Lucrarea 8

Sisteme tampon în homeostazie

Soluţia tampon a fost definită de către Sörensen ca un amestec chimic care are
proprietatea de a păstra aproape constantă concentraţia ionilor de hidrogen atunci când se adaugă
un acid sau o bază tare. Într-o accepţiune generală putem considera că soluţiile tampon sunt
soluţii care se opun modificărilor de pH. O soluţie ce conţine acidul slab în amestec cu sarea sa
cu o bază tare are capacitatea de a se opune modificării de pH alcătuind o soluţie tampon.

Soluţiile tampon sunt de două tipuri :

a) Soluţia unui acid slab şi sarea acestui acid cu o bază tare;
b) Soluţia unei baze slabe şi sarea acestei baze cu un acid tare.

La adăugarea unui acid, o parte din A- se neutralizează conform reacţiei:

-
A + H+ AH
Adăugarea unei baze duce la conversia lui AH în A- :

AH + HO
- A- + H2O
În ecuaţia Henderson-Hasselbalch, care se aplică la soluţiile tampon, raportul A-/HA
apare ca funcţie logaritmică. Prin urmare, modificări ale raportului A-/HA duc la mici schimbări
de pH, în domeniul de lucru al tamponului. Acesta este determinat de pKa-ul sistemului.
Cele mai folosite sisteme tampon conţin raporturi molare egale de acid şi bază conjugată.
În acord cu ecuaţia Henderson–Hasselbalch, dacă [A-]=[HA], atunci pH=pKa. Domeniul efectiv
pentru sistemele tampon este de 2 unităţi pH centrat pe valoarea pKa, adică intervalul pKa±1.
Prin urmare, sistemele tampon acţionează cel mai bine când raportul [HA]/[A-] este între 10 şi
1/10.
Capacitatea de tamponare depinde de volumul tamponului şi de concentraţia celor doi
componenţi. Soluţiile tampon fiind mai eficiente atunci când au concentraţii mai mari. De
remarcat că molaritatea unui tampon se referă totdeauna la concentraţia totală a speciilor
tamponului. Astfel, un tampon 0,5 M H2PO4-/HPO42- va avea [H2PO4-]+[HPO42-] = 0,5 moli/l.
Capacitatea de tamponare este definită, uzual, ca fiind numărul de echivalenţi de H+
(respectiv OH-) care sunt necesari pentru a schimba pH-ul unui volum dat de tampon cu o
unitate de pH.

Selectarea tampoanelor biochimice

Ideal, toate investigaţiile biochimice trebuie efectuate în soluţii tampon apoase. Mediul
natural al biomoleculelor şi organitelor celulare se află sub un control strict al
pH-ului. Cele mai multe sisteme tampon folosite în biochimie acoperă intervalul 6–8 de pH.
Ocazional este nevoie de sisteme tampon situate în afara acestui interval.
 Sisteme tampon utilizate în biochimie
Masa
Compus Abreviere pK1 pK2 pK3 pK4
molec.
Acid N-(2-acetamido)-2-
ACES 182,2 6,90 - - -
aminoetansulfonic
Acid N-(2-acetamido)-2-
ADA 212,2 6,60 - - -
iminodiacetic
Acid acetic 60,1 4,76 - - -
Arginină Arg 174,2 2,17 9,04 12,48 -
Acid barbituric 128,1 3,79 - - -
Acid N,N-bis(2-hidroxietil)-2-
BES 213,1 7,15 - - -
aminoetansulfonic
N,N-bis(2-hidroxietil)glicină BICINE 163,2 8,35 - - -
Acid boric 61,8 9,23 12,74 13,80 -
Acid citric 210,1 3,10 4,75 6,40 -
Acid etilendiaminotetracetic EDTA 292,3 2,00 2,67 6,24 10,88
Acid formic 46,03 3,75 - - -
Acid fumaric 116,1 3,02 4,39 - -
Glicină Gly 75,1 2,45 9,60 - -
Glicilglicină 132,1 3,15 8,13 - -
Acid N-2-hidroxietilpiperazină-
HEPES 238,3 7,15 - - -
N’-2-etansulfonic
Acid N-2-hidroxietilpiperazină-
HEPPS 252,3 8,00 - - -
N’-3-propansulfonic
Histidină His 209,7 1,82 6,00 9,17 -
Imidazol 68,1 6,95 - - -
Acid 2-(N-morfolino)-
MES 195,0 6,15 - - -
etansulfonic
Acid 3-(N-morfolino)-
MOPS 209,3 7,20 - - -
propansulfonic
Acid fosforic 98,0 2,12 7,21 12,32 -
Acid succinic 118,1 4,18 5,60 - -
Acid 3-tris(hidroximetil)-
TAPS 243,2 8,40 - - -
aminopropansulfonic
Acid N-tris(hidroximetil)metil-2-
TES 229,2 7,50 - - -
aminoetansulfonic
NTris(hidroximetil)metilglicină Tricine 179,0 8,15 - - -
Tris(hidroximetil)aminometan Tris 121,1 8,30 - - -

Tampoanele utilizate pentru determinări biologice trebuie să îndeplinească o serie de

proprietăţi:
1. pK cuprins între 6 şi 8;
2. Solubilitate mare în apă, dar solubilitate limitată în solvenţi organici;
3. Să aibă o contribuţie minimă la numărul de ioni din mediu;
 4. Să nu treacă prin membranele biologice sau efectul să fie minim;
5. Efect salin minim;
6. Să nu interacţioneze cu ionii metalici de importanţă biologică sau să formeze
complecşi solubili bine definiţi;
7. Absorbţie de radiaţie minimă în vizibil şi UV;
8. Stabilitate chimică;
9. Accesibilitate uşoară în forme pure.

Prepararea soluţiilor tampon

Se poate realiza în două moduri:
a) cantităţi cunoscute de A- şi HA pot fi amestecate şi diluate la volum;

Ecuația Henderson – Hasselbalch permite calcularea raportului concentrațiilor celor două

componente ale soluției tampon care trebuie amestecate pentru obținerea soluției tampon :

pH = pK + log
[A ] −

[ HA]

b) la o cantitate cunoscută de HA (sau A-) se poate adăuga o cantitate de bază (sau acid)
până la atingerea pH-ului dorit iar amestecul se diluează în continuare până la volumul
stabilit.

La prepararea soluţiilor tampon se va ţine seama de următoarele:

1. Apa folosită pentru prepararea reactivilor este bidistilată sau deionizată, lipsită de
dioxid de carbon (prin fierbere, în prealabil);
2. Se folosesc numai reactivi foarte puri, pentru analiză. Dacă se folosesc săruri anhidre,
acestea se vor usca 4-6 ore la 105-110˚C (funcţie de stabilitatea lor termică) şi se
răcesc în exicator înainte de folosire;
3. Toate cântăririle se fac la balanţa analitică;
4. pH-ul tampoanelor se va verifica cu ajutorul pH-metrului, etalonat, la temperatura la
care este utilizat tamponul;
5. Este recomandată păstrarea tampoanelor sub formă de soluţii concentrate. Soluţiile
diluate, în special, se vor păstra la +4˚C, în sticle de polipropilenă;
6. Când tampoanele sunt folosite pentru determinări enzimatice nu se vor folosi
substanţe conservante;
7. Pentru prepararea tampoanelor de un anumit pH, raportul componenţilor poate fi scos
din tabele speciale.
 Sistemele tampon cele mai importante din organismul uman care contribuie pe lângă alte
mecanisme, la menţinerea constantă a pH-ului mediului intern (7,4±0,5) sunt: sistemul
bicarbonat/acid carbonic; sistemul proteinelor; sistemul fosfaţilor; sistemul hemoglobinei.

A. Sistemul tampon acid carbonic-bicarbonat (H2CO3/HCO3-)

Ecuaţia globală după care funcţionează acest sistem tampon este:
–
CO2 + H2O HCO 3 +H+

Valoarea pKa în sânge a acestui sistem cuplat, în condiţii fiziologice, este pKa=6,1. pH-ul
normal al sângelui fiind pH=7,4 se pot calcula, pe baza ecuaţiei Henderson-Hasselbach,
concentraţiile sanguine de CO2 şi HCO3– necesare menţinerii pH-ului fiziologic:
–
Condiţiile fiziologice care satisfac această condiţie sunt: [HCO 3]=24mM şi
–
[CO2]=1,2mM. În locul raportului [HCO3 ]/[H2CO3], un raport mai practic este
[HCO3-]/pCO2, unde pCO2 reprezintă presiunea parţială a dioxidului de carbon din sânge.
Scăderea acestui raport duce la acidoză, iar creşterea lui la alcaloză.
–
În funcţie de modul în care variază cantităţile de CO2 şi HCO 3 se va modifica şi valoarea
pH-ului sanguin:
• Modificarea pH-ului sanguin datorată schimbării [CO2] se numeşte acidoză ([CO2]
creşte) sau alcaloză ([CO2] scade) respiratorie.
–
• Modificarea pH-ului sanguin datorată schimbării [HCO 3] se numeşte acidoză ([HCO–3]
–
scade) sau alcaloză ([HCO 3] creşte) metabolică.
• În organism aceste modificări au loc fie la nivelul plămânilor (modificări respiratorii ale
–
[CO2]), fie la nivelul rinichilor (modificări metabolice ale [HCO 3]). În acest fel se
desfăşoară permanent o reglare a pH-ului la valoarea de 7,4 prin compensarea acidozei
sau alcalozei respiratorii cu alcaloza sau acidoza metabolică.
2-
B. Sistemul tampon fosfat (HPO4 /H2PO4-)
Ecuaţia globală după care funcţionează acest sistem tampon este:

HPO42- + H+ H2PO4-

Raportul HPO42-/H2PO4 trebuie să fie 4/1 (pKa=6,8) pentru a menţine pH-ul sângelui
la valoarea 7,4. Deoarece fluidul extracelular nu conţine cantităţi mari de fosfat, sistemul
tampon al fosfaţilor acţionează mai mult intracelular, unde împreună cu proteinele reprezintă
principalele sisteme tampon intracelulare. La nivel renal, sistemul tampon fosfat acţionează
pentru neutralizarea H+ secretat de către rinichi în urină, nivelul de H+ secretat de către rinichi
fiind mai mare în prezenţa tamponului. Sistemul tampon fosfat nu joacă nici un rol în eliminarea
H+ secretat, ci doar în neutralizarea acestuia, de aceea H+ secretat de către rinichi trebuie să fie
eliminat pentru a nu se depăşi capacitatea de tamponare a sistemului tampon.

C. Sistemul tampon al proteinelor

Sistemul tampon al proteinelor este unul dintre cele mai importante sisteme tampon,
alături de sistemul bicarbonaţilor. Capacitatea de tamponare a proteinelor se datorează
grupărilor acide sau bazice ale catenelor laterale existente la catena polipeptidică şi a
capacităţii acestora de a ceda sau accepta protoni. Proteinele pot acţiona ca sisteme tampon şi
datorită prezenţei grupărilor amino şi carboxil terminale care pot accepta, respectiv ceda H+.
Proteinele plasmatice (în special albumina) acţionează la pH-ul fiziologic (7,4) ca sisteme
tampon prin intermediul resturilor de histidină din structura proteinei respective. Acestea sunt
capabile să accepte un proton la nivelul grupării imidazolice (pKa=7,3) conform următoarelor
reacţii:

Prot + H+ Prot +H

La nivel plasmatic, albumina este capabilă să neutralizeze H+ provenit chiar şi din acidul
carbonic.
D. Sistemul tampon al hemoglobinei
În eritrocite, hemoglobina reprezintă principalul sistem tampon care acţionează prin
intermediul grupărilor imidazolice ale resturilor de histidină. Ca şi în plasmă, în eritrocite sunt
neutralizaţi H+ generaţi de către CO2 rezultat din catabolismul celular. Hemoglobina
neutralizează (tamponează) acest exces de proton prin două modalităţi:
- Tamponare prin grupările ionizabile la valoarea pH=7,2 din eritrocite. Acestea cuprind
cele 4 grupări amino-terminale ale globinelor şi azotul heterociclului imidazolic din
catenele laterale ale resturilor de His:

Hb + H+ H+Hb

- Efectul Bohr în care H+ rezultat din CO2 + H2O ↔ HCO3- + H+ sunt incluşi în eritrocit şi
transportaţi sub formă de HHb+ la plămâni unde are loc reacţia inversă
HCO3- + H+ ↔ CO2 + H2O, după care CO2 va fi eliminat prin respiraţie.

Toate aceste sisteme tampon contribuie la menţinerea valorii pH-ului sanguin în

intervalul 7,35-7,45. Menţinerea constantă a pH-ului face parte integrantă din homeostazia
organismului uman.

Homeostazia reprezintă capacitatea organismului uman de a-şi regla propriul mediu

intern pentru a menţine relativ constante anumite proprietăţi (pH-ul, temperatura şi
concentraţia metaboliţilor) cu scopul de a menţine un mediu optim în care funcţiile
metabolice se pot desfăşura cu eficienţă maximă.
Controlul homeostazic se realizează prin mecanisme complexe de control prin
intermediul sistemului nervos, hormonilor, neurotransmiţătorilor şi a altor mediatori. Controlul
homeostazic vizează menţinerea echilibrului acido-bazic (menţinerea aproximativ constantă a
pH-ului), menţinerea echilibrului hidroosmotic, menţinerea constantă a temperaturii corpului, a
tensiunii arteriale, a concentraţiei unor metaboliţi (ex. glucoză).
Astfel, temperatura corpului este menţinută la 37˚C, deoarece la temperatură mai mare
există pericolul denaturării enzimelor şi implicit afectarea funcţionalităţii lor, iar la temperaturi
mai mici viteza cu care se desfăşoară procesele metabolice scade. O creştere doar cu 2˚C va duce
la perturbarea funcţiilor întregului organism, iar temperaturi de
43-45˚C sau sub 23˚C conduc la deces.
Volumul celular, esenţial pentru desfăşurarea normală a funcţiilor celulare este menţinut
prin controlul osmolarităţii plasmei, deoarece apa circulă liberă prin membrana celulară datorită
forţei osmotice. Osmolaritatea (presiunea osmotică) depinde de numărul de particule dizolvate în
fluidele biologice. Osmolaritatea se menţine relativ constantă de o parte şi de alta a membranei
celulare, astfel că în compartimentul intracelular concentraţia ionilor este de 368 mmol/L, iar iar
în compartimentul extracelular de 302 mmol/l.
Aportul şi excreţia de apă sunt controlate de osmoreceptorii din hipotalamus prin
influenţa exercitată asupra senzaţiei de sete şi a secreţiei de ADH (hormonul antidiuretic). Astfel,
menţinerea constantă a osmolarităţii fluidelor biologice şi a unui nivel constant de fluide
circulante (care transportă gaze, nutrienţi, ioni, hormoni şi substanţe care trebuie eliminate)
asigură o concentraţie relativ constantă a metaboliţilor circulanţi.
Acest lucru asigură disponibilitatea acestor metaboliţi pentru căile metabolice specifice în
care aceştia sunt implicaţi. Menţinerea relativ constantă a unor compuşi chimici în plasmă este
asigurată, pe de o parte, de sinteza endogenă, de unele procese de absorbţie şi de eliberarea lor
din rezerve, iar pe de altă parte, de formarea depozitelor de rezervă şi de eliminarea prin urină,
fecale, aerul expirat, transpiraţie. Menţinerea constantă a pH-ului normal al sângelui în intervalul
7,35-7,45 este realizată cu ajutorul sistemelor tampon specifice menţionate anterior şi un reglaj
fin la nivelul plămânilor şi rinichilor.

Parte practică:
1) Prepararea demonstrativa de catre cadrul didactic a 100 mL soluție tampon
CH3COOH/CH3COONa cu pH 4.8
2) Verificarea capacitatii de tamponare
Materiale și aparatură:

- Soluție acid acetic 0,01M

- Soluție acetat de sodiu 0,01M
- Pahare Berzelius de 100 mL
- Cilindru gradat de 50 mL
- Pipete de 2, 5, 10 mL
- Baghete de sticlă
- pH metru
1)Prepararea demonstrativa de catre cadrul didactic a 100 mL soluție tampon
CH3COOH/CH3COONa cu pH 4.8

Ecuația Henderson – Hasselbalch permite calcularea raportului concentrațiilor celor două

componente ale soluției tampon care trebuie amestecate pentru obținerea soluției tampon acetat.
pKa = 4,76

pH = pK + log
[A ]
−

[ HA]

pH-pKa = log [A-]/[HA] ; [A-]/[HA] = [CH3COONa]/[CH3COOH]

Pentru a obţine soluţia tampon cu pH=4.8 se ţine cont că pKa pentru acidul acetic este
4,76 şi se calculează raportul concentraţiilor molare ale celor două soluţii.

[CH3COONa] / [CH3COOH] = 10pH-pKa = 104.8-4,76 = 100,04 = 1,09

Deoarece atat solutia de CH3COOH, cat si cea de CH3COONa au concentratia initiala de

0.01M, raportul de amestecare al soluţiilor de CH3COONa 0,01M şi CH3COOH 0,01M va fi:

V[CH3COONa]/V[CH3COOH]=1,09.

Ştiind volumul de soluţie tampon care trebuie obţinută prin amestecarea celor două
componente V[CH3COOH] + V[CH3COONa]=100 mL, se calculează cele două volume care trebuie
amestecate:
V[CH3COONa] = 1,09 V[CH3COOH];
1,09 V[CH3COOH] + V[CH3COOH]=100 → V[CH3COOH] = 100/2,09→ V[CH3COOH] = 47,8 mL

Se calculează V[CH3COONa] = 100 -47,8 = 52,2 mL

Mod de lucru:
• Se amesteca 47.8 mL solutie CH3COOH 0.01M cu 52.2 mL solutie CH3COONa 0.01M
intr-un pahar Berzelius si se omogenizeaza
• Se verifică, cu ajutorul pH-metrului, pH-ul soluției tampon preparata.
Mai jos sunt prezentate volumele de soluție de acid acetic 0,01M și acetat de sodiu 0,01M care se
amestecă pentru a prepara 100 mL soluție tampon acetat de un anumit pH. (pKa = 4,76).

Vacid acetic 0,01M Vacetat de sodiu 0,01M

pH
(mL) (mL)
3,7 92,0 8,0
4,0 85,4 14,6
4,4 70,0 30,0
4,8 47,8 52,2
5,2 26,6 73,4
5,6 12,6 87,4

2) Verificarea capacitatii de tamponare

Se va verifica dacă soluţia tampon obţinută are proprietăţi de tamponare prin adăugare de
porţiuni mici dintr-un acid sau o bază tare după cum urmează:

- In trei pahare Berzelius se introduc cate 30 mL solutie tampon CH3COOH/CH3COONa

0.01 M (pH=4.8) preparata anterior; (paharele se noteaza 1a, 1b, 1c)
- In trei pahare Berzelius se introduc cate 30 mL H2O; (paharele se noteaza 2a, 2b, 2c)
- În eprubetele 1a şi 2a se adaugă câte 1 mL de acid clorhidric HCl 0,01M;
- În eprubetele 1c şi 2c se adaugă câte 1 mL de NaOH 0,01M;
- Se verifică de catre cadrul didactic pH-ul soluţiilor în cele 6 pahare Berzelius cu ajutorul
pH-metrului şi se notează rezultatele în tabelul de mai jos;

Soluţia tampon acetat H2O

Reactiv adăugat
1a 1b 1c 2a 2b 2c
Tampon acetat pH=4.8 30 mL 30 mL 30 mL - - -
H2O - - - 30 mL 30 mL 30mL
HCl 0,01M 1 ml - 1 ml - -
NaOH 0,01M - - 1 ml - - 1ml
pH 4,7 4,9 4,9 3,6 6,4 9,1

Mod de lucru cu pH-metrul:

- Se porneste pH-metrul (butonul din dreapta spate)

- Electrodul pH-metrului se clateste cu apa distilata inainte de fiecare masurare
- Se introduce electrodul in solutie si se asteapta ~ 15 secunde pana cand ph-metrul
inregistreaza modificarea de pH.
- Valoarea pH-ului apare afisata in coltul de sus din partea dreapta a ecranului !