UNIVERSITATEA „DUNAREA DE JOS”

Lucrare

MICOTOXINE PRODUSE DE G.PENICILLIUM-

PATULINA

A efectuat Malac (Toderici) Liubovi

CESA an. II

Cahul 2014
 Cuprins

Notiuni generale _______________________________________________2

Istoric si reglementare__________________________________________ 3

Structura compusilor___________________________________________4

Proprietati fizico-chimice________________________________________4

Alimente incriminate___________________________________________ 5

Metode de determinare a patulinei________________________________8

Bibliografie___________________________________________________11

1
 1. Notiuni generale

Micotoxinele sunt produşi metabolici ai fungilor, care sunt capabili să producă efecte
toxice acute sau cronice (cancerigene, mutagene, teratogene) asupra animalelor şi asupra
oamenilor.
Patulina este o micotoxină produsă de mucegaiurile Penicillium patulum, Penicillium
claviforme, Aspergillus clavatus, iar în special de Penicillium expansum.

Speciile genului
Penicillium pot produce
peste 60 de toxine mai ales
când se dezvoltă pe cereale
şi furaje. Dintre speciile
producătoare fac parte:

P.islandicum, care se
dezvoltă pe orez şi produce 2
micotoxine: islanditoxina şi
luteoskirina.
Pe fructe, se dezvoltă P.expansum, care produce putrezirea albastră şi sticloasă a merelor
şi sintetizează patulina. Se poate dezvolta pe cereale şi produse de panificaţie. Patulina este
rezistentă la temperaturi ridicate, la pH acid şi are efect cancerigen. Dacă sucul de fructe este
supus fermentaţiei, o parte din toxină se elimină din lichidul fermentat.
Alte specii:
P.citrinum produce citrinina pe orez decorticat, cauzând afecţiuni renale;
P. citreoviridae – citreoviridina, toxină ce produce la om dereglări nervoase, simptome
cardiace similare cu cele întâlnite în boala beri-beri etc.
În prezent, există mai mult de 500 de metaboliți toxici ,care sunt produsi circa de 250 de
specii de mucegaiuri. Dezvoltarea cercetării în domeniul micotoxicologiei a arătat că
intoxicația cu micotoxine este nu numai reală, dar, deasemenea o amenințare foarte gravă la
starea de sanatate a populatiei pe intreaga planetă.

2
 2. Istoric si reglementare.

Patulina a fost izolata pentru prima data drept antibiotic din culturi de ciuperca
Penicillium patulum (Penicillium urticae).
Datorita descoperirii acestui compus de mai multe personalitati, a fost cunoscut sub
diverse nume: clavacin (Anslow si alti 1943), expansine (Van Luijk 1938), claviformin (Chain
si alti 1942), clavatin (Bergel si lati 1943) acid gigantic (Philpot 1943) si miocin C (DeRosnay
si alti 1952). Initial izolat drept antibiotic cu spectru larg de actiune, antifungic (Korzybski si
alti 1976) a fost mai tarziu descoperit ca inhiba mai mult de 75% de specii diferite de bacterii,
incluzand bacteriile Gram + si Gram – (Ciegler si alti 1971). Studiile ulterioare provind
aplicatibilitatea compusului (Raistrick si alti 1943) nu au fost confirmate de studiile clinice
(Medical Clinical Council 1944, Stansfiled si alti 1944), au sugerat ca patulina ar putea avea
aplicatii in tratamentul congestiilor nazale si racelilor comune. Studiile aprofundate au dovedit
ca patulina nu prezinta toxicitate doar pentru fungi si bacterii dar si la animale si plante
superioare (castravete, grau, mazare, in)(Iyengar si Starky 1953; Norstadt si McCall 1963,1968;
Berestets’kyi si Synyts’kyi 1973)
Deodată patulina nu a fost considerată micotoxină deosebit de periculoasă, iar in 1954 ea
a provocat moartea a 100 de vaci din Japonia care au consumat furaje contaminate cu
micotoxine.
In timp ce evidenta asupra efectelor negative ale patulinei au continuat, mai multe agentii
de reglementare au inceput sa fixeze nivele maxime ale continutului patulinei in randul
alimentelor. Tarile europene au fost printre primele care au fost interesate de aceasta problema
si astazi multe tari din toata lumea, in particular cele in UE au limitat cantitatea maxima admisa
in alimente la 50 µg/l (Moller si Josefsson 1980; van Egmond 1989; AIJN 1990; Stoloff si alti
1991; Rovira si alti 1993; Forbito si Babsky 1996; Gokmen si Akar 1998).

3
 3. Structura compusilor.

Patulina se prezintă sub formă de cristale incolore, rombiforme sau prismatice, , cu o

greutate moleculara de 154 daltoni si un punct de topire de 110,5C cu maxim de absorţie la
276 nm, în soluţie alcoolică.
Patulina: 4-hidroxi-4H-furopiran este o lactona, ce contine metaboliti secundari produsi
de fungi. C7H6O4

Formula structurală a patulinei

4. Proprietati fizico-chimice.
Din punct de vedere chimic, patulina este o furopiranonă, stabilă în mediu acid, dar
instabilă în mediu alcalin. Este solubila în apa, etanol, acetona, acetat de etil, etil eter si
cloroform, dar insolubila în benzen si eter petrol, si este stabila la prelucrari termice la pH<6.
Patulina este distrusa gradat în timpul depozitarii în prezenta sulfitilor, grupul sulfhidrililor si
acidului ascorbic. Patulina este complet degradata în 15 secunde în solutii apoase de 10% ozon.

Patulina este relativ termostabilă, în mod special la pH acid. S-a dovedit că tratamentele
pe termen scurt la temperaturi înalte (150°C) duc la o reducere cu 20% a concentraţiei de
patulină. Cu toate acestea, numai procesarea termică nu este suficientă pentru a asigura un
produs liber de patulină. Patulina este stabilă, în special, în produsele procesate din mere: suc
de mere, suc concentrat de mere,nectar de mere, nectar de fructe (care are ca ingredient şi sucul
de mere), piure de mere, compot de mere etc.

 Se cunoaşte faptul că acidul ascorbic determină dispariţia patulinei din sucul de mere,
deşi condiţiile optime pentru inactivare nu au fost stabilite pe deplin.
Fermentaţia alcoolică distruge patulina şi, prin urmare, produsele fermentate, cum sunt
cidrul de mere şi cidrul de pere, nu conţin patulină.  Patulina a fost descoperită în produsele
fermentate cărora li s-a adăugat suc de mere contaminat cu patulină, după fermentare.
4
 5. Alimente incriminate

Contaminarea cu patulina ramâne în ciuda tuturor

cercetarilor o provocare pentru industria alimentara. O atenție
deosebită problemei cu micotoxine se acordă din cauza
distribuirii lor extrem de largă în natură. Micotoxinele pot
contamina produsele alimentare de origine vegetală și
animală, în orice stadiu al lor cultivare, procesare , transportul
și depozitarea in mediile industriale și menajere . Nerespectarea reglementărilor la fabricarea
produselor , recoltarea târzie sau uscarea insuficientă înainte de depozitare , depozitarea și
transportul produselor in conditii de umiditate ridicată duce la inmultirea fungilor toxigene
Dintre micotoxine care prezintă un număr mare de toxicoze un loc special ocupă patulina.
Patulina apare în principal în fructele mucegăite,
deşi prezenţa mucegaiului nu implică în mod necesar
prezenţa patulinei în fruct, dar indică faptul că aceasta
ar putea fi prezentă. În anumite situaţii, dezoltarea în
interior a mucegaiurilor are drept cauze atacul
insectelor sau altor invadări ale ţesuturilor sănătoase,
determinând apariţia patulinei în fruct, care la exterior apare ca fiind neafectat.
 Cu toate acestea, patulina poate apărea în fructele
lovite după depozitarea în atmosferă controlată şi
expunerea la condiţii ambientale, cu sau fără alterarea
pulpei. Spălarea fructului sau înlăturarea ţesutului
mucegăit imediat înaintea presării nu va înlătura patulina
prezentă în fruct, întrucât aceasta difuzează şi în ţesutul aparent sănătos.
Patulina a fost descoperită drept contaminant în multe fructe (pere, caise, piersici,
struguri, cirese, visine, coacaza, banane, capsuni, catina,), unele legume (rosii), cereale şi
produse derivate din ele (sucuri, piureuri, gemuri etc.)

Cu toate acestea, sursa majoră de contaminare constituie

merele şi produsele din mere. 40% din productia de mere
5
este folosita pentru suc si alte produse procesate. Contaminarea cu patulina în randul
produselor din mere prezinta un potential risc pentru sanatatea consumatorilor, in particular
pentru copii, care conform unui studiu realizat de USDA, consuma cantitati ridicate de produse
din mere in primul an de viata (6,4 g/kg corp), in comparative cu adultii (1g/kg corp)
expunandu-I la un grad ridicat de risc pentru toxicitatea patulinei. Riscurile privind sanatatea
prezentate de patulina necesita controlul si indepartarea acesteia din produsele de mere,
creandu-se o cere pentru tehnici de procesare ale alimentelor capabile sa faca acest lucru,
preferabil la un cost redus pentru industrie.

Limitele maxim admise pentru conţinutul în patulină al unor alimente

Nr. Produs Nivel maxim
al patulinei
(ppb)
1. Suc de fructe şi nectar de fructe, în special suc de mere şi sucurile de 50
fructe utilizate ca ingrediente pentru alte băuturi

2. Suc de fructe concentrat după reconstituire, conform specificaţiilor 50

producătorului

3. Băuturi spirtoase, cidru şi alte băuturi fermentate derivate din mere 50

sau conţinând suc de mere

4. Produse solide din mere, inclusiv compot de mere şi piure de mere, 25

destinate consumului direct

5. Suc de mere şi produse solide din mere, inclusiv compot de mere şi 10

piure de mere pentru sugari şi copii de vârstă mică
Alte alimente pentru copii altele decât cele pe bază de cereale
procesate

In timp ce 50 µg/l reprezinta norma pentru reglementarea patulinei, unele tari au stabilit
chiar si limite mai scazute pentru patulina intre 25-35 µg/l(van Egmond 1989). In consens cu
aceste standarde maxime Organizatia Mondiala pentru Agricultura si Alimentatie (WHO), un
comitet expert al citatei organizatii a stabilit un nivel maxim de consum zilnic de 0,4 µg/kg
corp pentru patulina (WHO 1995). SUA au fost mai incete pentru a stabili un nivel maxim
admis, dar in prezent Administratia pentru Medicamente si Alimente din SUA liminteaza
patulina la 50µg/l. Limitarea acestor reglementarii in cazul sucurilor de mere si sucurilor de
mere concentrate au fost bazate pe faptul ca in acel moment numai sucul de mere si cidrul au
6
fost gasite a fi contaminate in mod natural cu patulina (WHO 1990). In timp ce acest fapt a fost
deaprobat, sucul de mere si cidrul raman sursa majora a consumului uman de patulina.
Analizând caracteristicile de localizare a patulinei in anumite produse alimentare, trebuie
remarcat faptul că in mere patulina se concentrează în principal partea putreda, în timp ce în
partea intactă a mărului se găsește doar în jur de 1 % din totalul toxinei . Pentru tomate,
indiferent de mărimea zonei putrezite, patulina este distribuita uniform de-a lungul țesutului
sau. Experimental sa dovedit că fructele citrice și unele legume ( cartofi, ceapa, ridichie, vinete,
conopida, bostan, hrean ) sunt în mod natural rezistente la infectare cu patulina. In banane,
ananas, struguri, piersici, caise , coacăze negre , cireșe , roșii , afectate de putregai brun au fost
detectate cantitati mici de patulină.
Pentru evaluarea riscurilor pe care le prezintă patulina asupra organismului, au fost
întreprinse studii, pe o perioadă de peste cincizeci de ani.
Simptomele acute determinate de consumul unor produse contaminate cu patulină, pot fi:
agitaţie, convulsii, dispnee, congestie pulmonară, edem, ulceraţii, hemoragie intestinală,
degenerarea celulelor epiteliale, inflamaţie gastrointestinală, stare de vomă.
Consumul frecvent al unor produse contaminate cu patulină, peste limitele maxim
admise, poate determina în timp, următoarele efecte asupra organismului uman: efecte
neurotoxice, hepatotoxice, imunosupresive, teratogene şi cancerigene.

7
 6. Metode de determinare a patulinei.

Metodele rapide, care se pot folosi pentru determinarea patulinei sunt:

 ELIZA (Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay)
 Imunodeterminari bazate pe membrane.
 Imunofluorescenta.
 Tehnologia undelor evanescente.
 Polimeri cu recunoastere moleculara.
 Tehnologia microarray.
 Tehnologia Luminex Map.
 Lichid cromatografie de inalta performanta (HPLC).

Determinarea continutului de patulina in sucul de mere prin HPLC

Principiul metodei: Extracţia în acetonitril a patulinei din proba de analizat şi purificarea

extractului obţinut, utilizând coloane C.U. Patulin (MycoSep®228). Eluatul obţinut este
evaporat până la sec şi reconstituit. Patulina este separată pe coloană cromatografică C18 -
Hypersil Gold (cromatograf lichide de înaltă performanţă Thermo - Finnigan), eluată în fază
mobilă şi detectată la o lungime de undă de 276 nm, utilizând un detector UV-VIS cu şir de
diode ,,DIODE ARRAY”.

Etapele metodei de determinare a patulinei din sucul de mere:

1. Pregătire eşantion pentru analiză

2. Extracţie patulină
3. Purificare extract
4. Evaporare extract
5. Redizolvare reziduu
6. Detecţie HPLC a patulinei

Proba globală trebuie să fie reprezentativă pentru lotul supus analizei şi trebuie să
cântărească cel puţin 1 kg.

Probele elementare trebuie să aibă masă similară. Masa unei probe elementare trebuie
să fie de cel puţin 100 grame, rezultând o probă globală de cel puţin 1 kg.

Abaterea de la această regulă trebuie să fie consemnată în procesul verbal de prelevare.

8
 Reactivi: apa de inalta puritate(distilata sau deionizata), tertrahidrofuran(puritate
HPLC),alcool etilic absolut, acetonitril, faza mobila HPLC, acid acetic glacial,5-
hidriximetilfurfural, solutie de pectinaza, apa cu pH=4, patulina substanta etalon, solutie
standard de patulina(se prepara la intuneric).

Echipament si sticlarie:blender cu capacitate de 500-1000ml, vortex, balanta

analitica, unitate de filtrare, hartie de filtrare din microfibre de sticla,chit pentru purificarea
patulinei, pipete, baloane cotate brune, microseringa, unitate de evaporare, spectofotometru
UV.

Extracţia patulinei din sucul de mere, se realizează în acetonitril.

Omogenizare suc de mere cu solvent.

Purificarea extractului de patulină se realizează utilizănd coloane C.U. Patulin
(MycoSep®228).
Coloanele C.U. Patulin conţin umplutură, formată din: cărbune, celită, răşini
schimbătoare de ioni. La trecerea prin această coloană, patulina este separată de alţi compuşi
care o însoţesc în extract.

Coloane C.U. Patulin (MycoSep®228) Extract de patulină purificat

9
 Evaporarea extractului de patulină purificat se realizează cu ajutorul unui bloc de
încălzire cu sistem de concentrare a probei în atmosferă de azot.

Evaporarea extractului de patulină purificat

Pentru detecţia patulinei prin cromatografie de lichide de

înaltă performanţă se utilizeaza un cromatograf cu
detector UV-VIS cu şir de diode ,,DIODE ARRAY”.

10
 Bibliografie :

 Proiect de Cercetare, Institutul de Bioresurse Alimentare, Bucuresti.

 http://www.bioterapi.ro/
 http://bigfex.com/
 http://wikipedia.org
 http://www.fda.gov/
 http://www.bioresurse.ro/
 http://www.fda.gov
 http://www.ncbi.nlm.nih.gov
 http://www.fermentek.co.il/references/patulin

11