
fenomenelor de motilitate manifestate în timpul diviziuni celulare, iar corpusculii bazali,
coordonează mişcările cililor şi flagelilor.

4.1.5.2. Ultrastructura centriolilor şi a corpusculilor bazali

Studiile de microscopie electronică au condus la elucidare ultrastructurii centriolilor şi
corpusculilor bazali. Ambele structuri microtubulare au forma unui cilindru ( 0,2 µm diametru
şi 0,4 µm lungime ). Pereţi cilindrului sunt constituiţi din 9 fibrile dispuse circular, echidistant
şi înclinate la un unghi de 30-40˚. Fibrilele sunt imobilizate într-o matrice amorfă ce
înconjoară cilindrul. Fiecare fibrilă este formată din 3 subfibrile reprezentate de trei
microtubuli. Subfibrilele din fiecare triplet sunt notate cu A,B şi C dinspre lumenul cilindrului
spre exterior.
Subfibrila A este un microtubul complex, format din 13 protofilamente, în timp ce
subfibrilele B şi C sunt incomplete (10-11 protofilamente).
La capătul proximal al centriolilor şi corpusculilor bazali se constantă prezenţa unui
miez cilindric central, interconectat cu fibrilele periferice. Această structură, asemănătoare
unei roţi cu spiţe, este absentă în regiune distală a celor două structuri microtubulare. (fig. 57).

97
 Fig. 57 – Structura corpusculilor bazali şi a
centriolilor.Cele 9 fibrile periferice formează
peretele unui element de formă cilindrică. Fiecare
fibrilă este un triplet de microtubuli (A,B,C).
Fibrilele sunt legate între ele prin proteine
conectoare.

4.1.5.3. Replicarea centriolilor şi a

corpusculilor bazali
Replicarea centriolilor are loc la un anumit
moment al ciclului celular. În interfază, la începutul
perioadei G1, cei doi centrioli, prezenţi în centrul
celular, sunt situaţi unul lângă altul cu axele lungi în
unghi drept. La sfârşitul perioadei G1, centriolii se
separă, pentru ca în perioada sintetică ( S ) din fiecare
centriol prexistent să se diferenţieze câte un centriol-
fiu, numit procentriol. Fiecare procentriol este
orientat perpendicular pe centriolul din care a
provenit. Iniţial, mai mici decât centrioli parentali,
procentriolii se alungesc continuu, atingând
dezvoltarea maximă în metafază.
La începutul profazei, centrul celular se divide,
iar cele două perechi de centrioli, fiecare constituie
dintr-un centriol matur şi altul în creştere, se separă.
Perechile de centrioli migrează spre polii celulei unde
în metafază alcătuiesc polii fusului de diviziune.
În momentul separări celulelor-fiice rezultate în urma diviziunii celulare fiecare, va
conţine câte un cuplu de centrioli maturi, orientaţi perpendicular unul pe celălalt şi înconjuraţi
de materialul pericetriol. (fig. 58).

Fig. 58 – Schema replicării centriolilor.

Un fenomen replicativ similar este

întâlnit şi la corpusculii bazali. Corpusculul
nou format se diferenţiază din cel
preexistent şi se orientează perpendicular pe
aceasta. În momentul în care ajunge la
maturitate, el se separă de corpusculul
parental, generând apariţia unui nou flagel
sau a unui nou cil.
Replicarea centriolilor şi a
corpusculilor bazali nu este pe deplin
elucidată. Cercetări recente au demonstrat
existenţa la nivelul corpusculilor bazali a
unei molecule mici (6-9 milioane pb ) de ADN linear. Acest ADN conţine informaţia necesară
codificării majorităţii proteinelor existente în corpusculi. Se presupune că translaţia are loc în
ribozomii citoplasmatici, proteinele sintetizate fiind apoi transportate şi integrate în
corpusculii bazali. Prezenţa ADN la nivelul corpusculilor bazali explică capacitatea lor de
autoreplicare.

98
 Există date experimentale ce confirmă presupunerea prezenţei în centrioli a unui ADN
propriu. Se sugerează că ADN centriolar se găseşte în nucleu într-o formă inactivă, iar în
urma translocării sale în centriol, molecula este activă.
Interconvertibilitatea demonstrată a centriolilor şi corpusculilori bazali, asemănările
structurale şi funcţionale dintre aceştia şi nu în ultimul rând prezenţa ADN au condus la
concluzia că centrii organizatorici ai microtubulilor sunt componente ale unui sistem
citoplasmatic.
Capacitatea celulei de a coordona modificările morfologice şi funcţionale ce însoţesc
procesele de creştere şi diferenţiere celulară se pot explica prin activarea şi dezactivarea
centrelor de nucleaţie, ca rezultat al cooperării dintre unitatea genetică nucleară şi cea proprie
sistemului citoplasmatic.

4.1.6. Mişcările cililor şi flagelilor

Cilii şi flagelii sunt prelungiri celulare cu caracter permanent, prezente în multe celule
eucariote animale şi vegetale. Deşi între cili şi flageli există unele deosebiri, ei sunt
consideraţi variante ale acelaşi organit. La mamifere,inclusiv la om, celulele ciliate se găsesc
în mucoasa tractului respirator,având rolul de a îndepărta particulele materiale ce pătrund în
momentul inspirului în cavităţile nazale, faringe şi trahee. Ele sunt prezente şi în mucoasa
oviductului, cilii asigurând deplasare ovulului. Spermatozoidul este singura celulă flagelată
din organismele mamifere.
Flageli execută mişcări ondulatorii, cu amplitudine constantă, în acelaşi plan. În
majoritatea cazurilor, mişcările se propagă de la baza organitului către capătul său opus.
Uneori mişcarea sub forma unei unde plane este înlocuită de o altă helicoidală.
Cilii execută mişcări ciclice, în doi timpi: o bătaie activă şi o alta de întorcere. Fiecare
ciclu durează 0,1-0,2 secunde. Bătaia constă în înclinarea sub un unghi larg a cilului aflat în
extensie. Aproape concomitent are loc curbarea cilului în regiunea bazală, moment ce
marchează începutul mişcării de întoarcere. Curbarea se propagă de-a lungul cilului
determinând revenirea organitului la poziţia iniţială (fig. 59).

Fig. 59 – Schema mişcărilor cililor.

Mişcarea cililor, ce formează o suprafaţă ciliată este defazată, diferenţa de fază între
mişcările a doi cili consecutivi fiind constantă.
Atât mişcarea cililor, cât şi a flagelilor sunt procese energo-dependente, energia
necesară fiind furnizată prin hidroliza ATP.

99
 4.1.6.1. Structura cililor şi a flagelilor
Cilii şi flagelii celulelor eucariote au un plan de organizare comun, la baza structurii lor
aflându-se microtubulii.
Ambele organite sunt alcătuite din trei părţi: cilul sau flagelul propriu-zis, corpusculul
bazal şi rădăcinile.
Cilul sau flagelul propriu-zis constă dintr-o structură microtubulară complexă, numită
axonemă, înconjurată de hialoplasmă şi protejată la exterior de o membrană celulară simplă,
generată prin expansiunea plasmalemei.
Axonema este alcătuită din 9 fibre periferice şi 2 centrale. Fibrele periferice sunt dublete
subfibrilare ce se extind din corpusculul bazal în flagel (cil). Cele 2 subfibrile sunt notate cu A
şi B. Subfibrila A este un microtubul complet (13protofilamente), în timp ce subfibrila B este
incompletă (10-11 protofilamente). Rolul-cheie în interconectarea microtubulilor revine unei
proteine numită tectină.
În regiunea centrală a lumenului axonemei sunt localizate cele 2 fibre centrale, notate cu
C1 şi C2 . Fiecare este alcătuită dintr-un unic microtubul 1 (singlet). Cele 2 fibre centrale sunt
interconectate prin punţi transversale şi înconjurate de o structură fibrilară numită teaca
internă. De subfibrila A, în partea opusă subfibrilei b, sunt ancorate 2 braţe orientate în
direcţia acelor ceasornicului şi alcătuite dintr-o proteină ce poartă numele de dineină. Braţele
externe ale dineinei apar de-a lungul microtubulilor la intervale regulate de 24 nm, iar
distanţa dintre braţele interne succesive este de 32 nm. Tot din subfibrile A pleacă spre centrul
axonemei braţe radiale ce se termină în aproprierea tecii interne, prin regiuni regulare şi care
creează imaginea unei roţi cu spiţe. (fig. 60).

Fig. 60 – A. Structura axonemei. Peretele axonemei este alcătuit din 9 fibre

periferice, fiecare formată din două subfibrile (A şi B ). Braţele dineinei şi elementele radiale
sunt ataşate pe subfibrila A. În lumenul axonemei se găsesc singletele centrale, interconectate
prin punţi transversale şi înconjurate de teaca internă; B. Fibra periferică este un dublet de
microtubuli. Subfibrila A este un microtubul complet (13 protofilamente), subfibrila B este un
microtubul incomplet (10 – 11 protofilamente).
100
 Axonema este stabilizată prin interconectarea fibrelor periferice. Subfibrila A, dintr-un
dublet, este legată de subfibrile B a dubletului adiacent prin intermediul unei proteine
contractile numită nexină.
Cilul sau flagelul propriu-zis este ancorat în corpul celular prin rădăcini cu o structură
variată.

4.1.6.2. Mecanismul molecular al mişcări cililor şi flagelilor

În mişcările cililor şi flagelilor un rol important îl joacă dineina, o proteină alcătuită din
mai multe polipeptide, cu mase moleculare variate. La extremitatea fiecărui braţ de dineină
există 2-3 regiuni globulare, reprezentate de un polipeptid (400.000 Da) cu activitatea ATP -
azică.
În timpul mişcării cililor şi flagelilor, energia eliberată prin hidroliza ATP este utilizată
în scopul desfacerii şi refacerii succesive a legăturilor dintre dineinile ataşate de subfibrila A a
unui dublet şi subfibrila B a dubletului adiacent. Această deplasare a punţilor laterale dintre
fibrele determină alunecarea dubletelor unul faţă de altul şi în consecinţă înclinarea cilului
(flagelului).
Elementele radiale şi teaca internă au rolul de a coordona intrarea în acţiune a dineinei,
de la baza cilului (flagelului) spre vârful acestuia, convertind glisarea dubletelor într-o
mişcare de înclinare a axonemei.
Nexina, proteina contractilă ce leagă fibrele periferice adiacente, împiedică disocierea
dubletelor în momentul glisării.
Spre deosebire de cili, flageli se mişcă în acelaşi plan. Această limitare a mişcări este
impusă pe de o parte de existenţa unei legături rigide, cu caracter permanent între dubletele
externe, iar pe de altă parte de diferenţele morfologice dintre fibrele centrale.

4.1.7. Implicarea microtubulilor în diviziunea celulară

Microtubulii joacă un rol-cheie în trei procese importante ce se desfăşoară în cadrul

diviziuni celulare:
ƒ formarea fusului de diviziune;
ƒ deplasarea cromozomilori în planul ecuatorial şi celulei şi alinierea în
ƒ placa metafazică;
ƒ translocarea cromozomilori anafazici.

4.1.7.1. Formarea fusului de diviziune

În celulele aflate în interfază, microtubulii citoplasmatici radiază din centrozomul
centrului celular, având o orientare unipolară. Intrarea celulei în diviziune este anticipată de
autoreplicarea centriolilor, scindarea materialului pericentriolar şi formare celui de-al doilea
centru celular. Cei doi centrozomi coordonează nucleaţia microtubulilor care prin asociere
generează fibre. Fibrele, cu capătul (-) inserat în centrozom şi capătul (+) distal, liber, sunt
dispuse de jur-împrejurul fiecărui centrozom şi poartă numele de fibre asteriene (“stelare”).
Totalitatea fibrelor asteriene ce radiază dintr-un singur centrozom alcătuieşte asterul.
Fibrele din cei doi asteri ce se găsesc în contact se alungesc prin polimerizarea tubulinei,
determinând depărtarea centrilor celulari şi deplasarea lor spre polii celulei, unde vor constitui
polii fusului de diviziune. (fig. 61).

101
 Fig. 61 – Formarea fusului de diviziune:

a) – fibrele asteriene radiază din regiunea pericentriolară;

b) – replicarea centriolilor are drept consecinţă apariţia celui de-al doilea centru celular;
Alungirea fibrelor asteriene şi deplasarea celor doi centrii celulari spre polii opuşi ai
celulei;
c) – diferenţierea fibrelor polare ale fusului de diviziune între cei doi centrii celulari;
d) – ancorarea cromozomilor la polii fusului de diviziune prin fibrele kinetocorice.

Fibrele ce pleacă din centrozom spre planul ecuator al celulei poartă numele de fibre
polare. Acestea se alungesc prin adăugarea dimerilor de tubulină la capetele (+) libere. În
momentul dezorganizării membranei nucleare, fibrele polare pătrund în spaţiul nuclear şi
ancorează prin capetele (+) kinetocorii cromozomilor. Fibrele ce leagă kinetocorii de polii
fusului de diviziune se numesc fibre kinetocorice.
Kinetocorii sunt complexe multiproteice cu structura trilamelară, ce se dezvoltă pe cele
două feţe opuse ale centromerului (constricţie primare) la nivelul căruia sunt unite cele două
cromatide ale cromozomului metafazic.
Formarea acestei structuri specializate în interconectarea cromozomilor cu polii fusului
de diviziune este controlată de secvenţe de ADN, numite ADN centromeric. Secvenţele au
capacitatea de a lega proteine specifice ce iniţiază formarea complexului multiproteic.
Totalitatea fibrelor asteriene, polare şi kinetocorice ce radiază din cei doi centrozomi,
alcătuieşte fusul mitotic sau fusul de diviziune. Fusul de diviziune este format din două
semifusuri, fiecare conţinând fibrele ce pleacă de la un singur centrozom.
Caracterul polar al fusului de diviziune poate explica prin existenţa unui proces de
stabilizare selectivă a fibrelor polare. În acest proces sunt implicate proteine asociate
microtubulilor ce interconectează în plan ecuatorial fibrele polare învecinate antiparalele,
împiedicând depolimerizarea acestora.

102
 4.1.7.2. Deplasarea cromozomilor spre regiune ecuatorială a celulei şi alinierea lor în
placa metafazică
În prometafază, cromozomii se mişcă dezordonat, oscilând între cei doi poli ai fusului
de diviziune. În timpul acestor mişcări, un set de fibre polare capturează unul din cei doi
kinotocori ai cromozomului, după care şi celălalt kinetocor este ancorat de fibrele polare ce
pleacă din centrozomul opus. Fiecare cromozom va avea astfel o orientare strictă în raport cu
fusul diviziuni, prezentând kinetocorii spre cei doi poli ai celulei.
Deplasarea cromozomilor spre planul ecuatorial al celulei este determinată în parte de
polimerizare fibrelor kinetocorice. Aceste fibre au capătul (-) inserat în controzom şi capătul
(+) legat de kinetocor şi stabilizat prin proteine.
Injectând tubulină marcată, într-o celulă aflată în metafază, s-a constatat că dimeri sunt
incorporaţi la capătul (+) al fibrelor kinetocorice. În timp ce detaşarea prin micromanipulare a
fibrelor kinetocorice de cromozomi declanşează un proces rapid de depolimerizare a acestor
fibre. Aceasta sugerează că kinetocorul protejează capetele (+) ale fibrelor kinetocorice,
împiedicându-le depolimerizarea. Având ambele capete protejate, prin kinetocor şi
centrozom, fibrele kinetocorice au o stabilitate mult superioară celorlalte fibre ce alcătuiesc
fusul de diviziune.
Polimerizarea fibrelor kinetocorice nu reprezintă singurul proces ce explică deplasarea
cromozomilor şi alinierea lor în placa ecuatorială. Ruperea experimentală a fibrelor
kinetocorice ce leagă cromozomul de unul din polii fusului de diviziune este precedată de
rapidă deplasare a cromozomului spre polul de care a rămas ataşat. Aceasta demonstrează
caracterul elastic al fibrelor kinetocorice. Deplasării cromozomilor, ancoraţi în fibrele de
diviziune, spre unul din cei doi poli, i se opune o forţă ce atrage cromozomii spre polul opus.
Forţa este direct proporţională cu lungimea fibrelor kinetocorice.
S-a observat că, în urma exciziei kinetocorului, prin microchirurgie cu raze laser de pe
un braţ cromozomial, aceasta se depărtează spre polul fusului de diviziune cel mai apropiat.
Mişcarea braţului, lipsit de kinetocor, nu se datorează ancorării sale la fibrele fusului de
diviziune. O explicaţie a acestui fenomen ar putea-o constitui rapida polimerizare a fibrelor
fusului de diviziuni ce generează un curent care respinge structurile neataşate spre regiunea
ecuatorială a celulei.
Cele două forţe de respingere şi atracţie, spre polii celulei, acţionează asupra
cromozomilor şi după alinierea lor în placa metafazică, ceea ce justifică permanenta reajustare
a poziţiei lor prin mişcarea oscilatorii de mică amplitudine.

4.1.7.3. Translocarea cromozomilor anafazici

Desăvârşirea replicării centromerilor şi separarea cromatidelor surori ale cromozomilor
metafazici marchează sfârşitul metafazei şi iniţiază o altă etapă a mitozei, anafaza. În anafază
au loc două evenimente distincte cu o desfăşurare simultană în timp.
Primul eveniment constă în deplasarea cromatidelor surori spre polii opuşi ai fusului de
diviziune şi constituie anafaza A. Pe parcursul anafazei A, fibrele kinetocorice se scurtează
prin disocierea de tubulină de la capetele (+) (fig. 62).

Fig. 62 – Deplasarea cromozomilor

spre polii opuşi ai celulei în anafază.

Mecanismul prin care cromatidele

ascensionează spre polii fusului de
diviziune nu este încă elucidat. Până în
prezent au fost elaborate trei modele
teoretice alternative ale acestui
mecanism.

103
 În primul model, rolul-cheie îl joacă anumite proteine kinetocorice cu activitate ATP-
azică similare dineinei şi kinezinei. Proteinele leaga capetele (+) ale fibrelor kinetocorice şi le
stabilizează. Energia eliberată prin hidroliză ATP asigură deplasarea de-a lungul fibrelor a
proteinelor kinetocorice cu funcţie ATP-azică, care antrenează în această mişcare întreaga
cromatidă. Prin deplasarea proteinelor sun expuse capetelor (+) ale fibrelor kinetocorice care
suferă depolimerizarea.
Elementul central al celulei de-al doilea model îl constituie depolimerizarea fibrelor
kinetocorice. Disocierea dimerilor de tubulină este însoţită de ruperea şi refacerea ciclică a
legăturilor dintre proteinele kinetocorice (ce nu prezintă activitatea ATP – azică) şi
microtubulii ce alcătuiesc fibrele kinetocorice. Aceste proteine manifestă probabil o afinitate
crescută pentru tubulina polimerizată.
În cel de-al treilea model, fibrele kinetocorice au numai rolul de a direcţiona deplasarea
cromatidelor. Forţa ce determină această mişcare este generată de alte structuri, cum ar fi un
sistem de filamente elastice ce interconecteză kinetocorii şi polii fusului de diviziune.
Al doilea eveniment îl constituie anafaza B şi este reprezentat de alungirea fusului
mitotic şi depărtarea centrilori celulari. Forţa ce determină acest proces este generată de
interacţiunea fibrelor polare antiparalele (din cele două semifusuri) ce se întrepătrund în
regiunea ecuatorială a fusului de diviziune.
Rezultatele cercetărilor efectuate au condus la elaborarea unui model al mecanismului
elongarii fusului de diviziune.
Modelul se bazează pe două elemente: polimerizarea fibrelor polare şi presupunerea
axistenţei unor proteine cu activitate ATP-azică, similare dineinei sau kinezinei.
Prin adăugarea dimerilor de tubulină la capetele (+) libere ale fibrelor polare antiparalele
acestea se alungesc şi se suprapun în regiunea ecuatorială a fusului de diviziune. Se presupune
că proteinele cu activitate ATP - azică sunt ataşate de fibrele polare ale unui semifus. Energia
eliberată prin hidroliza ATP permite deplasarea proteinelor de-a lungul fibrelor polare ce
alcătuiesc al doilea semifus. Fibrele antiparalele sunt împinse spre centrii celulari
determinând,în final, depărtarea lor.
Nu este exclusă posibilitatea ca prin interacţiile cu cortica celulară microtubulii din
fibrele asteriene să participe la deplasarea în direcţii opuse a polilor fusului, diviziune în
timpul anafazei B.

4.1.8.Transportul intracelular mediat de microtubuli

Organitele, veziculele şi particulele proteice nu se deplasează haotic în spaţiul

intracelular. Ele sunt transportate în anumite situsuri, pe direcţi şi cu viteze caracteristice. În
stricta orientare a transportului intracelular un rol-cheie îl joacă microtubulii.
Iniţial, studiul implicării acestor elemente de citoschelet în transportul intracelular a
folosit, ca sistem experimental, celulele nervoase. Această alegere se baza pe faptul că
ribozomii sunt absenţi din axoni neuronilor, prezenţa proteinelor şi a organitelor celulare fiind
rezultatul unui proces de transport de la situsurile de sinteză, din corpul celular, spre regiunea
sinaptică. Procesul poartă numele de transport axonal anterograd. În paralele, în axon are loc
şi un transport retrograd în care sunt antrnate vezicule ce conţin fragmente de membrană şi
proteine citosolice. Acestea se deplasează dinspre terminaţiile sinaptice spre corpul celular,
unde vor fi degradate de către enzimele lizozomale.
Transportul axonal anterograd a fost pus în evidenţă prin injectarea aminoacizilor
marcaţi radioactiv şi urmărirea, prin metode autoradiografice, a proteinelor libere sau
incorporate în organitele celulare ce îi conţineau. Experimentul a demonstrat că deplasarea
proteinelor, veziculelor şi a organitelor nu are loc cu aceeaşi viteză. Cu cea mai mare viteză
(3mm/sec) sunt deplasate particulele şi veziculele mici, în timp ce proteinele ce intră în
alcătuirea citoscheletului se deplasează foarte incet (fracţiuni de mm/zi).

104
 O valoare intermediară o are viteza de transport a mitocondriilor.
Tehnica microscopiei computerizate în contras de fază a permis vizualizarea asocierii
organitelor cu structuri celulare filamentoase şi deplasarea lor de-a lungul axonului. În unele
cazuri, se pot observa două organite deplasându-se de-a lungul aceluiaşi filament, în direcţi
opuse, fără a intra în coliziune. Aceasta indică faptul că fiecare filament transportor conţine
mai multe “benzi de transport “ pentru organitele celulare. Încercările de a caracteriza aceste
filamente au condus la concluzia că ele reprezintă, de fapt, microtubuli plasmatici.
În plus, studiul efectuat pe culturi de fibroblaste a demonstrat implicarea microtubulilor
în dispersarea veziculelor rezultate prin fragmentarea aparatului Golgi, pe parcursul mitozei,
şi reagregarea lor în interfaza ciclului celular.
Pentru a înţelege mecanismul transportului intracelular asociat microtubulilor, s-a
realizat un sistem experimental ce conţinea microtubuli obţinuţi prin autopolimerizarea
dimerilor necontaminaţi cu proteine asociate sau citosolice şi vezicule sinaptice izolate din
diferite tipuri celulare. S-a observat că atât legarea, cât şi deplasarea veziculelor necesită
prezenţa în sistem a ATP şi a unor proteine specifice cu funcţia ATP-azcă.
Una dintre aceste proteine este kinezina (380.000 Da). Molecula alcătuită din patru
lanţuri polipeptidice este capabilă să lege, printr-unul din capete, microtubulul, iar prin
celălalt capăt, vezicula transportată. În prezenţa ATP, kinezina de deplasează de-a lungul
microtubulului împreună cu vezicula pe care a legat-o. Proteina asigură transportul anterograd
al veziculelor, deoarece ea se deplasează întotdeauna de la capătul (-) al microtubulului spre
capătul (+) al acestuia. Modul în care kinezina utilizează energia eliberată prin hidroliza ATP
pentru a asigura transportul veziculelor de-a lungul microtubulului este încă neelucidat (fig.
63).

Fig. 63 a) Transportul
anterograd al veziculelor de-a
lungul microtubulilor mediat de
kinezină; b) Imobilizate pe
suprafaţa unei plăci de sticlă,
moleculele de kinezină
deplasează microtubulul
asociat spre capătul său (-).

Responsabilă de transportul
retrograd al veziculelor este o
proteină asociată cu microtubulii
plasmatici numită MAPIC
(1.000.000 Da) sau dineină
citoplasmatică. În mod similar
kinezinei, proteina MAPIC este
capabilă să lege microtubulul şi
vezicula de transport, dar ea se
deplasează dinspre capătul (+)
spre capătul (-) al microtubulului,
folosind energia rezultată din hidroliza ATP.

4. 2. Microfilamentele

Microfilamentele de actina sunt componente citoplasmatice prezente în toate celulele

eucariote. Atât în celulele musculare, cât şi în alte tipuri celulare ele sunt asociate cu o
proteină fibrilară, numită miozină. În citoplasma tuturor celulelor, cu excepţia celor
musculare, întâlnim microfilamentele izolate cu o distribuţie relativ difuză şi dinamică.

105
Acestea participă alături de microtubulii citoplasmatici şi filamentele inermediare la
organizarea stucturii complexe a citoscheletului. În fibrele de stress, inelele contractile şi
microvili, microfilamentele sunt fasciculate (asociate în mănunchiuri), ele îndeplinind atât un
rol structural, de susţinere, cât şi un rol dinamic, fiind implicate în mişcările celulare ce au la
bază mecanismul actină – miozină. În celulele musculare microfilamentele participă la
realizarea contracţiei musculare. Aceste forme diferite de organizare a microfilamentelor, cât
şi funcţiile asociate lor sunt determinate de tipul proteinelor ce leagă specific actina.

4.2.1. Microfilamentele de actină

Actina reprezintă principala componentă a microfilamentelor. Actinele, izolate din

diferite organisme şi tipuri celulare, au mase moleculare, conformaţie şi secvenţă de
aminoacizi similare. Acest fapt sugerează că genele codanate au evoluat dintr-o genă
ancestrală comună. La păsări şi mamifere există cel puţin 6 gene diferite ce codifică actina.
Din cele 6 proteină, 4 prezintă un grad înalt de omologie (din cei 375 de aminoacizi doar 6
sunt diferiţi).
Aceste proteine se numesc alfa actine. Fiecare specie moleculară de alfa actină este
prezentă exclusiv într-un singur tip de celulă musculară (din muşchii striaţi, miocard, muşchii
netezi ce delimitează vasele sangvine sau muşchii enterici ce mărginesc lumenul intestinal).
Celelalte 2 specii moleculare de actină notate cu beta şi gama au un grad de omologie mai
scăzut şi sunt prezente în citoplasma tuturor tipurilor celulare.
Încercările de izolare şi caracterizare a acestor proteine au evidenţiat faptul că numărul
tipurilor de actine este mai mare decât cel al genelor care le codifică. Se apreciază că
modificările posttranslaţionale (acetilarea aminoacizilor din segmentul amino-terminal,
metilarea unui rest de histidină) sunt responsabile de apariţia unui număr atât de mare de
specii moleculare.Experimentele in vitro au demonstrat că moleculele de actina purificate din
diverse surse sunt capabile să copolimerizeze şi că toate stimulează activitatea ATP - azică a
miozinei. Deşi, încă, nedemonstrat experimental, este posibil ca speciile moleculare de actină
să manifeste o afinitate diferită faţă de proteinele citoplasmatice cu care se asociază. Acest
lucru ar explica funcţiile diferite ale microfilamentelor.Actina este un polipeptid cu o masă
moleculară de 42.000 Da. Aspectul globular al proteinei justifică denumirea de actină
globulară sau actină G.
La o concentraţie ionică similară cele existente în spaţiu intracelular actina G
polimerizează, în vitro, generând filamente de actină, numite actină fibrilară sau actină F.
Filamentele de actină obţinute în vitro sunt identice cu microfilamentele izolate din celule.
În filament moleculele de actină G, având caracter polar, se asociază cap la coadă
formând un helix monocateran cu o grosime aproximativ de 7 nm. Pe fiecare tur de helix se
găsesc două molecule de actină. Fiecare monomer este orientat perpendicular pe axa helixului
stabilind interacţii puternice cu cei doi monomeri situaţi în imediata vecinătate şi interacţii
slabe cu moleculele de actină G dispuse la dreapta şi la stânga sa de-a lungul helixului (fig.
64).

Fig. 64 – Modelul molecular al

actinei fibrilare (actina F).

Atât polaritatea subunităţilor

componente, cât şi stricta orientare a
acestora în structura helicoidală conferă polaritate filamentului de actină. Dinamica
microfilamentelor aminteşte de cea a microtubulilor. Adăugarea monomerilor sau disocierea
lor pot avea loc la oricare din capetele microfilamentului, dar viteza cu care se desfăşoară
reacţiile de polimerizare şi depolimerizare la capătul (+) este de 5-10 ori mai mare decât la
capătul (-).

106
 Similar dimerilor de tubulină ce stabilesc interacţii puternice cu GTP, monomeri de actină
leagă strâns ATP. Hidroliza ATP are loc imediat după încorporarea actinei G în
microfilament. Posibilele structuri cap ATP sau ADP nu influenţează polimerizarea
monomerilor şi aceasta se datorează, în mare parte, faptului că la concentrarea ionică
intracelulară (0,15M,KCI) este favorizată polimerizarea actinei. Pe de altă parte, concentraţia
intracelulară a monomerilor liberi este mult mai mare decât concentraţia critică. În consecinţă,
microfilamentele sunt structuri mult mai stabile decât micro tubulii. Această stabilitate este
accentuată prin ataşarea de microfilamente a proteinelor asociate.

4.2.2. Miozina

Miozina este o proteină cu largă răspândire în celulele organismelor eucariote. Până în

prezent se cunosc 2 specii moleculare ale acestei proteine. Miozina tip I este absentă în
celulele musculare, ea fiind implicată în fenomenele de motilitate celulară, ce au la bază
mecanismul actină- miozină. Miozina de tip II se găseşte atât în celulele musculare din
muşchii striaţi şi netezi, cât şi în alte tipuri celulare. Datorită rolului pe care miozina de tip II,
din celulele musculare, îl joacă în contracţia musculară, ea a constituit subiectul numeroaselor
cercetări experimentale.
Miozina de tip II (470.000 Da) este alcătuită din 6 lanţuri polipeptidice dintre care 2
lanţuri grele (230.000 Da/lanţ) şi 2 perechi de lanţuri uşoare (20.000 Da/lanţ).
Lanţurile grele sunt identice. Fiecare este format dintr-o regiune alfa heicoidală cu o
lungime de 30 nm, numită coadă şi o regiune globulară carboxi – terminală, cu diametrul de 4
nm, numită cap. Regiunile alfa helicoidale ale celor 2 lanţuri grele sunt răsucite una în jurul
celeilalte, în timp ce regiunile globulare rămân separate.
Perechile de lanţuri uşoare sunt ataşate celor două regiuni globulare. Lanţurile uşoare ce
alcătuiesc o pereche sunt identice între ele, dar diferite de lanţurile celeilalte perechi.
În structura de miozină II se remarcă existenţa a două puncte de flexiune ce marchează
domeniile structurale ale prote (fig.65).

Fig. 65 – Modelul molecular al miozinei. Molecula este alcătuită din două lanţuri
grele şi două perechi de lanţuri uşoare. Lanţurile grele prezintă câte o regiune amino –
terminală globulară, numită cap şi o regiune α – helicoidală, carboxi – terminală,
numită coadă. Molecula prezintă două puncte de flexiune.

Primul punct de flexiune este situat în regiunea alfa hericoidală, în timp ce al doilea
separă capul bilobat de coada moleculei. Miozina poate fi scindată la nivelul punctelor de
flexiune sub acţiunea unor enzime cu activitate proteazică. Chimotripsina scindează miozina
în două domenii. Primul domeniu, meromiozina grea (HMM) conţine capul bilobat şi un
segment din coada lanţurilor grele, iar al doilea domeniu meromiozina uşoară (LMM),
cuprinde segmentul aminoterminal al cozilor. Prin tratarea domeniului HMM cu papaină
segmentul de coadă este degradat şi sunt eliberate fragmentele S1, ce conţin câte un cap
globular şi perechea de lanţuri uşoare asociate acestuia.
Fragmentele S1, prezintă activitate ATP – azică. Pe regiunea globulară ce formează
capul lanţurilor grele ale miozinei, sunt localizate atât situsurile de legare ale ATP cât şi cele
pentru actină.

107
 Studiile biochimice au evidenţiat faptul că în prezenţa filamentelor de actină activitatea
ATP – azică a miozinei este stimulată; viteza de hidroliză a ATP creşte de 200 de ori.
Moleculele de miozină polimerizează generând filamente de miozină. Polimerizarea
implică agregarea cozilor moleculelor de miozină. În celulele nemusculare, filamentele de
miozină au dimensiuni mici (diametru 60 Å) şi caracter tranzitoriu, ceea ce face dificilă
vizualizarea lor la microscopul electronic.
Organizarea în filamente a miozinei a fost pusă în evidenţă, pentru prima oară, în
celulele musculare unde ele au o structură particulară şi sunt numite filamente groase.
Filamentele groase (diametru 150-200 Å) conţin 500-600 molecule de miozină. Orientarea
moleculelor în filament imprimă acestuia un caracter bipolar. Fiecare filament este alcătuit
dintr-o regiune centrală şi 2 regiuni terminale.
Regiunea centrală are un caracter exclusiv fibrilar fiind formată prin suprapunerea
cozilor antiparalele ale moleculelor de miozină. În cele 2 regiuni terminale, capetele
moleculelor de miozină se ataşează de jur-împrejurul filamentului, determinând îngroşarea
acestuia.

4.2.3. Rolul actinei şi miozinei în contracţia musculară

Mecanismul actină – miozină stă la baza unui tip particular de mişcare celulară, realizată
de structuri specializate din muşchii striaţii, netezi şi cardiaci şi care poartă numele de
contracţie musculară.
Muşchii striaţi primesc o inervaţie motorie somatică. Datorită inserţiilor osoase ei
asigură deplasarea şi păstrarea poziţiei corpului.
Musculatura netedă prezintă o inervaţie vegetativă. Muşchii netezi înconjoară organele
interne, fiind prezenţi la nivelul intestinului gros şi subţire al vezici biliare şi al vaselor
sangvine. Contracţia şi relaxarea muşchilor netezi asigură deplasarea alimentelor de-a lungul
tractului digestiv şi controlează diametrul vaselor sangvine. Spre deosebire de muşchii striaţi,
cei netezi se contractă mai lent, tensiunea dezvoltată fiind menţinută pe o durată mai mare de
timp.
Muşchii cardiaci se aseamănă din punct de vedere structural cu cei striaţi, dar se află ca
şi muşchii netezi sub controlul inervaţiei vegetative. Prin contracţia lor, sângele este pompat
în circuitul sanguin.

4.2.4. Actina şi miozina în celule nemusculare

Filamentele de actină din celulele nemusculare au un pronunţat caracter tranzitoriu.

Formarea reţelei de microfilamente este reglată de factori proteici şi concentraţia ionilor de
Ca.
Una dintre cele mai importante proteine ce influenţează procesul de polimerizare a
actinei, în aceste celule, este profilina. Proteina se leagă de monomerii de actină formând un
complex numit profilin-actină. Deoarece profilina blochează etapa de nucleaţie, complexul
este incapabil să polimerizeze spontan. În plus modul de legare a profilinei la monomer face
imposibilă legarea complexului la capătul (-) al unui filament de actină preexistent,
polimerizarea putând avea loc doar la capatul (+) al acestuia. După legarea profilin-actinei la
capatul (+) al filamentului de actină, profilina este eliberată creând posibilitatea adăugării unui
alt complex şi alungirii filamentului. În mod obişnuit, capetele (+) ale filamentelor de actină
sunt ancorate în membrana plasmatică şi/sau stabilizate prin proteine asociate. În acest caz,
profilina blochează complet polimerizarea actinei (fig. 66).

108
 Fig. 66- Rolul profilinei în polimerizarea actinei, în celulele nemusculare.

Reglarea procesului de polimerizare şi depolimerizare a actinei prin ionii de Ca este

mediată de cel putin două proteine similare ca structură şi funcţie: vilina şi gelsolina. La o
concentraţie citosolică mare a ionilor de Ca, proteinele rup filamentele lungi de actină,
rămânând ataşate la capătul (+) al fiecărui fragment, împiedicând astfel reasamblarea
filamentelor.
O dată cu scăderea concentraţiei Ca2+, vilina (nu şi gelsolina) este capabilă să accelereze
procesul de polimerizare al actinei.
Ambele proteine joacă şi un rol structural, interconectând filamentele de actină în
mănunchiuri.
Filamentele de miozină din celulele nemusculare sunt mult mai mici (10-20 molecule)
decât cele din celulele musculare. Molecula de miozină se aseamană cu cea din muşchii
netezi. Activarea funcţiei sale ATP-azice necesită fosforilarea lanţurilor uşoare şi este reglată
de complexul calmodulină – Ca2+.
Din celulele nemusculare au fost izolate şi proteine asociate intalnite în celulele
musculare, dintre care : tropomiozina şi alfa-actinina. Prezenţa calmodulinei, ca proteină
reglatoare, explică absenţa complexului troponinic din celulele nemusculare.

4.2.4.1. Microvilii
Microvilii sunt expansiuni ale celulelor epiteliale ce delimitează lumenul intestinal şi al
tubului contort proximal în rinichi. Ei contribuie la mărirea cu 25% a suprafeţei de absorbţie a
celulelor epiteliale. Structuri necontractile, microvilii sunt alcătuiţi dintr-o regiune centrală şi
o reţea terminală (fig. 67).
Regiunea centrală este reprezentată de un manunchi de filamente de actină dispuse
paralel. Ele indeplinesc un rol structural, menţinând forma microvilului. Filamentele prezintă
aceeaşi polaritate. Capetele (+) sunt indreptate spre vârful microvilului.

109
 Fig. 67- Structura microvililor.Elementul central îl reprezintă mănunchiul de
filamente de actină.Filamentele sunt interconectate prin proteine de legare şi ancorate în
membrana plasmatică ce delimitează microvilul prin proteina 110 Kda şi
calmodulina.Filamentele de actină fasciculate se extind din corpul microvilului în
reţeaua terminală unde sunt stabilizate prin intermediul unor proteineconectoare
(fodrina, spectrina etc.).

Din regiunea centrală lipsesc miozina, tropomiozina şi alfa actinina. În schimb, au fost
izolate alte proteine asociate filamentelor de actină, dintre care fimbrina şi vilina. Ambele
proteine au rolul de a stabiliza filamentele în mănunchiuri.
Cea mai interesantă proteină, asociată filamentelor de actină din microvili, este o
proteină similară miozinei de tip I, proteina 110, cu activitate ATP-azică. Impreună cu
calmodulina, proteina leagă filamentele de actină de la exteriorul manunchiului de membrana
ce delimitează microvilul. Se apreciază ca tensiunea generată de proteina similară miozinei de
tip I asigură menţinerea în poziţie centrală a mănunchiului de filamente.
La polul bazal, regiunea centrală este ancorată într-o reţea terminală, alcătuită din
filamente scurte de actină şi proteine asociate. Filamentele din reţeaua terminală
interconectează filamentele de actină din manunchi şi leagă mănunchiurile între ele. Acelaşi
rol îl joacă şi fodrina, principală proteina asociată, prezentă în reţeaua terminală.

4.2.4.2. Rolul actinei şi miozinei în citokineza

Filamentele de actină şi miozina joacă un rol in desfaşurarea citokinezei la celulele
animale. Ele alcătuiesc o structura contractila, cu caracter tranzitoriu, numita inel contractil,
localizat imediat sub membrana plasmatică la nivelul şantului de clivare.
În inelul contractil , flamentele scurte bipolare de miozina şi filamentele de actină sunt
organizate în microsarcomere similare celor din muşchii striaţi, dar mult mai mici, din care
lipsesc discurile Z. Filamentele de actină şi minisarcomerele adiacente sunt legate prin alfa-
actinina şi probabil şi alte proteine asociate.
Inelul se contractă prin mecanismul actină-miozina. Simultan are loc un proces de
depolimerizare a filamentelor de actină, ceea ce determină micşorarea continuă a diametrului
inelului contractil şi, in final, separarea toatală a celor 2 celule fiice rezultate prin diviziunea
celulară.

110
 4.2.4.3. Mişcarea ameboidala
Mişcarea ameboidala este un tip particular de locomoţie întalnită frecvent la protozoare,
dar comuna şi altor tipuri celulare dintre care şi celulelor ce intra în alcatuirea organismului
uman : macrofage, fibroblaste, limfocite.
Miscarea ameboidala se realizează prin emiterea şi retracţia continuă a unor prelungiri
celulare şi are la baza tranzitia reversibila a hialoplasmei din stare de gel în stare fluidă (sol).
Studiile electronomicrodcopice, efectuate iniţial pe protozoare şi ulterior extinse la
celulele din organismul uman ce prezintă acest tip de locomoţie, au pus in evidenţa existenţa a
2 regiuni diferite ale citoplasmei.
Regiunea centrală, numită endoplasmă, conţine particule şi organite celulare aflate intr-
o permanenta mişcare. În această regiune hialoplasma se găseşte în starea de sol.
În regiunea distală a prelungirilor celulare, imediat sub membrana plasmatică, este
localizată ectoplasma. Lipsită de organite celulare, ectoplasma conţine o reţea tridimensionala
de filamente de actină. Filamentele sunt interconectate prin proteine ascociate. Una dintre
acestea este filamina, o molecula flexibilă alcatuită din 2 lanţuri polipeptidice, prezentă în
nodurile reţelei. Alte proteine asociate filamentelor de actină din ectoplasma sunt alfa actinina
şi gelsolina (fig. 68).

Fig. 68 – Filamina leagă

filamentele de actină, favorizând
formarea unei reţele tridimensionale.

Studiul emiterii şi retractiei

prelungirilor celulare numite pesudopode,
la protozoare a demonstrat
interconvertibilitatea celor 2 regiuni
ceitoplasmatice. Pe parcursul formarii
pseudopodelor, are loc deplasarea
endoplasmei din centrul celulei în
prelungirile celulare. În regiunea distala a pesudopodului endoplasma se transformă în
ectoplasma prin tranziţia sol-gel a hialoplasmei. Procesele inverse au loc în momentul
retractarii pseudopodelor.
Se apreciază ca treansformarea reversibilă a endoplasmei în ectoplasma este controlată
de celula şi reglată prin concentraţia intracelulară a ionilor de Ca şi pH. Aceşti doi factori
afectează organizarea filamentelor de actină în cele 2 regiuni citoplasmatice printr-un
mecanism încă suficient elucidat, în care un rol important par să-l aibă proteinele asociate.
Filamina şi alfa actinina, proteine implicate în formarea şi stabilizarea reţelei filamentelor de
actină , asigură probabil tranziţia hialoplasmei în starea de gel. O dată cu creşterea
concentraţiei intracelulară a ionilor de Ca, filamentele de actină sunt scindate de gelsolina,
reţeaua se dezorganizează şi hialoplasma trece în stare de sol.
Dintre celulele din organismul uman ce se deplaseaza prin miscarile ameboidale, cele
mai bine studiate sunt fibroblastele. Fibroblastul emite continuu, pe direcţia miscării m
prelungirii celulare, numite lamelipode. În timpul deplasării, unele lamelipode aderă la
substrat , prin intermediul unor structuri specializate, numite placi de adeziune sau contacte
focale. Alte lamelipode se întorc spre partea dorsală a corpului celular.Pe parcursul deplasării,
corpul celular lasa în urmă o coadă numită fibră retractilă.Fibra rămâne aderentă la substratul
pe care se realizeaza mişcarea fibroblastului , fiind supusă în acelaşi timp tensiunii generate
de ondulatiile de suprafata. Acţiunea conjugată a acestor 2 forţe conduce la elongarea fibrei
retractile.
În final, forţa ce asigură înaintarea fibroblastului determină fie detaşarea fibrei de
substrat, fie ruperea ei şi ulterior retracţia cozii în corpul celular (fig. 69).

111
 Fig. 69 – Schema deplasării
fibroblaştilor.

4.2.4.4.Fibrele de stress
În ataşarea de substrat a
fibroblastelor cultivate in vitro
rolul principal revine fibrelor de
stress. Fibrele de stress sunt
manunchiuri paralele de filamente
de actină, localizate în regiunea
citoplasmatica aflată în
proximitatea plasmalemei aflată
în contact cu substratul. În zonele
de contact, filamentele de actină
apr a fi inserate în membrana
plasmatică.
Alaturi de actină în fibrele
de stress sunt prezente : miozina,
alfa-actinina, tropomiozina şi proteina reglatoare miozin-LC kinaza. Se sugereaza ca
filamentele de actină şi miozina sunt organizate în microsarcomere, tenşiunea generata prin
mecanismul actină –miozina determinand aplatizarea fibroblastelor în culturi. Cercetarile
experimentale au confirmat această ipoteză.
Îndepartarea celulelor de pe substrat este însoţită de înlocuirea fibrelor de stress cu o
reţea de filamente de actină şi revenirea celulei la forma sferică. Reintroducerea fibroblastelor
în cultura este urmată la cateva ore de reorganizarea fibrelor de stress, ataşarea celulelor de
suport şi aplatizarea lor.

4.3. Filamente intermediare

Filamentele intermediare sunt elemente de citoschelet mai groase decât
microfilamentele de actină şi mai subţiri decât microtubulii.
Iniţial, ele au fost puse în evidenţa în celulele muschilor striaţi , unde formeaza o
matrice ce înconjoară şi interconecteaza discurile Z. Ulterior, au fost identificate şi în alte
tipuri celulare (celule epiteliale, mezenchimale şi neuroni).
În celule, filamentele intermediare se pot gasi în ectoplasma, ancorate în structuri
periferice (desmozomi) sau situate în prelungirile celulare (axoni).

4.3.1. Proteine ce alcătuiesc filamentele intermediare

Ca şi microfilamentele de actină şi microtubulii, filamentele intermediare sunt rezultatul

polimerizarii subunitaţilor proteice. Spre deosebire de actină G şi tubulina, proteinele ce
formeaza filamentele intermediare sunt specifice pentru un anumit tip celular.
La vertebratele superioare s-au identificat 5 tipuri de molecule proteice distincte ce intra
în constituţia filamentelor intermediare :
ƒ vimentina (57 000 Da) ;
ƒ desmina (55 000 Da) ;
ƒ neurofilamentele (trei specii moleculare : NF1 70 000 Da ; NFm 150 000 Da; NFh 210
000 Da);
ƒ proteina gliala fibrilara acida( GFAP 50 000 Da) ;
ƒ citocheratinele (peste 30 de specii moleculare).

112
 Diversitatea proteinelor ce alcătuiesc filamentele intermediare nu constituie singurul
aspect ce le diferenţiază de subunitaţile proteice ale microfilamentelor de actină şi
microtubulilor. Cele cinci tipuri de proteine prezintă caracteristici structurale comune, fiind
formate dintr-o regiune centrală alfa helicoidala şi 2 domenii globulare, de mărimi variabile,
în regiunile carboxi- şi amino- terminale. Deosebirile există şi în maniera în care proteinele se
asociază în filamente (fig. 70).

Fig. 70 – Nivele de asamblare ale filamentelor intermediare.

Subunitatile proteice formează dimeri prin înfaşurarea stransă una în jurul celeilalte, a
regiunilor centrale, în timp ce capetele globulare rămân separate. În dimeri, subunităţile sunt
orientate paralel. Aceleaşi regiuni centrale par a fi responsabile de asocierea dimerilor în
tetrameri dar la acest nivel de agregare dimerii sunt antiparaleli. Prin legarea cap la cap a
tetramerilor se formează protofilamentul, iar 8 protofilamente generează filamentul
intermediar. S-a constatat că vimentina, desmina, proteina gliala fibrilara acidă şi NF1
formează homopolimeri. În celulele în care genele ce codifică vimentina şi desmina se
coexprima, proteinele copolimerizează. Cele 30 de tipuri de citocheratine sunt împarţite în 2
clase distincte : acide şi bazice /neutre. În filamentele de keratina raportul dintre
citocheratine de tip I şi cele de tip II este de 1 :1.
Studiul polimerizarii în vitro a monomerilor ce alcatuiesc filamente intermediare a
demonstrat că acest proces nu necesită consum de energie metabolică.
Modul de ordonare al subunitaţilor proteice în filamente imprimă acestora un caracter
apolar. Deci, spre deosebire de microfilamentele de actină şi microtubuli, filamentele
intermediare au capete echivalente funcţional; polimerizarea şi depolimerizarea se desfaşoară
cu aceeaşi viteza la ambele extremitaţi. Cercetările experimentale au demonstrat că în condiţii
fiziologice, 1% din proteine ce formează filamentele intermediare se găsesc sub formă de
monomeri liberi, în timp ce 99 % dintre acestea sunt asociate în filamente.
Raportul dintre subunităţile libere şi polimerizate exprimă caracterul mult mai stabil al
filamentelor intermediare comparativ cu microfilamentele de actină şi microtubulii.

113
 4.3.2. Tipuri de filamente intermediare şi semnificatia lor funcţională

Filamentele de vimentina sunt prezente în celulele mezenchimale ( celule endoteliale ale

vaselor sangvine) şi unele celule epiteliale. În celulele epiteliale filamentele de vimentina sunt
ancorate în desmozomi, contribuind la creşterea rigidităţii ţesutului epitelial. În adipocite
filamentele înconjoară picăturile lipidice, împiedicandu-le să fuzioneze între ele sau cu
membranele celulare. În toate tipurile celulare filamentele de vimentina sunt fizic legate de
membrana nucleară, fiind probabil implicate în coordonarea spaţială a nucleului celular.
Se constată existenţa unei strânse asocieri între filamentele de vimentina şi microtubuli.
Studiile efectuate de fibroblasti cultivaţi in vitro au demonstrat ca în celulele aflate în mitoza,
filamentele intermediare înconjoară manunchiurile de microtubuli ce formează fibrele fusului
de diviziune. Cele 2 tipuri de filamente sunt interconectate prin proteine, înca neidentificate.
Tratarea acestor celule cu colchicina a condus la dezasamblarea microtubulilor urmată de
deplasarea filamentelor de vimentina ce se organizează în manunchiuri în apropierea
nucleului. Acest experiment sugerează rolul important pe care microtubulii îl au în
organizarea filamentelor de vimentina.
Filamentele de desmina se întalnesc în toate tipurile de celule musculare. Filamentele
din celulele muşchilor striaţi formează o reţea ce strabate întreaga miofibra şi care leagă
discurile Z între ele, de membrana plasmatică şi, posibil , de unele organite
celulare(mitocondrii). Se apreciază că filamentele de desmina joacă, în principal, un rol
structural, susţinand discurile Z şi miofibrele.
Neurofilamentele sunt prezente exclusiv în axonii celulelor nervoase. În corpul celular
cele trei polipeptide (NF1, NFm şi NFh) se asamblează în filamente şi se asociază cu
microtubulii.. Complexele neurofilamentate-microtubuli se deplasează în axon, conferindu-i
acestuia stabilitate.
Filamentele gliale sunt caracteristice celulei gliale. Filamentele de cheratină sunt
întalnite în celulele epiteliale. Ancorate în desmozomi, filamentele de cheratina formează în
celula epiteliala o reţea ce asigură rezistenţa epiteliilor la factori mecanici. Se apreciază ca
fiecare tip de celula epiteliala conţine un complement chitocheratinic specific.

4.4. Reţeaua microtrabeculară

În celulă, microfilamentele, microtubulii şi practic toate celelalte componente
subcelulare sunt conectate de un sistem de microteabecule (mici bare). Reţeaua
microtrabeculara a fost descrisă la mărimi de circa 300.000x în citoplasma celulelor
examinate la microscopul de înalt voltaj (peste 1.000.000. de volţi) care generează electroni
rapizi ce pot penetra secţiuni relativ groase. Microtrabeculele (4mm) pot fi expresia
fenomenului de gelificare când filamentele de actină se leagă încrucişat unul de altul. În
consecinţa unii autori contestă realitatea lor biologică considerandu-le un artefact; alţii,
dimpotrivă, le atribuie rol de suport al materiei biostructurale ( Eugen Macovschi, 1958).

4.5. Proteinele asociate citoscheletului

O serie de proteine sunt asociate citoscheletului, oferind una din cheile înţelegerii
structurii şi funcţiunii acestuia. Sunt bine cunoscute în prezent circa 14 proteine asociate cu
actina (acrinogelina, acumentina, ankirina, brevina, caldesmona, filamina, fimbrina, fodrina,
fragmina, gelsolina, profilina, vilina, vinculina, calmodulina), 9 proteine asociate cu
filamentele intermediare (prekeratine, desmina, filagrina, plactină, proteină fibrilară acidă
glială, proteinele neurofilamentelor, şinemina, titina, vimentina) şi 7 proteine asociate cu
microtubulii (clatrina, dineina, MAP, MAP1, MAP2, nexina,) prezente predominant în
anumite celule şi având proprietăţi diverse.

114
 Capitolul 5

ORGANIZAREA NUCLEULUI ŞI EXPRESIA ACTIVITĂŢII

GENELOR

Nucleul reprezintă compartimentul care încorporează genomul nuclear, deci el conţine

aproape întreaga informaţie genetică. În situaţia aceasta, el îndeplineşte funcţiile de păstrare în
condiţii de securitate a ADN-lui, de transmitere nealterată a acestei informaţii descendenţilor,
de reglare şi control a activităţii celulei, prin semnale ce sunt recepţionate de molecula de
ADN.

În esenţă, funcţiile fundamentale ale nucleului se rezumă la două procese bazate pe

existenţa în acest compartiment a genomului celular şi anume:
- replicarea ADN, proces complex prin care molecula de ADN se autoreproduce şi
dă naştere la copii identice, ce vor fi transmise celulelor fiice; replicarea are loc
în faza S (de sinteză) a ciclului celular;
- transcripţia ADN, proces la fel de complex, prin care informaţia conţinută în
secvenţa ADN, este realizată prin sinteza moleculelor de ARN. ARN apare fie ca
produs finit cum ARN ribozomal (ARNr) şi ARN de transport (ARNt), fie ca
produs intermediar ARN mesager (ARNm), care urmează să transmită mesajul de
la ADN în sinteza proteinelor, necesare funcţiilor vitale ale celulei.
Transcripţia ADN se desfăşoară pe toată perioada interfazei şi este blocată în faza
M (mitoza).

5.1. Morfologia şi structura nucleului

Nucleul este constituit dintr-un înveliş (nucleolema, anvelopa nucleară), o materie
internă, cromatina şi unul sau mai mulţi nucleoli care se găsesc în substanţa de fond,
nucleoplasma (matricea). El există la toate celule organismelor eucariote, mai puţin la
eritrocitele vertebratelor superioare, unde este eliminat printr-o exocitoză în cursul
eritropoezei.
Nucleul este constituentul esenţial al celulelor eucariote fără de care existenţa lor ar fi
compromisă. ADN-ul cromozomilor este astfel organizat, încât o parte din secvenţele de baze
purinice şi pirimidinice reprezintă cadrul după care sunt transcrise diferite mesaje sub formă de
ARN, cealaltă parte a ADN-ului cromozomial are, probabil, rol în reglarea activităţii
transcripţionale.
Secvenţele de baze purinice şi pirimidinice se păstrează de-a lungul generaţiilor de celule
datorită replicării semiconservative a ADN cromozomial.
Tot în nucleu au loc sintezele diferitelor ADN-uri care, trecând în citoplasmă, constituie
aşa numitul aparat de biosinteză proteică (fig. 71).

115
 Fig. 71. Diagrama structurii nucleului.

5.1.1. Învelişul nuclear

Pe faţa internă a membranei nucleare se distribuie, la nucleul vertebratelor, o împâslire

de fibre fine, groasă de circa 200 - 600 Ả, care menţine rigiditatea nucleelor. Studiind
raporturile învelişului nuclear, se observă că membrana externă, citoplasmatică, dezvoltă
prelungiri scurte sau chiar tubuli care fac legătura cu reticulul endoplasmatic. Aria externă a
nucleului este acoperită cu ribozomi; în plus, în multe cazuri apar aglomerări juxtanucleare de
mitocondrii furnizoare de energie.
Datorită grosimii sale, membrana nucleului este invizibilă la microscopul fotonic. Însă o
parte din cromatină este dispusă sub membrana nucleului, astfel că pe secţiunile de ţesuturi
colorate, liziera de cromatină perinucleară apare colorată, indicând şi limita externă a
nucleului.
La microscopul electronic se observă bine că membrana nucleului este dublă, prezentând
pe faţa sa internă din loc în loc, îngroşări de care se prind fibrile cromatinei. Cromatină se mai
ancorează şi la exteriorul inelelor şi chiar la granulul central. Totalitatea acestor fibre de
cromatină constituie cromatină perinucleară .
O funcţie importantă a învelişului nuclear constă în schimburile nucleoplasmatice, chiar
dacă nu toate categoriile de molecule îl străbat .
Astfel, prin învelişul nucleilor izolaţi nu trec glicogenul şi ovalbumina, în schimb trec
tripsina, ribomeleaza, DNA-aza, histonele, polianionii ca heparina şi Hb şi bineînţeles,
nucleotidele şi aminoacizii, „în vivo", ionii străbat în ambele sensuri învelişul nuclear, astfel că
înăuntrul nucleelor se acumulează o cantitate dublă de Na+ şi K+ faţă de citoplasmă .
Aminoacizii, monozaharidele şi dizaharidele (GM sub 500) pătrund prin dubla membrană
nucleară, iar prin pori trec riboproteine sub formă de ribozomi, dar şi ribonuclează sau feritină.
De regulă, calea de trecere transmembranară este urmată de molecule mici de tipul Fe
coloidal, dar s-a observat că şi o serie de substanţe elaborate de reticulul endoplasmatic pot
trece din el în spaţiul perinuclear (anticorpii antiperoxidazici ai hemocitoblaştilor).

116
 Prin „înmugurirea" membranei exterioare a nucleului se formează lamele inela-te în
citoplasmă, care sunt purtătoare de ribozomi sau ARN încorporat în membrane .
La nucleele celulelor reproducătoare, atât de la plante cât şi de la animale, se pot observa
înmuguriri ale învelişului nuclear care dau naştere la vezicule ce pătrund în citoplasmă unde,
dezorganizându-se eliberează conţinutul de nucleoproteine. Prin granulul său central, polul
opune totuşi o rezistenţă difuziei libere a diferitelor molecule în valoare de 1Ω/cm2.
Moleculele cu sarcină electrică pozitivă trec uşor din citoplasmă în nucleu, însă cele
încărcate negativ sunt oprite de inelele porilor de care se leagă .
EM s-au observat ieşind helixuri de ribonucleoproteine prin porii nucleelor de amibe, iar
prin porii nucleelor glandelor salivare de chironomide trec granule de 200 - 400 Å diametru, tot
de ribonucleoproteine. Ribonucleoproteinele ajunse în citoplasmă reprezintă diferiţi ARN m,
precum şi fracţiile 18 S, 25 S, 5 S ale ARN v asociate cu proteinele lor specifice.
Însăşi ca numărul porilor poate creşte sau scade dă o indicaţie asupra rolului lor în
reglajul transferului de informaţie care, în mare, se realizează de la nucleu către citoplasmă
prin mesageri dar şi de la citoplasmă spre nucleu prin proteine histonice şi nonhistonice, printre
nonhistonice figurând unele enzime.
Este bine cunoscut faptul că, sub acţiunea fitohemaglutininei, limfocitele în cultură se
transformă în limfoblaşti. Fitohemaglutinina acţionează asupra unor receptori membranari care
activează AMP-cicloza, producând cAMP. Acest nucleotid ciclic stimulează o proteinkinaza,
care produce o proteină ce pătrunde în nucleu. Acolo determină o puternică activitate
transcripţională, sintetizându-se ARN m, ARN t şi ARN v care trec din nucleu în citoplasmă.
Astfel se asigură o intensă activitate de biosinteze citoplasmatice, dar şi de mitoze ale
limfoblaştilor.
Învelişul nuclear mai are şi rol de formarea lamelelor inelate . în telofază, când are loc
refacerea membranei nucleare pe seama reticulului endoplasmatic, rămâne un „surplus" de
membrane endoplasmatice fie incluse în nucleu, fie în citoplasmă din jurul acestuia.
Membranele respective se dispun paralel şi nu mai participă la reconstrucţia învelişului nuclear
din cauza rapidităţii ciclului celular. Asemenea membrane inelate se întâlnesc, de obicei, în
celule embrionare şi sexuale cu cicluri celulare scurte. În interfază, membrana exterioară a
nucleului înmugureşte spre citoplasmă vezicule care ulterior se desprind şi, aşezându-se cap la
cap, constituie lamele inelate. Prin contopirea acestora rezultă cisternele golgiene.
În alte cazuri, membrana exterioară a nucleului, după ce pierde ribozomii, înmugureşte
pe o porţiune anumită, dând naştere unei serii de vezicule. Acestea, cu timpul, se desprind şi
depunându-se în şiraguri, se contopesc formând cisterne golgiene. În timp ce se formează o
cisternă, pe faţa sa externă (uneori convexă) se dispune un alt şir de vezicule, şi aşa mai
departe, în asemenea mod luând naştere un dictiozom.

Porii
Dubla membrană este străbătută de pori având un diametru de circa 700 Å care conţine
fiecare câte un inel proteic ce limitează orificiul porului la 500 Å. Distanţa dintre centrele a doi
pori alăturaţi este de circa 1300 Å, sau un multiplu al acestui număr, existând întotdeauna o
legătură cu cromozomii interfazici, deoarece opt fibrile ale cromatinei se ataşează de marginile
fiecărui por . De fiecare por sunt asociate o serie de structuri care fac parte din matricea
nucleară .
Fiecare por cuprinde un material inelar, o diafragmă, un granul central şi un material
fibrilar. Materialul inelar cuprinde opt particule sferice proteice de circa 200 Å diametru
aşezate pe fiecare faţă a porului; acest material îşi modifică structura în funcţie de
metabolismul celular.

117
 Dilatările şi contracţiile porilor se explică prin adiţia, respectiv pierderea proteinelor
constitutive ale inelului. Diafragma este o substanţă densă, amorfă din interiorul porului, care
se întinde spre centrul lui, unde se află un granul central riboproteic de 250 Å diametru. De el
se leagă fibrilele de 50 Å diametru, care fac legătura cu particulele sferice interne şi externe ale
porului. O fibrilă încercuieşte lumenul porului la interior, solidarizând astfel materialul său
fibrilar ( fig. 72; fig. 73).

Fig. 72. Structura

porului nuclear: a( structura
octogonală a complexului
nuclear al porului în
membrana nucleară; b) o
secţiune verticală a
complexului; granula centrală
apare numai în anumiţi pori.

Fig. 73. Secţiune prin

porul nuclear care prezintă
schematic şi ipotetic sub formă
de cilindru, tunelul care ar
exista în structura porului şi
prin care moleculele sunt
transportate în interiorul sau
exteriorul nucleului.

5.1.2.Matricea nucleului

Reprezintă o structură proteică formată dintr-o reţea de fibrile foarte strânse şi fine, care
umplu complet spaţiile dintre blocurile mai mici sau mai mari de cromatină. Matricea nucleului
poate fi văzută la microscopul fotonic prin tratarea celulelor cu alfaamanitină. Acest alcaloid
produce în două ore contracţia cromatinei, iar după fixare şi colorare cu hemalaun-enzimă, la
microscopul fotonic se observă cum matricea este separată de blocurile cromatinei contractată,
prin conturări clare, necolorabile (deci spaţii goale).
Matricea dintre blocurile cromatinei este Feulgen (-), deci nu conţine ADN şi se
colorează slab cu albastru de toluidină, hemalaun sau verde luminos, deci nu conţine grupări
fosfatice multe. Matricea rezistă bine la „digestia" cu RN-ază, dar poate fi uşor solubilizată cu
pepsină, ceea ce indică un conţinut predominant proteic.
Tratarea nucleilor izolaţi din culturi celulare (Hela - S3) cu tampoane bogate în săruri,
DN-ază şi ditiotreitol a permis izolarea unei structuri de natură proteică asemănătoare ca aspect
cu cea a nucleului, dar „golită" de cromatină care a fost digerată cu DN- ază.
Analizele ultrastructurale şi biochimice indică faptul că matricea constă din elemente
membranare şi fibrilare cu o compoziţie chimică de 87% proteine, 12% fosfolipide, 1% ADN,
0,1% ARN. Proteinele separate prin electroforeză în strat subţire de dodecil-sulfat de sodiu
(SDS) în gel de poliacrilamidă s-au dispus în 30 - 35 de benzi cu GM între 14.000 - 20.000.
Matricea este reprezentată prin două clase de peptide majore, cu o greutate maximă cuprinsă
între 14.000 - 18.000 şi respectiv 45.000-75.000.

118
 În celulele sincronizate (aduse la aceeaşi fază a ciclului celular) se constată că în toate
fazele ciclului celular au loc sinteze de polipeptide matriceale, dar ele sunt mai reduse în faza
S/G2 (divizibil). După diviziunea celulară, în lipsa biosintezei proteice, vechile polipeptide cu
GM cuprinsă între 45.000 - 75.000 persistă după mitoză şi refac noua matrice a nucleului
interfazic.
Cercetările de histochimie EM, combinată cu analiza electroforetică a proteinelor
matriceale, au permis fundamentarea teoriei fibrilare a matricei nucleare (D. Comings şi T.
Okada, 1978). După extragerea cromatinei nucleelor hepatocitelor de şoarece cu soluţii saline
concentrate şi tratate apoi cu DN-ază şi TRITON X-100 rămâne numai matricea, cu o structură
fibrilară, care este reprezentată prin porii şi lamina fibrilară a învelişului nuclear, componenta
fibrilară a nucleolilor şi matricea intranucleară propriu-zisă.
E.M., matricea nucleară este compusă din fibrile proteice de 20 - 30 Å, denumite
matrixină. Ele se asociază în fibre mai groase, de 100 - 300 Å.
Separarea electroforetică a matrixinei evidenţiază trei benzi polipeptidice cu greutatea
maximă 65.000, 67.000 şi 68.000. Peste tot matrixină se leagă de fibrile de cromatină, ea având
un rol principal în organizarea acestor fibre în cromomerele cromozomilor mitotici şi meiotici.

5.1.3.Proteinele contractile nucleare

Au fost evidenţiate în diferite tipuri de nuclee din care s-au extras cromatină. Apoi din
cromatină s-au izolat mai departe proteinele nonhistonice, prin electroforeză . În felul acesta s-
au putut separa: miozina (G.M. 200.000), actina (G.M. 45.000), tropomiozina (G.M. 34.000) şi
subunităţile sale.
Comparându-se conţinutul în miozina şi actină din cromatină hepatocitelor şi cea a
neuronilor, se constată că în ficat miozina este în cantitate de 1,8 mai mare ca în creier şi actina
de 2,3 ori. Este foarte probabil ca activitatea transcripţională a hepatocitelor în mesager (ARN
m) ai actinei şi miozinei să fie de două ori mai mare ca în neuroni.
Există deci un raport invers proporţional dintre conţinutul actinei cromozomale şi
activitatea transcripţională. Probabil, actina exercită o represie asupra cromatinei, prin
condensarea ei la maximum, făcând-o astfel netranscripţională. Se pare că actina nu se leagă
direct cu ADM ci realizează un anumit tip de condensarea cromatinei.

5.1.4.Cromatina

Toţi nucleii prezintă în interfaţă regiuni extrem de împachetate ale fibrelor cromozomale .
Nucleii interfazici fixaţi şi coloraţi cu coloranţi bazici (albastru de toluidină, de metilen, Azur
A etc.), care colorează cromatina, o evidenţiază sub formă de particule mai mari sau mai mici
şi împlântate în matrice, ca o pătură subţire cromatică pe faţa internă a învelişului nuclear şi
una sau mai multe blocuri în jurul nucleonului. Aspectul general al cromatinei este asemănător
la nucleii aceluiaşi tip celular, dar variază în anumite limite după fixarea folosită .
Astfel, cromatina se poate prezenta sub formă de grămezi sau grămăjoare de granule fine
şi prelverulente, până la o reţea cu unele noduri ceva mai groase. Aspectul variază după tipul
de celulă şi gradul ei de activitate metabolică, dar şi ci specia considerată .
Examenul electrono-microscopic al cromatinei arată ca ea este formată din fibre
împachetate - filamente nucleoproteice - cu traiectorie spiralată şi cu diametrul variabil. In
zonele mai groase fibrele au diametrul de 200 - 500 Å, pe când în zonele subţiri de numai 60 -
100 Å. între grămezile de cromatina se găsesc spaţii intercromatiniene, colorate slab cu
coloranţi bazici, în care se mai află o serie de structuri:
ƒ fibrile cromatiniene, distanţate unele de altele şi fără traiecte spiralate;
ƒ fibrile pericromatice, de 30 - 50 Å diametru, care mărginesc blocurile de cromatina;
ƒ granule intercromatiniene, de 250 Å diametru, formate din tasări de fibrile pericro-
matiniene. Asemenea granule sunt rezistente la DN-ază şi numai după tratare cu pronază
119
 pot fi digerate după aceea cu DN-ază. Asemenea granule intercromatiniene par a fi trei
forme succesive de ARN m şi ARN v care ies din nucleu în citoplasmă unde rămâne câtva
timp inactive datorită proteinelor pe care le conţin
ƒ granule pericromatiniene situate la periferia cromatinei, mari de 450 Å diametru şi
înconjurate de un halou clar care le separă de masa fibrelor cromatinei. Asemenea granule
sunt formate din fibrile de 30 Å diametru, foarte neregulate ca traseu, ce depăşesc uneori
marginea granulelor . Ele sunt tot de natură ribonucleoproteică şi au rol în transmiterea
unor informaţii în sens invers, adică de la ARN la ADN;
ƒ corpii spiralaţi din regiunile intercromatiniene, care reprezintă împachetări de fibrile
răsucite, de 400 - 600 Å diametru, asociate sub formă de agregate sferice de 0,5µ. Ele sunt
tot de natură ribonucleoproteică şi mai conţine şi nişte fibrile subţiri, de 50 Å, care se
înfăşoară în jurul axului lor.
Cromatina se găseşte sub două forme: eucromatină, considerată ca fiind acea parte din
cromatină cu fibre fine şi uniforme repartizate în nucleu, active în replicarea ADN şi în
transcripţia ARN şi heterocromatina rezultată compactizarea cromatinei sub formă de granule
şi grămezi de diferite mărimi. Este intens colorabilă în roşu prin reacţia Feulgen pentru ADN şi
albastru când se tratează cu coloranţi bazici.
Studiile comparative de ME efectuate la plante şi animale au arătat că structuralizarea
cromatinei se prezintă, funcţional şi evolutiv, diferit la plante şi animale. Astfel, în nucleii de
Arabidopis cromatină formează cromocentre (cromozomi heterocromatici sau porţiuni de
cromozomi care rămân condensate şi astfel colorabile în interfază); la Viscum album
heterocromatina este reprezentată tot prin cromocentre, în schimb eucromatină formează
cromomere şi cromonemate mai subţiri decât heterocromatina, dar la fel de intens colorabile.
La Hedera helix, nucleii meristematici prezintă blocuri mari de heterocromatina condensată
printre eucromatină decondensată, sau nucleii adulţi, care printr-o subreplicare (replicare a
numai unei părţi din genom) devin tetraploizi (4n), suferă o cădere apreciabilă a cantităţii de
heterocromatina condensată . în acest caz, eucromatină nu mai este activă în replicarea ei,
probabil, numai în transcripţie .
Între speciile de plante există o variaţie a cantităţii de cromatină condensată prin faptul
că atât heterocromatina, cât şi eucromatină se condensează.
Condensarea eucromatinei este determinată la plante de cantitatea de ADN a speciei
date, precum şi de compoziţia acesteia. Variaţia cantităţii de cromatină din nucleii unei specii
de plante este expresia replicării diferenţiale a heterocromatinei, care este în întregime
constitutivă şi nu se exprimă prin condensări şi decondensări funcţionale în raport cu
activitatea fiziologică a celulelor .
La mamifere, însă celulele cu o activitate mitotică intensă sunt complet eucromatice,
adică cu cromatină decondensată. La aceeaşi cantitate de ADN în ţesutul considerat, coexistă
nuclee cu cromatină decondensată, mase de cromatină şi nuclee cu aproape toată cromatină
condensată. În toţi aceşti nuclei cromatină condensată este constitutivă, Giemsa + şi
încorporează mai târziu timidină tritiată, deci are o replicare întârziată - expresie a inactivării
diferenţiale a cromatinei.
O stare de condensare completă a cromatinei se întâlneşte la eritrocitele nucleate ale
nemamiferelor şi care este total nereplicativă, ca şi în nucleii spermatozoizilor. La animale,
gradul condensării cromatinei este dependent de funcţia celulei, fiind specifică unei activităţi
tisulare anumite. Heterocromatina transcrie o foarte mică cantitate de ARN.
Dat fiind complexitatea problemei, este necesar de schiţat o clasificare a aspectelor pe
care la prezintă condensarea şi decondensarea cromatinei:
Termenul de „heterocromatina" se foloseşte pentru heterocromatina constitutivă, care
ocupă o regiune permanent condensată din cromozom şi a cărei localizare este identică la
cromozomii analogi. Aceasta conţine o mare cantitate de ADN respectiv (secvenţe de baze care
se repetă), se replică după eucromatină, nu transcrie ARN şi se colorează diferit;

120
 Termenul de „heterocromatina facultativă" exemplifică cromozomul X, inactiv, al
femelelor de mamifere, care apare heteropicnotic în interfază, adică foarte condensat şi
colorabil (cromatina sexuală). La fel sunt şi cromozomii X sau Y din celulele sexuale ale unor
insecte care se aglomerează în corpusculi Feulgen +. Acest tip de heterocomatină se
caracterizează prin prezenţa unor proteine care modifică ADN făcându-l total inactiv, deoarece
caracterele localizate pe un singur cromozom X - genele recesive - sunt singurele care se pot
manifesta; aceasta deoarece cromozomul Y la mamifere a suferit o inactivare genetică prin
heterocromatinizare, astfel că genele de pe X au devenit semizigote la mascul.
Termenul de „cromatina condensată" semnifică eucromatina inactivată în mod specific
de proteine, cum este cazul limfocitelor inactive, al eritrocitelor nucleate, al spermatoizilor etc.
Prin stimularea celulelor cu lecitine, acestea se transformă în celule blastice (tinere), iar
cromatina se decondensează şi ADN-ul poate sintetiza diferiţi ARN mesageri .

5.1.5.Organizarea moleculară a fibrelor de cromatina. Nucleozomii

Organizarea moleculară a fibrelor de cromatina este realizată prin dublu helix al ADN şi
prin diferite proteine (histone, protamine, nonhistone foarte variate). Analiza cromatinei
interfazice realizată prin metoda precipitării cu magneziu, arată că ADN este 19,4%, ARN 14%
şi proteinele 66.6% . Dintre proteine, 30,6% sunt solubile în 0,2 MH2SO4 .
Considerând că fiecare cromozom este format dintr-un singur dublu-helix de ADN,
spiralizat la rândul său însă de câteva ori, s-a putut calcula că lungimea totală a ADN tuturor
cromozomilor complet despiralizaţi dintr-un nucleu este, în medie. De un metru la mamifere .
Când volumul nucleului respectiv este în jur de 15 µ3, se pune întrebarea cum este posibil să
încapă un metru ADN, oricât ar fi el de subţire (20 Å), într-un volum atât de mic? Mai mult
chiar, existenţa ADN cromozomal în micul volum oferit de nucleu asigură o serie de funcţii şi
roluri ale cromozomilor cum sunt replicarea şi reparaţia materialului genetic (ADN), precum şi
transcrierea diferitelor ARN etc. La această întrebare s-a răspuns prin teoria structurii
nucleozomale a cromozomilor.
O serie de cercetări din ultimii 10 ani (P. Oudet şi Ada Olins, R.D.Kornberg, A. Klug) au
dus la concluzia existenţei în nuclee a unor corpusculi numiţi nucleozimi. Ei sunt compuşi
dintr-un miez histonic, în jurul căruia se înfăşoară dublul helix al ADN . întregul dublu helix al
ADN al fiecărui cromozom se înfăşoară pe un şir enorm de asemenea corpusculi hiostonici,
într-un mod neîntrerupt, adică de la un capăt la celălalt al cromozomului. Această situaţie
sugerează imaginea unor mărgele înşirate pe aţă. ADN ar reprezenta aţa, iar miezul histonic ar
fi mărgelele. Numai că în cazul structurii nucleozomale, corpusculul nu este străbătut de
helixul dublu al ADN, ci acesta se înfăşoară în jurul corpuscului. Miezul histonic al
nucleozomilor este constituit din patru clase histonice: H4, H3, H2A şi H2B, având un conţinut
de 25% lizină, arginină şi histidină. Moleculele histonice H4 şi H3 sunt identice la toate
speciile, în schimb moleculele H2A şi H2B au o mai mică fidelitate, cu toate că porţiunea fără
caracter bazic a rămas nemodificată. Miezul nucleozomului este reprezentat printr-un set de opt
molecule histonice, şi anume, câte două din clasa H4, H3, H2A şi H2B; miezul este deci, un
octamer histonic. Acest complex, de histone, numit octamer, ce constituie miezul nucleosomic,
este înconjurat la exterior de două spire ale ADN-ului cromozomal, constituit din 166
nucleotide. Legătura dintre doi nucleozomi succesivi se face printr-un segment de dublu helix
ADN cu o lungime variabilă de câteva zeci de perechi de nucleotide care este asociat cu o
moleculă de histonă H1. Molecula H, (H, din nucleii eritrocitelor de pasăre) este diferită de
celelalte clase histonice, deoarece este de două ori mai mare cu o bazicitate crescută la 37%, cu
un conţinut ridicat de lizină, alanină şi valină, s-a arătat că, în soluţii tampon cu o concentraţie
ionică medie, regiunile mijlocii şi carboxiterminale ale moleculelor celor 5 clase histonice (H1,
H2A, H2B, H3, H4) sunt globulare (fig. 74).

121
 Fig.74 - Structura nucleozomilor.
Nucleozomii sunt formaţi din două
spire de ADN (ture) care înfăşoară
un miez („core”) format din 8
molecule de histone (câte 2 de
fiecare tip de histonă (H2A,H2B,H3
şi H4). Nucleozomii sunt legaţi între
ei de un fragmant de ADN „linker”
care nu este legat de proteine.Prin
hidroliză enzimatică nucleozomii se
separă conţinând ADN de aprox.
146 pb.

Moleculele histonice se pot

separa una de alta şi apoi reasocia
experimental, toate sau o parte din ele,
pentru a se cunoaşte rolul fiecăruia în
ansamblul molecular nucleozomal.
Nucleonii au formă sferică şi un diametru de 100 Å. În urma digestiei prelungite a
cromatinei, cu nucleoză, urmată de purificare, rezultă particule lipsite de histonă H1 care
conţine 140 ± 10 perechi de baze de ADN. Variabilitatea lungimii de la 180 la 250 perechi de
nucleotide este determinată în exclusivitate de variabilitatea lungimii segmentului
internucleosomic.
Localizarea şi asamblarea celor 8 molecule histonice în miezul nucleosomic sunt cu
aproximaţie cunoscute. Partea centrală a octomerului histonic este formată dintr-o unitate
tetramerică (2H3+2H4). Octomerul histonicare formă de inimă, datorită aranjamentului sub
formă de disc al tetramerului 2H3 - 2H4, care formează partea centrală şi vârful inferior al
inimii şi asocierii sale cu cei doi dimeri (2H2A şi 2H2B) spre a forma cele două vârfuri
superioare ale inimii.
Octomerul este probabil stabilizat în urma interacţiunii capetelor C - terminale hidrofalse
ale histonelor care, fiind globulare, se angrenează spre a constitui partea centrală a
octomerului, pe când, capetele N - terminale, bogate în arginină şi lizină rămân la periferie sub
forma unei cozi care interacţionează cu ADN ce se înfăşoară în jurul miezului sub forma
aproape două (l şi 3/4) tururi super helicale negative.
Studiile de reconstituire de cromatină în care s-au format cele patru fracţii histonice ce
alcătuiesc miezul nucleosomic, în diferite combinaţii, au condus la obţinerea unor date care
confirmă aranjamentul stabilit de histonele în alcătuirea nucleosomilor.
Nici o combinaţie de histone nu se poate realiza atunci când se omit histonele H3 şi H4,
cel mai puternic asociindu-se aceste histone bogate în arginină a căror secvenţă de aminoacizi a
fost puternic conservată în decursul evoluţiei. Interacţiunile dintre moleculele H3 şi H4 sunt
foarte puternice şi ele conferă miezului nucleosomal o formă specială de glugă, deci
controlează starea conformaţională a complexului de molecule.
Toate histonele, cu excepţia hi se leagă şi neutralizează sarcinile negative numai pe o
parte ale dublului helix ADN, pe partea opusă fiind încă prezente repulsii de aceeaşi sarcină,
permiţând astfel plierea ADN în jurul miezului histonic. Cromatina lipsită de histona H1 nu
prezintă o structură regulată. Când din cromatină se extrage H1 şi este menţinută la puteri
ionice scăzute, nucleosonii sunt încă distribuiţi de-a lungul matrixului ADN la aproximativ 200
perechi de baze, dar au un aspect mai puţin regulat şi ADN nu mai intră în şi iese din miezul
nucleosomic la acelaşi punct, ci la puncte opuse. Dacă puterea ionică este ridicată peste 40mM
NaCl, cromatina se condensează în aglomerări, nu în structuri helicale.

122
 Aceste cercetări sugerează că histona H1 are un rol structural şi este esenţială pentru
nivelele superioare de organizare a cromatinei.
Constituenţii de bază ai cromozomului eucariot sunt fibrile de cromatina de 100 şi 300 Å
diametru. Dacă cromatina intactă care conţine toate histonele este menţinută la o concentraţie
scăzută de săruri (1mM NaCl), acestea se prezintă ca o structură destul de deschisă, cu
nucleosonii bine definiţi, cu ADN ce intră şi iese din direcţii opuse la un acelaşi punct. Această
formă s-a numit filament nucleosomal, având diametru de 100 Å.
În prezenţa unor concentraţii saline apropiate de tonicitatea celulară, lanţul nucleosomal
formează suprastructuri helicoidale cu ture de către şase nucleozomi. Sunt aşa numiţii solenoizi
sau supersuperhelix, care pot fi văzuţi la microscopul electronic; diametru unei structuri super-
superhelix sau solenoid este de 250 - 300 Å.
În cromozomii metafazici s-au evidenţiat (Back, 1979) fibre ce circa 400 Å diametru care
s-ar forma prin condensarea fibrelor de 250 - 300 Å diametru, rezultând o structură supra-
solenoidală care s-a numit fibra-unitară (unit-fiber). Prin plierea acestei fibre rezultă
morfologia cromozomului metafazic.
În cromozomi, cromatina este ancorată la un schelet proteinic care formează partea
centrală a întregii structuri cromozomale.
Dacă din cromozomi sunt eliminate histonele şi asemenea - se vizualizează EM, acest
schelet proteinic împreună cu ADN formează un „halou" de circa 4.000 bucle de aproximativ
40.000 - 90.000 perechi de baze lungime, bucle care pornesc cu o ramură dintr-un punct al
scheletului proteinic şi se întorc cu cealaltă ramură într-un punct adiacent acestuia. Când se
reasociază cu histone, ADN-ul formează structuri moniliforme (structură nucleosomală). O
condensare ulterioară produce fibra de 100 Å, apoi fibra de 300 Å (solenoizii) care la rândul lor
sunt organizate, de asemenea, în fibre cu configuraţii helicale de ordin superior. Pornind de la
ADN, condensarea generală este de 5.000 - 8.000 ori până la 250.000 de ori în cromozomul
metafazic.
Aşa se explică cum moleculele de ADN extinse de la nivelul cromozomilor
complementului cromozomal uman având o lungime totală de 164 - 170 cm (aproximativ 2 m)
pot fi adăpostite la nivelul celor 46 de cromozomi a căror lungime totală este de până la 200
µm. La fel se explică şi în cazul mamiferelor posibilitatea cuprinderii moleculei de ADN care
alcătuieşte cromozomii într-un volum nuclear foarte mic.
Ierarhia de helixuri a fibrei de cromatina porneşte de la dublu helix ADN care se
condensează de şapte ori în nucleosom, fibra nucleosomală se spiralează la rândul ei de cinci
ori în solenoid şi de 40 de ori ca suprasolenoid. Aceasta se mai condensează încă de cinci ori,
aşa încât în cromozomul metafizic condensarea ajunge la un nivel mediu de 7.000 ori.
Prin „digestia" cromatinei cu eudonucleoza micrococală s-au obţinut particule
nucleosomală monomerice de care sunt asociate ADN-polimerazele, care împreună cu alte
enzime (fosfoprotein-fosfatazele acide şi neutre, enzimele de restricţie şi reparaţie, RN-azele,
proteazele etc) şi diferite proteine de structură, sunt clasate în aşa-numitele proteine
nonhistonice. Studii biochimice au arătat că în nucleu, ca şi în mitocondrii şi cloroplaste, se
găsesc o serie de ADN-polimeraze prin care se realizează replicarea semiconservativă a ADN.

5. 2. Replicarea ADN la eucariote

Deoarece ADN conţine informaţia genetică a celulei, sinteza sa este unul dintre cele mai
importante evenimente din viaţa acesteia . Realizată prin intervenţia unui complex aparat
enzimatic, sinteza ADN, este o reacţie de tip selectiv, reprezentând singurul caz din lumea
biomoleculară în care o substanţă îşi dirijează propria sa sinteză .
Replicarea acizilor nucleici stă la baza reproducerii vieţii, orice sistem biologic realizând
sinteza replicativă de ADN ca o precerinţă a reproducerii sale. Complementaritatea celor două
catene a dublului helix ADN a sugerat lui Naston şi Crik modelul semiconservativ de
replicare. Aşa cum a arătat Batson (1976), mecanismul replicării este asemănător

123
mecanismului cheie-broască, vrând să sugereze, prin acest sistem dual mecanic,
complementaritatea structural-funcţională a celor două catene ADN, fiecare servind drept
model, drept matriţă, pentru sinteza unei noi catene complementare care se numeşte replică.
Termenul de REPLICARE derivă de la cuvântul englezesc „to replicate" = a copia (fig. 75).

Fig. 75 - Înlănţuirea bazelor într-o

singură catenă de ADN.

Sinteza unei noi molecule de

ADN se realizează aşadar printr-un
proces de copiere, unic în lumea
macromoleculelor şi în lumea vie, proces
care se numeşte replicare. Replicarea
este caracteristică doar acizilor nucleici.
Aceştia prezintă o structură uimitor de
potrivită pentru realizarea replicării în
care, dintr-o moleculă iniţială iau naştere
două molecule identice între ele şi
totodată identice cu molecula iniţială.
Astfel, molecula iniţială îşi „topeşte"
identitatea în cele două molecule fizice
care derivă din ea şi care sunt identice ei.
Se asigură, pe de o parte reproducerea
fidelă şi continuitatea fenomenului
ereditar de-a lungul generaţiilor (fig. 76).

Fig. 76. a). Schema simplificată a

replicării semiconservative.

Bazele din cele două catene ADN

(vechi sau noi) sunt complementare.Când
ele se separă în cursul replicării,sunt
adăugate bazele complementare la
catenele vechi pentru a forma catenele
noi (fiice).Acest model asigură ca
moleculele noi de ADN să fie identice cu
cele vechi. b). Replicarea la eucariote (se
realizează bidirecţional; de la o singură
origine (O) se formează două furci de
replicare în direcţii opuse).

În condiţiile vieţii actuale,

replicarea acizilor nucleici nu poate avea loc decât în celule, fie procariote, fie eucariote.
Replicare acizilor nucleici virali nu poate avea loc în virion - particulă virală naturală - ci
numai în celula gazdă în care au pătruns în timpul infecţiei virale.
Este, de asemenea, remarcabil pentru lumea vie faptul că nu se poate crea „de -novo" nici
o moleculă de ADN, sinteza replicativă a ADN implicând existenţa obligatorie a unei molecule
preformate care participă direct în reacţie, având loc formarea a două molecule fiice, identice
cu molecula preformată. Continuitatea este asigurată de faptul că în moleculele nou formate
intră şi câte o catenă din molecula iniţială, astfel că moleculele fiice vor avea o catenă veche -

124
cea care a funcţionat ca matriţă şi o catenă nouă sintetizată - replicarea complementară a
matriţei. Moleculele fizice de ADN moştenind doar una din cele două catene ale moleculei-
mamă, mecanismul de replicare se numeşte semiconservativ.
In vivo sinteza acizilor nucleici se desfăşoară în trei etape:
a.) sinteza precursorilor nucleotidelor purinice şi pirimidinice adică a acidului inozinic şi
respectiv acidului uridilic ;
b.) sinteza nucleotidelor propriu-zise care intră direct în alcătuirea macromoleculei
acizilor nucleici:
ƒ dezoxiadenozintrifosfat - d ATP ;
ƒ dezoxigreananozintrifosfat - d GTP ;
ƒ dezoxicitidintrifosfat - d CTP ;
ƒ dezoxitimidintrifosfat - d TTP (pentru ADN) şi:
ƒ adenoziritrifosfat - ATP;
ƒ guanozintrifosfat - GTP;
ƒ citidintrifosfat - CTP;
ƒ uridintrifosfat - UTP pentru ARN.
c.) polimerizarea ordonată a nucleotidelor într-o secvenţă complementară unei matriţe
după modelul semiconservativ şi sub cataliza unor enzime polimerazice celulare.

5.2.1.Complexul de enzime polimerazice implicate în replicare

În desfăşurarea reacţiei de polimerizare este necesară prezenţa tuturor celor patru tipuri
de dezoxiribonucleide sub formă lor trifosfatică, absenţa numai a uneia dintre ele blocând
activitatea enzimei polimerizatoare.
La bacterii au fost descrise trei enzime ADN - polimerizatoare: ADN -polimeraza I
numită enzima lui Kornserg şi simbolizată Pol I, ADN - polimeraza II şi ADN - polimeraza III.
Deşi la început s-a crezut că ADN - pol I este implicată în reacţia de replicare, ulterior s-
a dovedit că doar ADN - pol III este enzima polimerizatoare în replicare, pe când ADN - pol I
joacă rol esenţial în repararea leziunilor produse în ADN de către diferiţi agenţi mutageni fizici
sau chimici. Funcţia ADN - pol II bacteriene nu este încă precizată, dar ea nu joacă rol esenţial
în replicare, putând, de asemenea, fi implicată în procesele reparatorii sau de recombinare.
La eucariote s-au descris mai multe tipuri de ADN polimeraze:
ƒ polimeraza alfa (α) - implicată în replicarea propriu - zisă; este responsabilă de 80% din
activitatea totală a enzimelor de replicare. S-ar părea că vertebratele au acelaşi fel de
polimeraza, iar nevertebratele una asemănătoare. Polimeraza a este constituită dintr-o
unitate catalitică de 150.000 daltoni, asociată cu 4 polipeptide de 54.000, 58.000, 61.000 şi
64.000 daltoni ce formează subunitatea heteropolimerică stimulatoare a regiunii catalitice
sau cu funcţie stabilizatoare a complexului ADN-polimeraza. - polimeraza beta (β),
implicată în reparare. Este prezentă la toate metazoarele, dar nu se întâlneşte la plante şi
protezoare, în timp ce a polimerază se află la toate celulele eucariate . O caracteristică
interesantă a β - ADN - palimerază este capacitatea de a folosi o matrice ribonucleotidică în
prezenţa unei „amorse" ADN. Această proprietate aminteşte de transriptaza inversă virală,
cu precizarea că enzima poate copia un ARN natural.
ƒ polimeraza gama (γ), care se pare a fi polimeraza mitocondrială, fiind prezentă şi în
mitocondrii, nu numai în nucleu.
ADN - polimerazele prezintă specificitate de direcţie, nu însă şi de secvenţă (nu recunosc
o anumită secvenţă specifică de baze azotate din ADN), deplasându-se pe ambele catene -
matriţă doar în direcţie dinspre 3' spre 5', catalizând formarea punţilor fosfodiestenice
(polimerizarea nucleotidelor) doar în direcţia 5' spre 3', astfel că totdeauna polaritatea replicei
este de sens opus polarităţii matricei, catenele complementare fiind deci antiparalele .

125
 Faptul că ADN - polimeraza nu are specificitate de secvenţă este dovedit de folosirea, în
reacţiile „în vitro", în calitate de matriţă, dar monocatene de ADN de orice proeminenţă ar fi
ele. ADN - polimeraza nu poate folosi ca matriţă ADN bicatenar.

5.2.2. Iniţierea replicării

Separarea celor două catene complementare - ce devin catene matriţă - în procesul de

replicare se realizează progresiv, astfel că, în desfăşurarea procesului, macromoleculele ADN
capătă forma literei „Y ", bifurcaţia sa numindu-se bifurcaţie de replicare şi reprezentând cele
două catene - matriţă ce-şi expun bazele în vederea împerecherii cu bazele azotate ale
nucleotidelor libere. La nivelul bifurcaţiei de replicare se desfăşoară procesele mecanismului
semiconservativ de replicare prin intervenţia unui complex aparat enzimatic.
Iniţierea replicării se face într-un punct de pe macromoleculă ADN numit originea
replicării. O asemenea secvenţă de origine se caracterizează (la toate sistemele biologice
analizate) G - C. La nivelul perechilor A - T are loc iniţierea separării celor două catene, aceste
perechi având doar două punţi de H, sunt mai uşor de separat comparativ cu perechile G - C
care având trei punţi de H sunt mai stabile .
În celule, macromoleculele ADN se află sub formă de structuri terţiene sau cuaternare,
iar cele circulare, cum sunt ADN bacterian, ADN mitocondrial, datorită superspiralizării
prezintă numeroase superrăsuciri. În vederea replicării, pentru a se permite înaintarea
bifurcaţiei de replicare de-a lungul circumferinţei moleculei, este necesară relaxarea
macromoleculei torsionate, prin superspiralizare. Această torsionare este înlăturată prin
acţiunea unei enzime care are capacitatea de a introduce crestături monocatenare tranziente în
duplexul ADN, ceea ce permite rotaţia liberă a unei catene, în jurul celeilalte. Această enzima
numită iniţial pivotază, enzima de creştere - închidere, enzima de relaxare pe ADN sau
UNWINDAZĂ, a primit în ultimul timp numele de TOPOIZOMERAZĂ - ADN.
Topoizomerazele introduc superspiralizări tranziente negative în ADN. Topoizomeraza este
alcătuită din două subunităţi luate de câte două ori, constituind un tetramer. Una din aceste
subunităţi funcţionează ca topoizomerază propriu-zisă, pe când cea de-a doua subunitate a
topoizomerazei acţionează ca ADN - GIRAZĂ sau PROTEINĂ OMEGA (Ω) introducând
tururi superhelicale în ADN nou sintetizat, refăcând starea superhelicală a moleculei fiice de
ADN . De aceea, metaforic s-a spus că topoizomerazele - ADN „desfac şi fac nodurile din
ADN". ADN-giraza superspiralizează ADN printr-un mecanism numit inversie de semn, în
care o superhelice pozitivă este direct convertită într-una negativă, printr-o creştere tranzientă
monocatenară a ADN bicatenar într-un anumit punct.
La eucariote s-a arătat că proteinele nonhistonice, desemnate HMG1 şi HMG2, pot
separa catenele dublului - helix ADN.
După intervenţia topoizomerazei care determină relaxarea ADN la nivelul originii
replicării, intervin enzime numite HELICAZE - ADN. Acestea realizează separarea catenelor
prin ruperea punţilor de H, folosind energia provenită prin defosforilarea ATP. Există şi
alternativa ca primul eveniment în separarea catenelor dublului helix să fie intervenţia la
punctul de iniţiere a replicării, a unei endonucleoze care, recunoscând în mod specific secvenţa
de nucleotide de la nivelul acestei origini, produce o „tăiere" a uneia dintre cele două catene -
tăiere care nu este altceva decât desfacerea unei legături covalente fosfodiesterice. În urma
acestei „creşteri" rezultă 2 extremităţi, una având gruparea 3' - OH şi alta 5' - fosfat. Energia
liberă de la nivelul acestei „creşteri" este suficientă pentru a desface încă 2-3 punţi de H,
moment în care se ataşează ADN - polimeraza - enzima polimerizatoare.
La E. coli, helicaza descrisă sub denumirea de proteină reparatorie se deplasează pe
monocatena ADN în direcţia 3' - 5', îndepărtând catena complementară. O altă helicaza numită
helicaza III se deplasează în direcţia 5' - 3', având o aceiaşi acţiune ca şi proteina reparatorie.
Proteine neenzimatice denumite UNWINDAZE sau proteine destabilizatoare ale dublului helix
(HDP), respectiv proteine de topire a ADN, intervin în asigurarea stabilizării monocatenelor,

126
nepermiţând, odată ataşate la ele, reasocierea monocatenelor complementare, astfel că acestea
să poată funcţiona ca matriţă.
După desfacerea structurii bicatenare în monocatenare şi stabilizarea monocatenelor la
nivelul originii replicării, intervine enzima PRIMAZA care determină sinteza unui scurt
segment de ARN care s-a numit ARN-PRIMER.

5.2.3. Primarea replicării

Toate enzimele ADN - polimerazice au capacitatea de a alungi catene polinucleotidice

deja existente, nu însă şi de a iniţia sinteza „de novo" a unei catene. Pentru aceasta, în
desfăşurarea polimerizării de nucleotide din cadrul replicării ADN, este necesară ca primă
etapă intervenţia unui ARN - polimeraze - enzima care are capacitatea de a iniţia sinteza „de
novo" de catene polinucleotidice, folosind ca model o catena - matriţă . Această intervenţie a
ARN - polimerazei în procesul de replicare a ADN apare ca un element ajutător, dar esenţial.
Prin activitatea ARN - polimerazei în procesul de iniţiere a replicării ADN se sintetizează un
scurt segment de ARN (primer).

5.2.4. Alungirea lanţului de ADN nou - sintetizat şi terminarea replicării

Capătul 3'-OH al fiecărui nucleotid aliniat pe matriţă, serveşte de fiecare dată drept
primer pentru activitatea de polimerizare a ADN - polimerazei.
Polaritatea opusă a catenelor - matriţă, 3' - 5' pe una şi 5' - 3' pe cealaltă, a ridicat
problema existenţei a două polimeraze care să catalizeze polimerizarea, una în direcţia 3' - 5',
alta în direcţia 5' - 3' . Dar, în ciuda tuturor încercărilor, nu au fost descoperite două ADN -
polimeraze care să polimerizeze în direcţii opuse. S-a stabilit cu certitudine că în replicare
intervine o singură enzimă polimerizatoare - la bacterii ADN - pol III, care se deplasează
numai în direcţia 3' - 5' pe ambele catene matriţă, determinând polimerizarea numai în direcţia
5' - 3'. În anul 1968, Okazaki şi colaboratorii au demonstrat prin experienţe de marcare
pulsatorie (contactul materialului biologic cu H - timidină este de foarte scurtă durată), că noile
catene complementare catenelor - matriţă sunt sintetizate pe segmente mici, care sau numit
fragmente OKAZAKI, având circa 1.000 - 2.000 nucleotide şi apoi aceste fragmente sunt unite
prin punţi fosfodiesterice sub acţiunea unei enzime numite ADN - ligaza, rezultând segmente
mai lungi. în ultimă instanţă, rezultă din unirea acestora din urmă catena nou sintetizată, replică
a matriţei.
Fiecare fragment Okazaki va fi primat, de un ARN - PRIMER, prin intervenţia primazei.
După sinteza fragmentului Okazaki, ARN - primer este îndepărtat prin excizie de către
un ADN - polimeraza I care are activitatea exonucleazică (de hidroliza legăturilor
fosfodiesterice). Golul rămas în urma exciziei ARN primer va fi umplut prin activitatea tot
ADN - pol I care va realiza completarea printr-o reacţie de polimerizare regională. În felul
acesta fragmentele Okazaki sunt asamblate fără ARN -primer.
Modelul de replicare discontinuă propus de OKAZAKI s-a dovedit a fi aplicabil la toate
sistemele biologice . Este posibil ca replicarea pe o catena să fie înaintată faţă de cea de-a doua
catena sau unirea fragmentelor OKAZAKI să fie mai rapidă pe o catena, numită catena
directoare (leading), pe când aceea cu sinteză încetinită se numeşte catena succesoare (lagging)
(fig. 77; fig. 78).

127
 Fig. 77 - Replicarea ADN. Se realizează în direcţia 5' - 3'. Catena leading se
sintetizează în mod continuu, catena lagging se sintetizează în mod discontinuu;
fagmentele Okazaki sunt unite de către ADN – ligază. În aceste condiţii şi pe catena
lagging sinteza are loc tot în
direcţia 5' - 3'.

Fig. 78 - Schema generală a

replicării în care fiecare enzimă
sau proteină auxiliară sunt
prezentate în mod individual.Ele
acţionează la nivelul furcii de
replicare.

5.2.5. Corectarea erorilor

de replicare

Replicarea ADN, fiind un

proces complex, care se desfăşoară
cu mare viteză, necesită ca
produşii rezultaţi să fie copiaţi cu
mare acurateţe, iar în cazul când s-
au introdus erori, în mod
accidental, ele să fie corectate
imediat.
La nivel molecular există
mecanisme care asigură corecţia
replicării şi care face ca un
nucleotid liber, greşit împerecheat
cu nucleotidul de pe matriţă să fie
excizat, altfel desfăşurarea
polimerizării este stopată (fig. 79).

128
 Fig. 79 - Schema reparării
ADN (înlocuirea dimerilor de
timină).

Acest sistem de corectare

postreplicativ, implică mai multe
etape şi mai multe enzime de
reparare:
- recunoaşterea bazei incorecte
introduse (deci a mutaţiei)
- îndepărtarea secvenţei lezate de
către nucleaze, fiind eliminate
de la 10, până la 50 nucleotide
- completarea regiunii excizate
cu o secvenţă corectă, de către
polimeraza I
- unirea fragmentelor pentru
stabilirea continuităţii catenei,
de către ADN – ligază (fig. 80).

Fig. 81 - Schema generală a sistemului de

reparare postreplicativ la bacterii, care
cuprinde cel puţin 4 etape: recunoaşterea
leziunii ADN; îndepărtarea de către nucleaze a
secvenţei lezate; completarea de către ADN-pol
I a întreruperii create în monocatena de ADN;
legarea celor două capete de către ADN -
ligază.

5.2.6. Unităţile de replicare

Numite şi repliconi - la procariote, reprezentaţi de cromozomul bacterian care

funcţionează ca unitate de replicare, la eucariote reprezintă acele regiuni ale ADN unde se
găsesc punctele de iniţiere (de origine) ale replicării. Spre deosebire de cromozomul viral şi
bacterian, cromozomul eucariotelor este o structură multirepliconică, fiind constituit din mai
mulţi repliconi (unităţi de replicare), complementar - matriţei ADN.
Acest segment de ARN s-a numit PRIMER, procesul în care are loc sinteza sa s-a numit
PRIMARE, iar ARN - polimeraza care catalizează asemenea sinteză s-a numit PRIMAZĂ.
Sinteza unei catene ADN, a replicei, începe deci de la primerul ARN, sub acţiunea ADN -
polimerazei care este eficientă în alungirea catenei polinucleotidice iniţiată prin sinteza
primerului ARN. ARN - primer oferă ADN - polimerazei capătul său de 3'-OH, care este liber
şi care pătrunde într-un sit special al acestei enzime numit SIT PENTRU CAPĂTUL 3'-OH Ah
PRIMERULUI. ADN - polimeraza realizează în cadrul acţiunii sale catalitice condensarea,
adică esterificarea grupei 3'-OH a primerului ARN cu grupa 5' - fosfat a primerului
dezoxiribonucleotid trifosfat aliniat pe matriţă în virtutea complementarităţii sale cu baza
azotată corespunzătoare din matriţă.

129
5.3. Transcripţia ADN sau sinteza ARN

5.3.1. Mecanismul general

Mecanismul prin care informaţia genetică, conţinută în molecula de ADN, se

materializează în sinteza proteinelor a fost elucidat în ultimii 40 de ani. Proteinele sunt
componente celulare care, de fapt, realizează toate activităţile ce au loc în celulă. Numărul
proteinelor este de aproximativ 109 – 1010 molecule/celulă, reprezentate de aprox. 10. 000 de
tipuri diferite. Desfăşurarea acestui flux informaţional apare sub denumirea de dogmă centrală
a biologiei moleculare ( 1960 – 1970 ). Această dogmă consideră că ADN transmite informaţia
la ARN şi de la ARN la proteine, după schema:

Transcripţie Translaţie
ADN ----------------→ ARN -------------→ PROTEINE
Mesager de transport
ribozomal
Temin şi Baltimore au stabilit (1970) că este posibilă transmiterea informaţiei şi de la
ARN la ADN, proces realizat de o enzimă (ce se găseşte de la virusuri până la eucariote)
denumită reverstranscriptază. În acest caz, ARNm reprezintă matricea (template) pentru
molecula de ADN, procesul fiind denumit reverstranscripţie şi astfel dogma centrală este
contrazisă. Din schema de mai sus, se observă că ADN nu intervine direct în sinteza
proteinelor. Transmiterea informaţiei se face prin ARNm, care este un produs intermediar, a
cărei funcţie este de a translata mesajul genetic în proteine. Acest proces de sinteză a ARN este
denumit transcripţia ADN, sinteza ARN sau expresia genică. Se foloseşte termenul de expresie
genică, pentru că o regiune din molecula de ADN reprezentată de o genă, când este activată,
transcrie un ARNm pentru o proteină dată.
Indiferent din ce celulă provine ADN (procariote sau eucariote) conţine mii de gene a
căror secvenţă corespunde, în întregime sau parţial, secvenţei aminoacizilor din proteine.
Secvenţa genelor din genomul celulelor procariote corespunde în întregime secvenţei
aminoacizilor din proteina pe care a codificat-o şi ele sunt numite gene coliniare (fig. 82). Spre
deosebire de acestea, genele din genomul celulelor eucariote sunt întrerupte de secvenţe care
nu vor fi regăsite în secvenţa proteinelor. Astfel, o genă (sau mai bine zis unitatea
transcriptibilă a genei) la eucariote este formată din două grupuri de secvenţe:
ƒ exoni, secvenţe care sunt transcrise în ARN precursor, sunt conţinute de ARNm şi sunt
regăsite în secvenţa aminoacizilor din proteină;
ƒ introni, secvenţe din genă, care sunt transcrise în ARN precursor, dar nu mai sunt conţinute
în ARNm şi deci nu se mai găsesc în secvenţa aminoacizilor din proteinele transcrise
(fig.83).
În prima etapă, gena este transcrisă în întregime într-o moleculă de ARN numită
precursor (pre-mesager sau ARN nuclear heterolog). Intronii sunt eliminaţi din molecula de
ARN precursor prin mecanisme speciale. În urma acestui proces, rezultă o moleculă de
ARNm, care conţine numai exoni şi a căror secvenţă serveşte pentru sinteza proteinelor. Astfel,
molecula de ARNm apare mult mai mică decât transcriptul primar – ARN heterolog.

Fig. 82 - Genă structurală care

corespunde exact secvenţei ARNm şi
proteinei sintetizate.

130
 Fig. 83 - Gene structurale eucariote intrerupte de introni. Din ARN precursor
intronii sunt îndepărtaţi, exonii sunt uniţi între ei (splicing) pentru a da naştere ARNm
sau matur, care prin translata proteina, în care secvenţele intronilor nu se mai regăsesc.

Majoritatea genelor pentru ARNt sau ARNr din genomul a numeroase eucariote conţin şi
ele introni care sunt eliminaţi din transcriptul primar. Chiar şi ADN mitocondrial conţine
uneori introni în genele care codifică toate tipurile de ARN. Sunt însă gene care nu au introni,
de exemplu, genele pentru histone, interferoni şi retrogenele (genele provenite din revers- sau
retrotranscripţia ARNm).

5.3.2. Elemente implicate în transcripţie

Transcripţia implică sinteza unui lanţ polinucleotidic de ARN care preia mesajul de pe
molecula de ADN. ARN este, ca şi ADN, un lanţ lung neramificat, format din cele patru
nucleotide (A,U,G,C) informaţia genetică a unei singure catene de ADN va fi transmisă la o
secvenţă complementară de ARN. În acest scop, cele două catene de ADN se vor separa,
temporar şi pe lungimi scurte, pentru ca una să servească de matrice pentru ribonucleotidele ce
vor fi aşezate complementar secvenţei catenei de ADN. Deci ARNm (ca şi celelalte tipuri de
ARN) sintetizat ca un lanţ monocatenar este complementar catenei de ADN care l-a transcris şi
este identic cu cealaltă catenă de ADN netranscrisă (fig. 84).

Fig. 84 - Transcripţia ADN. ARN polimeraza sintetizează ARN, copiind mesajul de

pe o singură catenă ADN. Opţiunea pentru catena ce va fi copiată este determinată de
poziţia promotorului în secvenţa ADN.

131
 Transcripţia ADN este un mecanism coplicat, care necesită un aparat de transcripţie. Pe
lângă ARN polimeraza specifică fiecărui ARN sunt implicate în acest proces numeroase
proteine auxiliare (factori de transcripţie) şi o serie de elemente de control existente în
structura ADN.

5.3.3. Aparatul enzimatic de transcripţie

Transcripţia ADN implică producerea a trei specii de ARN: ARN mesager (ARNm),
ARN ribozomal (ARNr) şi ARN de transfer sau de transport (ARNt). Procesul de transcripţie
este realizat de enzima ARN polimeraza. La procariote există un singur tip de ARN polimerază
care este responsabilă pentru sinteza celor trei specii de ARN. La E.coli numărul total de
molecule de ARN polimerază/celulă este de aprox. 7000. Angajate în transcripţie sunt probabil
2000-5000 de molecule.
Enzima completă sau holoenzima are o greutate moleculară de aprox. 480.000 Da şi este
formată din două componente: enzima core (de bază) şi factorul σ (sigma). Greutatea
moleculară a factorului σ variază de la 32000 la 92000 da. Enzima, pe lângă factorul σ, conţine
alte patru componente, codificate de gene distincte şi care au funcţii diferite în procesul de
transcripţie.
Iniţierea transcripţiei se face prin holoenzimă (enzima completă), factorul σ fiind
componenta implicată numai în recunoaşterea şi fixarea corectă a punctului de iniţiere.
Transcripţia odată iniţiată este continuată de enzima core, deoarece factorul σ nemaifiind
necesar , se desprinde de complex şi se asociază la o altă ARN- polimerază, care va începe
activitatea la un alt punct de iniţiere.
La celulele eucariote, aparatul de transcripţie este mult mai complex şi mai puţin
cunoscut decât la procariote. Într-o celulă eucariotă există trei tipuri de ARN- polimeraze
nucleare. Ele ocupă poziţii distincte în spaţiu nuclear şi fiecare tip de enzimă prezintă o
structură complexă. La eucariote, cele trei specii de ARN (ARNr, ARNm, ARNt) sunt
transcrise, fiecare, de către un tip de polimerază, şi anume:
- ARN-polimeraza I – este o enzimă localizată în nucleol şi catalizează transcripţia ARNr;
ea reprezintă activitatea sintetică cea mai mare (aprox. 50 – 70 % din total);
- ARN- polimeraza II – este o enzimă nucleoplasmatică, responsabilă pentru transcripţia
ARNm (activitate egală cu aprox. 20 – 40 % din total);
- ARN- polimeraza III – este o enzimă tot nucleoplasmatică care transcrie ARNt şi 5S
ARNr activitate egală cu aprox. 10 % din total ).
Fiecare celulă eucariotă conţine între 2 x 104 până la 2 x 107 molecule de ARN-
polimeraze. Procesul de transcripţie catalizat de ARN- polimeraze prezită trei etape importante.
1. etapa de iniţiere, care include: recunoaşterea de către ARN- polimerază a genei care
trebuie transcrisă ( gena ţintă ), a punctului de iniţiere unde are loc desfacerea helixului
ADN pentru generarea unei regiuni monocatenare scurte şi încorporarea primelor
nucleotide care formează lanţul de ARN; secvenţa ADN necesară pentru realizarea acestor
reacţii este reprezentată de promotor; locul la care primul nucleotid este încorporat se
numeşte punct de iniţiere (start point şi se notează cu + 1);
2. etapa de elongaţie, reprezintă faza în care nucleotidele sunt legate covalent la capătul 3' al
lanţului polinucleotidic. Bazele sunt adăugate succesiv la lanţul ARN, când are loc
formarea hibridului molecular ADN-ARN, în regiunea desfăşurată a helixului. Sinteza
continuă şi polimeraza alunecă de-a lungul ADN, desfăcând dublul helix pentru a expune
un nou segment al matricei sub formă monocatenară;
3. etapa de terminare, care reprezintă punctul unde sinteza lanţului de ARN se termină iar
hibridul ADN-ARN format, se separă. ADN se reface sub formă de dublu helix, ARN-
polimeraza şi molecula de ARN sintetizată se desprind şi devin libere în mediu.

132
 Terminarea sintezei este realizată de o secvenţă specifică în structura genei care se
numeşte terminator.
Pentru realizarea procesului complex de transcripţie, pe lângă ARN-polimerază este
necesar un mare număr de proteine auxiliare numite factori de transcripţie, care
interacţionează cu secvenţe specifice de ADN şi care pot acţiona stimulator sau inhibitor
asupra expresiei genice.

5.3.4. Factorii de transcripţie

Spre deosebire de procariote, unde ARN-polimeraza se leagă de ADN, la eucariote

ADN-polimeraza se leagă de proteine care au identificat promotorul genei ce va fi transcrisă.
Aceste proteine, reprezintă factorii de transcripţie care intră în aparatul transcripţional format
din aprox. 20 de proteine, implicat în:
- menţinerea duplexului ADN după legarea factorilor de transcripţie (FT);
- menţinerea stării active a genei ţintă sub acţiunea altor factori transcripţionali şi legarea
ARN-polimerazei;
- obţinerea energiei necesare sintezei, prin hidroliza ATP;
- iniţierea transcripţiei ( a sintezei ARN);
- elongarea transcriptului.
Cercetări analitice au permis să se izoleze şi purifice, din extractul nuclear, o serie de
factori de transcripţie. Primul care recunoaşte promotorul şi în special TATA-box, este factorul
de transcripţie D (notat TFIID), TF de la transcription factor şi II de la ARN-polomeraza II.
Pentru că el se leagă de secvenţa TATA-box a promotorului a fost denumit şi TBP (TATA-
Binding Protein). Acest factor odată legat la ADN va atrage şi alţi factori de transcripţie, cât şi
ARN- polimeraza.
Alţi factori de transcripţie (notaţi cu I, II, III, specificând tipul de ARN-polimerază care
se leagă) sunt notaţi cu litere: A (de ex: TFIA), B (TFIIB), D, E, F, G, H.
Dacă ARN-polimerazele sunt universale, identice pentru toate ţesuturile şi celulele,
factorii de transcripţie sunt specifici pentru anumite ţesuturi. Ei joaca un rol important în
diferneţierea celulară şi menţinerea tipurilor de celule.
Pe lângă aceşti factori de transcripţie, implicaţi direct în sinteza ARN există şi proteine
care reglează desfăşurarea procesului, în sensul ca îl intensifică, atenuează, nu blochează.
Acestea sunt proteine reglatoare, care ca şi factorii de transcripţie au capacitatea de a se lega de
ADN. Pentru acestea se impun cel puţin doua condiţii:
- proteina trebuie sa conţină în structura ei o secvenţa specifică de aminoacizi (de obicei 10-
100) care reprezintă domeniul (sau motif-ul) de interacţiune cu ADN. Aceste domenii sunt
considerate ca elemente de recunoaştere a genelor ţintă şi de aceea se numesc şi capete de
citire (Reading Head);
- la nivelul ADN trebuie să existe de asemenea secvenţe nucleotidice specifice (de obicei 5-
15) care să corespundă domeniilor (motif-elor) din proteinele reglatoare respective. Aceste
secvenţe sunt denumite elemente responsive (Responsive elements).
În aceasta categorie de proteine intră receptorii hormonali steroidici, care transportă
hormoni (corticoizi, estradiol, progesteron etc.) în nucleu şi interactionează cu secvenţele
specifice ADN (elementele responsive) iniţiind, accelerând sau blocând transcrierea unor gene.

5.3.5. Elemente de control în expresia genetică

Reglarea specifică a expresiei genice implică sinteza ARN, care copiază o singură catenă
a moleculei de ADN. Catena care se copiază asigură sinteza moleculei de ARN în direcţia 5'-3'
(deci va fi întotdeauna catena ADN cu direcţia 3'-5', iar catena nouă va avea direcţia 5'-3'. O
genă conţine atât informaţia pentru structura proteinei, cât şi elementele (secvenţele) de control
care reglează expresia genei, deci a sintezei ARN. (fig. 106).

133
 Gena din punct de vedere funcţional şi structural conţine 2 regiuni: regiunea reglatoare
şi regiunea de transcripţie (sau unitatea transcriptibilă) care sunt separate de punctul de iniţiere
a sintezei ARN (punctul start care se noteaza cu +1, adică primul nucleotid din molecula
ARN).
Regiunea reglatoare, care nu se transcrie, are ca element principal promotorul: o
secvenţă de nucleotide specifică fiecarei gene, iar la eucariote (mamifere) de factorii de
transcripţie.
La bacterii promotorul conţine doua secvenţe caracteristice şi necesare pentru legarea
ARN polimerazei si pozţionarea ei cu precizie faţă de punctul de iniţiere:
ƒ secventa-10,care reprezintă TATA-box (sau PRINBOW BOX);
ƒ secvenţa -35 (minus indicând că aceste secvenţe se află la stânga faţă de punctul de
iniţiere, adică upstream (fig. 85).

Fig. 85 - Schema generala a elementelor de control. Promotor cu (TATA box); secvenţele

activatoare –UAS şi enhancer-ii

La eucariote promotorul conţine 2 secvenţe caracteristice:

- secventa -27, care reprezinta TATA-box (sau HAGNESS BOX)
- secvenţa -84.
TATA box situată la -27 pb este secvenţa indispensabilă pentru iniţierea corectă a
transcripţiei de la punctul start (acelaşi rol îl are secvenţa -10 la procariote).
Promotorul este considerat o secvenţă esenţiala pentru reglarea ARN polimerazelor şi a
factorilor de transcripţie. Abilitatea promotorului de a iniţia transcrierea unei gene poate fi
foarte mult acentuată de prezenţa unui enhancer. Enhancer-ii sunt elemente reglatorii implicaţi
în activarea ratei de transcripţie a unei gene. Ei pot creşte transcripţia unui promotor până la
1000 de ori. Ei determină acetilarea histonelor care determină o relaxare a miezului histonelor,
promotorul devenind mai accesibil factorilor de transcripţie. Enhancer-ii pot fi situaţi în
secvenţa de ADN „în susul” (upstram) promotorului său „în josul” lui (down stream) faţă de
punctul de iniţiere a sintezei ARN(+1) (fig 85).
Există şi alte elemente similare, de exemplu la drojdii, aşa-numitele secvenţe
activatoare(upstream activator sequences – UAS). Aceste secvente UAS care sunt localizate la
distanţe diferite de promotor pot funcţiona în orice orientare. Enhancerii şi aceste elemente
UAS pot exista până la 3000-5000 pb distanţă de promotor, de unde îşi pot exercita efectul
pozitiv asupra transcripţiei.

5.4. Mecanismul transcripţiei

În general, ambele catene ale ADN pot servi drept matrice pentru sinteza ARNm. În
realitate, numai o singură catenă a ADN este transcrisă, iar ARN sintetizat este echivalent în
secvenţa nucleotidelor cu monocatena de ADN netranscrisă (catena opusă).
Promotorul, care, în funcţie de poziţia lui în secvenţa ADN, asigură legarea ARN
polimerazei şi orientează “citirea” (sinteza) într-o direcţie sau alta. În orice caz, sinteza ARN
având loc numai in direcţia 5’ – 3’, promotorul, în funcţie de orientarea în structura
ADN, va decide care catenă de ADN va fi copiată (fig. 86).

134
 Figura 86 - Promotorul
este orientat bine(in direcţia
3’-5’ a catenei ADN) si sinteza
ARN se va face in direcţia 5’-
3’.

La procariote legarea
ARN polimerazei la promotor
este determinată de două
secvenţe scurte: secvenţa-35 şi
secvenţa-10. Aceste două
secvenţe împreună cu punctul
de iniţiere (+1) determină de
fapt promotorul şi aşezarea
topografică, direcţia de
transcripţie (-35…-10…+1).
Modificări importante (mutaţii) produse la nivelul acestor secvenţe (numite secvenţe
consens) au ca efect abolirea activităţii de promotor.
La bacterii, factorul sigma (σ) are rol de recunoaştere a secvenţei promotorului şi de
fixare corectă a punctului de iniţiere a sintezei. La E. coli, fixarea polimerazei s-a constatat că
are loc în două etape:
- ataşarea lejeră a enzimei complete, la secvenţa -35, unde se formează un complex
“închis”.
- apoi, complexul “închis” este transformat într-un complex “deschis’, când, aprox. 17 pb,
începând de la secvenţa -10, se desfac, expunând catena matrice a ADN permiţând
introducerea primelor ribonucleotide (necesare sintezei moleculei de ARN) pentru
iniţierea sintezei (a transcripţiei). Secvenţa -10 conţine în general, baze AT, care permit
desfacerea dublei catene a ADN, cu mai multă uşurinţă decât perechile GC (fig. 87).

Figura 87 – Secvenţa -10

(TATA box),formată din baze
de complementare T-A,A-T,se
desfac pentru a permite
transcripţia unei catene de
ADN.

După ce ARN-polimeraza s-a fixat şi aprox. 8 nucleotide ARN au fost ataşate pe matriţa
ADN, factorul sigma (σ) se desprinde de ARN-polimeraza. Enzima core poate continua în
aceste condiţii sinteza ARN. În timpul elongaţiei, unde intervine un număr de factori de
elongaţie, sinteza catenei de ARN se desfăşoară cu o viteză de aprox. 30 nucleotide pe
secundă. Prin urmare, un polimer ARN de aprox. 5000 nucleotide, la temperatura de 370 C,
este realizat în aprox. 3 minute.
Factorii de elongaţie sunt de fapt proteine a căror structura este cunoscută, însă funcţia
lor exactă nu a fost elucidată.
Procesul de elongaţie a moleculei de ARN este oprit, în momentul când enzima
întâlneşte o altă secvenţă specială în regiunea transcriptibilă a ADN ( de obicei 6A ce vor fi
reprezentate în ARN prin UUU…). Această secvenţă a fost denumită terminator. Secveţa
terminator reprezintă semnalul terminării sintezei şi la acest punct ARN-polimeraza se
desprinde de catena ADN, iar hibridul format din moleculele ADN-ARN se desface, duplexul
ADN se reface, iar molecula ARN transcrisă este eliberată în mediu.

135
 La eucariote, ARN+polimeraza nu recunoaşte direct promotorul, ci prin intermediul
unuia dintre factorii de traanscripţie specifici procesului de sinteză a ARN. ARN+polimeraza
se va lega de factorul rspectiv şi nu de secvenţa de ADN. Factorii care iniţiază transcripţia se
deosebesc se ceosebesc de factorul sigma pe care îl conţine ARN-polimeraza bacteriană.
Factorii de transcripţie formează complexe de transcripţie, relativ stabile, care în mod selectiv
atrag moleculele de ARN-polimerază la promotorul de care ei s-au legat. Secvenţa desfăşurării
procesului ar fi următoarea:
- primul factor de transcripţie care recunoaşte promotorul, în special TATA box, este TFIID
(sau TBP);
- complexul ADN+TFIID acţionează ca un situs de legare pentru un alt factor: TGIIB care
legându-se va stabiliza complexul. Acest factor are acţiune ATP-azică, eliberând energia
necesară desfacerii catenelor de ADN, pentru formarea complexului deschis (open);
- la acest complex se asociază alţi factori: TFIIE şi TFIIH;
- acum, de acest complex se leagă ARN-polimeraza II şi în urma unui proces ATP-dependent
începe iniţierea transcripţiei. Iniţierea începe când s-a format complexul de iniţiere, la
nivelul promotorului genei ţintă;
- la acest complex se asociază un alt factor: TFIIS, care este factorul de elongaţie.
Acest factor împiedică terminarea prematură a sintezei ARN.
ARN-polimeraza I şi II formează complexe cu factori de transcripţie care se leagă
upstream (înaintea punctului de iniţiere) pe când majoritatea factorilor de transcripţie pentru
ARN+polimeraza II se leagă downstream (în mijlocul unităţii de transcripţie).
Viteza de sinteză a ARN este de 45 nucleotide/secundă. Sinteza (transcripţia) trebuie
făcută cu acurateţe pentru ca la nivelul ARN nu există sisteme de corectare a erorilor. Dacă au
apărut erori, ARN având un timp de înjumătăţire biologic ( T1/2) relativ scurt, nu pot produce
perturbaţii de ordin genetic, (transmisibile) ca în cazul erorilor ADN.
Procesul pe etape, prezentat în cazul procariotelor, se pare că este asemănător şi pentru
eucariote, cu excepţia că ARN sintetizat este reprezentat de molecule precursor, care necesită a
fi procesate. Procesarea, numită ARN splising, este necesară pentru eliminarea secvenţelor
intronice, care au fost transcrise în ARN precursor, dar care nu vor mai fi regăsite în secvenţa
aminoacizilor din proteinele corespunzătoare.

5.5. ARN splicing

În procesul de transcripţie produşii sintetizaţi sunt reprezentaţi de fapt de precursorii

ARNt, ARNr şi ARNm (numit şi pre-ARNm). Moleculele de ARN precursor, înainte de a fi
exportate în citoplasmă, ca să devină funcţionale sunt supuse la o serie de modificări: tăiere,
ordonare şi unire (splicing). Acest proces este necesar pentru ca intronii prezenţi în moleculele
precursor să fie eliminaţi şi numai secvenţele exonice să fie unite, pentru a realiza molecula de
ARN matur. Procesul trebuie să se realizeze cu mare acurateţe. O eroare produsă, prin
introducerea unui singur nucleotid necorespunzător, poate conduce la un ARNm care nu mai
poate translata o proteină funcţională.
Cercetările experimentale au relevat două aspecte în splicing-ul ARN, şi anume:
- self-splicing-ul ARN care a fost pus în evidenţă la nivelul pre-ARNm mitocondrial;
- splicing-ul ARN nuclear ce are lor la nivelul pre-ARNm.
Odată cu descoperirea intronilor self-splicing, aceştia au putut fi comparaţi cu structura
intronilor din pre-ARNm. Din această analiză a reieşit că intronii self-splicing pot fi împărţiţi
în două clase: introni de grupa I şi introni de grupa II. Cataliza este realizată de un complex
ribonucleoproteic, numit splisozom (spliceosome), care conţine ribonucleoproteine nucleare
mici (U1, U2, U5, U4,U6) plus alte componenete.

136
 La intronii din grupa I reacţia de splicing începe la o nucleotidă guanodinică (G), iar
intronii din grupa II la o nucleotidă adeninică (A). La ambele grupuri s-a constatat că splicing-
ul are lor în urma a două reacţii de transesterificare ( transfer de grupări fosfat ) şi anume:
- o adenină (A) din secvenţa intronului, situată aproape de situsul splice 3', realizează un
atac nucleofil (prin gruparea terminală 2-hidroxi - de la riboză) la nivelul situsul splice 5',
unde molecula de pre-ARNm este clivată. Capătul 5' al intronului devenit liber se leagă
covalent de adenina intronului formând o buclă;
- în etapa a doua hidroxilul 3' al primului exon, care s-a format în prima etapă, se ataşează la
capătul celui de-al doilea exon, unde are loc cel de-al doilea atac nucleofil, rupând
molecula de pre-ARNm. În urma acestui atac intronul este îndepărtat şi cei doi exoni care
erau separaţi în molecula precursor, se unesc. În felul acesta toţi intronii din molecula de
ARN precursor sunt eliminaţi.
Genele celulelor de la mamifere conţin mai mulţi introni decât exoni. Mărimea lor este
de aprox. 80 până la 10.000 nucleotide sau chiar mai mult. Se pare că intronii reprezintă un
„sac” de acumulare a mutaţiilor şi protejează în felul acesta ADN-ul de anumite leziuni.
Exonii existenţi se unesc cap la cap şi realizează o moleculă matură de ARNm. Aceste
molecule sunt exportate în citoplasmă şi pe baza informaţiei pe care le conţin se face sinteza
proteinelor funcţionale.
ARNm, prin transcripţie conţine următoarele secvenţe importante:
- o secvenţă specifică (5-10 nucleotide) care asigură legarea ARNm de subunitatea mică a
ribozomului, numită Ribosome Binding Sequence (secvenţă de legare la ribozomi);
- urmată de codonul de iniţiere a translaţiei ( AUG);
- secvenţa de nucleotide (codoni) pentru sinteza polipeptidului (proteinei);
- o secvenţă terminator (stop) reprezentată de unul din codonii stop sau terminatori: UAA,
UGA sau UAG (aceştia nu codifică nici un aminoacid).
După transcripţie şi splicing (procesare) ARNm suferă două procese (post-
transcripţionale) şi anume:
- captarea ARNm în urma căruia se adaugă la prima guanidină (la capul moleculei), o
grupare metil (– CH3) în poziţia 5';
- se adaugă o „coadă” de poli (A)+ la capul 31-OH terminal al moleculei. Coada formează un
polimer de aprox. 200 Ǻ, fiind realizată de o enzimă numită poli(A) polimeraza.
Aceste două procese nu sunt codificate în secvenţa ADN, de aceea ele sunt numite
procese post-transcripţionale.

5.6. Asigurarea necesarului de ARNm

Genele din genomul celulelor haploide se găsesc într-o singură copie, deci în cele
diloide se găsesc în cel puţin două copii. Pentru asigurarea o cantitate suficientă de proteine
pentru celulă sau organism, celula foloseşte două moduri de amplificare a ARNm, şi anume:

- gena respectivă va fi transcrisă de mai multe ori şi va rezulta o cantitate mai mare de
ARNm;
şi/sau
- ARNm este folosit de mai multe ori pentru sinteza proteinei respective. În acest caz el va
avea un T1/2 mai mare şi nu se va degrada după ce a dat prima copie de proteină.
Prin acest mecanism se explică cum gena fibroinei (2 copii/genom) produce în 4 zile 105
molecule de ARNm, iar ARNm produce 1010 molecule de fibroină. Această cantitate formează
firele necesare pentru o gogoaşă la viermele de mătase.
Sunt gene care codifică un singur tip de proteină, însă ele se găsesc în genomul celular în mai
multe copii. Acesta este cazul genelor pentru histone: H1, H2A, H2B, H3 şi H4.

137
 Capitolul 6

TRANSPORTUL INTRACELULAR
În anul 1976, un grup de cercetători de la Yale University (G.E.Palade, Jamieson,
Tartecoff, Sheele şi Berger), studiind mecanismul sintezei zimogenului de către celulele
acinoase pancreatice (celule specializate în sinteza şi exportul proteinelor), au reuşit să
demonstreze pentru întâia oară, drumul complet al unei proteine (proteină de tip secretor) de
la sinteză până la eliminarea sa din celulă, astfel au putut fi diferenţiate fazele:
- de sinteză proteică la nivelul ribozomilor;
- de concentrare, segregare a proteinelor în cisternele reticului endoplasmatic(RE);
- de transport intracelular, prin îmbarcarea proteinelor în vezicule de transport (vezicule
carriers) şi dirijarea lor spre complexul Golgi;
- de concentrare a proteinelor în vezicule de condensare (la polul apical al celulei, acinul
pancreatic);
- exportul (eliminarea) proteinelor în lumenul acinului pancreatic.
Rezultatele acestor studii au deschis calea cercetărilor în problema transportului
intracelular.
Treptat s-a dovedit că aproape toate proteinele membranare (cu excepţia unei părţi din
proteinele membranelor mitocondriale şi cloroplastice) sunt sintetizate la nivelul ribozomilor.
Producţia de proteine în celule este concentrată într-un compartiment anumit denumit
citozom (matrice celulară). Din acest compartiment celular de sinteză proteică, proteinele sunt
dirijate cu precizie şi cu maximum de eficienţă către circa 20-25 de destinaţii diferite:
biomembrane, elemente structurale, conţinutul unor compartimente celulare. Dirijarea precisă
a proteinelor non-sintetizate către o anumită destinaţie finală se datorează unei anumite
informaţii pe care proteina o poartă în structura sa. Este vorba despre un semnal specific al
proteinei (o anumită structură chimică) pentru recunoaşterea respectivei proteine de către un
anumit receptor de membrană (situs membranar).

6.1. Sistemul vacuolar intracitoplasmatic

Folosirea microscopului electronic a arătat prezenţa intracitoplasmatică a unui sistem
complex de membrane, care limitează tubuli, trabecule, vezicule, saci turtiţi sau cisterne
.Componenta membranară intracitoplasmatică are o structură trilaminară, cu o grosime
variabilă între 50 – 70 Ǻ, caracteristică.
Diversitatea, complexitatea şi plasticitatea sistemului de citomembrane constituie un
suport structural important în explicarea heterogenităţii funcţionale care caracterizează
biologia celulei.
Componentele reticulului endoplasmatic păstrează strânse interrelaţii topografice şi
funcţionale între ele, ca şi cu toate organitele celulare . Astfel, există o relaţie directă cu
zonele aparatului Golgi, elemente ale reticulului constituind membranele saculilor golgieni.
Tot elemente ale reticulului endoplasmatic sunt implicate în geneza lizozomilor. Prin
legăturile contractate cu membrana celulară plasmatică, cât şi prin comunicarea directă cu
membrana nucleară, componentele reticulului endoplasmatic servesc transportului de
materiale în celulă; sunt de asemenea, în contact cu mitocondriile, în jurul cărora formează
tubuli orientaţi regulat.
Aceste observaţii au acreditat ideea că, pe de o parte, între citomembranele sistemului
vacuolar şi celelalte membrane celulare (plasmatică, nucleară) există relaţii de continuitate,
iar pe de altă parte diferitele tipuri de reticul endoplasmatic se pot transforma unul în altul.
Astfel, s-au constatat contacte între reticulul endoplasmatic şi membrana celulară, ceea ce
sugerează o continuitate între aceste categorii de membrane.

138
 În acelaşi timp, relaţiile de continuitate între membrana nucleară externă şi membranele
rugoase, cât şi asemănările ultrastructurale dintre acestea, au permis a se considera că spaţiul
perinuclear este o extindere a sistemului vacuolar citoplasmatic.
Consecinţele acestor continuităţi sunt importante funcţional. În mod evident, spaţiul
perinuclear este în comunicare cu toate regiunile celulei, pe calea cisternelor citomembranelor
reticulare.
Sunt cazuri când membrana nucleară trimite prelungiri îndreptate către aparatul Golgi
Corelaţia de acest tip a permis aprecierea că membrana nucleară poate contribuie la formarea
membranelor golgiene. Microscopul electronic a semnalat şi formarea membranelor golgiene
netede pe seama membranei nucleare.
În afara acestor corelaţii ale membranelor golgiene cu membranele nucleare şi
citoplasmatice, frecvent au fost observate continuităţi structurale şi funcţionale ale acestora cu
reticulul endoplasmatic cu ribozomi. În apropierea zonelor Golgi, reticulul endoplasmatic
capătă aspect vezicular, pierde ribozomii şi se transformă în membrane agranulare netede.
Astfel, s-a acreditat ideea unei modificări succesive, ergastoplasma şi reticulul
endoplasmatic nuclear fiind aspecte ale aceluiaşi sistem structural endocelular, care corespund
la stări funcţionale distincte, iar veziculele mici reprezintă structuri „de transport” care asigură
legături funcţionale dintre reticulul endoplasmatic şi aparatul Golgi.
După structura sa, sistemul vacuolar citoplasmatic se împarte în reticul endoplasmatic
granular (ergastoplasmă), reticul endoplasmatic neted (agranular), acesta în raport cu
prezenţa sau absenţa la suprafaţa membranelor a poliribozomilor, aparatul Golgi, ca o
diferenţiere a sistemului vacuolar citoplasmatic şi structurile lizozomale.

6.2. Rolul citomembranelor granulare în sinteza proteică

O dezvoltare abundentă a citomembranelor granulare se observă în celule angajate activ
în sinteza de proteine „de export” (secretorii), cum sunt celulele glandelor salivare, pancreas
exocrin. O dezvoltare abundentă a sa se observă în celulele organului Corti, epiteliul
tiroidian, nefrocite. Studiile lui George Palade, aduc precizări asupra modalităţii in care
reticulul endoplasmatic participă la sinteza proteinelor intracelulare, arătând că la nivelul
reticulului endoplasmatic granular sunt sintetizate proteinele „de export”. Rezultatul acestor
studii este sintetizat în teoria lui Palade asupra mecanismului sintezei proteinelor secretate,
după care, spre deosebire de sinteza proteinelor structurale, al cărui sediu este reprezentat de
ceilalţi ribozomi şi se realizează într-un timp lung, sediul sintezei proteinelor secretate este
reticulul endoplasmatic granular la nivelul ribozomilor ataşaţi de membrane, într-un timp
scurt (până la un minut). După sinteză, proteinele secretate sunt transferate în cisterne, prin
sistemul de citomembrane, unde se maturează în timp, de circa 90 minute. După transferul în
spaţiul intracisternal, proteinele sunt transferate în zona golgiană.

6. 3. Biosinteza proteinelor sau translaţia ARNm

Prin microscopie electronică (Porter şi colab, 1945) şi prin metode biochimice s-a
demonstrat existenţa ribozomilor legaţi de membrana reticului endoplasmatic şi rolul major al
reticulului endoplasmatic în biosinteza proteică. În celula vie, ribozomii sunt „situsul” sintezei
proteinelor. În decursul acestui proces ARNm, cu ajutorul codului său triplet nucleotidic,
poartă mesajul ADN şi se fixează de ribozomi.
Complexele aminoacizilor-t-ARNm (aminoacil-t-ARN) ”recunosc” acest cod triplet şi
aminoacizii se adaugă pe rând, lanţului polipeptidic în creştere. Codul este tradus de ARN-m,
care se deplasează traversând ribozomul. În mod simultan, moleculele de ARN-t se eliberează
şi complexele noi de aminoacil-t-ARN se fixează pe ribozomi. O serie de factori de natură
proteică ce au situsuri de fixare pe ribozomi, favorizează acestora „citire” a mesajelor venite
de la ADN, iar la sfârşitul ei polipeptidul se eliberează de ARN-t.

139
 6.3.1. Decodificarea informaţiilor genetice

În cadrul sintezei proteice se realizează ultima etapă a transferului informaţiei genetice

conţinută în secvenţa de baze azotate din ADN. Ea este transcrisă sub formă de mesaj genetic
în ARNm şi acesta este tradus, respectiv decodificat, la nivelul ribozomului, dintr-o secvenţă
de codoni, într-o secvenţă de aminoacizi.
Astfel informaţia genetică din stare potenţială aflată în structura ADN, devine o
„realitate” într-o secvenţă de aminoacizi de la nivelul catenelor polipeptidice.
Al treilea nivel de transfer informaţional (translaţia) condiţionează convertirea
informaţiei din alfabetul cu 4 litere al ARNm (A-U; C-G) în alfabetul de 20 litere, reprezintă
cei 20 aminoacizi esenţiali ai proteinelor. Dicţionarul folosit de celulă, în această traducere
este reprezentat de colecţia sa formată din cele 54 tipuri de ARNt.(fig. 88).

Fig. 88 - Al treilea nivel informaţional (translaţia)

Toate procesele metabolice ale celulei se bazează pe existenţa şi funcţionarea

proteinelor care pot avea fie rol structural (colagenul), fie rol metabolic transportor
(hemoglobina), fie rol în apărarea organismului (imunoglobulinele), fie rol enzimatic. Până
în prezent au fost identificate, la diferite sisteme biologice analizate, peste 100 000 de
proteine diferite. Rolul proteinelor în desfăşurarea proceselor vieţii este esenţial. Însăşi
structura, dar mai ales desfăşurarea celor două funcţii esenţiale ale materialului genetic –
autocatalitică (replicare) şi heterocatalitică (dirijarea de sinteze specifice de proteine sau de
alte biomolecule: ARNm, ARNt, ARNr) sunt dependente de proteine precum histonele,

140
proteinele – enzime, în cadrul cărora intră şi cele care au rol hotărâtor în replicarea ADN
(polimeraze, topoizomeraze, ADN-ligaze, etc), în transcrierea (ARN polimeraze), în translaţie
(factori de iniţiere şi terminare), în recombinare (recombinaze), în repararea leziunilor induse
de ADN (excionaze, polimeraze, ADN- ligaze).
Este evident că fără participarea proteinelor, materialul genetic nu ar putea să
îndeplinească nici una din funcţiile sale.
În cadrul biosintezei proteinelor participă deopotrivă acizii nucleici şi proteinele.
Pentru sinteza unei singure catene polipeptidice sunt mobilizate sute de alte molecule
proteice cu rol structural şi enzimatic. Această intervenţie a unui număr mare de proteine
în diferite etape ale procesului decodificării este cerută de o traducere exactă a mesajului
genetic.
Proteinele sunt polimeri de aminoacizi. Polimerizarea aminoacizi, realizată la nivelul
ribozomilor, implică formarea de legături sau punţi peptidice între gruparea carboxil (-
COOH) a unui aminoacid şi gruparea amino (- NH2) a altui aminoacid cu eliminarea unei
molecule de H2O.
Formarea de punţi peptidice succesive determină polimerizarea aminoacizi liberi, adică
includerea lor într-o catenă polipeptidică care reprezintă structura primară a proteinei . Unele
proteine sunt alcătuite dintr-o singură catenă polipeptidică, altele din mai multe catene
polipeptidice identice sau diferite, în ultimul caz, informaţia genetică pentru fiecare dintre
aceste catene polipeptidice diferite, fiind deţinută de gene diferite, participante în
alcătuirea aceleaşi proteine ( o genă – o catenă polipeptidică).
La terminarea catenei polipeptidice, aceasta se prezintă sub forma structurii sale
primare, reprezentând secvenţe de aminoacizi care a fost determinată de mesajul genetic,
adică de secvenţa codonilor din ADN m .
Catenă polipeptidică este apoi supusă prelucrării post translaţionale în cadrul căreia
ea adoptă o structură secundară prin interacţiunea aminoacizilor săi, în anumite condiţii
fiziologice, de t° sau pH, prin intermediul unor punţi de H sau al unor punţi bisulfidice (- S -
S -). Prin acestea, catena polipeptidică capătă configuraţii spaţiale bidimensionale sau
tridimensionale . în urma formării punţilor de H, intercatenare dintre grupările ceto (C =
O) şi imino (N = H) ale legăturilor peptidice, rezultând o configuraţie regulată a
polipeptidului, cunoscută sub denumirea de configuraţia α - helix al cărui model a fost
propus de Linus Pauling pentru care a primit premiul Nobel.
Prin răsucirea catenelor polipeptidice asupra lor însele datorită acţiunii unor forţe de
atracţie dintre diferite aminoacizi ai catenei polipeptidice rezultă structura terţiară a
proteinei .
Ea are la bază legături de H, electrostatice, hidrofile sau covalente. Când proteina
este alcătuită din mai multe catene polipeptidice identice sau diferite, asocierea lor pentru a
alcătui molecula proteică funcţională se realizează, de asemenea, prin intermediul unor
asemenea legături şi acest caz proteina se prezintă sub formă de structură cuaternară.
Hemoglobina umană normală (HbA) este alcătuită din 2 catene α şi 2β; molecula de
insulina este formată din două catene polipeptidice; o catenă A, formată din 21
aminoacizi şi o catenă B formată din 30 aminoacizi; iar molecula de imunoglobulină -
anticorp are două catene grele (H) şi două uşoare (L) unite între ele prin punţi bisulfidice
(- S - S - ) ca şi catenele de insulină.
Se înţelege de la sine că pentru îndeplinirea funcţiei sale normale, proteina trebuie
să fie normală la toate nivelele sale structurale : primar, secundar, terţiar şi cuaternar,
structura primară fiind determinată pentru toate celelalte nivele structurale. Structura şi
funcţia proteinelor reprezintă expresia primară a informaţiei genetice.
În decodificarea informaţiei genetice rolul primordial îl joacă acizii ribonucleici
celulari: ARNm, ARNt şi ARNr . Rolul ARN în decodificarea informaţiei genetice a fost
evidenţiat după anul 1950 de către BRACHE T şi CASPERSSON, sinteza proteică fiind
însoţită de o creştere considerabilă a cantităţii de ARN în celulă.

141
 Toate tipurile de ARN celular sunt sintetizate pe matriţa de ADN, în cadrul căruia
există pe lângă genele structurale ce determină informaţia genetică pentru sinteza
diferitelor proteine, informaţie ce este transcrisă în ARN m care devine astfel purtător de
mesaje genetic, şi gene pentru diferite tipuri de ARNt şi ARNr.
Dintre toate cele trei tipuri fundamentale de ARN celular, doar ARNm este tradus
în proteină, ARNt şi ARNr îndeplinind însă roluri esenţiale în asigurarea traducerii mesajului
genetic din ARNm.
Dependenţa sintezei proteice de informaţia genetică din nucleu şi de sinteza
diferitelor categorii de ARN celular pe matriţa de ADN nuclear a fost determinată de
Brodnet (1955), Mazia şi Prescott (1963) la alga verde unicelulară „Acetabularia
mediterranea".
Ribozomii asigură interacţiunea ARNm -ARNt în cadrul căreia codonii din ARN m
sunt recunoscuţi secvenţial de anticodonii din ARNt - urile corespunzătoare, asigurându-se
astfel citirea mesajului genetic . Integritatea structural - funcţională a ribozomilor
condiţionează o citire corectă a mesajului genetic şi o traducere fidela a sa într-o secvenţă
de aminoacizi.
De exemplu, la bacteria E. coli, antibioticul streptomicină interacţionează cu 2
situsuri ale proteinei ribozomale Gu asociată cu ARNr 16G din subunitatea ribozomală
mică (30 S) ceea ce face ca ribozomul să nu mai fie funcţional, iar biosinteza proteică să
fie stopată.
Acest lucru nu se întâmplă însă şi la mutanţii rezistenţi la streptomicină, aceştia
prezentând în catena polipeptidică a proteinei ribozomale Gi2 două substituţii de
aminoacizi în poziţiile 42 şi 87.
Rezultă că această proteină ribozomală este esenţială în împerecherea codon -
anticodon de la nivelul ribozomului.
Folosindu-se agenţi care blochează sinteza ARN m (actinomicina D) s-a demonstrat
că sinteza proteică, în aceste condiţii durează atâta timp cât să fie sintetizată circa 1 0 -
2 0 molecule proteice.
Aceasta înseamnă că după folosirea ca mesager pentru sinteza a 10 - 20 catene
polipeptidice o moleculă de ARN m este hidrolizată, fiind necesară sinteza (sau adăugarea
în cazul sistemului acelular de sinteză (in vitro) a unei noi molecule de ARN m, pentru ca
sinteza proteică să poată continua . De astfel, în celulă, în condiţii normale, are loc o
„amplificare genetică" indirectă realizată nu prin mărirea numărului de copii ale genei ci prin
transcrierea repetatată a informaţiei genetice conţinută de o genă cu sinteza unui număr
mare de molecule ale unui ARNm. Astfel, se poate realiza sinteza unui număr mare de catene
polipeptidice.
Viteza de transcriere a unei gene este variabilă. De exemplu gena
triptofansintetazei (enzimă ce intervine în sinteza triptofanului) este de 28 nucleotide pe
secundă, iar traducerea ARN m corespunzător se face cu viteza de 21nucleotide/ secundă,
la 370 C. Sinteza hemoglobinei umane se realizează cu o viteză de 4 aminoacizi/ secundă
la aceeaşi temperatură.
Dacă celula vegetală poate să-şi sintetizeze toţi aminoacizi de care are nevoie, celula
animală nu poate sintetiza decât o parte dintre ei.
Astfel, din cei aproximativ 100 de aminoacizi identificaţi numai 20 intră, în mod
obişnuit, în structura celor circa 100.000 de proteine naturale identificate până în
prezent, proteine care au specificitate de specie, organ, ţesut, celulă şi chiar organit celular.
Pentru celula animală, următorii 10 aminoacizi sunt esenţiali sau indispensabili, adică
trebuie să-i primească prin surse alogene (prin hrană, de exemplu), deoarece nu este capabilă
să-i sintetizeze singură: lizina, triptofonul, arginina, metionina, leucina, izoleucina,
valina, fenilalanina, arginina şi histidina.

142
 Aminoacizii: glicina, alanina, serina, cisteina, acidul aspartic, asparagina, acidul
glutamic, glutamina, tirazina şi prolina sunt neesenţiale, pentru că celula animală îi
poate produce pe diferite căi metabolice, pornind de la aminoacizii esenţiali.
Ca orice reacţie de polimerizare şi biosinteza proteinelor se desfăşoară în trei etape ce
se succed neîntrerupt: iniţierea, alungirea (sau elongaţia) şi terminarea catenei
polipeptidice.

6.3.2.Iniţierea catenei polipeptidice

Sinteza unei catene polipeptidice începe cu un aminoacid -N - terminal şi se termină

cu un aminoacid - C - terminal.
Ordinea includerii aminoacizilor în catena polipeptidică este stabilită de ordinea
codonilor din ARNm.

Prima etapă în biosinteza proteică este activarea aminoacizilor cu ajutorul ATP,

reacţia fiind catalizată de enzima aminoacilsintetaza (numită şi aminoacid ARN t - ligaza)
şi care este specifică fiecărui aminoacid. Aminoacilsintetazele sunt enzime cheie în
„recunoaşterea" cifrului codului genetic.
Aminoacizii nu se pot lega direct la ARN m . Este necesară o moleculă adaptatoare
reprezentată de ARN t. Mai are loc ataşarea aminoacidului activat de ARNt corespunzător
lui (în etapa a doua), ataşare realizată la gruparea CCA de la capătul 31 al ARNt şi care
este catalizată de aceeaşi enzimă aminoacilsintetază, folosind energia rezultată din
hidroliza ATP:

ATP + H2O ADN + P cu eliberarea a 7 Kcal./mol

ATP + H2O AMP + PP cu eliberarea a 8 Kcal./mol
ADP + H2O AMP +P cu eliberarea a 6 Kcal./mol

Pentru formarea legăturii peptidice se folosesc 0,5 Kcal./mol, restul de energie liberă
fiind necesară menţinerii echilibrului reacţiei spre a se realiza sinteza proteică şi nu a avea loc
hidroliza proteinelor.
Între restul de adenozină (A) de la capătul 31 al ARN t şi aminoacidul activat se
formează o legătură covalentă macroergică a cărei energie va fi folosită în reacţia de
polimerizare a aminoacizilor:+

AA1+ATP aminoacilsintetază AA1 ~ AMP + P + P

AA1 ~ AMP + ARNt aminoacilsintetaza AA1 ~ ARNt + AMP

Ataşarea eronată a unui aminoacid la ARN t, altul decât cel care este specific acelui
ARN t va fi eliminată prin intervenţia aceleiaşi enzime aminoacil - sintetaza, care
prezintă o activitate de corecţie, recunoscând această „eroare" şi hidrolizând legătura dintre
aminoacidul greşit ataşat şi ARNt.
Este un lucru bine stabilit că deşi există mai multe tipuri de ARN t pentru un acelaşi
aminoacid (fapt determinat de caracterul degenerat al codonului genetic), există doar o
singură enzimă aminoacil - ARNt – sintetază pentru fiecare aminoacid. Aminoacilarea
ARNt catalizată de aceste enzime este un proces riguros controlat deoarece o încărcare
greşită a unui ARNt cu un aminoacid necorespunzător are aceeaşi consecinţă ca şi o
mutaţie - determinând includerea eronată a unui aminoacid în catena polipeptidică.
Aminoacil - sintetazele şi ARNt joacă deci rol esenţial în decodificarea informaţiei genetice.

143
 Etapa a treia în iniţierea unei catene polipeptidice se desfăşoară la nivelul ribozomului
care prezintă suprafeţe specifice de legare stereochimică a ARNm, ARNt şi a catenei
polipeptidice în creştere. Ribozomul asigură de aşa manieră asocierea acestor trei
elemente, încât să facă posibilă recunoaşterea codonului din ARNm de către anticodonul
corespunzător din ARNt, pe principiul complementarităţii, cu constituirea unei asocieri
tranzitorii prin intermediul punţilor de H, asociere care durează până ce aminoacidul legat
de ARN t este deconectat de la acesta şi înserat la catena polipeptidică unde rămâne ataşat
de aminoacidul precedent, printr-o legătură chimică covalentă — legătura peptidică (fig.
89).

Fig. 89 – Schema
transmiterii informaţiei: codon
(ARN m) – anticodon (ARN t) –
aminoacid

Proteina ribozomală S1 cu
proprietăţi contractile joacă un
rol important în realizarea
opoziţiei mesagerului (ARNm) şi
adaptorului (ARNt) ea asigurând
deplierea ARNm atunci când
acesta, interacţionează cu
ribozomii şi legarea acestuia la
subunitatea ribozomală mică 30
S.
Iniţierea catenei
polipeptidice este asigurată de
intervenţia unor factori de
iniţiere de natură proteică,
denumiţi IF1, IF2 şi IF3. Cu
ajutorul unei secvenţe denumită
secvenţă leader aflată la capătul
S1 al ARNm, acesta se leagă la
subunitatea ribozomală mică 30
S, secvenţa leader nefiind tradusă.
La acest complex ARNm - subunitatea ribozom de 30 S se ataşează subunităţii
ribozomale de 50 S, constituindu-se particule ribozomale întregi (70 S la bacteria E. coli)
funcţionale în asigurarea sintezei catenei polipeptidice .Complexul aminoacil ARNt se
asociază cu subunitatea ribozom 50 S care prezintă trei situsuri : situsul aminoacil (A), situsul
peptidil (P) şi situsul de ieşire - exit - (E). În situsul A pătrunde aminoacil ARN t
corespunzător codonului din ARNm recunoscut de anticodonul din ARNt.
De regulă situsul P acceptă complexul aminoacil ARNt numai dacă acesta a realizat
recunoaşterea codon - anticodon, adică numai dacă a trecut prin situsul A şi apoi a fost
translocat în situsul P. Acceptarea se bazează pe unele posibile modificări conformaţionale
pe care le-a suferit complexul aminoacil ARN t când a fost în situsul A.
La nivelul ribozomului, sinteza tuturor catenelor polipeptidice începe cu metionina,
al cărui codon din ARNm este codonul de iniţiere AUG sau, mai rar GUG. Dar, în
interiorul catenei polipeptidice metionina este specificată de acelaşi codon AUG . Ca
urmare, pentru ca ribozomul să recunoască în mod specific codonul de iniţiere AUG este
necesar un semnalul suplimentar de discriminare între AUG iniţiator şi AUG din
interiorul mesajului genetic.

144
 Acest semnal discriminator este reprezentat de aşa numita secvenţă Shine - Dalgarno,
descoperită de Shine şi Dalgrano în anul 1975.
Aceasta reprezintă o secvenţă de 7 - 15 ribonucleotide bogate în purine şi aflată în
amonte de codonul de iniţiere AUG, fiind complementare cu 3 - 7 baze dintr-o secvenţă de
polinucleotide de la capătul 3' al moleculei de ARNr de 16 S din cadrul subunităţii
ribozomale mici (30S) . Această interacţiune dintre capătul 3' al moleculei de ARNr 16 S şi
secvenţa Shine - Dalgarno din ARN m selecţionează codonul AUG iniţiator şi-1 aduce la
nivelul situsului P al ribozomului, fără al mai trece la nivelul situsului A, aceasta fiind
unica excepţie, toţi ceilalţi codoni trebuind să treacă mai întâi la nivelul situsului P.
În plus, o secvenţă în buclă (hairpird) adiacentă secvenţei Sherie - Dalgarno are
valoarea unui semnal suplimentar de iniţiere. O altă particularitate a procesului de iniţiere
este folosirea unui ARN t specific de iniţiere ce diferă de omologul său ce
interacţionează cu codoni AUG interni pentru metionină . Acest ARN t iniţiator a fost
denumit f - metionină ARN tMET la procariote şi i - metionină - ARN t MET la eucariote .
După încărcarea ARN tMET iniţiator cu metionină el devine metionil ARN t MET şi este
supus unei formulări prin ataşarea grupului formil sub acţiunea enzimei formilază la gruparea
NH2 a metioninei aceasta devenind formilmetionină (f - ARN t MET).
Formilaza este întâlnită la procariote şi ca urmare doar la aceste organisme primul
aminoacid al oricărei catene poliptidice este formilmetionină ARNt iniţiator încărcat cu
formilmetianină este singurul ARN t care se leagă direct la situsul P al ribozomului cu
ajutorul factorului de iniţiere IF2. Acest f- Met - ARN t se leagă la ARNr 23 S cu o mai
mare afinitate decât la orice alt ARNr, ceea ce face să aibă loc selecţia f -Met - ARNt în
situsul P. Formilarea metioninei determină blocarea grupării amino, ceea ce face ca ea să
nu mai poată participa în vreo reacţie de polimerizare. Ca urmare formil - metionina ocupă
poziţia unu a catenei polipeptidice dar oferă restul reactant COOH care unindu-se cu
gruparea NH2 a următorului aminoacid, prin eliminarea unei molecule de apă, va forma
puntea legătură peptidică. După terminarea sintezei catenei polipeptidice grupa formil de
la metianină este îndepărtată prin intervenţia unei enzime de deformilare, iar uneori
este îndepărtată însăşi metionina (fig.90).

Fig. 90 - Sinteza proteică: ciclul de elongare al lanţului peptidic.Formarea

legăturilor aminoacil – ARNt, formarea legăturilor peptidice,translocaţia (adaptat
după Stryger, 1991).

145
 6.3.3.Alungirea sau elongarea catenei polipeptidice

O dată formată prima legătură peptidică, ARNt iniţiator, rămas fără aminoacid,
părăseşte situsul P. Eliberat, acesta va putea primi cel de-al doilea aminoacil - ARNt care a
trecut în prealabil prin situsul A spre a se realiza recunoaşterea codon - anticodon.
Se formează cea de-a doua punte peptidică şi translocarea succesivă din A în P permite
citirea secvenţială, codon după codon, a întregului mesaj genetic conţinut în ARNm, de
către anticodonii complexelor aminoacil - ARNt ce pătrund, de asemenea, secvenţial prin
situsul A al ribozomului, selecţia complexului aminoacil ARNt din amestecul de aminoacil
ARNt - uri făcându-se în virtutea complementarităţii codon - anticodon.
Translocarea succesivă din A în P, însoţită de fiecare dată de formarea unei noi
legături peptidice, condiţionează desfăşurarea celei de-a doua etape în biosinteza catenei
polipeptidice şi anume elongarea sau alungirea catenei.
În alungirea catenei polipeptidice intervin aşa numiţii factori de elongaţie (alungire)
care au fost denumiţi EF -Ts şi EF-G, care nu sunt altceva decât proteine ribozomale care
se ataşează particulei ribozomale în faza de funcţionare a acesteia în sinteza proteică .
Aceşti factori de elongaţie se fixează în subunitatea ribozomală mare (50 S) între proteinele
h17 şi h12. EF - T4 şi EF - Ts asigură fixarea aminoacil ARNt pe ribozom iar EF - G
determină deplasarea acestui complex la nivelul ribozomului. Funcţionarea unor asemenea
factori de elongaţie este dependentă de energia eliberată prin hidroliza GTP.
După ce ribozomul a asigurat traducerea a circa 25 de codoni, capătul 5'al ARNm
devine liber spre a forma cel de-al doilea complex de iniţiere şi astfel, al doilea ribozom
se angajează în traducerea mesajului genetic spre a asigura sinteza unei a doua catene
polipeptidice, apoi un al treilea, al patrulea si aşa mai departe, astfel că, la un moment dat,
aceeaşi moleculă de ARNm este asociată cu mai mulţi ribozomi, rezultând un polisom sau
poliribozom.

6.3.4.Terminarea sintezei catenei polipeptidice

Când, în deplasarea sa pe macromolecula de ARNm, ribozomul ajunge cu situsul

său A în dreptul unui codon nonsens ( codon de stop sau codon terminal ) în acest situs nu
mai pătrunde nici un complex aminoacil - ARNt -, deoarece nu există anticodoni care să
recunoască codonii nonsens . Ca urmare, are loc încetarea sintezei catenei polipeptidice.
Codonii UAA, UAG şi UGA sunt codoni nonsens sau terminatori care sunt
recunoscuţi de factori de eliberare sau de terminare denumiţi TF - Ri, TF - R2 şi TF - R3.
Din interacţiunea codonilor nonsens cu factorul de terminare - ribozom, rezultă un
complex de terminare care nu mai permite alungirea în continuare a catenei polipeptidice
TF - R3 din cadrul acestui complex, acţionând enzimatic la nivelul situsului P, separă grupul
carboxil al aminoacidului C terminal de legătura sa cu ARN t printr-o hidroliza. TF - R3 va
rupe legătura esterificată a catenei polipeptidice cu ARNt final, aflat în situsul A şi astfel pot
fi eliberaţi din ribozom atât catena polipeptidică, cât şi ARN t, având loc totodată
disocierea" ribozomului în cele două subunităţi ale sale, proces care este mediat de IF3.
Proteinele ribozomale h1 şi h2 sunt implicate în terminarea sintezei catenei
polipeptidice pe o cale neelucidată (fig.91, 92).

146
Fig. 91 – Schema sintezei proteinelor la procariote

147
Fig. 92 – Schema sintezei proteinelor la eucariote

148
 6.3.5.Particularităţile decodificării la procariote şi eurocariote
La procariote, transcrierea mesajului genetic şi traducerea sa pot avea loc
simultan, deoarece înainte ca să fie terminată sinteza ARNm pe matriţa de ADN capătul
său 5' poate să se asocieze cu ribozomii spre a forma complexul de iniţiere în traducerea sa
într-o catenă polipeptidică. ARNm la procariote este policistronic, deoarece aceeaşi
moleculă de ARNm poate transcrie mai multe gene structurale ale aceluiaşi operon,
purtând mesajul genetic pentru mai multe catene polipeptidice, reprezentând enzime
diferite care intervin într-o aceeaşi cale metabolică. De exemplu, în sinteza histidinei
intervin 10 enzime-10 gene.
La eucariote, transcrierea are loc în nucleu, iar traducerea în citoplasmă unde se
află ribozomii. Trecerea mesagerului ARNm din nucleu în citoplasmă, se realizează la
nivelul porilor anvelopei nucleare. ARNm la eucariote este monocistronic, fiecare
moleculă de ARN purtând mesajul genetic pentru sinteza unei singure catene
polipeptidice.

6.4. Mecanismul compartimentării celulare a proteinelor nou-

sintetizate
Ribozomii, substratul molecular complex pe care se traduce mesajul ARNm în
molecule proteice, în celula eucariotă apar ca două populaţii spaţial separate: ribozomii
ataşaţi de membrana RE şi ribozomii neataşaţi de membrană, care sunt liberi în citosol
(dar şi ei apar legaţi de fibre ce aparţin citoscheletului).
Ambele tipuri de ribozomi sunt din punct de vedere structural şi funcţional
echivalente. Ei diferă numai prin tipul de proteine pe care le sintetizează (tabelul 2).
Diferenţierea este înscrisă în mesajul moleculei de ARNm, într-o secvenţă de
nucleotide specială pe care o posedă (secvenţa semnal sau secvenţa leader sau signal
peptide). După iniţierea translaţiei proteina cu această secvenţă va orienta ribozomul
spre RE, care se va ataşa de membrana organitului. Pe aceşti ribozomii sunt sintetizate
numai acele proteine care vor fi introduse în RE, modificate şi care apoi, în cea mai
mare parte vor fi secretate (exportate) sau transportate la diferite organite şi la
membrana plasmatică. Moleculele de ARNm care nu posedă această secvenţă în
structura lor se leagă de ribozomii care vor rămâne în citosol (ribozomii liberi). Pe ei
sunt sintetizate toate celelalte proteine, care nu necesită o prelucrare specială
(glicolizare, acetilare, etc.) prelucrare care are loc numai în RE şi aparatul Golgi.

Tabelul 2. Proteinele sintetizate de diferite clase de ribozomi

Localizarea ribozomilor Clasa de proteine sintetizate

Ribozomii citoplasmatici legaţi de
membranele RE
Ribozomii citoplasmatici nelegaţi
de membranele RE(ribozomii
liberi )
- proteine secretate
- glicoproteinele pentru membranele :plasmatice, nucleare, RE, aparatul
Golgi
- enzime lizozomale
- enzime ale REG
- enzime ale aparatului Golgi
- proteine ataşate pe suprafaţa externă a membranei celulare
(fibronectina, laminina, colagenul).
- proteine citoplasmatice solubile
- proteine ataşate pe suprafaţa externă a membranei celulare (actina,
spectrina,)
- proteine mitocondriale
- codificate de ADN-ul nuclear
- proteine peroxizomale
- - proteine nucleare (histone, lamine)

149
 Compartimentarea intercelulară a noilor proteine sintetizate în hialoplasmă are loc în
faze separate în timp şi spaţiu.
Într-o primă fază considerată a fi compartimentarea primară, proteinele nou sintetizate
se împart în proteine care rămân în hialoplasmă, proteine care migrează în nucleu şi proteine
care sunt transferate prin membranele intracelulare sau se încorporează în membrane.
În faza de compartimentare secundară, dintre proteinele ce se transferă prin membrane
unele ies din reticulul endoplamatic şi trec în lizozomii primari, în peroxizomi, în mitocondrii
şi cloroplaste şi altele sunt încorporate de membrana celulară.
Ca exemplu, vom analiza pătrunderea proteinelor de secreţie în cisternele RE. Cum se
cunoaşte din experienţele lui G.Palade, proteinele de secreţie sunt sintetizate de ribozomii
ataşaţi de membrana RE şi apoi transferate prin membrana acestuia în interiorul lui.
Din cisternele RE, se desprind vezicule pline cu proteinele de secreţie care sunt
transportate la aparatul Golgi, unde suferă transformări şi se includ în granulele de secreţie al
căror conţinut va fi exocitat. ARNm al unor asemenea proteine „de export”conţine în afară
de codonul iniţiator al translaţiei, un codon semnal care, tradus într-un peptid semnal (signal
recognition particule SRP) compus din 15-25 aminoacizi, face posibilă joncţiunea
ribozomilor funcţionali cu membrana RE.
Acestă legătură se realizează datorită unor proteine receptoare (SRP-receptor), care fac
parte din structura membranei RE. Asemenea proteine membranare joacă rol de adevăraţi
receptori ribozomali. Când peptidul semnal vine în contact cu receptorii membranari, aceştia
se mişcă în planul tangenţial al membranei şi se agregă într-un canal sau „tunel” membranar.
Asocierea receptorilor membranari stabileşte situsuri de fixare pentru subunitatea mare a
ribozomului, care permite tunelului său, cu peptidul în formare, să vină în prelungire cu
tunelul membranar neoformat.
Astfel peptidul semnal este separat de stratul bimolecular de fosfolipide şi prin tunelul
membranar, va intra în interiorul cisternei RE, după care va continua să intre restul lanţului
polipeptidic. Dar, în momentul în care peptidul semnal ajunge în lumenul reticulului, o
peptidază semnal membranară le secţionează de lanţul peptidic în formare.
Sinteza se continuă şi polipeptidul propriu-zis trece în întregime prin tunelul
membranar, în cisterna membranară, până la terminarea lanţului. Atunci peptidul va fi liber în
întregime în spaţiul intercisternal. Apoi, prin difuzia în planul membranei reticului a
receptorilor semnalului, se dezorganizează tunelul membranar de care era legat ribozomul
care, se desprinde şi se desface în cele două subunităţi (fig. 93).

Fig. 93- Schema generală a transportului proteinei nou – sintetizate în lumenul

reticulului endoplasmatic (RE):

150
 1) Proteina fiind în curs de sintetizare, o particulă semnal de recunoaştere (SRP) se
leagă de secvenţa semnal a proteinei (signal peptide) şi de ribozom; 2) Complexul format se
leagă de receptorul SRP din membrana RE; 3) Proteina, prin secvenţa semnal este inserată în
membrană şi translocată în lumen; 4) Complexul ribozom – SRP se disociază şi ribozomul
continuă translaţia, iar SRP este deplasat şi reciclat.

În concepţia lui G Blobel, formarea „tunelui” transmembranar din proteinele receptoare,

scoaterea peptidului - semnal de către peptidază şi segregarea finală a lanţului complet
polipeptidic în spaţiul intracisternal al RE sunt considerate ca un program cotranslaţional.
Detaşarea ribozomului şi dispersarea proteinelor receptoare ale tunelului în membrană
reprezintă fenomene post-translaţionale.
În unele cazuri, lanţul polipeptidic în formare are o secvenţă „stop” (foarte hidrofobă)
care, trecând prin membrană dezorganizează tunelul şi opreşte transferul lanţului. Aşa se
întâmplă cu proteina G a virusului Stomatitis vezicular, care rămâne cu capătul carboxil în
afară şi cu cel amino înăuntru.
Este interesant cazul proteinelor lizozomale ale fibroblaştilor, care sunt acumulate în RE
împreună cu proteinele peroxizomale şi cele secretoare. Aceste proteine sunt eliminate din
celule, însă cele lizozomale, care conţin în plus şi carbohidraţi, fiind „recunoscute” de
receptorii membranari (aprox. jumătate din numărul lor) sunt reintroduse în celulă prin
pinocitoză.
Pe de altă parte, se consideră că proteinele lizozomale sunt „sortate” de celelalte
proteine în cadrul regiunilor RE pregolgian şi anume, în zona proximă a complexului Golgi.
Spre deosebire de proteinele de secreţie, proteinele lizozomale şi cele peroxizomale au”
secvenţe de sortare” în plus, prin care, ele pătrund în anumite membrane ce conţin receptori
pentru anumite secvenţe şi astfel iau naştere vacuolele cu enzimele lizozomale şi
peroxizomale.
Citocrom C- oxidaza mitocondrială este constituită din 7 subunităţi proteice, dintre care
4 se sintetizează în citoplasmă şi 3 în mitocondrii. În citoplasmă, se sintetitizează o proteină
precursoare peroximală mai mare decât suma celor patru subunităţi, diferenţa reprezentând
tocmai suma unor secvenţe „semnal” cu care recunosc receptorii suprafeţei mitocondriale,
ceea ce le permit încorporarea lor în membrana internă mitocondrială. După pătrunderea celor
4 subunităţi, aceştia pierd oligopeptidele semnal.

6.5. Corelaţia particularităţilor structurale şi funcţionale ale reticulului

endoplasmatic neted cu heterogenitatea funcţională a celulelor
Reticulul endoplasmatic neted prezintă o dispoziţie a elementelor structurale,
caracteristică pentru fiecare tip de celulă, particularitatea structurală fiind legată de
heterogenitatea funcţională a celulelor respective.
Astfel, celulele care sintetizează steroli prezintă un reticul endoplasmatic neted format
din numeroşi tubuli ramificaţi şi bifurcaţi, dispuşi într-o reţea complexă în toată citoplasma. În
celulele luteinice ale corpului progestativ din ovar, reticulul prezintă numeroase vezicule
fenestrate, turtite, în strânsă vecinătate cu mitocondriile.
O formă specializată de organizare a reticulului endoplasmatic nuclear se întâlneşte la
fibrele musculare striate, unde în jurul fiecărei miofibrile, se găseşte un sistem de tubuli şi
cisterne dispuse longitudinal, constituind un sistem perimiofibrilar numit reticul sarcoplasmic
(sarcotubuli).
Tubulii alungiţi ai reticulului endoplasmatic fuzionează în zona striei H, ca şi în zona
benzii Z, în câte o cisternă, aşa încât formează un fel de manşon continuu în jurul miofibrilei,
întins între două benzi Z(sarcomer).

151
 La acest nivel (banda Z), între două cisterne ale celor două manşoane ale reticulului
sarcoplasmic pătrunde o invaginaţie a plasmalemei turtită în plan transversal al fibrilei
(tubulul T). În felul acesta, la nivelul benzii Z se formează o triadă, cu două elemente (două
cisterne) ale reticulului sarcoplasmic şi un tubul T (fig. 94). Triada aceasta este foarte
importantă funcţional şi anume prin tubulii T se transmite potenţialul de acţiune de la
suprafaţă la elementele contractile.

Fig. 94 - Reticulul endoplasmatic

al fibrelor musculare striate
(reticulul sarcoplasmic).

Tot prin tubulul T, din

plasmă intră în reticulul
sarcoplasmic ioni de Ca 2+ şi ATP,
difuzând uşor prin reticul şi
permiţând contracţia musculară .
Reticulul uşurează distribuţia
rapidă a Ca2+ şi ATP la nivelul
miofibrilelor, printre care se
găseşte dispus. Manşonul din
dreptul benzii A conţine cea mai
mare cantitate de Ca2+ şi ATP,
necesară tocmai în acest loc unde
apare contracţia. În timpul relaxării,
Ca2+ se acumulează în cisternele
terminale ale reticulului
sarcoplasmic şi, de aici trece în
tubulii transverşi (T) şi apoi în
sarcoplasmă.
O altă dispoziţie particulară a
reticulului endoplasmatic nuclear este cea de pe faţa internă a membranei plasmatice la
neuroni, atât ai vertebratelor cât şi ai nevertebratelor, unde se găsesc vezicule mari, turtite
numite cisternele de sub plasmalemă. Aceste cisterne sunt numai în neuroni (nu şi în celulele
Schwann sau celulele endoteliale), atât în sistemul nervos central cât şi cel periferic. Structuri
asemănătoare se găsesc şi în unele celule senzoriale sau musculare, care generează sau conduc
variaţii de potenţial electric.
Studiile lui Porter şi Palade asupra reticulului endoplasmatic la muşchii vertebratelor
au arătat asocierea acestor cisterne cu anumite locuri de pe plasmalemă prin care stimulii pot
ajunge în celule. Cisternele stau, deci, la baza aşa-numitelor locuri senzitive („senzitive
spots”).
Sarcolema cu cisterne prezintă o permeabilitate selectivă, ionii specifici fiind absorbiţi
la suprafaţa membranelor intracelulare ale cisternelor. Cisternele modifică mobilitatea şi
concentraţia ionilor la suprafaţa internă a sarcolemei.
Asocierea cisternelor cu mitocondriile sugerează că, în asemenea mod, permeabilitatea
membranelor este modificată şi transferul de materiale uşurat, datorită energiei rezultată din
hidroliza ATP din mitocondrii.
O altă formă particulară de organizare a reticulului endoplasmatic nuclear a fost
observată în unele celule secretoare ale adenohipofizei, unde tubulii reticulari se dispun
concentric, asemănător unui bulb de ceapă secţionat. Aşezate lângă nucleu, aceste formaţiuni
au fost numite paranuclei endoplasmici. Formaţiuni asemănătoare au fost observate în
hepatocite după administrarea de toxice sau după hepatectonie experimentală.

152
 Un tip special de reticul neted a fost descris în celulele stratului pigmentar al retinei,
unde ocupă aproximativ 50% din citoplasmă, găsindu-se situat la polul bazal al celulei şi în
procesele care migrează între conuri şi bastonaşe. Structurile reticu-lului formează aşa-numiţii
corpi mielinici, care au un aspect lenticular biconvex, de 4 - 5µ în axul lung, alcătuiţi din
săculeţe turtite, dispuse în stive. Adesea corpii mieloizi sunt grupaţi câte 4 – 5 laolaltă.
Asemănarea citomembranelor celulelor pigmentare cu structurile din complexul de
fotorecepţie a luminii, permit interpretarea că şi acestea intervenin în metabolismul vitaminei
A şi conversia rodopsinei.
Pe numeroase tipuri de celule au fost evidenţiată o variaţie cantitativă şi calitativă a
reticulului endoplasmatic în cursul desfăşurării procesului de diferenţiere celulară. Astfel, în
hepatocitele de şobolan, în ziua a treia prenatală reticulul endoplasmatic neted lipseşte, fiind
prezent cel granular, în ziua a opta postnatală reticulul devine de tip neted. Modificările se
reflectă în variaţiile raportului ARN/proteină, care scade în favoarea raportului
fosfolipoproteic /proteină. Această modificare a raportului este proporţională cu vârsta . Noile
membrane sunt, deci, sintetizate în reticulul endoplasmatic granular şi transferate apoi
reticulului endoplasmatic neted.
Pe lângă fosfolipide şi proteine, citomembranele netede conţin şi enzime. Faptul că
celulele a căror funcţie principală este sinteza lipidelor sau sterolilor au un reticul neted
dezvoltat au dus la concluzia localizării la nivelul acestuia a enzimelor de sinteză a sterolilor,
trigliceridelor şi a altor lipide .
A fost atestată, de asemenea şi localizarea enzimelor care participă la sinteza
glicogenului. Date experimentale sugerează sinteza la nivelul reticulului endoplasmatic neted
a enzimelor detoxifiante, capabile să anihileze acţiuni ale drogurilor (exemplu fenobarbital).
Dispoziţia spaţială a reticulului permite considerarea acestui sistem structural, ca un
„sistem circular” endocelular, foarte mobil, la nivelul căruia se pot realiza schimburi de
substanţe între mediul extracelular şi matricea nucleară.
Reticulul endoplasmatic intervine în schimburile ionice între citoplasmă şi nucleu,
concomitent cu un intens schimb hidric.
Un rol important al reticulului endoplasmatic este hidroxilarea medicamentelor Peste
două sute de compusi chimice, printre care fenobarbitalul şi hidrocarburile polichimice
declanşează in vivo un efect inductor asupra enzimelor microzomale (microzomi = fracţiuni
heterogene cuprinzând fragmente din membranele reticulului endoplasmatic, membrana
nucleară, membrana plasmatică, ribozomi), iar în unele cazuri produc chiar o amplificare
genică a unor enzime implicate în apărarea organismului.

6.6. Segregarea şi concentrarea proteinelor

Studii efectuate cu 3H – leucină în pancreas au stabilit că proteinele sintetizate în
ribozomi (reticulul endoplasmatic granular) sunt trecute apoi în reticulul endoplasmatic neted.
S-a stabilit că în reticulul endoplasmatic granular se sintetizează două tipuri de proteine: o
proteină „secundară”, într-un ritm scăzut şi o proteină „exportabilă”, cu un „turnover” foarte
rapid.
În vecinătatea aparatului Golgi ergastoplasma pierde ribozonii şi membrana devine
netedă. Reticulul endoplasmatic neted astfel format se veziculeză, constricţiile fiind un stadiu
în detaşarea de microvezicule libere, care sunt identice cu acelea din vecinătatea
dictiozomului.
Conţinutul veziculelor trece apoi în vacuolele de condensare, mecanismul intern fiind
încă discutabil. Observaţiile au sugerat cel puţin trei căi: 1) fuzionarea veziculelor cu cisterne
ale dictiozomilor; 2) fuzionarea veziculelor cu vacuole de condensare; 3) fuzionarea unor
microvezicule Golgi formând o vacuolă multiveziculată la care membranele vor forma
membrana limitantă a vacuolei de condensare.

153
 În vacuola de concentrare proteinele suferă un proces de concentrare în granule de
zimogen printr-un mecanism încă neclar (probabil printr-un proces de deshidratare, apa
acumulându-se în săculeţii care se umflă). Proteinele granulelor de zimogen sunt reprezentate
de o serie de enzime condensate care se descarcă la exterior prin pinocitoză inversă.

6.7. Sinteza şi secreţia polizaharidelor

Sinteza zaharurilor complexe, cum este glicogenul, are loc la nivelul citoplasmei
fundamentale. În schimb, sinteza glicoproteinelor şi mucopolizaharidelor se efectuează în
aparatul Golgi.
În formarea granulelor de diferite glicoproteine a fost formulată părerea că există două
etape: într-o primă etapă, datorită unei transferaze, în reticulul endoplasmatic pătrund N –
acetilgalactozomină şi monozohexozomină, care se leagă de lanţul polipeptidic sintetizat la
acest nivel. Vacuolele transportoare duc aceste proteine la care s-au adiţionat grupări
glucidice, la aparatul Golgi, unde într-o a doua etapă, se adiţionează galactoza, fructoza,
manoza şi acidul sialic, în circa 5 minute.
O localizare în timp în diferite formaţiuni ale aparatului Golgi a fost observată şi pentru
sulful radioactiv 35S injectat ca SO4Na2, acesta apărând mai întâi în dictiozomi şi apoi în
granule de mucus.
Detectarea mucopolizaharidelor acide s-a făcut, de asemenea, numai la nivelul zonei
Golgi, care asigură formarea proteinelor în vacuolele din concavitatea cisternelor şi în
granulele de secreţie.
În formarea lipoproteinelor, sinteza iniţială este asociată cu reticulul endoplasmatic,
membranele golgiene având rolul de a uni produşii separaţi (proteine – lipide) într-o moleculă
mare – complexul lipoproteic.
Întrucât produşii secretaţi de aparatul Golgi au un caracter variat, se apreciază că această
zonă posedă mecanisme speciale pentru formarea de entităţi macromoleculare. Ca atare,
complexul de membrane al aparatului Golgi nu poate fi privit numai ca un compartiment de
pasaj al unor tipuri de molecule, ci ca pe un compartiment la nivelul căruia are loc o activitate
enzimatică mult diferită şi o complexare a moleculelor mici într-o moleculă mare.
Aceste complexe macromoleculare specifice sunt formate din combinaţii între proteine,
hidraţi de C şi lipide. Reacţia de sulfatare este interpretată tot ca o formă specială de
complexare. Produsul care urmează să fie secretat va suporta apoi o remaniere suplimentară
după detaşarea veziculelor din săculeţii golgieni. Produsul secretat se prezintă ca material
diferit (enzime, mucus, înveliş celular, hormoni etc.).
Granule dense la fluxul de e- (ME) au fost observate şi în zonele golgiene la numeroase
tipuri de celule neurosecretoare, considerându-se neurosecreţia ca produs al lamelelor
golgiene. Se precizează ca la acest nivel membranele aparatului Golgi joacă rolul de
„complexare”, folosind şi materialul sintetizat în reticulul endoplasmatic.
Un rol particular al aparatului Golgi este evidenţiat în formarea acrozomului din
spermatozoid, care are o poziţie supra nucleară. La nivelul spermatocitelor s-a evidenţiat
apariţia unor granule proacrozomale în zona centrală a aparatului Golgi, care, prin fuzionare,
dau naştere acrozomului matur. S-a evidenţiat de asemenea, rolul reticulului endoplasmatic in
elaborarea unor vezicule care, fuzionând cu lamelele golgiene, furnizează cel puţin o parte din
materialul acrozomal.
La contactul cu ovulul şi sub influenţa acestuia, acrozomul suferă o serie de
transformări variabile dar care includ eliberarea de substanţe litice care participă la liza
structurilor rezistente ale ovulului faţă de pătrunderea spermatozoidului.
Complexul golgian este, structural şi funcţional, legat de reticulul endoplasmatic şi, aşa
cum e arată polaritatea lui, endomembranele se modifică într-un flux continuu de la reticul
spre membrana celulară. În cursul acestui flux membranar, aparatul Golgi transferă şi
concentrează proteinele, neoformează materiale membranare, sintetizează polizaharide şi

154
glicoproteine. Participarea aparatului Golgi la formarea noilor membrane celulare a fost
considerată de unii autori ca o funcţie principală a sa. S-a acreditat ideea unui circuit
intracelular al subunităţilor membranare hialoplasmice care participa la formarea veziculelor
transpoare ce se desprind din reticulul endoplasmatic, apoi imbogatesc membranele golgiene,
reinoindu-le permanent, fiind posibila formarea vacuolelor de secretie, care, in final, se
deschid la exteriorul celulelor. Aceste vacuole se fragmenteaza dupa exocitoză in vezicule
mici prin a caror dezorganizare se reface stocul subunitatilor membranare din hialoplasma.
Secreţiile solide. Aparatul Golgi îndeplineşte un rol şi în secreţiile solide şi anume,
astăzi este dovedit că participă la formarea pereţilor celulozici ai plantelor prin sinteza
celulozei.

6.8. Lizozomii
Sunt structuri tranzitorii din multe celule, limitate la o membrană, care includ o serie de
hidrolaze acide. Ei se găsesc în hepatocite, pe lângă canaliculii biliari şi abundă în macrofage,
histiocite, granulocite, la diferite alge unicelulare, granulele vitelusului proteic (în faza când
cristalizează proteinele sunt tot formatiuni lizozomale). Tot o activitate litică au şi veziculele
golgiene, ca de exemplu din glanda multifidă de melc.
Sinteza enzimelor lizozomale are loc în poliribozomii reticulului endoplasmatic, de
unde trec pe faţa distală a aparatului Golgi formată din saculi şi tubuli anastomazaţi. De aici,
prin înmugurirea acestora, se formează lizozomii.

6.8.1. Funcţiile lizozomilor

Rolul lizozomilor primari este de a aproviziona cu enzime fagozomii sau auto-
fagozomii, transformându-i în vacuole heterofagice, respectiv autofagice sau să elimine la
exterior conţinutul lor, în realizarea unei „digestii externe”, ca în cazul diferitelor glande de la
vertebrate (fig. 95).

Fig. 95 - Clasificarea dată de Ch. de Duve funcţionalităţile lizozomilor

155
 Endocitoza diferitelor particule sau pinocitoza lichidului extracelular se face cu
participarea filamentelor mecanocontracţiilor sub-membranare (fig. 96). Particulele care aderă
la suprafaţa membranei celulare, imobilizează proteinele acesteia, crescând permeabilitatea
Na+ care intră în celulă şi provoacă depolarizarea membranei. Unda de depolarizare eliberează
Ca2+ din reticulul endoplasmatic.

Fig. 96 - Dinamica endocitozei; desfăşurarea procesului este figurată de la stânga

la dreapta: sub acţiunea Ca++ filamentele contractile de sub membrana celulară
realizează înglobarea unei particule care intră în citoplasmă, înconjurată de membrana
respectivă.

Circulând în citoplasmă se încarcă cu enzimele lizozomale, transformându-se în

heterolizozomi, după care corpii reziduali pot fi excretaţi printr-un mecanism în care
proteinele mecanocontractile, sub acţiunea Ca++, se depărtează de faţa internă a membranei şi
uşurează astfel deschiderea vacuolei în exterior
În prezenţa Ca2+ are loc reunirea actinei cu miozina şi formarea actomiozinei, proces
care este însoţit de contracţia microfilamentelor respective in sensul invaginării membranei
celulare. Astfel, fagozomul iniţial, a mică invaginare ce conţine o mică parte din mediul
extern, este separat de citoplasmă printr-o porţiune din membrana plasmatică. Glicocalixul ei,
devenit interior, se separă de membrană formând în interiorul fagozomului o masă amorfă,
polizaharidică, care apoi dispare. După pierderea glicocalixului fagozomul suferă o
deshidratare, nu mai are formă sferică, migrează prin căile microtubulare de-a lungul
citoplasmei şi se fragmentează.
Fogozomul se poate deschide la exterior (regurgitare), sau se asociază cu lizozomii
primari devenind vacuole heterofagice. Vacuolele heterafagice pot acumula coloranţi şi
medicamente din mediul extracelular.

156
 Astfel, clorochina, acumulându-se în heterolizozomii plasmodiului malariei, determină
ruperea membranei şi enzimelor lizozomale distrug parazitul.
În mod normal, particulele captate prin fagocitoză sunt digerate în vacuole heterofagice
şi componentele lor trec prin membrana lizozomală în citoplasmă, hrănind celula. La fel sunt
digerate bacteriile de către leucocitele neutrofile şi macrofage şi sunt degradate substanţele
toxice şi medicamentoase, prin aceasta detoxificându-se organismul. Enzimele lizozomale
eliminate în afara celulelor permit unor celule să-şi croiască drum printre zone tisulare
compacte şi greu de străbătut. Se ştie că una din proprietăţile fundamentale ale celulelor este
de a-şi reînnoi permanent structurile lor funcţionale. Acest proces are loc pe trei căi:
- prin hidrolazele nelizozomale din nucleu şi citoplasmă;
- prin enzimele lizozomale care ies din lizozomii primari şi digeră structurile respective;
- prin autofagie.
Autofagozomii care se formează în ficat şi rinichi distrug permanent organitele celulare
în mod constant, metabolismul celulelor refolosind în acelaşi timp materialele acestora în
sinteze ulterioare.
Vacuola autofagică se constituie din contopirea unui autofagozom cu lizozomii primari.
Autofagozomul ia naştere prin circumscrierea unei porţiuni de citoplasmă cu organitele
respective de către membranele cisternelor reticulului endoplasmatic sau ale saculilor
golgieni; în alte cazuri, rezultă din contopirea mai multor vacuole endocitare. Când
autofagozomul s-a format, în el se varsă conţinutul enzimatic al lizozomilor primari. În circa
300 de zile mitocondriile unui hepatocit se reînnoiesc de aproximativ 30 de ori, ceea ce
înseamnă că într-o celulă o mitocondrie este distrusă la fiecare 15 minute.
În cursul ontogeniei, autofagia unei structuri constituie un mecanism care influenţează
integralitatea organelor, curburile encefalului, individualizarea falangelor, formarea
rinichiului, dispariţia cozii larvare la anure, etc. Tot prin autofagie se limitează extinderea
unor procese degenerative (ale hepatocitelor şi celulelor pancreatice de actinomicină –
inhibitor al sintezei ARN) etc.
Celulele unui animal
supus la inaniţie se nutresc prin
autofagia propriului conţinut,
iar celulele moarte sunt lizate
de enzimele lizozomale proprii.
Când organismul nu mai are
nevoie de anumiţi hormoni
atunci glandele care le
elaborează distrug prin
autofagie granulele de secreţie
respectivă. Ceea ce rămâne
nedigerat în hetero-fagozomi şi
autofagozomi apare sub forma
unor figuri mielinice, pigmenţi
biliari, feritine, lipofuxime etc.
Rezultă aşa-zişii „corpi
reziduali” care pot să-şi elimine
de foarte multe ori conţinutul
afară. Faptul că enzimele
lizozomale nu digeră
membrana lizozomilor s-ar
putea datora rezistenţei
învelişului propriu glicoproteic
de pe faţa internă a membranei
lizozomale.
Fig. 97 - Funcţiile peroxizonilor
157
 Sunt cazuri când membrana lizozomală este distrusă prin diferiţi factori externi (şocuri
traumatice, anoxie, endotoxine, virusuri, praf de cărbune etc.). În maladii ca pneumoconiozele
(leziuni pulmonare, ale branhiilor, scleroza parenchinului pulmonar) datorită inhalării de C,
Be, Si, Zn – se produc lize ale membranei lizozomilor, iar enzimele eliberate omoară celule.
Într-o serie de maladii genetice, fie membranele lizozomilor fuzionează dând lizozomi
mari de 2 – 5 µφ, permeabili ce produc scăderea rezistenţei organismului la infecţii, spleno şi
hepatomegalie, albinism, fotofobie, iar la copii moartea rapidă, fie, sunt cazuri când nu se mai
pot transcrie mesaje pentru o serie de enzime lizozomale (glucozidaze, sfingomielinaze,
galactizidaze) astfel că, o serie de substanţe ce pătrund în lizozomi, negăsind enzima
respectivă responsabilă de hidroliza lor, se acumulează in cantitate mare într-o serie de celule,
cu diferite consecinţe chimice.

6.9. Peroxizomii

Sunt corpusculi de 0,5 µφ formaţi dintr-o membrană şi o matrice, iar uneori cu

formaţiuni poli-şi multitubulare, denumite nucleoizi sau o placă marginală mai densă la
primate. În peroxizomi se întâlneşte catalaza care distruge H2O2 cu producere de H2O, fie
prin oxidarea unui substrat redus, fie când donorul de O2 este H2O2 .
Peroxizomii produc o cantitate mică de energie, reglează catabolismul glucozei, jucând
rol în gluconeogeneză, sintetizând glucoza din precursori neglucidici, intervenind şi în sinteza
sterolilor (fig. 97).

6.10. Proteinele chaperone

Studiile de specialitate şi biologie moleculară din ultimii ani au demonstrat, pe un
număr mare tot mai mare de organisme procariote şi eucariote, existenţa unei clase speciale de
proteine cu rol esenţial în viaţa celulei.
Aceste proteine au fost denumite „proteine chaperone” sau „chaperoni moleculari”, ceea
ce înseamnă „proteine de însoţire” deoarece intervin pe tot parcursul sintezei celorlalte
proteine din organisme, post-translaţional, determinând conformaţia structurală normală,
starea corectă de pliere şi agregare finală a acestora şi implicit, funcţionarea normală
corespunzătoare; ele reactivează proteinele legate după stres şi au rol de catalizatori prin
creşterea vitezei de înfăşurare a proteinelor, ajutându-le astfel să-şi găsească o structură
terţiară stabilă.
Proteinele charperone au capacitatea comună de a-şi regla propria asamblare şi pliere
(împăturire) motiv pentru care au fost numite şi autofoldaze.
Cunoaşterea acestei noi clase de proteine a permis în ultimii ani deschiderea unor noi
căi în abordarea şi înţelegerea proceselor celulare survenite în condiţii de stres, senescenţă cât
şi în fenomenele degenerative tip boli prionice .Datele acumulate pledează pentru existenţa
unui număr foarte mare şi complex de proprietăţi funcţionale ale acestor proteine.
Cercetările efectuate în ultimii 25 de ani au demonstrat că există o uniformitate izbitoare
în modul în care diferite organisme răspund la diferite forme de stres. Răspunsul la stres
implică alăturarea transcrierii unui set anumit de gene care codifică pentru proteinele de şoc
termic (hsp) numite şi „proteine de stres”.
Dintre acestea cea mai cunoscută la bacterii este proteina de şoc termic hsp70k1. Aceste
proteine de stres ajută celulelor supuse stresului să-şi menţină proteinele într-o conformaţie
corectă, ajută ca aceste proteine să fie translocate către diferite organite celulare (transport

1
kilodaltoni

158
vectorial), şi ghidează atât proteinele normale nou-sintetizate, cât şi pe cele anormale, să
atingă o conformaţie normală.
Proteinele de stres joacă un rol important şi în condiţii de nonstres, anume în perioada
de diferenţiere celulară, creştere şi dezvoltare.
În condiţii de stres pot să apară proteine împăturite, sau o mare cantitate de proteine
nascente neâmpăturite; aceste stări declanşează imediat răspunsul „la stres”, sugerând deci că
o proteină anormal împăturită reprezintă componentă cheie a procesului de recunoaştere a
stresului de către celulă. Răspunsul la stres este reglat în principal la nivel de transcriere, deşi,
în unele cazuri, au fost deschise şi reglări la nivel de translaţie.
Modul în care celula este capabilă să sesizeze acumularea intracelulară de proteine
anormal împăturite,declanşând procesul de transcriere/translaţie a proteinelor de stres nu este
încă bine cunoscut.
În celula eucariotă, reticulul endoplasmatic (RE) se comportă ca nu senzor ce captează
toate variaţiile în condiţii de stres (metabolismul calciului, potenţialul redox, proteinele
semiîmpăturite din lumenul şi membrana RE.
Proteina chaperone grp94 este cea mai abudentă dintre toţi chaperonii din RE (în
proporţie de 50%) şi aparatul Golgi, corespunzându-i în citoplasmă proteina chaperone hsp90.
Se pare că grp94 este o glicoproteină transmembranară (hidrofobă şi cu afinitate pentru
lipide); est considerată drept „marker de stres”.
În aceste condiţii, grp94 se redistribuie în aparatul Golgi, cantitatea ei creşte în nucleu şi
este secretată parţial în mediul extracelular. Studiile asupra redistribuirii proteinei grp94 în
condiţii de stres au adus lumină asupra înţelegerii patern-urilor de glicolizare ale grp94
modifică după stresul celular.
Proteina chaperone hsp90 este de asemenea implică în protecţia microtubulilor şi a
filamentoase citoplasmatice faţă de stres (şoc termic). Dintre proteinele de stres, cele mai
cunoscute sunt proteinele de şoc termic hsp (heat shock protein). Proteinele hsp se
diferenţiază între ele prin greutatea lor moleculară (exprimată în kda): hsp60, hsp70, hsp90.

Proteinelor chaperone li se atribuie multiple funcţii:

- protecţia celulară crescută în condiţii de stres, acordând termotoleranţă. Hsp90

protejează proteinele ţintă de proteoliză şi le asigură înmagazinarea;

- determinarea stării de împăturire,asamblare/dezasamblare a proteinelor non-sintetizate;

chaperonii hsp60 şi hsp70 au rol în împăturire, translocaţie, asamblare, stabilitate; hsp90
are rol în reglarea, activitatea factorilor de transcriere şi a activităţii kinazelor proteice.
Hsp90 constituie 1-2% din totalul proteinelor citoplasmatice. Această proteină a fost
deschisă atât la procariote cât şi la eucariote. Formează complexe mari citosolice cu
numeroşi alţi chaperoni;

- traficul proteinelor (transport vectorial); la procariote s-a demonstrat existenţa unui

sistem de proteine chaperone care acţionează succesiv, într-o reacţie în lanţ, având rol
vital în sinteza, translocaţia, plierea şi funcţionarea normală a proteinelor nou-sintetizate.
La eucariote, proteina chaperone hsp70 are rol în sortarea proteinelor anormale, dar şi a
anumitor proteine normale (cu viaţă scurtă) atât la procariote cât şi la eucariote;

- asamblarea complexelor ribonucleoproteice a ribozomilor. Hsp90 se asociază cu fibrele

de ribonucleoproteine modulând stuctura ARN-ului;

159
- biogeneza mitocondriilor şi peroxizomilor. Chaperonii, prezenţi în toate organismele, au
rol şi în biogeneza unor structuri macromoleculare. Dintre aceştia, proteinele hsp60 şi
hsp70 s-au dovedit a avea rol în biogeneza mitocondriilor. Proteinele hsp70 au rol şi în
stabilizarea citosolica a proteinelor peroxizemale.

- răspunsul imun; faptul că proteinele chapenare au potenţialul de a-şi creşte sinteza şi in

condiţii de stres, ar explica în mare măsură , rolul în imunogenitate. Într-un număr mare
de infecţii (bacteriene şi parazitare cu protozoare şi helminţi) moleculele chaperone devin
ţinte imune proeminente pentru celulele T. Au fost deschise drept ţinte imune proteinele
hsp10 de la Mycobacterium leprae şi proteinele hsp60 şi hsp70 de la Mycobacterium
leprae şi M. tuberculosis;

- replicarea ADN-ului la virusuri, procariote şi eucariote. Chaperonii au rolul în

menţinerea stării de răsucire moderată a moleculelor de ADN; în această stare, ADN-ul
poate fi uşor antrenat în activitatea de transcriere, replicare, recombinare. Hsp90 este
implicat în asamblarea diferitelor complexe virale (complex ARN reverstransciptaza);

- asamblarea şi reglarea activităţii receptorilor pentru hormonii steroizi.Hsp90, prin

legarea de receptorii pentru hormonii steroizi, face ca acestora să se menţină în stare
parţial despăturită capabilă de a fixa hormonul respectiv;

- rolul protector în SNC. Unele observaţii sugerează că hsp exercită o acţiune de

citoprotecţie asupra SNC ca urmare a răspunsului la stres. Stresul excitator este mediat
de scăderea cantităţii intracelulare de glucoză, activitatea kinazei, scăderea pH-ului
intracelular, clivajul proteolitic al proteinelor structurale şi prezenţa de radicali liberi
mediaţi de denaturarea proteinelor. Starea toxică este potenţată de eliberarea continuă de
glutamat după producerea leziunii iniţiale. Toate aceste procese sunt implicate în
producerea răspunsului de tip proteine şoc termic (hsp). Cel mai mare rol protector îl au
proteinele din familia hsp70. Proteinele hsp70 sunt prezente în ţesutul nervos şi în
condiţii de nonstres. Aceste proteine hsp70 reprezintă o proteină asociată cu microtuburi
şi implicată în transportul axonal lent. Hsp70 se leagă de ATP, având o slabă acţiune
ATP-zica; poate fi fosforilată în prezenţa unui înalt nivel de calciu. Mecanismul protector
al hsp se pare că este legat de combinarea acestora cu proteazele, fosfolipazele, kinazele
sau receptării controlul transmiţătorilor, având drept rezultat atenuarea efectelor
distructive.S-a demonstrat că insulina induce producerea de proteine hsp70;

- intervin în procesul de dezvoltare celulară. Date recente (Cyermely şi Colab, 1998) arată
că funcţia majoră a hsp90 pare a fi participarea acesteia la omogenizarea, menţinerea şi
remodelarea arhitecturii celulare (citoscheletul). Hsp90 şi grp94 intervin în ciclul celular
şi diferenţierea celulară (hsp90 intervine dezvoltarea neurală, retiniană, osoasă,
musculară). Hsp90 se asociază cu nucleolii, cu fibrele de ribonuleoproteine ale
pericromatinei , modulează stuctura ADN-ului nuclear, a ARN-ului şi proteinelor . Se
ataşează de ADN desfăşurând activitate de tip topoizomerază şi nuclează, regenerează
ADN-ul după şoc termic; prin formarea complexelor ADN-hsp90-histone, din cursul
mitozei, proteina hsp face posibilă asamblarea centrozomilor, rearanjările majore în
structurile nucleare în cursul oogenezei şi embriogenezei precoce.

Hsp90 şi grp94 intervin în apoptoză şi în procesele de îmbătrânire celulară; aceşti

caperonii oferă celulei protecţie faţă de factorii de necroză a tumorilor (TNF) şi faţă de
leziunile oxidative.

160
 Capitolul 7

REPRODUCEREA CELULARĂ
Creşterea organismelor şi transmiterea caracterelor ereditare de-a lungul generaţiilor au
la bază o caracteristică fundamentală a materiei vii - reproducerea. La nivel celular,
reproducerea se realizează prin forme diferite.
Reproducerea celulelor eucariote are loc printr-un proces complex denumit diviziune
celulară, în urma acestui proces, celula parentală se divide, dând naştere la două celule fiice.
Diviziunea celulară implică desfăşurarea unor evenimente celulare replicative, prin care
se realizează duplicarea constituenţilor celulari şi distributive, ce asigură partiţia
constituenţilor celulei în celulele fiice.
Apariţia unor descendenţi celulari cu acelaşi potenţial genetic reclamă exercitarea unui
riguros control asupra replicării şi distribuirii materialului genetic.
Procesul distributiv al moleculelor ADN se realizează prin mecanisme specializate, la
eucariote cele mai frecvent întâlnite fiind mitoza şi meioza.
Mitoza este caracteristică celulelor somatice şi asigură o repartizare egală în celulele
fiice a materialului genetic replicat.
Meioza este întâlnită la celulele germinale. în urma meiozei se formează 4 celule fiice
(gameţii), fiecare prezentând o jumătate din informaţia genetică a celulei parentale. Prin
fuziunea gameţilor (spermatozoidul şi ovulul) ia naştere oul fecundat din care se dezvoltă
ulterior întregul organism multicelular.
Acest capitol îşi propune să prezinte principalele etape ale reproducerii celulare şi
mecanismele de control implicate în desfăşurarea acestui complex proces.

7.1. Ciclul celular

Reproducerea celulară implică evenimente multiple şi complexe ce se succed ciclic şi

care constituie ciclul celular. Funcţie de compartimentele celulare în care se desfăşoară aceste
evenimente se disting două componente ale ciclului celular: ciclul cromozomial şi ciclul
citoplasmatic. În ciclul cromozomial dublarea cantităţii de ADN alternează cu mitoza; în
ciclul citoplasmatic are lor dublarea numărului de organite celulare şi citokineza.

7.1.1. Ciclul celular la plante

La plantele superioare rata ciclurilor celulare este invers proporţională cu temperatura

(5 – 30o), la fiecare interval de temperatură diferite faze ale ciclului rămânând constante ca
o

cinetică. Iniţierea replicării genomului depinde de o sinteză proteică prealabilă, care este
inductoare pentru nucleii cu capacitate de replicaţie; această capacitate pare a fi coordonată de
prezenţa intranucleară a ADNr, adică a segmentului genomic ce transcrie ARNr
(organizatorul nuclear). Duplicarea cromozomilor nu pare să fie în legătură cu distribuţia lor,
fiind posibile mitoze fără duplicarea cromozomilor sau duplicarea fără mitoze, ceea ce duce la
endoploidii. O altă sinteză proteică are loc la începutul fazei G2, fiind necesară condensării
cromozomilor profazici. Sinteza care are loc chiar în profază este necesară desfăşurării
mitozei şi dacă ea lipseşte celulele revin în interfază .

7.1.2. Ciclul celular la animale

Ca şi la plante, cea mai mare parte a ciclului celular de la animale este reprezentată de
interfază, adică de perioada de la sfârşitul unei diviziuni şi începutul următoarei.

161
 Nucleul nu prezintă în interfază transformări vizibile la microscopul fotonic, în schimb,
citospectrofotometric, se poate detecta, după reacţia Feulgen pentru AND, dublarea a acestuia,
ca şi a histonelor (fig. 98).

Interfaza
Faza G1. Urmează mitozei şi durează 5 – 10 ore la mamifere . În cursul ei nu se
înregistrează noi sinteze de ADN şi celulele conţin cantitatea de ADN caracteristică speciei sa
ţesutului respectiv . La om (46 cromozomi), cantitatea de ADN a nucleilor diploizi este de 6,8
x 10 –12g, cantitate care rămâne constantă în decursul perioadei G1. Fibra nucleozomală
unitară, de aproximativ 250Å diametru, formează în anumite locuri de-a lungul cromozomilor
împachetări mai voluminoase, denumite cromomere în raport cu proteinele matriceale.
Aglomerarea mai multor cromomere dă naştere blocurilor de heterocromatină. Fibrele de
cromatină dintre blocurile heterocromatinice sunt mai puţin împachetate, constituind
eucromatina.
Biosinteza proteică depinde de activitatea genică transcripţională din eucromatină,
care elaborează diferiti mesageri sub formă de ARN m ce servesc după aceea în biosinteza
proteică citoplasmatică .
Faza S . Durează 6 – 8 ore, în cursul căreia cantitatea de ADN se dublează . Această
replicare necesită separarea celor două lanţuri de ADN în punctele de iniţiere. Fiecare lanţ
serveşte ca model complementar al altuia nou care se sintetizează enzimatic . Marcajele cu 3H
– timidină a unor culturi celulare sincronizate arată că încorporarea „marcajului” (3H -
timidină) are loc în primele 10 minute ale fazei şi apare pe autoradiografii la periferia
nucleului şi nucleolului. Rata replicării helixului de ADN de la mamifere este de 0,5 – 1 µ /
minut, raportul dintre lungimea cromatinei cu fibra unitară de 250 Å diametru şi lungimea
ADN este la nucleii umani de 1 : 4.

Fig. 98 - Ciclul celular şi mitoza celulei animale

162
 În această perioadă sintetică cantitatea de ADN creşte de la nivelul diploid 2n, trecând
prin etape intermediare: 2,5C; 3C, 3,5C până ajunge la nivelul 4C, moment în care, prin
mecanisme foarte exacte de reglaj celular, încă necunoscute, este încetată încorporarea de 3H -
timidină. Celula şi-a dublat cantitatea de ADN; iniţială în vederea repartizării aceleiaşi
cantităţi 2C, de ADN în celulele fiice, respectiv aceleiaşi cantităţi de informaţie genetică.
Prin ţinerea materialului biologic în contact cu 3H – timidină pentru durate diferite de
timp presupuse a corespunde începutului, mijlocului şi sfârşitului perioadei S, se evidenţiază
autoradiografic o replicare timpurie, mijlocie şi târzie (tardivă) a unor segmente cromozomale
sau cromozomi întregi ai complementului unei celule sau specii.
Când materialul biologic este ţinut mai puţin timp în contact cu izotopul, se constată că
numai anumite părţi ale cromozomilor metafazici vor apare radiografic ca „grain-uri”
(puncte) de încorporare a acestuia. Acestea sunt segmentele eucromatice ale cromozomilor;
care au deci replicare precoce, la începutul perioadei S. Când materialul biologic stă mai mult
timp în contact cu trasorul, corespunzând la 1 / 2 sau 2/3 din stadiul S, se constată că cea mai
mare parte a cromozomului metafazici ca şi cei mai mulţi din cromozomii complementului
prezintă marcaj radioactiv, puţine segmente, respectiv cromozomii, rămânând totuşi
nemarcaţi. Acestea sunt segmente heterocromatice, respectiv cromozomi cu replicare tardivă.
Când materialul biologic a stat în contact cu trasorul pentru un timp ce corespunde unei
perioade S integrale, cromozomii metafazici, apar total marcaţi radioactiv.
Faza G2. Este mai scurtă, durând 4 – 5 ore şi începe odată cu terminarea replicării
heterocromatinei. Sintezele de ADN persistă, iar cantitatea de ADN este dublă faţă de G1.
Faza M (sau mitotică). Reprezintă separarea duplexurilor de cromozomi (sau a
cromatidelor – surori, după unii autori), împreună cu două loturi de citoplasmă care includ toţi
constituenţii săi, în cele două celule fiice.
Prin cinematografie cu contrast de fază s-a stabilit că profaza durează 10 – 15 minute,
prometafaza şi metafaza 25 – 35 minute, anafaza 5 – 8 minute şi telofaza 20 minute .
Derularea ciclului celular implică reglarea succesiunii evenimentelor ce se
desfăşoară în cadrul acestuia
Acurateţea proceselor de replicare şi segregare a ADN depinde de rezolvarea de către
celulă a problemei succesiunii evenimentelor ciclului celular într-o ordine strictă, astfel încât,
declanşarea unui nou eveniment să survină doar în urma încheierii complete a evenimentului
precedent.
Rezolvarea acestei probleme reclamă funcţionarea unor mecanisme de control şi
existenţa la nivel celular a unor factori reglatori.
Primele date privind existenţa unor factori implicaţi în reglarea ciclului celular au
fost furnizate de experienţele de fuziune celulară
Obţinerea populaţiilor de celule sincronizate (în care celulele se află în aceeaşi perioadă
a ciclului celular) şi experienţele de fuziune celulară au sugerat existenţa unor factori reglatori
ce controlează trei evenimente cheie ale ciclului celular:
a) iniţierea sintezei ADN;
b) derularea replicării materialului genetic nuclear;
c) declanşarea procesului mitotic în care are loc segregarea materialului genetic.
S-a constatat că în urma fuzionării unei celule aflate în perioada G1 cu o alta ce se
găseşte în perioada S a ciclului celular, ADN celulei G1 începe să se replice. Experimentul a
stat la baza presupunerii existenţei unui semnal capabil să activeze aparatul ADN replicativ.
Acest semnal absent probabil din celulele G1, dar prezent în citoplasmă celulelor S a fost
numit activator al perioadei S (S - phase activator). Deoarece în celulele hibride G2 x G1 nu
s-a înregistrat iniţiera replicării ADN în nucleul G2, s-a considerat că activatorul fazei S este
eliminat (sau blocat) din citoplasmă celulelor, la scurt timp după încheierea perioadei
sintetice.

163
 În urma fuziunii celulelor aflate în perioadele G2 şi S ale ciclului celular, sinteza ADN
în nucleul celulelor din S continuă până în momentul replicării complete a materialului lor
genetic, ceea ce indică absenţa unui inhibitor al sintezei ADN în citoplasmă celulelor G2. în
acelaşi timp prezenţa activatorului perioadei S nu pare să afecteze nucleul G2 de vreme ce nu
se înregistrează o reiniţiere a replicării ADN în acest nucleu, procesul replicativ fiind blocat
până la trecerea celulei în perioada G1 a unui nou ciclu celular. Funcţionarea unui mecanism
de blocare a sintezei ADN poate explica de ce într-o celulă nu are loc derularea repetată a
procesului ADN replicativ.
S-a constatat că atât replicarea incompletă a materialului genetic, cât şi existenţa unor
erori în molecule ADN nou sintetizate ce reclamă intervenţia mecanismelor de reparare,
determină întârzierea intrării celulei în mitoză. Deoarece procesul replicativ şi cel de reparare
sunt asociate cu existenţa ADN monocatenar, se consideră că excesul de ADN monocatenar
declanşează sinteza unui factor citoplasmatic, semnal ce împiedică intrarea celulelor în mitoză
până în momentul desăvârşirii replicării sau reparăii erorilor. Acest factor ce controlează
acurateţea procesului ADN replicativ a fost numit semnal de întârziere a perioadei mitotice
(M - phase delaying signal).
Intrarea celulelor în mitoză este determinată de dispariţia semnalului de întârziere a
mitozei şi acumularea în citoplasmă a unui factor ce iniţiază mecanismul de segregare a
materialului genetic, numit factor de activare a mitozei (M - phase promoting factor: MPF).
Studiile bazate pe experienţele de fuziune celulară, în care s-au obţinut hibrizi g1 X M;
G2 x M şi S x M, au demonstrat că prezenţa MPF (factor citoplasmatic prezent în celulele
aflate în mitoză) declanşează în nucleul celulelor aflate în oricare perioadă a ciclului celular
condensarea cromatinei, eveniment caracteristic mitozei.
Se sugerează că factorul de întârziere a mitozei exercită un efect inhibitor asupra
sintezei MPF. Acţiunea inhibitoare dispare în prezenţa MPF de vreme ce în celulele hibride,
rezultate prin fuziunea celulelor G1, S sau G2 cu celulele M, în care factorii citoplasmatici
coexistă, are loc condensarea cromatinei.

7.1.3. Ciclinele şi protein - kinazele dependente de cicline

Ciclinele şi protein - kinazele dependente de cicline constituie componentele motorului

ciclului celular. Modificările apărute în statusul motorului, ca urmare a interacţiunilor dintre
cele două componente, declanşează evenimentele ciclului celular (fig. 99). Aceste evenimente
pot fi clasificate în patru grupe:
a) evenimente declanşate de depăşirea punctului de START:
- iniţierea replicării ADN;
- replicarea centrilor organizatori ai microtubulilor (MTOC).
b) evenimente ce au loc pe parcursul derulării replicării ADN.
c) evenimente iniţiate în momentul intrării celulei în mitoză;
- asamblarea fusului de diviziune;
- condensarea cromatinei;
- dezorganizarea membranei nucleare.
d) evenimente ce marchează încheierea procesului mitotic;
- dezasamblarea fusului de diviziune;
- segregarea cromozomilor;
- decondensarea cromatinei;
- reorganizarea membranei nucleare;
- citokineza.

164
 Fig. 99 - Schema generală a funcţionării motorului ciclului celular. Interacţiunile
ce se stabilesc între cicline şi protein kinaze dependente de cicline (cdk) au ca rezultat
declanşarea evenimentelor caracteristice diviziunii celulare.

7.1.3.1. Protein - kinazele dependente de cicline (cdk)

Prima protein kinază dependentă de cicline (34 KDa) a fost descoperită în 1988 ca
produs al genei cdc2 din Saccharomices pompe şi al genei CDC 28 din Saccharomices
cerevisiae. Ea a fost numită proteina p34 cdc2/CDC28 sau cdk1. Proteina cdk1 joacă un rol
important în controlul ciclului celular, operând la nivelul punctelor de graniţă G1/S şi G2/M.
Gene omologe cdc2/CDC28 au fost identificate şi în genomul uman. Introduse prin clonare în
drojdii defective în cdc2/CDC28, genele umane au fost capabile să suplinească absenţa
genelor corespondente din drojdii. Constatarea sugerează că proteina cdkl a fost conservată
de-a lungul evoluţiei speciilor, acest element implicat în reglarea ciclului celular fiind comun
tuturor celulelor eucariote.
Descoperirea unei proteine, p33 (33KDa), numită cdk2 datorită asemănării structurale şi
funcţionale cu cdk1, a demonstrat existenţa unei întregi familii de protein kinaze dependente
de cicline. în prezent, şase membri ai acestei familii au fost identificaţi.

7.1.3.2. Ciclinele
Ciclinele reprezintă un grup restrâns de proteine a căror sinteză se realizează într-o
manieră dependentă de perioadele ciclului celular. Ele activează cdk formând cu acestea
complexe ce prezintă activitate kinazică. Pe parcursul formării complexelor, ciclinele induc
modificări conformaţionale şi de locaţie a cdk ceea ce conferă acestora specificitate în
fosforilarea diferitelor substrate. Specificitatea activităţii catalititce a complexelor ciclină/cdk
stă la baza parcurgerii de către celulă a ciclului celular.

165
 Fig. 100 - Complexele ciclină/cdk implicate în diferitele perioade ale ciclului
celular. Spre deosebire de cicline, care se acumulează în celulă într-o manieră
dependentă de perioadele ciclului celular, cdk sunt prezente pe tot parcursul ciclului
celular.

Funcţie de omologia secvenţelor de aminoacizi şi implicarea lor în perioadele ciclului

celular, ciclinele se clasifică în trei grupe (fig. 100):
a) ciclinele perioadei G1 (ciclinele G1): ciclineie D şi E;
b) ciclinele perioadei S: ciclina A;
c) ciclinele perioadei M (cicline mitotice): ciclina B.
Ciclinele G1 asigură traversarea de către celulă a perioadei G1 şi tranziţia G1/S. Din
această grupă fac parte cele trei subtipuri ale ciclinei D (D1, D2, D3) şi ciclina E.
Ciclinele D sunt sintetizate în faza timpurie a perioadei G1. Ele formează complexe cu
diferite tipuri de cdk (cdk1 - cdk6). Se sugerează că complexele ciclina D/cdk constituie
primele componente ale cascadei ciclinelor, ele acţionând în sensul activării ciclinelor E, care
Ia rândul lor activează ciclinele A implicate în derularea perioadei sintetice a ciclului celular.
Ciclinele E sunt sintetizate târziu în G1. Mai selective comparativ cu ciclinele D,
ciclinele E se asociază doar cu cdk2 şi cdk3.
Acţiunea celor două tipuri de complexe G1 se suprapune spre sfârşitul perioadei G1
având ca rezultat propulsarea celulei în perioada sintetică a ciclului celular.
Ciclina A se asociază cu cdk2 la graniţa dintre perioadele G, şi S. Complexul
favorizează derularea perioadei sintetice şi intrarea celulei în G2. În faza târzie a perioadei S
se formează complexul ciclina A/cdk1 ce conduce celula de-a lungul perioadei G2 spre
graniţa G/M.
Ciclina B prin asociere cu cdk1 dă naştere unui complex cunoscut sub numele de factor
de promovare a celulei în mitoză (MPF – Maturation Promotion Factor) ce operează în
punctul de tranziţie G2/M.
Studiile efectuate pe drojdii au furnizat informaţii interesante cu privire la modul în care
complexul ciclină B/p34cdc2 acţionează în sensul propulsării celulei în perioada mitotică a
ciclului celular (figura 101).

166
 Fig. 101 - Ciclinele B se
acumulează pe parcursul
interfazei, formând prin asociere
cu p34cdc2 complexul pre-MPF.
Acesta este imediat fosforilat la
nivelul Tyr 15 şi a Thr 160 din
p34cdc2 de către tirozin/treonin
kinaza (wee1), pierzându-şi
activitatea kinazică. Sub
acţiunea tirozin fosfatazei
(cdc25) pre-MPF este
defosforilat, transformându-se în
MPF activ la începutul mitozei.
în ultimele etape ale mitozei
ciclinele B sunt rapid degradate
de proteaze.

Sinteza ciclinelor B este iniţiată în faza târzie a perioadei sintetice. Pe parcursul

perioadei G2 ciclinele B se asociază cu p34cdc2 dând naştere unui complex pre-MPF, lipsit
de activitate kinazică. Pierderea activităţii kinazice de către pre-MPF se datorează faptului că
acest complex constituie unul dintre substratele unei tirozin/treonin kinaze. Enzima, produs al
genei weel, fosforilează tirozina 15 şi treonina 160 din lanţul de aminoacizi ai proteinei
p34cdc2. Fosforilarea tirozinei 15 este responsabilă de inhibarea funcţiei kinazice a proteinei
p34cdc2. Defosforilarea tirozinei 15 are loc la sfârşitul perioadei G2 a ciclului celular, sub
acţiunea unei tirozin fosfataze codificată de gena cdc25. Reacţia de defosforilare, transformă
pre-MPF inactiv în MPF cu activitate protein kinazică (figura 102).
MPF inhibă tirozin/treonin kinaza şi activează tirozin fosfataza, ceea ce conduce la
acumularea masivă a MPF în citoplasmă şi, ulterior, declanşarea unei rapide şi ireversibile
treceri a celulei în perioada mitotită a ciclului celular.

Fig. 102 - Reacţiile de

fosforilare şi defosforilare ale MPF

Evenimentele ce marchează
intrarea celulei în perioada mitotică
sunt rezultatul fosforilării directe sau
indirecte a unor proteine de către
MPF. Prin fosforilarea laminelor
nucleare, MPF declanşează
dezorganizarea membranei nucleare.
Fosforilarea histonei H1, proces ce
iniţiază condensarea cromatinei, este
cataliuzaqtă de proteinkinaza, enzimă
activată prin fosforilare de către
MPF. Se consideră că un mecanism
indirect de fosforilare similar stă la
baza asamblării fusului de diviziune.
Dintre enzimele activate de
MPF fac parte şi cele implicate în
conjugarea ciclinelor cu molecula
marker a proteolizei, numită ubiquitină.

167
 În urma ubiquitinării, ciclinele sunt rapid degradate. Scăderea concentraţiei ciclinelor în
celulă este urmată de disocierea complexelor ciclină/cdk. în absenţa acţiunii efectorilor
pozitiv (cicline) scade capacitatea catalitică a cdk ceea ce determină ieşirea celulelor din
mitoză şi intrarea lor într-un nou ciclu celular.

7.1.4. Interacţiunea cicline- proteina Rb - mecanism de reglare pozitivă a

ciclului celular

Proteina Rb transcrisă de antioncogena Rb1 este o proteină nucleară ce face parte dintr-
un mecanism de blocare a proliferării celulare sub acţiunea factorilor antimitotici (sau în
absenţa factorilor mitotici).
În stare hipofosforilată proteina Rb leagă diferite proteine nucleare implicate în reglarea
principalelor procese ce asigură creşterea celulară, inclusiv factori de transcripţie. Unul dintre
aceştia este factorul E2F responsabil de exprimarea genei ce codifică ciclina A. Sechestrarea
factorului E2F blochează sinteza ciclinei A, ceea ce determină menţinerea celulei în G1.
Ciclinele D prezintă o secvenţă peptidică amino-terminală (Leu-X-Cys-X-Glu) prin care
se pot lega la un domeniu specific (pocket region) al proteinei RB, blocându-l. Pe de altă
parte, datorită activităţii kinazice, complexele ciclina D/cdk determină trecerea proteinei Rb în
stare hiperfosforilată, ceea ce conduce la eliberarea factorului E2F şi sinteza ciclinei A. La
rândul lor, ciclinele A menţin proteinele RB în stare hiperfosforilată pe parcursul perioadelor
S, G2 şi M ale ciclului celular (figura 103). Se sugerează că proteinele Rb funcţionează ca un
comutator molecular în activarea în cascadă a ciclinelor prin reglarea sintezei ciclinei A.

Fig. 103 - Fosforilarea proteinei RB

are loc la sfârşitul perioadei G1 sub
acţiunea complexelor ciclină D/cdk.
Proteina este menţinută în stare
hiperfosforilată până la ultimele etape ale
mitozei, când revine în starea
hipofosforilată.

7.1.5. Reglarea ciclului celular

prin mecanisme feed-back

Apariţia unei desincronizări între durata necesară desfăşurării unui eveniment al ciclului
celular şi funcţionarea motorului are ca rezultat iniţierea în celulă a unui nou eveniment
înaintea încheierii celui precedent. Aceasta conduce inevitabil la alterare genetică şi moarte
celulară. Existenţa unor mecanisme de control feed-back face posibilă încetinirea sau blocarea
temporară a motorului ciclului celular în momentul în care desincronizarea a fost detectată.
Un exemplu în acest sens este oprirea intrării celulei în mitoză, prin blocarea activării MPF în
condiţiile unei replicări incomplete a ADN (fig. 104).
Un mecanism de control feed-back reclamă existenţa a cel puţin trei elemente:
a) un senzor ce monitorizează desfăşurarea evenimentului;
b) un semnal generat de senzor;
c) un răspuns la nivelul motorului celular care permite progresia, întârzierea sau oprirea
depăşirii punctului de control de către celulă.
Tot prin mecanisme feed-back celula este capabilă să detecteze şi să remedieze erori ce
apar în desfăşurarea proceselor de replicare şi segregare a materialului genetic. Un rol
interesant în unele mecanisme feed-back îl au inhibitorii cdk (ICDK). Aceste proteine au
drept ţintă cdk şi complexele ciclină/cdk, în special cele active în perioada G.

168
 Un inhibitor cdk este produsul genei GADD45 (Specific Growth Arrest DNA Damage
Inductible). El face parte dintr-o cale de transmitere a semnalelor ce controlează oprirea
ciclului celular în urma lezării ADN sub acţiunea radiaţiilor ionizante. Această cale mai
implică cel puţin doi participanţi: proteina codificată de gena AT (ataxie-telangiectazie) şi
proteina p53 (figura 110).
În urma detectării leziunii la nivel ADN, se remarcă acumularea proteinelor p53 în
celulă, printr-un mecanism ce implică produsul genei AT. Proteina p53 funcţionează ca un
factor de transcripţie ce induce exprimarea genei GADD45. Prin acţiunea inhibitoare asupra
complexelor cicline G,/cdk, proteina GADD, prelugeşte perioada G, oferind timp celulei să
repare leziunea înainte de a intra în perioada S a ciclului celular.
Acest mecanism feed-back este inactivat la persoanele ce suferă de ataxie-
telangiectazie, o boală autozomală recesivă ce se manifestă prin hipersensibilitate la radiaţii, o
incidenţă crescută a cancerelor, ataxie cerebrală progresivă şi deficienţe în sistemul imun.
Recent s-a descoperit un alt mecanism p53 dependent, prin care celula este oprită în
perioada G1 ca urmare a lezării ADN prin radiaţii ionizante sau alţi factori de stres celular.
Proteina p53 induce exprimarea unei gene ce codifică un inhibitor cdk, numit proteina p21
(WAF1 -Activated Fragment-1 sau CIP1 –cdk Interacting Protein-1).Prin legarea proteinei
p21 de diferiţi cdk ce acţionează în G, este blocată activarea complexelor ciclină G,/cdk ceea
ce împiedică fosforilarea substratelor ţintă, cum ar fi proteinele Rb. în acelaşi mod se
consideră că ar acţiona şi proteina 16 (p 16).

Fig. 104 - Mecanismele feed-

back sincronizează funcţionarea
motorului ciclului celular cu
derularea evenimentelor celulare.
Sunt prezentate schematic trei
situaţii:

a) sincronizarea perfectă a
replicării ADN cu activarea MPF ce
declanşează mitoza;
b) replicarea ADN nu este
complet încheiată în momentul
activării MPF.
c) Desincronizarea conduce la
moarte celulară;
d) activarea MPF este blocată
prin mecanism feed-back ceea ce
permite finalizarea procesului
replicativ.

169
 Fig. 105 - Mecanisme feed-back
controlează replicarea ADN în celulele
supuse acţiunii factorilor de stress (radiaţii
ionizante).

Sunt prezentate două căi de control

dependente de proteina p53. Atât calea AT -
p53 - GADD45, cât şi calea p53 - p21 - RB
conduc la oprirea celulei în G1 ca urmare a
detectării unei leziuni la nivel ADN. GADD45
şi p21 funcţionează ca inhibitori ai cdk activi în
perioada G1 a ciclului celular.

7.1.6. Alţi factori responsabili de

controlul proliferării celulare în
organismele pluricelulare

În organismele unicelulare, proliferarea

este un proces rapid a cărui desfăşurare este
influenţată în principal de aportul nutriţional şi
viteza metabolismului celular. În organismele
pluricelulare, celulele individuale ce le compun
cooperează în scopul asigurării supravieţuirii
acestora.
Menţinerea integrităţii structurale a organismului reclamă stabilirea unui permanent
echilibru între proliferare şi moarte celulară (apoptoză).
Acest echilibru este reglat prin numeroşi factori extra şi intracelulari. Majoritatea
acestor factori acţionează asupra unui punct de control (check point) echivalent punctului start
la drojdii, numit punct de restricţie (R).
Diverşi factori ce reglează trecerea celulelor din G1 în S impun reguli stricte de
depăşire a punctului de restricţie, ceea ce ilustrează semnificaţia sa deosebit de complexă la
organismele pluricelulare.
Încălcarea acestor reguli determină grave modificări la nivel celular ce conduc la
malignizare sau moarte celulară. Diversitatea factorilor şi a mecanismelor prin care ei
reglează trecerea din G1 în S a celulelor ce alcătuiesc organismele pluricelulare sugerează
existenţa la sfârşitul perioadei G1 a mai multor puncte de restricţii.

7.1.7. Ciclul cromozomial şi creşterea celulară

Similar organismelor unicelulare, depăşirea perioadei G1 de către celulele organismelor

pluricelulare este condiţionată de atingerea dimensiunii standard.
Există foarte puţini indici cu privire la modalitatea prin care celulele sunt capabile să-şi
sesizeze propria dimensiune.
Dat fiind relaţia de proporţionalitate dintre dimensiunea celulei şi gradul său de ploidie,
s-a sugerat că raportul dintre volumul celular şi cantitatea totală de ADN sau numărul
seturilor de gene din genomul celular ar constitui un factor critic.
Mecanismul prin care dimensiunea celulei influenţează ciclul cromozomial implică
probabil sinteza unei molecule într-o manieră dependentă de cantitatea de ADN celular, în
aceste condiţii, raportul dintre cantitatea totală a moleculei şi ADN celular rămâne constantă.

170
 Scăderea concentraţiei moleculei sub o valoare prag, determinată de creşterea volumului
celular, ar putea constitui un semnal de depăşire al punctului de restricţie şi de iniţiere a
replicării ADN. În organismele pluricelulare numeroase celule se găsesc în stadiul G0.
În aceste celule raportul dintre sinteza şi degradarea proteinelor este modificat în
comparaţie cu cel al celulelor proliferative aflate în perioada G1.
Atât aparatul proteosintetic (ribozomi, ARNm, proteine implicate în desfăşurarea sau
reglarea acestui proces), cât şi viteza sintezei proteice sunt mult diminuate.
Celula îşi sintetizează proteinele de întreţinere, rămânând viabilă, dar nu mai creşte, în
urma stimulării cu factori de creştere a celulelor aflate în G0, se constată o intensificare a
proteosintezei, ea evoluând paralel cu ciclul cromozomial.
Legătura dintre creşterea şi proliferarea celulară nu este rigidă. Afirmaţia se bazează pe
rezultatele experienţelor pe culturi de celule în care s-a reuşit blocarea sintezei proteice fără ca
ciclul cromozomial să fie afectat şi invers. De asemenea, pentru unele celule aflate în G0, (de
exemplu neuronii) creşterea celulară nu reclamă replicarea ADN.

7.1.8. Implicarea factorilor de creştere în reglarea diviziunii celulare

Factorii de creştere sunt proteine implicate specific în stimularea diviziunii celulare.

Recunoaşterea lor de către celule prin intermediul receptorilor, prezenţi la nivelul membranei
plasmatice, reprezintă o primă etapă a unui mecanism complex finalizat prin inducerea
replicării ADN.
Factorul de creştere derivat din trombocite (platelet-derivated growth factor-PDGF) este
unul din cele aproximativ 30 de tipuri de factori de creştere identificaţi.
El stimulează proliferarea fibroblaştilor în culturi celulare şi a celulelor din ţesuturile
conjunctiv şi muscular neted, făcând astfel posibilă repararea leziunilor tisulare. Alţi factori
de creştere sunt prezentaţi în tabelul 3.
Recunoaşterea şi legarea factorului de creştere de către receptorul specific declanşează
evenimente ce se derulează în cascadă, prin intermediul cărora semnalul este transmis de la
nivelul membranei plasmatice la genele implicate în proliferarea celulară (procesul fiind
denumit signal transduction).
În transmiterea semnalului un rol important îl are fosforilarea proteinelor antrenate în
acest proces. Receptorul pentru factorul de creştere este o proteină cu activitate tirozin-
kinazică. Formarea complexului receptor-factor de creştere determină autofosforilarea la
nivelul tirozinei a regiunii intracitoplasmatice a receptorului, care devine astfel capabila sa
fosforileze alte proteine asociate membranei plasmatice.
Semnalul amplificat este preluat de proteine citoplasmatice cu activitate tirozin sau
treonin/ serin-kinazica şi ulterior transmis în nucleu proteinelor ce joaca rolul de factori de
reglare ai replicării şi ai transcripţiei AND.
Factorii de reglare operează la nivelul materialului genetic în sensul activării genelor ce
transcriu proteinele implicate în iniţierea sintezei AND, fapt care determină depăşirea de către
celulă a punctului de restricţie.
Majoritatea proteinelor antrenate în răspunsul celular la factorii de creştere sunt
codificate de proto-oncogene, gene care prin diferite mecanisme (mutaţie punctiformă,
rearanjare cromozomială, amplificare genetică sau inserţie mutatională) se pot activa,
devenind oncogene, capabile să inducă transformarea malignă a celulei (fig. 106).

171
 Tabelul 3. Factorii de creştere şi acţiunea lor asupra celulelor ţintă

Factorii de creştere Acţiunea asupra celulelor ţinta

Factorul de creştere epidermal (EGF) Stimulează proliferarea mai multor tipuri celulare.
Factori de creştere de tip insulinic Stimulează proliferarea adipocitelor si a celulelor
(IGF-I; IGF-II) di tesutul conjunctiv.
Stimulează proliferarea:
Factorul de creştere a fibroblastilor - fibroblaştilor;
(FGF) - celulelor endoteliale;
- mioblaştilor.
Induce creşterea axonală si viabilitatea neuronilor
Factorul de creştere neuronal (NGF)
simpatici şi senzori.
Interleukina 2 (IL2) Stimulează proliferarea limfocitelor T.
Stimulează proliferarea celulelor stem şi a
Interleukina 3 (IL3) majoritatii celulelor precursoare ale multor celule
diferenţiate.
Stimulează proliferarea celulelor precur-soare ale
Eritropoietina
eritrocitelor.
Stimulează proliferarea:
Factori de stimulare a coloniilor - celulelor precursoare ale macrofagelor şi
granulocitare (G-CSF) granulocitelor;
- neutrofilelor.
Factori de stimulare a coloniilor de Stimulează proliferarea:
macrofage (M-CSF) - celulelor precursoare ale macrofagelor şi
granulocitelor;
- macrofagelor.

Fig. 106 - Principalele proteine

codificate de protooncogene ce intervin în
transmiterea semnalului de proliferare
celulară de la factorul de creştere la ADN.

Activitatea proto-oncogenelor în
oncogene şi implicit codificarea unor proteine
ce prezintă modificări calitative sau/şi
cantitative conduce la pierderea capacităţii
celulei de a răspumde corect faţă de factorii de
creştere. Celulele transformate se comportă ca
şi cum complexul receptor-factor de creştere
ar avea un caracter permanent, ramânând într-
o continuă stare proliferativă.

7.1.8.1. Competiţia celulelor pentru

factorii de creştere
Deoarece celulele conţin numeroase
tipuri de receptori, proliferarea este dependentă de coexistenţa mai multor factori de creştere.
În organismele pluricelulare, factorii de creştere prezenţi în combinaţii variate reglează
selectiv diviziunea diferitelor tipuri celulare.
Factorii de creştere constituie elemente prin care celulele sunt capabile să controleze
proliferarea altor celule (mecanisme paracrine) ce se încadrează în clase diferite sau aparţin
aceleiaşi clase (mecanisme autocrine).

172
 În acest ultim caz, cooperarea intercelulară permite menţinerea unei anumite densitatea
a populaţiei celulare. Afirmaţia se bazează pe rezultatele studiilor interprinse pe culturi
celulare. S-a observat că într-o cultură de fibroblaşti formarea monostratului induce inhibarea
proliferării celulare, fenomen cunoscut sub numele de inhibiţie de contact sau inhibarea
diviziunii celulare dependenta de densitate. Densitatea populaţiei celulare în monostrat, la
care proliferarea este inhibata, depinde de concentraţia factorilor de creştere din mediu.
Deoarece factorii de creştere sunt prezenţi în mediu în concentraţii foarte mici
(PDGF=10-10 M), iar celulele ţintă conţin numeroşi receptori specifici (105 receptori pentru
PDGF/ fibroblast), celulele ce alcătuiesc populaţia se găsesc într-o permanentă competiţie
pentru factorii de creştere. În momentul în care densitatea populaţiei celulare depaşeşte o
valoare prag, concentraţia factorilor de creştere scade şi în consecinţa diviziunea celulara este
oprită.

7.1.9. Influenţa adeziunii celulare asupra proliferării

S-a constatat ca celulele cultivate în suspensie, supuse unei permanente agitari, devin
sferice şi îşi pierd capacitatea proliferativă, fenomen numit dependenţa de ancorare a
diviziunii celulare.
În culturile statice, celulele se ataşează de suportul solid, prin intermediul contactelor
focale ce reprezintă locuri de ancorare în matricea extracelulară a filamentelor de actină ce
alcătuiesc citoscheletul. Ataşarea impune celulei adoptarea unei forme aplatizate şi
favorizează proliferarea acesteia, fapt ce sugerează existenta unui mecanism ce cuplează
diviziunea celulara cu organizarea citoscheletului.
La majoritatea celulelor organismelor vertebrate, formarea adeziunilor intercelulare şi
celula-matrice este o condiţie importantă în depăşirea punctului de restricţie . După intrarea în
perioada sintetică, până la încheierea mitozei, celulele pierd parţial legăturile ce le stabilizează
în ţesut şi se rotunjesc (fig.107).

Fig. 107 - Celulele ce se găsesc în mitoză pierd legăturile ce le stabilizează în ţesut

prin dezorganizarea contactelor focale

Mecanismul ce stă la baza pierderii de către celule a adeziunii la substrat (in vitro) sau
la matricea extracelulară (in vivo) este încă insuficient cunoscut.
Un rol important în acest mecanism îl joacă proteina SRC, care, conform
experimentelor cu anticorpi monoclinali, pare a fi concentrate la nivelul contactelor focale.
Proteina cu activitate tirozin-kinazica, SRC, poate determina dezorganizarea contactelor
focale pe doua căi.

173
 Prima cale implică fosforilarea receptorului pentru fibronectină. În urma fosforilării
scade afinitatea receptorului pentru fibronectină (element al matricei extracelulare), căt şi
pentru talină (proteină de adeziune intacelulară). Acest fapt conduce la instabilizarea
legăturilor dintre componentele contactului focal şi la eliberarea mănunchiurilor de filamente
de actină.
A doua cale constă în secreţia masivă a unei enzime proteolitice, numită activator de
plasminogen. Ea este capabilă să activeze prin clivarea plasminogenului, plasmina, o alta
enzima proteolitică. Printre proteinele degradate de plasmină se numără şi proteinele matricei
extracelulare, inclusiv fibronectina.
Activarea SRC în celulele normale are loc în urma legării unui factor de creştere la
receptorul specific (fig.108).

Fig. 108 - Schema modificărilor ce apar la nivelul contactelor focale ca urmare a

recunoaşterii şi legării factorilor de creştere de către receptori specifici

Există cel puţin patru argumente ce stau la baza acestei afirmaţii:

ƒ acţiunea SRC are caracter tranzitoriu;
ƒ SRC este implicată în stimularea proliferării celulare prin factori de creştere;
ƒ într-o primă etapă, stimularea unei celule prin factori de creştere determină pierderea
de către celula a adeziunii la substrat;
ƒ in vivo, dezorganizarea structurii complexe de la nivelul contactelor focale nu este
suficientă pentru inducerea replicării ea necesită şi prezenţa factorilor de creştere.
Găsirea unui răspuns cu privire la modul prin care adeziunea celulară declanşează
replicarea AND şi depăşirea punctului de restricţie se dovedeşte a fi foarte dificilă.
Până în prezent, se consideră că pentru inducerea sintezei ADN, într-o celulă normală,
sunt necesare trei evenimente:
ƒ ancorarea celulei la matricea extracelulară prin asamblarea într-o structură complexă a
proteinelor intercelulare specializate şi a elementelor de citoschelet;
ƒ activitatea acestei structuri prin factori de creştere şi eliberarea unui semnal ce
dictează depăşirea punctului de restricţie;
ƒ dezasamblarea structurilor ce asigura adeziunile celulă-celulă şi celulă-matrice, ca
rezultat al eliberării semnalului.

174
 Ciclurile de ataşare şi detaşare celulară permit probabil rearanjarea punctelor de contact,
implicate în adeziunea celulă-celulă şi celulă-matrice. Aceasta face posibilă ordonarea şi
ulterior legarea în ţesut a celulelor rezultate în urma diviziunii celulare.
În celulele maligne dezorganizarea structurilor implicate în adeziunea celulară este
suficientă, pentru generarea semnalului de proliferare.

7. 2. Diviziunea celulară
În cea de-a patra perioada a ciclului celular, perioada mitotică, au loc procese
distributive, de repartizare în celulele fiice ale constituenţilor celulari implicaţi în interfază.
Totalitatea acestor procese poarta numele de diviziune celulară indirectă, deoarece întâi
are loc cariokineza, denumirea fiind sugerată de schimbările majore ce au la nivelul nucleului
celular şi apoi citokineza, respectiv separarea maselor de citoplasmă (diviziunea citoplasmei).
Desfasurarea diviziunii celulare indirecte necesită diferenţierea în spaţiul intracelular a
aparatului mitotic. Acesta este alcătuit din două componente: aparatul cromatic (cromozomii)
şi aparatul acromatic (fusul de diviziune şi centrii celulari).
Formarea aparatului mitotic este iniţiată de proteine activate prin fosforilare directă sau
indirecta de catre MPF.
Activarea protein kinazei H1 de către MPF face posibilă fosforilarea histonei H1 şi, în
consecinţă, condensarea cromatinei şi apariţia cromozomilor.
Acest eveniment fascinant al diviziunii mitotice constituie pentru celulă un mecanism
eficient ce garantează repartizarea egală a materialului genetic în celulele fiice. Segregarea
cromozomilor ar fi însa imposibilă în absenţa aparatului acromatic a cărui organizare implică
fosforilarea indirectă a proteinelor asociate cu microtubulii de către MPF.
Apariţia celui de al doilea centru celular conferă celulei un caracter bipolar. Între cei doi
poli ai celulei se formeaza fusul de diviziune ce are rolul de a ancora şi separa cromatidele
surori ale cromozomului mitotic, care se comportă ca elemente pasive în procesul de
segregare. La celulelor, cu un numar mare de cromozomi, s-a impus rezolvarea problemei
uşurării accesului fibrelor fusului de diviziune la cromozomi. Soluţia pe care celula a găsit-o,
pentru aceasta problemă, constă în dezorganizarea şi reorganizarea membranei nucleare.
Modificările la nivelul membranei nucleare se datorează fosforilării şi defosforilării laminelor,
proces reglat direct de MPF.
Se apreciază că MPF nu reglează doar procesul distributiv al materialuilui genetic, ci şi
scindarea celulei parentale în celulele fiice (citokineza). Este posibil ca acest mecanism de
reglare să se realizeze prin fosforilarea proteinelor asociate filamentelor de actină şi miozină
ce intră în structura inelului contractil.
În funcţie de modul de desfăşurare, se deosebesc două tipuri de diviziune celulară
indirectă : Mitoza şi Meioza.

7.2.1. Mitoza (diviziunea mitotică)

Mitoza (greaca: mithos=aţă, fir) constituie tipul de diviziune caracteristic celulelor

somatice ale tuturor organismelor eucariote. Ea este denumită şi diviziune ecvaţională,
deoarece în cadrul ei celula îşi conservă garnitura cromozomilală initială, celulele fiice
prezentand acelaşi număr de cromozomi ca şi celula parentală.

175
 Fig. 109 - Schema generală a mitozei.

Mitoza poate fi impărţită în cinci etape

caracterizate prin modificări morfologice specifice :
profaza, prometafaza, metafaza, anafaza şi telofaza.
Cea de-a şasea etapă a diviziunii mitotice, citokineza,
debutează în anafază şi se încheie la sfârşitul ciclului
celular (fig.109).

A. Profaza

Profaza se caracterizeaza prin condensarea

cromatinei şi individualizarea cromozomilor sub
forma unor filamente, subţiri, duble şi ataşate pe faţa
exoplasmatică a membranei interne nucleare.
Filamentele sunt intim asociate formând un spirem
(ghem).
Cele doua cromatide ce alcatuiesc cromozomul
sunt unite la nivelul centromerului şi sunt strâns
răsucite una în jurul celeilalte (spiralizarea
plactonemică). Condensrea cromatinei continuă pe
intreaga durată a profazei conducând la scurtarea şi
ingrosarea progresivă a filamentelor cromatidice.
La începutul profazei centrul celular se divide generând doi centri celulari. Fiecare
conţine câte o pereche de centrioli din care unul matur şi altul în crestere.
Centrii celulari rezultati se deplaseaza spre polii opuşi ai celulei. Concomitent se
înregistrează dezorganizarea microtubulilor citoplasmatici, parte componentă a citoscheletului
interfazic şi apariţia fusului de diviziune, structura bipolară alcatuită din microtubuli şi
proteine asociate, dispusă între cei doi centrii celulari. Fusul de diviziune se asamblează iniţial
în afara nucleului. Profaza se caracterizeză prin condensarea cromatinei cu individualizarea
cromozomilor bicromatidici, diferenţierea fusului de diviziune şi dezorganizarea nucleolului
(fig. 110).

Fig. 110 - Profaza

176
 Creşterea gradului de condensare a cromatinei este însoţită de o încetinire a proceselor
de transcripţie şi sinteză proteică.
Principalele proteine sintetizate în profaza timpurie şi mijlocie sunt cele implicate în
condensarea cromatinei şi edificarea aparatului acromatic.
Scăderea gradată a procesului transcriptional determină iniţial micşorarea volumului
nucleolar şi ulterior, la sfârşitul profazei, fragmentarea şi completa sa dezorganizare ca
rezultat al blocării sintezei ARN.

B. Prometafaza
Prometafaza debutează prin fragmentarea învelişului nuclear în vezicule delimitate de
membrană ce staţionează pe întreaga duratî a mitozei în jurul fusului de diviziune.
În urma acestui eveniment, carioplasma fuzionează cu hialoplasma formând
mixoplasma. Dezasamblarea membranei nucleare permite accesul fibrelor fusului de
diviziune în regiunea nucleară (fig. 111).

Fig. 111. Prometafază

În prometafaza pe cele doua feţe opuse ale centromerului se maturează complexe

proteice specilizate în ancorarea cromozomilor de către fibrele fusoriale, numite kinetocori.
Cei doi kinetocori ai unui cromozom sunt capturaţi de fibre ale fusului de diviziune ce pleacă
din centrii celulari opuşi.
Acestea au fost numite fibre kinetocorice. Fibrele fusoriale libere, orientate spre planul
ecuatorial al celulei, poartă numele de fibre polare.
Tensiunea exercitată de fibrele kinetocorice asupra cromozomilor imprimă acestora o
mişcare agitată, de oscilare între cei doi poli celulari.

C. Metafaza
Metafaza este inertă din punct de vedere sintetic, cromatina atingând condensarea
maximă. Cromatidele surori ale cromozomului metafazic sunt situate una alături de cealaltă.
Fibrele kinetocorice aliniază cromozomii într-un singur plan perpendicular pe axa fusului de
diviziune, localizat la jumatatea distanţei ce separă polii celulari, formand placa ecuatorială
sau metafazică (fig. 112).
Alinierea cromozomilor în planul ecuatorial al fusului de diviziune constituie principalul
eveniment al metafazei.

177
 Fig. 112 - Metafaza: alinierea
cromozomilor în planul ecuatorial al
fusului de diviziune, formând placa
ecuatorială sau metafazică

Mecanismul deplasării cromozomilor

spre regiunea ecuatorială a celulei şi a
alinierii lor în placa metafazică este
prezentat pe larg în capitolul 4.
La sfârşitul metafazei are loc
desăvarşirea replicării centromerilor, ceea
ce are drept consecinţă separarea
cromatidelor surori ale cromozomilor în anafază.

D. Anafaza
Primul eveniment ce marchează începutul anafazei constă în segregarea kinetocorilor
pereche din fiecare cromozom, ca rezultat a replicării centromerilor şi separarea ulterioara a
cromatidelor surori.
S-a constatat că detaşarea, prin micromanipulare, a fibrelor kinetocorice ce ancorează
unul din cromozomii metafazici nu interferă cu separarea cromatidelor surori. Segregarea
cromatidelor tuturor cromozomilor, inclusiv a celui detaşat se desfăşoară simultan. Observaţia
sugerează ca iniţierea anafazei nu este dictate de aparatul acromatic, ci de un semnal specific.
Studiile întreprinse , pe cultura de celule, au demonstrate ca declanşarea anafazei este
însoţită de creşterea concentraţiei intercelulare a ionilor de calciu. Mai mult, creşterea
experimentală a concentraţiei de Ca2+ în spaţiul intracelular conduce la iniţierea prematură a
anafazei. Se consideră că un semnal, încă necunoscut, determina eliberarea Ca2+ din
veziculele delimitate de membrane ce înconjoară fusul de diviziune şi prin aceasta, intrarea
celulei în anafază.
La trecerea celulei din metafază la anafază are loc defosforilarea unui număr mare de
proteine, inclusiv histonele H1 şi laminele. Identificarea proteinelor antrenate în aceasta
reacţie ar putea reprezenta o cale spre descoperirea semnalului ce iniţiază anafaza.
În anafaza, cromatidele surori ale cromozomilor sunt deplasate spre poli opuşi ai celulei
cu viteza de aproximativ 1mm/min. Acest eveniment ce constituie anafaza A este rezultatul
depolimerizării fibrelor kinetocorice. Concomitent are loc îndepărtarea polilor celulari prin
alungirea fibrelor polare, eveniment ce marchează anafaza B. Mecanismele prin care se
realizează translocarea cromozomilor anafazici şi îndepărtarea polilor celulari sunt prezentate
în capitolul ce prezintă elementele componente al citoscheletului (capitolul 4).
Cromozomii anafazici, monocromatici suferă de regulă un proces de decondesare,
însoţit de creşterea lor în lungime. La sfârşitul anafazei, cromozomii se afla grupaţi la cei doi
poli ai celulei şi fibrele kinetocorice dispar (fig. 113).

178
 Fig. 113 - Anafaza; a) depolimerizarea fibrelor kinetocorice; b) polimerizarea
fibrelor polare.

E. Telofaza

În telofază se desfăşoară procese inverse celor ce au loc în profaza. Decondensarea

cromozomilor continuă. Dacă la începutul telofazei ei au aspectul unor fibre fine, alungite şi
încolăcite unele în jurul altora formând câte un spirem, la fiecare pol celular, spre sfârşitul ei,
cromatina îşi recapătă aspectul
caracteristic interfazei (fig. 114).

Fig. 114 - Telofaza

Veziculele delimitate de
membrană, ce înconjoară fusul de
diviziune, fuzionează delimitând doua
spaţii nucleare situate la polii celulari
opuşi. Porii nucleari se reasamblează,
iar laminele defosforilate se
reasociază formând lamina nucleară.
Un rol important în
reorganizarea membranei nucleare îl
are lamina B ce rămâne permanent
ataşata de membranele veziculelor
rezultate prin fragmentarea învelişului nuclear în prometafază.
La nivel nuclear, reîncepe sinteza ARN, iar în citoplasmă procesul de proteosinteză se
intensifică. Transcripţia genelor ARNr, din organizatorii nucleolari şi formarea subunităţilor
ribonucleoproteice (RNP) prin asocierea ARNr cu proteinele specifice importate în nucleul
din citoplasma, conduc la reapariţia nucleolului. La om, cele cinci perechi de organizatori
nucleolari controlează formarea în telofază a cinci nucleoli. De regula aceştia fuzionează
astfel încât în majoritatea celulelor interfazice nucleul celular prezintă un singur nucleol. Pe
întreaga durata a telofazei are loc dezorganizarea aparatului acromatic.

179
 F. Citokineza

Citokineza defineşte fenomenul de diviziune a citoplasmei. Deşi s-a constatat ca

citokineza nu are loc niciodată înaintea diviziunii nucleare, totuşi procesul mitotic nu
condiţionează strict declanşarea diviziunii citoplasmatice. Studiul primei etape a dezvoltării
embrionale la Drosophila melanogaster ne oferă un exemplu concret. Oul fecundat al
Drosophilei melanogaster parcurge 13 cicluri de diviziuni nucleare, transformându-se intr-o
celula multinucleară. Prima diviziune citoplasmatica are loc după cel de-al 13-lea ciclu
mitotic si conduce la formarea aproximativ a 600 de celule uninucleate.
La celulele animale diviziunea citoplasmatica se realizează prin clivarea. Locul de
clivare devine vizibil încă din anafaza, sub forma unei adâncituri (sunt), pe suprafaţa
membranei plasmatice. El este situate in planul plăcii ecuatoriale, perpendicular pe fusul de
diviziune.
Experimentele efectuate, in vitro, în care s-a realizat deplasarea prin micromanipulare, a
fusului mitotic la începutul anafazei, au avut drept rezultat invariabil schimbarea situsului de
clivare. Aceasta demonstrează ca planul de scindare al citoplasmei este determinat spaţial de
poziţia fusului de diviziune. Deci, este posibil ca o anume orientare a fusului de diviziune să
dicteze caracterul simetric sau asimetric al diviziuni celulare.
Recent, s-a constatat ca distrugerea fusului mitotic, prin tratare cu colchicina, după
apariţia şanţului de clivare nu duce la blocarea diviziunii citoplasmice. Deci, după momentul
iniţierii clivării, mecanismul citokinezei devine independent de structurile microtubulare.
Rolul principal revine acum inelului contractil. Această structura alcătuită din filamente de
actină şi miozină, ataşate de fosa citoplasmatică a plasmalemei prin proteine încă
necaracterizate, se asamblează la începutul anafazei.
Contracţia inelului prin mecanismul actină - miozină concomitent cu depolimerizarea
filamentelor de actină ce-l alcătuiesc, conduc la continua micşorare a diametrului sau/şi
implicit la adâncirea şanţului de clivare.
La sfârşitul perioadei mitotice cele doua celule fiice sunt încă unite printr-o regiune
centrală (“midbody”), ce conţine fibre polare ale fusului de diviziune parţial dezorganizate
înconjurate de hialoplasma (fig. 115).

Fig. 115 - În cazul celulelor

animale citokineza se realizează
prin clivare.

Separarea completa a celulelor

fiice, moment ce marchează
desavarşirea citokinezei, are loc la
începutul următoarei interfaze.
Fiecare celulă fiică moşteneşte
în urma citokinezei un set de
componente celulare, deoarece, cu
excepţia nucleului, organitele
celulare nu se pot duplica în
absenţa unei copii preexistente, în
celula parentală are loc duplicarea
constituenţilor celulari înaintea declanşării citokinezei. Duplicarea organitelor celulare se
realizează prin mecanisme diferite. Mitocondriile cresc şi se divid prin fisiune, aparatul Golgi
şi reticulul endoplasmatic se fragmentează în vezicule din care se vor fi construite noile
organite celulare, în timp ce ribozomii se multiplică prin asamblarea elementelor constituente
(ARNr şi proteine ribozomale).

180
 Ţinând cont de numărul de copii ale organitelor celulare dintr-o celulă eucariotă şi de
duplicarea lor înaintea diviziunii, se apreciază că celula nu dispune de un mecanism
specializat de distribuire a organitelor celulare.
S-a constatat că suprafaţa totală a celulelor fiice este mai mare decât cea a celulei
parentale. Deci, membrana plamatică a celulei ce se divide este insuficientă pentru celulele
rezultate în urma citokinezei. Aceasta impune intensificarea biosintezei membranei
plasmatice în celula parentalăp , anterior declanşării diviziunii celulare.

7.2.2. Meioza (diviziunea meiotică)

Meioza (geacă ”meiosis = micşorare”) este întâlnită în procesul de gametogeneză

(formarea gameţilor) şi reprezintă un tip de diviziune nucleară caracteristic celulelor
germinale.
Meioza se caracterizează prin înjumătăţirea numărului de cromozomi în celulele
progene. În celulele diploide (2n), inclusiv cele germinale, nucleul conţine cu excepţia
cromozomilor de sex (X şi Y), perechi de cromozomi omologi, fiecare pereche fiind alcătuită
dintr-un cromozom matern şi altul patern. Gameţii ( spermatozoidul şi ovulul) rezultaţi prin
diviziunea celulelor germinale sunt celule haploide (n). În nucleul lor se găsesc câte un
cromozom din fiecare pereche de omologi (autozomii) şi un singur cromozom ce determină
sexul (heterozomii, X şi Y).
Meioza reprezintă un mecanism complex ce implică desfăşurarea succesivă a două
diviziuni indirecte – meioza I şi meioza II (fig.116).

Fig. 116 - Schema generală a

meiozei

Cele doua diviziuni ce au loc în

cadrul meiozei sunt precedate de o
interfaza premeitica (identică cu
interfaza mitotică) şi separate de o
interfază scurtă, din care lipseşte
perioada sintetica (replicarea AND),
numită Interfaza meiotică.

A. Prima diviziune a meiozei

(meioza I)

Meioza este o diviziune

reducţională complet diferită de
mitoza somatică. Ea asigură
înjumătăţirea numărului de
cromozomi în celulele progene.
Meioza I are loc imediat după
încheierea interfazei premeiotice,
astfel încât la începutul acestei
diviziuni AND este complet replicat
(celulele sunt tetraploide), fiecare
cromozom fiind alcătuit din doua
cromatide surori.
Cromozomii bicromatidici omologi (matern şi patern) se grupează în perechi formând o
structura tetracromatidică, numită cromozom bivalent sau tetradă.

181
 Cromatidele nesurori ale bivalentului sunt antrenate în procese de remaniere
cromozomială. Separarea ulterioară a cromozomilor omologi , translocarea acestora spre polii
celulari opuşi şi citokineza conduc la formarea a două celule progene. Fiecare progen conţine
câte două copii ale unui singur cromozom din fiecare pereche de omologi ai celulei parentale
(jumătate din numărul cromozomilor celulei mamă). Copiile sunt asociate formând un
cromozom bicromatidic .
Înţelegerea proceselor ce se desfăşoară pe parcursul meiozei, face necesară prezentarea
etapizată a acestui tip de diviziune
Similar mitozei somatice, în cadrul meiozei I, se disting cinci etape: profaza,
prometafaza, metafaza, anafaza şi telofaza. Meioza I se încheie cu procesul de citokineză.

a) Profaza meiozei (profaza I)

Profaza I se deosebeşte de profaza mitotică atât sub aspectul duratei (90-95% din
desfăşurarea meiozei I), cât şi sub cel al evenimentelor ce au loc în această etapă. Profaza I
este împărţită în cinci stadii succesive: leptoten, zigoten, pachiten, diploten şi diachineza.
Laptotenul se caracterizează prin condensarea cromatinei şi individualizarea
cromozomilor sub forma unor filamente lungi şi subţiri. Deoarece in perioada S a interfazei,
materialul genetic al celulei parentale (2N) a fost replicat, celula în leptoten este tetraploidă
(4N).
Fiecare cromozom este alcătuit din două cromatide surori unite la nivelul centromerului
şi intim asociate, ceea ce oferă cromozomului un aspect monocromatidic Cromozomi sunt
ataşaţi cu ambele capete de învelişul nuclear prin intermediul unor structuri specializate
numite placi de ataşare.
La sfârşitul leptotenului, pe o singura parte, în lungul fiecărui cromozom se diferenţiază
o lama proteică (400-700 A grosime), numita axă. Cromatina ce formează cromatidele surori
proeminează sub forma unor bucle, pe faţa
opusă axei (fig.117).

Fig. 117 - Stadiul de leptoten

Zigotenul reprezintă stadiul în care are

loc conjugarea cromozomilor omologi,
numit sinapsis (sinapsarea sau formarea
sinapsei).
Conjugarea este anticipată de
apropierea omologilor. Recunoaşterea şi
gruparea cromozomilor omologi în pereche
se realizează prin intermediul proteinelor ce
intră în alcătuirea axelor.
Un rol în aceste evenimente il joaca şi învelişul nuclear de vreme ce, în zigoten,
cromozomi continuă să fie ataşaţi de membrana nucleară.
Conjugarea cromozomilor omologi poate fi iniţiată de la o extremitate a acestora
(proterminală) ori din una sau mai multe regiuni centrale (procentrică). Iniţierea conjugării
implică interacţii între perechile de baze complementare ale ADN din regiuni cromozomiale
specifice numite zigomere sau sinapsomere.
Prin stabilirea interacţiilor se realizează alinierea cromozomilor, astfel încat fiecare genă
dintr-un cromozom este juxtapusă genei omologe din cromozomul pereche. Din punctele de
iniţiere conjugarea se extinde progresiv, cuprinzând integral cromozomii prealiniaţi într-o
manieră zipper like (zipper = fermoar). Rezultatul desăvârşirii conjugării îl constituie
formarea bivalenţilor, numiţi şi tetrade, denumire sugerată de numărul cromatidelor ce-i
alcătuiesc.

182
 În momentul conjugării, cele doua axe ale cromozomilor omologi sunt dispuse faţă în
faţă, la o distanta de 100 nm, constituind elementele laterale ale unei structuri trilamelare,
numită complex sinaptinemal.
O lama proteică (200 Å grosime) este interpusă între cele doua axe. Ea reprezintă cea
de-a treia componentă a complexului sinaptonemal şi poarta numele de element central.
Elementele laterale sunt conectate la elementul central prin intermediul unor benzi protice
transversale dispuse în mod similar treptelor unei scări (fig. 118).

Fig. 118. Stadiul de zigoten.

În meioza I, complexul
sinaptonemal joacă un rol
important în stabilizarea
cromozomilor omologi în
tetradă.
Conjugarea
cromozomilor X si Y, pe
parcursul meiozei I a celulelor
germinale din indivizii
masculi, este posibilă datorită
existenţei la cei doi cromozomi
de sex a unei regiuni terminale
omologe.
Pachitenul începe în
momentul desăvârşirii
conjugării cromozomilor.
Ca rezultat al condensării progresive a cromatinei pe parcursul primelor doua stadii ale
profazei I , în pachiten cromozomii sunt mai groşi şi mai scurţi.
Principalul eveniment ce caracterizează pachitenul este crossing-over-ul, fenomenul ce
implica ruperea în aceiaşi poziţie a extremităţii unei cromatide materne şi a alteia paterne şi
reunirea încrucişată a fragmentelor. Prin schimbul reciproc de fragmente între cromatidele
surori se realizează recombinarea genetică. Fiecare cromozom va conţine gene aparţinând
ambilor genitori, noua combinaţie de gene creată transmiţându-se generaţiilor următoare.
Structura ce oferă premisele desfaşurării crossing-over-ului este reprezentată de
complexul sinaptonemal. Procesul de recombinare este catalizat de către complexe
multiproteice a căror diametru este de 90 nm, numite noduli de recombinare. Aceştia se
formează în interiorul complexului sinaptonemal ocupând aproape integral spaţiul ce separa
cele două axe ale cromozomilor omologi (fig.119).

Fig. 119. Stadiul de pachiten

Deşi implicarea complexelor

multiproteice în recombinarea
genetică nu a fost demonstrată
experimental, se consideră că nodulii
de recombinare conţin întregul
echipament enzimatic necesar clivării
cromatidelor surori, reunirii
încrucişate a fragmentelor
cromatidice.

183
 Participarea acestor noduli în desfăşurarea crossing-over-ului a fost sugerată de
următoarele constatări:
a. corelarea existentă între numărul nodulilor şi cel al chiasmelor evidenţiate în stadiul
următor al profazei I;
b. distribuţia spaţială similară a nodulilor de recombinare şi a evenimentelor de crossing-
over de-a lungul complexului sinaptonemal;
c. la mutanţi de Drosophila melanogaster ce prezintă o diminuare şi o distribuţie anormală a
crossing-over-ului, numărul nodulilor de recombinare este mai mic, iar localizarea lor
diferă de cea întâlnită la indivizii normali.
Aceste observaţii atestă rolul important pe care nodulii îl joacă în procesul de
recombinare, numărul şi localizarea acestora în complexul sinaptonemal determinând
frecvenţa şi situsul crossing-over-ului.
Diplotenul reprezintă stadiul profazei I în care are loc separarea parţială a omologilor
prin dezorganizarea complexului sinaptonemal. Cromozomi omologi rămân ataşaţi la nivelul
situsurilor la care are loc crossing-over-ului. Aceste puncte de ataşare poartă numele de
chiasme.
Deşi încep să se formeze în pachiten, chiasmele devin vizibile numai după desinapsarea
cromozomilor ce alcătuiesc bivalentul. Concomitent cu desinapsarea omologilor are loc
separarea cromatidelor surori ce rămân unite prin centromer. Ambele evenimente sunt
caracteristice stadiului diploten .
Bivalenţii pot prezenta una sau mai multe chiasme, numărul lor ilustrând frecventa
crossing-over-ului. La nivelul fiecărei chiasme, doua din cele patru cromatide ale bivalentului
se intersectează în spaţial delimitat de cromatidele omologe (fig. 120).

Fig. 120 - Stadiul de diploten

Deşi teoretic, chiasmele se pot

forma în orice zonă cromozomială s-a
constatat absenţă lor în regiunile
heterocromatidice. Deci, aceste regiuni
nu sunt antrenate în evenimente de
crossing-over împiedică desfăşurarea
unui eveniment similar în zonele imediat
învecinate, ceea ce impune o anumită
distanţă între chiasmele situate pe acelaşi
braţ cromozomial . Ea a fost denumită
distanţă de interferenţă .
În meioza I, chiasma joacă un rol similar celui pe care îl are centromerul în mitoză,
asigurând segregarea corectă a materialului genetic. Absenţa chiasmei într-un bivalent face
imposibilă segregarea cromozomilor omologi în următoarele etape ale meiozei, fenomen
cunoscut sub numele nondisjunctie. În acest caz, o parte din gameţii rezultaţi vor avea un
cromozom în minus, în timp ce alţii vor conţine o copie cromozomială în plus.
Deoarece în ocite, diplotenul poate dura luni sau ani, în acest stadiu cromatina suferă un
proces de uşoară decondensare ceea ce face ca sinteza ARN să fie reiniţiată.
Diachineza debutează cu condensarea cromatinei şi blocarea transcripţiei. Cromozomii se
detaşează de membrana nucleară. În fiecare bivalent cromozomii omologi sunt uniţi la nivelul
chiasmelor iar cromatidele surorii ale fiecărui cromozom din pereche sunt legate prin
intermediul centromerului (fig.121).

184
 Fig. 121 - Diachineza

În timpul diachinezei chiasmele

încep să se deplaseze spre extremităţile
cromozomilor, fenomen numit
terminalizare.

b) Prometafaza meioze I
(prometafaza I). În prometafaza l, se
dezorganizează învelişul nuclear şi se
formează aparatul acromatic. La nivelul
centromerelor se diferenţiază
kinetocorii. Cei doi kinetocori ce se
dezvoltă pe centromerul unui
cromozom bivalent sunt ancoraţi de fibre kinetocorice ce pornesc de la acelaşi pol al
fusului de diviziune. Kinetocorii de pe centromerul cromozomului omolog sunt legaţi prin
fibre kinetocorice de polul opus.

c) Metafaza meiozei I (metafaza I)

Mobilizarea bivalenţilor spre regiunea ecuatorială a celulei şi alinierea lor în placa
metafazică, constituie evenimentele caracteristice metafazei I. Cei doi centromeri ai bivalentului
sunt orientaţi spre polii celulari opuşi (fig. 122).

Fig. 122 - Metafaza meiozei I. Bivalenţii sunt aliniaţi

în placa ecuatorială. Kinetocorii de pe cromatidele surori
sunt orientaţi spre acelaşi pol al fusului de diviziune.

Chiasmele localizate terminal menţin cromozomii omologi

uniţi pe toată durata metafazei I. Sfârşitul acestei etape este
marcat de dispariţia chiasmelor şi eliberarea cromozomilor din
bivalent.

d) Anafaza meiozei I (anafaza I)

Odată eliberaţi din tetrada.cromozomii omologi sunt
translocaţi spre polii celulari opuşi printr-un mecanism similar celui întâlnit în mitoză
(depolimerizarea fibrelor kinetocorice şi alungirea fibrelor polare).
Spre deosebire de cromozomii monocromatidici din anafază mitotica, cromozomii din
anafaza mitozei I sunt bicromatidici (fig. 123). Migrarea la polii celulari ai cromozomilor
bicromatidici conduce la reducerea la jumătate a numărului de cromozomi prezenţi iniţial în
celuia parentală. Concomitent începe procesul de decondensare a cromozomilor.

Fig. 123 - Anafaza meiozei I. Cromozomii omologi sunt

completseparaţi şi migrează spre polii opuşi ai celulei

e) Telofaza meiozei I (telofaza I)

În telofaza I, cromozomii se găsesc la polii fusului de diviziune.
Decondensarea cromozomilor continua fără ca aceştia să-şi piardă
individualitatea. Relaxarea cromatinei face posibilă reînceperea
sintezei ARN.

185
 Membrana nucleară se reorganizează delimitând cei doi nuclei rezultaţi în urma diviziunii.
Meioza I se încheie cu procesul de citokineza prin care sunt separate celulele progene.
Fiecare progen conţine o jumătate din garnitură cromozomială a celulei parentale, deşi cantitatea
de ADN corespunde unei celule diploide. Aceasta se explică prin existenţa în fiecare celulă a două
copii ale aceluiaşi cromozom. Datorită recombinării genetice ce are loc în profaza I, copiile nu
sunt perfect identice (fig. 124).

Fig. 124 - Celulele fiice rezultate în urma

primei diviziuni meiotice

Interfaza meiotică

Mai scurtă decât interfaza mitotică, interfaza

meiotică, ce separă cele două diviziuni meiotice se
caracterizează prin absenţa perioadei S.
Pe parcursul interfazei meiotice se
desfăşoară procese transcripţionale şi de
proteosinteză ce pregătesc intrarea celulei în
meioza II.
Se apreciază că acum are loc reorganizarea
kinetocorilor, care se poziţionează pe feţele opuse
ale centromerului fiecărui cromozom bicromatidic.
Reorientarea face posibilă segregarea materialului
genetic pe parcursul celei de-a doua diviziuni
meiotice.
Interfaza meiotică nu este întâlnită la toate
celulele eucariote, fiind posibilă derularea
succesivă a celor două diviziuni.

B. A doua diviziune a meiozei (meioza II)

În celulele progene, rezultate în urma meiozei I, iniţierea celei de-a doua diviziuni meiotice,
are loc simultan. Meioza II reprezintă, de fapt, o diviziune mitotică, ecvaţională, ce asigură
repartizarea egală a copiilor cromozomiale din cele două celule fiice şi în consecinţă formarea
gameţilor. Etapele şi evenimentele celulare caractzeristice acestora sunt similare celor întâlnite în
cadrul diviziunii mitotice.
Meioza II debutează cu profaza II, etapă mult mai scurtă decât profaza mitotică, în care are
loc formarea unui nou aparat acromatic şi dezorganizarea înveluşului nuclear.
Fibrele kinetocorice ce radiază din polii opuşi ai fusului de diviziune ancorează kinetocorii
de pe cele două cromatide ce alcătuiesc fiecare cromozom.Unite prin intermediul centromerului,
cromatidele surori sunt deplasate şi aliniate în planul ecuatorial al celulei formând în metafaza II
placa metafazică. Sfârşitul acestei etape este marcat de replicarea centromerului şi separarea celor
două cromatide.
În anafaza II cromatidele surori sunt translocate spre polii opuşi ai celulei.Cromozomii
monocromatidici anafazici se alungesc ca rezultat al relaxării cromatinei.
În telofaza II decondensarea cromozomilor continuă astfel încât la sfârşitul meiozei II
cromatina îşi recapătă aspectul caracteristic interfazei. La polii opuşi ai celulelor se reorganizează
învelişul nuclear. Separarea celor patru celule haploide (gameţii) este consecinţa directă a
procesului de diviziune citoplasmatică.

186
 Capitolul 8

APOPTOZA

Apoptoza reprezintă procesul fiziologic de moarte celulara programată (PCD =

Programmed Cellular Death).
Timp îndelungat au fost studiate doar mecanismele de proliferare şi diferenţiere celulară,
în vreme ce procesul de moarte celulară a fost considerat doar un proces haotic.
Procesul apoptotic are loc în toate organismele vii, atât în viaţa embrionară cât şi în cea
adultă, prin acest mecanism, organismele eliminând celulele nedorite, nocive sau anormale
din punct de vedere funcţional.
Apoptoza nu rezultă din leziune, nu este reversibilă şi nici nocivă pentru organism, ci
chiar necesară pentru menţinerea normalităţii.
Drept sinonime pentru apoptoza celulară se mai folosesc denumirile: moarte celulară
normală sau moarte celulară fiziologică.
Astăzi se cunoaşte că procesul de apoptoză are rol în medierea proceselor de dezvoltare
şi a efectelor nutriţionale care prelungesc cursul vieţii. Descreşterea anormală a apoptozei
poate avea rol în declanşarea bolilor autoimune şi a evenimentelor legate de senescenţă
(tumorigeneză).

8.1. Mecanismele de producere a apoptozei

În cursul procesului de apoptoză se elimină un număr mare de celule fără a se produce
vreun proces inflamator.
Arhitectura tisulară şi celulară adiacentă este păstrată intactă şi ea umple spaţiile lăsate
goale de celula apoptotică. Celulele apoptotice sunt caracterizate printr-un proces de adunare
şi redistribuire a cromatinei sub forma unei mase compacte care rămâne pe membrana
nucleară, urmată de zbârcirea suprafeţei celulare.
Organitele celulare şi in special mitocondriile sunt bine conservate, iar celula apoptotică
se rupe în corpusculi apoptotici.
Asemenea corpi apoptotici pot transporta antigene (incluzând fragmente de AND
intacte), care, în condiţii anormale, pot deveni responsabile de dezvoltare de autoanticorpi (în
lupusul eritematos sintetic).
Deoarece aceşti corpusculi sunt rapid generaţi de celulele vecine şi fagocite, ei sunt
observaţi foarte rar chiar şi în timus, acolo unde viteza apoptozei este foarte mare.
Procesul de apoptoză se desfăşoară în trei timpi :

- în faza iniţială, celulele individuale, enclavate în ţesutul normal, pierd legăturile cu

celulele vecine, cromatina nucleară se condensează, rezultând fragmentarea AND-ului
celular; celulele se retractă din cauza pierderii de conţinut citoplasmic şi a condensării
proteinei citoplasmatice; cele mai multe organite citoplasmatice rămân însă intacte;

- în faza a doua, membrana celulară se zbârceşte, se găureşte şi se fragmentează,

formându-se corpi apoptotici care conţin resturi nucleare;

- în faza finală, celulele vecine şi macrofagele fagocitează aceste fragmente până la

completa lor degradare (fig.125).

187
 Fig. 125 - Aspecte de apoptoză

Procesul de apoptoză este foarte rapid şi

durează în total câteva ore.
Apoptoza ca proces active necesită atât
energie în formă de ATP, cât şi sinteză de ARN
şi de proteine. Formarea inozitolfosfaţilor care
determină creşterea concentraţiei intracelulare
de ioni Ca²+ este un eveniment precoce al
apoptozei, urmat de exportul rapid şi selective
de ioni şi apă, ceea ce are drept consecinţă
condensarea citoplasmei şi cromatinei şi
formarea fragmentelor ADN.
Corpusculii apoptotici conţin un schelet de
proteine crosslinkate (anvelope) rezistente la
proteoliză.
Recunoaşterea celulelor apoptotice şi
fagocitarea lor de către celulele fagocite par a fi mediate de către numeroşi receptori
(vitronectina, tromboplastina etc.) de pe celulele umflate; proteazele dependente de prezenţa
ionilor Ca²+ pot participa la degradarea citoscheletului corpusculilor apoptotici.
În cursul apoptozei, pe partea extremă a membranei plasmatice apare fosfatidilserina,
care, în mod normal, îşi are sediul pe partea internă a acesteia, aspect ce trebuie luat în
considerare, deoarece poate semnifica un semnal de activare a fagocitării celulelor apoptotice.

8. 2. Necroza
Spre deosebire de apoptoză (moarte celulară normală), necroza reprezintă o moarte
celulară patologică; este un proces pasiv care apare sub acţiunea unor noxe celulare, având
drept consecinţă leziuni grave.
În cursul necrozei se produce dilatarea reticulului endoplasmatic, creşterea volumului
mitocondriilor, flocularea cromatinei nucleare, umflarea celulelor urmată de ruperea, printr-un
dezechilibru osmotic, a respectivelor celule.
Cromatina devine tot mai compactă şi nu apare distribuită pe membrana nucleară; apar
leziuni ultrastructurale ale organitelor celulare; în final, membrane plasmatică, organitele şi
nucleul se dezintegrează, iar resturile sunt digerate de către fagocitele infiltrate.
În contrast cu apoptoza, în care procesul se produce într-o celulă solitară, în cazul
necrozei procesul apare simultan într-un grup de celule în care s-a produs în prealabil o
leziune în arhitectura celulară.
În final, ingestia fagocitară de celule necrozate (în contrast cu cele apoptotice) este
acompaniată de eliberarea de mediatori chimici ai inflamaţiei, care induc un răspuns de tip
inflamator. Aceste aspecte se explică prin existenţa unui set diferit de semnale, implicat în
fagocitoza celulelor apoptotice, în comparaţie cu setul de semnale implicat în fagocitarea
celulelor necrotice sau a agenţilor infecţioşi.

8.3. Frecvenţa procesului de apoptoză

După cum s-a arătat mai sus, apoptoza este un mecanism eficient de eliminare atât a
anumitor celule în cursul dezvoltării embrionare cât şi a celulelor adulte normale.
Există de obicei un număr de celule normale care sunt depăşite la un moment dat dintr-o
multitudine de cauze; un exemplu este cel al celulelor neuronale care se produc în exces în

188
sistemul nervos al vertebratelor; în acest caz, 50% din diferitele tipuri de neuroni mor curând
după ce au format conexiunile sinaptice cu celulele ţintă.
Aceste celule neuronale au avut probabil o funcţie în timpul evoluţiei şi dezvoltării, dar
au încetat la un moment dat să mai fie necesare (au atins momentul de regresie a
metamorfozei lor). Apoptoza are loc şi în celulele adulte somatice, în cursul reînnoirii
normale a ţesuturilor.

8.4. Gene implicate în procesul apoptotic

8.4.1. Gene letale

În prezent există evidenţa unei gene sau a unui set de gene care codifică proteine cu
efect letal (de sinucidere) asupra celulei purtătoare. Astfel, la organismul nevertebrat
Caenorhabditis elegans (nematode) au fost descrise două asemenea gene: Ced 3 şi Ced 4 cu
acţiune letală; în cazul în care una din aceste gene este inactiva prin mutaţie, nu mai survine
moartea celulară. Aceste două gene acţionează autonom pentru a produce moartea celulară
programată. În mod similar, un număr de gene letale au fost evidenţiate la mamifere; astfel, s-
a arătat că gena protooncogenă c-myc, care în mod normal stimulează diviziunea celulară, este
implicate şi în inducerea apoptozei.
În cazul genei supresoare de tumori p53, s-a observat cum creşterea nivelului proteinei
p53 este asociată cu moartea celulară apoptotică.
Aceste gene s-au dovedit esenţiale pentru moartea celulară apoptică, apoptoza rezultând
în cazul supra expresiei genelor c-myc sau p53, sau prin coexpresia simultană a mai multor
gene.
Apoptoza trebuie privită ca un proces fiziologic normal faţă de influenţele mediului
extern; acest proces este mediat de o cascadă de transducţii de semnale la suprafaţa celulară,
probabil printr-un program genetic îndreptat împotriva unei stări antiproliferative. Astăzi se
ştiu încă puţine lucruri despre căile acestei morţi celulare. S-a demonstrat că multe gene letale
sunt activate în cursul apoptozei.
După cum am arătat deja, se pare că o creştere a concentraţiei ionilor de Ca2+ în citosul
ar avea un rol important în funcţia de reglare a apoptozei; totuşi acest mecanism rămâne încă
neclarificat. Se pare că acest calciu citosolic ar declanşa şi evenimentele secundare legate de
activarea transglutaminazelor. Enzimele de membrană şi citosolice (în particular proteinaza
C) implicate în fosforilarea proteinelor au rol central în transducerea semnalelor apoptotice.
Pornirea apoptozei necesită inducerea unui program genetic nou. Este posibil ca şi
oncogenele nucleare cu activitate reglatorie transcripţională să aibă un rol în apoptoză.

8.4.2. Genele supravieţuirii (gene antiapoptotice)

Genele supravieţuirii sunt acelea care, în mod normal, acţionează ca o frână asupra
mecanismului de moarte celulară normală.
Dacă aceste gene sunt inactivate printr-o mutaţie, multe celule care ar trăi în mod
normal mai departe sunt supuse, în acest caz, apoptozei.
La organismul Caenorhabditis elegans,gena Ced-9 s-a dovedit că acţionează drept
antogonist al morţii apoptotice celulare.
Activarea anormală a acestei gene Ced-9 face ca moartea celulară să nu se mai
producă. În cazul contrar, când se inactivează gena Ced-9, celula intră sub influenţa genelor
Ced-3 şi Ced-4, care determină moartea precoce a respectivului organism.
Astăzi este demonstrat faptul că asemenea gene de supravieţuire există şi în celulele
mamiferelor. Astfel, la mamifere, s-a descris o proteină din constituţia membranei interne a
mitocondriilor bcl-2, care, în condiţii de supraexprimare, determină inhibarea apoptozei.

189
 Această proteină bcl-2 nu stimulează proliferarea celulară, ci favorizează
supravieţuirea celulară într-o stare nonciclină; aceeaşi genă bcl-2 inhibă inducerea apoptozei
de către gena c-myc şi face celulele mai puţin sensibile la radiaţii şi droguri citotoxice.

8.5. Rolul apoptozei în embriogeneză şi dezvoltare

În prezent se ştie că echilibrul apoptotic joacă un rol important în embriogeneză şi
dezvoltare. Exprimarea fiziologică a genei bcl-2 (inhibitoare a apoptozei) este prezentată în
ţesuturile fetale unde probabil joacă un rol în dezvoltarea şi morfogeneza normală. Este
demonstrat faptul că există un impact important al nutriţiei din cursul embriogenezei şi
perioadei precoce de după naştere asupra dezvoltării nou-născutului şi evoluţiei individului în
cursul vieţii adulte.
La specia umană, greutatea mai mare la naştere şi alăptare la sân micşorează riscul
dezvoltării bolilor cardiace la vârstă adultă. Pe modele animale s-a dovedit experimental
existenţa unei tumorigeneze crescute în cazul în care respectivele animale au primit o dietă
bogată în grăsimi în cursul embriogenezei, prin scăderea nivelului apoptozei, dar nu şi atunci
când această dietă a fost administrată după naştere şi înţărcare.
Respectivele efecte tumorigene imprimate de dieta bogată în grăsimi din cursul
embriogenezei au apărut abia la a doua generaţie.

8.6. Aspecte de reglare a apoptozei

De mare importanţă pentru un organism este menţinerea balanţei între genele letale şi
genele de supravieţuire, dar modul în care se menţine această balanţă este în prezent foarte
puţin cunoscut. Se ştie că semnalele extracelulare pot rupe această balanţă, rezultatul fiind
supravieţuirea sau moartea, după cum sunt induse sau supresate respectivele gene.
S-a dovedit că niveluri înalte ale proteinei corespunzătoare genei bcl-2 de la mamifere
inhibă apoptoza, iar cele ale proteinei corespunzătoare genei Ced-9 de la nematodul
Caenorhabditis elegans au un efect similar.
Experienţa in vivo a demonstrat că, în absenţa hormonilor specifici, multe celule
dependente de sistemul endocrin (de exemplu, neuronii şi oligodendrocitele) necesită pentru
dezvoltare factori neurotrofici şi citokine, iar alte celule (tip celule hemotopoietice) necesită
unul sau mai mulţi factori de stimulare (de exemplu, limfocitele T necesită interleukina 2).
Trebuie menţionat cazul particular al blastomerelor, care supravieţuiesc şi se divid în
cultură, în absenţa moleculelor semnal exogene; blastomerele sunt unicele celule embrionare
care necesită un minimum de comunicare.
În general, atât supravieţuirea cât şi proliferarea sunt simulate prin semnale provenite de
la alte celule; se pare că există un control al mediului asupra vieţuirii şi morţii celulare.

8.6.1. Factori implicaţi în reglarea apoptozei

• Factori inductori
Printre factorii interni care declanşează şi controlează apoptoza se numără tiroxina,
glucocorticoizii, retinoizii (molecule lipofile). Aceştia interacţionează cu receptorii nucleari,
determinând activarea transcrierii genelor legate de inducerea apoptozei. S-a demonstrat, de
asemenea, că un antigen de suprafaţă al timocitelor (antigenul Fas) este implicat în procesul
de apoptoză. Agenţi externi nefiziologici, ca radiaţiile ionizate, substanţele toxice (toxine),
drogurile (agenţi antitumorali chemoterapeutici), şocul termic ester-forbolul, ionii de Ca++,
acţionează ca inductori ai apoptozei.

190
 • Factori inhibitori
Factorii de creştere, factorii de activare a macrofagelor, factorii serici şi citokinele (a-
TNF) inhibă apoptoza. De asemenea, la vertebrate, apoptoza este inhibată de către toţi
inhibitorii sintezei ARN-ului, ai sintezei proteice, ai proteinkinazei, ai tirozinfosforilării, ai
endonucleazelor, ai transaminazelor şi ai proteazelor.
A fost evidenţiată existenţa unui timing (intrare în funcţie la un moment precis) al
apoptozei, în special în cursul morfogenezei şi dezvoltării. Aceste aspecte sunt însă foarte
greu de urmărit şi clarificat, deoarece citoplasma celulară şi nucleul celular sunt potenţial
autonome în declanşarea procesului de apoptoză, şi anume: celulele fără nucleu pot declanşa
apoptoza, dar şi nucleii pot declanşa modificări caracteristice de apoptoză în ADN-ul unor
celule intacte.

• Glucocorticoizi – sistem imun – apoptoză

Nelson (1992) emite ipoteza conform căreia ar exista o implicare neuroendocrină în

întârzierea îmbătrânirii ca urmare a dietei hipocalorice. La şoareci s-a demonstrat
experimental că o dietă hipocalorică creşte nivelul glicocorticoizilor în cadrul ritmului
circadian, cu începere înainte de miezul nopţii, atingând vârful chiar înainte de ora prânzului;
scăderea nivelului de corticosteron are loc după administrarea hranei; acest rezultat
demonstrează importanţa ritmului cardiac atunci când se urmăreşte măsurarea nivelelor
circulatorii ale adrenocorticosteroizilor, cât şi faptul că reducerea raportului de colorii poate
afecta semnificativ secreţia de adrenocorticoizi.
Se pare că atât indigestia totală de calorii cât şi pattern-urile de alimentare (perioada de
post cu hrănire intermitentă/acces continuu la hrană) ar putea influenţa viteza apoptozei şi a
proliferării celulare. Hrana hipocalorică cronică creşte atât nivelul diurn al corticoizilor
plasmatici, cât şi rata apoptozei. Hrănirea după o perioadă de post apare asociată cu o scădere
a ratei de apoptoză. Dieta hipocalorică favorizează, prin creşterea nivelului corticoizilor (cu
rol important în modularea apoptozei), întârzierea îmbătrânirii celulare şi a fenomenelor de
tumorigeneză.
Sistemul imun produce un mare exces de limfocite care sunt programate să moară dacă
nu sunt recrutate pentru răspunsul imun. Se presupune că, în organele nonlimfoide, apoptoza
este foarte restrânsă şi foarte rară în comparaţie cu cea în sistemul imun.
La un individ normal, nivelul de corticoizi şi răspunsul glucocorticoid la stres scade cu
vârsta, dar acest declin poate fi atenuat printr-o dietă hipocalorică.
Nivelul crescut de corticoizi cu capacitate de a elimina selectiv, prin apoptoză, celulele
limfoide în exces (de exemplu, celule T autoreactive ale sistemului imunitar) caracterizează
un sistem imunitar tânăr. Prelungirea acestei capacităţi în cursul vieţii adulte ar putea fi
întreţinută timp îndelungat printr-o dietă hipocalorică.
Pentru menţinerea unei funcţii normale a timusului este necesar un anumit nivel de bază
al glucocorticoizilor circulanţi. Celulele timice intrinseci exprimă enzime steroidogene şi
produc pregnenolon şi dezoxicorticosteron. Se pare că aceşti steroizi sintetizaţi local
acţionează într-o manieră paracrină.
Faptul că glucocorticoizii pot fi sintetizaţi local de organele aparatului imunitar
(incluzând aici şi timusul) ridică posibilitatea ca o dietă hipocalorică să aibă efecte favorabile
asupra bolii autoimune, prin modularea generală local de glucocorticoizi. S-a avansat ipoteza
conform căreia glucocorticoizii ar putea modula procesul de selecţie şi maturare, în cursul
dezvoltării sistemului imun.
Din cele prezentata mai sus reiese că sistemul imun incluzând timusul ar putea fi un
focar important pentru dezvoltarea şi pentru efectele de maturare ale glucocorticoizilor, în
funcţie de modularea dietei alimentare. Corticoizii (sintetizaţi fie sistemic, fie local) ar putea
avea un efect critic asupra proceselor timice şi de imprinting, incluzând selecţia pozitivă a
celulelor CD4 şi CD8.

191
 • Lipidele Ω - 3 şi apoptoza

Asocierea acizilor graşi saturaţi cu incidenţa crescută a bolilor cardiovasculare a

determinat substituirea, în dieta alimentară, a grăsimilor saturate cu uleiuri vegetale nesaturate
(Ω - 6).
În SUA, consumul de grăsimi este 170 grame pe zi, din care 90% sunt de origine
vegetală. Substituirea grăsimilor saturate cu uleiuri vegetale reduce cantitatea de colesterol şi
de lipide LDL. Acizii graşi nesaturaţi şi metaboliţii lor servesc nu numai drept componenţi
structurali ai celulelor şi ca substrat pentru sinteza prostaglandinelor, leucotrienelor şi
trumboxanului, ci ei mediază şi exprimarea genelor.
Acidul eicosapentaenoic (EAP) scade proliferarea şi stimulează apoptoza. Acidul
arahidonic (care asigură fluiditatea membranelor celulare) poate activa receptorii nucleari
pentru hormoni steroizi, tiroidieni şi retinoizi; această observaţie sugerează că acizii graşi
polinesaturaţi ar putea avea efect direct asupra supresării genelor H-ras (p.221)
În ultima vreme s-a trecut la utilizarea uleiurilor nesaturate Ω-3 extrase din peştele
oceanic, constatându-se că acest tip de ulei a adus beneficii, ameliorând severitatea bolii auto-
imune şi prelungirea vieţii. Esenţial este că acest ulei de peşte să fie conservat cu anti-oxidanţi
potriviţi (vitamina E), pentru a împiedica oxidarea şi reîncezeala în cursul perioadei de
păstrare. Lipidele oxidate pot determina formarea de radicali liberi, ceea ce ar putea explica
unele rezultate nefavorabile (contradictorii) obţinute în studiile anterioare referitoare la
efectele uleiurilor de peşte. În prezent se recomandă o utilizare a uleiurilor de peşte Ω-3 ca
supliment în dietă, dar cu condiţia îmbunătăţirii procesului tehnologic (cu adaos de
antioxidanţi corespunzători).
Uleiurile nesaturate Ω-3 şi Ω-6 duc la scăderea bolii arteriosclerotice; în plus Ω-3 au
efect favorabil asupra funcţiei imune şi supresoare a tumorigenezei. S-a dovedit că consumul
crescut de lipide Ω-3 are la om efecte benefice în caz de artrită, boli cardiovasculare, diabet,
boli renale şi boli de piele.
Efectul uleiurilor de peşte asupra apoptozei s-ar realiza prin exprimarea crescută a
enzimelor antioxidante şi scăderea formării de radicali liberi.
Lipidele Ω-3 cresc exprimarea enzimelor de tip superoxiddismutaza şi catalaza, care
îndepărtează (mătură) radicalii liberi scad nivelul peroxizilor circulanţi, reduc stresul oxidativ
cronic. Deci lipidele Ω-3, administrate în cadrul dietei alimentare, ar putea scădea producerea
de radicali liberi şi ar menţine un nivel normal de apoptoză.

8. 7. Apoptoză – îmbătrânire – senescenţă

Printr-un proces de apoptoză controlat genetic în cursul vieţii, se produce treptat o

pierdere de masă celulară, ceea ce duce la îmbătrânire. Procesul normal de îmbătrânire
evoluează către stadiul final de senescenţă, când celulele nu mai proliferează, devenind
rezistente atât la proliferare cât şi la apoptoză.
O dată cu înaintarea în vârstă scade eficienţa apoptozei, organismul fiind predispus la
modificările legate de vârstă (degenerări, dereglări imune, tumorigeneză).
Dereglarea apoptozei poate duce la alterarea funcţie imune, la dezvoltarea bolii
autoimune şi la tumorigeneză.
În prezent se ştie că o dietă hipocalorică (fără malnutriţie sau deficienţe de elemente
esenţiale, dar cu scăderea aportului de carbohidraţi, proteine, grăsimi) duce la creşterea
nivelului apoptozei, întârziind îmbătrânirea, prelungind perioada de viaţă şi întârziind
momentul apariţiei modificărilor legate de vârstă (degenerări, dereglări imune, tumorigeneză);
până în prezent sa dat totuşi prea puţină atenţie legăturii existente între prelungirea perioadei
de viaţă (prin administrarea unei diete hipocalorice), pe de o parte, şi nivelul apoptozei, pe de
altă parte.

192
 Deşi mecanismele implicate în procesul de senescenţă şi tumorigeneză rămân insuficient
clarificate, se cunoaşte faptul că acumularea de radicali liberi derivaţi dintr-un metabolism
oxidativ şi leziunile celulare rezultate din acţionarea radicalilor liberi joacă un rol important în
aceste fenomene.
Printr-o dietă hipocalorică se poate reduce stresul oxidativ, homeostazia celulară fiind
menţinută şi asigurându-se prelungirea vieţii.

8.8. Apoptoza şi starea de boală

ƒ Agenţii infecţioşi virali şi infecţia virală

Agenţii virali patogeni dezvoltă strategii pentru inhibarea apoptozei, permiţând astfel
replicarea virală în celula gazdă, a cărei viaţă este prelungită. Astfel, s-a demonstrat că
adenovirusurile, virusul papilloma uman şi SV40 pot modula apoptoza, prin interacţiunea unei
proteine virale cu proteina celulară p53.
În cazul infecţiei cu virusul HIV1, depleţia de limfocite este rezultatul unui proces
complex, în care legătura glicoproteinei gp120 (de pe suprafaţa virusului HIV1) de antigenul
CD4 al limfocitelor T CD4 face celula sensibilă la apoptoză, la a doua stimulare.
Ţinând cont de acest aspect, Sindromul de Imunodeficienţă Acută la Om (SIDA) poate
fi privit ca un dezechilibru între viteza morţii celulelor limfocite T CD4 şi procesul de
reînnoire a acestor celule.
Apoptoza crescută peste normal poate fi deci nocivă prin pierderea unor celule CD4, a
căror prezenţă ar fi atât de necesară în cazul de mai sus.
ƒ Boala autoimună
Boala autoimună reprezintă o altă consecinţă a dereglării apoptozei în sistemul
imunologic.
În condiţii normale, limfocitele (autoreactive) mor prin apoptoză. Un deficit în deleţia
(dispariţia, moartea) lor, predispune la boala autoimună. Supresia apoptozei joacă un rol
important atât în bolile autoimune, cât şi în patogeneza cancerului (de exemplu în limfoame).
Administrarea de glucocorticoizi exogeni ameliorează boala autoimună (de exemplu, lupusul
eritematos) prin creşterea apoptozei. S-a observat de asemenea că o perioadă scurtă de post
sau de regim hipocaloric are efecte evidente asupra sintezei de glucocorticoizi şi asupra
creşterii apoptozei, care contribuie la eradicarea celulelor autoreactive din boala autoimună in
vivo.
S-a demonstrat că administrarea de uleiuri Ω-3 (din peşte oceanic) duce la supresia bolii
autoimune şi la prelungirea vieţii.
Celulele CD4-CD8- (precursoare ale celulelor timice T) rezistente la apoptoză, exprimă
o cantitate mai mare de proteină bcl-2 decât celulele CD4+ şi CD8+ sensibile la apoptoză,
confirmând astfel că ar exista o corelaţie între exprimarea genei bcl-2 şi rezistenţa la
apoptoză.
ƒ Apoptoza şi procesul de oncogeneză
Procesul neoplazic este înţeles astăzi drept o dereglare a echilibrului
apoptoză/proliferare celulară.
Conform ipotezei lui Stryer (1991), toate genele oncogene cunoscute până astăzi ar fi
forme alterate ale genelor celulare normale. Aceste gene oncogene pot influenţa circuitele
moleculare care controlează creşterea şi dezvoltarea. În acest context trebuie privită şi
acţiunea genei protooncogene celulare c-myc.
În condiţii normale, gena c-myc, menţine un echilibru între proliferarea celulară şi
apoptoză. În condiţii anormale, un retrovirus cu rol declanşator, prin inserţie pe respectiva
genă protooncogenă, poate activa transcrierea genei c-myc, ceea ce are drept consecinţă o
dereglare a echilibrului apoptoză/proliferare celulară; în aceste condiţii de dereglare a

193
apoptozei, apare o deteriorare a funcţiei sistemului imun şi o creştere a riscului de
tumorigeneză o dată cu înaintarea în vârstă. Prin activarea produsă prin inserţia retrovirusului,
gena protooncogenă c-myc devine oncogenă (implicată în geneza limfomului Burkitt).
Se admite astăzi că procesul de oncogeneză apare în urma unor modificări de replicare a
ADN, când se produce o acumulare anormală de celule cu mutaţie.
În general, proporţia dintre diviziunea celulară şi moartea celulară determină viteza de
dezvoltare a unui proces oncogen.
Unele celule canceroase se divid mult mai încet decât celulele normale, dar procesul
neoplazic se poate totuşi întinde din cauza perioadei de viaţă prelungite a respectivei celule.
Apoptoza trebuie privită ca o măsură de protecţie care previne transformarea malignă. În
organisme au evoluat mecanisme eficiente pentru eliminarea celulelor cu leziuni genetice
(rezultate dintr-o diviziune neprogramată), supunând aceste celule transformate apoptozei,
drept răspuns la semnalele adverse de creştere.
Luvers, apariţia unei tumori necesită evenimente genetice secundare care să atrage calea
apoptotică; cel mai bun exemplu în acest sens sunt evenimentele mutaţionale suferite de gena
gp53 supresoare de tumori.
Produsul genei gp53 normale a fost numit “poliţistul molecular“, deoarece induce
poptoza în celulele care au suferit leziuni ireversibile ale ADN. Mutaţii ale genei supresoare
ale tumorii gb53 reprezintă una din alterările genetice cel mai frecvent semnalate în cazul
tumorilor umane.
Genele codificatoare de proteine care conferă rezistenţă la apoptoză ar putea fi, de
asemenea, incriminate în oncogeneză; o asemenea genă ar fi protooncogenă bc1-2 (genă
mitocondrială), care inhibă apoptoza într-un număr de tipuri celulare.

194
 Capitolul 9

PROCESUL DE ÎMBATRÎNIRE-SENESCENŢA

Sedlow 1974 şi Curtis 1996 indică strânsa interrelaţie /eficenţa reparării ADN-ului (prin
excizia leziunilor) şi durata de viaţa a speciilor.
La mamifere (inclusiv la om) perioada lungă de viaţa se găseşte sub controlul unui
număr foarte mare de gene (control poligenic), şi anume:
ƒ gene pentru replicarea corectă a ADN-ului;
ƒ gene pentru repararea ADN-ului;
ƒ gene pentru sinteza de factori antioxidanţi (enzime etc.);
ƒ gene pentru sinteza corectă a proteinelor;
ƒ gene pentru supresia de tumori;
ƒ gene pentru reglarea activităţii sistemului inimi.
După maturarea totală a unui organism, începe procesul îmbătrânirii, acesta
reprezentând inexorabilul declin al capacitaţi de menţinere homeostaziei fiziologice.
Îmbătrânirea reprezintă pierderea treptată a masei celulare dintr-un organism, prin apoptoza
controlată genetic. Pierderea celulelor premature sau excesive, în cursul unui proces de
îmbătrânire precoce (de exemplu, sindromul Werner) poate duce la disfuncţie de organ sau
boală.
Procesul normal de îmbătrânire evoluează treptat către senescenţă. Senescenţa este
stadiul final al îmbătrânirii când celulele nu mai proliferează, ele devenind rezistente atât la
proliferare, cât şi la apoptoză (celulele devin senescente în momentul în care telomerele devin
brusc prea scurte şi nu mai pot suporta o nouă diviziune celulară).

9.1. Gene implicate în controlul senescenţei

Senescenţa este o caracteristică a organismelor superioare. Acest proces se află sub un

control genetic activ, fiind implicate trei categorii de gene:
ƒ Gene reglatoare pentru menţinerea integrităţii somatice şi a proceselor de
reparare. Aceste gene reglează sistemele intracelulare (mecanismul de reparare a
ADN-ului, acţiunea enzimelor antioxidante) până la mecanismele de turnover celular
(ale sistemului imun, ale structurilor epidermice etc.) Prin reglarea acestor procese,
activitatea respectivelor gene menţine un nivel înalt de protecţie faţă de agenţii de
stress intrinseci şi extrinseci, împiedicând acumularea de leziuni somatice responsabile
de producerea senescenţei.

ƒ Gene pleiotrope. Aceste gene conferă avantaje în stadiile timpurii de viaţă, dar
ulterior suferă deleţii, având în consecinţă o serie de efecte negative asupra
organismului.

ƒ Factori genetici individuali. Aceşti factori determină fenotipurile procesului de

îmbătrânire-senescenţă, care ulterior este modular (amplificat sau menţinut la nivel
scăzut) prin acţiunea agenţilor din mediu extern.
În reglarea îmbătrânirii celulară şi a senescenţei, un rol important are, după ultimele
date un ceas (un mecanism programator) reprezentat de telomere. Acestea sunt secvenţe
repetitive de ADN situate la extremităţile libere ale cromozomilor liniari. Astfel la om
capetele cromozomilor conţin 2-3kb de unităţi repetitive telomerice, (TTAGGG), în ADN-ul
telomeric, secvenţele TTAGGG sunt orientate cu extremităţile bogate în G spre capul 3 OH
195
al firului de ADN, apărând astfel, în final, orientate în tandem pe cele două fire ale dublului
lanţ de ADN cromozomial cu capete libere.
Telomerele nu sunt codificatoare (nu conţin gene), în celule, ele au rol de a cronometra
fiecare diviziune celulară, probabil datorită acţiunii enzimei telomeraza. Telomelere sunt
structuri importante ale arhitecturii cromozomiale, în condiţii normale, ele împiedică fuziunea
extremităţilor cromozomiale cât şi dezintegrarea ADN-ului fiind totodată şi responsabil de
fixarea cromozomilor pe membrana nucleară.
Telomerele au fost deja clonate şi secvenţiate (ADN-ul telomeric reprezentând 0,03%
din totalul ADN-ului genomului uman). Ele nu se sintetizează în cadrul ciclului de replicare a
lanţului ADN corespunzător ci separat sub acţiunea telomerazei.
Sub acţiunea acesteia se adună mai întâi blocuri de oligonucleotide telomerice care se
fixează la capul 3’-OH al lanţului ADN matriţa (fig 126). Telomeraza (complex
ribonucleioproteic) orientează capetele băgate în G ale respectivelor secvenţelor telomerice
spre extremitatea 3’-OH a lanţului matriţă.
Această alungire a lanţului matrice duce la formarea unui loop astfel încât capătul 3’-
OH ajunge să servească drept primer pentru sinteza unor noi secvenţe nucleotidice telomerice
în apropierea lanţului fiică.. ADN-ligaza ajută la fixarea acestor noi secvenţe telometrice la
capătul 5’ al lanţului fiică iar apoi nick-aza clivează loop-ul la nivelul subsecventelor
telomerice (secvenţe incomplet sintetizate) astfel încât, în final, capetele celor două fire de
ADN să rămână libere.
Pe cele două fire de ADN telomerele sunt formate din secvenţe repetitive identice dar
aşezate în tandem (5’-TTAGGG faţă de TTAGGG-3’-OH). Rezultă o catenă fiică de aceeaşi
lungime cu catena matrice dar cu secvenţe telomerice mai puţin numeroase; această catena
fiică va juca rol de matriţă în runda următoare de replicare şi va da naştere unei noi catene
fiice cu un număr şi mai mic de secvenţe telomerice astfel încât, după un număr de replici,
catena fiică rezultată, cu telomerul foarte scurt va deveni incapabilă de o nouă replicare.

Fig. 126 - Terminalizarea cromozomilor sub acţiunea telomerazelor

Nu se cunoaşte încă bine interrelaţia dintre apoptoză şi lungimea tolomerelor, în cursul

perioadei de îmbătrânire; se ştie doar că apoptoză întârzie îmbătrânirea şi supresează
tumorigeneza, acest fenomen fiind acompaniat atât de supresarea leziunilor celulare
cumulative, cât şi de ce a leziunilor ADN.

9. 2. Principalele mecanisme (ipotetice) implicate în senescenţă

Aceste mecanisme sunt:

• Acumularea de mutaţi somatice;
• Acumularea de leziuni oxidative;
• Acumularea de proteine aberante;
• Acumularea de mutaţii în ADN-ul mitocondrial.

196
 Plecându-se de la studiul acestor patru mecanisme, care au o acţiune sinergică, s-a ajuns
la elaborarea unei teorii a reţelei prin care se încearcă ipotetic să se explice astăzi intrigarea şi
interacţiunea la nivel molecular a mecanismelor implicate în procesul de senescenţă (fig.
127).

Fig. 127 - Reţeaua interacţiunilor dintre diferite mecanisme intracelulare

ipotetice implicate în procesul de senescenţă (după Kingwood, 1996).

A. Acumularea de mutaţii somatice

În culturile de ţesuturi prenatale provenite de la rozătoare s-a demonstrat că celulele au
capacitate foarte înaltă de reparare ADN, această capacitate scăzând o dată cu creşterea
numărului de pasaje. Culturile celulare de fibroblaste umane diploide au oferit, de asemenea,
un model experimental excelent pentru studiul fenomenelor de înbătrînire; pe acest model s-a
demonstrat că pentru respectivele celule, după o perioadă de multiplicare activă, timpul de
generaţie creşte, iar apoi mitoza încetează progresiv (perioadă de senescenţă); potenţialul de
creştere în cultură a acestor celule este invers proporţional cu vârsta donatorului de celule.
O dată cu înaintarea în vârstă, eficenţa apoptozei scade, organismul fiind mai predispus
la modificările de vârstă (degenerări, dereglări imune, tumorigeneza). În celulele vârstnice
există o frecvenţă înaltă de ruperi de lanţuri ADN (probabil prin acumularea situs-uri labile la
alcalii); concomitent apar modificări ale histonelor, care îngreunează accesibilitatea enzimelor
la nivelul cromatinei, în vederea acţiunii de reparare a ADN.
Organismele care trăiesc mai mult timp fie acumulează în cursul vieţii cantităţi mai mari
de ADN lezat decât organismele cu viaţă mai scurtă, fie posedă sistem de reparare ADN mult
mai eficient.
Multe teorii referitoare la îmbătrânirea celulară se bazează pe ipoteza leziunii genomului
celular somatic,multe dintre aceste teorii postulează o relaţie între viaţa celulei şi apariţia
leziunilor (erorilor) ADN. Pînă în prezent mutaţiile somatice au fost studiate foarte puţin.
Un asemenea exemplu de mutaţii somatice apărut la un moment dat în cursul vieţii în
organisme este apariţia unui spot bleu pe un iris brun.
George Martin de la Universitatea Washington din Seattle (1996) estimează că mutaţiile
care ating 7% din genomul uman pot avea capacitatea de a modula apariţia unui fenotip al
procesului de îmbătrânire la om.

197
 O singură mutaţie nu este suficientă pentru declanşarea unui proces de îmbătrânire, ci
sunt necesare cel puţin câteva mutaţii pentru a modula aspectele multiple ale unui fenotip de
îmbătrânire (de exemplu sindromul Werner la adulţi sau sindromul Giolford la copii). În
aceste două sindroame a fost evidenţiată o mutaţie tip deleţie pe braţul scurt al cromozomului
8 (Gotto şi colab 1982).
Strânsa interrelaţie dintre mutaţii şi îmbătrânire a fost demonstrată şi de constatarea
existenţei unui grup semnificativ de patern-uri de mutaţii somatice specifice de specie în
cursul procesului de îmbătrânire la mamifere .Tot la mamifere s-a constatat că frecvenţa unor
mutaţii intragenice şi cromozomiale se află invers cu longevitatea respectivului organism, cu
cît numărul este mai mare cu atât viaţa respectivului organism este mai scurtă.

B. Acumulare de leziuni oxidative

Produşii oxidanţi rezultaţi din metabolismul normal determină treptat o dată cu
înaintarea în vârstă, leziuni ale ADN-ului proteinelor şi lipidelor. Acţiunea acestor produşi
este echivalenta cu cea a radiaţiilor. Aceşti produşi oxidanţi contribuie la :
- procesul de îmbătrânire;
- producerea de boli degenerative (prin leziuni somatice celulare, o dată cu
îmbătrânirea: cancer, boli cardiace, disfuncţii imunologice şi cerebrale, cataracta).
Experimental, s-a demonstrat că leziunile oxidative ale ADN-ului se acumulează o dată
cu vârsta, un şoarece devenind astfel bătrân în numai doi ani (când se acumulează circa un
milion de leziuni ADN per celulă).
Deşi organismele posedă factori de apărare cu acţiune antioxidantă (ascorbat tocoferoli,
carotenoizi, sistem enzimatic auto oxidant tip superooxiddismutaza), ADN-ul suferă efecte
oxidante care se acumulează cu vârsta, deoarece respectivele sisteme de apărare nu sunt
perfecte. Numărul loviturilor oxidante asupra ADN-ului per celulă şi per zi este de circa 100
000 la şoarece şi de zece ori mai mic la om.
Enzimele de reparare a ADN-ului îndepărtează eficient un număr mare de leziuni, dar nu
reuşesc nici ele să le îndepărteze pe toate. Mutaţiile se acumulează o dată cu vârsta prin
multiplicarea respectivelor leziunilor ADN în cursul diviziunilor celulare. În cursul
fosforilărilor oxidative se produc substanţe oxidante la nivelul mitocondriilor, având drept
consecinţă un nivel de zece ori mai mare al leziunilor oxidative la nivelul ADN-ului
mitocondrial decât la nivelul ADN –ului nuclear.
Celulele se apără singure împotriva unui număr mare de leziuni printr-un turnover
constant mitocondrial, prin care se îndepărtează, probabil, mitocondriile alterate (care produc
un număr mare de substanţe oxidante). Totuşi leziunile oxidative reuşesc să se acumuleze cu
vârsta, mai mult în ADN –ul mitocondrial decât în cel nuclear.
Substanţele oxidante produc leziuni şi la nivelul proteinelor, enzimele proteolitice
protectoare care hidrolizează proteinele oxidante nu sunt suficiente pentru a împiedica
acumularea de proteine oxidate o dată cu înaintarea în vârstă.
George Martin de la Departamentul de Patologie şi Genetică al Universităţi Washington
din Seattler arată că există o strânsă legătură între îmbătrânirea biologică intrinsecă şi
biologia neoplozilor, această interrelaţia dezvoltându-se pe baza unei instabilităţi genomice.
Cel puţin pentru regnul animal, se consideră astăzi că biologi neoploziei este un aspect
particular al îmbătrânirii precoce intrinsece (de exemplu, adenocarcinoamele de colon şi
prostata). Ca şi în cazul senescenţei, se pare că în procesul de tumorigeneza radicalii liberi
derivaţi dintr-un metabolism oxidativ au un rol important în provocarea leziunilor celulare.

C. Acumulare de proteine aberante

S-a arătat deja la capitolul referitor la acumularea de mutaţii somatice că o dată cu
înaintarea în vârstă apar histone modificate, care îngreunează accesibilitatea enzimelor de
reparare la nivelul cromatinei, în vederea reparării ADN.

198
 Una dintre teoriile îmbătrâniri celulare (teoria lui Orgel) susţine că apariţia
întâmplătoare a cromozomilor în genomul celular ar explica acumularea de anomalii în
moleculele proteice esenţiale din organism. Din punct de vedere teoretic, un asemenea
fenomen s-ar explica prin acumularea treptată de ADN, care duce la deteriorarea mai mult sau
mai puţin rapidă a mecanismelor de transcriere şi translaţie, având drept consecinţă sinteza
unor proteine deficitare şi scurtarea vieţii.
Cercetările din ultimii ani menţionează alterarea sintezei unor proteine reglatoare în
perioada de creştere somatică, ca urmare a unor fenomene epigenice ce apar în cursul vieţii,
subliniind rolul acestor fenomene în procesul de îmbătrînire.
Prin fenomene epigenice (epimutaţii) se înţeleg acele evenimente acumulate care pot
duce la alternarea structurii şi funcţiei genelor, fără apariţia unei modificări în senescenţa
primară a nucleotidelor. În acest fenomen s-ar încadra reactivările (paradoxale) unor anumite
locusu-uri de pe cromozom (de exemplu cromozomul x la şoarece) drept consecinţă a unor
modificări ale stării de metilare a citozinei de pe lanţul ADN cromozomial.
În 1983 Wilson şi Jones arată că metilarea ADN-ului scade o dată cu vârsta (cu excepţia
celulelor neopolizice). Faptul că alterări în metilarea ADN-ului au fost observate la şoareci cu
vârsta de 6 luni demonstrează că aceste modificări sunt determinate viitoarea dezvoltare şi
adaptare, consecinţa acestor modificări fiind tulburarea sintezei unor proteine reglatoare în
perioada de creştere somatică.
Din datele acumulate până în prezent s-a putut conchide că procesul de alterare a
metilării ADN-ului, o dată iniţiat, evoluează permanent, ducând tardiv în cursul vieţii la efecte
negative, atunci când forţa de selecţie naturală a organismului scade evident.
Un alt aspect al acumulării de proteine aberante este cel al acumulării cu mult peste
nivelul normal admis de proteine oxidante în organism; această situaţie duce la declanşarea
unuia dintre cele două sindroame de îmbătrânire prematură: sindromul Werner şi sindromul
Hutchinson Gilford (progeria). În aceste sindroame de îmbătrânire precoce la om se produce o
pierdere celulară prematură şi excesivă, având drept consecinţă disfuncţii de organe şi
instalare unei stări de boală.
Sindromul Werner este o boală autosomală de tip recesiv caracterizată printr-un număr
mare de degeneraţi tipice; prima manifestare este întârzierea creşteri urmată de albirea părului
atrofia ţesutului subcutant şi a pielii, hiprekeratoza căderea generalizată a părului, alterarea
vocii, cataracta bilaterală, ulceraţii ale pielii în jumătate din cazuri apare diabetul zaharat; alte
semne tipice arterioscleroza severă, osteoporoza, atrofia musculară scheletică, degenerescenţa
gravă testiculară, durata medie de viaţă de 47 de ani, în 10% din cazuri apar neoplasme.
În acest sindrom a fost evidenţiat un linkaj genetic constituit din 5 markeri pe
cromozomul 8 (Gotto et al. 1992).
Sindromul Rothmund Thomson este o afecţiune congenitală transmisă recesiv,
considerată de unii autorii drept o variantă a sindromului Werner.
Sindromul Hutchinson Gilford (progeri) este o afecţiune autosomală cu transmisie
recesivă, cu semn de senilitate evidentă deja la vârsta de 10 ani. Boala prezintă complicaţii de
tip arterioscleroză coronariana, care determină moartea pacienţilor în primii 20 de ani de
viaţa. Pe culturi celulare provenite de la persoane cu acest sindrom, Epstein şi colaboratorii au
evidenţiat o restaurare defectuoasă a ADN-ului. Celulele nu au supravieţuit în cultură mai
mult de 11 generaţii, celulele au fost incapabile să restaureze corect lanţurile de ADN, după
expunerea la raza y şi cobalt.

D. Acumularea de mutaţii în ADN-ul mitocondrial (ADNmt)

Se consideră ca într-un organism normal (cel puţin teoretic) toate moleculele de ADNmt
sunt identice; această situaţie caracterizează starea de homoplasmie.
În cazul unei boli mitocondriale cu mutaţii (de exemplu deleţie) respectivul organism
conţine mai multe tipuri de ADNmt, situaţia care caracterizează starea de heteroplasmie.
Starea de heteroplasmie poate apărea şi la un individ normal, o dată cu înaintare în vârstă; o

199
deleţie, o dată apărută pe ADNmt, se multiplică exponenţial cu vârsta. Nivelele cele mai înalte
de deleţie au fost evidenţiate postmitotic în ţesuturile aerobe muşchi scheletici, muşchiul
cardiac şi SNC). Aceste observaţii au crescut interesul cercetătorilor pentru rolul jucat de
mutaţiile de la nivelul ADNmt în cursul procesului de îmbătrânire şi în cel al bolilor
neurodegenerative.
În cursul procesului normal de îmbătrânire la un individ sănătos, proporţia de ADNmt
cu deleţie este în foarte rare cazuri mai mare de 0,1% din totalul ADNmt şi poate fi detectată
numai prin reacţia polimerizării în lanţ; reiese deci că nu este încă clarificat dacă orice deficit
funcţional poate fi legat de acest tip de mutaţie.
În schimb în bolile mitocondriale bazată pe selecţii ale ADNmt, proporţia de ADNmt,
cu deleţie trebuie să reprezinte mai mult de 60% din ADNmt total pentru a putea fi exprimat
fenotipic.
Leziunile oxidative continue ale ADN-ului sunt responsabile de scăderea capacitaţii de
fosforilare oxidativă o dată cu înaintarea în vârsta. Se pare că un proces similar ar fi implicat
în pierderea de neuroni, predispunând astfel organism la unul din fenotipurile
neurodegenerative tip boala Parkinson, boala Huntington sau boala Alzheimer.
La om este astăzi dovedit statistic că o dată cu vârsta creşte şi incidenţa bolilor.
Constatările de până în prezent ne permit să afirmăm că există o relaţie directă între procesul
de îmbătrânire şi boală, deşi natura precisă a acestei relaţii nu este încă dovedită experimental
din considerente etice.
Este foarte greu de afirmat că la o vârstă înaintată (de 90 ani sau mai mult), într-un
organism chiar aparent sănătos nu au apărut modificări patologice în corp, creier, sistemul
senzorial, chiar dacă acea persoană nu a fost diagnosticată cu o anumită boală specifică.
Modificări la nivelul anumitor organe apar în mod normal o dată cu vârsta, căci senescenţa,
deşi este un proces fiziologic normal, implică apariţia unor aspecte anormale.
Astfel în cursul senescenţei se produce, treptat, o modificare a genotipului somatic şi
totodată acumularea unor defecte care pot duce la un moment dat la conturarea unui anumit
fenotip (de boală). Unele boli apar cu frecvenţă mai mare la vârstă mai înaintată, deoarece
mecanismele cauzale necesită probabil un timp pentru ca efectele lor să devină evidente.
Astfel acumularea de alterări somatice pot duce, în cadrul bolilor degenerative asociate
procesului de îmbătrânire, la malignizarea într-o linie celulară.
În contextul relaţiei mai sus amintite, îmbătrânirea-boală se poate afirma că există o
relaţie fundamentală directă între îmbătrânire şi cancer. Se pare că acelaşi mecanism care
protejează organismul împotriva acumulării unor leziuni responsabile de senescenţă
protejează organismul şi împotriva unor mutaţii ce duc la declanşarea cancerului.
Astăzi sunt consideraţi factori care întârzie (protejează organismul de) senescenţă: dieta
hipocalorică şi exerciţiul fizic.
La om, este dovedit că subnutriţia creşte ulterior în viaţă, riscul de hipertensiune şi boli
cardiovasculare. În schimb, nutriţia hipocalorică postnatală, la rozătoare duce la creşterea
evidentă a duratei de viaţă. Implicaţiile interacţiunii dintre dieta hipercalorică şi mecanismul
fundamental care reglează senescenţa şi durata vieţii la om rămâne încă a fi investigat în
detaliu.
Referitor la exerciţiul fizic se consideră că acesta aplică cu regularitate la om poate
ameliora modificările legate de vârstă la nivelul mitocondriilor din ţesutul muscular.
Exerciţiul fizic, prin creşterea vitezei turnover-ului la nivelul mitocondriilor, întârzie
îmbătrânirea aparatului mitocondrial din ţesutul muscular.

200
 Capitolul 10

RĂSPUNSUL IMUNITAR

10. 1. Noţiuni generale despre imunitate şi sistem imunitar

Imunitatea reprezintă capacitatea de a recunoaşte şi neutraliza macromolecule sau celule

străine organismului şi care, pătrunse în mediul intern, ar putea produce dereglări ale
homeostaziei. Imunitatea înlătură, în afară de substanţele străine şi pe cele proprii
organismului, dar pe care acesta nu le mai recunoaşte ca proprii, din cauză că au suferit
anumite modificări.
Imunitatea poate fi moştenită (naturală), când s-a instalat ca urmare a contactului
generaţiilor anterioare cu un anumit antigen şi se transmite ereditar, sau poate fi dobândită, ca
urmare a contactului prealabil al organismului cu un anumit antigen (imunitate consecutivă
anumitor boli infecţioase). Imunitatea poate fi dobândită şi artificial, prin vaccinuri care
conţin germeni atenuaţi sau morţi – imunitate activă, sau prin administrarea unor seruri imune
conţinând anticorpi specifici – imunitate pasivă.
Sistemul imunitar este un sistem responsabil cu apărarea organismului împotriva
efectelor nocive ale corpurilor străine (antigeni). Principala funţie a sistemului imunitar este
de a recunoaşte şi ataca antigenii străini.
Răspunsurile imunitare sunt de două tipuri:
1. Răspunsuri umorale - ce constau în generarea de anticorpi, (proteine cu structuri
similare), cunoscute sub numele de imunoglobuline şi care sunt specifici unui anumit antigen;
în cadrul răspunsului imunitar umoral specific, anticorpii sunt produşi pe calea stimulării
limfotitelor B sau a celulelor plasmatice (plasmocite).
2. Răspunsuri celulare - de exemplu infiltrarea limfocitelor în pielea sau organul
grefat. Răspunsul imunitar celular este generat de limfocitele T, care stimulate specific devin
celule T efectoare. Celulele T sunt de mai multe feluri în funcţie de natura reacţiei pe care o
determină. Astfel, celulele T pot să:
- amplifice răspunsul imunitar (celular T ajutătoare);
- reducă răspunsul imunitar (celule T supresoare);
- distrugă efectiv celelele ţintă (celule T citotoxice).
Răspunsul imunitar umoral este important pentru infecţiile bacteriene, iar răspunsul
imunitar celular pentru acţiunea organismului asupra celulelor maligne, a transplatelor tisulare
şi infecţiilor (ciuperci sau fungi).
Limfocitele au un rol deosebit de important în cazul, ambelor tipuri de răspuns
imunitar, demonstrându-se că aceste celule pot transforma de la un organism la altul
capacitatea de a produce anticorpi şi de a rejecta grefele .Această capacitate de transfer a
limfocitelor face ca ele să joace un rol cheie în apariţia răspunsurilor imunitare.
Răspunsul imunitar celular este dependent de starea timusului de aceea limfocitele
respective poartă numele de celule T (timus dependente). Similar, limfocitele producătoare de
anticorpi, care sunt dependente de măduva osoasă poartă numele de celule B (de la bursa lui
Fabricius, organ limfoid prezent la păsări, timus independente). Sistemul imunitar acţioneză
deci ca un sistem defensiv în cazul apariţiilor unor infecţii. Din această cauză, persoanele cu
deficienţe imunitare congenitale, dacă sunt netratate, nu pot supravieţui (fig. 128).
Un răspuns imunitar constă din două părţi:
1. răspunsul specific la un anumit antigen;
2. creştere nespecifică a efectului răspunsului.
În cazul răspunsului imunitar specific, acesta este mai rapid şi cu o amploare mai mare
în cazul în care reîntâlneşte un antigen particular. Această comportare poartă numele de
memorie imunitară, şi este cea care asigură eficienţa ridicată a acţinii sistemului imunitar.

201
Fig. 128 - Componentele sistemului
imun

Un răspuns are două faze:

1. faza de recunoaştere - în care
antigenul este recunoscut ca un corp
străin;
2. faza activă în care aticorpii elimină
antigenul

10.2. Organizarea sistemului imunitar

Celulele esenţiale pentru generarea răspunsului imunitar, limfocitele işi au originea în

măduva oaselor.
Din cadrul sismului imunitar fac parte două categorii de organe:
1. Organe limfocitare primare: timusul şi măduva osoasă ce conţin celule care dezvoltă un
proces de maturare a celulelor sensibile la antigeni;
2. Organe limfocitare secundare: nodulii limfocitari, splina şi ţesuturi limfocitare asociate
mucoaselor care sunt cele ce conţin celule sensibile la antigeni aflate intr-un circuit de
recirculare prin organism.
3. Celule libere, circulante în fluxul sanguin. Din această categorie fac parte limfocitele,
macrofagele, neutrofilele, bazofilele, eozinofilele. Celula centrală in imunologie este
limfocitul. Limfocitele sunt componente celulare specifice pentru antigeni. Ele
acţionează prin receptorii de pe suprafaţa membranei, fiecare receptor având o înaltă
specificitate. Diferite clone limfocitare au propria lor specificitate unică. Studiul
markerilor de pe suprafaţa limfocitară şi a activităţii lor funcţionale a permis
identificarea celor două populaţii de limfocite T (timus dependente) şi B
(bursodependente – de la bursa lui Fabricius, organ limfoid întâlnit la păsări, timus
independente). Celulele T şi B circulă prin organism pe un traseu bine stabilit prin
organele limfocitare secundare. Cele mai multe celule limfocite care sunt recirculate sunt
cele de tip T, al căror ciclu complet durează aproximativ 24 de ore, dar sunt recirculate şi
celule B, inclusiv cele care au „memorie".
Originea limfocitelor şi diferenţierea. La mamifere precursorii limfocitelor apar în
insule sanguine din sacul vitelin şi migrează prin placentă în ficat, splină şi măduvă osoasă.
În timpul vieţii măduva osoasă produce celule susă care au printre descendenţii lor şi
precursorii limfocitelor.
Limfocitele T. Sunt derivate din timus sau influenţate de timus în timpul dezvoltării lor.
Ele migrează încă din timpul vieţii fetale în timus unde se diferenţiază diferit în zona
corticală, faţă de zona medulară. În zona corticală, aproximativ 90% din celulele T se divid
rapid, conţin pe suprafaţă mulţi antigeni şi sunt sensibilile la liza prin acţiunea
corticosteroizilor. În zona medulară, limfocitele în număr redus sunt rezistente la cortizon, se
divid lent şi conţin pe suprafaţă puţini antigeni. Celulele care părăsesc timusul dobândesc
receptorul pentru antigen, intră în organe limfoide secundare (ganglioni limfatici, splină) şi se
localizează în arii timodependente. Aceste celule T au viaţă scurtă. Dacă sunt expuse la
antigen se maturizează în celule sensibilizate care sunt circulante şi au viaţă lungă. Aceste
celule sunt capabile să se transforme în celule efectoare timice dacă sunt reexpuse la antigen.
Limfocitele T sunt răspunzătoare de reactivitatea cutanată întârziată, apărarea împotriva
anumitor microorganisme, fungi, bacterii patogene, virusuri, respingerea alogrefelor,
imunitatea antitumorală. Limfocitele T nu produc anticorpi circulanţi şi nu dau naştere la
celule secretoare de anticorpi. Există două categorii funcţionale de limfocite T: limfocite T

202
reglatoare care pot amplifica (celule helper) sau pot suprima (celule supresoare) răspunsurile
altor limfocite (T sau B) şi limfocite T efectoare, răspunzătoare de reacţii imune mediate
celular, cum sunt: reacţiile de hipersensibilitate cutanată întârziată, respingerea de grefe şi
tumori, eliminarea de celule infectate etc. Din această categorie fac parte limfocitele T
citotoxice (celule killer), care participă ultimile la răspunsul imun şi limfocitele T de
hipersensibilitate întârziată, care eliberează limfokine (citokine), glicoproteine care mediază
răspunsul inflamator.
Limfocitele B. Limfocitele B şi celulele plasmatice produc anticorpi sau
imunoglobuline (Ig), proteine plasmatice circulante şi sunt răspunzătoare de imunitatea
umorală. După generarea lor în măduva osoasă, celulele B imunocompetente migrează în arii
specifice din organe limfoide periferice. Aceste celule au viaţă scurtă ca şi celulele T şi
necesită expunerea la antigen pentru a se maturiza în celule B sensibilizate, recirculante, care
răspund la reexpunerea la antigen prin proliferare şi diferenţiere prin celule B de memorie şi
plasmocite.
Rolul principal al limfocitelor B este în realizarea imunităţii rapide. Răspunsul imun
primar are loc la primul contact al limfocitului cu antigenul. Limfocitul se transformă în
limfoblast (imunoblast) care are un nucleu palid cu o cantitate mare de eucromatină şi 2 - 4
nucleoli. După activare, limfocitele B se divid şi dau naştere la clone celulare B. Unele
limfoblaste se diferenţiază în plasmocite, celule care produc imunoglobuline, iar altele devin
circulante, transformându-se în celule cu memorie, reţinând în memoria lor primul contact cu
acelaşi antigen. Se dezvoltă astfel un răspuns imun secundar, prin care la un nou contact cu
antigenul, celulele cu memorie îl recunosc şi se transformă mai rapid în imunoblaste.

10.3. Molecule cu rol esenţial în cadru sistemului imunitar

10.3.1. Antigenii

Antigenul (Ag) este capabil să provoace un răspuns imun. El reacţionează atât cu

receptorii celulelor T, cât şi cu anticorpii.
O moleculă antigenică poate avea mai mulţi determinanţi antigenici (epitopi): fiecare
epitop se poate lega cu un anticorp individual şi o singură moleculă care poate deci provoca
mai multe molecule de anticorpi.
Anumite molecule numite haptene deşi nu sunt capabile să provoace răspunsuri
imunitare ele însele, pot însă să reacţioneze cu anticorpi existenţi şi cu celule T receptoare.
Asemenea molecule trebuie să se asocieze cu moleculele - purtător pentru a fi antigeni. Pentru
anumite chimicale, cum ar fi medicamentele, purtătorul poate fi o (auto)proteină gazdă.
Structura terţiară, ca şi secvenţa de aminoacid este importantă pentru determinarea
caracterului antigenic. Lipidele pure nu sunt antigeni (nu provoacă un răspuns imun), iar acizii
nucleici sunt de asemenea slabi antigeni.
Antigenii sunt la rândul lor împărţiţi în mai multe categorii, în funcţie de factorii
necesari a interveni pentru provocarea răspunsului imun, astfel :
a. antigeni dependenţi de timus necesită participarea celulelor T pentru a provoca producerea
de anticorpi (exemple de asemenea antigeni sunt serurile de proteine străine şi celulele
roşii străine de corp);
b. antigeni independenţi de timus: nu necesită celule T pentru producţia de anticorpi, ei
stimulând direct limfocitele B pentru a produce anticorpi Ig; asemenea antigeni sunt
polizaharidele bacteriale (din pereţii celulari bacteriali) şi endotoxinele.
Există şi alţi factori diferiţi de proprietăţile intrinseci ale antigenilor, care influenţează
calitatea răspunsului imun, printre care se pot enumera: natura moleculelor (conţinutul de
proteine, mărimea, solubilitatea); doza (mică, moderată, mare); calea de intrare (injecţie -
intradermale, intramusculară, intravenoasă, subcutanată, pe cale orală, inhalare); adăugarea
unor substanţe cu efect sinergetic, de exemplu adjuvante alţi antigeni etc.; factorii genetici.
203
 10.3.2. Anticorpii

Anticorpii (Ac) sau imunoglobulinele (Ig) sunt molecule proteice heterogene cu

proprietatea de asociere specifică cu substanţa care a provocat formarea lor (antigenul). Sunt
produşi de celulele B şi plasmocite, provenite din celule B. Cu excepţia Ig naturale, anticorpii
se formează ca răspuns la o substanţă străină (Ag). Ig reprezintă receptorul celulei B pentru
Ag.
Imunoglbulinele reprezintă 20 % din totalul proteinelor plasmatice. La electroforeza
serului, majoritatea Ig migrează spre gamaglobuline, dar cantităţi semnificative migrează şi
spre zona betaglobulinică; diferite cantităţi de Ig se găsesc în lichidele extravasculare, în
secreţii exocrine, pe suprafaţa limfocitelor.
Un anticorp în structura sa de bază este alcătuit din patru lanţuri:
- două lanţuri identice grele (H);
- două lanţuri identice usoare (L).
Fiecare lanţ este alcătuit din domenii de aproximativ 110 aminoacizi. Domeniile au
aceeaşi structură de bază şi la compararea secvenţelor de aminoacizi se pot pune în evidenţă
multe arii similare. Domeniul terminal N al lanţurilor grele si al celor uşoare este foarte
important pentru recunoaşterea antigenilor, deoarece el cuprinde zona de legătură. Secvenţa
de aminoacid a acestor domenii terminale variază de la anticorp la anticorp, de aceea sunt
cunoscute sub numele de regiuni variabile V. Învecinat cu regiunea variabilă a moleculei de
anticorp se află regiunea constantă C, constituită dintr-un domeniu în cazul lanţurilor uşoare şi
din trei domenii în cazul celor grele (fig. 129).

Fig. 129 - Structura de bază a unui anticorp.

VL - reprezintă domeniul variabil al lanţului

uşor;
CL - domeniul constant al lanţului uşor;
VH- domeniul variabil al lanţului greu;
CH- domoniul constant al lanţului greu.
Lanţurile grele determină clasa (isotipul)
anticorpului, precum şi funcţia fiziologică a
unei molecule particulare de anticorp. Când un
domeniu terminal N al unei molecule de
imunoglobuline a reacţionat cu un anticorp, molecula suferă o schimbare în conformaţia
lanţurilor grele.
Principalele clase de imunoglobuline sunt următoarele:
- IgM are o moleculă mare, constituită din patru unităţi de bază menţinute într-o structură
unitară de un lanţ de legătură, rolul major al acestor imunoglobuline fiind neutralizarea
vasculară a microorganismelor, în sprecial a viruşilor; reprezintă 10 % din totalul
imunoglobulinelor;
- IgG este o imunoglobulină mai mică, care poate uşor penetra ţesuturile; este singura
imunoglobulină care penetrează placenta pentru a furniza protecţie imunologică fătului;
reprezintă 75 % din totalul imunoglobulinelor;
- IgA este imunoglobulina cea mai importantă care apare în mucoase; ea este o secreţie a
mucoaselor şi constă din două unităţi de bază unite printr-un lanţ de legătură; reprezintă
15 % din totalul imunoglobulinelor;
- IgD este imunoglobina sccretată de limfocitele B şi probabil implicată în activarea acestor
celule de către antigeni; reprezintă 0,2 % din totalul imunoglobulinelor;
- IgE este imunoglobina produsă de plasma celulelor, dar principalul ei rol fiziologic nu
este încă cunoscut, deşi se bănuieşte că este implicată în expulzarea paraziţilor intestinali,
în inflamaţii şi alergii; reprezintă 0,04 % din totalul imunoglobulinelor.

204
 10.3.3. Celule T

Celulele T recunosc un antigen

atunci când le este prezentat într-o formă
adecvată, adică în general, după
prelucrarea lor de către celulele de
prezentare (macrofagele). Celulele
receptoare T prezintă două lanţuri, alfa şi
beta. Structura probabilă a unei astfel de
celule este prezentată în figura 130.

Fig.130 - Structura celulei

receptoare T

La fel ca imunoglobulinele, ambele lanţuri de celule T receptoare au regiuni variabile,

regiunile constante sunt alcătuite din domenii, iar lanţurile sunt pliate. Aceste similarităţi au
dus la presupunerea că genele pentru celulele T receptoare îşi au originea în aceleaşi gene
părinte ca genele pentru imunogiobuline, ambele fiind membre ale familiei de „supergene".

10.3.4. Antigeni de histocompatibilitate

Aceşti antigeni nu sunt atât de bine definiţi, dar au un rol important în răspunsul imun. Au
denumirea dc antigeni de histocompatibilitate din cauza reacţiilor foarte puternice pe care le
provoacă în cazul nepotrivirii transplanturilor de organe. Sunt implicate în recunoaşterea
antigenilor de către majoritatea celulelor T.
Antigenii de histocompatibilitate umani sunt cunoscuţi sub denumirea de antigeni HLA şi
sunt la rândul lor de două tipuri:
- antigeni HLA de clasa I;
- antigeni HLA de clasa II.
În figura 131 se prezintă structura acestor antigeni. Acestea sunt glucoproteine de la
suprafaţa celulelor şi au un grad avansat de polimorfism genetic, adică variabilitate genetică
între indivizi. Majoritatea indivizilor care nu sunt înrudiţi prezintă antigeni HLA diferiţi, deci
este foarte dificilă obţinerea unei potriviri a acestor antigeni în cazul unor transplanturi de
organe de la indivizi neînrudiţi.

Fig. 131 - Structura unor antigeni

10.3.5. Citokinele

Fazele de desfăşurare ale imunităţii

naturale şi specifice (împotriva virusurilor şi
bacteriilor, de exemplu), sunt în mare parte
mediate de hormoni proteinici numiţi
citokine.
În imunitatea naturală citokinele
efectuare sunt produse in special de
fagocitele mononucleare şi astfel sunt numite monokine. Deşi monokinele pot fi induse direct de
microbi, ele pot fi de asemenea secretate de fagocitele mononucleare celulelor T stimulate
antigenic deci ca parte a imunităţi specifice.

205
 De asemenea, monokinele joacă roluri importante fiind continuatori ai activării
limfocitelor, amplificând astfel mecanismele pentru răspunsurile imune specifice.
In imunitatea specifică, majoritatea citokinelor sunt produse de limfocitele T activate şi se
numesc limfokine. Celulele T produc câteva citokine ce reglează activarea, creşterea şi
diferenţierea populaţiilor limfocitare variate.
Alte citokine, derivate din celulele T activează şi reglează celulele inflamatorii care sunt
fagocitele mononucleare, neutrofilele şi eozinofilele. Aceste citokine sunt molecule efectuare ale
imunităţii imediate celular şi sunt, de asemenea, responsabile pentru comunicaţiile dintre celulele
sistemelor imune şi inflamatorii.
Limfocitele şi fagocitele mononucleare produc şi alte citokine numite factori stimulatori ai
coloniei, ce stimulează creşterea şi diferenţierea leucocitelor imature in măduva oaselor. Prin
urmare, citokinele sunt un grup divers de glicoproteine, având următoarele proprietăţi generale:
- citokinele sunt produse în timpul fazelor efectuare ale imunităţii naturale şi specifice şi servesc
medierii şi reglării răspunsurilor imune şi inflamatorii;
- secreţia citokinelor este un eveniment self-limitat scurt. Citokinele nu sunt stocate ca
moleculele pre-formate şi sinteza lor este iniţiată de o nouă transcripţie genică. Activarea
transcripţională este tranzitorie, moleculele de ARNm sunt instabile; combinaţia unei
perioade scurte de transcripţie cu o durată de viaţă a ARNm pentru citokine determină
caracterul tranzitoriu al sintezei citokinelor. Odată sintetizate citokinele sunt rapid secretate;
- multe citokine sunt produse de diverse tipuri celulare. Citokinele produse deci de tipuri
celulare diverse, acţionează de asemenea, asupra multor tipuri de celule diferite, proprietate
numită pleiotropism;
- acţiunile citokinelor sunt deseori redundante, de fapt fiind implicate mai multe citokine
diferite); citokinele influenţează sinteza altor citokine; citokinele influenţează acţiunea altor
citokine (doua citokine pot avea acţiune antagonică,ori sinergică-efect crescut ori adiţionale);
- citokinele, ca şi alţi hormoni polipeptidici iniţiază acţiunea lor prin legarea la receptorii
specifici de pe suprafaţa celulelor ţintă. Când aceeaşi celulă ţintă secretă citadine acţiunea se
numeşte autocrină; când o celula din apropriere secretă citokină, acţiunea se numeşte
paracrina, iar când o celulă este stimulată de la distanţă prin citokinele secretate în circulaţie,
acţiunea este endocrină, ca in cazul hormonilor adevăraţi;
Expresia multor receptori ai citokinelor este reglată de semnale specifice (care pot fi alte
citokine, de exemplu).
Majoritatea răspunsurilor celulare la citokine este lentă, după o perioadă de câteva ore şi
necesită un nou ARNm şi sinteza proteică.
Pentru multe celule ţintă, citokinele acţionează ca regulatori ai diviziunii celulare, adică ca
factori de creştere (de pildă, ca factori de creştere epiteliali şi mezenchimali în repararea tisulară).
Funcţiile citokinelor sunt clasificate astfel:
ƒ mediatori ai imunităţii naturale (induse de agenţi infecţioşi din fagocitele mononucleare);
ƒ regulatori ai activităţii, creşterii şi diferenţierii limfocitelor (induse în răspunsul
recunoaşterii antigenului specific de limfocitele T);
ƒ activatori ai celulelor inflamatoare nespecifice (induse ca răspuns la recunoaşterea
antigenului specific de limfocitele T);
ƒ stimulatori ai creşterii leucocitelor imature şi ai diferenţierii (produşi de limfocite
stimulate şi alte celule).

Citokinele ce mediază imunitatea naturală

Citokinele ce mediază imunitatea naturală împotriva infecţiei virale şi pe cea care iniţiază
reacţiile inflamatorii împotriva bacteriilor sunt următoarele:- interferonii tip I; - factorul de
necroza tumoare; - interleuchina; -1; - interleukina-6: - citokinele inflamatorii cu greutate
moleculară joasă.

206
 Interferonul tip (IFN I)
Include două grupe de proteine distincte serologic şi anume IFN-A (produse de fagocit
molecular în principal) şi IFN-B (produse de fibroblast) având patru acţiuni biologice:
1. IFN de tip I inhibă replicarea virală: IFN induce sinteza unui număr de enzime, ca 2-1-
oligoadenilat, sinteza care interferă cu replicarea ADN ori ARN viral.
2. Acţiunea antivirală a IFN este de tip paracrin, adică celula infectată viral secretă IFN pentru
protecţia celulelor vecine încă neinfectate. Se spune că o celulă care a răspuns la IFN şi este
rezistentă la infecţia virală se află intr-o stare antivirală;
3. IFN inhibă proliferarea celulară. Această acţiune este datorită aceloraşi enzime care inhibă
replicarea virală dar şi inducţiei altor enzime ce previne sinteza aminoacizilor, în special a
aminoacizilor esenţiali ca triptofanul;
4. IFN creşte potenţialul letal al limfocitelor nativ ucigaşe;
5. IFN modulează expresia moleculară autogenelor de histocompatibilitate.
Acei interferoni cresc expresia moleculelor din clasa I şi inhibă expresia celor din clasa II.
Deoarece majoritatea limfocitelor citolitice recunosc antigenele străine legate de clasa I de
antigene ale complexului major de histocompatibilitate IFN ajută faza efectuare a răspunsurilor
imune mediate celular, mărind eficienţa uciderii;în acelaşi timp; IFN poate inhibă faza cognitiv a
răspunsurilor imune, prevenind activarea ajutătoare. Prin urmarea cele trei activităţi funcţiilor
litice ale limfocitelor ucigaşe si creşterea in expresia moleculelor din clasa I a complexului major
de histocompatibilitate, acţionează concertat eradicarea infecţiei virale.

Factorul de necroză a tumori (FTN)

Este principalul mediator al răspunsului gazdei la bacterii gram negative. Sursa celulara
majoră a acestui factor sunt fagocitele mononucleare activate de lipopolizaharidul (endotoxina)
derivat din peretele celular al bacteriei.
Acest factor, al concentraţiei scăzute (cea 10-9 M) acţionează local ca regulator paracrin şi
autocrin al leucocitelor şi celulelor endoteliale, astfel:
1. FNT permite celulelor endoteliale să devină adezive pentru leucocite iniţial pentru
neutrofile, apoi pentru monocite care se acumulează la locurile inflamaţiei;
2. FNT activează leucocitele inflamatori pentru a omorî, în special neutrofilele dar şi
eozinofilele mononucleare;
3. FNT stimulează fagocitele mononucleare şi alte celule Nn produc citokine, în special IL-1 Ni
IL-6;
4. FNT este un costimulator al activităţii celulei T;
5. FNT induce sinteza CSF de către celule endoteliale şi fibroblaste;
6. FNT exercită o acţiune protectoare împotriva viruşilor şi amprente expresia clase I de
molecule ale complexului major de histocompatibilitate potenţând liza mediata de limfocite
asupra celulelor infectate viral. De asemenea JFNT exercită acţiuni sistematice diverse (este
un hidrogen endogen, simulează fagocitele mononucleare să secrete IL-1 Ni IL 6, hepatocitele
să sintetizeze anumite proteine serice, etc.), iar în concentraţii mari poate avea efecte letale
(deprimă contractilitatea miocardului, reduce presiunea sanguina şi perfuzii, cauzează
trombon intravasculară,etc.)

Interleukina-1 (IL-1)
Funcţia principală a IL-1 este acea de mediator al răspunsului inflamator în imunitatea
naturală. Sursa celulară a IL-1 este fagocitul mononuclear activ. Local, acest factor măreşte
proliferarea celulelor T CD şi creşterea şi diferenţierea celulelor B, stimulează diferite celule în
răspunsul imun, etc.
Interleukina-6 (IL-6)
Este sintetizată de celule endoteliale, fibroblaste, etc având două acţiuni binecunoscutele
hepatocite (care sintetizează fibrinogen ce contribuie la faza acută) şi pe celulele B, ca principal
factor de creştere.
207
 Citokinele inflamatorii cu greutate moleculara joasă: familia interlekina-8
Aceste citokine inflamatorii derivă din:
a. celule T activate antigenic;
b. fagocite mononucleare,celule endoteliale, fibroblaste sau celule epiteliale;
c. plachete.
Ele servesc ca principali mediatori secundari ai inflamaţiei.

Citokinele ce reglează activarea limfocitelor, creşterea şi diferenţierea

Aceste citokinele sunt produse în principal de limfocitele active antigenic, în special din
subsetul CD. Aceste celule T sunt utile atât pentru răspunsul imun mediat umoral, cât şi pentru
acela mediat celular, în mare parte prin secreţia citokinelor.
Citokinele ce acţionează primar pentru a regla limfocitele, sunt interleukina-2, interleukina-
4, β factorul de transformare a creşterii (β -FTC).

Interleukina-2 (IL-2)
IL-2 este principala citokină responsabilă pentru trecerea limfocitelor T de la fazi G la faza
S a ciclului celular. Este produsă în special de celulele T. CD acţionează pe aceleaşi celule care
o produc, deci ea funcţionează ca un factor de creştere endocrin.
Acţionează de asemenea pe limfocitele T din apropiere (pe ambele substraturi CD şi CD) şi
deci este totodată şi un factor de creştere endocrin.
În timpul răspunsurilor imune fiziologice, ce nu circula în sânge pentru a acţiona la distanţă
şi de aceea nu este considerată un factor de creştere endocrin. Principalele ei acţiuni pe limfocite
sunt:
Interleukina-2 este factorul de creştere endocrin major pentru limfocitele T Ni cantitatea de
IL-2 sintetizată de celulele T CD activate este un determinant important al magnitudinii
răspunsurilor imune;
IL-2 stimulează creşterea celulelor nativ ucigaşe şi măreşte funcţia lor catalitica (sunt
produse aşa numite celule killer-activate de limfokinază).
IL-2 acţionează pe celulele B umane ca un factor de creştere cât şi un stimul pentru sinteza
anticorpilor.
Deoarece IL-2 este considerat in prezent o "cheie" în imunologia celulei T şi un agent
terapeutic promiţător în lupta anticanceroasă, menţionăm că în structura tridimensională a
proteinei a fost identificat recent un helix necesar pentru folding-ul terţiar bioactiv—care este un
mănunchi afla- helical antiparalel (0,3 nm), capătul C-terminal formând helixul ce se extinde de
la poziţia 117 la 133 în secvenţele de aminoacizi.

Interleukina (IL-4)
IL-4 este produsă de celule T CD Ni are efecte importante pe patru timpuri de celule:
1. IL-4 este un factor de creştere şi diferenţiere pentru limfocitele B (putând fi necesară atât
pentru proliferare cât şi pentru secreţia anticorpilor de celulele B ca răspuns la antigenele
proteice). IL-4 este singurul factor comutator cunoscut pentru producerea IgE.
2. IL-4 este un factor de creştere autocrin pentru un subset de celule T CD clonate c secretă IL-
4JL-5 Ni IL-6 în contrast cu majoritatea clonelor cere produc IL-2, gamainterferon şi
limfotoxină;
3. IL-4 este un factor de creştere pentru mastocite şi acţionează sinergic cu IL-3 Nn stimularea
proliferării mastocitelor;
4. IL-4 este de asemenea un factor de activare a macrofagelor (chiar dacă efectele de potenţare
sunt mai reduse decât efectele gama-interferonului). De asemenea, s-a sugerat recent că IL-4
poate contribui si la imunitatea mediată celular.

208
 Factorul β de transformare a creşterii ( β - FTC)
Celulele T activate antigenic cât şi macrofagele activate secretă β - FC biologic activ.
Acţiunile acestui factor sunt pleiotropice. El inhibă creşterea multor tipuri celulare şi stimulează
creşterea altora; uneori însă poate fie să inhibe creşterea aceluiaşi tip celular în cultură; β - FTC
cauzează sinteza proteinelor matrice extracelulare asemenea, β - FTC determina creşterea de noi
vase sanguine, un proces numit angiogeneză.
Ca o citokină, β - FTC este potenţiala important deoarece antagonizează multe răspunsuri
ale limfocitelor. De exemplu, β - FTC inhibă proliferarea celulelor T la miogen policlonali, inhibă
maturarea celulelor CTL1, inhibă activarea macrofagelor, etc. În vivo, anumite tumori pot scăpa
de un răspuns imun secretând mari cantităţi de β - FTC.

Citokinele ce activează celulele inflamatorii

Aceste citokine provin în principal din limfocite T CD şi CD şi servesc în special activării
funcţiilor celulelor efectoare nespecifice. Astfel, aceste citokine mediază faza efectoare a
răspunsurilor imune mediate celulare şi ele includ gama-interferon, limfotoxină, interleukina-5 şi
factorul de inhibare a migrării.

Interferonul imun sau gamma (gamma-IFN)

Acest interferon (numit şi interferonul tip II) induce - ca şi interferonul tip I - o stare
antivirală şi antiproliferativă, însă are câteva proprietăţi legate de imunoreglare care ii separă
funcţională de IFN tip I.
Este produs atât de celulele T ajutătoare CD ce secretă IL-2 cât de celulele T CD.
În imunoreglare, acest interferon are următoarele funcţii:
1. Gama-IFN este un activator important al fagocitelor mononucleare. El induce direct
sinteza enzimelor ce permit macrofagelor să omoare microbii fagocitaţi. Citokinele care
cauzează modificări funcţionale în favoritele mono nucleare au fost numite factori de
activare a macrofagelor. Astfel, gama-IFN este principalul factor de activare a
macrofagelor şi el furnizează mijloace prin care celulele T activează macrofagele;
2. Gama-IFN creşte expresia moleculară din clasa I de antigene a complexului major de
histocompatibilitate, în contrast cu IFN tip I care, la o varietate de tipuri celulare,
determină expresia moleculară din clasa 11 a acestui complex;
3. Gama-IF acţionează direct pe limfocite T şi B pentru a promova diferenţierea;
4. Gama-IFN activează neutrofilele (însă mai puţin decât FTN sau limfotoxină);
5. Gama-IFN este un activator potent al celulelor nativ ucigaşe (mai mult decât IFN tip l);
6. Gama-IFN este un activator al celulelor endoteliale vasculare (promovând adeziunea
limfocitelor CD şi alterează caracterele morfologice ce facilitează extravazarea
limfocitelor).

Limfotoxina
Limfotoxina este sintetizată de celulele T şi de obicei acţionează local ca un factor paracrin
şi nu ca mediator al injuriei sinteticele este un activator potent al neutrofilelor furnizând
limfocitelor un mijloc de reglare a reacţiilor inflamatorii acute. LT este, de asemenea un activator
al celulelor endoteliale vasculare acuzând creşterea aderării leucocitelor la endoteliu, producerea
citokinelor şi modificări morfologice ce facilitează extravazarea leucocitelor.

Interleukina-5 (IL-5 )
Este produsă de celulele T CD activate şi mastocitele activate. O acţiune importantă; IL-5
este capacitatea de a stimula centra şi diferenţierea eozinofilelor şi de a activa eozinofilele mature
ca acestea sa poată omorî helminţii.

209
 Factorul de inhibare a migrării
Acumularea fagocitelor mononucleare în ţesuturi depinde de reţinere acestor celule ca
răspuns la citokinele produse local ce inhibă motilitatea. Se considera în prezent că reţinerea
leucocitele în ţesuturi este controlată de exprimarea recepţionerilor specifici pentru moleculele
matrice extracelulare, cum sunt integrinele. Acest factor nu reprezintă o citokină unică, fiind
donate molecule cu această activitate.

Citokine ce stimulează hematopoieza

Reacţiile imune şi inflamatorii care consumă leucocitele induc producerea de noi leucocite
care înlocuiesc celulele inflamatorii. Se ştie că maturarea unei leucocite implică comutarea la o
linie particulară cu pierderea capacităţii de dezvoltare în alte tipuri de celule mature.
Citokinele ce stimulează expansiunea şi diferenţierea progenitorilor din măduva oaselor sunt
denumite factori de stimulare a coloanei (FSC). Acţiunile acestor citokine sunt influenţate de alte
citokine. De exemplu FNT, LT, gama-IFN, FTC inhibă creşterea celulelor din măduva oaselor, în
timp ce IL-l, IL-6, măresc răspunsul la aceşti factori.
Mediatorii creşterii leucocitelor imature B ai diferenţierii lor sunt interleukina-3 de
stimulare a coloniei macrofagelor, factorul de stimulare a coloniei granulocite-macrofag, factorul
de stimulare a coloniei granulocitelor B, interleukina-7.
În timp ce interleukina-3 (cunoscută ca factor de multitudine) promovează expansiunea
celulelor ce se diferenţiază în toate tipurile de celule mature cunoscute, acţiunea inteleukina-7,
recent descrisă, vizează progeniturii hematopoietice comutaţii la linia limfocitelor B.
În concluzie, citokinele exercită numeroase funcţii utile organismului, însă în cazul
producerii lor excesive se poate instala dezordinea tisulară şi chiar moartea.
Ele servesc creşterii chiar şi a celulelor nemuritoare, adică celulelor canceroase. De
exemplu, IL-6 acţionează ca factor de creştere pentru multe celule maligne plasmatice
(plasmacitoame sau mieloame) B, astfel multe celule tumorale ce cresc autonom secretă IL 6 ca
un factor de creştere autocrin. Mai mult, IL-6 promovează creşterea celulelor somatice hibride
produse prin fuziunea celulelor B normale cu celule mielomului, adică a "hibridoamelor"ce
produc anticorpi monoclinali.

10.4. Relaţii de cooperare între componentele sistemului imun

Antigenele macromoleculare conţin epitopi multipli sau determinanţi, fiecare din

aceştia putând fi recunoscuţi de un anticorp.
Anticorpi sunt produşi in RER al celulei B; lg de la suprafaţa celulei B este receptorul
celulei B pentru antigen. Moleculele de anticorpi secretaţi neutralizează antigenele, activează
sistemul complement, obsonizează antigenele şi amplifică fagocitoza lor de către diferite celule.
În plus, diferite izotipuri de anticorpi se leagă la receptorii Fc pe eozinofile, mastocite şi celule
native ucigaşe şi stimulează funcţiile acestor celule ca pe o consecinţă a legării antigenului. Alţi
receptori Fc de pe celulele epiteliale mediază transportul transepitelial al anticorpilor IgA si IgG.
Celulele T recunosc antigenul numai pe suprafaţa celulelor accesorii, în asociaţie cu
produsul unei gene a self-ului, complex major de histocompatibilitate.
Prin urmare, celulele T recunosc şi răspund la antigenele proteice străine numai când
antigenul este ataşat de suprafaţa altor celule, în timp ce celulele B şi anticorpii secretaţi leagă
antigenele solubile aflate în circulaţie sau în faza apoasă.
Limfocitele T helper şi citolitice specifice pentru antigenele proteice străine recunosc
deci simultan două structuri, antigenul străin şi o moleculă MHC self, prezente pe suprafaţa
celulelor accesorii sau celulelor ţintă.
Celulele accesorii cel mai bine definite pentru limfocite T helper includ:
- fagocitele mononucleare;
- limfocite B;
- celule dendritice (celule de prezentare, respectiv macrofagele);

210
 - celule Langerhans ale pielii;
- celulele endoteliale.
Limfocitele T helper CD+4 recunosc antigenele în asociaţie cu produsele clasei a doua a
complexului major de histocompatibilitate şi celulele CD+8, CTL 1 recunosc antigenii în asociaţie
cu produsele genice din clasa întâia complexului major de histocompatibilitate.
CD4 şi CD8 sunt glicoproteine de suprafaţa exprimate exclusiv pe sub seturi de celule T
mature cu modele distincte de restricţie a complexului major de histocompatibilitate.
Proteinele exogene străine sunt internalizate în celulele accesorii unde suferă procesarea
într-un compartiment vezicular acid. Procesarea asigura ca porţiuni ale unei proteine (heptone
imunodominante) se vor lega la moleculele clasei II a complexului major de histocompatibilitate
şi vor forma complexe imunogenice.
Aceste complexe sunt exprimate pe suprafaţa celulelor accesorii, unde sunt recunoscute de
celulele T CD+4. Genele complexului major de histocompatibilitate clasa I funcţionează ca gene
ale răspunsului imun; produsele lor se leagă selectiv şi prezintă unele antigene, dar nu altele.
Antigenele ţintă pentru CD+8 CTL sunt proteine sintetizate endogen, astfel ca antigenele
virale, care sunt procesate şi asociate cu moleculele complexului major de histocompatibilitate
clasa I. Multe tipuri celulare au capacitatea de a prezenta antigenele celulelor T ajutătoare CD+4.
Reglarea expresiei genelor complexului major de histocompatibilitate clasa II reprezintă un
punct de control important pentru răspunsurile imune.
Anomaliile antigenelor de histocompatibilitate asociate unor boli ca spondilita anchilozantă.
artrita reumatoidă, hemocromatoza idiopatică, sindromul Sjogren cât şi o serie de boli autoimune
(de exemplu lupusul sistemic eritomatos, miastenia gravis, dermatita herpetiformă, diabetul
insulinodependent etc).
Celulele T limitate la un complex de histocompatibilitate exprimă clonal receptori proteici
heterodimerici (alfa,beta) legaţi prin legături disulfidice ce sunt omologi moleculelor Ig. Aceşti
receptori leagă specific antigenul procesat complexat la moleculele complexului major de
histocompatibilitate de suprafaţa celulelor (APC 1).
Rezultatul legării antigen-complex major de histocompatibilitate la celulele T este o se-
rie de evenimente intracelulare numite cu un termen comun activarea celulei T care începe cu
generarea celui de al doilea mesager şi terminarea cu dezvoltarea funcţiilor efectuare şi
proliferarea celulei T. Cele mai timpurii evenimente din această cascadă includ modificarea
fosfolipidelor membranare, activitate crescută a proteinkinazei C, creşterea concentraţiei în
calciul citoplasmatic; apoi câteva proteine sunt fosforilate. Aceşti mesageri secundari
stimulează transcripţia genelor necesare pentru răspunsurile proliferative şi efectoare ale celulei
T. Diviziunea mitotică a celulelor T are ca rezultat expansiunea clonelor de celule cu aceiaşi
specificitate antigenică şi astfel amplifică răspunsurile imune la un antigen particular. Pe
limfocitele B se găsesc markeri fenotipici şi moleculari funcţionali de suprafaţă. În plus la Ig şi
clasa II ale complexului major de histocompatibilitate (cu rol în interacţiunea celulă T-B),
limfocitele B exprimă o varietate de proteine de suprafaţă cu semnificaţie funcţională
(incluzând receptorul C3d pentru virusul Epstein Barr). Aceste proteine de pe suprafaţa celulelor
B sunt importante deoarece:
- ele pot fi de markeri fenotipici de maturitate şi ai liniei de celule B;
- ele pot funcţiona activând ori reglând celula B;
- anticorpi împotriva proteinelor de suprafaţă pot fi utilizaţi să localizeze şi să trateze
tumori derivate din limfocitele Bd) unele proteine de suprafaţă sunt receptori pentru
citokine. De exemplu, celulele B exprimă receptori de înaltă afinitate pentru câteva
citokine incluzând IL-1, IL-2, IL-4, IL-5 şi IL-6.
În general celulele B în repaos exprimă un număr scăzut de receptori pentru citokine (de
la câteva sute la 1.000 per celulă), însă exprimarea acestora este crescută pe celulele B
stimulate via Ig din membrană, cu anticorp anti-lg sau prin alţi activatori policlonali. Prin
urmare, răspunsurile anticorpului sunt iniţiate prin interacţiunea antigenului cu molecule Ig
specifice de membrană de suprafaţa limfocitelor B.

211
 Această interacţiune stimulează celulele B să intre în ciclul celular, probabil via producere
de mesageri secunzi intracelulari. În plus, antigenele proteice ale celulei T sunt procesate de către
celulele B şi prezentate în asociaţie clasa II de molecule ale complexului major de
histocompatibilitate, limfocitelor T ajutătoare. Interacţiunea limitată la complexul major de
histocompatibilitate dintre celula B şi limfocitele T ajutătoare furnizează ea însăşi semnale
activatoare celulelor B restante şi conduce la secreţia diverselor citokine de către celulele T.
Diferite citokine induc proliferarea celulelor B, secreţia anticorpilor şi alte trăsături ale
răspunsului imun umoral la antigenele proteice.
Celulele accesorii (de exemplu macrofagele) pot juca un rol important în iniţierea
răspunsului imun, prezentând antigenele celulelor T şi secretând citokine ce promovează
expansiunea şi diferenţierea ambelor feluri de limfocite, T şi B.
Principalele funcţiuni ale fagocitelor mononucleare (monocite, macrofage) în imunitatea
naturală includ următoarele:
ƒ macrofagele fagocitează particule străine (microbi, macromolecule, incluzând antigene şi
chiar ţesuturi proprii vătămate ori moarte, de exemplu eritrocite senescenţe); substanţele
fagocitate sunt degradate de enzimele lizozomale. În plus, aceste celule secretă enzime, specii
reactive de oxigen, mediatori derivaţi din lipide, ca prostagladinele, toate acestea omorând
microbii, controlând întinderea infecţiei şi pot vătăma chiar ţesuturile normale în imediata
vecinătate;
ƒ macrofagele produc citokine care recrutează alte celule inflamatorii, în special neutrofile şi
sunt responsabile pentru multe din efectele sistemice ale inflamaţiei ( febra, eritemul,
tumefierea, creşterea temperaturii locale).
ƒ Macrofagele produc de asemenea factori de creştere pentru fibroblaste şi endoteliul vascular
ce promovează repararea ţesuturilor vătămate.
Fagocitele mononucleare joacă următoarele roluri în faza cognitivă, de activare şi efectuare a
răspunsurilor imune specifice:
ƒ Macrofagele dispun antigene străine pe suprafaţa lor intr-o formă ce poate fi recunoscută de
limfocitele T antigene specifice. Ele secretă şi conţin în membrană proteine ce promovează
activarea celulei T;
ƒ în faza de efectuare a răspunsurilor imune mediate celular celulele T ajutătoare secretă
citokine ce activează macrofagele. Macrofagele astfel activate sunt mai eficiente in realizarea
funcţiilor fagocitice, degradative şi citolitice decât celulele nestimulate. În acest fel,
macrofagele figurează printre principalele celule efectuare ale imunităţi medie celular; în
faza efectuare a răspunsurilor imune umorale antigene străine, ca microbii, devin învelite sau
opsorizate de anticorpi şi proteine ale complementului.
Deoarece macrofagele exprimă receptori de suprafaţă pentru anticorpi şi anumite proteine
ale complementului, ele leagă şi fagocitează particulele opsonizate mult mai avid decât pe cele
neînvelite (neopsonizate). Astfel, macrofagele participă la eliminarea antigenelor străine prin
răspunsuri imune umorale. Capacitatea macrofagelor şi limfocitelor de a-şi stimula unele
altora funcţiile dovedesc un mecanism de amplificare importantă pentru imunitatea specifică. În
plus, la limfocite şi fagocitele mononucleare, alte leucocite şi granulocite participă în faza
efectuare a răspunsurilor imune specifice.
Granulocitele, numite şi celule inflamatorii, deoarece joacă roluri importante în
inflamaţie şi imunitatea naturală, au şi funcţia de a elimina microbi şi celulele moarte. Ele sunt
stimulate ca şi macrofagele, de citokinele derivate din celula T şi fagocitează particule
opsonizate.
Neutrofilele răspund rapid la stimuli chemotactici putând fi iniţial activate de citokinele
produse de macrofage. Ele posedă receptori pentru porţiunea Fc a anticorpilor şi pentru
proteinele complementului, migrând şi acumulându-se la locuri de activare a complementului.
Ele fagocitează particule opsorizate şi funcţionează ca celule efectuare ale imunităţi umorale.
Eozinofilele exprima receptori Fc pentru o clasă de anticorpi IgE, fiind efectori importanţi in
reacţiile imune la antigenii ce induc nivelele ridicate de IgE, astfel ca paraziţi, ele distrug

212
helminţi ce rezistă deseori enzimelor lizozomale ale neutrofilelor şi macrofagelor. Eozinofilele
sunt numeroase la locurile reacţiilor de hipersensibilitate imediată,in alergie, datorate producerii
de anticorpi IgE.
Eozinofilele sunt activate şi de alţi anticorpi ca formula secretată AigA. Creşterea şi
diferenţierea eozinofilelor sunt stimulate de o citokină derivată din celula T helper numită
interleukina-5, astfel încât activarea celulei T herper poate contribui la acumularea eozinofilelor
la locurile cu reacţii de infestare parazită şi alergice.
Bazofilele şi mastocitele exprimă receptori de înaltă afinitate pentru IgE şi leagă astfel
anticorpi IgE. Interacţiunea antigenelor cu aceste molecule IgE stimulează bazofilele şi
mastocitele de a excreta conţinutul granulelor lor, care sunt mediatori chimici ai hipersensibilităţi
imediate. Astfel, aceste granulocite sunt celule efectuare ale hipersensibilităţi imediate datorită
IgE.
Prin urmare, citokinele servesc multor funcţiuni ce sunt critice în apărarea împotriva
agenţilor patogeni şi furnizează legături între imunitate specifică şi naturală.
Este ştiut că interferonii, de exemplu, au acţiunea antivirală, antiproliferativă şi imuno
modulatoare.
Citokinele reglează de asemenea amplitudinea şi natura răspunsurilor imune prin
influenţarea creşterii şi diferenţierii limfocitelor.
În sfârşit, citokinele asigură mecanisme de amplificare importante ce fac capabile
limfocitele în număr scăzut, specifice pentru oricare antigen, să activeze o varietate de
mecanisme efectuare pentru a elimina antigenul. Pe de altă parte, când rezultă un defect în unul
din efectorii sistemului imun (limfocitele T şi B, fagocite, proteinele complementului) se
vorbeşte de imunocompromis. De asemenea, producţia excesivă ori acţiunile citokinelor pot
conduce la distrucţie tisulară şi chiar moarte.
Imunopatia instalată în anumite cazuri poate conduce deci la cronicizare ori moarte.
Administrarea citokinelor sau a inhibitorilor lor constituie o abordare potenţială pentru
modificarea răspunsurilor biologice asociate cu boală. De pildă efectele antitumorale ale
interleukinei-1 pot fi înregistrate prin 3 mecanisme:
ƒ direct citolitic;
ƒ activarea celulelor imune;
ƒ inducţia linfokinelor antitumorale sau facilitarea efectelor lor.

10.5. Baza umorală a răspunsului imun

Este mediată de celulele B, producătoare de Ig.

S-a stabilit că limfocitele sunt celule care iniţiază răspunsul imunitar specific şi care
posedă memorie imunitară. Unele dintre ele sunt responsabile cu recunoaşterea, iar altele cu
efectuarea acţiunii. Limfocitele efectoare sunt de două tipuri: celule B şi celule T.
Cum s-a spus anterior, celulele B produc anticorpi, responsabili cu neutralizarea,
opsonizarea sau dizolvarea antigenilor. Celulete T pot fi la rândul lor împărţite în trei
categorii, în funcţe de natura lor, astfel:
- celule T ajutătoare – actionează pentru pregătirea terenului de acţiune a celulelor T
efectoare şi supresoare şi a celulelor B;
- celulele T efectoare – distrug antigenii sau determină inflamarea ca răspuns la acţiunea
antigenului;
- celuleT supresoare – suspendă, atunci când acest lucru este necesar, acţiunea celulelor T
ajutătoare, deci implicit, acţiunea celulelor T efectoare şi a celulelor B.

213
 10.5.1. Prezentarea antigenilor

Primul stadiu al răspunsului imun la acţiunea oricărui tip de antigen implică

modificarea antigenului de către macrofagi. Acesta nu este un proces specific. Macrofagele
au rol în concentrarea şi prezentarea unor antigene, în prelucrarea antigenelor, în reglarea
tipului de răspuns şi amploarea răspunsului imunitar. Antigenul purtat de către macrofag
este apoi „prezentat" limfocitelor care sunt predeterminate să reacţioneze la antigen. Din
cauza tipului de acţiune desfăşurat de către macrofagi, acestea sunt denumite celule de
prezentare (sau auxiliare).
Procesul ce are loc la nivelul celulelor macrofage este o parte esenţială a procesului
de generare a răspunsului imun care implică celulele T. Calitatea răspunsului este
îmbunătăţit de prezenţa celulelor macrofage datorită, probabil, producerii de factori
solubilizanţi, inclusiv interleukine 1.

10.5.2. Producerea de anticorpi

Producerea de anticorpi implică cel puţin patru tipuri de celule:

- celulele macrofage ─care acţionează ca celule de prezentare
- celule B;
- două tipuri ce celule T, ajutătoare şi supresoare.

Celulele B
Anticorpii sunt produşi de către celulele B, care pot fi uşor recunoscute datorită
prezenţei pe suprafaţa lor a imunoglobulinelor. O astfel de celulă pare capabilă să producă
mai multe tipuri de imunoglobuline, pe măsură ce se maturizează. Astfel, de la producerea
de IgM, poate trece la producerea de IgM şi IgD pentru ca în final să producă IgG, IgA şi
IgE. Tipul final de imunoglobulinăde la suprafaţă pare să prezinte natura anticorpului
produs de celulă. Această secvenţă de maturare se potriveşte cu cinetica răspunsului,
răspunsul primar fiind preponderent IgM, iar cel secundar preponderant IgG (fig. 132).

Fig. 132 - Ciclul de dezvoltare

al celulelor B; C - lanţ
citoplasmatic; S - lanţ de
suprafaţă.

O parte din celulele B răspund

direct la antigenii numiţi antigeni T-
independenţi. Ele au determinanţi
antigenici şi repetabili şi determină
un răspuns cu IgM, nu cu IgG, IgA
sau IgE.
Asemenea substanţe pot
provoca proliferarea nespecifică a
celulelor B de memorie (celule
produse care prezintă aceleaşi
imunoglobuline la suprafaţă), de
accea sunt cunoscute sub denumirea de celule B policlonale mitogene. Pentru aceste acţiuni
nespecifice pot fi responsabili şi alţi determinanţi, alţii decât epitopi.

214
 Majoritatea celulelor B însă nu răspund direct în majoritatea antigenilor chiar când
aceştia sunt prezentaţi de celulele ajutătoare adecvate. Este nevoie de încă un semnal de
activare pentru stimularea acestor celule B. Deoarece semnalele sunt în mod normal generate
de celulele T, antigenii sunt denumiţi antigeni T-dependenţi.
Adăugarea celulelor T determină un răspuns, chiar dacă celulele T singure nu sunt
capabile să determine anticorpi. Celulele T sunt de aceea denumite ajutătoare.

Celulele T ajutătoare
Acţiunea celulelor T este specifică antigenului. Doar celulele ajutătoare T care au
răspuns la antigenul prezentat de către celulele macrofage poate în continuare să ajute celulele
B.
Celulele ajutătoare T recunosc la celulele de prezentare antigenul şi antigenul HLA de
clasa II ca un complex. Ele recunosc apoi aceeaşi combinaţie de antigen şi antigen de clasa II
specific celulei B corespunzătoare.
Chiar dacă celulele T sunt separate de celulele B printr-o membrană, ele pot încă să
stimuleze un răspuns la celulele B, sugerând faptul că factorul solubilizant eliberat de celulele
T mediază efectul de ajutorare a celuleor B.
Antigenii de clasa II joacă un rol important în activitatea celulelor ajutătoare T. Celulele
T de la un individ nu pot coopera cu celulele macrofage şi celulele B de la altul.
Când o celulă ajutătoare T întâlneşte un antigen pentru prima dată, ea ajută pe de o parte
celulele B, iar pe de altă parte declanşează un proces de transformare şi proliferare care are ca
efect o creştere a numărului de celele ajutătoare T specifice, disponibile atunci când individul
va fi din nou supus acţiunii antigenului. Răspunsul imunitar la o expunere ulterioară va fi mai
rapid şi mult mai viguros.
Celulele T au glicoproteine de suprafaţă specifice care acţionează ca marcatori care le
diferenţiază. Ele pot fi recunoscute de anticorpii monoclonali. Unele din aceste glicoproteine
se găsesc doar la celulele T.
Recunoaşterea antigenului implică mai mulţi receptori la suprafaţa celulelor T
ajutătoare. Celule B, care recunosc antigenul prin imunoglobulinele de suprafaţă, văd acelaşi
epitop diferenţiat. De exemplu, haptenele pot fi recunoscute ca antigeni de celulele T doar cu-
plate cu un purtător, iar haptenele libere pot reacţiona cu anticorpii.

Celulele T supresoare
Efectele celulelor T ajutătoare sunt contrabalansate de celulele T supresoare. Acestea
au pe suprafaţă o glicoproteină specifică CDS, iar funcţia lor nu este în totalitate cunoscute.
Ele par să fie capabile să lege direct antigenul, fără a necesita şi acţiunea celulelor de
prezentare, acţionând mai degrabă asupra celulelor ajutătoare T dect asupra celulelor B. Ca şi
celulele T ajutătoare, celulele supresoare T sunt specifice unui anumit antigen.
Acţiunea celulelor T supresoare poate fi accentuată de anumite acţiuni de imunizare; de
exemplu, la animalele de experiment injectarea repetată a unor doze relativ mari de antigen
poate duce la toleranţă în care nu este produs nici un anticorp specific ca răspuns la acţiunea
antigenului, pe când capacitatea de răspuns la alţi antigeni rămâne nemodificată.

10.6. Răspunsul imunitar mediat de celule

Răspunsul specific antigenului mediat este generat de celule limfocitare T. Celulele T

pot să:
- dezintegreze antigenii specifici: citotoxicitate;
- elibereze substanţe solubile biologic active (limfokine) care stimulează inflamarea:
hipersensibilitate întârziată.

215
Aceste două tipuri de răspunsuri ale celulelor T sunt mediate de populaţii specifice:
- citotoxicitatea este determinată de celulele citotoxice T;
- hipersensibilitatea întârziată este determinată de celalele T de hipersensibilitate întârziată.

Celulele citotoxice T
Celulele citotoxice T dizolvă celulele infectate cu virusuri. Această citotoxicitate este
dependentă de virus şi doar celulele care prezintă proteine virale relevante la suprafaţa lor sunt
distruse. De vreme ce pe suprafaţa celulelor infectate apar proteinele specifice virusului
înainte de producerea altor virusuri, celulele citotoxice T sunt foarte importante în faza de
refacere, distrugând celulele infectate înainte de producerea altor particule virale.
În comparaţie cu celulele T ajutătoare, celulele citotoxice T recunosc antigenii virali
împreună cu antigenii HLA de clasa I. Ele prezintă specificitate pentru antigenii HLA, putând
distruge doar celulele care prezintă acelaşi antigen HLA clasa I.
Inducerea celulelor citotoxice T necesită celule precursoare şi interleukine – 2 de la
celulele T ajutătoare. Inducerea este declanşată de antigenii de clasa I şi este reglată de
celulele T supresoare. Celulele citotoxice T sunt implicate în rejecţia grefelor.

Celulele T de hipersensibilitate întârziată

Reacţia de tip hipersensibilitate întârziată este cunoscută de foarte mult timp. Reacţiile
determinate de vaccinuri sunt de acelaşi tip. De exemplu, reacţia la injecţia intradermală cu
tuberculină în cazul testului Hantoux este o reacţie de acest tip.
În contact cu antigenii străini, celulele T de hipersensibilitate întârziată eliberează
limfokine care mediază un răspuns imflamatoriu. Limfokinele sunt substanţe solubile capabite
să influenţeze cinetica altor celule inflamatoare. Sunt atrase la locul unde are loc reacţia de
hipersensibilitate întârziatăcelule macrofage, neutrofile şi alte limfocite; celulele sunt apoi
imobilizate şi este declanşată inflamarea. Macrofagii pot fi de asemenea activaţi de linokine
să distrugă paraziţii intracelulari ca microbacteriile.
Limfokinele includ interferon, care este bine cunoscut pentru efectul său antiviral
direct, dar care activează de asemenea un tip de celule ucigaşe naturale NK (Natural Killer).

10.7. Interacţiuni celulare în răspunsul imun

Mecanismele de declanşare şi control ale reacţiilor imune sunt complexe şi antrenează o

cascadă de reacţii de stimulare sau inhibiţie între diversele populaţii celulare şi speciile
moleculare. În linii mari, succesiunea evenimentelor care au loc după pătrunderea antigenului în
organism este următoarea: în câteva minute, antigenul este captat de către macrofage şi degradat
în fagolizozomi în material neantigenic şi în componente înalt imunogene. Fracţiunile
imunogene sunt proiectate pe membrane macrofagului, care le transportă la nivelul organelor
limfoide secundare. Prin receptorii pentru antigen, limfocitele primesc informaţii referitoare la
structura imunogenului, acestea sunt traduse şi transmise AND-ului care la rândul său v-a ordona
diviziunea celulară. Clona respectivă începe să se multiplice activ, să elaboreze limfokine care
vor acţiona asupra macrofagelor, a unor limfocite încă nesensibilizate şi asupra altor celule
accesorii. Macrofagele la rândul lor, eliberează monokine, amplificând şi mai mult reacţiile.
Celulele efectuare de la nivelul organelor limfoide formează foliculi şi centri germinativi unde îşi
vor exercita activitatea distructivă, acţionând asupra antigenului fie direct, prin reacţii de
citotoxicitate , fie indirect prin secreţie de imunoglobuline cu funcţii de anticorp.
Deoarece limfocitele cu receptori pentru antigenul în cauză părăsesc circulaţia şi se
localizează în organele limfoide, în primele momente ale stimulului antigenic proporţia lor in
sângele periferic scade considerabil.
Când limfocitele B sunt stimulate antigenic ele se divid prin mitoze repetate, dând naştere
la clone celulare B. Din acestea unele imunoblaste se diferenţiază în plasmocite - celule
secretoare de imunoglobuline.

216
 Alte imunoblaste se reîntorc la forma de limfocit circulant, devenind celule B cu memorie.
Acestea reţin în memoria lor (în acizii nucleici) primul contact cu antigenul. Anticorpii
sintetizaţi sunt exocitaţi şi depuşi fie la suprafaţa membranei celulare, fie trecuţi în sânge,
declanşându-se imunitatea umorală rapidă. După 24-48 de ore, datorită proliferării clonale
active, celulele de memorie încep să revină în circulaţie, unde patrulează un timp îndelungat,
pregătite să facă faţă unui nou atac.
Celulele efectuare rămân la nivelul centrilor germinativi unde continuă prolifelarea şi
secreţia de limfokine sau monokine, organul limfoid fiind astfel crescut în volum tumefiat şi
edemaţiat. Durata scurtă de viaţă a celulelor efectuare reprezintă un mijloc eficient de stingere a
reacţiilor imune.
După ce complexele antigen-anticorp uşor fagocitabile sunt eliminate din organism,
celulele efectuare mor, rămânând de veghe numai celulele de memorie, cu viaţă lungă, care
asigură supravegherea imunologică.
Spre deosebire de limfocitele diversificate clonal, macrofagul captează antigenul
nespecific, aceiaşi celulă putând fagocita diferite molecule indiferent de structura lor.
Antigenul formând complexe cu anticorpii, complexele se vor ataşa la FcR (receptorul Fc
– fragment cristalizat), a macrofagului (opsonizare), funcţiile fagocitare fiind mult activate.
Legarea prin porţiune Fc a complexelor antigen-anticorp la FcR a macrofagului, induce şi
formarea unor compuşi chimici simpli, care ar stimula la rândul lor sinteza şi exprimarea pe
membrana macrofagului a antigenelor I (asociate regiunii I din MHC – major histocompatibility
complex class I). Fc este un receptor membranar care leagă Ig. Este un dimer constituit din două
jumătăţi C-terminale ale lanţurilor H (grele) de Ig. Receptorii Fc sunt glicopreteine rezistente la
tripsină, nu şi la pronază.
Interacţiunea celulară ar interesa succesiv câte două tipuri de celule legate prin punţi
formate de către antigen: macrofag şi limfocit TH ( helper) şi ulterior limfocit TH şi limfocit B.
În unele situaţii, celula care reprezintă antigenul limfocitului T poate fi limfocitul B şi nu
macrofagul. În această interacţiune guvernează aceleaşi restricţii genetice ca acele implicate în
interacţiunea limfocite T - macrofag, în care macrofagul prezintă antigenul "prelucrat"
limfocitelor T şi eventual cel "neprelucrat" limfocitelor B.
Prezentarea antigenului de către macrofag atât celulelor T, cât şi celulelor B, poate fi
importantă în reacţiile imune faţă de antigene cu moleculă mare, care trebuie "sfărâmate",
operaţie de care sunt capabile numai celulele cu funcţii fagocitare.
Interacţiunea s-ar putea instala şi simultan, între toate 3 tipuri celulare (macrofag, celule T
şi B) după cum cooperează s-ar putea realiza fără contact intercelular, prin mediatori eliberaţi de
limfocitul helper sau ajutător (TH) care ar activa macrofagul sau direct celula B.
De asemenea, cooperarea celulară se instalează atunci când limfocitele sunt expuse
stimulilor mitogenici şi nu numai celor antigenici. În declanşarea şi controlul răspunsului imun
intervin numeroşi factori a căror apariţie şi dispariţie din scenă este ordonată de multiple
semnale şi circuite de reglare şi control.
De exemplu, o populaţie de celule T ajutătoare (TH) activează multiplicarea şi
transformarea unei clone de precursori B spre plasmocite secretoare de imunoglobina dar prin
alte canale semnalizează şi celule T supresoare (TS) care vor controla atât proliferarea
precursorilor B cât şi cea a limfocitelor TH. Astfel se asigură un permanent control homeostatic
care menţine cadrul normal al reacţiilor imune.

10.7.1. Unele mecanisme de apărare imună în infecţiile bacteriene

În general, sunt folosite predominant mecanismele imunităţii mediate umoral împotriva

speciilor care trăiesc în afara celulei şi cele alte imunităţii mediate celular contra celor adaptate
la viaţa intercelulară, fără a fi însă graniţe rigide între cele două tipuri de reacţii imune. De
asemenea poate interveni şi citotoxicitate anticorpodependentă (ADCC), adică mijloace de
apărare celulară condiţionate insă de prezenţa anticorpilor specifici.

217
 10.7.1.1. Mijloace de apărare imună mediate umoral
Sunt cunoscute in infecţiile bacteriene:
a. imobilizarea germenilor ciliaţi sau flagelaţi;
b. inhibiţia aderenţei;
c. bacterioliza dependentă de anticorpi;
d. neutralizarea toxinelor bacteriene;
e. opsonizarea.
Imobilizarea germenilor ciliaţi sau flagelaţi poate fi realizată practic de către toate clasele
imunoglobuline şi se dovedeşte eficientă în frânarea virulenţei unor germeni gram negative
(Salmonella, Proteus, E.coli, etc). Inhibiţia aderenţei la seroase sau mucoase se realizează de
asemenea, graţie anticorpilor (în special cei din clasa IgA), care interferând cu adezinele, inhibă
aderarea şi, în consecinţă, multiplicarea bacteriei.
Bacterioliza dependentă de complement, ca şi în cazul hemolizei prin complementare loc
ca urmare a activării complementului de către anticorpii care s-au fixat pe bacterie, mai
susceptibile la liză fiind formele SD, ale germenilor gram-negativi (cei gram-pozitivi sunt
practice rezistenţi).
Acest mijloc de apărare antimicrobiană nu este important deoarece subiecţii cu deficienţe
congenitale în componentele complementului nu sunt mai semnificativ expuşi la infecţii în
comparaţie cu cei normali. In schimb, neutralizarea toxinelor bacteriene (realizată aproape
exclusive de către anticorpii din clasa IgG) este un mijloc important de apărare (în special în
cazul germenilor din genurile Clostridium, Staphylococcus etc. care secretă exotoxine).
In ceea ce priveşte opsonizarea, se ştie că bacteriile au o serie de factori care le protejează
de acţiunea fagocitară a macrofagelor. Este cazul capsulei proteinei M la Streptococcus,
microvililor, polizaharizilor capsulari, proprietăţilor hidrofile ale peretelui celulei bacteriene, etc.
Împotriva acestor factori antifagocitari, granulocitele şi macrofagele au receptori membranar
pentru fragmentul Fc sau pentru fracţiuni ale complementului prin intermediul cărora bacteria
este "prinsă" pe căi indirecte.
"Activarea" fagocitozei sau "opsonizarea" este mediată prin anticorpi din clasa IgG, prin
factorii C3 sau C4 ai complementului, ori în absenţa anticorpilor specifici. De exemplu, pentru a
conferi condiţii favorabile opsonizării S. typhimurium, trebuie să fixeze cca 8.000 molecule de
IgG pe suprafaţa bacteriei. În cazul complexelor antigen + anticorp, fragmentul FC este fixat la
FCR şi bacteria este fagocitată.
În cazul complementelor C3 sau C4, are loc ataşarea la receptorul pentru complement, dar
nu şi fagocitoza, bacteria fiind "reţinută" la peretele celulei.
Prin urmare, mecanismele opsonizării includ legarea complexului bacterie-anticorp prin
receptorul pentru FC (FCR) sau legarea complexului bacterie-anticorp prin receptorul
complement (CR), iar în absenţa anticorpilor specifici opsonizarea se realizează fie prin
activarea complementului pe cale alternativă, fie prin agregate de molecule de imunoglobulină
fără funcţii specifice pentru bacteria respectivă.

10.7.1.2. Mijloace de apărare imună mediată celular

Unele bacterii (M .tuberculosis, Toxoplasma etc.), chiar dacă sunt fagocitate de către
macrofagele opsonizate, nu sunt atacate de enzimele lizozomale, fiind inhibată fuziunea
lizozomilor cu fagozomii. Nefiind distruse, bacteriile pot persista timp îndelungat în fagozomi
sau distrug fagozomi, şi ajung în citoplasmă.
Astfel simpla opsonizare este total ineficientă deoarece, după fagocitare, este omorâtă de
regulă, celula fagocitată şi nu bacteria.
Prin mecanisme mediate celular, macrofagele, sunt activate de limfokine eliberate în
special din limfocite T, dobândesc proprietăţi citotoxice şi bactericide şi proliferează la locul
infecţiei sau inflamaţiei. La rândul lor, macrofagele activează funcţiile citotoxice ale limfocitelor
T care apoi distruge eficient celulele infectate bacterian (sau viral). Bacteriile sau celulele
infectate cu bacterii pot fi lizate spontan, natural şi de celule nativ-ucigaşe (NK).

218
10.8. Reglarea imunologică

Reglarea imunologica este de foarte mare importanţă mai ales în cazul maladiilor
umane, deoarece orice dezordine poate cauza o boală autoimună sau o boală de
imunodeficienţi.

10.8.1. Reglarea normală

Factorii care reglează un răspuns imun normal sunt multiplii, dar ei includ
disponibilitatea antigenilor şi influenţa anticorpilor anti-idiotip.

Disponibititatea antigenitor
Răspunsul imun este declanşat în mod natural de antigeni. Concentraţia de antigeni va
scădea în urma metabolizării sau îndepărtării acestora, ca urmare a proceselor imune care au
loc. Stimulul de bază, pentru răspunsul imun devine deci mai slab, declanşând doar clonele
care au receptori cu mare afinitate.
Rata în care antigenii declanşeză celulele B este probabil un factor important în
limitarea producerii de anticorpi.

Anticorpi anti-idiotip
Structura zonei de legătură a antigenului este unică pentru fiecare anticorp şi poartă
numele de idiotip. Sunt produşi anumiţi anticorpi anti-idiotip în cadrul unui răspuns imun
normal; asemenea anticorpi sunt, prin definiţie, autoanticorpi. Se pare că asemenea anticorpi
anti-idiotip sunt implicaţi în cazul reglării unui răspuns imun normal.

10.8.2. Reglarea alterată

Factorii care reglează răspunsul imun pot fi manipulaţi experimental. Ajustarea

adecvată a dozei şi a ratei de expunere la un anumit antigen, poate împiedica apariţia unui
răspuns imun. Această stare de absenţă a răspunsului este cunoscută sub numele de toleranţă.
Mecanismele implicate includ activarea celulelor T supresoare şi eliminarea celulelor
ajutatoare T şi a celulelor B corespunzătoare.
Există bineînţeles, toleranţa naturală la antigenii proprii. Este esenţial ca un sistem
imunitar să nu reacţioneze cu celulele gazdă. Inexistenţa auto-toleranţei duce la apariţia
bolilor autoimune.

10.9. Intensificarea răspunsului imun

Rolul răspunsului imun este distrugerea antigenilor străini, indiferent dacă aceştia sunt
molecule inerte sau organisme. Întepărtarea atigenilor este influenţată de mai mulţi factori
printre care:
- concentraţia de antigeni;
- zona de pătrundere a antigenului;
- disponitilitatea anticorpilor;
- viteza răspunsului imun.
Anumiţi factori nespecifici pot creşte efectele anticorpilor. Principalii factori sunt:
- celulele fagocitare (macrofagii şi leucocitele poliformonucleare care indepărtează
antigenii).
- sistemul complementar care poate fi să distrugă un organism, fie să faciliteze, fagocitarea
sa.

219
 10.9.1. Sistemul complement

Sistemul complementar constă dintr-o serie de proteine activate pe rând. Componentele

există în mod normal ca şi precursori inactivi, dar o dată activată, o componentă
complementară poate acţiona ca o enzimă care scindează mai multe molecule ale următoarei
componente din secvenţă. Fiecare precursor este scindat în două sau mai multe fragmente, ca
în figura 133.

Fig. 133 - Scindarea unei

molecule precursoare sub acţiunea
unei componenete complementare

Fragmentul principal are două

zone active biologic:
- o zonă pentru legarea de membrană
celulară;
- o zonă pentru scindarea enzimatică a
componentei complementare
următoare.
Fragmentele minore generate prin
scindare au proprietăţi biologice deosebit
de importante în faza fluidă, cum ar fi,
de exemplu, activarea chemotactică.
Rolul major al căii complementare este furnizarea unei posibilităţi de înlăturare şi
distrugere a antigenului, indiferent dacă acesta devine sau nu învelit cu anticorpul.
Funcţia de bază a sistemului complementar este probabil opsonizarea
microorganismelor şi complexelor imune; microorganismele învelite (opsonizate) cu
imunoglobuline şi/sau complement sunt mult mai uşor recunoscute de macrofagi şi mult mai
repede fagocitate.
Fragmentele minore sunt generate la aproximativ fiecare etapă în cascadă şi contribuie
la generarea răspunsului inflamator. Unele dintre ele cresc permeabilitatea vasculară, în timp
ce altele atrag neutrofilele şi macrofagele pentru fazele următoare de opsonizare şi fagocitare.

10. 9.2. Alte categorii celulare implicate în imunitate

Macrofagele
Macrofagele sunt celule echivalente cu monocitele şi împreună cu monocitele,
reprezintă sistemul mononuclear responsabil cu fagocitoza. Limfocitele şi mcrofagele provin
din trunchiuri înrudite de celule din măduva spinării.
Monocitele circulă doar câteva ore înainte de a intra în ţesuturi, unde trăiesc pentru
câteva săptămâni sau luni, devenind nediferenţiabile de macrofagi. Ţesuturile macrofage sunt
eterogene în aspect, metabolism şi probabil în funcţie.
O funcţie majoră sistemului de fagocite mononucleare este fagocitoza organismclor care
invadează organismul gazdei şi a altor antigeni. Macrofagii au în interior nişte granule care
conţin diferite enzime degradate cu care distrug materialul fagocitat. Materialul distrus poate
fi un organism viabil, celule moarte, un antigen sau un complex imun. Pentru a-şi putea
îndeplini funcţia, macrofagii trebuie sa fie activaţi în această stare, ei prezintă o potenţialitate
distrugătoare crescută. Macrofagii sunt de asemenea importanţi pentru prezentarea antigenilor
altor celule ale sistemului imunitar, aşa cum a fost prezentat anterior.

220
 Leucocite neutrofile polimorfonucleare
Neutrofilele joacă un rol foarte important în apărarea organismului în cazul infecţiilor
acute. Ele pot adera sau pot migra din vasele de sînge în ţesuturi. Această migrare apare ca
efect a acţiunii agenţilor chemotactici produşi la locul inflamaţiei. Neutrofilele sunt celule
fagocitare. Din punct de vedere morfo-fiziologic, procesul de fagocitare este similar atât
neutrofilelor cât şi fagocitelor mononucleare. Neutrofilele, în plus, sunt, capabile să degradeze
substanţele pe care le digeră. Realizarea acestei degradări necesită o cantitate considerabilă de
energie, un consum marit şi o producţie crescută de superoxid.

Celule ucigaşe (killer)

Celulele ucigase sunt celuule non- fagocitare mononucleare cu morfologie limfoidă,
responsabilă pentru citotoxicitatea dependentă de anticorp. Ele sunt capabile să recunoască
celulele care au reacţionat sub acţiunea IgG şi le distrug, printr-un mecanism încă necunoscut.
Ele nu pot distruge celule în absenţa anticorpului.

Celule ucigaşe naturale (natural killer)

Celulele ucigaşe naturale ( NK ) arată că limfocitele granulare mari pot distruge celule .
În absenţa anticorpului sau stimulării antigenice şi sunt diferite de celulele ucigaşe prezentate
anterior. Ele pot fi activate nespecific de agenţi mitogeni sau interferon şi deci pot fi recrutate
de orice celulă T. De menţionat că celule ucigaşe naturale nu sunt celule ale sistemului
imunitar în sens strict ca macrofagii de exemplu, şi nu au memorie imunitară. Aria lor
potenţială în acţiune este foarte mare. Organismele care au un deficit de celule ucigaşe
naturale au o incidenţă , mai mare a tumorilor. Aceste celule sunt considerate foarte
importante pentru supravegherea apărării organismului împotriva tumorilor.

10.10. Finalitatea răspunsurilor imune

O dată ce sistemul imun a fost iniţiat, rezultatul final al acţiunii sale depinde de natura şi
localizarea antigenului, indiferent dacă răspunsul predominant a fost de natură umorală sau
mediat de celule.

10.10.1. Funcţia directă a anticorpilor

Neutralizarea este unul din efectele directe ale anticorpilor, iar IgG este în mod special
remarcabil pentru aceasta. Un mare număr de antigeni, inclusiv toxina tetanusului, difteriei şi
mulţi viruşi, pot fi neutralizaţi de anticorpi.
O dată neutralizate, aceste substanţe nu se mai pot lega de ţesuturile receptoare;
complexul autigen-anticorp rezultat este în general îndepăttat din circulaţie şi distrus de
macrofagi. Desi rolul anticorpilor IgE nu este îincă cunoscut, ei par să fie implicaţi în
expulzarea paraziţilor din tractul gastrointestinal.

10.10.2. Funcţia indirectă a anticorpilor

Opsonizarea este procesul prin care un antigen devine învelit cu substanţe care îl face să
fie mai uşor distrus de celulele fagocitare ( fig. 134).

221
 Fig. 134 - Relaţia dintre opsonizare şi fagocitare.

10.10.3. Uciderea celulelor ţintă

Celulele ţintă ucise ca urmare a unui răspuns imun includ organismele şi celule care
conţin antigeni virali sau tumorali specifici la suprafaţă. Aceste celule ţintă pot fi distruse de
mecanisme specifice.

10.10.4. Procesul inflamator

Inflamarea este definit ca o creştere a permeabilităţii vasculare însoţită de infiltrarea

celulelor „inflamatoare”. Creşterea permeabilităţii vasculare este determinată de un număr de
agenţi specifici, printre care fragmente de complement.

10.10.5. Controlul prin reacţie inversă

O etapă importantă a răspunsului imun este declanşarea unui mecanism de autocontrol
(feed-back), mecanism care împiedică eventualele reacţii de autodistrugere a organismului.

10.11. Genetica sistemului imunitar

După cum a fost menţionat anterior, fiecare moleculă de imunoglobulină este de fapt o
proteină compusă din două lanţuri uşoare (L) identice şi două lanţuri grele (H) identice, care
sunt legate prin punţi.
Există doua tipuri de lanţuri uşoare:
- lanţ uşor de tip Kappa;
- lanţ uşor de tip Lambda.
Lanţurile uşoare sunt identice la toate clasele de imunoglobuline dar fiecare clasă are un lanţ
greu caracteristic, după cum este prezentat în tabelul urmator:

Clasele Greutatea moleculară Lanţ greu Lanţ uşor

Ig G 150000 γ k/γ
Ig M 900000 µ k/γ
Ig A 160000 α k/γ
Ig D 185000 ρ k/γ
Ig E 200000 ε k/γ

222
 Fiecare lanţ al imunoglobulinei conţine trei regiuni:
- regiunea variabilă (V);
- regiunea de joncţiune (J);
- regiunea constantă (C).
În lanţurile grele există o regiune diversificată (D), aflată între regiunile variabile şi cea
de joncţiune.
Gena responsabilă cu crearea lanţului uşor Kappa se găseşte pe braţul scurt al
cromozomului 2, în timp ce gena pentru lanţul uşor Lambda este pe cromozomul 22. Locusul
pentru gena lanţului greu este pe cromozomul 14. Fiecare din aceste gene este în realitate o
genă cluster (ciorchine).
Gena cluster pentru lanţul greu conţine: aproximativ 200 de gene variabile; circa 50 de
gene diverse; 6 gene de joncţiune ş una sau mai multe gene pentru regiunea constantă a
fiecărei clase de imunoglobuline.
În fiecare celulă plasmatică, printr-un proces de recombinare somatică o genă V, o genă
D, o genă J şi o genă C sunt alaturate şi transcrise într-o moleculă unică continuă a ARN-ului
mesager. Restul de ADN al mănunchiului este excizat şi constituie marcatori pentru
limfocitele de origine ale celulelor B.
Se poate produce orice combinaţie, acestea ducînd la mai mult de 12000 de combinaţii
posibile. Suplimentar, se pot însera extranucleotide la nivelul joncţiunii şi aceste gene sunt
predispuse să sufere mutaţii somatice după ce au fost obţinute, ceea ce are ca rezultat o mai
mare diverisificare.
Deşi combinaţia VDJ de obicei rămîne constantă pentru celulele plasmatice şi toţi
descendenţii lor, este posibilă o schimbare a genelor constante, de exemplu pentru IgM spre
IgG, dar specificitatea antigenică rămîne neschimbată.
Aceasta este realizată iniţial de diferitele fragmente ale ARN-ului lipite şi
secvenţializate, cu ajutorul ADN-t recombinat.
Receptorul celulelor B este anticorp (de ebicei de tip IgM) şi astfel, o celulă plasmatică
care răspunde la diferiţi antigeni poate să exprime o combinaţie VDJC diferită.
Genele cluster pentru lanţurile uşoare Kappa şi Lambda au o structură similară cu
aproximativ 200 de gene variabile şi 4 gene de joncţiune, dar în schimb au o genăconstantă şi
nu au gene diferite.
Fiecare celulă plasmatică produce lanţul uşor VJC într-o singură combinaţie şi produce
fie lanţul Kappa, fie lanţul Lambda, dar nu amîndouă.
Această abilitate a fiecărei gene cluster de a produce diferite polipeptide este o excepţie
importantă a regulii: o genă - o polipeptidă.
Receptorul celulelor T este foarte asemănător ca structură cu imunoglobulina şi constă
din doua lanţuri: un lanţ alfa şi un lanţ beta. Aceste lanţuri sunt legate între ele prin punţi
bisulfurice.
Gena cluster pentru lanţul alfa al receptorului T este pe cromozomul 14, iar gena cluster
pentru lanţul beta este pe cromozomul T. Fiecare are o structură analoagă cu gena cluster
pentru lanţtul usor al imunoglobulinei, iar amîndouă suferă o recombinare somatică pentru
celulele T cu specificitaţii diferite.

10.11.1. Imunodeficienţa dobîndită

Imunodeficienţa dobîndită poate apare în fiecare sau în amîndouă componentele

răspunsului imun. Simptomele şi semnele acesteia depind de mecanismele de apărare rămase
intacte, dar în general includ invaziile timpurii susceptibile faţă de infecţii.

223
 Aşa cum sunt conturate tabelul de mai jos, aceste condiţii de apariţie arată o
eterogenitate genetică.

Boală Moduri de moştenire

Combinaţii imunodeficienţe severe AR, XR
Agammaglobulinemia XR, AR
Sindromul Wiskott-Aldrich XR
Boli granulomatice cronice XR,AR
Sindromul Chediak-Higashi AR
Sindromul DiGeorge deleţie cromozomială
Deficienţă Properdin XR
Sindromul Limfoproliferativ XR

Imunodeficienţa moştenită este cauzată în 50% din cazuri de defectele anticopilor, în

400% din cazuri ca urmare a defectelor de imunitate celulară, iar în 60/o din cazuri depinde
de defectele sistemului complementar.
Cele mai previzibile defecte sunt deficienţele IgA-lor (1/570), iar mulţi din aceşti
pacienţi sunt asimptomatici cu o frecvenţă de 1/1000 de combinaţii în cazul unor deficienţe
ale sistemului fagocitar şi o frecvenţă de 1/70000 pentru combinaţii imunodeficiente severe.

10.11.2. Grupele sanguine

Grupe sanguine sunt determinate de proteinele de suprafaţă ale antigenilor de pe

celulele roşii. Până acum au fost descrise aproximativ 400 de grupse sanguine, iar dintre
acestea cel mai bine cunoscute sunt ABO şi sistemele Rh ale grupelor sanguine.

Sistemul sanguin ABO

Există 4 fenotipuri majore AB0: .A, B, 0 şi AB, care sunt determinate de reacţia
celulelor roşii ale indivizilor cu anticorpii respectivi anti-A şi anti-B, conform tabelului de
mai jos:

Fenotipul celulelor roşii Anti-A Anti-B

0 - +
A + -
A - +
AB + -
unde: + înseamnă aglutinare, iar – non-aglitinare .

Antigenii AB0 sunt de asemenea prezenţi pe multe alte celule din organism, inclusiv
pe celulele sanguine.
Indivizii care au grupa A au antigen A pe celulele lor roşii, cei care au grupa B au
antigeni B, cei cu grupa AB au ambele tipuri de antigeni, iar cei cu grupa 0 nu au nici un
antigen.
Indivizii cu grupa A au în serul lor IgM anti-B (izo-glutine), cu grupa B auanti-A, iar
cei cu grupa 0 le au pe amândouă.

224
 Gena pentru grupele AB0 este localizată lânga braţul lung al cromozomului 9 şi au
fost identificate 3 alele majore: 0, A şi B. Deşi sunt posibile genotipuri 00, AA, A0, BB, B0
şi AB, A şi B sunt gene dominante, iar gena pentru grupa 0 este recesivă. În continuare este
prezentat un tabel cu genotipurile şi fenotipurile locusurilor AB0:

UK Antigene ale Anticorpi

Genotip Fenotip
frecvenţa celulor roşii serici
00 0 0,46 nici unul Anti-A, Anti-B
AA A 0,42 A Anti-B
A0 B 0,09 B Anti-A
BB B 0,09 B Anti-A
B0 B 0,09 B Anti-A
AB AB 0,03 AB nici unul

Nu este posibil să distingem în grupele sanguine grupa AA de A0 sau BB de B0, dar

acest lucru se poate face folosînd informaţii de ascendenţă.

Sistemul Rh sanguin
Există 2 fenotipuri Rh: Rh + şi Rh -
Aceste fenotipuri sunt determinate de reacţia celulelor roşii ale indivizilor cu
anticorpii anti-Rh.Persoanele Rh + posedă antigeni Rh pe celulele lor roşii şi pe cele
tisulare, în timp ce persoanele cu Rh - nu au aceşti antigelii.
Complexul genelor pentru Rh este pe cromozomul 1 cu 2 altele, fiecare având 3
locusuri strâns legate C, c, E, şi D sau non-D. Persoanele cu Rh + sunt hetero- sau
homozigote pentru alelele D (tabelul 4).

Tabelul 4. Genotipurile şi fenotipurile Rh.

Genotip Notaţie prescurtată UK frecvenţa Fenotip Rh

cde/cde rr 0,15 -
CDe/cde Rr 0,32 +
CDe/CDe RR 0,17 +
cDE/ede Rr 0,13 +
cDe/cDE RR 0,14 +
cDE/cDE RR 0,04 +
altele 0,05 posibil +
(rare)

85% din populaţia Europei Occidentale, de exemplu, are Rh+, dar acest procent variază la
alte popoare. Aproape toţi orientalii şi nord-americanii au Rh+ de asemenea, în timp ce
30% din populaţia bască sunt Rh.

10.12. Interacţiunea între peptidele sistemului imun şi peptidele sistemului

nervos şi endocrin

Sistemul imun interacţionează cu sistemul nervos şi endocrin prin inervaţii ale ţesutului
limfoid, neurohormoni endocrini sau neuropeptide şi vice-versa. Organele limfoide primesc o
extensivă inervaţie intraparenchimală simpatică.

225
 Celulele sistemului limfoid poartă receptori adrenergici. Numărul de receptori variază cu
tipul celular, astfel: celule supresoare T > monocite > celule citotoxice T >celule helper. După
ablaţia sistemului nervos simpatic la animale, numărul receptorilor β2 -adrenergici creşte pe
celule limfoide; antagoniştii-adrenergici cresc nivelul cAMP în celulei limfoide şi alterează
funcţia.
Datele experimentale sugerează că sistemul nervos simpatic modulează răspunsurile imune
şi că supraactivitatea sistemului nervos simpatic aşa cum este de aşteptat în stres scade
responsivitatea imun.
Efectul modulator al sistemului nervos simpatic este mediată în partea via
neurotransmiţători şi în parte printr-o peptidă cu greutate moleculară mare ce inhibă marcat
răspunsul limfocitar proliferativ şi reduce producţia de IL-l şi FNT de către macrofage.
Neuronii simpatici răspund direct la IL-1, cel puţin în vitro şi se ştie că conţinutul în
norepinefrină din organele limfoide scade în timpul răspunsului imun.
Sistemul imun este capabil să producă factori, care pe lângă rolul lor crucial în timp
răspunsului imun servesc integrării circuitelor imuno-neuro-endocrine cu consecinţe imuno
regulatoare şi metabolice pentru gazdă.
Celulele imune stimulate pot creşte nivelele sanguine în hormonul adrenocorticotrop
(ACTH) şi corticosteroidul şi scade conţinutul de norepinefrină al hipotalamusului, mimând
astfel două din modificările neuroendocrine observate în timpul răspunsului imun. De asemenea,
s-a arătat recent că IL-1 induce o rapid şi profunda creştere în ACTH şi corticosteroidul din sânge
,fără să afecteze marcat nivelele sanguin ale altor "hormoni ai stresului",cum sunt catecolaminele,
prolactina,hormonul creşteri şi hormonul α- melanostimulator.
Alt efect important al IL-1 este capacitatea sa de a afecta homeostazia glucozei. Injectarea
în vivo a acestei citokine are ca rezultat o profundă hipoglicemie, care nu se datorează acţiunilor
secretagoge insulinice ale acestei citokine. Mai mult ,o simplă injectare a IL-1 poate normaliza
nivelele sanguine în glucoză pentru o durată de cel puţin 6 ore la animale diabetice incluzând
şoarecele diabetic insulino-rezistent.
Modularea citokinonică a neuropeptidelor hipotalamice: interleukine ce reglează
creşterea şi stresul. Reglarea centrală a sistemului imun este in prezent bine stabilit, sporind
dovezile că peptidele legate de imunitate(adică citokinele) pot afecta profund sistemul nervos
central. S-a relevat faptul că IL-1 şi IL-6 induc rapid eliberarea somatostatinei IL-1 induc încet
dar semnificativ creşterea şi în alte neuropeptide hipotalamice. Se pare că interleukinele
pleiotropice stimulează axa hipotalamo-hipofizaro-adrenală într-un loc situat probabil în nucleul
paraventricular şi ar deprima creşterea prin stimularea predominată a somatostatinei comparativ
cu factorul liberator al hormonului creşterii.
Se consideră că stresul infecţiilor şi traumatismelor pot stimula macrofagele şi nevroglia să
producă citokine IL-1,care în schimb reglează secreţia anumitor hormoni ce pot influenta
evenimentele imune , în timp ce stresul psihologic induce secreţia interleukinei-6 (ce este
mediată de sistemul nervos autonom).
O altă citokină care posedă efecte pleiotropice este factorul de necroză (α-FTN) derivat din
macrofag . α -FTN stimulează secreţia IL-1 de către macrofagele activitatea, promovează
mobilizarea grăsimilor corpului şi pierderea în greutate şi are proprietăţi anorexigene.P Lângă
aceste efecte, α -FTN exercită câteva efecte extraimunologice. Printre altele α -FTN este
cunoscut ca un mediator al reţelei bidirecţionale neuro-endocrino-imune. Citokinele interferează
cu secreţia hormonilor, incluzând în reproducere (în acest cu hormonul luteinizant, LH şi foliculin-
stimulator, FSN).
De reţinut că atât interleukina-l-alfa ( IL-l ) cât şi factorul de necroză tumorală α - FTN
împart cu hormonul liberator al corticotropinei unele efecte comportamentale ca mediatori ai
sistemului. Atât IL-1 cât şi α - FTN pot induce, similar hormonului eliminator a corticotropinei,
beta-endorfina ,adrenocorticotropină, sintetază eliberarea de prolactină.

226
 Se ştie că factorul hipotalamic eliberator de corticotropină are rol pivot în reglarea axei
hipotalamice-hipofizare-suprarenale, şi exercită efectele centrale inhibitorii pe funcţii
reproducătoare (ce poate fi inhibată de stres). Aceste efecte au loc prin eliberarea de beta-
endorfina neuronală şi hipofizară şi sunt anatagonizate prin tratament cu antagoniştii opiacei. De
asemenea IL-1, α -FTN şi hormonul eliberator de corticotropină induc o creştere a pragului
nociceptiv.
Hormonul eliberator de corticotropină şi citokinele diferă însă în ceea ce priveşte tipul de
stres pe care îl recunosc, adică stresul cognitiv sau non-cognitiv. Alte studii recente sugerează
creşterea producţiei de peptide neuroendocrine după stimularea celulelor cu IL-2. Astfel, prin
metode imunohistochimice s-a detectat clonarea intensă a citoplasmei celulelor mononucleare
(ACTH şi β endorfinice pozitive) din sângele periferic şi o creştere a dimensiunii celulare medii
după stimularea cu interleukina -2.
Alte studii sugerează, în plus, că una din moleculele de ACTH ce este sintetizat de celule
imune stimulează direct migrarea monocitelor umane, sugerându-se astfel un rol posibil al
peptidelor ACTH in răspunsul imun.
In prezent, numeroase interacţiuni intre sistemele imune şi neuroendocrine sunt demonstrate
şi se crede că numeroase peptide pot fi utile noilor strategii terapeutice.

10.13. Relaţiile virusuri-celule gazdă. Relaţiile virusuri-membrane celulare

10.13.1. Receptorii virali

Prezenţa sau absenta receptorilor celulari specifici influenţează nemijlocit spectrul de

gazdă tropismul tisular şi celular al virusului;elementele respective pot interveni însă în etape
ulterioare, de exemplu penetrare, decapsidare, antrenare a metabolismului celulei gazdă în
producţia componentelor virale.
Receptori celulari sunt, frecvent, de natură glicoproteică iar acidul sialic este considerat o
componentă critică în interacţiunea virus-receptor.
Virusul Sendai se leagă de o structură carbohidrat specifică ( NeuAc ) dar nu de alte
gangliozide, conţinând unul sau mai multe reziduuri de acid neurinamic. Alte mixoviruri sunt mai
puţin restrictive. Pentru virusul gripal toţi compuşii neurinamic pot acţiona ca receptori indiferent
de modalitatea de legare a carbohidratului. Virusurile gripale A şi B au receptori (glicoforina) pe
hematii; virusul rabic are receptori pentru acetilcolină la joncţiunea neuromusculară; virusul
Epstein-Barr are receptori ( CR2 pentru C3d ) pe limfocite B iar HIV are receptori (molecula
CD4 sau T4) pe limfocit T etc.

Trei metode moderne au permis studiu receptorilor celulari cu acurateţe:

a) sinteza anticorpilor monoclonali antireceptori;
b) sinteza anticorpilor antiidiotip care mimează antigenele virale;
c) utilizarea unor analogi peptidici ale situsurile de ancorare virală
A fost introdus conceptul de receptor productiv, adică de receptor care conduce singur la
infecţie, deosebit de alţii implicaţi în legarea nespecifică a virionilor. Ataşarea nespecifică a
virionilor la unele substraturi (colagenul de exemplu), poate avea importanţă patogenică pentru
că se realizează concentraţii mari de virusuri în zone unde există şi receptori productivi. În
general, organele-ţintă ale infecţiei virale au astfel de receptori productivi care sunt similari cu
receptorii cu afinitate înaltă.
Receptorii cu afinitate înaltă la nivelul "butonilor" terminali ale axonilor explică
neurotropismul unor virusuri.
În ceea ce priveşte virusul gripal, care este bine cunoscut, datele de biologie moleculară
precizează următoarele: acest virus este un orthomixovirus cu înveliş membranar; anvelopa
constă dintr-un strat bilipidic cu proteina M asociată cu porţiunea internă a dublului strat şi două
glicoproteine membranare, ai căror spiculi extramembranari se pot observa în microscopia

227
electronică. Una dintre proteinele transmembranare este hemaglutinina, iar cealaltă,
naurominidaza. Aceste două proteine permit virusului să se lege de suprafaţa celulei gazdă şi să
fuzioneze cu membrana celulară.
A fost clonată gena pentru neuraminidază, proteina conţinând 454 aminoacizi cu greutatea
moleculară 50.087 Da. Această proteină prezintă o zonă hidrofobă majoră, care o ancorează in
membrana virală. Proteina prezintă 5 situsuri de glicozilare şi este incorporată in membrana virală
sub forma unui trimer simetric cu laturile polipeptidice identice. Rolul neuraminidazei in infecţie
nu este cunoscut,dar se ştie că ea clivează acidul N-acetilneuraminic(acid sialic) al lanţului
hidrocarbonat glicoproteina. Substratul neuraminidazei poate fi glicoproteina celulei-gazdă sau
glicoproteina-hemaglutinică a virusului.
Activitatea enzimatică a neuraminidazei este necesară pentru producerea infecţiei,
deoarece anticorpii antineuraminidază inhibă replicarea virală. Cealaltă glicoproteină
transmembranară a virusului gripal, hemaglutinina, leagă virusul la acidul sialic conţinut de
receptorii membranei celulei-gazdă. De asemenea,ea mediază fuziunea celulară a virusului.
Hemaglutinina virusului gripal este un trimer de 224.640 Da. Fiecare trimer conţine un lanţ
oligozaharidic. Glucidele sunt localizate la suprafaţa proteinei pe întreaga sa lungime si au rolul
de a proteja hemaglutinina de degradarea proteolitica nespecifica. Pentru ca virusul gripal sa
fuzioneze cu membrane celulei-gazda,hemaglutinina trebuie sa cliveze in doua fragmente , HA1
si HA2, prin hidroliza legăturii peptidice a argininei din poziţia 238. Clivarea hemaglutiniei în
cele două fragmente creşte infecţiozitatea virusului de 100 ori, fără să afecteze activitatea
hemaglutinică. Molecula de hemaglutinina provoacă fuziunea ăn absenţa oricăror alte
componente virale.Tipul viral cel mai patogen al gripei - tipul A - conţine 13 subtipuri de
hemaghetinine (HA) notate HA1 - HA 13 si 9 antigene de tip neuraminidaza (N) notate Nl-N9.
Fiecare virus prezintă 300-600 spiculi de hemaglutina care explica ataşarea virionilor la
celule. Intr-o prima etapă, hemaglutinidele virale se leagă pe reziduurile de acid sialic ale
glicoforinelor A. Caracterizarea precisă a domeniilor de legare la nivelul proteinelor virale şi a
receptorilor celulelor gazdă deschide o noua cale în terapia antivirală: experimentarea şi
producerea unor agenţi care să acţioneze în competiţie cu virusurile în legarea pe receptor.

10.13.2. Penetrarea virusului în celulă

Procesul de internalizare a virionilor, declanşat de ataşarea lor ireversibilă la receptorii

celulari este numit viropexie (enducitoza). În plus, virusurile cu anvelopa (ortho-si
paramixovirusurile, rhabdo- si togavirusurile etc.) datorită includerii în structura externa a unei
porţiuni lipidice pot penetra si printr-un proces de fuziune. Pătrunderea paramixovirusurilor în
celulă prin fuziunea dintre anvelopa virală şi membrana celulară, perturbează permeabilitatea
acesteia din urma, ceea ce poate avea urmări toxice ca hemoliza (la hematii), liza "din afară" (la
celulele nucleate) şi chiar modificării nucleare şi alterări cromozomale.
Studii electronomicroscopie combinate cu detectare a antigenului cu anticorpi marcaţi de
peroxidază au lămurit în cazul virusurilor respirator sinciţial şi rujeolic, secvenţa evenimentelor
timpurii ale infecţiei. Astfel, consecutive absorbţiei (la +37C) anvelopa virală şi membrana
celulara fuzionează, apoi antigenele virale se dispersează în regiunile adiacente ale membranei,
întreaga celulă devenind specific reactivă cu anticorpii antivirali marcaţi. Aceasta difuziune
explică cel puţin două fenomene:
- starea refractara a celulelor la fuziunea cu alte virusuri şi,
- difuzarea infecţiei din aproape în aproape prin antrenarea celulelor vecine în procesul
de sincitizare. În cazul papovavirusurilor, ca rezultat al absorbţiei se notează o creştere
rapida a fluidităţii membranei celulare datorită activităţii unor enzime membranare,
probabil declanşată de procesul endociotic.

228
 Prin urmare, absorţia la suprafaţa celulei este urmată de penetraţia virusului în celulă, care
se poate desfăşoară pe doua căi:
a) fuziune directa cu membrane plasmatică;
b) prin endocitoza (viropexie) simplă (absorptiva) sau mediată de receptori (clatrinică).

Virusurile încapsulate pot urma ambele cai, în timp ce virusurile nude numai endocitoza.
Endozomul (fagozomul) fuzionează apoi cu lizozomul a cărui aciditate favorizează fuziunea
membranelor virale şi lizozomale ; procesul este foarte rapid, încât expulzarea nucleocapsidei în
citoplasma se efectuează fără distrugerea ei de către enzimele lizozomale de degradare.

10.13.3. Tipuri de efect citopatic

Sunt descris mai multe tipuri morfologice de efecte citopatice viral - induse în culturi, de
pildă:
a. citotoxic (produs de infecţii masive, hiperacut, fără a exista timp pentru sinteza virusului
progen; leziunile au fost asimilate cu fenomenul lizei "din afara" in cazul bacteriilor
parazitate de fagi);
b. citolitic (caracterizat prin alterări celulare acute-rotunjire,ratatinare-şi pierderea
capacitaţii celulelor de a retine coloranţii vitali);
c. sinciţial (indus de virusuri care poseda proteine structurale de "difuziune" ca herpes-
virusuri, paramixovirusuri, retrovirusuri);
d. incluziogen (caracteristic unei replicări virale relativ lente şi însoţit, în afara de apariţia
incluziilor virale (noi particule de virus) de vacuolizari citoplasmice, citomegalie,
sincitizare etc.
De reţinut faptul ca relaţiilor virus-celula gazda, exprimate morfologic, le corespunde o
proporţie semnificativ mai mare de interacţiuni neproductive, aşa cum infecţiile clinic aparente
sunt amplificate epidemiologic de infecţiile subclinice.

10.13.4. Leziuni cromozomale determinate de virusuri

Virusurile induc diverse anomalii cromozomale ca:

- aberaţii cromozomale (fragmentări, pulverizaţii, rupturi, schimburi cromatiniene);
- anomalii ale aparatului mitotic (mitoze multipolare , mitoze colchicina-like);
- cariotip anormal cu complement instabil sau stabil;
- policariocite.
În ceea ce priveşte patogeneza virala la nivel molecular, de notat ca datele actuale
evidenţiază adaptarea continuă a genomului viral şi a gazdei, astfel încât să fie asigurată
supravieţuirea ambilor parteneri.
Temin a propus o serie de intermediari evolutivi între elementele genetice mobile şi
retrovirusuri, trecând prin provirusuri. Însăşi retrovirusurile cuprind grupe evolutive si anume:
retrovirusuri nononcogene, lent-oncogene şi rapid oncogene . Se ştie că un concept recent asupra
oncogenezei virale susţine integrarea unui provirus retroviral adiacent la o genă celulară potenţial
oncogenă (c-onc).
Important din punct de vedere teoretic este deci faptul ca inserarea elementelor genetice
mobile (sau a provirusurilor) într-un loc sau altul al genomului celular mobil este urmată de
inactivarea sau activarea unor gene celulare. Astfel de activări, consecinţă a controlului exercitat
de un nou promotor, pot fi la originea unor tumori canceroase.

229
 10.13.5. Natura şi funcţia unor structuri virus-like: prionii

Un capitol de patologie moleculară a celulei interesant în virusologie, genetică şi clinică

priveşte în prezent natura, compoziţia chimica si funcţia unor structuri puse in evidentă prin
diverse metode, ori demonstrate direct prin microscopie electronică.
Astfel proteina prion (PrP) este una din proteinele majore produse in exces in
encefalopatiile spongiforme subacute la om si animale de laborator. Natura exactă a agenţilor
neconvenţionali care induc aceste boli este necunoscuta in prezent.
Au fost evocate câteva ipoteze conform cărora agenţii ar prezenta: un virus convenţional,
o noua clasa de agenţi numiţi virioni, o proteină autoreplicabilă (numita Prion), un retrovirus sau
este vorba de o boala post-translatională , care implică dereglarea sintezei proteice.
Acumularea PrP , ca şi a proteinei acidice fibrilare gliale (GFAP) în infecţiile experimentale
la şoarece cu scrapie, în special în creier, implică aceste proteine în mecanismele lezionale ale
sistemului nervos central (SNC). PrP (33-35 KD) este o sialoglicoproteină celulară localizată pe
faţa externă a neuronilor în cultură, ancorată printr-un glicolipid fosfatidilinozitol.
Nivelul expresiei genetice PrP este menţinut strict pe parcursul vieţii. Studii de cinetică a
expresiei genetice PrP si GFAP pun în evidenţa faptul că ARNm GFAP şi PrP variază
semnificativ în timpul dezvoltării normale postnatale a creierului de şoarece.
ARNm pentru proteina prion a fost detectată imediat după naştere şi a crescut de patru ori în
dezvoltarea ontogenetică.
În prezent este investigată expresia genelor PrP si GFAP în creierul in dezvoltare infectat
cu scabie pentru cunoaşterea mecanismelor de reglare şi/sau dereglare în astfel de infecţii.
Toate encefalopatiile spongiforme transmisibile, incluzând scrapia, sindromul Gerstmann-
Straussler-Scheingker şi encefalopatia spongiformă bovină conţin forma agregată, parţial
rezistentă la proteaze, ca un marker specific pentru boala oferit de această proteină PrP.
Se consideră în prezent că spre deosebire de PrP normală de la suprafaţa neuronilor, forma
agregată PrP apare fie dintr-o infecţie , sau de la o genă mutantă PrP, care acţionează ca un
catalizator în conversia proteinei normale endogene PrP în cea agregată şi abundentă, astfel incît
funcţia normală a proteinei este abolită şi rezultă boala degenerativă.
Conform altor opinii, proteina normală PrP acţionează ca receptor pentru un agent al
scrapiei încă neidentificat; de asemenea este incriminat un mic acid nucleic care este un virus
neconvenţional ( de aceea este dată denumirea de virus neconvenţional sau virină).
Din alt punct de vedere este frapantă similitutidinea de patologie a scrapiei cu studii
recente privind receptorul poliovirus (PVR).Unele studii recente transgenetice au arătat de
exemplu că şoarecele transgenetic exprimând PVR uman devine susceptibil la poliovirus;
şoarecele normal este rezistent. Pe măsură ce şoarecii transgenetici ce exprimă PVR au dezvoltat
această boală, ei arată modificări patologice corespunzătoare.
O variantă a PrP a fost implicată recent în producerea sindromului Gerstmann-Straussler-
Schemgker, boală umană rară similară scrapiei, caracterizată prin patologie spongiformă,
proteină PrP protează rezistentă si placi (depozite mari proteice).
S-a arătat în cazul acestui sindrom, un linkaj între incidenţa bolii şi mutaţia proteinei PrP
şi anume, o substituţie a proliniei cu leucina la codonul 103. Ar fi vorba deci de o leziune
genetică care poate cauza neurodegenerarea spongiformă transmisibilă sau mutaţia produce o
modificare în structura proteinei sau în stabilitate, care mimează efectul legării unui agent
patogen.
Termenul de prion a fost introdus în biologia moleculară în anul 1982 de către Harley
Prusiner de la universitatea din San Francisco.
Prionii (cunoscuţi şi sub numele de protovirine, virineos, virusuri latente) reprezintă o
clasă de agenţi infecţioşi subvirali, cu greutatea de 27000-30000, unici în felul lor, fiind
rezistenţi la toate procesele de inactivare care degradează acizii nucleici (căldura, razele u.v,
radiaţii ionizante); prionii rămân o enigmă „o perplexitate” a biologiei moleculare, deoarece
admiterea existenţei lor drept agenţi infecţioşi, lipsiţi de acid nucleic şi formaţi exclusiv din

230
proteine, ar pleda pentru dărmarea dogmei centrale a biologiei moleculare, prin acceptarea
unei codificări şi multiplicări a acestei proteine prionice infecţioase, nu prin intermediul
acidului nucleic al celulei gazdă.
Pentru acelaşi motiv,bolile prionice sunt considerate astăzi „pseudoinfecţioase” în
comparaţie cu bolile infecţioase clasice, ale căror agenţi etiologici sunt microorganisme
(virusuri, bacterii) care conţin în structura lor acid nucleic.

Caracteristicile principale ale bolilor prionice sunt:

- afectează sistemul nervos central (SNC) provocând encefalopalii spongiforme;
- au o perioadă foarte lungă de incubaţie: de la câteva luni la 37-40 de ani;
- au o evoluţie lentă, progresivă, totdeauna letală.
Pâna în prezent au fost deschise 12 boli priorice: şase la animale şi şase la om (tabelul
4). Dintre acestea, cele mai bine studiate sunt scrapie la animale şi boala Crentzfeldt-Jakobs
(CJD) la om. Celelalte zece boli prezintă similarităţi de ordin clinic, anatomo-patologice şi
hismitochimic cu aspectele din scrapie. În aceste boli, principala caracteristică moleculară o
reprezintă acumularea masivă în SNS a unei proteine PrPc a gazdei, dar într-o izomorfă
anormală tip PrPsc (tip proteină din scrapie) la animal respeciv PrPcjd (tip proteină din CJD la
om). În prezent se admit trei posibilităţi de producere a bolilor prionice : infecţia lentă,
infecţie sporadică şi alterare genetică (tabelul 5).

Tabelul 5. Bolile prionice

Data
Nr. Gazda
Boala Frecvenţa transmiterii
crt. naturală
exprerimentale
1. SUA, Anglia,
Scarpie capre, oi 1936
Franţa, Elveţia
2. Eucefalopatia transmisibilă Rară dar cu
curci 1939
curcilor (TME) mortalitate >90%
3. Boala cronică devastatoare SUA(Colorado,
elan, căprior 1983
(CWD) Wyoming)
4. Nyola şi
Eucefalopatia spongiformă a
Anglia antilopa -
copitatelor (EVE)
africană
5. Eucefalopatia spongiformă pisici
Anglia(1989) -
felină(FSE) domestice
6. Eucefalopatia spongiformă
bovină(BSE) Anglia bovine 1988
boala vacilor nebune
7. Papua – Noua
Kuru om 1966
Guinee
8. 1/1.000.000 pe tot
Boala Crentyfeldt - Jakols om 1968
globul
9. Sindromul Gertmann- <0,1milion/an
om 1981
Ströussler Japonia
10. Italia, Anglia,
Insomnia fatală familială om -
Franţa, America
11. om, unele
Insulele Faroe,
tulpini au
Scleroza multiplă Scoţia, Irlanda, 1993
produs
Key West
scrapie la oi
12. Boala lui Alper om

231
 Particularităţi de diferenţiere a prionilor de virusuri
Prionii se diferenţiază de virusuri prin următoarele caracteristici majore:
Absenţa ADN-ului. În încercările de purificare a prionilor, prin electroforeză în gel
sarcosil şi sedimentare în gradient discontinuu de sucroza (proteină) cu greutatea moleculară
de 27.000-30.000 (PrP= proteină prionică), dar nici un acid nucleic.
Structura exclusiv proteică. În ţesutul cerebral al animalelor cu infecţie prionică plăci de
amiloid şi fibre amiloide (SAF =fibre asociate scrapiei).
Amiloidul reprezintă un derivat dintr-o glicoproteină celular normală (PrPc), care se
găseşte în mod normal pe membrana celulei neuronale.Se ştie astăzi că în cursul infecţiei
prionice se produce conversia unei cantităţi de proteină PrPc (prin modificări
posttranslaţionale) în PrPsc reprezintă tocmai SAF (proteină înalt infecţioasă). Plăcile
amiloide sunt incluzii de prioni. PrPc şi PrPsc au aceeaşi greutate moleculară (33-35Kda), dar
PrPc poate fi complet digerată „în vitro” de proteineaza K, în timp ce PrPsc este rezistentă,
fiind doar parţial digerată lăsând un miez rezistent proteinoza K; acest miez este reprezentat
de PrP 27-30 (GM= 30Kda).
PrPsc are o are o abilitate foarte mare de a determina modificări posttranslaţionale ale
propriei molecule şi de a forma amiloid, fapt pentru care are consecinţe asupra replicării,
transmisibilităţii şi neuropatogenici bolii. Fibrele de amiloid reprezintă produse de degradare
(de rupere) PrPsc infecţioase.
Modificările posttranslaţionale care contribuie la transformarea PrPc în PrPsc au fost
considerate un timp doar modificări conformaţionale de împăturire (substituirea α-helixurilor
cu β-sheet-uri); date recente pledează şi pentru modificări de ordin chimic.
Absenţa imunităţii. Spre deosebire de virusuri, care produc răspuns imun prionii nu sunt
imunogeni. Bolile prionice sunt cu evoluţie lentă, apar paradoxal în absenţa oricărui răspuns
imun care a putea opune rezistenţă înaintării infecţiei.
Existenţa unor forme multiple cu grad înalt de infecţiozitate. Prionii pot exista sub
formă de bastonaşe, complexe proteice cu lipit-detergent (DhPCs) şi sub formă de lipozomi.
Aceste forme sunt interconvertibile; în toate aceste forme singura moleculă identificată este
tot PrPsc.

Ipoteze referitoare la natura prionilor

Referitor la natura prionilor s-au emis imens unele ipoteze (ipoteza viroidului animal,
ipoteza virină, ipoteza retrovirusului, grupul ipotezelor de agenţi infecţioşi „fără geamăn”
etc.). Până în prezent nici una din ipoteze nu se bucură de adeziunea întregii comunităţi
ştiinţifice.
Prionii rămân o clasă aparte, fără precedent, de agenţi infecţioşi fudamental diferiţi de
virusuri şi viroizi. Multe întrebări referitoare la prionii îşi aşteptă răspunsul în viitor.
Este de menţionat însă faptul că problema BSE (boala vacii nebune) şi cea a
radioactivităţii ocupă în prezent aceeaşi nişă psihologică în societate, în timp ce fumatul,
obezitatea, abuzul de alcool, lipsa de mişcare (agenţi ai unor boli cu incidenţă a mortalităţii
extrem de mare pe glob) sunt total ignoraţi.

Ipoteza viroidului animal

Viroizii sunt agenţi subvirali exclusiv din ARN fără înveliş (capsidă) proteic. Spre
deosebire însă de viroizii cunoscuţi (potato spindle tuber viroid), foarte rezistenţi la u.v.,
prionii sunt de 10 ori mai rezistenţi decât ARN-ul purificat al acestora; de asemenea, în timp
ce viroizii sunt sensibili la nulează, prionii sunt rezistenţi.

Ipoteza virină
O moleculă de acid nucleic ce conţine informaţia biologică (prion) ar fi protejată de o
moleculă de proteină a gazdei, fomând împreună o particulă infecţioasă, capabilă de
replicare; prezenţa acestui acid nucleic nu a fost încă confirmată.

232
 Ipoteza retrovirusului
Pentru asigurarea retrovirală a prionilor se aduc ca argumente tropismul pentru SNC şi
modificările de membrană (induse foarte rar) fără răspuns inflamator major.

Argumente contra originii retrovirale a prioinilor sunt următoarele:

- nu a putut fi pus în evidenţă nici un retrovirus, prin metodele actuale, în bolile prioniei;
- rezistenţă foarte mare la formaldehidă şi glutaradeldehidă (retrovirusurile fiind sensibile la
aceste doua substanţe).

Grupul ipotezelor de agenţi infecţioşi „fără genom”

Plecând de la conceptul iniţial de prior respectiv „proteină autoreplicabilă”, se emit mai
multe ipostaze prin care se încearcă explicarea modificării proteinei celulare normale PrPc în
proteină izomorfă patologică PrPsc, fie datorită unor mutaţii suferită de gena ce codifică PrPc,
fie datorită unor perturbatori ce apar posttranslaţional în conformaţia spaţială a proteinei în
diferite etape.

Modele viitoare
Modelele transgenetice deşi au sporit cunoaşterea noastră în înţelegerea bolilor scrapie-
like nu au clarificat totuşi complet rolul proteinei PrP. Se speră ca în viitorul apropiat să se
creeze prin recombinare omoloagă, linii de şoarece cu modificări precise în gena PrP endogenă
şi fără nici o extracopie.
De pildă, şoareci cu gene PrP nefuncţionale ar permite să se elucideze funcţia normală a
PrP în sistemul nervos şi ar putea fi folosiţi să demonstreze dacă această proteină a gazdei este
într-adevăr necesară pentru replicarea agentului scrapie.
De asemenea, numeroase observaţii electronomicroscopice în boli ca lupusul eritematos
,dermatomiozită, glomerulonferită, etc, s-au referit la incluziile "tubulare" (paramixovirus-like)
dm citoplasmă celulelor endoteliale , fibroblastelor, macrofagelor , limfocitelor, etc. Formaţiunile
respective au circa 1,5 um în diametru şi fiecare tubul măsoară circa 20-25 nm.
In secţiune transversală, tubulii prezintă un mers dens (probabil acid nucleic), apoi o zonă
cu densitate medie şi o pătură periferică (probabil proteică), fiind similar ca aspect general cu
nucleocapsidele fără înveliş ale paramixovirusurilor.În sprijinul naturii virale a "tubulilor" pe
lângă trăsăturile morfologice în examinarea directă , s-a invocat capacitatea acestora de a
perpetua în culturile de celule păstrându-se sensibilitatea la ribonucleaza cât si depozitarea
complexelor imune virale de tip C în piele.
S-a emis chiar ipoteza potrivit căreia etipatogenia aşa-ziselor colagenoze s-ar petrece mai
întâi infecţia virală (acidul nucleic viral ar fii un timp în stare biofită )şi apoi imunocompromisul
indus de virus. Conform altor opinii,asemenea agregate tubulare larg răspândite la om şi la
animale , în diferite ţesuturi şi în diferite boli, ar prezenta fie material celular alterat eliberat în
circulaţii după răniri , fie produse de regenerare celulară sau chiar complexe imune. De regulă
RER apare anormal dilatat în celulele endoteliale ale vaselor sanguine din piele şi muşchiul
scheletic la subiecţi cu astfel de boli, conţinând tubulii caracteristici.
Deşi problema acestor formaţiuni tubulare este şi ea grevată de necunoscute , se acceptă
încă folosirea lor ca elemente de diagnostic în unele boli ale ţesutului conjunctiv. În sfârşit, în
sindromul de imunodeficienţă dobândită (SIDA) unele limfocite conţin în citoplasmă particule
sferice , dispuse ordonat după un model paracristalin- ca un stadiu în morfogeneza virală.

10.14. Relaţiile bacterii-celulele gazdei

Bacteriile sunt importante din punct de vedere teoretic şi practic prin rolul jucat în
experienţele de recombinare a ADN (inginerie genetică) şi prin caracterul patogen al unor specii.
În patogenia umană ele produc infecţii-boală, datorită factorilor de patogenitate determinaţi
genetic.

233
 Prin virulenţa lor, ele pot depăşi capacităţile de apărare al gazdei, factorii de virulenţă
incluzând factorii de colonizare şi factorii care contribuie la multiplicare.
O importanţă majoră pentru aderenţă şi colonizare o are doza infectantă; în intestin numai
o singură celulă bacteriană din câteva mii ajunge să adere şi să colonizeze.
În procesul de aderenţă participă anumite structuri macromoleculare antigenetice, de la
suprafaţa bacteriei numite adezine şi receptorii corespunzători ai celulelor epiteliale.
Adezinele(glicoproteine,liporoteine de 1000-125000 Da) sunt reprezentate în general de
filamente (numite fimbrii la bacteriile gram-negative)şi de fibrile (la cele gram-pozitive).
Prezenţa receptorilor celulari corespunzători diferitelor adezine determină în mare parte
specificitate de specie sau de ţesut a aderenţei bacteriene.
Odată aderate şi înglobate în stratul de mucus secretat de celulele epiteliale, unele bacterii
se limitează la epitelii (C. dipteriac, E. coli etc) întrucât nu pot trece de fagocitele subepiteliale
anticorpi, factori bactericizi serici etc, în timp ce altele (Str. pyogenes, Salmonella etc) pătrund
în ţesuturile subepiteliale.
Penetrarea acestora este asigurată de enzime (histolitice şi citolitice) componente ale
peretelui celular (peptidoglicani etc) şi de endocitoză de către celulele epiteliale care ulterior le
exocitează.
După depăşirea membranelor bazale (care acţionând ca un filtru le temporizează
diseminarea),bacteriile ajung în ţesutul subepitelial de unde pe cale limfatică şi/sau sanguină, sau
fagocitate, pot difuza în tot organismul.
De reţinut că bacteriile foarte mobile şi subţiri (spirochetele) pătrund prin epiteliile gazdei
atât prin endocitoză cât şi prin mişcări active datorită aparatului locomotor, formei spiralate şi
extremităţilor ascuţite, singura zonă unde se găsesc şi adezine.
Fibrele periplasmatice ale spirochetei Tr. pallidum sunt implicare în locomoţia bacteriei
care se deplasează "înşurubându-se" în mediul lichid.
Dacă virusurile gripale sunt cantonate la epiteliul ciliar al tractului respirator superior, în
cazul bacteriilor deficienţe ale aparatului mucociliar ale acestui tract favorizează producerea
sinuzitelor, bronşitelor, pneumoniilor, de către flora nazofaringiană normală.
Sisteme enzimatice complexe situate la suprafaţa celulei bacteriene sau eliberate în mediu
(care permit consumul elementelor nutritive ca atare sau modificate conform necesităţilor
metabolice proprii) asigură multiplicarea lor.
Agresinele de la suprafaţă (mucopeptide, polipeptide, enzime) permit inhibarea ori
ocolirea mecanismelor de apărare a gazdei, iar toxinele (proteice şi lipopolizaharidice)
generează diverse efecte patologice; toxina difterică, de pildă citotoxică, inhibă sinteza
proteinelor, producând leziuni predominant cardiace, hepatorenale şi nervoase.
Oricare ar fi gradul patogenecităţii bacteriei implicate şi severitatea căii de pătrundere în
organism, starea de imunitate a gazdei reprezintă factorul major de condiţionare a manifestării
patogenităţii.

234
 Capitolul 11

BIOTEHNOLOGIA
Secolul XX şi în special perioada de după al doilea Război Mondial, a însemnat un
uriaş pas înainte în dezvoltarea cercetărilor de genetică şi inginerie genetică, de biologie
celulară şi moleculară, de biochimie şi microbiologie, precum şi a tehnicilor de culturi de
celule vegetale, animale şi microorganisme. S-au creat astfel premizele apariţii
biotehnologiilor moderne şi a bioindustriei.
Biotehnologia este o ramură industrială complexă care utilizează drept materie primă
microoganismele (bacterii, drojdii, mucegaiuri etc), culturi de celule vegetale şi animale,
pentru obţinerea de organisme şi de substanţe utile economic. Astfel, biotehnologiile moderne
au mari implicaţii în industria alimentară ( producerea de proteine monocelulare
neconvenţionale, sinteza unor aminoacizi esenţiali, cum sunt lizina şi acidul glutonic,
producerea de enzime, sinteza de aditivi alimentari), în industria farmaceutică (producerea de
antibiotice, hormoni, vitamine, substanţe antivirale şi amtitumorale, vaccinuri, anticorpi
monoclonali etc), în bioexploatarea petrolului şi minereurilor (creşterea gradului de
recuperare cu ajutorul unor microorganisme), în ecologie ( valorificare biomasei, preparate cu
rol în purificarea apelor industriale şi menajere ), în medicină (produse de interes medical
utilizate în diagnostic, tratament sau cercetare fundamentală.
O importanţă deosebită au biotehnologiile moderne pentru manipularea genomului
celulei vegetale şi animale în vederea creării de soiuri de plante şi rase de animale pe căi
neconvenţionale, mult mai repede şi mai eficient.

11.1. Ingineria genetică

Progresele spectaculoase ale biologiei, aşa cum se exprimă ele în realizările ingineriei
genetice sunt strâns legate de înaintarea impresionantă a tehnicilor analitice, ca
ultracentrifugare, marcarea moleculelor prin izotopi radioactivi, electroforeză, cromatografia
de afinitate (de ex., tehnica separării moleculelor complexe prin anticorpii monoclonali
corespunzători), electrofocalizarea bidimensională (permiţând analiza a 50 000 de proteine ale
unei celule), microanaliza (de ex., determinarea structurii primare a unei proteine pornind de
la numai 10 nanograme, dar şi a structurii altor macromolecule biologice).

11.1.1. Tipuri de transfer de gene

Prin această tehnologie se realizează noi combinaţii de ADN de la două organisme

diferite, prin transfer de gene de la un organism la altul, obţinându-se în acest fel organisme
transgenice.
Până în prezent s-au obţinut următoarele tipuri de transfer de gene:
a) Gene virale transferate la virusuri;
b) Gene virale transferate la eucariote;
c) Gene de la procariote transferate la procariote;
d) Gene de la procariote transferate la eucariote;
e) Gene de la eucariote transferate la procariote;
f) Gene de la eucariote transferate la eucariote.

Gene virale transferate la virusuri.

Folosindu-se un asemenea transfer s-a putut obţine prin tehnica de recombinare genetică
un nou vaccin rabic cu o eficienţă mult crescută faţă de cele folosite în mod obişnuit.

235
 Rabia este o infecţie virală ce se transmite prin muşcătură (în cazuri speciale şi prin aer)
de câine, vulpe (Europa), sconcşi, ratoni, lupi, câini, vulpi polare, lilieci (America). În fiecare
an se înregistrează 50000 de decese umane prin rabie pe glob (majoritatea în Asia) şi câteva
milioane de decese la animale.

Gene virale transferate la eucariote.

În 1995, Becker şi Darai arată că ingineria genetică cu viruşi vectoare reprezintă un
subiect de primă importanţă pentru dezvoltarea protocoalelor de terapie genică la om.
Cu ajutorul retrovirusului recombinat Herpes simplex tip I a fost transportată gena
timidinkinaza HSV-1TK de la acest virus în celule pulmonare canceroase de la om.
Respectiva enzimă a indus în celulele canceroase sinteza de monofosfat de aciclovir şi
ganciclovir şi apoi fosforilarea acestora până la forma de trifosfat, care a inhibat sinteza ADN
celular din celulele canceroase, oprind diviziunea celulară şi propagarea celulelor neoplazice.
În aceeaşi categorie de transfer de gene se încadrează metoda de preparare a vaccinului
hepatitei B (vaccin Engerix-B). Biologia moleculară a permis determinarea cvasi-totală a
materialului genetic al virusului hepatitei B. Astfel, în secvenţa ADN a fost identificată gena
S drept responsabilă se sinteza proteinei S (antigen HBs); proteina S este un antigen de
suprafaţă al virusului (antigen prezent, în mod constant, în serul bolnavilor de hepatită virală
tip B).
Prin aplicarea unei tehnologii genetice, din ADN viral a fost izolată gena S şi, cu
ajutorul unui vector, a fost inserată în materialul genetic al unei celule gazdă eucariote ( o
levură), care prin multiplicare a permis ulterior exprimarea şi sinteza în cantitate mare a
respectivei proteine a antigenului HBs. Respectivul antigen nu este infecţios, ci doar
imunogen. Pentru prepararea vaccinului Engerix-B (ADN recombinat), a fost selecţionată
levura Saccharomyces cerevisiae (1991) (Smith Kline-RIT). Pentru producerea vaccinului la
scară industrială, tulpina de levură pe care se realizează procesul de recombinare este
însămânţată în cuve de fermentaţie (bioreactoare), în care levura se multiplică rapid,
producând proteina-antigen HBs. Celulele de levură sunt apoi recoltate, broyate, iar antigenul
HBs este izolat şi înalt purificat, înainte de a fi condiţionat în vaccin.

Gene de la procariote transferate la procariote

Pentru a realiza introducerea ADN-ului (gena) bacterian într-o altă bacterie, sunt folosite
două tehnici. Prima constă în utilizarea plasmidelor* ca vectori, iar a doua în utilizarea
bacteriofagilor.
Deoarece bacteriile sunt organisme haploide, reasortarea materialului genetic nu se
poate realiza prin recombinare în cadrul aceleaşi celule, ci prin transferul de material genetic
de la o tulpină donoare la una receptoare (diferită de prima), din cadrul aceleiaşi specii sau
între specii bacteriene înrudite. Rezultă o celulă care conţine întreg genomul receptorului şi un
fragment din genomul donorului. S-au descris patru mecanisme diferite de transfer genetic:
• transformarea;
• transducţia;
• conjugarea;
• transpoziţia (translocarea sau recombinarea cu specificitate de situs).
Transformarea reprezintă prelucrarea unei molecule de ADN de la o tulpină donor de
către o celulă receptoare competentă. ADN-ul transformat se leagă de celula competentă, la
nivelul unor situs-uri specifice ale învelişului celular, pătrunde apoi în celula receptor şi se
integrează prin recombinare în regiunea omologă a cromozomului receptor.

* Plasmidele = clasă majoră de elemente genetice mobile, formate dintr-un duplex ADN; sunt
cromozomi accesorii, se pot replica autonom (replicon).

236
 Transducţia reprezintă transferul de material genetic de la o bacterie la alta, prin
intermediul fagilor transductori. Acest fenomen este practic posibil la toate speciile bacterine,
dar numai anumiţi fagi au proprietatea de a fi transductori (fagul λ de la E. coli, fagul P1 de la
E. coli, fagul P22 de la Salmeonella typhimurium).
Conversia. Anumiţi fagi (convertizori) transportă gene cu alte funcţii decât cele virale,
cel mai cunoscut fiind gena “tox” responsabilă de toxinogeneza tulpinilor de bacil difteric.
Conjugarea presupune un transfer de material genetic de la celula donatoare la celula
receptoare, prin intermediul factorului de fertilitate F (factor plasmidic = vector), numit şi
factor de fertilitate. Transferul de material genetic este polarizat de la celula F+ (celula
donatoare, care conţine factorul de fertilitate F ) către celula F- (celula receptoare, lipsită de
factorul F), începând cu capătul 5’ al ADN-ului. Factorul F pătruns în celula receptoare F-
poate rămâne liber în citoplasmă şi atunci celula F- devine F+, sau se poate integra în
cromozomul bacterian (cu frecvenţă de 105 per generaţie); în acest ultim caz, celula
receptoare F- devine Hfr (high frequeney recombination), deoarece prezintă frecvenţa înaltă
de recombinare.
Transpoziţia este fenomenul prin care copii (elemente transpozabile) ale unor secvenţe
specifice de acid nucleic, dintr-un genom bacterian, se deplasează de-a lungul aceluiaşi lanţ de
acid nucleic sau pe cel al altui genom bacterian, având capacitatea de a se insera pe unul sau
mai multe situs-uri specifice.

Gene de la procariote transferate la eucariote

S-a obţinut transferul unei gene (responsabilă de sinteza unei endotoxine care omoară
insectele) de la Bacillus thuringiensis în celule vegetale (bumbac) cu ajutorul unui plasmid Ti
asociat cu un retrovirus. Această tehnologie generică este folosită cu rezultate foarte bune de
mai bine de 30 de ani.
Plasmidul Ti provine de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, bacterie care
parazitează plantele; plasmidul Ti poate trece spontan în celulele vegetale infectându-le,
rezultatul fiind producerea unor tumori la plante, tumori cunoscute sub numele de “creasta
cocoşului”. Aceste plasmide Ti, folosite astăzi, în asociere cu un retrovirus, drept vectori
pentru manipulări genetice (transfer între o celulă procariotă şi o celulă eucariotă), îşi pierd
capacitatea tumorigenă şi o păstrează doar pe cea de vector a unei gene străine (de ex., gena
de sinteză a endotoxinei bacteriene de mai sus).

Gene de la eucariote transferate la procariote

Acest transfer este practicat de 20 de ani. Genele din genomul eucariot sunt transferate
cu ajutorul unui vehicul corespunzător în organismul procariot iar apoi aceste noi gene
transferate se multiplică (cu rată foarte înaltă) în organismul procariot. În acest fel,
organismele procariote (microorganisme tip bacterii) cu rată foarte înaltă de multiplicare pot
fi utilizate pentru sinteza anumitor gene din organismele superioare. Acest tip de combinaţie
ADN in vitro, urmată de clonarea genelor nou transferate, se foloseşte astăzi pe scară
industrială şi se realizeză după următoarele etape:
ƒ ADN din cromozomul organismului eucariot este extras şi purificat, apoi tăiat de
endonucleaze de restricţie;
ƒ se foloseşte un vehicul izolat dintr-o bacterie. Plasmidul de formă circulară este deschis
(cu ajutorul unei enzime de restricţie), obţinându-se un lanţ ADN unic. Deoarece
endonucleazele se fixează pe plasmid doar la nivelul aceloraşi secvenţe de baze ca cele de
pe fragmentul ADN, rezultă locuri de tăiere cu secvenţe complementare. Acest aspect
reprezintă condiţia esenţială pentru fuziunea fragmentului ADN cu plasmidul deschis. Pe
baza capetelor ADN lanţ unic cu secvenţe complementare (sub influenţa ADN-ligazei) se
pot lega cele două lanţuri ADN străine (plasmid + gena de la eucariot), formând deci un
lanţ dublu ADN. În acest fel, plasmidul se închide, incluzând şi gena eucariotă, care
devine astfel o parte integrantă din sistemul genetic al procariotului, rezultând un plasmid

237
 hibrid. Pentru a se facilita pătrunderea acestui plasmid hibrid în celula bacteriană se
foloseşte soluţia de CaCl2, care creşte permeabilitatea membranei bacteriene, determinând
terminarea transferului de gene.
ƒ selectarea celulelor bacteriene care conţin gena eucariotă se realizează cu ajutorul unui
plasmid care poartă unul sau mai mulţi markeri de rezistenţă la antibiotice.
Dacă cultura bacteriană cu plasmidul mai sus-menţionat este pusă în prezenţa
antibioticelor respective, bacteriile, cu câteva excepţii, vor fi omorâte. O bacterie rezistentă
posedă o genă (eucariotă) străină (cuplată cu plasmid cu markeri de rezistenţă). Aceste celule
bacteriene cresc pe respectivul mediu sub formă de colonii în care există un număr de ordinul
a sute de milioane de celule bacteriene cu genă eucariotă, deci fiecare celulă bacteriană dintr-o
colonie rezistentă la antibiotice conţine o genă eucariotă. Aceste celule bacteriene au fost
transformate.
Prin tehnologia genetică de transfer de gene de la eucariote la procariote s-au obţinut
următoarele sinteze:
- somatotropina (hormon de creştere uman) (1979)
- interleukina umană (1980)
- interferon leucocitar de fibroblaşti (1980).

Gene de la eucariote transferate la eucariote

Gene umane (responsabile de sinteza unor produse metabolice) au fost transferate în
celule de drojdii; acestea, după integrarea în genomul lor a genelor umane, au putut sintetiza
produse metabolice umane. În prezent drojdiile se folosesc în acest scop pe scară largă în
industria farmaceutică.
Gene umane au fost inoculate şi în culturi de celule de mamifere. De pildă, gena umană
(de pe cromozomul 10) responsabilă de sinteza factorului VIII al coagulării a fost clonată şi
transferată în celule renale de hamster, celula de hamster începând să sintetizeze produsul
acestei gene, adică factorul VIII de coagulare, necesar în tratamentul hemofilicilor; preţul
acestui produs s-a dovedit a fi mult mai ieftin decât al factorului VIII extras din plasma de la
om sănătos.
Pentru cele 4000 de boli genetice umane cunoscute astăzi ca nevindecabile se
preconizează o terapie genetică prin: reperarea genelor mutante responsabile de defectul
genetic şi ulterior, înlocuirea genei mutante printr-o alelă normală. Această terapie este încă la
început; se încearcă introducerea unei gene normale în genomul pacientului şi urmărirea
acestei acţiuni în timp. Acest prim pas reprezintă “adiţia de gene“; principiul acestei metode
este recoltarea de la pacienţi de celule cu defect, injectarea acestora cu gene sănătoase fixate
pe un virus vector, apoi reinfuzarea respectivelor celule la pacient.

11.1.2. Terapie cu gene ţintă (Gene Targeting)

În condiţiile progresului actual al ştiinţelor biologice, există premisele tratării într-un

viitor foarte apropiat a unor boli genetice, infecţii HIV, boli neoplazice. În aceste boli, terapia
cu gene are drept scop introducerea unor gene intacte din punct de vedere funcţional în
celulele cu genă defectă şi apoi exprimarea acestor gene nou introduse.
Din punct de vedere teoretic, terapia cu gene poate fi de două feluri:
ƒ terapie cu gene somatice, în care celulele receptoare de genă intactă sunt celulele
organismului. În acest caz, tratamentul este restrâns doar la pacienţii trataţi, dar rămâne
fără efect asupra descendenţilor;
ƒ terapie cu gene sexuale, în care celulele receptoare de genă intactă pot fi celulele sexuale
sau celula ou fecundată, în acest caz influenţa tratamentului transmiţându-se progeniturii.
Astăzi este însă interzis prin lege transferul de gene la nivelul celulelor sexuale umane;
rămâne practicabilă doar terapia cu gene în celulele somatice. Principiile de bază ale terapiei
cu gene sunt următoarele:

238
 ƒ recoltarea de celule ţintă de la pacient;
ƒ cultivarea şi multiplicarea celulelor ţintă în culturi celulare, în condiţii speciale;
ƒ clonarea genelor sănătoase;
ƒ introducerea în celulele ţintă cu ajutorul unor vectori corespunzători (retrovirusuri) a
unor gene sănătoase;
ƒ selectarea celulelor care conţin gene sănătoase străine şi exprimarea lor;
ƒ multiplicarea celulelor dorite în culturi de celule;
ƒ reintroducerea acestor celule la pacienţi.

a. Terapia cu gene în boli ereditare

Majoritatea bolilor genetice la om sunt determinate de mutaţii punctiforme sau deleţii.
În prezent se studiază posibilităţile tratării, pe baza terapiei cu gene, a următoarelor boli
ereditare:
ƒ boli sanguine de tip talasemie şi meniscocitoză (sickle cell anemia); în aceste boli există o
genă deficitară în sinteza subunităţii tip β-globină din structura hemoglobinei; celulele
ţintă pentru terapia cu gene sunt reprezentate, în acest caz, de celulele stem pentru seria
eritrocitară din măduva osoasă;
ƒ hipercolesterolemia familială; este o tulburare genetică a metabolismului grăsimilor, bazat
pe absenţa receptorilor LDL (lipoproteine cu densitatea scăzută) ai celulelor hepatice.
Anderson şi colab. De la Univ. Houston din Texas preconizează pentru tratamentul acestei
boli realizarea unor ‘neo-organe’ (structuri din materiale artificiale plasate în vecinătatea
ficatului), în care sunt introduse celule hepatice injectate cu gene care au capacitatea de a
atrage colesterolul. Acest ‘neo-organ’ (cu rol de ligand), dacă va fi conectat printr-o reţea
de vase sanguine cu ficatul, va extrage excesul de colesterol din sistemul circulator (unde
colesterolul poate determina tulburări cardiovasculare) şi îl va îndrepta prin reţeaua
sanguină către ficat, care îl va elimina;
ƒ distrofia musculară Duchenne; se manifestă printr-o topire rapidă a masei musculare;
boala apare ca urmare a inactivării genei responsabilă de sinteza distrofinei. Această
inactivare este consecinţa inserţiei, în exonul 48 al respectivei gene, a unui retrotranspozon
L1;
ƒ mucoviscidoza (fibroza chistică) este o boală genetică recesivă care afectează pancreasul
exocrin; se caracterizează prin creşterea consistenţei secreţiei pancreatice având drept
consecinţă obturarea glandelor exocrine şi formarea de chisturi pancreatice cu distrugerea
ţesutului pancreatic şi scăderea nivelului enzimelor pancreatice. În această boală este
prezent şi un deficit funcţional al enzimei mitocondriale NAD- dehidrogenaza cât şi o
creştere intercelulară de ioni de Ca++;
ƒ boala imunodeficienţei combinate severe (SCID) cu deficit funcţional al limfocitelor T
(prin absenţa enzimei adenozindezaminaza A şi B). Această boală este foarte rară, până
astăzi fiind descrise numai 50 de cazuri în literatura de specialitate. Absenţa respectivei
enzime determină scăderea capacităţii de apărare a organismului şi moartea copilului în
primul an de viaţă.
Epoca terapiei cu gene a început în septembrie 1990 în SUA, când Francis Anderson,
şeful secţiei de Hematologie Moleculară de la Naţional Heart, Lung and Blood Institute al
Universităţii Houston Texas, şi medicii Michael Blaese şi Kenneth Culver de la Naţional
Cancer Institute au efectuat prima terapie cu gene tocmai într-un caz cu deficit funcţional de
limfocite T. Procedeul a constat în recoltarea de limfocite T de la copilul bolnav; aceste
limfocite au fost cultivate şi multiplicate în culturi celulare. Cu ajutorul unui vector, aceste
celule T din culturi au fost inoculate cu gene pentru enzima adenozindezaminază. Apoi aceste
limfocite inoculate au fost cultivate şi multiplicate mai departe în culturi celulare, fiind apoi
reinfuzate i.v. la acelaşi copil. Acest tratament va trebui repetat în cursul vieţii pacientului.
Cu referire specială la utilizarea retrovirusurilor drept vectori de gene, trebuie menţionat
că Richard Mulligan de la Massachusetts Institute of Tehnology a imaginat o metodă eficace

239
de prelucrare prealabilă a acestui virus. Această prelucrare constă în eliminarea prealabilă a
majorităţii genelor virale din structura acestuia şi combinarea ulterioară a segmentului de
virus rămas cu genele care urmează să fi injectate în celulele umane. În acest fel, virusul lipsit
de majoritatea genelor proprii devine inofensiv, deposedat fiind de capacitatea infecţioasă,
păstrând însă capacitatea ca, o dată introdus într-o celulă, să-şi poată îngloba încărcătura
genetică în aceasta.
Retrovirusurile reprezintă astăzi uneltele cele mai larg utilizate în ingineria genetică.
Retrovirusurile sunt mai mici decât celelalte virusuri şi, spre deosebire de acestea, nu ucid
celulele pe care le contaminează. Fenomenul prin care retrovirusul vector transportă şi fixează
o anumită genă în nucleul unei celule ţintite poartă numele de transducţie.
Pentru terapia genică, alegerea celulelor ţintă este foarte importantă. Iniţial s-a încercat
folosirea celulelor stem (celule-tulpină) din măduva osoasă, dar aceste celule s-au dovedit a fi
ţinte foarte dificile, fiind foarte greu de obţinut; proporţia acestor celule stem în ţesuturile
medulare este mai mică de 1/10000 şi nu există nici o metodă adecvată de separare a celulelor
stem de celelalte celule. În plus, fenomenul de transducţie poate avea loc doar în celule care
se divid, or celulele stem, se divid foarte rar, deci transducţia în aceste celule este practic
imposibilă.
De aceea, deşi celulele stem au o durată de viaţă infinită în comparaţie cu limfocitele (
cu viaţă doar de câteva luni), au fost preferate limfocitele drept celule ţintă pentru vectori.
Pentru a fi ‘altoite’ cu retrovirusul transductor, limfocitele sunt puse în contact, într-o
mixtură cu acesta, într-o cultură de celule; în câteva ore virusul va pătrunde în majoritatea
acestor limfocite, care apoi vor fi infuzate pacientului. Este posibil ca limfocitele corectate
(prin injectare cu virus vector + gena pentru sinteza enzimatică) să asigure un timp, cel puţin
parţial, un anumit nivel imunitar organismului.

b. Terapia cu gene în infecţia HIV

Anderson şi colab. Împreună cu R. Gallo (National Cancer Institute) preconizează
tratamentul cazurilor de SIDA prin terapie ţintită cu o genă pentru sinteza unei proteine
receptoare CD4 pe suprafaţa limfocitului. În prezenţa respectivei gene, limfocitele ar fi
capabile să sintetizeze o cantitate mare din această proteină. Virusul HIV, în primul stadiu al
pătrunderii sale în organism, se fixează pe această proteină de pe suprafaţa limfocitelor.
În cazul în care în sistemul sanguin ar putea exista şi circula o cantitate mare dintr-o
proteină similară, această proteină ar putea fixa virusul HIV, acesta nemaiputând să pătrundă
în celulele sistemului imunitar, ciclul de multiplicare virală intracelulară fiind astfel oprit.

c. Terapia cu gene în boli neoplazice

A fost utilizată întâia oară în melanomul malign. În 1991, două persoane cu forme
avansate de melanom malign au fost supuse următorului tratament: li s-au extras o cantitate de
macrofage pe care s-au grefat apoi vectorii (retrovirusuri) purtători de gene pentru sinteza de
‘factor de necroză a tumorilor ‘ (factor TNF). Factorul TNF este o proteină formată din 157 de
aminoacizi cu rol în captarea şi distrugerea celulelor tumorale şi a substanţelor străine
organismului.
În mod normal, acest factor TNF este sintetizat de macrofage şi eliberat în circulaţie; în
cazul acestor doi pacienţi cu macrofage defectuoase, TNF nu se poate injecta direct în torentul
circulator, deoarece există pericolul diluţiei acestui factor, la locul tumorii nemaifiind posibil
să ajungă o concentraţie suficient de activă de TNF. De aceea, macrofagele extrase şi
întreţinute pe culturi celulare au fost inoculate cu vector purtător de TNF şi apoi reinlocuite la
cei doi pacienţi cu melanom.

240
 11.1.3. Aplicarea metodelor de biotehnologie în agricultură în vederea
obţinerii de organisme transgenice

Biotehnologiile moderne, aplicabile la plante şi animale, au în vedere obţinerea de

organisme modificate genetic (transgenice), care să prezinte caracteristici îmbunătăţite, în
interesul omului.

a. La plante
Până de curând, cunoştinţele de genetică vegetală se foloseau doar pentru studiul
eredităţii, pentru analiza segregărilor* la descendenţii rezultaţi din hibridizări.
Posibilitatea de a utiliza elementele disociate (ţesuturi, celule) din organisme vegetale,
de a manipula şi cultiva in vitro, în vederea regenerării plantelor, a deschis primele căi de
intervenţie genetică;de asemenea, obţinerea primelor organisme transgenice a deschis noi
perspective în ingineria genetică vegetală.
Organismele transgenice (plante şi animale) sunt organisme care pe lângă înzestrarea lor
genetică câştigă proprietăţi noi, ce se incorporează în genom şi se transmit descendenţilor.

Biotehnologia de hibridare somatică

Această procedură permite hibridări totale sau parţiale, permutaţii de organite
citoplasmatice, fuzionare de protoplaşti (celule fără perete pectocelulozic) chiar de la două
specii diferite. Se obţin hibrizi în afara sexualităţii. Prin acest procedeu se obţine regenerarea
unui număr mare de plante - figurile: 135, 136 şi 137).

Fig. 135 - Etapele de izolare şi cultură a protoplaştilor (după Cachiţă-

Cosma,1984).
241
 Fig. 136 - Prin
fuziunea protoplaştilor
se produc hibrizi
somatici, cibrizi şi
himere (după Badea şi
Raicu, 1984).

Fig. 137 - Prezentare schematică a

principalelor posibilităţi de obţinere a
unor noi varietăţi de plante (după
Brezeanu şi Soran, 1985).
Biotehnologie de haploidizare
Ţesuturi care au suportat meioza (deci
sunt haploide) sau celule rezultate din
pseudofecundaţie provocată sunt introduse în
culturi in vitro.
Există 2 tipuri de haploidizare:
- androgeneza = cultura şi regenerarea
plantelor plecând de la microspori (fig. 138);
- ginogeneza = cultura şi regenerarea
plantelor plecând de la ovul sau de la celule
haploide asociate.

242
 Fig. 138 - Diferite faze ale desfăşurării
androgenezei la Datura innoxia:
1 – structuri embrionare diferenţiate direct din
anteră; 2,3 – plante complet diferenţiate din
antere; 4 – plantă androgenetică în tub; 5 – plantă
androgenetică la ghiveci (după Badea şi
colab.,1987).

Plantele regenerate au un singur set

cromozomial (patern de androgeneză şi respectiv
matern de ginogeneză) şi ar fi rămas sterile dacă
n-ar fi fost puse la punct mecanismele de
autodedublare a acestor cromozomi. Prin aceste
metode de haplodiploidizare se crează plante
diploide perfect homozigote (linii izogene) şi de
utilitate majoră în ameliorarea calităţii speciilor
de plante (descendenţi absolut omogeni în
anumite condiţii de reproducere) (fig. 139).

Fig. 139 - Obţinerea de plante

haploide, linii izogene şi mutante la
nivel haploid prin cultura in vitro a
gametofiţilor.

Biotehnologie de transfer
Un exemplu a fost menţionat la
capitolul despre tipurile de transfer de
gene procariote la eucariote în scopul
obţinerii de specii de plante (bumbac)
rezistente la insecte. Primele
organisme transgenice prin
biotehnologie de transfer s-au obţinut
la cereale: la orez în 1988, la porumb
în 1990, la grâu în 1992.
Spre aceste trei specii de cereale,
care reprezintă circa jumătate din
necesarul de substrat alimentar pentru
alimentaţia populaţiei globului cu
proprietăţi cât mai adecvate, prin
folosirea tehnologiei genetice.
În general se urmăresc obţinerea
următoarelor proprietăţi în noile organisme transgenice:
ƒ fixarea azotului din atmosferă;
ƒ rezistenţa la infecţii virale, bacteriene, vegetale, insecte;
ƒ toleranţa la uscăciune, temperatură nefavorabilă, metale grele, concentraţie crescută de
Na în sol, ierbicide;
ƒ creşterea producţiei de substanţe nutritive, creşterea cantităţii de acizi graşi nesaturaţi;
ƒ izolarea din plante a substanţelor cu proprietăţi farmaceutice.

243
 Până în prezent au fost obţinute noi soiuri transgenice de roşii, grâu, tutun şi petunii,
rezistente la uscăciune, căldură, metale grele, grad înalt de salinitate şi rezistente la
insecticide. În anul 1992 erau raportate 40 de soiuri noi de plante transgenice. În timp ce
pentru o cultivare de plante clasice sunt necesari zece ani, pentru obţinerea unui nou caracter,
în cazul utilizării tehnicilor genetice, acest interval scade la şase ani. În 1994, în SUA a fost
proiectată crearea unor soiuri de plante transgenice rezistente la ierbicide, în timp ce
buruienile rămân sensibile la ierbicide.
Obţinerea de noi soiuri de plante rezistente la infecţiile virale se realizează prin:
ƒ integrarea unei părţi din ADN viral în genomul plantei; prin aceasta, exprimarea proteinei
de înveliş viral va asigura rezistenţa plantei la respectivul virus;
ƒ inhibarea replicării virale prin tehnica antisens (1992).
În 1993, în SUA au fost obţinute soiuri de roşii transgenice prin metoda de inhibare cu
ARN antisens, care a oprit sinteza enzimei poligalacturonaza, responsabilă de compunerea
peretelui celular al tomatei. În aceste condiţii, tomatele pot fi culese când se află la punctul
favorabil al coacerii şi se pot păstra şase-opt săptămâni fără a fi puse la rece.
În 1995, în SUA se prevedea obţinerea de noi soiuri de plante transgenice rezistente la
insecte, care să fie livrate pe piaţă în următorii zece ani.
Pentru viitor, trebuie luate în considerare anumite riscuri care apar drept consecinţă a
apariţiei unor variante de specii vegetale. Pentru acest motiv oamenii de ştiinţă vor trebui să
folosească cu multă grijă şi măsură aceste posibilităţi moderne ale biotehnologiei.
Dintre riscurile posibile, se pot enumera:
ƒ pierderea diversităţii lumii vegetale, având drept consecinţă dezechilibrul ecosistemelor;
ƒ deşteptarea unor gene ancestrale nedorite;
ƒ riscul dezvoltării explozive a unor ‘patotipuri’ adaptate în mod special;
ƒ restrângerea gamei de calităţi organoleptice naturale ale unor noi sorturi de legume şi
fructe;
ƒ noi biosinteze, neprevăzute în prezent;
ƒ posibilităţi de biosinteze nedorite de acizi graşi, glucozide, alcaloizi, enzime, hormoni
(produse vegetale);
ƒ dezechilibre nutriţionale.
Prevenirea riscurilor menţionate mai sus cere multă prudenţă cât şi anticiparea
remediilor posibile înainte de crearea noilor variante. În acest sens se recomandă:
ƒ evitarea difuzărilor tipurilor omogene şi uniforme de vegetale pe suprafeţe foarte întinse;
ƒ efectuarea detailată a analizelor de structură şi control în faza precoce a noilor variante ale
unui sort vegetal;
ƒ încheierea de acorduri internaţionale pentru înfiinţarea unei comisii de etică cu posibilităţi
de control permanent, etapă de etapă, asupra varietăţilor nou-obţinute.

b. La animale
S-au obţinut crapi transgenici prin transfer de gene de creştere de la creştere de la
păstrăvi; aceste noi organisme transgenice au avut o viteză mult mai mare de creştere decât
organismele noi organisme transgenice au avut oviteză mult mai mare de creştere decât
organismele normale.
La porci au fost transferate gene responsabile de sinteza hormonului de creştere, în
vederea obţinerii unor organisme transgenice cu metabolism activat, cu o eficienţă înaltă de
utilizare a hranei şi cu o creştere foarte rapidă.

244
 11.1.4. Ingineria genetică utilizată în prepararea de noi conservanţi
alimentari

Nizina, substanţă din categoria lantibioticelor, şi-a găsit o foarte largă aplicabilitate
practică în industria alimentară; astfel, în 1989, nizina era utilizată drept conservant alimentar
în peste 50 de ţări de pre glob.
Nizina este produsă de tulpinile de Lactococcus lactis 6F3, ATTC 11454 GR. 4
Lancefield; în concentraţie mai mică de 30 µl/ml inhibă dezvoltarea diferitelor specii de
germeni gram-pozitive , prezentând activitate inhibitorie maximă la un pH mai mic de 5,5.
Nizina inhibă de asemenea sporularea la bacterii din genul Clostridium şi Bacillus, dar nu are
nici un efect asupra majorităţii bacteriilor gram-negative şi nici asupra fungilor şi levurilor.
Din 1951, nizina este folosită în industria alimentară pe scară internaţională, drept
conservant natural pentru vegetale, fructe, brânzeturi proaspete şi procesate, carne, peşte,
cacao, băuturi alcoolice (vinuri). Această largă utilizare se datoreşte faptului că nizina
prezintă marele avantaj de a nu avea efecte nocive asupra organismului viu, în comparaţie cu
nitraţii şi nitriţii (folosiţi tot drept conservanţi), care prin producerea de nitrozamine au
acţiune carcinogenă asupra organismelor. Pentru produsele în care nu se poate renunţa total la
adaosul de nitraţi (nizina fiind ineficientă asupra florei gram-negative), cantitatea de nitraţi
poate fi redusă considerabil, prin utilizarea lor asociată cu nizina. Nizina prezintă şi avantajul
de a fi hidrolizată complet de către proteazele tractului digestiv uman, neproducând nici o
dereglare a florei intestinale gram-negative. Totuşi în prezent se consideră că posibilităţile de
utilizare ale nizinei drept conservant alimentar sunt încă limitate din cauza slabei ei
solubilităţi şi a stabilităţii scăzute la pH neutru; în prezent ea poate fi utilizată drept
conservant activ în alimente cu pH-ul mai mare de 6,5.
În perspectiva dezvoltării biotehnologice, se preconizează obţinerea prin procedee de
inginerie genetică şi proteică a unor variante de nizină cu spectru larg de activitate, variante ce
vor putea fi utilizate drept conservante într-o gamă mult mai largă de produse alimentare,
evitându-se astfel nocivitatea altor conservanţi alimentari asupra sănătăţii publice.
În ultimii ani, prin studiile de micribiologie au fost identificate tulpini microbiene care
printr-un proces de bioconversie microbiană/enzimatică acţionează asupra acizilor graşi (acid
linoleic şi linolenic) şi esterilor, ambele clase de substanţe derivate din uleiuri vegetale,
ducând în final la obţinerea unor arome naturale (lactone şi metilketone) cu utilizare largă în
industria alimentară.

11.1.5. Ingineria genetică şi rezolvarea unor probleme de ecologie

Posibilităţile tehnologiei genetice au importanţă nu numai pentru dezvoltarea cercetării

fundamentale, a dezvoltării ştiinţelor medicale şi agriculturii, ci şi pentru rezolvarea în viitor a
unor probleme ecologice, de exemplu creşterea sintezei unor resurse naturale din mediu.
Multe tulpini bacteriene de Pseudomonas putida posedă un plasmid responsabil de
descompunerea hidrocarburilor din petrol, aspect ce semnifică posibilitatea unei mai bune
utilizări a petrolului brut natural. În acest sens, se încearcă în prezent obţinerea unei bacterii ‘
îmbunătăţite’, al cărei plasmid să crească eficienţa utilizării petrolului brut.

11.2. Alte aspecte ale biotehnologiei moderne şi perspectivele secolului XXI

Progresele recente în cunoaşterea la nivel molecular a interacţiunilor extra- şi intra-

celulare, mediate de clase specifice de molecule şi semnale au contribuit la construirea unui
fundament pentru elaborarea viitoarelor strategii de sinteză a unor noi agenţi terapeutici cu
următoarele calităţi:

245
ƒ eliberarea ţintită (situs-specifică) în circulaţie
ƒ prelungirea timpului de înjumătăţire
ƒ efect prelungit la locul de acţiune
ƒ efecte benefice mărite asupra organismului.
În acest sens există deja o metodologie pentru obţinerea unor proteine-himere, cu
aplicabilitate practică în domeniul terapiei:
A. anticanceroase
B. antivirale
C. cardiovasculare
D. în boli metabolice.

A. Terapia anticanceroasă
În prezent, terapia anticanceroasă cu citostatice este nesatisfăcătoare într-un număr mare
de cazuri din cauza:
ƒ dezvoltării rezistenţei la droguri
ƒ efectelor secundare nocive (imunodepresie medulară, toxicitate hepatică şi renală etc.).
Ţinând seama de aceste considerente, cercetătorii şi-au propus:
ƒ îmbunătăţirea gradului de acţiune selectivă a drogului, înţelegând prin aceasta o acţiune
cât mai ţintită asupra celulelor tumorale, bazându-se pe achiziţiile cele mai recente ale
biologiei moleculare;
ƒ minimalizarea cât mai mult cu putinţă a efectelor toxice secundare ale drogurilor, în cursul
distribuţiei acestora în organismul bolnav.
Pornindu-se de la aceste elemente, s-a încercat construirea unor noi molecule cu
potenţial antiumoral, şi anume:

a. Inhibitori ai topoizomerazelor
Topoizomerazele sunt enzime destinate a modifica structura spaţială a ADN-ului înainte
de replicare, suprimând superrăsucirile dublului helix.

b. Molecule active pe tubulină (antimitotice)

Au acţiune antimitotică împiedicând diviziunea celulară prin stabilizarea microtubulilor
(spre diferenţă de Vinca, alcaloizi care determină depolimerizarea tubulinei). Dintre
antimitotice, taxolul a fost testat experimental prin administrare intratumorală în tumori
vezicale la şoarece. Acesta s-a dovedit foarte eficace în asociaţie cu alte antimitotice curente,
prezentând sinergie cu metotrexatul şi adriamicina. Derivaţii de platină reprezintă astăzi o
clasă foarte studiată de antimitotice; dintre acestea, pentru cisplatină şi carboplatină a fost
demonstrată eficacitatea clinică. Diaminociclohexanul şi axoliplatina sunt în curs de
experimentare şi nu au atins încă faza de testare clinică; sunt platine liposolubile care se pot
administra cu ajutorul liposomilor.

c. Substanţe antiangiogenice
S-a studiat rolul factorului de creştere fibroblastic (bFGF) asupra mecanismelor de
angiogeneză (geneza vaselor sanguine) şi consecinţa acesteia asupra metastazării. S-a
constatat că acest factor bFGF are o acţiune de stimulare a proliferării celulelor endoteliale de
activare a angiogenezei (neoformaţie de vase sanguine).
Pentru contracararea acţiunii bFGF, a fost sugerat un mecanism de blocare a receptorilor
celulelor endoteliale cu ajutorul unor analogi ai heparinei, peptide antagonice, anticorpi. Pe
modele experimentale s-a demonstrat şi eficacitatea ologozaharidelor sulfatate, care, blocând
receptorii celulelor endoteliale, opresc fixarea bFGF pe respectivii receptori, împiedicând în
consecinţă angiogeneza şi inhibând simultan adenoamele experimentale (de pancreas, sân,
prostată) de origine umană.

246
 Se pare că aceste substanţe antiangiogenice acţionează prin oprirea dezvoltării de noi
vase sanguine şi nu prin distrugerea celor formate; deci opresc neoformaţia şi, în consecinţă.
metastazarea.

d. Inhibitori de kinaze
Sunt inhibitori ai tirozinkinazei proteinkinazelor, tioindolului, inhibă autofosforilarea
bFGF (via tirozinfosforilare); prin inhibarea acţiunii bFGF este oprită proliferarea
fibroblastelor, fiind astfel inhibată dezvoltarea metastazelor (prin inhibarea neoformaţiei de
vase de sanguine).

e. Substanţe antisens
Studiul acestor substanţe a fost posibil datorită cercetărilor de biologie moleculară;
acţiunea lor a fost urmărită până în prezent pe linii celulare, ţintele principale de acţiune a
acestor substanţe dovedindu-se a fi:
ƒ gena oncogenă c-myc (pentru substanţele AACR 1833, AACR 3154. AACR 3668, AACR
3672, AACR 3679)
ƒ proteinele p120 (pentru substanţele AACR 1832, AAXR 3155)
ƒ proteinele p53 (pentru substanţele AACR 3630, AACR 3668).
În prezent sunt studiate metodele de inoculare cele mai eficiente a acestor substanţe în
organismul bolnav, căutându-se a se ameliora penetrabilitatea lor în celule.
Pentru a se înţelege mecanismul de acţiune (‘’controlul’’) al ciclului nucleic antisens
asupra unui proces de oncogeneză (“expresie oncogenă“), trebuie amintit mai întâi că
transformarea celulelor normale în cellule maligne reprezintă un proces în mai multe etape:
ƒ activarea protooncogenelor
ƒ inactivarea genelor supresoare de tumori
ƒ inactivarea genelor de reparare a ADN.
Pornind de la aceste aspecte, astăzi sunt urmărite următoarele obiective:
ƒ descompunerea unor droguri care să poată inhiba selectiv efectele biologice ale produşilor
oncogeni
ƒ restabilirea funcţiei factorilor supresori de tumori şi a genelor pentru repararea ADN-ului.
Majoritatea drogurilor existente în prezent acţionează la nivelul proteinelor. Chiar şi
drogurile anticanceroase care interacţionează cu ADN îşi exercită acţiunea biologică prin
inhibarea enzimelor (topoizomeraze) care procesează ADN. Modul cel mai simplu de a
corecta activitatea acidului nucleic este cel de a folosi tocmai acid nucleic; pornindu-se de la
această idee, s-au preparat fragmente scurte de acid nucleic (oligonucleotide), care să se lege
selectiv de o secvenţă complementară a unui acid nucleic unic lanţ (un ARNm sau un ARN
viral). Acest oligonucleotid (antisens) blochează, prin legarea lui de ARN-ul ţintă (target),
translaţia sau respectiv reverstranscriptaza ARN-ului (viral) ţintă. Oligonucleotidele antisens
sunt fosfodiesteri naturali care au diferite mecanisme de acţiune. Oligonucleotidele antisens
de tip oligofosfotioaţi se folosesc şi în tratamentul leucemiilor şi al infecţiilor cu HIV. Un
oligoribonucleotid (ribozim) ARN se leagă de o secvenţă complementară a ARN ţintă, ca şi
oligonucleotidul antisens, dar poate include în plus şi clivajul catalitic al ARN ţintit.

f. Strategia “ de sens” cu structuri oligonucleotidice

În 1980 a apărut o nouă strategie şi anume cea a antigenelor în care oligonucleotidul are
drept “ţintă” un ADN dublu helical, pentru a forma în final un triplu helix la nivelul căruia
este blocată transcrierea (ceea ce reprezintă blocarea primei etape a expresiei genelor).
Oligonucleotidele pot fi folosite pentru controlul genelor în aşa-numita strategie de sens
(sense approach); este vorba de un oligonucleotid “capcană”, folosit pentru a prinde “în
cursă” un factor de transcriere (de expresie) care duce în final la alterarea expresiei tuturor
genelor de pe respectivul fragment ADN. Rezultă că în comparaţie cu strategiile “antisens”
(tip ribozim), strategia de sens este mai piţin selectivă. Totuşi oligonucleotidele “capcană” pot

247
fi utilizate pentru a prinde “în cursă” exprimarea unui număr de gene din genomul unui virus
sau al unui parazit. Efectul acestor oligonucleotide de strategie de se3ns poate fi deci selectiv
pe un virus sau parazit.

g. Strategia aptamer
Recent a fost elaborat un nou mod de utilizare a acestor oligonucleotide, pe baza
legărilor lor de o proteină a cărei funcţie normală nu implică creo interacţiune cu acidul
nucleic; este vorba de strategia aptamer.
În cadrul acestei strategii, se folosesc oligonucleotidele cu rol de liganzi pentru enzime,
receptori, factori de creştere.

h. Utilizarea anticorpilor monoclonali

Dezvoltarea intensivă a noilor concepte molecular-biologice din imunologia ultimilor 20
de ani a deschis noi perspective în terapia cancerului. Una din problemele dezbătute în prezent
în această direcţie este obţinerea unor proteine de fuziune cu anticorpii monoclonali
recombinaţi, în scopul utilizării acestor noi preparate în imunoterapia cancerului.

i. Proteine de fuziune (anticorpi monoclonali - interleukina IL2)

Aceste proteine de fuziune au fost realizate prin tehnici de inginerie genetică. Anticorpii
monoclonali antitumorali (cu specificitate unică), care, în condiţii de recombinare, poartă
fixate pe molecula lor citokine, direcţionează aceste citokine atunci când sunt introduşi în
organismul bolnav către situs-urile celulelor tumorale corespunzătoare. Aceste proteine de
fuziune (anticorpi-IL2) sunt injectate în organismul bolnav. Construirea acestei proteine
fuzionate recombinate se face în scopul obţinerii unei eficienţe biologice optime, prin
combinarea capacităţii de ţintire unică a anticorpilor monoclonali cu activităţile
multifuncţionale ale citokinelor.

j. Terapie genetică cu gene codificatoare pentru citokine

S-a pornit de la observaţia că citokinele reglează reactivitatea imunologică, maturaţia,
activitatea şi migrarea celulelor inflamatoare. Observaţiile efectuate pe animale de experienţă
au arătat că “o provizie locală” formată din diferite tipuri de citokine infuzate direct, sau
obţinută în urma unei terapii genice cu gene (sintetizatoare) de citokine, poate induce o
imunitate antitumorală puternică de lungă durată şi ocazional, poate determina chiar şi
îndepărtarea unei tumori preexistente.
În 1995, literatura de specialitate semnala existenţa a 19 cazuri clinice la om, supuse
tratamentului cu citokine. Principiul acestei terapii constă în implatarea în organismul bolnav
a unor celule somatice (limfocite) modificate din punct de vedere genetic (limfocite pe care s-
au transferat în prealabil gene codificatoare de citokine); aceste celule limfocitare vor fi foarte
bune vehicule în organismul bolnav datorită capacităţii lor de a prolifera, ca răspuns la
administrarea de interleukina 2 (IL2) sau antigen, cât şi datorită faptului de a putea migra şi
răspândi în tot organismul. Schmidt-Wolf şi colab. (1995) au propus un protocol de terapie
genică bazat pe utilizarea celulelor CIK (celule killer transfectate cu gena IL7) pentru inducere
de citokine IL7. Aceste celule CIK s-au dovedit a fi celule efectoare citotoxice foarte eficiente,
cu efect antitumoral mult mai înalt decât cel al celulelor LAK (celule killer activate de
limfokine standard).

B. Terapie antivirală
Terapie anti-HIV
La începutul anilor 1980 exista în întreaga lume opinia că datorită antibioticelor şi
vaccinurilor va fi rezolvată problema infecţiilor bacteriene şi virale, deoarece aceste preparate
terapeutice reuşiseră mai mult sau mai puţin să ducă la dispariţia acestor infecţii de pe glob.
Dar în 1981 apărea virusul HIV (Human Immunodeficiency Virus), care se dovedeşte foarte

248
curând a declanşa mari epidemii SIDA (Syndrome d’Immuno-Deficience Acquise) pe glob,
creând o panică tot atât de gravă ca şi cea determinată de ciuma bubonică din Europa
secolului al XIV-lea.
În decembrie 1994, datele OMS estimau în lume:
ƒ 4,5 milioane cazuri de boală SIDA declanşată, din care doar 1025073 cazuri înregistrate;
ƒ 17 milioane de persoane infectate (purtătoare de virus) HIV, din care un milion de copii.
În România s-au înregistrat între 1985-1994, 3119 cazuri de boală SIDA, dintre care
2885 la copii şi 234 la adulţi.
La sfârşitul anului 1999, Programul UNAIDS şi al OMS-ului raporta 50 de milioane de
persoane infectate cu HIV de la declanşarea epidemiei de SIDA, din care 16 milioane au
decedat din cauza bolii.
În 1999, numărul cazurilor noi de persoane infectate a fost de 5,6 milioane iar decesele
au atins cifra record de 2,6 milioane de persoane pe glob.
În România, la 30 septembrie 1999 se înregistrau 10000 de persoane infectate cu HIV,
dintre care 6000 deja bolnave.
Trebuie remarcată diferenţa între infecţie şi boală; o persoană poate fi infectată cu virus
HIV fără a fi încă bolnavă. Infecţia înseamnă că virusul HIV, prezintă în organism dar ascuns
în nucleul celulelor limfocitare, se află în “stare dormindă” timp de luni de zile până la 5-20
de ani; persoana este sero-pozitivă, dar nu este încă bolnavă. Boala reprezintă starea
organismului în momentul în care virusul HIV din “stare dormindă” se trezeşte, se multiplică,
invadează organismul, devenind deci agresiv, având drept consecinţă apariţia simptomelor de
boală.
Astăzi infevţia HIV reprezintă o criză majoră de sănătate publică. Conform rapoartelor
OMS, pentru anul 2000 se prevăd pe Terra 30 de milioane de purtători HIV.
Până în prezent oamenii de ştiinţă nu au reuşit să prepare încă un vaccin pentru această
infecţie, din cauza marii variabilităţi a virusului HIV. Această mare variaţie genetică a
virusului a constituit obstacolul major în prepararea unui vaccin HIV.
Pentru a se prepara substanţe terapeutice cu acţiune antivirală au fost necesare întâi
studii de biologie moleculară în vederea determinării structurii virusului HIV şi a ciclului de
viaţă al acestuia.
Virusul HIV face parte din categoria virusurilor ARN (retrovirusuri) care prezintă un
aspect particular de multiplicare. Studiile molecular-biologice au demonstrat că ciclul de viaţă
a HIV în organismul uman cuprinde3 trei etape:
I.- ARN viral se transcrie în ADN în prezenţa enzimei virale revers transcriptaza; acest
aspect reprezintă particularitatea multiplicării acestui virus, şi anume curgerea inversă a
informaţiei genetice din direcţia ARN→ADN
II. - Acest ADN viral (copie după ARN) se integrează în genomul celulei gazdă sub
influenţa enzimei virale integraza;urmează starea dormindă a virusului.
III. - Etapa de transcriere: după tiparul (pattern-ul) ADN viral integrat, se resintetizează
ARN viral şi proteina virală corespunzătoare, dar această proteină primară nou-sintetizată are
lanţuri foarte lungi şi este inactivă. Pentru a deveni activă, această proteină foarte lungă
trebuie secţionată (procesată) de nişte enzime virale numite proteaze. Prezenţa acestor
proteine scurte şi active, cât şi cea a respectivului ARN viral nou format vor duce la formarea
virusului matur care va fi capabil să invadeze alte celule.
Substanţele anti-HIV utilizate până în prezent, de tipul zidovudinului (analogi
nucleozidici) şi derivaţi (dideoxiinozin, dideoxicitidin),acţionează la nivelul etapei I, fiind
inhibitoare ale reverstranscriptazei şi împiedicând astfel conservarea virusului în copii, în
stare dormindă şi integrată în nucleul celulelor, virusul ARN dispărând prin imposibilitatea
multiplicării sale. Dar aceste substanţe terapeutice s-au dovedit a avea efecte toxice foarte
puternice, în special la nivelul sistemului nervos central (SNC). De asemenea, aceste
substanţe au determinat şi dezvoltarea rezistenţei virusului HIV la drog.

249
 În prezent se experimentează o substanţă cu acţiune anti-HIV la nivelul etapei a III-a de
dezvoltare a virusului, şi anume o substanţă care să inhibe proteazele virale, împiedicând
tăierea lanţurilor lungi de proteine inactive. În aceste condiţii, proteina rămânând sub formă
de lanţ lung şi inactivă, virusul matur nu se mai poate forma, dispărând deci posibilitatea de
invadare de către virus a altor celule ale organismului. În 1997 trei companii mari
farmaceutice lucrau la obţinerea unei asemenea substanţe de tip inhibitori ai proteazei
virusului HIV, şi anume:
ƒ firma Merck, Sharp & Dohme - substanţă cod 693541
ƒ firma Hoffmann-LaRoche - substanţă cod Ro-31-8959
ƒ firma Abbott - substanţă cod A-77003
Substratul de preparare a substanţei active părea a fi un material biologic, dar firmele
păstrau secretul de fabricaţie. Rămân încă de rezolvat probleme legate de:
- acţiunile secundare farmacokinetice (toxice);
- dezvoltarea rezistenţei la drog;
- eficacitatea substanţei prin administrare per os .

C. Terapie ţintită cardiovasculară

Se referă la tratamentul cu anticorpi monoclonali antitrombocite umane în cazul
infarctelor, în scopul unei trombolize rapide şi al prevenirii reocluziei. S-au preparat anticorpi
monoclonali (anti Mo-1) fată de receptorul de adeziune al trombocitelor.
Studii in vitro pe câine au demonstrat capacitatea acestor anticorpi de a reduce leziunile
ischemice miocardice postinfarct cu 46% în comparaţie cu animalul martor. Reducerea zonei
de infarct s-a dovedit a fi independentă de severitatea ischimei. S-a observat, de asemenea, o
îmbunătăţire a recanalizării arteriale coronariene, prin injectarea de anticorpi monoclonali
antireceptor trombocite umane (gpIIb şi gpIIIa) şi activarea reocluziei vasculare. Metoda
Anderson pentru liza trombilor vasculari se bazează pe receptorii gpIIb şi gpIIIa, sintetizaţi de
gene din familia genelor “integrine”; aceşti receptori mediază mecanismele de adeziune
(fixare) de fibrinogen, fibronectina, vitronectina, factor Wilabrand, trombospondin.
În cazul implantelor vasculare se preconizează învelirea acestor receptori în strat de
celule injectate cu o genă sintetizatoare de un factor litic care, prin liza cheagului sanguin, să
prevină apariţia trombilor vasculari.

D. Terapie în boli metabolice

Prepararea de liganzi proteici tip lipoproteine
Apolipoproteinelesunt proteine care datorită structurilor lor helicale amfipatice leagă
lipide. Ele reprezintă liganzi pentru receptori specifici.
Apolipoproteinele de densitate înaltă (HDL), prin legarea lor de o mare varietate de
celule (macrofage, hepatocite) şi ţesuturi, joacă un rol esenţial în transportul şi reglarea
metabolismului colesterolului. Se preconizează utilizarea lor în tratamentul
hipercolesterolemiei familiale.

E. Vaccinuri recombinate
În pragul mileniului al treilea, cercetările sunt aproape gata să introducă în practica
medicală tehnologia unei noi vaccinări, cea a imunizării directe cu ADN; ar fi al cincilea tip
de vaccinare cunoscut în istoria medicinii după: vaccinurile vii atenuate, cele cu agenţi
microbieni omorâţi, cu componente purificate şi cele obţinute prin inginerie genetică.
În cadrul tehnologiei vaccinurilor ADN, ADN-ul care codifică o proteină specifică este
cuplat cu elementele genetice de control pentru a se obţine plasmide care se vor replica atunci
când vor fi introduse în bacterii corespunzătoare. Creşterea bacteriilor va duce la producerea
unui număr mare de copii plasmidice din care se separă ADN-ul imunizat pentru a fi folosit
apoi drept vaccin.

250
 În prezent se încearcă prepararea unor asemenea vaccinuri pentru administrare nazală
sau per os, luându-se în considerare faptul că acest tip de vaccin este mult mai sigur, mai puţin
costisitor şi mai uşor de administrat decât vaccinurile convenţionale. Se preconizează că acest
tip nou de vaccin va avea o eficienţă enormă asupra bolilor infecţioase care astăzi dau încă o
rată foarte înaltă de mortalitate, în bolile emergente, bolile reemergente, cât şi în cazurile de
rezistenţă la chimioterapice.
Prin vaccinarea cu ADN existând posibilitatea de a vaccina pentru un număr mare mai
mare de proteine specifice deodată, această vaccinare apare ca o terapie “multidrog”.
Vaccinurile ADN stimulează atât imunitatea umorală cât şi cea celulară ; potenţialul
acestor vaccinuri de a stimula capacitatea citolitică a celulelor T reprezintă un punct de
răscruce în vaccinologie. S-a demonstrat că aceste vaccinuri ADN induc celulele T de tip T1
helper cu efect împotriva virusului HIV. Aceste vaccinuri produc un răspuns imun persistent,
ca şi vaccinurile cu virusuri atenuate, dar fără a exista pericolul recâştigării virulenţei de către
virusul vaccinant. Toate aceste vaccinuri ADN se prepară după acelaşi principiu al
plasmidelor, nefiind necesară de fiecare dată inventarierea unei noi tehnologii, în funcţie de
fiecare agent infecţios. Aceste vaccinuri sunt foarte stabile atât la temperatură scăzută cât şi
foarte ridicată, motiv pentru care se pot transporta la temperatura mediului ambiant fără a fi
necesară refrigerarea.

F. Acţiunea de depoluare a ecosistemelor

În condiţiile creşterii populaţiei globului, a urbanizării şi industrializării, consecutiv cu
lipsa unei educaţii ecologice elementare a populaţiei, necesară pentru conservarea mediului
înconjurător, în ultimii 30 de ani s-a ajuns la un dezechilibru ecologic major care astăzi
ameninţă viaţa pe Terra (defrişări masive, deşertificări întinse, grad foarte ridicat de poluare a
râurilor, fluviilor, distrugerea florei şi faunei marine etc.).
În aceste condiţii , astăzi oamenii de ştiinţă pun tot mai acut problema refacerii cadrului
natural şi a reciclării deşeurilor poluante. În acest context, cercetătorii încearcă să folosească
agenţii microbieni (bacterii) în acţiunea de reducere a poluării solului (pentru dezintegrarea
gunoiului şi a deşeurilor domestice, municipale, industriale) cât ţi a contaminanţilor din
mediul extern. Astfel, după îndepărtarea prealabilă a conţinutului toxic de metale grele (Cd,
Zn, Cu) din gunoaiele menajere, se trece la prelucrarea reziduurilor organice în vederea
obţinerii unei producţii eficiente de compost care să aibă calităţi foarte apropiate de
îngrăşământul natural pentru agricultură.
Acest nou compost îmbunătăţeşte structura solului iar prin conţinutul său în
microorganisme (care au capacitatea de a inhiba dezvoltarea unei flore microbiene
fitopatogene de sol) contribuie la îmbunătăţirea calităţii plantelor şi a recoltelor.
Pe viitor vor continua investigaţiile în vederea detectării unor microorganisme cu
potenţial de degradare şi transformare a poluanţilor din diferite deşeuri materiale.
În vederea progresului rapid în această direcţie se urmăreşte crearea şi aplicarea unei
„tehnologii sensor” care să cuantifice activitatea fiziologică şi biochimică a
microorganismelor.

251
 Capitolul 12

METODE ŞI TEHNICI MODERNE

MOLECULAR - BIOLOGICE ŞI APLICAŢIILE LOR

12. 1. RECOMBINAREA ADN - ului

Teoria stabilitaţii genomului celular a fost zdruciunatǎ în anul 1951, odatǎ cu

descoperirea elementelor transpozabile. Fenomenul destabilizării genomului celular a rǎmas
inexplicabil până în momentul în care a fost posibil studiul moleculei de ADN.
Concentrarea studiilor asupra ADN a fǎcut posibilǎ injectarea genelor cu ajutorul
virusurilor vectoare in celule, deschizînd perspectivele noii terapii cu gene (terapie geneticǎ =
Gene Targeting). Respectivele virusuri (vectoare de gene) cu aspect de ,,ace” sînt introduse
ţintit prin ,,împuşcare” (shotgun) într-un numǎr foarte mare de ,,ţinte celulare”, care includ
linii foarte variate de organisme; Aceastǎ metodǎ a dus la o revoluţie tehnico-ştiinţificǎ a cǎrei
consecinţǎ a fost construirea de noi genotopuri, la toate tipurile de bacterii, plante, animale.
Faptul cǎ informaţia geneticǎ a organismelor vii se gǎseşte acumulatǎ pe helixul ADN,
iar acest material genetic poate fi izolat iar cele douǎ lanţuri ale dublului helix ADN separate
şi apoi fiecare din cele douǎ lanţuri recombinate cu un alt lanţ de ADN străin complementar,
dǎ posibilitatea creǎrii de noi organisme, atît în condiţii naturale,cât şi laborator.
Procese naturale de recombinare ADN (recombinare genetică)
Joacă un rol foarte important în natură, reprezentând un factor evolutiv; existenţa acestor
procese se explică apariţia unor noi specii.
Procese artificiale de recombinare ADN (tehnologia ADN-ului recombinat)
Se realizează în condiţii de laborator, în vederea obţinerii de noi variante de
microorganisme şi plante, printr-un număr de metode ce formează tehnologia genetică,
cunoscute la nivel internaţional sub numele de Genetic Engineering.
Descrierea compoziţiei şi structurii spaţiale a ADN de către J. D. Watson şi Fr. Crick din
anii 1953 au reprezentat cunoştinţele fundamentale care au stat ulterior la baza noilor direcţii
de cercetare, şi anume a tehnologiei genetice. Prima reuşită de recombinare a fost realizată în
SUA în 1970. Aceste tehnici încearcă pe cale artificială combinatrea informaţiei genetice (a
genelor) de la două organisme diferite, în vederea creării unui organism nou cu proprietaţi
prestabile (ţintite); organismele rezultate sunt organismele recombinate care formează astăzi
obiectul unor studii cu implicaţii deosebite în dezvoltarea ştiinţifică şi economică pe scară
internaţională, cu mari perspective de viitor.
Aceste tehnici de recombinare genetică stau la baza cercetărilor fundamentale şi aplicare
în biologia moleculară, farmacologie şi în medicina viitorului, în scopul ameliorării
diagnosticului şi terapiei medicale într-un număr mare de boli. Aceste tehnici vor avea
implicatii majore şi în dezvoltarea agriculturii, în ceea ce priveşte crearea unur specii noi de
plante cu o mare eficienţă economică.

12.1.1. Principiul recombinării

Un proces natural de recombinare genetică există la organismele eucariote (cu set

diploid de cromozomi) în cursul meiozei (diviziune reducţională). Meioza are loc în celulele
germinale şi duce la reducerea setului dublu de cromozomi (set diploid) în set haploid
(simplu). În prima fază se produce un schimb de fragmente cromatidiene între cromozomi
omologi (M/P=materni/paterni) alăturaţi printr-un fenomen de ,,crossing-over”, ceea ce
reprezintă un fenomen de recombinare genetică.

252
 Într-un organism diploid cu un anumit număr de perechi de cromozomi omologi şi o
singură pereche de cromozomi sexuali, fiecare cromozom în interfază apare format din cîte
două cromatide (iar fiecare cromatiodă la rîndul ei dintr-o moleculă de ADN dublu helix). Prin
încrucişarea cromatidelor (crossing-over) pe locul de încrucişare, lanţurile duble ADN ale
celor două cromatide vor fi tăiate, vor interschimba fragmente de ADN, iar apoi capetele
tăiate se vor lega altfel, rezultând cromatide recombinate (molecule ADN recombinate). La
cromozomii umani există în medie două-trei asemenea fenomene de crossing-over şi
interschimburi de fragmente ADN pe ambele cromatide ale unui cromozom. Aceste procese se
produc atît de exact, încît nu se pierde nici un nucleoid. După interschimburile între
cromatidele cromozomilor omologi se produce separarea acestor cromozomi cu cromatidele
interschimbate şi împarţirea lor între cele două celule fiice.
În faza a II-a a meiozei urmează separarea cromatidelor în patru celule germinative
mature. Aceste patru celule pot conţine:
ƒ c1 = numai material matern
ƒ c2 = numai material patern
ƒ c2 şi c3 = material cromatidian recombinat (rezultat din fenomenul de
crossing-over) matern şi patern.

12.1.2. Procese artificiale de recombinare ADN (Genetic Engineering)

Cu ani în urmă era posibilă doar cercetarea indirectă a ADN-ului asupra produselor
ARN şi proteice, sau analiza genetică foarte laborioasă asupra funcţiei genelor prin cercetarea
aspectelor fenotipice ale organismelor mutante şi ale progeniturii acestora. Tehnologia ADN-
ului recombinat, care a apărut în jurul anilor ’70, a revoluţionat biochimia, oferind
posibilitaţile cele mai eficiente pentru analizarea şi modificarea genelor (ADN) şi proteinelor
din organismele vii. Pe baza acestei tehnologii, astăzi poate fi modificat într-un mod dinainte
stabilit şi ţintit bagajul genetic al organismelor. Tehnicile de recombinare ADN stau la baza
progreselor biotehnologiei moderne, aceste tehnici vizînd direct informaţia genetică a
organismelor, utilizarea acestor metode putînd duce în viitor la înfrângerea barierei între
specii. Prin procedeele de inginerie genetică se poate obţine, prin introducerea unei informaţii
genetice într-un organism, un organism cu priorietăţi noi (de exemplu, obţinerea de noi soiuri
de plante cu rezistenţă crescută şi agenţi dăunători).
Tehnologia ADN recombinant presupune următoarele etape:
ƒ tăierea lanţurilor duble ADN în fragmente specifice, prin acţiunea enzimelor de restricţie,
astfel încât să fie obţinute în final fragmente ADN de lanţ unic; pe această cale,
moleculele ADN cu greutate moleculară înalta sînt tăiate în molecule cu greutate
moleculară mult mai mică. Concomitent cu ADN-ul de cercetat, vectorul (virusul) este
supus şi el acţiunii aceloraşi enzime de restricţie, pentru că, în final, pe ambele lanţuri de
acid nucleic (lanţ unic de cercetat şi lanţ unic al vectorului), să se obţină acelaşi tip de
capete adezive:
ƒ fragmentul de acid nucleic de cercetat, cît şi cel al vectorului se leagă covalent (în cursul
unui process de circularizare) în prezenţa ADN-ligazelor
ƒ introducerea, o data cu vectorul, a respectivului fragment de ADN selecţionat şi fixat
pe vector în celula gazdă (celula bacteriană avirulentă de Esch. coli K12)
ƒ multiplicarea sincronă, o data cu celula gazdă, a vectorului şi a fragmentului ADN străin
încorparat în genomul celulei gazdă. Apar în consecinţă un număr mare de celule
purtătoare de copii identice de ADN recombinat. Acest process poartă numele de clonare.
În cadrul acestui proces, celula bacteriană astfel ,,nou construită” (cu ADN recombinat)
ƒ reprezintă celula cap de colonă.
Construirea unui genom nou prin introducerea unei secvenţe ADN străine în genomul
unei celule gazdă (de exemplu, bacteria, organisme multicelulare) reprezintă de fapt tehnica
de inginerie genetică prin care se obţin genomuri modificate ce pot fi ulterior exprimate

253
(transcrise şi translaţionate) de către celula gazdă, prin sinteza de noi proteine (caractere noi
cîştigate de celula gazdă).
Termenul Genetic Engineering este adesea folosit drept similar celui de recombinare
ADN, din care rezultă un nou genom (prin introducerea, în genomul unei celule, a unei
secvenţe străine de ADN cu autorul vectorului), celula respectivă cîştigă caractere noi. Prin
aceste metode genetice pot fi manipulate, modificate şi interschimbate sau nou recombinate
atît secvenţele codificatoare, cît şi secvenţele de control ale unei gene. Este posibil să se facă
noi combinaţii pentru secvenţele de control ale unei gene şi să se determine în acest fel
exprimarea unei gene dorite, intr-o anumită celulă. Astfel, prin alegerea unei anumite secvenţe
de control, se poate reuşi exprimarea practice permanentă a unei gene altminteri slab activă; în
acest context proteinele, care în cantităţi mari în calula nou construită. Pentru creşterea acestei
cantităţi de proteine se utilizează de regulă fragmente de ADNc (secvenţe codificatoare fără
introni). Dacă se urmăreşte introducerea şi exprimarea unor gene eucariote în bacterii şi
drojdii, se folosesc tot fragmente ADNc deoarece aceste microorganisme nu sînt capabile să
îndepărteze prin fenomene de splicing din ARNm transcris secvenţele de introni.
Etapele metodei de inginerie genetică utilizată în vederea obţinerii unei anumite proteine
în cantitate mare sînt următoarele:
ƒ se porneşte de la matricea ADN;
ƒ se obţine o copie de ADNc (în prezenţa reverstranscriptazei);
ƒ se obţine un lanţ dublu ADN;
ƒ respectivul lanţ dublu ADN este clonat;
ƒ fragmentul ADNc clonat este înglobat în vectorul de exprimare;
ƒ fragmentul ADNc înglobat în vector este introdus în celula receptor o dată cu vectorul;
ƒ în celula receptor se produce transcrierea şi translaţia fragmentului ADNc strain
(introdus), obţinându-se în final sinteza proteinei dorite.
Folosind această metodă s-a reuşit ca celulele bacteriene, drojdiile şi celulele de
memifere să fie aduse în starea de a produce cantităţi mari de anumite proteine ţintă. În acest
fel devine posibilă analiza proteinelor celulare, care, în mod normal se găsesc în organism în
cantităţi foarte mici (doar urme) şi ar scăpa astfel cercetării. Proteinele sintetizate prin această
metodă şi-au găsit utilizare în terapie şi profilaxie.
Pornindu-se de la aflarea expresiei anumitor gene s-a putut ajunge la descifrarea funcţiei
unor proteine cu rol în procesele şi diviziune celulară, prin aceasta creîndu-se bazele pentru
cercetarea şi găsirea cauzelor unor boli genetice.

12.1.3. Elemente de lucru utilizate în tehnologia ADN recombinat

Aceste elemente de lucru sunt reprezentate de:

- enzimele de restricţie;
- ADN-ligazele;
- vectorii.

12.1. 3. 1. Enzimele de restricţie

Sunt endonucleaze de origine bacteriană; ele clivează moleculele de ADN strain (de
exemplu, ADN viral pătruns în respectica celulă bacteriană) fără a cliva însă ADN-ul
bacterian propriu, deoarece ADN-ul bacterian poartă un semn de recunoaştere (un password )
care este reprezentat de nişte situs-uri specifice metilate. Metilarea reprezintă un mecanism de
apărare al celulei bacteriene faţă de propriile endonucleaze; într-o celulă bacteriană, un dublu
helix ADN nou-sintetizat şi metilat numai pe un lanţ este recunoscut ca propriu de către celula
bacteriană, nefiind digerat de endonucleaze, iar în timp metilaze converteşte treptat ADN-
hemimetilat în total metilat. Metilazele recunosc pe lanţul ADN bacterian aceleaşi secvenţe ca
şi endonucleazele.
Nucleazele bacteriene se clasifică în:

254
ƒ exonuleaze care se fixează pe molecula de ADN numai la capătul ei;
ƒ endonucleaze care nu se fixează la extermităţile moleculei ADN, ci se fixează în
interiorul moleculei de ADN, unde produc ruptura (tăierea). În această categorie se
încadrează şi endonucleazele de restricţie.
Endonucleazele de restricţie au acţiuni secvenţial-specifică; se fixează pe o anumită
secvenţă nucleotidică, despicând-o (clivare prin hidroloza legăturii fosfodiesterice)
îndepărtând astfel respectivul segment dublu de ADN. Secvenţele de baze recunoscute de
către aceste enzime sînt palindromice (aceleaşi, dar poziţionate în sens invers pe cele două fire
ale dublului helix ADN), fiind citite de aceste enzime la fel pe cele două lanţuri şi rezultând
un clivaj poziţionat simetric pe ambele lanţuri. Aceste endonucleaze se găsesc în număr mare
la procariote.
S-au descris enzimele de restricţie I, II şi III, dintre care:
ƒ enzimele I şi II recunosc secvenţele specifice şi se fixează pe acestea cu următoarele
particularitaţi:
ƒ enzimele I taie nespecific 100-1000 de perechi de baze, în afara regiunii specifice în
direcţia 5’ Æ 3’ pe lanţul ADN;
ƒ enzimele II au locul recunoaştere, fixare şi tăiere (4-6 nucleoide) de obicei constant deci
au specificitate de secvenţă absolută, motiv pentru care sînt preferate în studiile de
recombinare ADN;
ƒ enzimele III taie nespecific 20-30 de perechi de bază în direcţia 5’ Æ 3’ pe lanţul ADN.
Endonuleozele de restricţie sunt denumite după microorganismele din care se izolează:
ƒ enzime I Eco K şi B (izolate din E. coli);
ƒ enzime II Eci RI (izolate din E. coli); pot recunoaşte situs-urile ţintă ale ADN ului
palindronic, dar în prealabil trebuie să fie rupte perechile de baze care ţin unite cele două
lanţuri complementare ADN
ƒ Bam HI (izolate din Bacillus amilolichefaciens)
ƒ Hpa I (izolate din Haemophilus parainfluenzae)
ƒ Hin + III (izolate din Haemophilus influenzae)
Enzima II au fost supranumite şi, foarfeci moleculari”; ele recunosc o secvenţă de 4-6
nucleotide şi pot tăia cele două lanţuri ale helixului ADN, în mod: simetric, rezultând capete
drepte; asimetric, rezultând capete coezive. Până în prezent s-au purificat peste 90 de enzime
de restricţie.
Un segment de ADN obţinut prin acţiunea unei enzime de restricţie poate fi clivat main
departe în segmente mai mici de către alte enzime de restricţie. Structurile acestor fragmente
finale pot servi drept, amprente” (fingerprints) ale unei molecule de ADN.
Cromozomii complecşi care conţin sute de milioane de bace pot fi astfel secţionaţi şi
apoi cartaţi stabilindu-li-se harta genelor, prin folosirea enzimelor de restricţie.
Prin enzimele de restricţie s-a descris şi un grup special de enzime care au fost numite
izoschizomeri; acestea recunosc aceleaşi secvenţe nucleotidice, deşi fiecare taie asemenea
secvenţe localizate, însă în poziţii diferite pe respectivul lanţ ADN.
Descrierea enzimelor endonucleaze de restricţie a făcut posibilă revoluţia ştiinţifică
biologică şi dezvoltarea tehnologiei ADN recombinat (modificări ţintite în structiura genelor
şi proteinelor şi analiza acestora bazată pe enzimologia acizilor nucleici).

12.1. 3. 2. ADN-ligazele (polinucleoid-ligazele)

ADN-ligazele nu pot lega două lanţuri unice de ADN, ci doar două lanţuri ADN ce
aparţin aceleiaşi molecule ADN duble helix.
Aceste enzime catalizează formarea unei legături fosfodiesterice între gruparea 3’-OH a
unei extermităţi a unui lanţ ADN şi gruparea 5’-fosfat de la extermitatea celuilalt lanţ.
Procesul de legare (linkare) mediat de ADN-ligaze este esenţial pentru sinteza normală a
ADN, procesul de reparare a ADN, procesul de recombinare genetică..

255
 12.1.3.3. Vectorii
Se deosebesc două categorii majore de vectori: A. Vectori de expresie; B.
Vectorispeciali.
Vectorii de expresie
Vectorii folosiţi pentru sinteza unor cantităţi mari de proteine:
- plasmide: factorul F, factorul R, factorul Col;
- bacteriofagi: fagul λ; φ80; fagul µ
- cosmide (fragmente de φ* λ+ plasmid )
- fragemide (φ+plasmid)
- secvenţe de inserţie (SI) 0,8-1,4 kb.

Vectori de transcriere (pentru sinteza ARN):

- plasmid + φ promotor (SP6)
- plasmid +2 φ promotori (SP6 ş T7)

Vectori speciali:
- retrovirusuri
- retrovirus+plasmid Ti

A. Vectori de expresie
a1). Vectori folosiţi pentru sinteza unor cantitaţi mari de proteine.

Plasmidele
Reprezintă o clasă majoră de elemente genetice mobile. Sunt prezente atît celulele
procariote (bacterii), cît şi la eucariote. La procariote sunt molecule de ADN dublu helix
circular din dimensiuni de la două la cîteva sute de kilobaze; reprezintă material genetic
extracromozomial (cromozomi accesorii). Spre diferenţă de ADN-ul cromozomial, esenţial
pentru supravieţuirea celulei, ADN-ul extracromozomial poate disparea la un moment dat din
celulă, fără ca absenţa acestuia să afecteze viaţa celulara. În unele celule pot exista simultan
1*20 copii ale unei plasmide. În celula bacteriană, genomul celular este reprezentat de
materialul genetic cromozomial genetic cromozomial şi extracromozomial (inconstant).
Greutatea moleculară a unui plasmid variază între 1,5-200 x 10 6 daltoni (5% din greutatea
cromozomială).
Un plasmid este constituit dintr-un segment format din una sau mai multe gene, care
imprimă o proprietate sau mai multe proprietăţi celulei bacteriene (de exemplu, rezistenţă sau
multirezistenţă la antibiotice);un segment care asigură transferul plasmidic de la o celulă la
alta (factor de transfer).
În 1976, plasmidele erau definite de Novick drept ,,repliconi stabili moşteniţi în stare
extracromozomială, capabili a se replica independent de cromozom”. În 1981, Dhillon şi
Colob. propun pentru plasmide termenul de ,,repliconi accesori” (neesenţiali), dar astăzi se
ştie că aceşti repliconi joacă un rol important în procesele de selecţie şi de adaptare a celulelor
bacteriene, ca răspuns la modificarile din mediul extern.
Plasmidele s-au dovedit a fi unelte foarte valoroase în cercetarile efectuate în scopul
aprofundării unor procese fundamentale de biologie moleculară (replicarea ADN,
incompatibilitatea).
Astăzi plasmidele sunt considerate ,,entităţi fundamentale ale celulei bacteriene”,
reprezentînd o parte vitală a pool-ului de gene, determinînd potenţialul de adaptare al celulei
gazdă la condiţiile de mediu. Prin cîştigarea plasmidelor, celulele bacteriene au fost înzestrate
cu noi căi enzimatice în cursul evoluţiei. Zestrea plasmidică este un atribut de tulpină (şi nu de
specie).

256
Plasmidele pot fi:
ƒ neintegrate, libere în citoplasma celulei. Se mai numesc şi autonome (de exemplu, factorii
de bacteriocinogenie ColE1 Æ colE8, Col I, Col V). aceste plasmide de replica autonom,
asincron şi mai frecvent decît ADN-ul cromozomial; în acest caz există 10-20 de copii per
celulă;
ƒ integrate (epizomi), inserate în cromozomul bacterian (de exemplu, factori de
bacteriocinogenie pentru sinteza piocinelor). De replica concomitent cu ADN
cromozomial şi există în una-două copii per celulă.
În 1972, Clowes delimita două grupe majore de gene plasmidice (plasmid-borngenes):
ƒ agregate, exclusiv de origine extracromozomială; au potenţial de răspândire foarte larg a
anumitor caractere printe bacterii; s-au dezvoltat primele, din ele derivînd apoi
cointegratele. Sînt sisteme economice pentru conservarea anumitor mesaje genetice care se
transmit masei de celule dar în caz de nevoie, în cursul procesului de adaptare la noi
condiţii de mediu. Una sau mai multe plasmide (neconjugative, de exemplu factorul Col)
se transmit 100% de la o celulă la alta cu ajutorul factorul F (plasmid conjugativ); în cazul
tratamentului celulei receptor cu un factor curing (acridin oranj etc.) se pierde doar
factorul F, dar rămân factorii Col (linkaj reversibil).
ƒ cointegrate reprezintă elemente genetice compuse din doi sau mai mulţi repliconi aşezaţi
într-o continuitate liniară, în care fiecare replicon îşi păstrează independenţa fizică a
replicării deoarece fiecare replicon are propriul său replicator (de exemplu, cointegratul F.
ColV. ColB. trp.cys.)
Cointegratele sunt sisteme funcţionale mai eficiente decît cele ale agregatelor din punct
de vedere al transferului şi stabilităţii caracterelor linkate. În raport cu caracterele fenotipice
exprimate, se cunosc pînă în prezent următoarele tipuri de plasmide:
ƒ de rezistenţă la agenţii microbieni;
ƒ de rezistenţă la raze u.v. (codifică enzime care intervin în mecanismele de reparare a ADN
celular);
ƒ pentru sinteza bacteriocinelor;
ƒ pentru sinteza agenţilor antitumorali: de exemplu, agrocina 84 (sintetizată de tulpina
bacteriană de Agrobacterium radiobacter) cu acţiune bactericidă asupra bacteriei
abrobacter tumefaciens (agent de colonizare, adeziune, hemolizine, enterotoxine, factori
chelatori de ioni de fier);
ƒ codificatoare de enzime ale unor căi metabolice, fixate de azot (de exemplu, la tulpini de
Klebsiella), degradarea camforului, toluenului (tulpina de Pseudomonas);
ƒ plasmide ,,criptice” ale unor caractere somatice (nu au putut fi încă indetinficate).

Factorul F
Este plasmidul care induce conjugarea la bacterii. Acest fenomen presupune un
transfer de material genetic de la celula donoare, la celula receptoare, prin intermediul
factorului F (factor plasmidic-vector), numit şi factor de fertilitate.
Celula donoare conţine factorul F liber în citoplasmă este notată F+, sau inclus în
cromozomi (Hfr); celula receptoare (F-) este celula care primeşte factorul F.
Reiese de aici că trasnferul de material genetic este polarizat de la celula F+ sau Hfr
către celula F-, începând de la capătul 5’ al ADN-ului.

Factorul Col
Reprezintă plasmidul responsabil de sinteza colicinelor (bacteriocine produse de
tulpinile bacteriene de Escherichia coli).
În general bacteriocinele sunt principii actici sintetizate de bacterii, cu acţiune
bactericidă asupra unor bacterii din aceeaşi specie, specii inrudite dar şi foarte îndepărtate.
Bacteriocinele se subdivid în două categorii:

257
ƒ necorpusculare (nonparticulare) cu greutate moleculară mica, de natură chimică
enzimatică, analogi adenin-nucleozidici, proteică dau de natură complexă glicoproteică.
ƒ corpusculară (particulară) cu greutate moleculară mare, prezentînd aspecte omologe cu
diferite, componente fagice defective (capete goale de fagi, structuri de cozi goale sau
pline, cozi fagice incomplete umplute cu un lanţ scurt de ADN).
Printre bacteriocinele cele mai studiate şi mai bine cunoscute astăzi se numără colocinele şi
cloacina DF13. Producerea de bacteriocine se datorează prezenţei plasmidului de
bacteriocinogenie în respectivea celulă bacteriană.
Plasmidul (factor genetic responsabil de sinteza de bacteriocină) poate fi:
ƒ nonintegrat (replicon accesoriu), liber în citoplasmă; de exemplu, factorii Col E1, E2, E3,
E6, EI, EV,şi ColDf 13;
ƒ integrat în cromozom; de exempli, factorul pentru sinteza aeruginocinelor,colicinelor I-2,
V- K94, şi piocinelor.
Plasmidele nonintegrate se subdivid în:
ƒ nonconjugate: se transmit numai cu ajutorul factorului F sau al unui fag transductant, au o
greutate moleculară joasă, între (4,2-8) x 10 8 megadaltoni prezintă un număr mic de
greutate moleculară joasă, de obicei în număr mare de copii (15-60) per ADN
cromozomial (de exemplu, factorii Col E1, E1a, E2, E3, E7, A, K, CloDF13);
ƒ conjugative: se transmit singure prin conjugare, au greutate moleculară (40-80)x10 6
megadaltoni, au un număr, mare de gene funcţionale (100-200), de obicei prezente în 1-2
copii per celulă (de exemplu, factorii Col, Col Ib, Col IB, Col I, Col V).
Structura plasmidelor Col nonintegrate conjugative şi nonconjugative a fost studiată cu
ajutorul endonucleozelor de restricţie; acest studiu a demonstrat că ambele tipuri de plasmide
conţin în structura lor:
- un grup de gene (cluster) ,,rep” esenţial pentru replicarea autonomă; locus-ul de origine
pentru replicarea plasmidului este prezent într-un punct pe această zonă;
- o genă responsabilă de sinteza proteinei (colicină);
- o genă responsabilă pentru sinteza proteinei de imunitate (evidenţiată la plasmidele Col
E1, E2, E3, CloDf13).
Plasmidele conjugative posedă în plus: un extra grup (extracluster) de gene (G – T)
implicate transfer. Acest grup de gene conţine circa 20% din SADN-ul plasmidic.
În general, celulele bacteriocinogene sunt immune la propria bacteriocină datorită
prezenţei de imunitate mai sus mentionate. Ruperea acestei imunităţi se produce doar în
prezenţa unei concentraţii foarte înalte de bacteriocină, acest fenomen purtând numele de
fenomenul de rupere a imunităţii (break-down immunity).
Există însă şi cazuri particulare în care unele bacteriocine (welchicinele) sunt active
chiar şi pe celulele producătoare (în acest caz explicaţia fiind absenţa genei de imunitate pe
plasmidul de bacteriocinogenie).
În funcţie de interrelaţiile de factorul Col cu alţi factori plasmidiali din celula bacteriană,
s-au descris:
ƒ agregate; de exemplu linkajele: F. ColE2 şi Col Ib. Col E1, în ultimul agregat factorul Col
Ib jucând rol de factor de transfer. Aceste aggregate au origine exclusiv
extracromozomială şi posedă un potenţial foarte înalt de răspândire a proprietăţii de
bacteriogenie în populaţia bacteriană;
ƒ cointegrate; de exemplu, combinaţia F. Col V. trp.cys.
Se pare că proprietatea de colicinogenie este mai rar răspândită la tulpinile bacteriene de
origine umană, dar este prevalentă în flora apelor menajere şi în populaţia de enterobacterii de
la animalele domestice. Cu referire specială la rolul plasmidelor de bacteriocinogenie în
organismul uman şi animal, trebuie menţionate următoarele:
ƒ factorul Col v codifică sinteza unui sistem de chelare (fixate, legare şi transport) al
fierului din mediul extern, de către celula bacteriană, ducînd astfel la creşterea virulenţei

258
 bacteriilor. În acest sens, sistemul aerobactinei este considerat astăzi un mijloc crucial de
supravieţuire şi proliferare a celulelor bacteriene invasive;
ƒ factorul Col V conferă tulpinilor bacteriene capacitate de supravieţuire în ser in vitro,
crescând rezistenţa acestora la efectul bactericid al serului;
ƒ factorul Col conferă capacitatea de adeziune celulelor bacteriene pe epiteliul intestinal
(atribut al virulenţei celulei bacteriene);
ƒ la tulpinile de Esch. coli enterale autohtone, factorul Col are rol protector determinând
producerea de colocine cu acţiune îndreptată împotriva unor bacterii enterale patogene (de
exemplu, Shigella), îngreunîndu-le acestora implantarea;
ƒ în culturi celulare s-a remarcat o acţiune de inactivare a toxinei tulpinilor de E coli
enterotoxigene de către colicina sintetizată de alte tulpini de Myzobacterium smegmatis are
o acţiune citocidă asupra celulelor eucariote tumorale (inhibă creşterea celulelor tumorale
umane,animale), dar rămîne fără efect asupra celulelor normale din aceeaşi specie (datorită
selectivităţii de membrană) prezintă agrocina (bacteriocină); tulpinile bacteriene de
Agrobacterium radiobacter produc bacteriocina agrocină 84, capabilă să omoare tulpina
bacteriană Agrobacteruim tumefaciens (purtătoare de plasmid Ti), care determină o stare
canceroasă (boala cocoşului) la plante dicitiledonate. Se presupune că structuri
nucleozidice analogigrocinei 84 cu acţiuni citocidă pe celulele canceroase ar fi mai
răspândite în natură decît se cunoaşte astăzi;
ƒ plasmidele Col sunt considerate a fi entităţi fundamentale pentru multe celule bacteriene
ţinându-se cont de faptul că sunt implicate în multe activităţi celulare.Pe baza cunoştinţelor
actuale despre plasmidele Col se poate aprecia că acestea reprezintă o parte vitală din pool-
ul de gene al speciilor bacteriene. Cele două posibilităţi de linkaj al plasmidelor de
bacteriocinogenie (system aggregate şi cointegrate) pot fi considerate aspecte particulare
ale potenţialului de adaptare în cursul evoluţiei.
Gradele diferite de complexitate prezente de diferitele sisteme de bacteriocinogenie pot
imprima şi explica potenţialul de adaptabilitate al celulei gazdă la condiţiile permanent în
schimbare din:
- datele acumulate pîna în prezent pledează pentru o strînsă relaţie filogenetică între
plasmidele de bacteriocinogenie (factorul Col), pe de o parte şi factorii plasmidiali F şi R,
pe de altă parte;
- prezenţa şi similaritatea genelor ,,kill” şi ,,de imunitate” în plasmide de bacteriocinogenie
şi fagi pledeaza pentru o strînsă interrelaţie în cursul evoluţiei între aceşti determinanţi
genetici;
- fenomenul de bacteriocinogenie este considerat a fi un split-phenotype al răspunsului
celular SOS la agenţi inductori (raze u.v., mitomicina C, acid nalidixic). Genele celulare
rec A şi lex A posedă o capacitate complexă de a regla diferite răspunsuri celulare SOS,
incluzînd aici şi fenomenul de bacteriocinogenie, în scopul asigurării supravieţuirii şi
adaptării celulare la condiţiile de mediu extern. A fost dovedit rolul multiplu de copii
plasmidice autonome/integrate per celulă;
- datele prezente sugerează că fenomenul de bacteriocinogenie semnifică o cale enzimatică
specifică cîstigată în cursul evoluţiei;
- studiul fenomenului de bacteriocinogenie a permis aprofundarea unor aspecte
fundamentale de biologie moleculară (replicarea ADN-ului plasmidic, controlul replicării,
fenomenul de incompatibilitate plasmidială, interrelaţiile evolutive între celula gazdă şi
factorul Col).

Factorul R
Fenomenul de rezistenţă la drog a fost descris de către Ehrlich în perioada anilor1910-
1913. Rezistenţa celulelor bacteriene la antibiotice prezintă două aspecte:
ƒ rezistenţa naturală – proprietate intrinsecă a speciei, stabilă, de natură cromozomială;

259
ƒ rezistenţa dobîndită – caracter cîştigat în urma unei terapii cu antibiotice (prin cîştigarea
de plasmid R, mutaţie, sau în urma unui process de recombinare).
Plasmidele R (factori de rezistenţă multiplă la antibiotice) au fost descries atît la germeni
gram-pozitivi cît şi gram-negativi. Au fost semnalate întîia oară în Japonia, bacilii Gram
negative (Akiba,1959). Factorii R sunt molecule de ADN, dublu catenar formând anse închise
covalent autonome în citoplasma celulară bacteriană. Au sisteme proprii de replicare şi pot
exista în mai multe copii.
Posedă unul sau mai mulţi determinanţi de rezistenţă (markeri). Se pot transfera:
ƒ vertical la descendenţi (ereditate extracromozomială)
ƒ orizontal între specii.
Acest ADN plasmadial codifică sinteza de proteine (enzime) prin intermediul unui ARNm.
Factorii R sunt:
- conjugativi (autotransferabili), au greutate moleculară de 20 x 106 Æ 2000 x 106 daltoni,
sunt alcătuiţi din trei secvenţe nucleotidice cointegrate, şi anume:
ƒ factorul RTF (factor de transfer de rezistenţă similar factorului F) care iniţiază
transferul plasmidului de la celula donoare la celula receptoare;
ƒ factorul codificator al autoreplicării plasmidului (replicator);
ƒ determinanţii de rezistenţă la antibiotice de la 1 pâna la 20 de markeri.
Cu cât plastidele sunt mai mari, cu atât replicarea lor se produce mai lent (I -2
copii/celulă).
- nonconjugativi (netransferabili), posedă un ADN circular, fără factorul RTF, conţinând
numai replicatorul şi determinanţii de rezistenţă. Au greutatea moleculară de 0,5x106 până
la 5,5x106 daltoni, codifică rezistenţa la unul-două antibiotice, replicarea este mai rapidă pe
generaţie, se formează uşor copii multiple.
Transferul plasmidelor R se face între celulele bacteriene, depăşind barierele de specie,
gen şi chiar de familie. Se realizează prin mecanisme de:
- transfer clasic (conjugarea la bacili gram negativi, transducţie la stafilococi şi
transformare)
- recombinare (pe baza omologiei ADN gazdă-ADN străin) prin crossing-over la nivelul
cromozomului bacterian. Acest fenomen de recombinare este foarte rar.
Plasmidele R pot fi pierdute:
- spontan; se pot pierde unul sau mai mulţi markeri de rezistenţă, de exemplu prin
conservarea tulpinilor bacteriene la +4 C câteva luni.;
- sub influenţa unor factori fizici (raze u.v.), chimici (acridinoranj, acriflavină).
Reasortarea plasmidelor R (din punct de vedere al numărului, proprietăţilor si sediului
markerilor) se realizează prin elemente transpozabile tip transpozomi. Transpozomii sunt
elemente genetice mobile ce poartă gene determinate de rezistenţă la antibiotice; ei se pot
exciza dintr-un ADN şi autoinsera în altul (într-un plasmid sau cromozom). Se pot integra
în situs-uri diferite, pe aceeaşi moleculă de ADN. Prin mecanismele lor de translocare
(cromozom-plasmid, plasmid-cromozom) determină un schimb larg de determinanţii R intre
specii.
Au fost descrişi transpozomi care codifică rezistenţa la β- lactamine (penicilina,
ampicilina), la trimetoprim/sulfametoxozol, neomicină/kanamicină, gentamicină/tobramicină,
eritomicină etc. Unii trenspozomi au dimensiuni foarte mari, codificând rezistenţa la un număr
foarte mare de antibiotice.
Referitor la circuitul plasmidelor R în natură trebuie menţionat că flora intestinală
comensală şi saprofîtă (oportunist patogenă) la om şi la animale este izvorul natural de bacili
gram-negativi; la nivelul acestor germeni microbieni are loc cel mai important schimb de
plasmide R între specii. Mecanismele de rearanjare a markerilor de rezistenţă plasmidici şi

260
transferul plasmidic explică formarea rapidă a rezervorului de bacterii multi-rezistente.
Epidemiile apar atunci când aceste plasmide R cu markeri multipli de rezistenţă ajung la
bacterii înalt patogene şi cu înaltă contagiozitate. Răspândirea plasmidelor R este favorizată
de utilizarea necontrolată şi abuzivă a antibioticelor, condiţii ce determină selectarea şi
vehicularea în cadrul infecţiilor intraspitaliceşti a unor tulpini bacteriene cu un spectru foarte
larg de antibiorezistenţă, ce creează mari dificultăţi terapeutice.

Bacteriofagii
Sunt virusuri care infectează bacteriile. Se fixează pe membrana celulei bacteriene, unde
îşi abandonează învelişul proteic, injectându-şi materialul genetic în celula bacteriană.
Virusurile împrumută aparatul metabolismului celular bacterian, pentru propria replicare, sunt
deci paraziţi obligatorii ai celulelor, multiplicându-se pe socoteala acestora. In natură,
virusurile apar în general drept paraziţi obligatorii ai organismelor şi celulelor vii (bacterii,
plante, animale, celule umane). Materialul genetic ai virusurilor constă din ADN sau ARN, în
formă liniară sau circulară închisă. Materialul genetic viral, după injectare în celula
bacteriană, poate evolua pe una din cele două căi:
- poate fi integrat în genomul bacterian (cale lizogenă)
- poate trece imediat la multiplicare folosind aparatul enzimatic de sinteză al celulei
bacteriene gazdă (receptoare). Noii fagi sintetizaţi prin acest ciclu „litic" ,în urma lizei
celulare, sunt eliberaţi în mediul extern, de unde pătrund şi parazitează alte celule
bacteriene.

Fagul λ
Este foarte bine studiat şi utilizat ca vector. Cu ajutorul sistemului proteic reglator este
capabil să aleagă între cele două posibilităţi de evoluţie mai sus prezentate. Alegerea căii de
multiplicare este determinată de starea de nutriţie şi sănătate a celulei receptor (gazdă). Gazda
fagului λ este celula bacteriană de E. coli.; genomul acestui fag este reprezentat de un lanţ
dublu ADN. Din ADN-ul fagului λ poate fi îndepărtată o cantitate de 40% fără ca funcţiile
vitale ale acestui fag să fie evident influenţate. Datorită acestui aspect este posibil ca în fagul
să poată fi introdus ADN străin. Membrana proteică a fagului are o capacitate limitată de
acceptare de ADN, deci cantitatea de ADN străin ce poate fi înglobată este limitată. După
introducerea ADN străin prin membrana proteică fagului λ se poate trece la injectarea acestui
fag (în care este înglobat ADN-ul străin) în celulele bacteriene de E coli.
Bacteriofagii au un sistem propriu de transport pentru fragmentele ADN străine care pot
fi astfel introduse pe cale naturală şi multiplicate în celula gazdă. Fagii lizogeni pot media (ca
şi factorii plasmidici F) schimburi de gene. Astfel fagul λ (ADN) se poate insera pe
cromozomul celulei de E coli între genele gal şi bio. Când se formează virionii progeni,
excizia nu este totdeauna precisă, în acelaşi loc. În unul din 105 virioni, ADN-ul fagului λ
conţine fie operonul gal, fie operonul bio. Infecţia cu asemenea fagi se numeşte λ gal sau
λ bio; ea introduce genele celulei bacteriene de E coli, alături de genele fagului λ într-o nouă
celulă infectată de respectivul fag.

Fagul φ 80
Este înrudit cu fagul; se insera lângă operonul trp şi poate purta gena trp de la o celulă
infectată la alta.

261
 Fagul µ
Se insera în orice loc pe cromozomul celulei de E. coli; transportă totdeauna un
fragment din acest cromozom. Aceşti fagi transductori (ca şi factorul plasmidic F) sunt
elemente genetice mobile care declanşează interschimbul între genele bacteriene,
accelerând în acest fel evoluţia bacteriană.

Cosmide
Sunt plasmide în care a fost introdus un anumit fragment de ADN din fagul λ . Cosmidele
sunt îmbrăcate în membrana proteică a acestui fag. Prin infecţie fagică (pătrunderea fagului în
celulă), cosmidul este injectat în respectiva celulă gazdă. În celula gazdă, cosmidul se replică
apoi ca un plasmid.

Fagemide
Reprezintă o nouă clasă de vectori în care o parte din genomul unui fag cu lanţ unic ADN
(de exemplu M13) este combinat cu un plasmid ADN. Fagemidul se multiplică în celula
gazdă ca un plasmid cu lanţ dublu ADN. Dacă în momentul introducerii fagului se injectează
în celula gazdă şi un fag helper, atunci famegidul se multiplică ca un fag cu lanţ unic ADN.

Secvenţe de inserţie (SI)

Sunt elemente transpozabile. Transpoziţia este fenomenul prin care copii (elemente
transpozabile) ale unor secvenţe specifice de ADN dmtr-un genom, se deplasează de-a lungul
aceluiaşi lanţ de ADN sau pe cel al altui genom, având capacitatea de a se insera pe unul sau
mai multe situs-uri specifice.
S-au descris două tipuri de elemente transpozabile:
- secvenţe de inserţie (SI) cu dimensiuni de 0,8-1,4 kilobaze (kilobaza (kb)=1000 perechi
de baze);
- transpozonii (Tn) cu dimensiuni de 3-20 kb (numiţi şi gene săritoare).

2) Vectorii de transcriere.
Reprezintă o clasă specială a vectorilor de expresie. Se folosesc pentru sinteza ARN.
Prototipul acestor vectori de transcriere este format dintr-un plasmid în care a fost înglobat un
fag, promotor (SP6) sau chiar doi fagi promotori (fagii SP6 şi T7).

Vectorul format din plasmid cu un fag promotor ( φ SP6)

Acest vector poartă numele de SP6. Celula gazdă pentru φ SP6 este celula bacteriană de
Salmonella typhimurium; promotorul φ SP6 reprezintă secvenţa start ADN de unde porneşte
transcrierea (deci sinteza ARNm-ului). în spatele promotorului φ SP6 se găseşte o zonă formată
dintr-un număr de secvenţe nucleotidice (zona MC S= muItiple cloning site), care oferă mai
multe locuri de tăiere pentru multe enzime de restricţie (Fig. 140).

Fig. 140 - Vector format din plasmid şi fag

promotor SP6.

Este de menţionat că zona MCS reprezintă

porţiunea din sistemul vector unde pot fi înglobate de
plasmid noi fragmente de ADN. După tăierea zonei
MCS în două, de către o enzimă de restricţie, şi
262
înglobarea unui fragment de ADN dublu lanţ (fragment ADN sau ADNc) în mijlocul zonei
MCS (fig.134), zona MCS este tăiată din nou de către alte enzime ADNc de restricţie, vectorul
linearizîndu-se (fig.141).

Fig. 141 - Tăierea zonei MCS şi înglobarea

unui nou fragment ADN

Fig. 142 - Vector linearizat

De obicei ADN-ul înglobat este cel care urmează a fi transcris în ARN. Transcrierea cu
ajutorul unui singur fag promotor este unidirecţională.

Vectorul format dintr-un plasmid şi doi fagi promotori (SP6 şi T7).

Acest sistem cu doi promotori este vector bidirecţional, deoarece cei doi promotori
dirijează transcrierea în sensuri opuse (fig. 143 şi fig. 144).

Fig. 143 - Vector format dintr-un plasmid şi doi fagi

promotori

Fig. 144 - Tăierea cu

ajutorul enzimelor de
restricţie a celor două zone
MCS şi transcrierea în sens
opus a celor două lanţuri
ADN cu ajutorul fagilor SP6
şi T7

263
 Pentru utilizarea acestui sistem de transcriere bidirecţională se aleg două enzime diferite
de restricţie; aceste două enzime acţionează pe situs-uri diferite pe zona MCS, după tăierea
prealabilă a acestei zone în două segmente între care a fost înglobat noul segment ADN.
Astfel prima enzimă taie primul fragment MCS între fagul SP6 şi ADN-ul înglobat, iar a doua
enzimă taie al doilea fragment MCS între fagul T7 şi ADN-ul înglobat. Promotorii SP6 şi T7
sunt astfel orientaţi încât primul să conducă transcrierea unui lanţ din ADN dublu-lanţ
înglobat într-un sens iar al doilea promotor, transcrierea celuilalt lanţ ADN (al aceluiaşi ADN
dublu lanţ nou-înglobat) în sens opus (fig. 145). Acest sistem vector cu doi promotori care
acţionează în două sensuri opuse, permiţând transcrierea concomitentă a celor două lanţuri a
ADN (dublu-lanţ) nou-înglobat, se numeşte vector bidirecţional.

Fig. 145 - Tăietura I – Vector linearizat. Utilizarea sistemului SP6 pentru

transcrierea unuia din lanţurile ADN înglobate.

Alegerea vectorilor
Se face după mărimea fragmentului ADN care urmează a fi înglobat într-o celulă.
Lungimea fragmentului ADN sau ARN se stabileşte după numărul de perechi de baze:
1 kb (kilobază) = 1000 baze (sau 500 perechi de baze);
1 mb (megabaze) = 1 milion de baze (sau 500 000 perechi de baze).
Cosmidele se folosesc drept vehicule pentru fragmente foarte mari de ADN (de 30-45
kb). În ultima vreme s-au putut construi cosmide-vectori în care s-au putut îngloba fragmente
mari de ADN de 100 kb - 1 mb, de pildă vectori YAC (yeast artificial chromosome), numiţi
şi minicromozomi. Un vector tip YAC se comportă în celulele de drojdii ca un cromozom care
se dublează înainte de diviziunea celulară, iar, în cursul acestei diviziuni, îşi împarte materialul
ADN între cele două celule fiice. Aceste cosmide ajută la studiul poziţiei genelor pe harta
genetică a cromozomului sau pe fragmente lungi de ADN.
Vectorii de expresie reprezintă vectori construiţi anume care conţin în structura lor multe
secvente de control optim pentru transcrierea şi translaţia genelor. Fiecare fragment de ADNc
străin care va fi înglobat de către vector se va fixa pe acest vector tocmai în apropierea acestei
secvenţe de control (cu rol de promotor); aceasta secvenţă de control (promotor) va porni apoi
transcrierea secventei ADNc strain inglobat. S-au construit un numar mare de vectori de
expresie care să fie propice pentru diferite tipuri de celule. Secvenţele de control nu sunt
aceleaşi pentru diferitele tipuri de celule. Vectorii de expresie trebuie selectionaţi pentru
fiecare tip de celulă în care urmează a fi introdusă o gena straină pentru a se obtine sinteza

264
unei anumite proteine. Astfel, prin alegerea unor vectori de expresie adecvaţi, s-a reuşit
introducerea unor fragmente ADNc străin (de la eucariote) în celula bacteriană şi sinteza
ulterioară a urmatoarelor proteine:
- insulina;
- eritropoetina;
- factorul VIII de coagulare;
- somatotropina;
- activator de plasminogen;
- vaccinuri pentru boli bacteriene şi virale;
- anticorpi monoclonali;
- factori imunologici (factori de necroza a tumorilor, interferon, interleukine);
- hiradin (antitrombotic); până de curând principiul activ se extragea direct din râme.

B. Vectori speciali

b1. Retrovirusurile
Sunt virusuri ARN cu o treaptă ADN în replicare (de exemplu: HIV, VISNA). Multe
retrovirusuri sunt oncogene, putADN determina formarea unor tumori in organismul gazda
(virusul sarcomului Rous, virusul leucemiei aviare).
Retrovirusurile ARN au capacitatea ca, o dată patrunse în organismul celulei gazdă să
declanşeze, în prezenţa reverstranscriptazei, o transcriere inversă, adică de la ARN spre ADN,
determinând astfel sinteza unui ADN dublu lant (după paltern-ul respectivului ARN viral).
Acest ADN dublu lanţ se integrează apoi în cromozomul celulei gazdă (umană sau animală).
Celula poartă în acest fel, integrată în cromozomul ei, informaţia pentru sinteza virusului
ARN, care este declansată însă doar în anumite condiţii.
Retrovirusurile sunt mai mici decat celelalte virusuri; spre deosebire de virusurile ADN,
ele nu ucid (nu lezeaza) celulele pe care le contaminează, motiv pentru care ele sunt folosite
astăzi drept vectori în tehnicile de inginerie genetică şi de terapie genetică, în scopul
transferului unor gene străine în celula ţintă. În aceste cazuri, retrovirusurile joacă rolul unor
carcase pentru transportul respectivelor gene străine către o anumită celulă ţintă.
A fost imaginată o metodă eficace de prelucrare prealabilă a retrovirusului vector
(Richard Mulligan de la Massachusetts Institute of Technology USA), prin care se elimină în
prealabil un număr de gene virale, iar segmentul de virus rămas este combinat apoi cu gene
care urmează a fi injectate ţintit într-o anumită celulă. În acest fel, virusul, lipsit de majoritatea
genelor sale, devine inofensiv, deposedat de capacitatea lui infecţioasa, dar vector de o gena
(de gene) nouă, pe care a fixat-o şi pe care o introduce în celula ţintă (mecanismul de
transductie); injectat în celula ţinta, prin mecanismul de transcriere inversa, retrovirusul vector
declansează actiunea reverstranscriptazei care determină sinteza ADN-ului corespunzator
(replică a ARN-ului vector + gena fixată). Aceasta replică ADN se integrează în cromozomul
celulei gazdă, conferind celulei gazdă o noua proprietate corespunzatoare noii gene fixate.
Retrovirusurile reprezintă astazi uneltele (vectorii) cele mai utilizate în ingineria genetică
pentru transportul de gene către genomul unei celule tintă.

b 2. Retrovirusuri şi plasmidul Ti
Plasmidele Ti se găscsc în bacteriile Agrobacterium tumefaciens din sol. Prin infectarea
unor leziuni ale plantelor cu această bacterie, plasmidele Ti ajunse în celulele vegetale
determină apariţia unei tumori. Deci plasmidele Ti au efect tumorigen.

265
 Prin utilizarea unui vector special, format dintr-un retrovirus şi un plasmid Ti, acesta din
urmă, prin prelucrarea prealabila, pierde capacitatea de a mai produce tumori şi păstrează doar
rolul de vector de gene către o celulă ţintă.

Procesul de transfectie si vectori speciali

În biologia molecularaâă, introducerea unui ADN străin (gene) în celulele organismelor
superioare (plante, mamifere) poartă numele de tranfecţie. Introducerea acestor gene străine în
organismul plantelor sau mamiferelor (animale, om) se face cu ajutorul unor vectori speciali:
plasmide Ti şi retrovirasuri. Dintre aceşti vectori, retrovirusurile reprezintă astazi uneltele
(vectorii) cele mai larg utilizate în ingineria genetică şi terapia genică, prin transport de gene
către genomul unor celule ţintă.
Introducerea acestor gene străine în celule se mai poate face cu ajutorul particulelor de metal
nobil (experienţe balistice biologice), dar aceste metode produc leziuni grave celulei.
Altă metodă constă în supunerea celulei unui câmp electric (electroporare), tratament
prin care respectivele celule devin capabile (permeabile) să accepte macromoleculele din
exterior. Se mai utilizează razele laser care produc orificii foarte fine în peretele celular rigid (la
plante) prin care se injectează apoi molecula de ADN străin.

12.2. HIBRIDAREA
Este o tehnica de recombinare de acizi nucleici, care vizeaza construirea unei molecule
de acid nucleic dublu lant din doua lanturi unice, separate, pe baza complementaritatii bazelor
azotate. Imperecherea de baze complementare se poate face intre:
ADN - ADN
ADN-ARN
ARN-ARN
Totdeauna hibridizarea are loc intre doua lanturi unice de acid nucleic. Hibridizarea se
foloseste ori de cate ori se urmareste identificarea secventelor nucleotidice pe un acid nucleic
(secventa tinta).

12.2.1. Principiu

Se analizeaza o secventa de acid nucleic unic lant (secventa tinta). Analiza acestei
secvente necunoscute se face fata de o sonda genetica (proba de acid nucleic) marcata
(radioactive sau prin alte metode) cu o secventa de baze cunoscute. Daca sonda si secventa
tinta sunt total sau partial complementare din punct de vedere al secventelor de baze
nucleotidice, se formeaza o molecula hibrid de acid nucleic in care se identified secventele
nucleotidice pe secventa tinta, in raport cu bazele (complementare) de pe secventa
nucleotidica cunoscuta a sondei genetice.
Pentru lucru, ADN dublu lant trebuie intai denaturat (supus actiunii caldurii sau
substantelor chimice alcaline) pentru a fi disociat in lanturi unice. Lantul unic va reprezenta
apoi substratul pe care se va efectua hibridizarea cu sonda genetica.

12.2. 2. Denaturarea
Dupa cum s-a aratat, pentru analiza si identificarea secventelor nucleotidice ale unui acid
nucleic tinta, acesta trebuie intai adus la forma de lanturi unice prin denaturare. Denaturarea
reprezinta modificarea structurii acidului nucleic prin tratament cu caldura (temperatura de

266
100"C) sau substante chimice, sau supunerea in mediu alcalin (pH>l 1). Folosind aceste
metode se realizeaza desfacerea legaturii de hidrogen dintre bazele complementare.

a). Denaturarea prin caldura

Reprezinta taierea lantului dublu ADN cu ajutorul temperaturii inalte. Punctul de topire
reprezinta temperatura la care 50% din respectivul acid nucleic dublu lant disociaza in unic
lant. Acest punct de topire poate fi influentat de:
- o zona bogata in guanina-citozina, care cere totdeauna o temperatura mai inalta,
deoarece aceste baze se leaga prin trei punti de hidrogen, in timp ce bazele adenina-
timina
se leaga doar prin doua punti de hidrogen;
- concentratia in NaCl a solutiei; o concentrate scazuta de NaCl determina destabilizarea
moleculei de acid nucleic, aceasta necesitADN o temperatura de topire mai scazuta;
- concentratia cationilor.

b). Denaturarea chimica

Se face prin adaos de substante denaturante (formamida, uree) care determina scaderea
punctului de topire.

12.2.3. Renaturarea (annealing/reannealing)

Reprezinta o hibridizare. Prin scaderea temperaturii sau a pH-ului este favorizata

refacerea gaturilor intre bazele complementare de pe cele doua lanturi unice de ADN - ARN
sau ARN - ADN. Reactiile de renaturare se produc de regula la temperaturi care corespund
unei iferente de 20-30 C fata de temperatura punctului de topire al dublului lant de acid
nucleic. iaca temperatura insa scade brusc, lanturile raman separate.
Cantitatea de acid nucleic unic lant, care prin renaturarea trece in dublu lant, depinde
de:
- concentratia moleculara a acidului nucleic din solutie;
- lungimea moleculei de acid nucleic;
- zona bogata în guanina-citozina; concentratia în NaCl;
- concentraţia de formamida.

12.2.4. Factorul stringent

Este un important factor de hibridizare. Reprezintă intensitatea reactiei de hibridizare.
Dacă două lanţuri unice de acid nucleic sunt pe toată lungimea lor formate din baze
implementare, iar conditiile de reacţie sunt favorabile, stringenta (intensitatea) reacţiei de
ambinare este foarte puternică. Dacă pe cele două lanţuri de acid nucleic există doar zone
parţiale cu baze complementare, stringentă este mai scazută (această situaţie apare în special
atunci cADN cele două lanţuri de acid nucleic provin din două organisme diferite).

12.2.5. Tipuri de hibridări

a. Hibridare Blotting:
a.1. Southern Blotting (ADN Blotting)
a.2. Norhern Blotting (ARN Blotting)
a.3. Western Blotting (Protein blotting)
a.4. Dot Blotting
267
 a.5.Slot Blotting
b. Hibridizare in situ;
c. Hibridizare Colonială.

a. Hibridizare Blotting

Este o tehnică specială prin care acidul nucleic ţintă (de cercetat) este axtras din
materialul de cercetat prin încălzire la 100 grade C şi răcire la gheaţă şi apoi depus pe o
membrană(de nitroceluloză sau filtru de nylon) şi fixat. Hibridarea acestui acid nucleic
necunoscut are loc direct pe filtru cu ajutorul sondei genetice (acid nucleic cunoscut şi
marcat).
Noţiunea de "Blot" reprezintă fitrul+acidul nucleic fixat(imobilizat).
Acţiunea de "Blotting" reprezintă trecerea acidului nucleic pe filtru.
Există mai multe variante de hibridare Blotting şi anume:

a.1. Southern Blotting

A fost imaginată de Southern în 1975.Evidenţiază secvenţele specifice ale unor
fragmente de ADN separate prin gelelectroforeză.
Etapele reacţiei:
- se extrage ADN dintr-un produs patologic lichid(ser sanguin care conţine acid nucleic
viral) sau solid(celule,ţesuturi);
- ADN este tăiat cu enzime de restricţie;
- fragmente de ADN(de circa 1000 perechi de baze)sînt supuse electroforezei şi separate
în funcţie de greutatea lor moleculară;
- fragmentele ADN obţinute în gel sînt supuse denaturării;
- trecerea fragmentelor de lanţ unic ADN de pe gelul sensibil(de nitroceluloză) care
fixează aceste fragmente de ADN.
Pentru transferul respectivelor fragmente de ADN de pe gel pe fitru se folosesc diferite
metode,dintre care una este cea prin transfer capilar (Fig.146).
Gelul (2) este pus pe hărtie de fitru (1) umedă(care a absorbit prin capilaritatea lichid din
vasul cu soluţie tampon); peste gel (2) se pune altă hîrtie de filtru (3) uscată, care se
îngreunează prin aplicare,deasupra ei,a unei lame de sticlă (4) şi a unei greutăţi (5). Curentul
de lichid care rezultă din soluţia tampon şi care se formează prin capilaritate,de la hîrtia de
fitru umedă spre cea uscată,acţionează şi scoate prin spălare moleculele ADN din gel şi le
trage către şi pe hîrtia de fitru superioară (4).
Fragmentele de lanţ unic ADN fixate pe hîrtia de fitru superioară prin acţiunea căldurii
sînt tratate(hibridizate) cu sonde genetice ADN sau ARN (marcate radioactiv).
Hibridizarea se realizează prin incubarea hîrtiei de fitru (3) într-o soluţie care conţine
sonda genetică radioactivă (de exemplu, ADN marcat cu 32P); molecula-hibrid realizată va fi
evidenţiată prin metoda autoradiografică sub formă de benzi.
Utilizarea practică a variantei Southern Blotting
Gelul (2) este pus pe hărtie de fitru (1) umedă(care a absorbit prin capilaritatea lichid din
vasul cu soluţie tampon); peste gel (2) se pune altă hîrtie de filtru (3) uscată, care se
îngreunează prin aplicare,deasupra ei,a unei lame de sticlă (4) şi a unei greutăţi (5). Curentul
de lichid care rezultă din soluţia tampon şi care se formează prin capilaritate,de la hîrtia de
fitru umedă spre cea uscată,acţionează şi scoate prin spălare moleculele ADN din gel şi le
trage către şi pe hîrtia de fitru superioară (4). Fragmentele de lanţ unic ADN fixate pe hîrtia de
fitru superioară prin acţiunea căldurii sînt tratate(hibridizate) cu sonde genetice ADN sau
ARN (marcate radioactiv). Hibridizarea se realizează prin incubarea hîrtiei de fitru (3) într-o
soluţie care conţine sonda genetică radioactivă (de exemplu, ADN marcat cu 32P); molecula-
hibrid realizată va fi evidenţiată prin metoda autoradiografică sub formă de benzi.

268
Fig. 146 - Hibridarea Southern Blotting

269
 Utilizarea practică a variantei Southern Blotting
Prin apariţia unei mutaţii în genomul celulelor germinative (modificarea unei baze), care
se moşteneşte, respectiv ADN modificat, dacă va fi supus acţiunii enzimelor de restricţie,va
prezenta una din următoarele două ipostaze posibile:
- lanţul ADN rămîne netăiat,deoarece enzimele de restricţie nu mai recunosc situs-ul
specific;
- din contră, poate apare un nou situs specific de tăiere pentru aceste enzime. În acest al
doilea caz, pot apărea în consecinţă noi tipare de fragmente ADN; acest fragment a fost
numit "polimorfism de lungime al fragmentelor de restricţie" (RFLP). Studiul acestor
fragmente şi a diferenţei dintre ele, cu ajutorul metodei Southern Blotting,a putut aduce
noi informaţii în cercetările efectuate asupra unor boli genetice şi în medicina judiciară.
Astfel s-a putut demonstra că:
- la germenii univitelini, aceste tipare RFLP sînt complet identice;
- la rude, aceleaşi tipare RFLP sînt în mare parte identice;
- în boli genetice se evidenţiază prezenţa unor gene defecte (pe baza unor fragmente ADN
cu un tipar individual);
- prezenţa unor modificări genetice în cazul unor procese tumorale;
- pe baza tiparelor RFLP s-au putut clasifica microorganismele (virusuri şi bacterii)
- în medicina judiciară, pe baza pattern-urilor RFLP (ADN minisatelite=fragmente
hipervariabile din genom, care nu sînt transcriptibile) se poate face determinarea
paternitaţii.
De asemenea, pe baza aceloraşi pattern-uri RFLP se pot face identificări de persoane în
criminalistică, prin studiul unor probe de sânge sau spermă;
ADN de origine umană şi cel provenind de la cimpanzeu şi gorilă sînt omologate în
proporţie de 97%(diferenţa constă în cromozomul X). Speciile de cimpanzeii sunt mult mai
copiate de om decât alte specii de maimuţa.
În Africa de Sud a fost studiată originea speciei Quagga (Equus quagga), care a
dispărut în 1883, şi pe baza studiilor filogenetice s-a stabilit că aceasta reprezintă forma
originară a tuturor speciilor de zebră;
Studiul genelor pentru globină la primate (responsabile pentru sinteza proteinei
hemoglobină) a demonstrat că aceste gene sînt localizate la un loc,într-un cluster pe
cromozomii umani 11 şi 16. Dimensiunea acestor clusteri este asemănătoare la om, gorilă şi
gibon.
a. 2. Northern Blotting
Această variantă a hibridizării Blot pune în evidenţă secvenţe specifice ale unor
fragmente ARN departe prin gelelectroforeză.
Etapele reacţiei sunt:
- ARN este extras din materialul de cercetat;
- ARN este pus în prezenţa substanţei denaturatei (glicoxal dimetilsulfoxid formaidehidă
sau metilmercur);
- ARN este supus separării electroforetice;
- transferul moleculelor ARN pe filtru (nylon sau mitriceluloză);
- hibridizarea ARN de pe filtru cu o sondă genetică ARN sau ADN;
- evidenţierea moleculei hibrid construite.
Aplicaţii practice ale variantei Northen Blotting
- determinarea ribotipurilor tulpinilor bacteriene (în studii genetice, epidemiologice).
- În epidemiologie, reprezintă o motodă foarte modernă şi utilă de cercetare pentru
determinarea filiaţiei cazurilor în epidemii, această metodă fiind mult mai sensibilă decât
determinarea hizotipurilor de tulpini. Astfel, în actuala a VII -a pandemie de horelă, cu
ajutorul metodei de ribotipare s-a putut demonstra că profilul genetic al tulpinilor de
Vibrio cholerae biotip eltor, prezente în Asia şi Europa, este în mai mult de 70% din cazuri
identic.
270
a. 3. Western Blotting (tehnica immunoassay)
Această variantă a hibridizării Blot nu reprezintă o reacţie de hibridizare propriu-zisă
(anume construirea unei molecule ADN dublu lanţ din două lanţuri separate de ADN).
Această variantă foloseşte doar principiul reacţiei de hibridizare, şi anume desfaşurarea
substratului de cercetat pe gel de electroforeză şi apoi trecerea acestuia pe o membrană de
nitroceluloză,unde este apoi cuplat şi evidenţiat prin intermediul unor grupări chimice
complementare.În acest caz de Western Blotting, substratul de cercetat nu este reprezentat de
un acid nucleic ci de o proteină. Reacţia foloseşte la evidenţierea unor cantităţi foarte mici de
proteine prezente în lichidele sau celulele unui organism, prin cuplarea acestora cu anticorpi
specifici corespunzători (marcaţi).
Etapele reacţiei sunt următoarele:
- proteina este supusă electroforezei în gel SDS*-policrilamidă;
- transferul spoturilor proteice (antigene) pe membrana de nitroceluloză;
- adaos de anticorpi specifici marcarţi (cu enzime sau radionuclizi);
- spălarea anticorpilor rămaşi nefixaţi;
- aplicarea deasupra membranei de nitroceluloză a unui film fotografic;
- expunere şi developare;
- citirea prin autoradiografie a benzilor de proteină cu ajutorul anticorpilor
specifici marcaţi şi fixaţi.
Avantajul metodei este acela de a pune în evidenţa prezenţa unei anumite proteine, dintr-
o mixtură complexă.Această metodă este folosită pentru clonarea genelor.

a. 4. Dot Blotting
Se execută pe o placă de plexiglas cu godeuri rotunde (fig.147). Este necesară extracţia
prealabilă a acidului nucleic din probele de cercetatare(ser,extracte celulare sau tisulare.
Proba de acid nucleic extrasă se depune într-unul din godeurile rotunde ale plăcii de
plexiglas.În fiecare godeu se depune altă probă de acid nucleic,în total pe o placă depunîndu-
se atîtea probe câte godeuri are placa. Apoi respectiva placă se acoperă cu hîrtie de filtru, care
absoarbe aventualele probe de acid nucleic prezent. Nu se face nici o separare electroforetică;
probele de acid nucleic de pe hîrtia de filtru sînt supuse apoi denaturării (prin încălzire la 100
gradeC şi răcire la gheaţă). Apoi probele de acid nucleic denaturat de pe filtru sînt hibridizate
cu sonde genetice.

Fig. 147 - Tehnica Dot

Bloptting

a. 5. Slot Blotting
Se execută pe o placă
de plexiglas cu godeuri de
formă dreptunghiulară
(Schlitz-uri = tăieturi sau
Slot-uri).
Principiul metodei este
identic cu cel de la Dot
Blotting. Aceste ultime două
variante de hibridizare se
folosesc atunci când se
lucrează deodată cu un
număr foarte mare de probe
patologice nefracţionate
(probe de ser, extract celulare
sau tisulare).

271
 12.2.6. Hibridizare in situ

Se efectuează direct pe celule şi ţesuturi. În cazul hibridizării Blotting este necesară

extracţia prealabilă a acidului nucleic din proba de cercetat; prin această extracţie, se pierde
însă informaţia asupra sediului exact al respectivului acid nucleic (ADN sau ARN) din
anumite structuri celulare. Această informaţie se poate obţine numai cu ajutorul hibridizării in
situ.Prin această ultimă metodă se poate realiza evaluarea exactă a distribuţiei anumitor
secvenţe ADN sau ARN direct in situ simultan cu determinări calitative şi semicantitative.
Se folosesc fragmente de ţesuturi, amprente de celule, culturi celulare (prelucrate,
aplicative şi fixate pe lame obiective). Fixarea se face cu xilol, etanol (100% şi apoi 70%).
Lama obiectiv cu celule fixate corespunde filtrului cu acid nucleic legat prin hibridizare
Blotting.
Reacţia de denaturare şi hibridizare se face pe lama obiectiv şi anume: după depunerea
probei pe lama obiectiv, pentru denaturarea probei se foloseşte o încălzire puternică sau
tratarea cu proteaze şi digitonină, ultima slăbind şi desfăcând citoscheletul şi rezultînd
molecula ţintă de acid nucleic unic.Lama cu probă pentru denaturarea se acoperă cu o placă,
realizîndu-se o cameră umedă. După denaturare, lama se spală (pentru îndepărtarea
particulelor nelegate) şi abia apoi urmează hibridizarea cu sonda (ADN sau ARN) marcată; în
cazul reuşitei hibridizării, secvenţele ţintă din acidul nucleic de cercetat (din ţesuturi) sînt
evidenţiate la autoradiografie (prin cuplare cu secvenţele de acid nucleic complementare din
probele marcate cu biotină). Biotina din sondă a fost fixată de un necleotid cu uracil; acest
uracil se va împerechea în lanţul de acid nucleic ţintă cu o adenină;după ce se produce această
reacţie de hibridizare, se face o spălare cu o soluţie tampon,care îndepartează moleculele
nelegate de acid nucleic din probă.
Marcarea cu biotină este evidenţiată ulterior prin diferite variante de lucru (vezi "Sonde
genetice.Marcarea").
Aplicaţiile practice in situ sunt:
- evidenţierea şi localizarea diferiţilor agenţi infecţioşi în diferite celule şi ţesuturi
ale organismului: virusul hepatitei virale tip B, HIV, virusul Epstein-Barr, virusul
cito-megaliei, virusul herpes simplex, virusul papilloma;
- cercetarea relaţiilor virus-procese oncogene (de exemplu, relaţia virusul hepatitei
virale tip B-carcinom hepatic);
- diagnosticul pre- şi postnatal în boli genetice;
- localizarea genelor defecte pe cromozom (de exemplu, în fibroza chistică, distrofia
musculară Duchenne);
- identificarea anormalităţilor cromozomiale (de exemplu: trisomia 21, sindromul
Langdon Down, sindromul Turner);
- stabilirea sexului la embrion;
- cercetarea tiparelor de expresie genetică (stabilirea momentului activării anumitor
gene);
- stabilirea hărţii genetice cromozomiale (stabilirea relativă a locus-ului fiecărei gene
pe cromozom);
- hibridarea colonială.
Pe plăci cu medii de cultură se însămînţează colonii bacteriene din două tipuri de clone:
- o clonă bacteriană de origine(cu plasmid);
- o clonă bacteriană cu ADN ţintă (cu plasmid+ fragmente de ADN ţintă).
Prin replica plating se obţine copii ale acestor colonii din cele două clone pe un filtru de
nitroceluloză. Aceste copii de clone bacteriene (de pe fitru) sunt supuse lizei pentru a se obţine
ADN.
ADN este supus denaturării pentru obţinerea lanţurilor unice de ADN.
Lanţul unic ADN este supus hibridizării cu probele ADN cunoscut şi marcat radioactiv.
După fixarea probelor ADN radioactive(fixarea complementară)pe lanţul unic de ADN ţintă

272
(de cercetat) se procedează la evidenţierea autoradiografică a marcării pe un film Roentgen.
Prin compararea imaginii radiografice se identifică şi se diferenţiază clonele bacteriene
care conţin fragmente de ADN ţintă faţă de clonele bacteriene de origine. Clonele bacteriene
care poartă ADN ţintă recombinant (plasmid + ADN ţintă) vor fi multiplicate mai departe
(sincron se vor multiplica şi fragmentele de ADN straniu).

12.2.7. Importanţa reacţiei de hibridare pentru medicină şi biologie

Această reacţie a pus bazele unui număr de tehnici care au ajutat la progresul cercetării
biologice fundamentale,cît şi la progresul diagnosticului medical într-un număr de boli.
Astfel s-a reuşit:
- stabilirea concentraţiei anumitor secvenţe ADN sau ARN într-o mixtură de secvenţe;
- determinarea numărului de copii dintr-o anumită secvenţă prezentă într-un dovedirea
gradului de înrudire între diferite organisme în raport cu numărul de secvenţe ADN
identice;
- stabilirea activităţii genelor pentru care s-au pus în evidenţă moleculele de ARNm
corespunzătoare;
- evidenţierea secvenţelor specifice ADN şi ARN în material biologic de cercetat (sânge,
celule, ţesuturi);
- evidenţierea acidului nucleic viral;
- în serul sanguin LCR, în vederea elucidării diagnosticului unor infecţii virale cronice:
evidenţierea acidului nucleic viral în aceste produse semnifică prezenţa particulei virale
în organismul respectiv. Evidenţierea prezenţei acidului nucleic viral direct în produsele
patologice (ser, LCR) sau în materialul citologic reprezintă o posibilitate de diagnostic
rapid şi precoce, în vederea instituirii a unei terapii de urgenţă în special la persoanele
bolnave de SIDA sau la cele imunosupresate (terapeutic) în urma unor transplante de
organe.
În aceste cazuri diagnosticul serologic de obicei nu poate fi de ajutor deoarece
pozitivarea serului în cazul infecţiei cu HIV se produce abia după câteva săptămâni de
infecţie, iar în cazul imunosupresaţilor după câteva luni sau chiar deloc;
ƒ evidenţierea prezenţiei virale în tumori de origine virală;
ƒ studiul efectuat asupra produsului de transcriere (ARNm) a unor secvenţe ADN
celulare glucogene nevirale a ajutat la complectarea şi aprofundarea diagnosticului de
tumoră. Astfel o reacţie de tip imunohistochimic a putut pune în evidenţă un produs de
transcriere (ARNm) specific de ţesut (de exemplu, prezenţa unui anumit ARNm
corespunzător unei munoglobuline prezente în caz de limfoane maligne sau prezenţa
unui anumit ARNm hormonal în anumite tumori neuroendocrine. Această metodă
reprezintă o unealtă foarte eficientă pentru cercetarea activităţii genelor oncogene prin
evidenţierea indirectă imunohistochimică a produselor lor de translaţie (ARNm
corespunzător);
ƒ diagnosticul pre- şi postnatal al bolilor ereditare (la femei care doresc copii sau la care
se pune problema întreruperii sarcinii);
ƒ determinarea defectelor metabolice;
ƒ utilizarea metodelor ce folosesc sonde genetice pentru diagnosticarea infecţiilor virale
ale arborilor fructiferi (cu o precizie de diagnostic pentru o cantitatea de antigen de
2x10 nanograme);
ƒ aplicaţii în epidemiologia moleculară în vederea depistării unor noi markeri genetici
(de exemplu, robotip, pulsotip);
ƒ se precizează ca în viitor metoda hibridizării să ofere posibilităţi pentru elucidarea
mecanismelor de reglare a activităţii genelor.

273
12. 3. SONDE GENETICE
Cu ajutorul enzimelor de restricţie, astăzi se pot izola, teoretic, toate genele tuturor
organismelor vii, în vederea obţinerii unei bănci de gene (le vivant mondial).
Principiul hibridizării în vitro a două ADN-uri complementare stă la baza metodei care
foloseşte sondele moleculare(coduri de ADN cunoscute asociate cu un marker). Cu ajutorul
unor asemenea sonde, la un individ dintr-o anumită specie se pot repera codurile
complementare pe care sonda "le luminează" prin procesul de hibridizare moleculară. Cu
ajutorul ADN-polimerazelor s-a reuşit şi amplificarea ulterioară a acestor fragmente de ADN
bine determinate şi deci clonarea genelor pentru a face şi mai uşoară (mai sensibilă) reperea
lor. Astăzi,graţie sondelor genetice, etichetarea, reperarea şi cartografierea genelor au devenit
operaţii de rutină în marile laboratoare din lume, ceea ce va asigura în viitor progresul rapid al
alcătuirii hărţilor cromozomiale complete ale genomului uman.
Sondele genetice (probe de acid nucleic tip ADN sau ARN marcate) reprezintă unealta
esenţială de lucru în metoda de hibridizare pentru analiza secvenţelor nucleotidice din
secvenţele "ţintă" ale ADN-ului de cercetat (genele). Aceste sonde genetice (proba de ADN
sau ARN) sunt marcate (radioactiv sau nonradioactiv) pe un singur nucleotid (cu o secvenţă
de baze cunoscute).
În prezent sondele genetice pentru cercetare şi diagnostic se pot comADNa şi cumpăra
de la casele producătoare. Sondele genetice se prepară prin aceleaşi metode de hibridizare
utilizate şi pentru secvenţierea (sequencing) acidului nucleic, şi anume prin metodele Blot
(Western Blot,Southern Blot) şi metoda hibridizării in situ.

A. Prepararea probelor de acid nucleic(sonde genetice) pentru reacţiile de hibridizare

Sondele genetice pot fi: probe de ADN şi probe de ARN.

a. Prepararea probelor de ADN:

a.1. Din fragmente ADN dublu lanţ clonate (în vederea obţinerii ulterioare de sonde
genetice).
Aceste fragmente se obţin prin încorporarea de fragmente da ADN genomic(tăiate cu
ajutorul enzimelor de restricţie) sau de fragmente ADNc (sintetizate cu ajutorul
reverstranscriptazei după modelul unei matriceARNm) într-un vector şi prin introducerea lor,
o dată cu acest vector (recombinant), într-o celulă gazdă, unde vectorul se multiplică rezultînd
în final o cantitate mare de ADN clonat.
Pentru hibridizări sînt în special de preferat fragmentele ADNc clonat, deoarece
reprezintă secvenţe de ADN fără introni şi fără altă secvenţă care ar putea reacţiona
nespecific. Moleculele ADNc sunt, iniţial, unic lanţ, dar prin diferite metode sunt transformate
în ADN dublu lanţ şi apoi introduse în vectori şi multiplicate o dată cu aceştia în celula gazdă.
În acest caz, într-o moleculă finală de ADNc dublu lanţ doar un lanţ conţine secvenţe
corespunzătoare moleculei matriţă ARNm, iar celălalt lanţ ADNc reprezintă secvenţele
complementare respectivului lanţ matriţă ARNm. Probele ADN dublu lanţ pot fi ulterior
marcate în vederea obţinerii sondelor genetice (vezi „ Marcarea sondelor genetice”).
a.2. Sub forma de oligonucleotide ADN unic lanţ prin sinteza chimică în "maşini de
gene".
În aceste maşini se pot realiza concomitent sinteza şi marcarea sondelor genetice.
Aceste oligonucleotide ADN-unic lanţ reprezintă baza materială pentru:
ƒ sonde genetice;
ƒ sinteza de gene;
ƒ primeri pentru reacţii polimerazice în lanţ.

274
b.Prepararea probelor ARN (sonde genetice)
b.1. În " maşini de gene":ca şi probele ADN unic lanţ.
b.2. Prin metoda de transcriere in vitro cu ajutorul vectorilor de transcriere.
Această metodă de transcriere in vitro (sinteza ARNm după o matriţă ADN) se
realizează cu ajutorul vectorilor de transcriere unudurecţionali şi bidirecţionali, ăn vederea
obţinerii de probe ARN lanţ unic (sondă genetică), care se utilizează ulterior în reacţiile de
hibridare.Prin această metodă, ADN este transcris în afara celulei, în ARN, ARN-ul respectiv
putând fi marcat direct în cursul sintezei.
Vectorii de transcriere (clasă aparte a vectorilor de expresie), nu se folosesc caşi ceilalţi
vectori de expresie pentru sinteza de proteine, ci pentru sinteza de ARN. Vectorii de
transcriere sunt formaţi dintr-un plasmid ADN, în care au fost înglobaţi un fag promotor (SP6)
sau doi fagi promotori (SP6 şi T7). În cazul vectorilor cu un fag promotor (SP6), transcrierea
in vitro va fi unidirecţională, iar în cazul vectorilor cu doi fagi promotori, bidirecţională.
Promotorul reprezintă secvenţe de ADN de unde începe procesul de transcriere, deci sinteza
ARNm.

b.2.1. Transcrierea unidirecţională cu ajutorul φ SP6

După înglobarea în sistemul SP6, ADN-ul străin este cel care urmează a fi transcris în
ARN. După linearizare se adaugă în mediu SP6-ARN-polimeraza şi patru ribonucleotide
(dintre care trei nucleotide marcate şi unul nemarcat).ARN- polimeraza se va lega de
promotorul SP6 pornind transcrierea genelor în direcţia SP6>fragment MCS>fragment ADN
nou înglobat (fig. 148). Va fi transcris unul din cele două lanţuri de ADN nou înglobat. În
sinteză, ARN-polimeraza va folosi ribonucleotidele marcate şi nemarcate, pentru formarea
unei molecule ARNm conform matriţei ADN.

Fig. 148 - Transcrierea unidirecţională cu ajutorul φ SP6

Având în vedere că transcrierea începe la nivelul promotorului SP6 şi se termină la locul

de tăiere a enzimei de restricţie, înseamnă că prin utilizarea diferitelor enzime de restricţie se
poate prestabili lungimea lanţului transcris şi se pot obţine lanţuri ARNm transcrise de
lungimi prestabilite.

b.2.2.Transcrierea bidirecţională cu ajutorul vectorului bidirecţional cu doi

promotori (φ SP6 şi φ T7).
Vectorul bidirecţional este format din ADN plasmidic, φ SP6, zona MCS şi φ T7 (vezi
fig. 137). Cei doi promotori dirijeajă transcrierea în două sensuri opuse. Prin introducerea şi
înglobarea într-un vector de transcriere bidirecţională a unui dublu lanţ ADN (de exemplu,
ADNc între două segmente de MCS şi după linearizarea vectorului), se poate stabili de la
început care din cele două lanţuri ADNc va fi transcris în ARN. Fiecare din cele două
polimeraze necesare pentru transcrierea respectivului lanţ ARN şi anume, SP6 – ARN
polimeraza şi T7 - ARN polimeraza , se leagă specific doar de promotorul corespunzător.
După linearizare, în funcţie de enzima de restricţie folosită, cât şi de ARN-polimeraza utilizată
pentru transcriere, se va sintetiza ARN sau ARN antisens.

275
 Într-un dublu helix ADN:
- un lanţ ADN este complementar cu ARNm de origine utilizat pentru sinteza ADNc;
- al doilea lanţ conţine aceleaşi secvenţe de nucleotide ca şi ARNm de origine.
Prin transcrierea:
- primului lanţ ADN, rezultă ARN sens identic şi cu acelaşi sens ca şi ARNm de origine;
- celui de-al doilea lanţ ADN, rezultă ARNm antisens = complementar faţă de ARNm de
origine: Acest ARN antisens se mai notwează ARNc (complementar) şi are sensul invers
decât ARNm sens (normal).
Probele de ARN obţinute în maşini de gene cât şi prin metoda transcrierii cu ajutorul
vectorilor fagici, pot fi marcate direct în soluţia de sinteză cu ajutorul nucleotidelor marcate
(vezi „Marcarea”). Probele de lanţ unic ARN astfel obţinute şi marcate se utilizează ulterior în
reacţii de hibridare, ca sonde genetice.

B. Marcarea
Se face pe un sungur nucleotid, cu o substanţă care îl face vizibil din punct de vedere
biochimic sau imunohistochimic.

a. Marcarea radioactivă
Se face cu radioizotopi 3H,35S, 125I, 32P.La alegerea izotopului trebuie ţinut cont de
timpul de înjumătăţire (timp necesar pentru ca substanţa radioactivă să se descompună în
proporţie de 50%). Astfel, timpul de înjumătăţire pentru :
3
H este de 12,35 ani;
35
S este de 87,4 ani;
125
I este de 60 de zile;
32
P este de 14,3 zile.
Atomul radioactiv introdus în probă prin dezintegrare va emite radiaţii β care vor fi
evidenţiate la autoradiografie (impresionarea plăcii Roentgen la iluminarea cu radiaţii u.v.).
Timpul de expunere a filmului la u.v. va fi diferit în funcţie de izotopul folosit:
- pentru hibridarea Blotting se foloseşte proba marcată cu 32P;
- pentru hibridarea in situ se foloseşte proba marcată cu 3H.
În ultima vreme există tendinţa ca substanţele radioactive să fie abADNonate din cauza
efectului lor nociv asupra organismului şi înlocuirea lor cu substanţe neradioactive.

b. Marcarea neradioactivă
Se face în două etape:
Etapa I – marcarea probelor cu biotină (cel mai frecvent), bromdeoxiuridină, digoxigenină.
Etapa II – probele marcate sunt evidenţiate prin intermediul legării markerului de avidină
(glicoproteină din ou)/streptovidină (sintetizată din ciuperca Streptomyces avidinii) şi
anticorpi antimarker (de exemplu, antibiotina) marcaţi cu fluorocrom.

Etapa I
Markerul (biotina) se leagă printr-un lanţ de legare numit spacer de baza uracil din
nucleotid. Acest braţ de legare va uşura şi legarea ulterioară a biotinei de proteinele
avidină/streptovidină, în etapa II. În mod normal uracilul se înglobează numai în ARN, nu şi
în ADN, dar în condiţii de laborator, prin intermediul spacer-ului de la biotină se pot realiza
două tipuri de legături:
- legătura cu nucleozidul natural;
- legătura cu nucleozidul artificial.
De exemplu: Bio – UTP; Biotină – spacer – uracil – zahăr – trifosfat
Bio – dUTP; Biotină – spacer – uracil – zahăr – trifosfat.
Pentru aceste structuri se folosesc în laborator trifosfaţii nucleozidelor. ATP-ul din
nucleotidele ADN este transportor de energie pentru metabolismul celular.

276
 Atât Bio – UTP, cât şi Bio – dUTP sunt derivate biotinate ale dezoxiuridin – trifosfstului
şi , respectiv ribouridin – trifosfatului şi vor fi înglobate în locul dezoxitimidin – trifosfatului
şi, respecti în ARN, în locul rbouridin – trifosfatului.
În momentul hibridării cu segmente ADN ţintă, nucleotidele cu uracil se împerechează,
pe lanţul complementar de ADN ca şi pe lanţul ARN, tot cu un nucleotid cu adenină.

Etapa a II-a
Probele de mai sus biotinate se evidenţiază prin legarea biotinei de avidină/streptovidină
sau anticorpi antibiotină marcaţi cu fluorocrom.Biotina prezintă o mare afinitate pentru
avidină. Legătura bitină + avidină este foarte puternică şi aproape ireversibilă. Din cauza unor
reacţii nespecifice se preferă streptovividina în locul avidinei.
În final, pentru a se evidenţia prezenţa complexului molecular hibrid biotină –
avidină/streptovidină, acesta este marcat prin diferite metode.

C. Înglobarea nucleotidelor marcate în sonda genetică

Se realizează prin:
a. Metode enzimatice
b. Metode chimice.

a. Metode enzimatice
Înglobarea nucleotidelor marcate radioactiv sau neradioactiv se face cu ajutorul unei
reacţii enzimatice, în prezenţa ionilor de Mg++.

I. Nick - translaţia
Cea mai folosită metodă pentru marcarea sondelor este Nick-translaţia (translaţia prin
tăiere). În această metodă se folosesc două enzime: ADN-aza I şi ADN – polimeraza I.
ADN- aza I este o enzimă de restricţie extrasă din pancreas de bou; ea taie legăturile
fosfodiesterice de ADN unic sau dublu lanţ; nu atacă ARN şi acţionează în prezenţa ionilor de
Mg++ şi Mn++ (fig. 149).

Fig. 149 - Acţinea ADN- azei I pe dublul lanţ ADN îm prezenţa ionilor de Mg++ şi Mn++

ADN- polimeraza I (polimeraza Kornberg) este izolată din E. coli, are acţiune
polimerazică 5' > 3', fixează nucleotidul ADN la capătul liber 3' (mai scurt) al moleculei ADN
parţial dublu lanţ, în funcţie de complementaritatea faţă de nucleotidele de pe lanţul matriţă
corespunzător (fig. 150). ADN – polimeraza I are şi o acţiune exonucleazică în ambele
sensuri: 5 ' > 3' şi 3' > 5' ; această acţiune apare doar când în cursul sintezei unui ADN sunt
introduse nucleotide false (fig. 151).

Fig. 150 - Acţiunea 5 ' > 3' polimerazică a ADN- polimeraza I

277
 Fig. 151 - Acţiunea exonucleazică în ambele sensuri ale ADN – polimerazei I.

Astfel, după încorporarea nucleotidelor marcate, dublul lanţ ADN este denaturat (cele
două lanţuri sunt separate); se vor obţine fragmente de lanţuri unice ADN marcate de diferite
lungimi şi cu diferite secvenţe de baze (sonde genetice) (fig.152).

Fig. 152 - Schema Nick –

translaţiei (după Hermaun ,
1991).

II. Oligomarcare
(RADNom Priming, RADNom
Priming Oligolabelling,Feinberg-
Vogelstein Technik)
Spre diferenţa de “nick-
translatie”, in oligomarcare se
folosesc drept matriţe lanturi
unice de ADN rezultate dintr-o
denaturare prealabila a unui lanţ
ADN. Se foloseşte enzima
Klenow Polimeraza care
reprezinta un fragment de ADN-
polimeraza. Klenow Polimeraza
poseda activitate 5’ – 3’, si 3’- 5’
exonucleazica (dar nu prezinta
activitate 5’- 3’ exonucleazica).
Se mai utilizează un
amestec de hexanucleotide
(oligonucleotide sintetizate cu
ajutorul unei maşini de gene ); ele
sunt structuri formate fiecare sir
cate sase nucleoide care contin
practic toate combinaţiile de
secvenţe nucleotidice posibile,
reprezentate de nucleotide ADN
marcate (.) cît şi nemarcate (o),
aflate de obicei in proporţie de la
1 la 3.
Numele metodei de
RADNom Priming derivă de la
utilizarea drept primeri a
hexanucleotidelor cu secvenţe
întamplătoare (randomized
primer).

278
III. Marcare terminala a lanturilor ADN (Endlabelling).
Pot fi marcate capetele 3’ si 5’ ale moleculei ADN şi ARN. Spre diferenţa de primele
doua metode (1 şi 2), prin care sunt marcate moleculele de ADN probe (sonde genetice), în
aceasta a treia metoda marcare se face numai la capetele moleculei ADN-proba rezultata ;de
aceea, sensibilitatea moleculei de ADN rezultata prin această metoda este mult mai
mică.Acest tip de marcare se efectueaza atat pe ADN unic lanţ cît şi dublu lanţ.Exista mai
multe metode de marcare terminală.
Marcarea terminală 3’ a ADN:se face cu ajutorul enzimei transferaza terminala*.
Această enzimă, în cazul de faţă, catalizează fixarea nucleotidului pe capatul 3’-OH liber
al moleculei ADN unic (sau dublu lanţ). Enzima nu are nevoie de nici o matriţa; va rezulta
deci un ADN lanţ unic cu un capat 3’-OH liber (şi respectiv un ADN cu un capat format dintr-
un lanţ 3’-OH care atârna în afara).
În aceasta metoda se foloseşte doar un singur nucleotide ADN marcat (de exemplu, cu
biotina): dezoxiribouridinbiotinat (Bio-dUTP). Acest Bio-dUTP este legat prin acţiunea
transferezei terminale de capetele 3’-OH ale unei molecule ADN dublu lanţ, deci pe fiecare
din cele două lanturi, la capetele 3’-OH formînd o coada cu acelaşi nucleotide pe ambele
lanturi ale dublului lanţ ADN (dar la capetele opuse). Lungimea acestei cozi este dependenta
de concentraţia cationilor de Co++si de concentraţia nucleotidelor.
Cu ajutorul enzimei transferaza terminala se poate,de asemenea, ataşa, unei molecule
dublu lanţ ADN , o coada cu nucleotide nemarcate,care conţin toata timina.Dupa denaturarea
şi hibridicarea unei asemenea “probe marcate”, această coada cu timina poate fi evidenţiată
indirect prin fixarea, în cursul hibridizarii, a unei cozi cu adenina marcata cu biotin ape lanţul
ADN proba (adenine se va fixa prin complementaritate pe coada de timina).
În cazul acestei hibridizari, lanţul cu coada de timina reprezinta secvenţa ţinta, iar cel cu
coada de adenine, secvenţa proba..

b) Metode chimice
Reprezinta o marcare directa a acidului nucleic.

ƒ 1. Marcarea cu fotobiotină.
Un asemenea tip de marcare este bazat pe legarea biotinei printr-un braţ de legare
chimică, de acidul nucleic, pe o grupare chimica activate in prezenţa luminii (iluminare foarte
scurta). Se formeaza o legatura stabile între biotina şi acidul nucleic (lanţ unic sau dublu).

ƒ 2. Marcarea cu acridin oraj.

Prin cuplarea între acridinester şi acidul nucleic se produce o legatură de
chemoluminiscenta care eliberează lumina.

12.4. CLONAREA ADN – ului

Clona bacteriana reprezinta un grup de celule bacteriene identice din punct de vedere
genetic, care provin dintr-o singură celula bacteriană.Clonarea se poate realiza prin
încorporarea (printr-o tehnică de recombinare ADN) a unui fragment de ADN străin într-un
vector care ulterior este introdus şi multiplicat într-o celula gazdă.
În biologia moleculară, clonarea semnifică obţinerea unei culture de celule dintr-o
celulă unică, astfel încat sa se obţină populaţie uniforma din punct de vedere genetic.

==================================================================
*Dezoximetil-nucleotid-terminal-transferaza; această enzimă se foloseşte şi în experienţe de clonare pentru
obţinerea capetelor franjurate ale fragmentelor ADN

279
A. Etapele principale ale metodei de clonare
Sunt urmatoarele:
ƒ extragerea unui fragment ADN, prin taierea ADN genomic, cu ajutorul enzimelor de
restricţie;
ƒ introducerea fragmentului ADN într-un vector;
ƒ introducerea vectorului recombinant (plasmid care a înglobat fragmentu ADN străin) în
celula gazdă;
ƒ selectarea celulelor bacteriene care conţin vectorul recombinant.
Clonarea ADN se recomADNă atunci cADN este necesară izolarea şi multiplicarea
unui segment de ADN (dintr-un genom). În majoritatea experimentelor de clonare, se folosesc
celule bacteriene de E.coli.

1.Extragerea unui fragment ADN.

Se lucreaza pe celule de Esch.coli.Se folosesc enzime de restricţie de tip sticky* şi un
plasmid care poarta doua gene (markeri de rezistenţa la doua antibiotice: ampicilina şi
tetraciclina).
În scopul eficienţei de clonare:
a) pentru a împiedica circularizarea vectorului ADN străin, trebuie îndepartate grupările
fosfat de la extremitaţile 5’ ale moleculei deschise de ADN a vectorului, cu ajutorul
fosfatzei alcaline.În acest fel, vectorul nu se va mai circulariza. Fosfataza alcalina se
obţine din celule de Esch.coli sau celule de intestine de oaie;
b) pentru a permeabiliza membrane celulei bacteriene la respectivul plasmid vector,
celula bacteriana trebuie tratata cu soluţie CaCl2 pentru a devenit compententa;
c) având in vedere faptul ca celulele bacteriene poseda sisteme care protejează celula de
pătrunderea unui ADN străin, se folosesc pentru clonari celule bacteriene mutante
(celule cu system de apărare mult diminuat).

2.Introducerea vectorului recombinant in celula gazda (competenta)

Acest fenomen reprezinta procesul de trasformare. În soluţia nutritive în care se găsesc
celulele bacteriene, sincron cu multiplicarea celulelor bacteriene, se produce şi multiplicarea
vectorilor recombinanti incorporate.
Ţinând cont de faptul că atît plasmidul cît şi fragmentele ADN au locuri (situs-uri) de
tăiere complementare, atunci cînd vectorul deschis şi segmnetul ADN străin vor veni in
contact, din zonele sticky, se vor lipi şi va rezulta lanţul ADN recombinant (fragmentul ADN
a devenit inclus in vector). De obicei, pe plasmidul iniţial care poarta rezistenţa la antibiotice
(tetra şi ampicilina) se incorporeaza fragmentul ADN străin pe locul unuia din cei doi markeri,
eliminADN markerul respective(de obicei se elimina gena tetra şi ramane cea pentru
ampicilina in momentul taierii lanţului ADN de atre enzimele de restricţie.

3.Testarea celulor bacteriene supuse procesului de transformare.

Aceasta testare se face cu scopul de a controla daca celula bacteriana a incorporate
respectivul plasmid recombinant. În acest sens, bacteriile transformate (cele care au primit
vector+ADN) se testeaza pe un mediu de cultura cu ampicilina; vor supravieţui numai acele
celule bacteriene care au caştigat rezistenţa la ampicilina, prin acceptarea plasmidului
recombinant, purtatorde gena pentru ampicilina (rezistenţa la ampicilina). Din aceste bacterii
cu vectori recombinant, însămînţate pe mediu de cultura cu ampicilina vor creşte colonii
bacteriene, din care fiecare va reprezenta o clonă.

4. Selectarea celulelor bacteriene purtătoare de vector recombinant.

Selectarea acestor celule purtătoare de plasmid cu ADN străin încorporate şi
diferenţierea lor de celule (clone) fără ADN străin se face prin însămînţare, prin replica

280
 plating, a coloniilor bacteriene pe un mediu cu tetraciclina; pe acest mediu vor supravieţui
doar clonele care nu conţin nici un fragment de ADN străin (celule rezistente la tetraciclina).
Tip sticky=enzime care taie cele două lanţuri ale helixului dna în mod franjurat datorită
faptului ca şi-au pastrat gena purtatoare de aceasta rezistenţă (este vorba de plasmidul “gol”
fără ADN străin ataşat), în timp ce clonele care au pierdut gena de rezistenţa la tetra (în
momentul legării plasmidului de ADN STRĂIN), prin formarea unui plasmid recombinant, nu
cresc pe acest mediu. Abia din acest moment se poate studia mai departe clona care conţine
fragmentul ADN dorit, printr-o tehnică de hibridizare speciala, şi anume prin hidibridizare
colonială.
B. Biblioteca genomica ADN (secvenţe de exoni+introni)
Dacă genomul unui organism este secţionat cu enzime de restricţie, iar diferite
fragmente de ADN sunt clonate (în celule bacteriene), se va obţine un numar de clone
corespunzADN diferitelor amestecuri (vector plasmidic+segment ADN). Totalitatea acestor
clone rezultate din genomul unui organism iniţial reprezintă biblioteca genomica ADN. Acest
mod de clonare, care duce la formarea unei biblioteci genomice ADN prin tăierea genomului
(cu ajutorul enzimelor de restricţie) potrivit principiului întamplării şi prin unirea fragmentelor
rezultate, reprezinta tehnica “împuşcarii” (shotgun).
Clona ADN genomica a unuia şi aceluiaşi organism este totdeauna identical şi
independenţa de tipul celular, deoarece toate celulele aceluiaşi organism posedă o înzestrare
genetică identical.Din aceasta biblioteca se obţin secvenţe ADN necesare pentru tehnica de
hibridizare; acestea vor fi folosite drept secvenţe ADN cu rol complementar (cu secvenţe
ADN cunoscute), in vederea identificarii unor fragmente ADN noi, necunoscute, a caror
secvenţe nucleotidice trebuie cercetare şi identificate.
Clonele genomice ADN vor conţine atat secvenţe de introni, cît şi exoni,
corespunzătoare genomului celulei respective de origine.
Clonele din biblioteca genomica ADN se folosesc pentru:
- cercetarea structurii complete a genelor;
- cercetarea structurii exonilor şi intronilor;
- cercetarea secvenţelor reglatoare.
C. Biblioteca ADNc (ADN copie dupa matriţa de ARNm matur)
Reprezintă doar o informaţie pură formată numai din secvenţe de exoni.Spre diferenţa de
biblioteca genomica ADN, care rezultă din clonarea de fragmente ADNc se sintetizează
artificial în laborator, pe o molecula de ARNm matur, drept copie complementară (în prezenţa
enzimei reverstranscriptaza).
Produsul acţiunii acestei enzime va fi o molecula mixta (hibrid): ARNm-ADNc. Din
acest hibrid, lanţul dublu ADNc se va forma din acest lanţ unic ADNc, prin doua posibilităţi:
- în prezenta ADN-polimerazei (Klenow= ADN-polimeraza I extrasa din celula de
Esch.coli);
- în vectori; vectorii recombinaţi(vector+ lanţ unic ADNc) vor determina ulterior formarea
de clone bacteriene ADNc.
În timp ce clonele de ADN genomic sunt identice pentru toate celulele aceluiaşi
organism, clonele ADNc sunt diferite pentru diferitele tipuri de celule ale aceluiaşi
organism.În fiecare tip de celule, aceluiaşi tip de ADN genomic îi corespund alte gene active
(exoni), ceea ce înseamnă ca în fiecare tip de celule poate apare un alt tip de ARNm matur,
astfel încat, aceluiaşi organism, biblioteca ADNc rezultata variaza de la un tip celular la altul.
Clonele din biblioteca ADNc se folosesc în special în scopul analizei directe a
secvenţelor de baze care codifica un anumit aminoacid sau produsul proteuc final (codificat de
respectivul fragment ADNc). Secvenţa clonelor ADNc este studiată în special prin
experimentele de hibridizare.
Astăzi, în terapia bolilor tumorale se intrevede posibilitatea identificarii şi distrugerii
tintite a anumitor molecule ARNm, care induc translaţia informaţiei pentru sinteza unor
substanţe oncogene.

281
 Cu ajutorul experientelor de clonare s-a reuşit citirea de secvenţe de ADN de pe lanţul
ADN al genomului unui organism.Pasul urmator îl reprezintă obţinerea unor modificariale
acestor segvente ADN, cu ajutorul unor tehnici de inginerie genetică (procese artificiale de
recombinare ADN), cît şi introducerea acestor segmente astfel modificate de ADN în celule
sau organisme, unde aceste modificări urmeaza a se exprima.

12. 5. Reacţia de polimerizare în lanţ (PCR)

A fost numită de Lederberg, în 1993, “instrumental pentru democratizarea biologiei
moleculară”.Această reacţie dă posibilitatea ca dintr-o mixture de ADN să poata fi “pescuită”
o singura moleculara de ADN, şi aceasta sa fie ulterior amplificata enzimatic, cu mijloace
tehnice relative simple.
Spectrul de aplicabilitate al PCR este foarte larg: de la medicina judiciara, diagnosticarea
bolilor genetice pînă la “vanarea” şi identificarea de noi virusuri şi studii de ecologie şi
arheologie (studiul ADN-ului) din fosile.
PCR este folosită pentru cercetarea unor cantităţi foarte mici de ADN dintr-un produs
biologic.
Avantajele acestei reacţii sunt urmatoarele:
- fiind foarte sensibilă, reacţia poate pune în evidenta chiar şi prezenţa unei singure
molecule de ADN, in probele de cercetat (produs biologic), deoarece reacţia ofera
posibilitate multiplicarii (clonarii) ADN-ULUI chiar şi in afara celulei vii;
- reacţia permite chiar şi multiplicarea unei singure secvenţe de ADN.
Astăzi exista masini automate (Thermai Cycler) pentru realizarea unor asemenea reacţii
repetate; o multiplicare suficienta de secvenţe de ADN este reprezentata de minimum 25 de
cicluri de multiplicare; într-o masina automata se desfaşoara 30 de cicluri într-un interval de 4
ore.
A. Principiul reacţiei.
Se foloseşte drept matriţa un ADN monocatenar. În condiţii de laborator în vitro, pe
acest lanţ unic de ADN se poate sintetiza un lanţ complementar cu ajutorul ADN-polimerazei
şi în prezenta unui oligonucleotid (15-20 nucleotide) primer (armorsa). Pentru a porni sinteza
noului lanţ ADN pe un lanţ ADN matriţa, ADN-polimeraza necesită prezenta pe matriţa a
unui oligonucleotid primer cu capatul 3’-OH liber; la acest capăt urmeaza a se fixa
nucleptidele ADN care vor forma noul lanţ.
B. Efectuarea reacţiei
PCR poate porni de la punctul a sau b.
a. ADN genomic dublu lanţ (de cercetat) izolat din celule şi tăiat în fragmente cu
ajutorul enzimelor de restricţie corespunzătoare;
b. Lanţ unic de ADNc, sintetizat în prealabil prin trascriere inverse a ARNm.
La capatul 3’ al lanţului ADNc se ataşeaza o coada de nucleotide-guanina cu ajutorul
enzimei trasferaza terminala.Urmeaza desfaşurarea PCR cu doi primeri diferiţi utilizaţi
simultan, câte unul corespunzator pentru fiecare lanţ ADN (rezultat din ADN-ul dublu lanţ
denaturant). Dintre cei doi primeri, primul primer este nucleotide-timina, al doilea primer este
nucleotide-citozina.
Etapele reacţiei;
ƒ denaturarea ADN-ului genomic (izolat din celule) dublu lanţ sau ADNc (sintetizat cu
ajutorul unei molecule de ARNm) la temperature înalta (95 grade C).Acest ADN conţine
secvenţe care urmeaza a fi multiplicate (amplificate);
ƒ dupa scăderea temperaturii se adaugă primerul în exces. În aceste condiţii fixarea
primerului pe ADN-ul unic lanţ reprezintă un proces de hibridizare ce are loc la
temperature scăzuta (36-65 grade C). Primerul delimiteaza capatul iniţial al fiecarei din
cele doua secvenţe ADN unic lanţ (rezultate din denaturarea ADN-ului dublu lanţ) de
multiplicat. Adaosul de primer se face în exces, pentru a se obţine o hibridizare primer

282
 lanţ unic de ADN şi nu o hibridizarea între lanţurile unice de ADN rezultate din
denaturare.
ƒ reacţia de sinteza a noului lanţ ADN cu ajutorul ADN-polimerazei, în prezenta celor 4
tipuri de nucleotide ADN (adenine/timin/guanine/citidin deoxi-nucleozid trifosfat)
pornind de la locul de fixare a primerului. ADN-polimeraza se leagă de capatul 3’ al
primerului şi sintetizează noul lanţ în direcţia 5’->3’, folosind drept matriţa segmentul
ADN lanţ unic de amplificat.Primerul va fi încorporate în noul lanţ de ADN format.În
acest fel lanţul de ADN este dublat şi, o data cu acesta, un ciclu de PCR este terminat.
ƒ începe un nou ciclu cu denaturarea de aceasta dată a ADN-ului dublu lanţ nou sintetizat
(în treapta anterior anterioara); mai departe, acest nou ciclu si acest ADN nou-sintetizat
(prin sinteza mijlocita de ADN-polimeraza);
ƒ cu fiecare nou ciclu ( de denaturare/sinteză a ADN-ului) va fi dublata cantitatea de ADN
rezultata din ciclul anterior.
Pentru sesizarea eventualelor erori sau neajunsuri ale reacţiei PCR, se recomandă;
- repetarea de mai multe ori a respectivei reacţii pentru aceeaşi probă;
- reacţia PCR sa fie însoţită, de fiecare dată, de controale negative.
C. Polimeraza utilizată în PCR.
În anii 1980, se folosea ADN-polimeraza Klenow (fragment de ADN-polimeraza I de la
e. coli); fiind termolabila, această enzima a fost apoi înlocuită cu o ADN-polimeraza
ternostabilă, izolată de la o bacterie termifila Thermus acquaticus.
Aceasta ADN-polimeraza a fost numită Taq-polimeraza. Taq-polimeraza este stabila
până la 95 grade C.
La fiecare nou ciclu al PCR se adaugă Taq-polimeraza proaspătă.Optimum de activitate
al acestei enzime este la 75-80 grade C; această activitate scade cu 50% la 60 grade C şi cu
90% la 37 grade C.
Dacă pentru PCR denaturarea ADN-ului se face la 95 grade C, noul adios de Taq-
polimeraza declanşeaza de fiecare dată ciclu următor de sinteza ADN. În acest fel, se poate
efectua reacţia în care toţi reactivii se pun de la început în recipient I până la sfarşitul reacţiei
nu mai trebuie adaugate noi cantităţi.
Utilizarea Taq-polimeraza a făcut posibilă automatizarea totala a acestei produceri în
maşinile Thermal Cyclers. În condiţii normale, cu ajutorul Taq-polimerazei se pot efectua
consecutive 40 de cicluri PCR, obţinându-se o amplificare ADN de ordinal 10 la puterea 6-10
la puterea 7. Dacă se urmareşte o amplificare ADN mai mare decât cea corespunzatoare la 40
de cicluri PCR, trebuie începuta o noua serie de cicluri, cu ajutorul ADN-ului amplificat,
obţinut şi diluat de 1000-10000 de ori.
În acest fel, cu ajutorul a doua serii câte 40 de cicluri PCR, se poate obţine o amplificare
de 109 a cantitaţii de ADN. Pentru o multiplicare sufienta de secvenţe ADN sunt necesare 25-
30 de cicluri de reacţii automatizate, care se efectuează, dupa cum am mai arătat, în
aproximativ 4 ore.
D. Amplicabilitatea practica a PCR-ului.
Produsele ADN obţinute prin PCR sunt separate electroforetic în funcţie de dimensiuni,
sub forma de benzi, în gelul de electroforeza, iar apoi benzile sunt făcute vizibile, în lumina
U.V. prin tratarea prealabilă a gelului cu etidiumbromid. Apoi se realizeaza hibridizarea
ADN-ului cu sonde genetice specifice prin metoda Souther Blotting. PCR are un spectru de
aplicabilitate foarte larg.
a) În diagnosticul medical.
În acest scop. ADN-ul extrage din celule proaspat lizate şi din celule fixate şi inglobate
în parafina. ADN-ul astfel extras este supus reacţiei polimerazei în lanţ şi apoi analizat cu
ajutorul sondelor genetice prin reacţia de hibridizare. PCR este utilizat în: diagnosticul bolilor
ereditare (fibroza chistica, anemia Cooley, distrofia musculara Duchenne, fenilcetonuria).
Diagnosticul bolilor ereditare, graţie PCR-ului, se poate face şi prenatal, în făt, prin
determinarea ADN-ului din celulele trofoblastice; prin aceasta metoda se poate face

283
determinarea prenatal pentru sexul copilului şi se poate pune şi diagnosticul unei eventuale
boli genetice. În urma recoltarii de lichid amniotic este supus determinarii cu ajutorul PCR-
ului sau al anticorpilor monoclonali, în acest fel fiind posibila determinarea de defecte
genetice cromozomiale, metabolice (enzimopatii). diagnosticul bolilor infecţioase.
Diagnosticul infecţiei HIV cu ajutorul PCR-ului se poate face în stadiile prococe ale
infecţiei, prin identificarea prezentei acidului nucleic viral în sânge (şi anume acidul nucleic
viral fixat în genomul celulei limfocitare umane), atunci când toate celelalte reacţii serologice
sunt înca negative.PCR poate da un rezultat precoce pozitiv chiar şi în prezenţa unei singure
celule infectate cu HIV ( din materialul de cercetat ).
Introducerea diagnosticului rapid al infecţiei HIV prin PCR este astazi absolut necesara
în practică, în special în investigarea donatorilor de sânge şi de organe.
Pentru diagnosticarea infecţiei HIV într-o encefalita declanşată de acest virus, nu este
necesara o proba de ţesut cerebral, ci este suficienta doar o proba de LCR.
În general, pentru un diagnostic prin PCR, recoltarea de probe reprezinta un stres minim
pentru bolnav; în acest caz se folosesc drept probe; spalatura bucala (cu celule epiteliale),
epitelii de fir de par, probe uscate de sânge. PCR mai este utilizat în diagnosticul urmatoarelor
boli infecţioase: hepatita virala, infecţia cu virus herpes simplex, virus Epstein-Barr,virus
papollima, Mycobacterium tbc., Pneumocistis carinii, Neisseria meningitides, Clostridium
difficile. Recent, cu ajutorul reacţiei PCR au fost efectuate studii genetice asupra tulpinei de
Vibro cholerae grup 0139 (izolata pentru întaia oara, pe glob, în 1992-1993, în Bengal),
reuşind sa se demonstreze ca această tulpina ar reprezenta rezultatul unor modificări genetice
suferite de tulpina Vibrio cholerae grup 01 biotip eltor, prin deletia, de pe ADN-ul
cromozomial, a unui segment de 22 kb, concomitant cu inserţia unui segment nou de 35 kb.
PCR este utilizat şi în identificarea unor germeni microbieni ramaşi până astăzi
necultivabili, de exemplu în boala Whipple.
Boala Whipple a fost semnalată pentru întâia oara în anul 1907; este primul exemplu din
partologia umană în care s-a emis ipoteza prezenţei posibile a unei bacterii necultivabile,
imposibil de identificat prin posibilitaţile clasice cunoscute. S-au postulat apoi şi alte boli de
etiologie posibil microbiana fara a fi însa posibilă evidenţierea prezenţei unor
microorganisme, probabil microbiană fără a fi însa posibilă evidenţierea vizuală, în aceste
cazuri fiind necesare alte metode decât cultivarea pe medii de cultura, pentru detectarea şi
identificarea agenţilor patogeni. Noile metode îşi au rădăcinile în filogenetica moleculara.
Boala whipple se manifesta clinic prin astralgii migratorii, febra, dureri abdominale, diaree,
pierderi în greutate, apariţia în ganglionii mezenterici de infiltrate macrofagice proeminente,
depozite de grasime.
b. În medicina judiciară
PRR este folosit pentru evidenţierea identităţii unui fir de părsau a unei cantităţi foarte
mici de sânge sau spermă. Astăzi PCR poate fi folosită în combinaţie cu metoda fingerprinting
în aceleaşi scopuri.
c. În studii ecologice
Cu ajutorul PCR s-a reuşit evidenţierea unui număr de microorganisme în probe de
pământ şi apă; au fost analizate microorganisme care până astăzi nu au putut fi cultivate pe
medii de cultură, cât şi microorganisme de sol care au suferit în timp modificări genetice.
d. În arheologie
PCR a fost utilizată până în prezent şi pentru analiza ADN provenit din mumii egiptene
vechi de mai bine de 2400 de ani.

284
12. 6. SECVENŢIEREA ADN- ului
Analiza structurii ADN a început o dată cu anii '70, cu ajutorul metodei de secvenţiere
ADN şi de analiză a secvenţelor nucleotidice din aceste structuri.
Acest studiu a fost posibil datorită folosirii enzimelor de restricţie (endonucleaze), care pot
tăia moleculele de ADN în fragmente de cîteva sute până la câteva mii de perechi de baze.
Aceste fragmente obţinute pot fi apoi separate electroforetic şi analizate.
La Los Angeles şi la Heidelberg există în prezent bănci de date în care au fost strânse
toate secvenţele ADN cunoscute până în prezent. Genomul multor virusuri a fost total
secvenţiat. În 1995 a fost terminată secvenţierea completă a primului genom bacterian, cel de
Haemophilus influenzae, urmat la scurt timp de cel de Mycoplasma genitalium. Curând vor fi
terminate şi secvenţierile complete ale genomurilor bacteriene Escherichia coli, Bacillus
subtilis, Methanobacterium thermoautotrophicum. La drojdii (drojdia de bere –
Saccharomyces cerevisiae), a fost secvenţiat pentru prima dată un cromozom, şi anume
cromozomul III, dovedindu-se că conţine 315 357 perechi de nucleotide şi 200 de gene; la
această analiză s-a lucrat trei ani în 35 de laboratoare din lume.
Cu ajutorul acestei proceduri s-au obţinut informaţii şi asupra materialului genetic inclus
în cele 23 de perechi de cromozomi umani, şi anume:
- locul relativ al genelor pe cromozomi;
- identificarea unuio număr de gene;
- cauzele unor boli genetice.
În prezent este în curs de desfăşurare proiectul de cercetare asupra genomului uman,
genom care conţine circa trei miliarde de perechi de bze (50 000 – 100 000 de gene).
Astăzi se ştie că doar 3 % din genomul uman reprezintă gene funcţionale (exoni), restul
de 97 % din genom reprezintă doar „balast genetic” a cărui semnificaţie este încă
necunoscută.
A. Principiu
Secvenţierea ADN (sequencing) înseamnă tăierea lanţului ADN în secvenţe şi analiza
ulterioară a secvenţelor de baze nucleotidice din aceste fragmente.
Prin descifrarea acestor secvenţe de baze se poate ajunge la delimitarea genelor şi la
stabilirea secvenţelor de aminoacizi codificate de o singură genă.
Ca urmare, analiza secvenţială a ADN-ului şi, indirect, cea a proteinelor corespunzătoare
pot furniza date cu privire la conformaţia proteinei, funcţiei proteice, înrudirii dintre proteine,
cât şi asupra bolilor produse prin mutaţii. Secvenţierea ADN este o variantă a tehnicii de
recombinare ADN cu ajutorul căreia se poate stabili secvenţa de baze din molecula ADN.
Condiţia de baza pentru realizarea acestei secvenţieri este prezenţa unui număr suficient de
copii ale moleculei de ADN. Acest lucru se poate realiza prin clonarea ADN sau prin metoda
PCR.
B. Metode
Pentru secvenţiere se folosesc două metode:
a. Metoda enzimatică; tehnica Sanger (Chain Termination Tehnique).
b. Metoda chimică; tehnica Maxam- Gilbert ( de obicei combinată cu metoda Sanger).
a. Metoda enzimatică
Tehnica Sanger
Principiu: se determină secvenţele de baze nucleotidice pe copia de acid nucleic şi prin
complementaritate se deduce secvenţa de baze de pe lanţul de acid nucleic de origine.
Etapele reacţiei:
- lantul dublu de acid nucleic (AN) aste adus la forma de AN unic lanţ;
- pe lanţul unic AN se fixează un primer (moleculă starter sau amorsă). Acest primer ste
un oligonucleotid scurt, preparat semiautomat prin tăiere, cu ajutorul enzimelor de
restricţie, a unui fragment ARN. Primerul este stfel selectat încât capătul 3' să se

285
 potrivească prin complementaritate, într-un punct, pe lanţul ADN de cercetat. Acest
primer este înglobat într-un vector sau secvenţă cunoscută;
- are loc sinteza lanţului ADN complementar (după modelul matriţei AN) în prezenţa celor
patru dezoxinucleotid trifosfaţi (dNTP: dATP, dTTP, dGTP, dCTP), dintre care unul este
marcat, a unui didezoxinucleotid trifosfat (ddNTP) şi a ADN-polimerazei I sau
reverstranscriptazei;
- sinteza lanţului ADN se va opri acolo unde în locul unui dNTP se va îngloba un ddNTP
corespunzător. În acest punct se va opri reacţia polimerazei. Această reacţie de sinteză a
ADN-ului se va desfăşura în patru variante, în fiecare din variante fiind marcat altul din
cele patru dNTP-uri;
- cele patru molecule de ADN dublu lanţ obţinute sunt denaturatze prin căldură;
- lanţul de acid nucleic nou sintetizat cu un nucleotid marcat este separat prin gel
elecroforeză;
- în locul marcării radioactive, fiecare bază este colorată cu altă substanţă fluorescentă.
Apoi se face citirea bazelor colorate de pe gelul de electroforeză prin autoradiografie.
b. Metoda chimică
Tehnica Maxam-Gilbert
Spre deosebire de tehnica Sanger, unde determinarea secvenţelor se face pe lanţul copie,
prin tehnica Maxam-Gilbert determinarea secvenţelor se face pe lanţul de acid nucleic de
origine. Tehica se bazează pe o modificare chimicăaunei baze şi o tăiere specifică la nivelul
altei baze (de exemplu adenina), de pe molecula ADN. Aceste reacţii au loc pe lanţul ADN
originar. În ultimii ani, în S.U.A. în laboratoarele de Genetică ale Universităţii Berkeley, s-au
realizat aparate automate pentru citirea secvenţelor de baze nucleotidice din acizii nucleici cu
viteza de 7 000 – 8 000 secvenţe de baze pe zi.

12.7. FINGERPRINTING GENOMIC (amprente de ADN)

a. Principiu
Pe baza analizelor de secvenţiere a ADN-ului, s-a demonstrat că fiecare individ este
caracterizat printr-un fingerprinting genomic (un pattern individual al regiunilor
hipervariabile din ADN-ul genomic, şi anume de pe zona ADN- urilor minisatelizate).
Genomul uman conţine trei miliarde de perechi de nucleotide, dintre care:
ƒ 70 % reprezintă secvenţe unice identice la toţi indivizii;
ƒ 30 % reprezintă secvenţe repetitive, şi anume:
- înalt repetitive 7 – 10 %; aceeaşi secvenţă de 300 perechi de nucleotide se repetă
de 30 000 – 1 milion de ori dispersat, pe toată lungimea genomului;
- gene structurale pentru sinteza de ARNt, ARNr şi histone;
- zona spacer ce conţine gene criptice (silenţioase);
- ADN-uri satelite înalt repetitive, netranscriptibilr, necodificatoare de proteine.
ƒ 20 – 30 % moderat repetitive, fiecare secvenţă cu câteva sute până la 6 000 de perechi de
nucleotide se repetă în 20 – 30 000 de copii.
b.Tehnica RFLP
Cu ajutorul acestei tehnici se pun în evidenţă zonele de ADN variabil de la individ la
individ. Aceste tipare de fragmente de ADN individual sunt reprezentate de o amprentă RFLP
specifcă ( polimorfismul de lungime al fragmentelor de restricţie).
Pentru determinarea acestor tipare individuale, se izolează ADN-ul genomic din celulele
unui organism (diferite ţesuturi, rădăcini ale firului de păr, sânge, salivă, spermă).
Tehnica RFLP cuprinde următoarele etape:
- ADN-ul extras este supus acţiunii enzimelor de restricţie;
- Fragmentele de ADN (dublu catenar) sunt supuse migrării bidimensionale într-un gel
denaturat (conţinând un agent chimic denaturat ca ureea, concentraţie 5 %);

286
 - Benzile de ADN unic lanţ obţinute în gel sunt supuse colorării cu etidiumbromid;
- Benzile ADN sunt vizualizate prin transiluminare la u.v.
Această tehnică evidenţiază atât prezenţa/asenţa fragmentelor de restricţie, cât şi
polimorfismul de lungime al respectivelor fragmente. Determinarea RFLP pentru organismele
eucariote, inclusiv omul, are semnificaţie, în mod deosebit, în cazul urmăririi transmiterii la
descendenţi, a informaţiei genetice parentale (prin compararea fringerprint- urilor între
generaţii). În cazul examinării singulare ( a informaţiei genetice per individ), se preferă
metoda Southern Blotting a cărei capacitate discriminatorie este considerată mai bună.
c.Tehnica AFLP
Această tehnică ce combină principiul analizei RFLP cu cel al reacţiei PCR înalt
specifică, detectează numai prezenţa sau absenţa fragmentelor de restricţie, dar nu face şi
analiza polimorfismului de lungime a fragmentelor. Tehnica este considerată astăzi metoda
universală pentru determinarea prezenţei/absenţei unei anumite amprente de ADN în orice
sursă de origine bacteriană, vegetală, animală sau umană.
d.Aplicaţii ale metodei amprentelor ADN
În medicina judiciară:
- în criminalistică; urmărirea criminalului poate fi condusă în funcţie de urmele găsite:
amprente individuale prezente în resturi de piele, păr, sânge, spermă. Dacă materialul
genetic se află în cantitate foarte mică, se recurge la PCR pentru amplificarea cantităţii de
ADN;
- diagnosticul paternităţii; având în vedere că variaţiile de ADN- urile minisatelite se
moştenesc după legile mendeliene, metoda amprentelor ADN este utilă pentru dovedirea
unei înrudiri (amprenta genetică diferă de la individ la individ, se potriveşte în mare parte
la rude şi este identică la gemenii univitelini);
În medicina clinică
- în boli genetice; în analiza de likage şi determinarea instabilităţii genetice;
- în oncologie; pentru diagnosticul midificărilor genetice din celulele tumorale de la
persoane cu carcinom mamar (se prepară şi se compară amprente de ADN din celulele
tumorale/elemente figurate sanguine cu condiţia ca în proba de sânge să nu existe celule
modificate oncogen;
- urmărirea epidimiologică a circulaţiei agenţilor infecţioşi pentru determinarea pattern-
urilor RFLP la virusuri şi tulpini bacteriene;
- stabilirea interrelaţilor virale şi bacteriene pe bază de amprente ADN, în vederea încadrării
taxonomice a unor noi agenţi infecţioşi;
- prin introducerea tehnicii de fracţionare a segmentelor de restricţie şi separării acestora în
gel cu gradient denaturat, se va putea, în viitor, măsura frecvenţa mutaţiilor în genomul
uman,se va putea analiza instabilitatea genomului şi a relaţiei acestuia cu senescenţa şi
neoplazia, se vor putea realiza analize de linkage şi cartare de noi gene implicate în boli
genetice;
În biologie
- stabilirea paternităţii unor păsări de pradă ale căror ouă au fost clocite de părinţi adoptivi;
- stabilirea de relaţii genetice între diferite specii pe baza structurii ADN-ului, acest criteriu
fiind superior celui al sistematizării de până în prezent, efectuat pe bază simplelor
caractere morfologice;
- stabilirea polimorfismului genetic în interiorul aceleiaşi specii (de exemplu, heterozigoţii);
- pe baza existenţei RFLP-urilor au fost amplificate şi analizate secvenţe nucleotidice din
fragmente ADN provenite de la specii dispărute;
În arheologie
- s-a analizat ADN-ul provenit de la mumii egiptene vechi de mai bine de 2400 de ani
(prin clonare şi secvenţierea unor fragmente ADN de circa 3400 de baze).

287
 Capitolul 13

BIOSENZORII

13.1. Biosenzorii – sisteme de coantificare a informaţiilor viului

Problema biosenzorilor este un capitol al biotehnicilor de cea mai mare importanţă –mai
ales în ultimii ani—dar şi extrem de complicată şi vastă. De curând, cercetătorii şi tehnicienii
cu preocupări în acest domeniu au propus chiar o diferenţiere semantică a acestor sisteme de
cuantificare a informaţiilor ce pot fi obţinute în diferitele funcţiuni ale lumii viului. Astfel, a
fost propusă o terminologie care să se refere la traductori pentru toate sistemele de înregistrare
şi prelucrare a informaţiei ca utilizări şi în biologie; senzori biologici – pentru sistemele
naturale ale fiinţelor vii (organe de simţ: văz, auz, pipăit etc.) iar termenul de biosenzori să fie
atribuit generic oricărui sistem simplu sau mixt (natural sau construit de om) care să
înregistreze la nivel micro informaţia circulantă într-un sistem viu.
Domeniile de studiu primar pentru a cunoaşte sau a fabrica aceşti biosenzori sunt
biochimia, biofizica şi biocibernetica, precum şi alte ştiinţe antecesoare acestora, inclusiv
microtehnologiile speciale din domeniul micromecanicii şi microelectronicii.
Ţinând seama de complexitatea acestei problematici, precum şi de evidenta dezvoltare
a domeniului biosenzorilor şi a aplicaţiilor acestora în biotehnologii, ne-am propus
enumerarea principalelor tipuri de biosenzori moderni şi tradiţionali:
- senzori piezoelectrici, potenţiometrici, amperometrici, electrochimici;
- senzori enzimatici amperometrici (monoenzimatici şi dienzimatici, mono- şi multi strat):
metabolici, pentru glucoză, galactoză, gluconat, lactat, piruvat, alcooli, fenoli, amine,
coresterol, acizi nucleici, aminoacizi etc.;
- senzori care au la bază reacţii de tip imunitar: cu dispozitiv membranar, cu pierdere de
reacţii, imunosenzori optici;
- senzori cu receptori.
Dintre aplicaţiile biosenzorilor, enumerăm:
- utilizarea biosenzorilor pentru laboratoare clinice şi chimice;
- monotorizarea permanentă a pacienţilor cu senzori implantaţi;
- inregistrarea glucozei în sânge;
- măsurarea de ureii din rinichiul artificial;
- analiza produselor alimentare;
- controlul proceselor în industria microbiologică şi în protecţia mediului.
Determinarea selectivă şi cu sensibilitate mare a unui număr crescut de combinaţii are o
deosebită importanţă, atât pentru cercetare, cât şi pentru diferite ramuri ale economiei, de
exemplu supravegherea producţiei în industia chimică şi alimentară.
În domeniul medical, această metodă este de neînlocuit în stabilirea diagnosticului bolnavilor.
De asemenea, în biotehnologie este necesară, printre altele, pentru analiza componentelor
mediilor de cultură.
O dată cu progresele remarcabile din domeniul analiticii instrumentale, de exemplu
cromatografia gazoasă, cromatografia fluxului de lichid (fluidităţii) la presiuni ridicate,
măsuri spectrometrice şi spectroscopia absorbţiei atomice, în combinaţie cu microelectronica,
s-a ajuns la obţinerea unei înalte selectivităţi în microanalitică. Aceste metode sunt, datorită
costurilor ridicate, implementate doar în cadrul laboratoarelor. Cu toate acestea, dezvoltarea
măsurătorilor de investigaţie selective şi uşor de manevrat reprezintă o problemă cheie a
analiticii.

288
 Într-o primă parte dorim să facem o analiză a unor probleme şi în acelaşi timp un studiu
paralel care să, includă date ştiinţifice de activitate relatate de specialişti care au lucrat
nemijlocit la această problemă.
Ne bazăm, în realizarea calitativă a analizei şi sintezei propuse, pe experienţa didactică
şi de cercetare dar şi pe o bogată bibliografie adunată în timp, cu precădere în ultimii 7-8 ani.

13.2. Impactul informaţional al biosenzorilor

Ştim din ce în ce mai exact felul în care sistemul genetic stochează şi distribuie
informaţia, sistemul neuro-endocrin crează şi manipulează informaţia, sistemul imunologic
prelucrează şi utilizează informaţia, într-un cuvânt, pe măsură ce timpul se desfăşoară iar nu-
mărul populaţiilor biologice creşte, se eliberează în proporţie geometrică informaţia care
caracterizează dinamica atât a. sistemelor vii cît şi a celor considerate neînsufleţite.
Se creează fireşte, necesitatea recepţionării cât mai complete şi mai exacte a acestei forme de
existenţă a universului, recepţionată de om drept componentă a tetradei care descrie o formă
de echilibru substanţă-energie-informaţie-timp.Tot atît de firesc, apare interesul omului pentru
abţinerea unor captatori cît mai fideli ai informaţiei primite de la diferite sisteme vii sau nevii,
nevoia de a avea senzori sensibili şi fiabili pentru orice demers în domeniul cunoaşterii.
Dacă cu mulţi ani în urmă, senzorii îmbrăcau forma instrumentaţiei utilizată în
laboratoare pentru cercetări experimentale, în prezent aria preocupărilor în vederea obţinerii
unor date dinamice în studiul proceselor a conturat în profunzime imaginea despre utilitatea şi
importanţa senzorilor. Cercetările de bionică au adus noi clarificări privind simularea şi
extrapolarea senzorilor naturali (din organele de simţ) cu posibilităţi de utilizare nu numai în
biomedicină dar şi în dirijarea unor procese industriale.
Dezvoltarea roboticii a crescut şi mai pregnant importanţa senzorilor, în vederea dotării
roboţilor cu asemenea capacităţi de orientare şi de lucru. Senzorii optici bazaţi pe
microcamere TV au fost suplimentaţi cu sisteme de recunoaştere a formelor şi imaginilor alb-
negru şi color precum şi cu analizori termici. O altă serie de aparate au fost concepute pentru
prevenirea incendiilor sau decelarea fenomenelor de poluare sau de toxicitate în mediul
înconjurător.
Dezvoltarea automaticii a solicitat intens crearea unor noi sisteme de culegere rapidă a
informaţiei. Aceste preocupări, departe de a rezolva toate problemele, au creat o serie de noi
întrebări atât la nivelul utilizatorilor cât mai ales a specialiştilor. Iată succint, spre
exemplificare, câteva din acestea.
- Informaţia este delimitată strict şi poate creşte prin adiţionare sau este holografică?
- Semnalele conţin informaţie. Sunt suport al informaţiei sau sunt catalizatori ai informaţiei
cognoscibile?
- Emiterea sau culegerea informaţiei este uniformă sau periodică? Acţiunea sa asupra
receptorilor este ritmică sau continuă?
- Natura este mai bogată astăzi în informaţie liberă, circulantă, decât acum 1 milion de ani?
- Raportul dintre cantitatea totală de informaţie existentă şi utilizată este constant?
- Creşterea utilizării informaţiei şi necesitatea cuprinderii sale de către sistemul nervos
uman, poate genera, peste anumite limite, o patologie specifică?
- Impactul psihologic între necesitatea şi obligaţia de a consuma mereu mai multă
informaţie şi nevoia de adaptare a omului la lumea informaţională, creează noi probleme?
Lista acestor întrebări poate continua iar răspunsurile sunt departe de a fi complete.
Dacă în domeniul tehnologiilor se pare că eforturile pot fi suficient determinate, în
domeniul cunoaşterii biologice şi medicale curiozitatea şi motivaţiile sunt din ce în ce mai
puternice, ceea ce i-a făcut pe mulţi să afirme că secolul următor va fi secolul biologiei.
Ştiinţa şi industria computerelor a făcut un mare pas înainte când pe lângă hard-ware şi
soft-ware a adăugat brain-ware.

289
 Această triadă deschide de pe acum posibilităţi nebănuite puterii de calcul şi stocare în
informatică.
Modelul biologic pătrunde impetuos în tehnică. Cu puţin timp în urmă au apărut
primele biocipuri. Acum ele se perfecţionează rapid, apărând noi componente având ca
suport materia vie. S-a născut un nou domeniu, biosenzorii - bioizi din ce în ce mai
perfecţionaţi.
Ca în orice domeniu, culegerea şi prelucrarea informaţiei se face etapizat pe mai multe
nivele structural-energetice, intensitatea semnalelor şi informaţiilor culese fiind în funcţie de
capacitatea receptorilor de a vehicula pe canalele specifice fluxul informaţional.
În acest context, senzorii construiţi de om se supun legilor naturale descrise de chimia-
fizică, fiind de fapt modele ale aplicaţiilor curent utilizate de cercetările biofizice. Fiabilitatea
lor este relativ mare dar aproape în totalitate determinată de tehnologiile utilizate.
În ceea ce priveşte senzorii naturali biologici (tactili, vizuali, auditivi etc.), calitatea
informaţiei prelucrate este dependentă de structura anatomo-fiziologică, de sensibilitatea şi
modelele fixate repetitiv pe sistemele de memorare ale organismelor vii. Condiţionarea
genetică joacă un rol determinant în acest caz.
Dacă ne referim la achiziţiile dobândite în cadrul dezvoltării ontogenetice şi
filogenetice, gradul de diferenţiere a prelucrării şi utilizării semnalelor din mediul intern şi
extern este diferit în funcţie de complexitatea organismului studiat, pe scara biologică. La om,
integrarea psiho-neuro-endocrino-imunologică complică procesul de înţelegere al
mecanismului şi modului de acţiune selectiv a senzorilor biologici. Cu toate acestea,
cercetarea ştiinţifică actuală încearcă să elucideze separat sau integrat modul de acţiune al
circulaţiei pe canale informaţionale a vectorilor semnalelor stimulatori sau inhibitori la nivelul
diferitelor verigi biocibernetice. Variaţia rapidă, în timp a acestor fluxuri informaţionale
constituie un impediment destul de serios al cunoaşterii reale, în timp util, a principalelor căi
şi modele reale în care selecţia informaţională acţionează.
Pe măsură ce coborâm la nivele de organizare mai profunde, cantitatea de informaţie
deşi aparent scade, este mult mai densă, dar diferenţiat, cuantificarea energetico-
informaţională este mai greu de realizat pentru cercetători. În aceste situaţii aparatura de
măsurare întâmpină greutăţi din ce în ce mai mari începând cu selecţia semnalului din
zgomotul de fond şi înlăturarea bruiajelor şi până la obţinerea unor valori individualizate care
pot fi interpretabile sau pot constitui valori de referinţă. Fără îndoială că natura a creat o
multitudine de biosenzori care rezolvă pe plan biologic aceste probleme. Tehnologia din
momentul de faţă nu este însă suficientă pentru a ne oferi rezolvări concrete şi acest fapt face
să considerăm că elaborarea şi cunoaşterea biosenzorilor se află încă în domeniul
pionieratului. În momentul de faţă, sunt întreprinse cercetări aprofundate privind reglarea
schimburilor la nivelul membranelor celulare, al modului de acţiune al microbiocurenţilor, a
electricităţii „chimice" a enzimelor de restricţie şi recombinare, a cunoaşterii algoritmului de
modificare a raporturilor de electroliţi şi a pompelor ionice, a biocomunicării şi modificarea
câmpurilor ce acţionează în sfera biologicului, a efectelor de fineţe din interacţiunea
macrocosmos şi microcosmos.
Mintea umană încearcă un efort de autodepăşire în înţelegerea unor variante noi
matematico-logice de utilizare de noi limbaje, utilizând probabilităţi neinvestigate încă, în
efortul de a depăşi experimentalul posibil şi în speranţa de a deschide noi ferestre în domeniul
cunoaşterii.

13.3. Metodologia de cercetare a proprietăţilor senzorilor biologici

Sensibilitatea oricărui sistem de măsură este condiţionată în mare măsură de calitatea
traductoarelor utilizate.
Traductoarele clasice (cele inductive, capacitive, rezistive etc.) au intrat în competiţie cu
o nouă clasă de traductoare, traductoarele biologice. Utilizarea unui organism viu sau a unei
290
porţiuni din acesta (ţesut, celulă, enzimă), în scopul obţinerii unor informaţii asupra mediului
înconjurător nu este o idee nouă. Ea a apărut pe la începutul secolului, prin cercetările
efectuate de exemplu, de fizicianul C. Bose, dar a căpătat o dezvoltare explozivă doar în
ultimii ani, când tehnica de calcul şi progresele tehnologice au permis-o. Deşi rezultatele
obţinute au depăşit faza de laborator, extinderea pe scară largă a acestor senzori este încă
limitată, atât de considerente de ordin tehnologic, cât şi de dificultăţile pe care aceşti senzori
le pun în faţa cercetătorilor privind stabilitatea şi reproductibilitatea semnalelor preluate.
Tendinţa de abordare globală a interacţiunilor unui biosenzor cu mediul înconjurător,în sensul
deschiderilor şi intra-deschiderilor pe care o manifestă, se loveşte de cele mai multe ori de o
inconsecvenţă în metodologia experimentală în care metodele clasice nu sunt organic
integrate cu cele noi apărute. Majoritatea studiilor efectuate asupra utilizării senzorilor
biologici în măsurătorile fizice, vizează îmbunătăţirea performanţelor aparatelor de măsură, în
sensul creşterii-sensibilităţii şi selectivităţii faţă de mărimile măsurate. Substratul biologic
utilizat este de cele mai multe ori o parte specializată dintr-un sistem viu, fapt ce determină o
reducere a interacţiunilor pe care partea o are în cadrul întregului, şi deci, permite abordarea
mai simplă a metodelor de interpretare. În momentul de faţă numeroase măsurători din
domeniul chimiei beneficiază de aceasta categorie de traductoare. Tehnologia actuală permite
izolarea unor enzime şi implementarea lor în sisteme de măsurare oferind acestora
sensibilitate şi selectivitate ridicată, răspuns la stimul uşor de recunoscut, la un preţ de cost
scăzut. Preluarea unor semnale electrice de la părţi ale unui organism viu, deşi beneficiază de
avantajul selectivităţii specifice unui organ specializat, ridică o serie de probleme, cum ar fi
tehnica de prelevare fără traume esenţiale, asigurarea condiţiilor de viaţă pe durata cât mai
lungă a porţiunii prelevate, tehnica de implementare a electrozilor şi natura materialului din
care se execută aceştia, în vederea reducerii perturbaţiilor în funcţionarea porţiunii prelevate.
Chiar dacă se asigură toate condiţiile de mai sus partea prelevată nu va beneficia de
interacţiunea sa cu întregul sistem, motiv pentru care răspunsul obţinut poate fi diferit sau
deformat. De exemplu, se cunoaşte că răspunsul electric al unei fibre nervoase este diferit la
măsurătorile în vitro faţă de cele „in vivo”. Din acest motiv se consideră o variantă posibilă de
utilizare ca senzor biologic a unui organism întreg, ,problema revenind în a se determina zona
sau punctele de măsură şi metodologia de interpretare a rezultatelor în funcţie de tipul şi de
natura interacţiunii urmărite a se măsura. Dacă se ţine seama de necesitatea imobilizării pe
durata măsurătorilor a organismului viu, se poate aprecia că planta poate răspunde cel mai
bine acestei cerinţe (imobilizare naturală).

13.4. Aparatura de măsurare

Cunoaşterea influenţei aparaturii de măsura asupra senzorului biologic este esenţială în

sensul reproductibilităţii măsurătorilor efectuate. Ea trebuie judecată prin prisma
caracteristicii puternic neliniare a interfeţei organism-mediu, majoritatea măsurătorilor
implicând aplicarea,pe suprafaţa organismului viu a unor electrozi şi conectarea acestora la un
sistem electronic de măsurare.
Mergând mai spre concret, se constată, de exemplu, că membranele biologice (i)
prezintă o caracteristică neliniară a curbelor tensiune-curent.
Caracteristica măsurată scoate în evidenţă două aspecte deosebite:
- asimetria (valorile curentului în cele două sensuri nu sunt egale pentru o aceeaşi
tensiune aplicată);
- prezenţa unor zone de rezistenţă negativă (fig.153).

291
 Fig. 153 - Curba
caracteristică tensiune – curent

Cercetările efectuate asupra

utilizării plantelor ca senzori
biologici au scos în evidenţă o
dinamică a acestor curbe, în special
în sensul variaţiei zonei de
rezistenţă negativă. De asemenea s-
a constatat existenţa pe suprafaţa
frunzelor a unor puncte de
rezistenţă electrică scăzute,
asemănătoare prin modul de
identificare cu punctele de acu-
punctură.
Spre deosebire de acestea ele sunt grupate în zone pe suprafaţa frunzei,
neidentificându-se o lege de amplasare.

13.5. Posibilităţi de folosire a biosenzorilor în biotehnologie

Procesele biotehnologice sunt folosite tot mai des în practică pentru a obţine produse
utile. Pot fi realizate noi industrii de înaltă eficienţă, dar pentru aceasta este necesară o
reglare sigură a sistemelor folosind modele matematice adecvate şi o informaţie cât mai
completă asupra lor. Dacă practic mărimile fizice pot fi măsurate cu succes, în schimb
parametrii chimici intercelulari sunt mai dificil de măsurat; biodetectorii (biosenzorii)
trebuie să rezolve această problemă.
Biosenzorul poate fi definit ca dispozitiv (de regulă electronic) ce foloseşte molecule
de interes biologic pentru a detecta molecule specifice. Poate consta dintr-un biocatalizator
imobilizat şi dintr-un aparat fizico-chimic care transformă informaţia chimică într-un sem-
nal electric.
O primă clasificare a unor biosenzori:
- senzori enzimatici;
- senzori microbieni;
- imunosenzori (ca antigeni şi anticorpi);
- senzori ca organite celulare.
Senzorii enzimatici conţin o enzimă determinată, care este imobilizată după o
tehnică convenabilă şi un senzor fizico-chimic corespunzător. Enzima reacţionează selectiv
cu substratul său, măsurându-se astfel concentraţia de substrat. Stabilitatea enzimei este
foarte importantă pentru realizarea măsurătorilor.
Imobilizarea de enzime şi celule pe purtător s e face cu metode fizice şi chimice. Prin
metode chimice se realizează legătura covalentă între e n z i m a şi substrsatul solid.
Imobilizarea este ireversibilă. În cazul metodelor fizice imobilizarea este reversibilă.
Sunt folosite membranele semipermeabile, mai ales la construirea biosenzorilor
electrochimici.
În prezent, din circa 2000 de enzime, numai 30 sunt de interes comercial. Î n j u r de 500
sunt oxidoreducătoare, catalizând reacţii c u cedare de electroni; sunt cunoscute circa 50 de
oxidaze, folosite în tandem cu electrodul Clark pentru măsurători amperometrice de
concentraţii pentru diferite substanţe.
În biofermentoare folosirea biosenzorilor este dificilă din motivul c ă nu pot fi sterilizaţi
termic ş i chimic, nici cu radiaţii şi n i c i printr-un alt procedeu. Din aceste motive, nu sunt
direct folosibili î n aceasta arie tehnologică. De asemenea, stabilitatea electrozilor enzimatici

292
nu este suficientă pentru măsurători de lungă durată. Inhibitorii din substratul de fermentaţie
induc erori mari de măsurare.
Senzorii microbieni constau din microorganisme imobilizate într-un suport poros;
aceste microorganisme conţin enzime de interes. Senzorii microbieni construiţi pe un
principiu electrochimic pot fi împărţiţi astfel:
- senzori cu determinarea amperometrică a activităţii respiratorii;
- senzori cu determinarea amperometrică sau potenţiometrică a metaboliţilor (substraturi
electroactive).
O clasificare a biosenzorilor după metoda folosită în prelucrarea informaţiei prelevate
de aparate fizico-chimice ar putea fi următoarea:
- biosenzori bazaţi pe metode electrochimice;
- biosenzori cu procese de combustie;
- biosenzori electromagnetici;
- biosenzori optici;
- biosenzori electronici.
Biosenzorii electrochimici au la bază un electrod chimic selectiv. Se determină selectiv o
substanţă care apare în reacţia biochimică. Dăm ca exemplu electrodul de glucoză (fig. 154).

Fig. 154 - Schema unui biosenzor electrochimic cu electrod de glucoză

1 – catod; 2 – anod; 3 – membrană de acetat de celuloză; 4 – membrană cu enzimă
imobilizată; 5 – membrană de policarbonat.

Glucoza difuzează prin membrane (5) cu grosimea de 5 µm şi cu p o r i de 0,03 µm care

blochează enzime ş i coloizi care ar deranja zone de reacţie. Când glucoza ajunge în stratul de
mijloc se formează H202, proporţional cu viteza de difuzie a glucozei. H202 difuzează la anod
şi acolo are l o c reacţia (1).
A treia pelicula este o membrană de acetat de celuloză c a r e lasă s ă treacă uşor H202
dar reţine reductori. Curenţii de semnal obţinut de la traductor sunt proporţionali cu
concentraţia de glucoză din probă.
Sistemul de reacţii se poate schematiza astfel:

(1) H202→2H+ +O2 + 2ē

(2) 2AgCl + 2ē→2Ag + 2Cl-

(3) 4Ag + 4Cl- + 02 + 2H20→4AgCl + 40H-

(4) β+ D-glucoza + 0 2 glucozooxidaza glucono-&-lactoză +H202

Substrat +enzimă ↔ produs+ enzimă oxidată

Enzima oxidată + intermediar ↔ enzime + intermediar oxidat + profoni
Reacţia la electrod este :

Intermediar oxidat ↔intermediar + electroni

Ex. de intermediari : (C9H5)2Fe, (OH3C5H4)2Fe, (HOOC C5H4)FeC5H5.

293
 Biosenzorii microbieni, folosesc un electrod Clark pentru p02 p r i n c a r e se
determină amperometric activitatea respiratorie a microorganismului folosit.
În figura 155 este prezentată schema unui electrod de glucoză microbian bazat pe
determinarea amperometrică a activităţii respiratorii a celulelor imobilizate de Pseudomonas
fluorescens.

Fig. 155 - Schema unui

electrod de glucoză microbian.
1 – electrod de pO2; 2 –
membrană de teflon; 3 –
membrană calogenică cu bacterie.

Glucoza şi O2, intră în

metabolismul bacteriei. Se
măsoară consumul de oxigen care
este direct legat de concentraţia de
glucoză. Timpul de răspuns este
destul de lung (circa 10 min).
Precizia măsurării este bună, nefiind supărătoare interferenţele cu alte glucide sau
aminoacizi. Pentru acest tip de senzori a fost elaborată o metodă în impulsuri, timpul de
măsurare scăzând la circa 30 s.
Biosenzorii cu produs secundar de combustie se bazează pe măsurarea unei substanţe
eliberate într-un proces biochimic enzimatic. Substanţa eliberată este proporţională cu
cantitatea de reagent. Ca exemplu, poate fi dat termistorul enzimatic şi microbial (fig. 156).
Corpul este prezentat de un calorimetru adiabatic în flux. Prin el trece o soluţie tampon,
adusă cu o pompă peristaltică cu 0,5-4 ml/min. Trecând prin schimbătorul de căldură aceasta
se încălzeşte până la o temperatură dată. Când într-o astfel de soluţie se adaugă şi proba
(0,1-1 ml), în tubul de curgere cu enzima imobilizată sau microorganisme are loc reacţia
biochimică. Ca rezultat are loc o cedare de căldură proporţională cu concentraţia de
substanţă. Se obţine o diferenţă de temperatură t2 – t1 între temperatura iniţială constantă t1 ─
t2, ca urmare a procesului din tub.

Fig. 156 - Termistor enzimatic

1 – termostat; 2 – schimbători de
căldură; 3 – termistori; 4 – tub de
curgere; 5 – enzimă imobilizată.
Metoda se foloseşte pentru
măsurători continue. S-au construit
termistori enzimatici pentru măsurători
de concentraţii în cazul acidului
ascorbic, etanol, glucoză, lactoză,
penicilina, zaharoză, trigliceride, uree.
Biosenzorii electromagnetici
au o înaltă sensibilitate şi siguranţă analitică, dar din cauza complexităţii, au încă o
aplicabilitate redusă (ex. spectrometrie de masă cu enzime pentru glucoză, glutamat, L-ami-
noacizi).
Biosenzorii electronici utilizează tehnici de imobilizare enzimatică şi microelectronică
şi este o direcţie de perspectivă în ce priveşte crearea unor dispozitive de biosenzori
miniaturali, foarte sensibile şi multifuncţionale.
Tranzistorii cu efect de câmp fac obiectul unor intense activităţi de investigare. Aceşti
tranzistori absorb ioni din soluţie prin învelişul ionoselectiv modificând curentul prin
tranzistor.
294
 Biosenzorii optici s-au dezvoltat sub forma senzorilor ce au la bază reacţii imunitare.
Se foloseşte semnalul optic ce apare în timpul reacţiei antigen─ anticorp. Spectroscopia
convenţională nu este aplicabilă în acest caz. Senzorii de acest tip au aplicaţii în medicină,
independent de, faptul că încă nu s-a atins sensibilitatea determinarilor radioimunologice.
În figura 157 se arată schematic senzorul enzimatic electronic cu structura de tranzitor
cu efect de cîmp iar în figura 158 este reprezentată schema pe măsură cu un astfel de senzor,
precum şi dependenţa curentului prin sursă în funcţie de pH. Cu enzimă imibilizată pe stratul
izolator de pe poarta tranzistorului cu efect de cîmp s-a realizat un biosenzor pentru măsurarea
ureii, aceticolinei, glucozei etc.

Fig. 157 - Senzor electronic cu enzimă cu

structură de tranzistor cu efect de câmp

Fig. 158 - Schema de măsură cu

senzorul electronic de măsură şi
dependenţa curentului de pH-ul
soluţiei.
1 – apă cu temperatura constantă; 2 –
probă; 3 – electrodul Ag - Ag Cl (pastă); 4
– tranzistor cu efect de câmp; 5 –
înregistrator.
Avantajele biosenzorilor electronici sunt că pot fi combinaţi senzori pentru mai
mulţi componenţii, au dimensiuni mici şi uşurinţa, de a fi legaţi la aparatura de măsură.
Vor fi realizaţi în număr mare în viitor. Se combină cu măsurătorile de pH, O2, C02,
potenţial redox şi glucoză. Probleme importante pune structura capacitivă: membrana -
izolator - poartă. În privinţa perspectivelor folosirii biosenzorilor în controlul şi reglarea
proceselor de fermentaţie, până în 1975 au apărut 120 de patente de biosenzori (50%
electrochimici). Avantajele se bazează pe:
- enzimele imobilizate, microorganismele au acţiuni selective; bună sensibilitate; pot
masura concentraţii foarte mici de substrat organic; aparatura nu este foarte
complicată; semnalul de ieşire este electric; sunt uşor de indus, nu au implicaţii asupra
purităţii optice a probei măsurate. Pot fi folosiţi la reglarea proceselor de fermentaţie.
Dezavantajele biosenzorilor pot fi rezumate astfel:
- nu sunt sterilizabili nici termic, nici chimic;
- au stabilitate scăzută (mai cu seamă pentru cei enzimatici);
- biocatalizatorii sunt greu de pregătit;
- apar erori din cauza inhibitorilor catalizatorilor;
- după datele fvrnizate de literatura de specialitate aceşti senzori se folosesc mai cu seama
în laborator;
- există problemele de preţ privind aparatura, sensibilitate şi selectivitatea;
- cea mai mare problema este cea legată de sterilizare.

295
 BIBLIOGRAFIE

1. ALBERTS B., and col., 1989 – Molecular biology of the cell, General Publishing Inc.,
New York.
2. ALBERTS B., BRAY D., HOPKIN K., 2004 - Biologie moléculaire de la cellule,
Flammarion Médecine-Sciences, Paris.
3. ANDREICUT S, BECUS, M, 1985 - Biologie Celulara, Indrumator de Lucrari Practice si
demonstratii, Litografia IMF, Tg Mures.
4. ANTOHI S., GAVRILĂ L., 1983 – Progrese în genetica moleculară, Ed. Ştiinţifică şi
Pedagogică, Bucureşti.
5. ATANASIU L., 1990 – Utilizarea fotosintezei ca sursă alternativă de energie,
Biotehnologii moderne, ED. Tehnică, Bucureşti.
6. BARABAS N., PRISECARU MARIA., 1999 - Histologie vegetala, Ed. Emil Borcea,
Bacau, 1999, 150 p.
7. BEHNKE H. D., and col., 1993 – Progress in botany, ed. Springer-Verlang, Heidelberg.
8. BENGA G., 1985 - "Biologia celulară şi moleculară", Ed. Dacia, Cluj-Napoca.
9. BERCEANU ST., PĂUNESCU E., 1981 – Biologia şi patologia imunităţii, Ed. Acad.
Române.
10. BOGDAN C., 1988 - Elemente de geriatrie practică. Ed. Medicală, Bucureşti.
11. BUCUR GH., 1987 – Boli dermatovenerice, Ed. Ştiinţifică şi Enciclopedică, Bucureşti.
12. CACHIŢĂ-COSMA D., 1987 – Metode in vitro la plantele de cultură, Ed. Ceres,
Bucureşti.
13. CAJAL N., 1990 – Tratat de virusologie medicală, vol. I, 407 – 413, Ed. Medicală,
Bucureşti.
14. CHIRICUŢĂ, 1984 – Cancerologie generală, Ed. Medicală, Bucureşti.
15. CÎRLAN V.M., 2001 – Clonarea animalelor şi consecinţele clonării, Ed. Junimea, Iaşi.
16. CORMARK H. D. , 2003 - Esential Histology and Citology, Philadelphia.
17. COTRUTZ C., 1994 - Manual de Lucrari Practice de Biologie Celulara, Ed. Tehnica
Chisinau.
18. CRISTEA T.O., GHICA M., PRISECARU M.,- Variatia randamentului de
micropropagare “in vitro”determinate de influenta genotipului la varza alba pentru
capatana-Brassica oleracea L.,forma alba,U.S.A.M.V.,Iasi,Lucr,St.,anulXLVIII vol.I,
(48),seria Horticultura, Ed.Ion Ionescu de la Brad,I.S.N.N. 1454-7376, 2005, p.191-196.
19. CRISTEA TINA OANA, AMBARUŞ SILVICA, MARIA PRISECARU, FALTICEANU
MARCELA, 2008 - Effect of „in vitro” plant growth regulators over the meristematic and
mitotic activity at different genotypes of CAPSICUM ANUUM L.. U.Ş.A.M.V. Iaşi,
Simpozionul ştiinţific international ″Horticultura, stiinta, diversitate, armonie″, Facultatea
de Horticultură Iaşi, 29 – 31 Mai 2008 Lucrări ştiinţifice, Seria Horticultură, Editura “Ion
Ionescu de la Brad ”, I.S.S.N. 1454 – 7376, p. 201-206.
20. CRISTEA TINA OANA, SILVICA AMBĂRUŞ, MARCELA FALTICEANU, MARIA
PRISECARU, 2007 - Studies concerning the utilisation of “in vitro” micropropagation in
the conservation process of some valuable genotypes of pepper - Capsicum anuum L.,
U.Ş.A.M.V. Iaşi, Lucrări ştiinţifice, Anul L, Vol. I (50) Seria Horticultură, Editura “Ion
Ionescu de la Brad”, I.S.S.N. 1454 – 7376, p. 439-444.

21. CRISTEA TINA OANA, SILVICA AMBĂRUŞ, MARIA PRISECARU, 2008 -

Cytogenetic Effects Induced by „In Vitro” Cultivation of Shoot Tips at Capsicum Anuum
L., Universitatea de Ştiinţe Agronomice şi Medicină Veterinară, Bucureşti, Lucrări
ştiinţifice UŞAMV Bucureşti, seria V, vol. LI, ISSN 1222-5312, p. 50-55.

296
22. CRISTEA TINA OANA, 2008 - Utilizarea biotehnologiilor vegetale în ameliorarea
plantelor, Ed. Vicovia, Bacău, ISBN: 978-973-1902-09-8.
23. CRUCE M., 2002 - Biologie Celulara si Moleculara, Ed. Aius Craiova.
24. DARNELL J., and col., 1990 – Molecular cell biology, Sc.Am.Books, New York.
25. DĂNĂILĂ L., PAIS V., 1988 – Ateroscleroza cerebrală din sistemul carotidian, Ed.
Ştiinţifică şi Enciclopedică, Bucureşti.
26. DICULESCU I., ONICESCU D., BENGA G., POPESCU L. M., 1983 - "Biologie
celulară", Ed. Did. şi Ped., Bucureşti.
27. DICULESCU I., ONICESCU DOINA, BENGA GH., POPESCU L. M., 1987 –
Histologie medicală, Ed. Medicală, Bucureşti.
28. DIMOFTACHE C., JERMAN SONIA, 1993 – Biofizică medicală, partea a III-a Biofizică
celulară, Ed. Cerma, Bucureşti.
29. DUDAN R., VIKI ALLAN, KREIS T., 1991 – Trends in Cell Biology, 1, 15-19.
30. DUMITRU I.F., 1980 – Biochimie, Ed. Did. şi Ped., Bucureşti.
31. FRASINEL N., VERDES D., 1994 - Biologie Celulara si Moleculara, Ed. Mirton,
Timisoara.
32. GAVRILĂ L., AGRIPINA LUNGEANU, ROGOZ I., 1989 – Citogenetică moleculară şi
evoluţionistă, Ed. Ştiinţifică şi Enciclopedică, Bucureşti.
33. GAVRILĂ L., DABALĂ I., 1981 – Descifrând tainele eredităţii, vol. I, II, Ed. Dacia,
Cluj-Napoca.
34. GENEVES L., 1972 – Biologie cellulaire, tome I, II, Dunod, Paris.
35. GHEORGHE BENGA, 2005 - Introducere în Biologie Celularã şi Molecularã, Ed.
Medicalã Universitarã, Cluj-Napoca.
36. GHERMAN I., 1994 – Bazele celulare ale creşterii, diferenţierii, îmbătrânirii,
degenerescenţei şi morţii celulare, pag. 93, în: Curs de Biologie celulară, Universitatea
Ecologică, Bucureşti.
37. GHIORGHIŢĂ G., PETRESCU NICUŢĂ D., 2005 – Biotehnologiile azi, Ed. Junimea,
Iaşi.
38. HAENEY M., 1985 – Introduction to Clinical Imunology, Butterworths Update
Publications, London &.
39. IONESCU-VARO M., DIMITRIU G., DELIU C., 1981 - "Biologie celulară", Ed. Did. şi
Ped., Bucureşti.
40. ISRAIL A. M., 2000 - "Biologie moleculară - prezent şi perspective" Ed. Humanitas,
Bucureşti.
41. LODISH H., 2005 - Biologie moléculaire de la cellule, De Boeck Université, Paris.
42. LODISH H., BERK A., ZIPURSKY S., MATSUDAIRA P., BALTIMORE D.,
DARNELL J., 1999 - Molecular Cell Biology, 4ed., New York, W. H. Freeman & Co.
43. KAPLAN J. C., 1990 - Biologie Moleculaire et medicine, Flammarion, Paris.
44. KARP G., 2004 - Biologie: cellulaire & moléculaire, De Boeck Université, Paris.
45. KLEMPERER W., 1992 – Intermolecular interactions, Science, 257, 887-888.
46. M. PRISECARU, R. VOICU, A. IOSOB, Observations on the embryonic development of
Triturus/Lissotriton vulgaris L., Studii şi Cercet. Ştiinţ.,seria Biologie animală, 15, p.56 –
67, 2008.
47. MACOVSCHI E., 1984 – Concepţia biostructurală şi teoriile moleculare ale materiei vii,
Ed. Şt. şi Enciclop., Bucureşti.
48. MAILLET M., 2002 - Biologie cellulaire, Masson, Paris.

49. MIXICH F., ARDELEAN A., 2002 - Principii fundamentale de biologie moleculara, Ed.
Med. Univ. Craiova.
50. MURRAY A: W., 1992 – Cell-cycle checkpoints and feedback controls, Nature, 359,
599-603.
51. NEACŞU C., 1982 – Informaţia biologică, Ed. Şt. şi Enciclop., Bucureşti.

297
52. PALADE G. E., 1975 – Science, 189, 347.
53. PĂIŞ V., 1995 - "Biologie şi patologie celulară şi moleculară", Ed. Romfel, Bucureşti.
54. POLLARD Th. D., 2004 - Biologie cellulaire, Elsevier SAS, Paris.
55. POLLARD T., EARNSHAW W., 2002 - Cell Biology, Elsevier SAS, Paris.
56. POPA L., REPANOVICI R., 1982 – Tehnologia ADN recombinant (Inginerie genetică),
Ed. Şt. şi Enciclop., Bucureşti.
57. POPA L., REPANOVICI R., 1992 – Acizii nucleici, Ed. Acad. Române, Bucureşti.
58. POPESCU-VIFOR S., şi col., 1980 – Genetica şi eredopatologie, Ed. Did. şi Ped.,
Bucureşti.
59. PRISECARU M, GHIORGHITA G, MIHU G, NICUTA D, CRISTEA O,-Production of
haploid plants by in vitro anther and ovule culture of Brassica, Ed.Corson,Genetics and
evolutions,2000,vol IV,Iasi,p.169-178.
60. PRISECARU M, MIHU G,CRISTEA O.T.,-Studiu comparative privind iducerea plantelor
haploide la Brassica oleracea L.,utilizand culturile de antere si ovare “in
vitro”,U.S.A.M.V.,Iasi,Vol.”Simpozionul aniversar “50 de ani de la infiintarea Fac. De
Horticultura Iasi,2002,I.S.S.N.1454,p.68-74
61. PRISECARU M,,GHIORGHITA G.,-Influenta tipului de explant asupra capacitatiide
regenerare din embrioni somatici la Triticum aestivum L.,Bul.Soc.Nat.Biol.Cel.,A XIV-a
Ses.St.anuala,Oradea,1996,p.223.
62. PRISECARU M,CRISTEA O.T.,MIHU G.,-The preservation of some valuable genotypes
of Brassica –white cabbage-by “in vitro” microclonation,Studii si Cer.de Biol.Univ.,
Bacau, 2005,10,p.195-197.
63. PRISECARU M,CRISTEA O.T.,-The stimulation of the gynogenetic development to Bete
vulgaris L.,by the pollination of the embryo sac with irradiated pollen.Sudii si Cercet.de
Bio.,V,2001,Bacau,p.15-18.
64. PRISECARU M,MIHU G.CRISTEA O.T.-Obtaining the haploid plants to Lycopersicn
esculentum L.,through “in vitro” androgenesis and gynogenesis,St.si Cerc.de
Biol.,vol.XIV,2000, p.23-27.
65. PRISECARU M.,CRISTEA O.T.,GHICA M.,-Studies concerning the behaviour of some
tomato (Lycopersicon esculentum Mill.)genotypes to “in vitro”anther and ovule
culture.Univ.de St.Agron.si Med.Vet.,Bucuresti,2001, Lucrari St., seria V, anul XLIV;
Horticultura, p.19-23.
66. PRISECARU M.,GHIORGHITA G.,- Organogeneza indirecta la sfecla de zahar (Beta
vulgaris L.), St.Cerc. Biol. ,Seria Biol.Veget.,1995, p.81-84.
67. PRISECARU M.,GHIORGHITA G.,-Studiul histologic in calusul de grau (Triticum
aestivun L.) obtinut prin culturile embrionilor imaturi “in vitro”.Bul.Soc.Nat.Biol.Cel., A
XIV a Ses.St.anuala,Oradea,1996, p.222.
68. PRISECARU MARIA, GHIORGHITA G., 2002 – Haploidia experimentala in contextul
biotehnologiilor moderne. Editura Tehnica Bucuresti, 192p.
69. PRISECARU MARIA, VOICU ROXANA, RĂDUCANU DUMITRA, PRISECARU
FLORIAN, 2008 - Ecotoxicologie – Curs universitar, Ed. „Alma Mater”, Bacău, ISB
70. PRISECARU MARIA., 1994 - Cito-histo-embriologie vegetala. I. Citologie,Tipografia
Univ. Bacau, 1994, 225 p.
71. PRUCE M. E., DICKINSON A. G., 1987- Journal of General Virology, 68, 79-89.
72. RAICA MARIUS, Citologie Clinica, Timisoara, 2001.
73. RAICU P., 1991 – Genetica, Ed. Did. Şi Ped., Bucureşti.

74. RUSU V., BARAN T., BRĂNIŞTEANU D.D., 1991 – Biomembrane şi patologie, vol.2,
Ed. Medicală, Bucureşti.
75. SASSON A., 1993 – Biotehnologii şi dezvoltare, Ed. Tehnică, Bucureşti.
76. SLAYTER E. M., 1992 - Electronic Light Microscopy, Cambridge, UK.

298
77. STRACHAN T., READ A.P., 1999 - Human Molecular Genetics, 2ed. Oxford, UK, BIOS
Scientific Publishers Ltd.
78. TOLEDANO A., LOPEZ g. MARIA, 1987 – The cell membrane: esential element in the
chemistry of life. Current topics in Science an medicine vol.1, Merck.
79. VOICULEŢ N., PUIU L., 1997 - "Biologia moleculară a celulei", Ed. All, Bucureşti.
80. WILSON J., HUNT T., 2004 - Biologie moléculaire de la cellule: livre d'exercices,
Flammarion Médecine-Sciences, Paris.

299