Infecția șobolanilor de

laborator cu un nou virus

asemănător cu cel al
citomegalozei

Citomegalovirusul (CMV) a fost studiat pe scară largă folosind modele animale, în

special șoareci și cobai.
Acest studiu descrie evoluția infecției RA-1 la două tulpini de șobolani de laborator.
Au fost studiate distribuția pe organe, preferința pentru glandele salivare, dezvoltarea
infecției cronice și latente și reactivarea în timpul imunosupresiei. În plus, a fost
determinată dezvoltarea anticorpilor și citotoxicitatea mediată de celule.
Constatările prezente în experimentele in vivo coroborează rezultatele anterioare in
vitro și sugerează că virusul RA-1 poate fi desemnat ca fiind un CMV pentru șobolan.

Materiale si metode:

Animalele si culturile de celule :

- femele de șobolani în vârstă de patru până la cinci săptămâni, din două tulpini de
șobolani consangvinizate (Lewis și BN).
- culturi de celule de fibroblaste de embrion de șobolan (REF)

Virus ales:
- RA-1, virusul șobolanului, cu caracteristici asemănătoare citomegalovirusului,
izolat în acest laborator, a fost menținut prin administrarea de suspensii de glande
salivare intraperitoneal la șobolani Lewis în vârstă de trei-patru săptămâni
- a fost recoltat la trei săptămâni după inoculare, prin omogenizarea glandelor
salivare într-un măcinător Ten Broek
- omogenatele, 10 % în mediu minim esențial Eagles, au fost depozitate la 80° C

1
Chirpac Ionut Florentin Facultatea de Bioinginerie Medicala
Anul IV, Grupa II

Infecții ale șobolanilor :

- șobolanii au fost inoculați i.p. cu suspensii de glande salivare care conțineau 104
(sau altfel, după cum se indică) unități formatoare de plăci (PFU) de virus
o au fost uciși la anumite intervale de timp și, în funcție de experiment, au
fost menținuți timp de până la un an după infectare
- glandele salivare, splina și rinichii au fost obținute pentru experimentele de
izolare a virusului.
o celulele din splină au fost utilizate pentru experimentele de citotoxicitate
mediată celular.
- probele de sânge au fost recoltate la intervale de timp date pentru determinarea
anticorpilor împotriva RA-1

Testarea virusului :
- organele au fost omogenizate într-un omogenizator de țesuturi Ten Broek
- s-au preparat suspensii de 10% în MEM
o centrifugate timp de 10 minute la 2 000 rpm
o supranaturile au fost testate pe culturi de celule REF pentru prezența virusului
prin titrare în plăci folosind o modificare a metodei lui WENTWORTH și
FRENCH .
o monostraturile REF confluente cultivate în godeuri ale unei tăvi de 24 de
godeuri (Costar) au fost infectate în patru exemplare cu 0,1 ml de diluții
seriale de 10 ori mai mari de omogenate tisulare
o după o perioadă de incubare de 90 de minute la 37° C într-un incubator cu
CO2, s-a adăugat un strat de bază de 1 ml de MEM-2 (Gibco) care conține
2% ser de vițel nou-născut (NCS) și 0,25 % agaroză.
- după 3 până la 5 zile de incubare la 37° C într-o atmosferă de 5 % CO2, celulele
au fost fixate cu 10 % formalină peste noapte la temperatura camerei.
o după fixare, stratul de bază solid a fost îndepărtat
o monostraturile de celule au fost colorate cu albastru de metilen 1 % apos,
iar plăcile au fost numărate

Fragmente de glande salivare au fost fixate în glutaraldehidă 4 % în

tampon fosfat (pH 7,2) și fixate apoi cu tetroxid de osmiu la pH 7,2. Țesutul
fixat a fost deshidratat în etanol și încorporat în Epon 812 pentru microscopie
electronică.

Glandele salivare au fost fixate în soluții Bouin și secțiuni încorporate în

parafină au fost colorate cu hematoxilină și eozină.

2
Chirpac Ionut Florentin Facultatea de Bioinginerie Medicala
Anul IV, Grupa II

Testarea anticorpilor împotriva RA-1 prin metoda ELISA a fost efectuată

folosind o modificare a tehnicii descrise pentru CMV uman (HCMV) de către
SCHMITZ :
- monostraturile de celule infectate care prezintă un efect citopatic complet au fost
răzuite din sticlele de cultură celulară și suspendate în 10 ml de apă distilată cu
0,4 % KCI
- se utilizează suspensia celulară centrifugată timp de 5 minute la 400*g , iar peletul
a fost suspendat în 5 ml de soluție de 0,4 % KCl și 1 % Nonident P40, apoi
omogenizat într-un omogenizator Dounce
- omogenatul a fost așezat pe 10 ml de zaharoză (0,25 Min 0,4 % KCl) și
centrifugat la 700*g timp de 5 minute
- pelerina a fost suspendată în 12 ml de tampon care conține 10 mM de clorhidrat
de Tris (hidroximetil) aminometanol (pH 7,5), sonicat cu un sonificator Branson
și centrifugat timp de 5 minute la 1000*g
- supernatantul a fost utilizat ca antigen, antigenul de control a fost preparat din
nuclee de celule neinfectate

Citotoxicitate mediată celular (CMG) :

Suspensiile de limfocite din splina șoarecilor infectate intraperitoneal cu 106 PFU
de RA-1 au fost preparate în MEM care conținea 10 % ser fetal bovin inactivat
termic.
Celulele limfoide au fost pregătite conform descrierii lui MAJOOR.
Splina a fost tăiată cu o foarfecă pe o sită de tifon de nailon Monodur.
Celulele moarte și eritrocitele au fost îndepărtate prin centrifugare într-un
gradient bifazic de Percoll preparat în conformitate cu KuRNICK.
La interfața Percoll de 30-80 %, s-au recuperat 90 % din limfocitele viabile.
Seringi de 10 ml au fost umplute cu 0,6 g de lână de nailon spălată, uscată și apoi
preincubate cu mediu RPMI-1640 tamponat cu HEPES și suplimentat cu 5% ser
fetal bovin (FBS) la 37 °C înainte de utilizare.
Un ml de suspensie celulară conținând până la 1,5 x 108 celule a fost trecut în
vată de nailon cu 1,5 ml de mediu încălzit la 37° C.
După 45 de minute de incubare la 37° C, celulele neaderente din vata de nailon
au fost eluate cu 10-15 ml de mediu cald.
Numărul de celule de splină pozitive la suprafață a fost de aproximativ 5%.
Celulele țintă au fost pregătite prin infectarea celulelor Lewis REF cu 8 PFU per
celulă de virus timp de 24 de ore, colectarea prin tripsinizare și incubarea timp de
45 de minute la 37° C în medii care conțin 40 µCi de cromat de sodiu 51Cr
După spălare, s-au adăugat celule efectoare la un raport efector-țintă de 1:100.
Timpul de incubare a fost de 20 de ore.
Diluțiile de celule efectoare au fost adăugate la triplicat atât la țintele infectate,
cât și la cele neinfectate.

3
Chirpac Ionut Florentin Facultatea de Bioinginerie Medicala
Anul IV, Grupa II

După incubare, supranatantele au fost aspirate și numărate într-un contor Y.

Procentul de eliberare specifică de 51Cr din celulele țintă a fost calculat prin
următoarea formulă:
𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇 𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶 − 𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶 𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠
∗ 100
𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶 𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 − 𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶 𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠
Celulele BN REF infectate și celulele Lewis REF neinfectate au fost utilizate ca
martori.

Câteva rezultate :
- niciunul dintre șobolanii cărora li s-au inoculat suspensii de glande salivare care
conțineau 104 sau 106 PFU RA-1 nu a prezentat simptome de boală
- în glandele salivare ale animalelor sacrificate la patru săptămâni după infecție au
fost observate celule acinare caracteristice, de dimensiuni mari, cu incluziuni
intracitoplasmatice eozinofile
o au fost observate, de asemenea, incluziuni intranucleare, adesea înconjurate de
halouri

- examinarea la microscopul electronic a glandei salivare a șobolanilor sacrificați la

cinci săptămâni după ce au fost sacrificați a evidențiat grupuri intracitoplasmatice
de virioni înveliți
o s-au observat particule de virus în canalele glandelor salivare

4
Chirpac Ionut Florentin Facultatea de Bioinginerie Medicala
Anul IV, Grupa II

- evoluția infecției cu RA-1 la șobolanii Lewis și BN a fost urmărită prin măsurarea

numărului de PFU în suspensiile de splină, rinichi și glande salivare
o în primele câteva săptămâni după infecție., virusul a putut fi detectat în
omogenatul de splină și rinichi
 ulterior, novirusurile au putut fi izolate din aceste organe
 cantitatea de virus în ambele organe a fost scăzută, atingând un maxim
de 100 PFU per organ.
- în glandele salivare, virusul a putut fi detectat după o săptămână, atingând titrul maxim
după 4-5 săptămâni.

Bibliografie:
- BRODSKY, I., ROWE, W. P., Infecție cronică subclinică cu virusul glandelor
salivare de șoarece. Proceedings of the Society of Experimental Biology and
Medicine
- OH, L., HUDSON, J. B., Infecția cu citomegalovirus murin în splină și relația sa
cu imunosupresia. Infect. Immun.
- C. A. BRUGGEMAN , W. M. H. DEBIE , G. GRAULS , G. M JOOR, C. P. A. van
Boven, Arhivele de Virologie, Infecția șobolanilor de laborator cu un nou virus
asemănător cu cel al citomegalozei, 7 martie 1983