06-07.12.

2011

ANALIZA MEDICAMENTULUI
NOTE DE CURS (10)
06-07.12.2011

Sef LP dr Codruta Maier

Spectrofotometria în infraroşu

1
 06-07.12.2011

Spectrofotometria în infraroşu

¨ Domeniul spectral IR.

¨ Principiul metodei. Spectrul IR

¨ Echipamente

¨ Pregătirea probelor

¨ Aplicaţii

Domeniul infraroşu

UV VIS IR microunde

λ (μm) 0,2 0,4 0,8 2,5 25 300

IR IR IR
apropiat mijlociu îndepărtat

-1
ν (cm ) 4000 400

¨ IR apropiat - determinări cantitative

¨ IR mijlociu - informaţii despre structura substanţelor medicamentoase

2
 06-07.12.2011

Spectrele IR

¨ Interacţiunea dintre radiaţia electromagnetică şi materie

(molecule, atomi)

¤ Pentru a putea interacţiona, legăturile din molecule trebuie să fie

polarizate (să prezinte un moment de dipol)

¤ Nu pot fi analizate prin tehnica IR, moleculele simetrice (O2, N2)

Spectrele IR

¨ Corespund mişcărilor de rotaţie - vibraţie a atomilor, sau

moleculelor

întindere simetrică întindere asimetrică forfecare

balansare în plan balansare în afara planului torsiune

3
 06-07.12.2011

Spectrul IR

¨ Reprezentare grafică

¤ abscisă:
-1
n lungimea de undă λ (µ/µm) sau numărul de undă ν (cm )

¤ ordonată:
n transmitanţa T sau absorbanţa A (%)
n extincţia E sau coeficientul molar de extincţie ε

Spectrul IR

¨ Spectrul IR al octanului
¤ Transmitanţa - funcţie de numărul de undă
¤ Absorbanţa - funcţie de numărul de undă

4
 06-07.12.2011

Echipamente

¨ Spectrofotometrul IR:
¤ Sursă: filament de oxizi metalici
¤ Cuve
¤ Monocromator / interferometru
¤ Amplificator / detector
¤ Înregistrator

Pregătirea probelor

¨ Diferit, în funcţie de starea de agregare a probelor:

¤ Lichide (substanţe lichide, sau solide dizolvate):
n film
¤ Solide - conform FRX sunt prelucrate sub formă de:
n suspensie (pastă)
n dispersie (comprimate)
n pelicule
¤ Gazoase

! Cuvele şi solvenţii trebuie să fie transparente în IR

5
 06-07.12.2011

Pregătirea probelor

¨ LICHIDE (film)
¤ Lichid, sau solid dizolvat în solvent
potrivit
n CCl4, CHCl3, CS2
n ! NU se utilizează apa

¤ Proba se introduce între ferestrele

celulei, formând un film (<0.1mm)
prin care trece radiaţia IR

¤ Ferestrele se confecţionează din

materiale transparente în IR
n NaCl, KBr, AgCl
n Materiale noi: ZnSe, CaF2, BaF2,
diamant (rezistente la umiditate)
Celule utilizate la analiza probelor lichide

Pregătirea probelor

¨ SOLIDE - pastă, pastile,

pelicule
¤ Suspensie (pastă) (5-10mg
analit)
n Proba (grad de
pulverizare)
n se dispersează într-un
solvent corespunzător
n nujol, perfluorokerosen

n se depune între două

ferestre transparente IR Triturarea analitului în mojar de agat

6
 06-07.12.2011

Pregătirea probelor

¨ SOLIDE - pastă, pastile, pelicule

¤ Dispersie (pastile) (1-2mg analit)

n Proba dispersată în KBr (KCl)

n se comprimă obţinându-se pastile
n necesită abilităţi speciale pentru
prepararea pastilelor

n Important:
n gradul de pulverizare
n omogenitatea pastilei
Pastila de KBr
n absenţa umidităţii

Pregătirea probelor

¨ SOLIDE - pastă, pastile, pelicule

¤ Substanţe solide prelucrate sub formă de pelicule
n Proba dizolvată într-un solvent corespunzător se depune pe o suprafaţă
inertă
n După evaporarea solventului se formează o peliculă de grosime
corespunzătoare, care va fi introdusă între 2 ferestre transparente IR

7
 06-07.12.2011

Pregătirea probelor

¨ GAZE

¤ Se utilizează celule cu pereţi transparenţi în IR

¤ Proba concentraţie - ppb

Aplicaţii

1. Analiza structurală

2. Spectrul IR - criteriu de identitate

3. Spectrul IR - criteriu de puritate

4. Dozare

8
 06-07.12.2011

Aplicaţii. Analiza structurală

1. Analiza structurală
¤ Chimia organică, sinteză, caracterizarea de noi molecule
¤ Are la bază identificarea frecvenţelor caracteristice grupelor funcţionale
= frecvenţe caracteristice

Aplicaţii. Analiza structurală

1. Analiza structurală
¤ Se asociază cu
n RMN: informaţii suplimentare şi detaliate despre structură
n Spectroscopie de masă: masa moleculară şi informaţii structurale
n Spectroscopie Raman: informaţii structurale (vibraţii moleculare)

9
 06-07.12.2011

Aplicaţii. Analiza structurală

Aplicaţii. Analiza structurală

10
 06-07.12.2011

Aplicaţii. Analiza structurală

Aplicaţii. Analiza structurală

11
 06-07.12.2011

Aplicaţii. Analiza structurală

Aplicaţii. Criteriu de identitate

2. Spectrul IR. Criteriu de identitate

¤ Compararea spectrului probei cu al unei substanţe cunoscute,
presupusă a fi substanţa de analizat
n + evaluarea benzilor grupărilor funcţionale

¨ A - CO-OH (3000)
¨ B - CH (2800)
¨ C - C=O (ester) (1757)
¨ D - C=O (carboxil)
(1690)

12
 06-07.12.2011

Aplicaţii. Criteriu de identitate

2. Spectrul IR. Criteriu de identitate

¤ Spectrometria IR ca amprentă digitală
n Ex. diferenţierea dintre dexametazonă şi betametazonă

Aplicaţii. Criteriu de puritate

3. Spectrul IR. Criteriu de puritate

n apariţia de benzi suplimentare
n deplasarea / modificarea intensităţii benzilor existente

¤ Nu este o metodă foarte sensibilă

¤ Impurităţi < 4-5% de cele mai multe ori nu sunt vizibile în IR

n Utilizarea FTIR (spectrofotometru cu transformantă Fourier) a scăzut
limita de detecţie a impurităţilor

13
 06-07.12.2011

Aplicaţii. Determinări cantitative

4. Determinări cantitative
¤ Metodă rar utilizată, datorită dificultăţii preparării probelor şi
complexităţii spectrelor
¤ Sensibilitatea metodei este de 2% pentru analizele de rutină şi 0.01%
în condiţii speciale
¤ Principiu: legea Lambert-Beer
A = log Io / I
n determinarea se face alegând din multitudinea de benzi
n banda cea mai intensă
n banda care se referă la gruparea funcţională din moleculă responsabilă
de activitatea biologică
n 2 metode
n tehnica raporturilor empirice
n tehnica liniei de bază

Aplicaţii. Determinări cantitative

4. Determinări cantitative
¤ Tehnica raporturilor empirice

14
 06-07.12.2011

Aplicaţii. Determinări cantitative

4. Determinări cantitative
¤ Tehnica liniei de baza
n are la bază măsurarea a 2 valori
n energia radiaţiei incidente Io
n energia radiaţiei transmise I

Spectrofotometria în IR

4. Determinări cantitative
¤ Se pot obţine informaţii cantitative legate de degradarea
substanţelor

ex. Benzilpenicilina
n 3 benzi caracteristice
n datorate celor 3 grupări C= 0

Frecvenţe caracteristice de grup

15
 06-07.12.2011

Spectrofotometria în IR

ex. Penicilina - 3 benzi caracteristice

datorate celor 3 grupări carbonil

Concluzii

¨ Metodă care poate fi aplicată la stabilirea structurii,

identităţii, purităţii şi dozarea majorităţii substanţelor
¨ Se pot analiza substanţe lichide, solide sau gazoase
¨ Sunt necesare condiţii speciale,
¤ Solvenţi
¤ Celule

¨ Abilităţi speciale în special pentru prepararea pastilelor de

KBr
¨ Pentru analiza structurală este necesară completarea datelor
cu studii RMN, SM, Raman

16
 06-07.12.2011

Spectrometria de masă

Spectrometria de masă

¨ Introducere. Principiul metodei

¨ Echipamente

¨ Cuplarea cu alte tehnici analitice

¨ Aplicaţii

17
 06-07.12.2011

Spectrometria de masă

¨ Utilizează interacţiunea câmpului electric şi/sau magnetic cu

materia, în scopul determinării masei

¨ Măsoară mase şi NU absorbţia sau emisia radiaţiei

electromagnetice

¨ Concept pus în practică de Francis Aston (fizician), în 1919

¤ Destinat măsurării masei elementelor (în special izotopi)
¤ Nobel - 1922

¨ Una dintre cele mai puternice tehnici de analiză chimică

Spectrometria de masă. Principiu

¨ Elemente diferite pot fi identificate pe baza masei moleculare

18
 06-07.12.2011

Spectrometria de masă. Principiu

¨ Diferite substanţe pot fi identificate pe baza masei moleculare

Butorfanol L-DOPA Etanol

N-CH2-
COOH
OH
HO -CH2CH-NH2 CH3CH2OH

HO
HO

GM = 327.1 GM = 197.2 GM = 46.1

Spectrometria de masă. Principiu

Produce Separă ioni Detectează

ioni ioni

19
 06-07.12.2011

Spectrometria de masă. Principiu

¨ Identificarea unei modalităţi de a “încărca” un atom, sau o

moleculă = IONIZARE

¨ Plasarea particulelor ionizate într-un câmp magnetic, sau într-

un câmp electric
¤ măsurarea vitezei acestora în funcţie de raportul masă/sarcină (m/z)

¨ Detecţia ionilor
Proba

+
_

Sursa ionizare Filtru de masă Detector

Cromatograma / spectrul de masă

20
 06-07.12.2011

Spectrul de masă

¨ Reprezentarea grafică a intensităţii ionilor (abundenţa) în

funcţie de raportul m/z
¤ Stabilirea masei moleculare +/- structurii compusului analizat
¤ Determinări cantitative
¨ Ex. spectrul de masă al aspirinei
C9H8O4 ¨ Noţiuni
C7H4O2+
¤ Ion molecular (m/z 180)
- C9H8O4+
CH3CO+
¤ Pic de bază (m/z 120) -
C7H4O2+
C9H8O4+ ¤ Fragmente ionice (m/z
43, 92, 120, 137)

Spectrometre de masă

21
 06-07.12.2011

Spectrometrul de masă

Vid avansat

Sursă Filtru Prelucrare

Intrare Detector
ioni de masă date

Introducere directă MALDI TOF

HPLC ESI Quadrupol
GC FAB Trapă ionică
CE/HPCE EI/CI Sector magnetic

Spectrometrul de masă

Vid avansat

Sursă Filtru Prelucrare

Intrare Detector
ioni de masă date

Introducere directă MALDI TOF

HPLC ESI Quadrupol
GC FAB Trapă ionică
CE/HPCE EI/CI Sector magnetic

22
 06-07.12.2011

Tehnici de introducere a probei

¨ Introducere directă
¤ Puritatea probei!

¨ Cuplare cu tehnici separative

¤ HPLC
¤ GC
¤ CE/HPCE

Cuplarea cu tehnici separative

¨ GC-MS
¤ Cuplare facilă
¤ Separarea compuşilor volatili în coloana cromatografică şi identificarea
pe baza maselor moleculare

23
 06-07.12.2011

Cuplarea cu tehnici separative

¨ LC-MS
¤ Cuplaj mai dificil datorita prezentei solventilor (apa)
¤ Separarea compuşilor labili şi cu masă moleculară mare
¤ Identificarea pe baza maselor moleculare (se formeaza aducţi)

Spectrometrul de masă

Vid avansat

Sursă Filtru Prelucrare

Intrare Detector
ioni de masă date

Introducere directă MALDI TOF

HPLC ESI Quadrupol
GC FAB Trapă ionică
CE/HPCE EI/CI Sector magnetic

24
 06-07.12.2011

Spectrometria de masă. Metode de ionizare

¨ Impact electronic (EI – fragmentare puternică)

¤ Molecule mici, 1-1000 Da, stabilirea structurii

¨ Ionizarea prin bombardare cu atomi rapizi (FAB -

fragmentare puternică)
¤ Peptide, glucide, până la 6000 Da

¨ Ionizare prin electrospray (ESI – fragmentare uşoară)

¤ Peptide, proteine, până la 200,000 Da

¨ Ionizare prin desorbţie de matrice cu ajutorul laserului

(MALDI – fragmentare uşoară)
¤ Peptide, proteine, ADN, până la 500 kDa

Ionizare prin impact electronic

¨ Se preteaza cuplajului GC-MS

¨ Proba este introdusă în spectrometrul de masă după volatilizare

¨ Proba în stare gazoasă este bombardată cu electroni

¤ Filament de Rh, sau W (energie = 70 eV)

¨ Moleculele sunt fragmentate (70 eV >> 5 eV – legături chimice)

¨ Fragmentele sunt trimise spre filtrul de masă

25
 06-07.12.2011

Ionizare prin impact electronic (EI)

¨ Fragmentare puternică

Ionizare prin impact electronic (EI)

¨ Fragmentare EI a metanolului
CH3OH CH3OH+
CH3OH CH2O=H+ + H
+CH + OH
CH3OH 3

CH2O=H+ CHO=H+ + H

Ion molecular

Fragmentarea EI rupe molecula într-un mod predictibil

26
 06-07.12.2011

Ionizare prin electrospray

¨ Cuplare HPLC-MS
¨ Fragmentare usoara
¨ Ionizarea moleculelor se realizează în faza mobilă înaintea
separării cromatografice
¨ În general se formează aducţi de genul [M+H]+, sau aducţi cu
Na, K

Ionizare prin electrospray

¨ Sunt generaţi aerosoli (picaturi) încarcaţi electric, la presiune atmosferică

¨ Se impune îndepărtarea solventului înainte de a ajunge la analizor

¤ Curent de aer cald → evaporarea progresiva a moleculelor de solvent prin
mecanisme complexe de desolvatare si evaporare
¤ Densitatea de sarcini devine prea mare astfel incat picaturile cu dimensiuni mult
reduse vor exploda eliberand ionii protonati si nefragmentati (ion molecular)

27
 06-07.12.2011

MALDI

¨ Cuplare LC-MS
¨ Proteomică – stabilirea masei molecularea a fragmetelor
peptidice
¨ Fragmentare blanda

MALDI

¨ Principiu:
¤ Pregătirea matricei
n Derivaţi de acid hidroxicinamic sau hidroxibenzoic
¤ Excitarea matricei
n Fascicul laser
(fotoni cu energie mare)
¤ Ionizarea analitului
¤ Transferul spre filtrul de masa

28
 06-07.12.2011

Spectrometrul de masă

Vid avansat

Sursă Filtru Prelucrare

Intrare Detector
ioni de masă date

Introducere directă MALDI TOF

ESI Quadrupol
HPLC
GC FAB Trapă ionică
CE EI/CI Sector magnetic

Filtre de masă

¨ Sector magnetic
¤ Rezoluţia mare, mase exacte

¨ Quadrupol
¤ Rezoluţie mai redusă (1 amu), rapid, ieftin

¨ Analizor de timp de zbor (Time-of-Flight Analyzer -

TOF)
¤ Nu există limită de masă (m/z) superioară, rezoluţie mare

¨ Trapa ionică
¤ Rezoluţie redusă, ieftin

29
 06-07.12.2011

Sector magnetic

¨ Separarea ionilor se face ca urmare a interacţiunii cu un câmp

magnetic
¤ Ionii produsi in camera de ionizare sunt introdusi intr-un camp magnetic
uniform, perpendicular pe traiectoria lor
¤ Forta Lorentz → curbarea traiectoriei ionilor formati
n Deviatia traiectoriei ionilor este diferita in functie de raportul m/z →
permite calcularea exacta a masei acestora

Quadrupol

¨ Este format din 4 cilindrii metalici pe care este aplicat un

potential oscilant
¨ Traiectoria ionilor sub actiunea acestui potential este sinusoidala,
dependenta de potentialul aplicat
¤ Pentru valori date ale potentialului, numai ionii cu o valoare bine
determinata m/z vor traversa intreaga lungime a filtrului
¤ Toti ceilalti ioni vor avea oscilatii instabile, vor ciocni polii analizorului si se
vor pierde din fascicul

30
 06-07.12.2011

TOF

¨ Se bazează pe măsurarea timpului necesar unui ion accelerat

in prealabil de a parcurge o distanta fixa
¤ Ionii mai uşori (m/z mică) ajung la detector mai repede decât ionii grei
¤ Pornind de la timpul de zbor se poate calcula raportul m/z

¨ Conferă măsurători extrem de precise a masei analiţilor

(variaţii de ppb faţă de masa reală)

Aplicaţii

¨ Determinarea sau confirmarea structurii chimice a

medicamentelor şi a metaboliţilor (MS-MS)

¨ Detectarea/cuantificarea impurităţilor

¨ Detectarea/cuantificarea substanţelor medicamentoase în

fluide biologice şi ţesuturi

¨ Drug screening

¨ Analiza amestecurilor

31
 06-07.12.2011

Aplicaţii

¨ Teste clinice - detecţia

¤ erorilor de metabolism la nou-născuţi
¤ cancer, diabet
¤ intoxicaţii cu solvenţi organici, toxicomanii), etc.

¨ Analiza prin fingerprint a nutraceuticelor şi medicamentelor pe

bază de plante

¨ Identificarea pe baza analizei fingerprint a sursei produselor

naturale sau a unor medicamente

Tehnica MS-MS (tandem)

¨ Asocierea de 2, sau mai multe spectrometre de masă (filtre de

masă)
¤ QTOF – acurateţe, precizie
¤ Triplu quadrupol – determinări cantitative
n 3 filtre quadrupolare
n Q1 acţionează ca un filtru de masă, transmite şi accelerează ionii spre Q2
n Q2 = celula de coliziune
n Accelerază şi transmite ionii fără să-i filtreze
n Presiunea este mai mare şi permite coliziunea cu un gaz neutru (He), favorizând
fragmentarea suplimentară

n Fragmentele sunt accelerate spre Q3

n Sortează ionii formaţi (filtru de masă)
n Transmite ionii spre detector

32
 06-07.12.2011

Tehnica MS-MS. Aplicaţii

¨ Triplu quadrupol
¤ Analiza endosulfan, GM = 237

Tehnica MS-MS. Aplicaţii

Proteomica – definită ca analiza sistematică a proteinelor în scopul

determinării identităţii, cantităţii şi a funcţiei lor în organism
¤ “bottom-up proteomics”
n Proteine – proteoliză – peptide – spectre MS ð structură
¤ “top-down proteomics”
n Proteina – GM (MS) – fragmentare MS/MS ð structură

Produce ioni Separă ioni Detectează ioni

¨ Tehnici de ionizare ¨ Filtre de masă ¨ Spectre de masă

¤ MALDI ¤ LTQ ¨ Baze de date
n matrix-assisted laser n linear/orbital trap -
desorption ionization quadrupol
¤ ESI ¤ QqTOF
n electrospray n quadrupol-quadrupol-timp de zbor

33
 06-07.12.2011

Tehnica MS-MS. Aplicaţii

¨ Metode de identificare
a proteinelor

Concluzii

¨ Metodă de analiză a moleculelor/fragmentelor încărcate electric

pe baza raportului m/z
¨ Metodă extrem de specifică de determinare/confirmare a
identităţii sau structurii unei substanţe medicamentoase
¨ Prin cuplare cu tehnici cromatografice (GC/LC) permite
¤ Caracterizarea impurităţilor din diverse matrici
¤ Determinarea concentraţiilor substanţelor medicamentoase +/- metaboliţilor
din matrici biologice
¤ Identificarea şi caracterizarea proteinelor

¨ Tehnică analitică relativ costisitoare

¨ Necesită personal înalt specializat

34
 06-07.12.2011

Bibliografie

Watson D.G. Pharmaceutical Analysis, A textbook for

pharmacy students and pharmaceutical chemists, 2nd edition,
Elsevier, 2005.
Ashutosh Kar. Pharmaceutical drug analysis. New Age
International Publishers, 2005.
***** - Farmacopeea Română ed. aX-a, Editura Medicala,
2003.
Bojiţă M., Roman L., Sandulescu R., Oprean R - Analiza si
controlul medicamentelor. Volumul 1 Bazele teoretice si
practice, Ed. Intelcredo, Deva, 2002

35