Genetică moleculară – curs 2

1.6. ROLUL INFORMAȚIONAL AL ACIZILOR NUCLEICI

Experimentele lui Griffith si Avery

Griffith a efectuat experienţe cu bacterii din specia Diplococcus pneumoniae, aşa numiţii
pneumococi. El a observat că există două tipuri (tulpini) de pneumococi: unii virulenţi, care injectaţi la
şoareci de laborator provoacă infecţii grave (septicemie) şi alţii nevirulenţi, inofensivi.
Experimentele întreprinse de Griffith (Figura 21) cu cele două tulpini de pneumococi au fost
următoarele:
• A injectat o cultură de pneumococi vii virulenţi de tip S la şoareci de laborator. Ca urmare,
animalele au murit de septicemie.
• A injectat o cultură de pneumococi vii nevirulenţi de tip R la şoareci, dar nu se mai produce
îmbolnăvirea.
• A omorât o cultură de pneumococi virulenţi cu şocuri termice, iar lizatul celular obţinut
(celulele sparte ale pneumococilor) l-a injectat şoarecilor, neafectând sănătatea acestora.
• A injectat la şoareci pneumococi vii aparţinând tulpinii nevirulente, amestecaţi cu
resturile pneumococilor virulenţi, omorâţi prin căldură. Surpriza a fost că şoarecii au murit
de septicemie, iar din ei a izolat pneumococi vii virulenţi.

Figura 21 Experimentul efectuat de Griffith

Ulterior, s-a demonstrat că acest fenomen are loc în condiţii experimentale şi la alte organisme,
căpătând o semnificaţie mai largă, denumită transformare genetică. Fenomenul de transformare genetică
s-a relizat şi la alte specii de bacterii: Bacillus subtilis, Hemophilus influenzae, Escherichia coli etc.
Rezolvarea cauzalităţii acestui fenomen a venit în anul 1944, când Oswald T. Avery, Colin M. McLeod
şi Maclyn McCarty (Rockefeller Institute, New York), au reluat experimentele lui Griffith, reuşind să
identifice componentul care induce transformarea pneumococilor şi să-l purifice. La momerntul în care
1
Genetică moleculară – curs 2

Avery şi colaboratorii lui şi-au început cercetările era stabilit că proprietatea de virulenţă în cazul
pneumococilor este corelată cu prezenţa unei structuri celulare, numită capsulă, de natură polizaharidică.
Experimentele realizate de echipa lui Avery au fost următoarele:
• A injectat o cultură de pneumococi S (vii virulenţi) la şoareci de laborator, producându-se
infecţia.
• A injectat şoarecilor lizat celular obţinut în urma omorârii prin şoc termic a pneumococilor S,
neproducându-se infecţia.
• A injectat şoarecilor lizat S împreună cu pneumococi R (vii nevirulenţi), declanşându-se infecţia.
• Lizatul S, împreună cu ADN-ază (enzima dezoxiribonuclează) şi cu pneumococi R au fost
injectaţi la şoareci, neproducându-se infecţia.
• Lizatul S, împreună cu ARN-ază (enzima ribonuclează) şi cu pneumococi R, au fost injectaţi la
şoareci, la care s-a produs infecţia.
• Lizatul S, împreună cu protează şi cu pneumococi R, injectaţi la şoareci, au produs infecţia.
Concluzia desprinsă din aceste experimente a fost că natura componentului care determină
transformarea pneumococilor nevirulenţi în pneumococi virulenţi este ADN.

Figura 22 Experimentul efectuat de Avery

Experimentul Hersey - Chase

O demonstraţie indubitabilă a rolului informaţional al ADN a fost oferită şi de cercetările efectuate
pe material viral, elucidându-se cauzalitatea infecţiilor virale. Acestea au fost realizate de către A. Hershey
şi M.C.Chase la Cold Spring Harbor, din Long Island în anul 1952. Datorită dezvoltării tehnicilor de
ultracentrifugare şi de marcare radioactivă a unor componente celulare, s-a reuşit separarea
componentelor virale sub formă de înveliş proteic (capsida) şi acizi nucleici virali.

2
Genetică moleculară – curs 2

1.7. GREUTATEA MOLECULARĂ A ACIDULUI DEOXIRIBONUCLEIC

Greutatea moleculară a ADN variază în funcţie de specie, de metoda de extracţie utilizată şi de

metoda prin care s-a determinat greutatea moleculară.
Macromolecula de ADN este una dintre cele mai mari molecule biologice, cu o masă moleculară
având valori cuprinse între 12-16 x 106 daltoni (1 dalton = 1/12 din masa atomului de carbon).
În funcţie de origine, macromoleculele de ADN sunt diferite, deci, macromolecula ADN este
heterogenă sub aspectul greutăţii moleculare. Spre exemplu, o macromolecula de ADN de 10μm lungime
are o greutate moleculară de aproximativ 107 daltoni în cazul unor virusuri şi bacterii.
Diversificarea surselor de prelevare a probelor a lărgit limitele de variabilitate, constatându-se că
greutatea moleculară poate fi cuprinsă între 0,6 x 106 şi 2 x 106 daltoni.
S-a constatat că, deşi deosebit de stabile, macromoleculele de ADN se pot rupe prin agitarea
mecanică, indispensabilă din orice protocol de extracţie. Chiar şi ultrasunetele pot fragmenta dublul helix,
fără a induce o separare a celor două catene. Prin simplă agitare mecanică, dar cu frecvenţă variabilă se
poate induce o fragmentare omogenă a macromoleculei de ADN. Mărimea fragmentelor astfel obţinute
este invers proporţională cu frecvenţa agitării.
S-a demonstrat că greutatea ADN fagic variază între 120 x 106 şi 160 x 106 daltoni, stabilindu-se cu
această ocazie că într-un fag există o singură macromoleculă de ADN cu o lungime de aproximativ 0,1mm.
De aici s-a conturat ipoteza conform căreia un cromosom înglobează o singură macromoleculă de ADN.
O altă constatare obţinută prin determinări repetate este aceea că o bacterie din specia Escherichia
coli conţine în unicul cromosom o macromoleculă de ADN, lungă de 40mm, cu o greutate moleculară de
4 x 1010 daltoni.
În cazul omului, un nucleu celular haploid conţine în medie 3.234.830.000 pb (aproximativ 6,6 pg
ADN) dintre care doar 1,5% codifică 20.000 proteine.

1.8. PROPRIETĂŢILE FIZICO- CHIMICE ALE ACIDULUI DEZOXIRIBONUCLEIC

În apă pură, toate grupările fosfat din scheletul glucidofosforic al macromoleculei de ADN ionizează
şi dau o încărcătură electronegativă ridicată. Acest comportament dovedeşte că ADN este insolubil în apă
pură.
Adăugarea de NaCl determină saturarea rapidă a sarcinilor electrice ale ADN, iar interacţiunile
intermoleculare dispar. Din această cauză, dizolvarea ADN este posibilă doar în soluţii apoase saline. Însă,
creşterea concentraţiei saline peste anumite valori determină o scădere a solubilităţii ADN În scopul
efectuării unor analize relevante, în soluţia în care se solvă ADN, se pot introduce agenţi chelatori (citratul
de sodiu) care elimină efectele perturbante ale ionilor bivalenţi şi inhibă unele activităţi nucleazice.
În UV (ultraviolet) soluţia de ADN prezintă o bandă de absorbţie la 260nm. Pentru stabilirea
constantei de sedimentare (S), se foloseşte numai absorbţia în UV, metoda fiind mult mai sensibilă în
comparaţie cu metodele optice refractometrice obişnuite.
În soluţilile diluate, particulele de ADN au o configuraţie liniară, dar nu rectilinie, având o dispunere
în zig-zag mare, destul de rigid. La o greutate moleculară de aproximativ 8 x 106, pe lungimea
macromoleculei în zig-zag se găsesc peste 100 de subunităţi drepte.
Deoarece formarea legăturilor de hidrogen între diferitele baze azotate depinde de forma lor ionică,
deci de pH, stabilitatea perechilor de baze ale ADN dublu helix este de asemenea dependentă de pH.
Perechile de baze prezintă un maxim de stabilitate la valori ale pH-ului cuprinse între 4,0 şi 11,0. În afara
acestor limite, nefiziologice, macromolecula de ADN dublu helicoidală devine instabilă şi se derulează.

Vâscozitatea. Datorită rigidităţii dublului helix şi lungimii foarte mari a macromoleculei de ADN în
comparaţie cu diametrul său mic, soluţiile de ADN, chiar şi cele foarte diluate, prezintă o vâscozitate
accentuată. Măsurătorile de vâscozitate sunt adesea folosite pentru a urmări denaturarea şi derularea
macromoleculelor de ADN bicatenar. O altă consecinţă a dimensiunilor mari ale macromoleculelor de ADN
3
Genetică moleculară – curs 2

este aceea că, prin difuzie, ele antrenează un volum de soluţie, de 10 000 de ori mai mare decât volumul
propriu.

1.9. DENATURAREA ADN

Denaturarea macromoleculei de ADN constă în perturbarea legăturilor de hidrogen şi a forţelor van

der Waals între bazele azotate ale celor două catene polidezoxiribonucleotidice.
Denaturarea acizilor nucleici poate fi cauzată de:
- temperaturi înalte (cuprinse între 63 şi 100°C), dependente de conținutul în pb de tip C≡G
- scăderea forţei ionice a mediului,
- creșterea pH-ului – favorizează ruperea legăturilor de hidrogen,
- soluții saline cu concentrații scăzute care permit denaturarea la temperaturi mai scazute. ADN
devine mai puternic încărcat electronegativ, rezultând o puternică respingere între catene
(Figura 23)
- prezenţa acizilor, alcoolilor sau cetonelor în soluţie etc.

Figura 23 Dependența denaturării ADN de concentrația ionică. Diferite concentrații de KCl în tampon de citrat
pH=7

În cazul denaturării termice a acizilor nucleici, în tranziţia de la o stare la alta, participă un număr
mare de interacţiuni şi fiecare interacţiune anterioară creşte probabilitatea de desfăşurare a următoarei
interacţiuni, întrucât interacţiunile între bazele azotate ale celor două lanţuri polinucleotidice sunt
cooperante. De aceea, denaturarea acizilor nucleici bicatenari sub acţiunea temperaturii se numeşte
„topire" (engl. melting).
Ca rezultat al denaturării acizilor nucleici, are loc separarea lanţurilor din dublul helix al
macromoleculei de ADN sau din zonele bicatenare ale ARN, fiecare lanţ separat luând forma de ghem cu
o înfăşurare dezordonată. Mai mult, denaturarea poate produce şi fragmentări ale macromoleculelor de
ADN.
Procesul denaturării se desfăşoară astfel: cele două catene ale dublului helix se derulează pe
anumite porţiuni și se produce ruperea punţilor de hidrogen dintre cele două catene derulate. Porţiunile
derulate iau conformaţii întâmplătoare care se modifică permanent. (Figurile 25 - 27).
Temperatura la care cel puţin jumătate dintre macromoleculele de ADN din soluţia respectivă sunt
denaturate, se numeşte temperatură medie de topire (engl. melting midpoint), temperatură de tranziţie,
sau temperatură de echilibru (Figura 24)

4
Genetică moleculară – curs 2

Figura 24 Curba de denaturare (topire) a ADN bicatenar.

Valoarea temperaturii medii de topire depinde de numărul perechilor de baze G şi C, în sensul că

un număr crescut a acestor perechi de nucleotide induce o creştere a stabilităţii macromoleculei şi
implicit, o creştere a temperaturii medii de topire. S-a constatat că temperatura medie de topire a zonelor
bicatenare ale ARN, este mai mare decât a ADN dublu catenar. Aceasta dovedeşte că macromoleculele de
ARN sunt mai bogate în G ≡ C comparativ cu macromoleculele de ADN.

Tm = 2oC (A+T) + 4oC (C+G)

Un alt argument că perechile de baze G ≡ C determină creşterea valorii Tm, este şi faptul că în
procesul denaturării dublului helix, derularea şi apoi separarea catenelor complementare încep din
regiunile bogate în perechile de baze A = T, înaintând progresiv către zonele bogate în perechi de baze G
≡ C. Legăturile triple de hidrogen între G şi C induc o mai mare stabilitate dublului helix.
Dinamica denaturării termice poate fi pusă în evidenţă şi prin capacitatea de absorbţie a radiaţiilor
UV, măsurată la lungimea de undă de 260 nm. Capacitatea de absorbţie în UV creşte corelativ cu numărul
perechilor de baze A = T. Altfel spus, în stare denaturată, macrmolecula de ADN absoarbe în domeniul UV
mai intens decât în stare nativă (dublu helix), condiţionând efectul hipercromic (Figura 25).
Creşterea maximă a absorbţiei poate să atingă 80% în cazul denaturării complete a acizilor nucleici
(separării complete a catenelor complementare).
Efectul hipercromic presupune şi alte modificări ale soluțiilor de ADN, cum sunt: diminuarea
vâscozităţii şi diminuarea greutăţii moleculare cu aproximativ 50%.

5
Genetică moleculară – curs 2

Figura 25 Absorbția ADN în UV pentru

1 – dubluhelix, 2 – ADN denaturat spiralizat randomic, 3 – nucleotide libere, aflate în aceeași concentrație
ca în cazul ADN nativ

Figura 26 Denaturarea diferitelor tipuri de ADN bicatenar

A – denaturarea ADN bicatenar liniar, determină formarea a două lanțuri monocatenare liniare; B – denaturarera
ADN bicatenar circular prin producerea a cel puțion o rupturîă a unei legături fosfodiester, determină formarea
unei catene liniare și a unei catene circulare; C – catenele nu se pot separa în cazul moleculelor de ADN bicatenar
circular

6
Genetică moleculară – curs 2

Figura 27 Etapele denaturării şi renaturării macromoleculei dublu catenare de ADN

Figura 28 Etapele denaturării şi renaturării macromoleculei dublu catenare de ADN

7
Genetică moleculară – curs 2

1.10. RENATURAREA ADN

Prin răcirea bruscă a soluţiei de ADN denaturat, lanţurile polidezoxiribonucleotidice

complementare rămân separate, caz în care denaturarea devine ireversibilă.
Dacă soluţia de ADN denaturat se răceşte încet, cu puţin sub temperatura de topire (scăzând
temperatura cu circa 20°C faţă de cea de denaturare), se restabileşte structura bicatenară nativă. Acest
proces dovedeşte că denaturarea este reversibilă, iar fenomenul se numeşte renaturare (engl.
reannealing).
Renaturarea macromoleculei de ADN depinde de concentraţia macromoleculelor iniţiale, de
uniformitatea şi omogenitatea secvenţelor nucleotidice.
Procesul renaturării se desfăşoară în două etape:
a) asamblarea în perechi a unui număr mic de nucleotide, rezultând secvenţe dublu catenare scurte;
b) accelerarea asamblării dublului helix prin legarea succesivă a nucleotidelor complementare în
perechi.
Deoarece în timpul denaturării, monocatenele provenite de la diverse macromolecule se amestecă
între ele, renaturarea decurge cu viteze diferite. Un proces de renaturare este considerat eficient, când
cel puţin 70% din macromoleculele de ADN devin bicatenare. Aprecierea intensităţii renaturării poate fi
oferită şi de scăderea capacităţii de absorbţie a radiaţiilor UV, precum şi de modificarea vitezei de
sedimentare.
Un fenomen deosebit de important legat de denaturare şi renaturare este hibridarea ADN-ADN
(de origini diferite), sau hibridarea ADN-ARN. Acest fenomen se explică astfel: ADN denaturat (deci
monocatenar) poate să interacţioneze pe baza principiului complementarităţii cu ADN sau ARN
monocatenar aparţinând altor organisme. Dacă se vor amesteca produşii de denaturare ai acizilor nucleici
cu origini diferite, atunci în condiţiile renaturării se vor forma macromolecule bicatenare atât din catene
omoloage cât şi din catene diferite. Acest tip particular de renaturare se numeşte hibridare moleculară,
întrucât conduce la formarea macromoleculelor hibride ADN-ADN şi ADN-ARN. Hibrizii moleculari ADN-
ADN ajută la stabilirea gradelor de înrudire între două specii diferite, in timp ce hibrizii ADN-ARN oferă
evidenţierea corespondenţei ADN-ARN mesager, corespondenţă cu implicaţii deosebite pentru
descifrarea secvenţei genice pentru estimarea procesului reverstranscripţiei.
Metoda hibridării moleculare se foloseşte pentru cercetarea poziţiei taxonomice şi înrudirii
genetice a diferitelor organisme, permiţând elucidarea unor probleme dificile ale taxonomiei şi evoluţiei.

1.11. TIPURI DE HELIXURI ADN

Structura spaţială a macromoleculei de ADN a fost studiată prin tehnici de spectrofotometrie,

rezonanţă magnetică nucleară, difracţie cu raze X etc.
Difracţia cu raze X asupra macromoleculei de ADN arată existenţa a mai multor tipuri distincte de
structură cu orientarea elicei spre dreapta, demonstrând prin aceasta caracterul dinamic din punct de
vedere structural al macromoleculei de ADN.
Cercetări relativ recente au evidenţiat că în natură există excepţii de la modelul Watson şi Crick.
Astfel, pot să apară împerecheri neobişnuite de tipurile: C – C şi /sau A – G, sau A – C, împerecheri
identificate până în prezent doar în cazul catenelor de acid ribonucleic (ARN). Alteori, abaterile de la tipul
standard al macromoleculei de ADN (modelul Watson-Crick) pot fi datorate prezenţei analogilor bazelor.
Spre exemplu, 5-bromuracilul în starea cetonică se uneşte cu adenina şi îndeplineşte rolul timinei.
În prezent se cunosc mai multe tipuri conformaţionale ale macromoleculelor de ADN, notate A,
B, C, D, Z. Tipurile de ADN – A, B, C, D au spirale duble orientate spre dreapta, iar tipul Z are spirale duble
orientate spre stânga.

Tipul ADN-B este modelul standard propus de Watson şi Crick, cea mai mare parte din ADN-ul
celular, fiind de tip B (Figurile 29 – 30)
8
Genetică moleculară – curs 2

ADN-B este, aşa cum am mai precizat o dublă elice cu spiralizare spre dreapta, în care cele două
catene au polaritate opusă şi nu pot fi separate una de alta dacă nu sunt derulate. Fiecare tur complet al
dublului helix conţine 10 perechi de baze, fiecare pereche de baze având planul orientat perpendicular pe
axul longitudinal al macromoleculei. Diametrul macromoleculei de ADN-B este de 2 nm, iar pasul elicei
(un tur complet) măsoară 3,4 nm. Helixul B prezintă două tipuri de cavităţi: o cavitate majoră și o cavitate
minoră. Deshidratarea prin tratamente cu soluții saline având concentrații ridicate sau cu alcooli, induce
tranziţia de la tipul B la tipul A de ADN (Figura 31).

Tipul ADN-A este tot un dublu helix cu spiralizare spre dreapta (engl. right-handed). „In vitro”,
tranziţia de la B la A se realizează sub acţiunea solvenţilor organici, în timp ce „in vivo”, tranziţia se produce
sub acţiunea unor proteine.
Spre deosebire de tipul B, în care perechile de baze sunt poziţionate perpendicular pe axul
helixului, la tipul A, perechile de baze au o poziţie înclinată într-un unghi de 20° faţă de axul longitudinal
ceea ce determină modificarea pasului elicei, pas care se reduce la 2,8 nm (28 Å). De asemenea, se
modifică şi numărul de perechi de baze pe tur de elice, astfel că vor fi 11 perechi de baze în loc de 10.
Helixul A este mai larg şi mai scurt decât helixul B. Deci, diametrul helixului A este mai mare decât
al helixului B, şi anume de 2,3 nm (23 Å) în loc de 2 nm cât are ADN-B (Figura 32).

Figura 29 ADN-B Figura 30 ADN-B

9
Genetică moleculară – curs 2

Figura 31 Tranziția ADN-B – ADN-A

Figura 32 ADN-A

10
Genetică moleculară – curs 2

Tipul ADN-C reprezintă tot un helix de dreapta, cu pasul spiralei duble de 3,31 nm şi 9 perechi de
baze pe spiră. Tipul C-ADN este caracteristic unor genomuri virale (Figura 33).

Figura 33 ADN-C Figura 34 ADN-D

Tipul ADN-D este foarte rar întâlnit, este un helix dublu cu spiralizare spre dreapta. Unghiul de
rotaţie al acestui tip de helix este destul de mare (45°). D-ADN este asemănător cu ADN glicozilat extras
din bacteriofagul T2 (Figura 34)

11