UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE I MEDICIN VETERNAR A BANATULUI TIMIOARA

FACULTATEA DE ZOOTEHNIE I BIOTEHNOLOGII

Procese biochimice n reproducerea animalelor

Referat cu tema:

Caracterizarea din punct de vedere biochimic a comportamentului celulei in timpul crioconservarii

2010

Caracterizarea din punct de vedere biochimic a comportamentului celulei in timpul crioconservarii

Crioconservarea i criocongelarea au aplicaii importante n cele mai multe domenii ale tiinei biomedicale cnd este necesar stocarea celulelor sau esuturilor pentru o perioad lung.

Crioconservarea natural
Organismele multicelulare microscopice, pot supravieui congelarii la temperaturi sczute, prin nlocuirea n cea mai mare parte, a apei din interiorul lor, cu trehaloz de zahr. Trehaloz este un zahar care nu cristalizeaz uor. Amestecuri de substante aditionale dizolvate pot obine efecte similare. Unele substane dizolvate, inclusiv srurile, au dezavantajul c acestea pot fi toxice la concentraii mari.

Istoric
Una dintre cele mai importante lucrri si inceputurile pe teoria de crioconservare a fost lui James Lovelock cunoscut prin ca autorul teoriei Gaia. Dr. Lovelock a sugerat c deteriorarea celulelor roii din snge n timpul congelarii s-a datorat din punct de vedere osmotic. Lovelock la nceputul anilor 1950 a sugerat, de asemenea, c, creterea concentraiilor de sare ntr-o celul n care se deshidrateaza pentru a pierde ap si a forma gheaa externa, ar putea cauza daune celulei. Crioconservarea de esut, a inceput cu nghearea spermatozoizilor de la psri, care a fost pusa in aplicatie, n 1957 cu ajutorul unor crioprotectori, de o echip de oameni de tiin n Regatul Unit, condus de Dr. Christopher Polge. Procesul sa mutat n lumea uman n anii 1950, cu rezultate obinute dup inseminarea spermei congelate. Cu toate acestea, imersiunea rapid a probelor n azot lichid nu poate fi facuta, pentru unele dintre aceste probe, cum ar fi tipurile de embrioni, mduva osoasa i celulele stem, pentru ca aceastea nu prezinta viabilitatea necesara pentru a le face mai uor de utilizat la decongelare. nelegerea sporit a mecanismului de congelare la celule s-a subliniat prin importana controlarii unei raciri lente pentru a obine un maxim de supravieuire la dezghearea celulelor vii. Pentru aceasta este nevoie de o rat controlata a procesului de rcire, care s permit echilibrarea probelor biologice, pentru a optimza parametri fizici osmotici ntr-un crioprotector. Capacitatea crioprotectantilor , la nceputul utilizarii de glicerol, pentru a proteja celulele deteriorate de ngheare, a fost descoperita accidental.

Deteriorarea de congelare are dou aspecte daune, directe, din cristale de ghea i daunele secundare, cauzate de creterea concentraiei ale substanelor dizolvate. n 1963 Peter Mazur, la Oak Ridge National Laboratory din SUA, a artat c nghearea letala intracelular ar putea fi evitate dac rcirea a fost destul de lenta pentru a permite apei suficient timp pentru a prsi celula n timpul nghearii progresive a lichidul extracelular. Aceast rat difer, ntre celulele de diferite dimensiuni i permeabilitatea apei: o rat tipic de rcire n jur de 1 C / minut este adecvat pentru multe dintre celulele de mamifere dup tratamentul cu crioprotectori cum ar fi glicerolul sau sulfoxidul de dimetil, dar rata nu este un optim universal.

Materiale Biologice Crioconservate

Tesuturi crioconservate n general, este mai uor de crioconservat probe in cantitati mici de celule individuale, pentru c acestea pot fi rcite mai rapid i impun prin acest lucru, doze mai mici de crioprotectori toxici. Prin urmare, scopul de crioconservare de ficat uman i inimii, pentru depozitare i de transplant, este nc la distan. Cu toate acestea, combinaii adecvate de crioprotectori i anumite regimuri de rcire i cltire n timpul procesului de crioconservare, permit, de multe ori cu succes a materialelor biologice, prin suspensii speciale de celule sau probe de esuturi mici, sa fie crioconservate. Exemplele includ: material seminal; sange; celule speciale pentru transfuzie; celulele stem; sngele ombilical din cordonul ombilical; probe de esuturi, cum ar fi tumori i seciuni transversale histologice ovocite; Embrionii, in stadiile 2, 4 sau 8 celule, cand sunt inghetate; esut ovarian ; Semine de plante sau lstari, pot fi crioconservati n scopuri de conservare. n plus, eforturile sunt n curs de a pstra un om criogenic, cunoscut sub numele de cryonics. Cryonics este o categorie diferit de exemplele menionate anterior, cu toate acestea, n timp ce pentru nenumrate celule crioconservate , vaccinuri, esut i alte probe biologice au fost decongelate i folosite cu succes, acest lucru nu a fost nc definit si nu au avut reusite in incercarea crioconservarii organelor punandu-se accent is special pentru realizarea unui creier crioconservat. Sustinatorii cryonics fac un caz in care crioconservarea folosind tehnologia actual, n special vitrificare a creierului, poate fi suficient pentru pstrarea persoanelor ntr-o forma "teoretica", astfel nct acestea ar putea fi renviat, in ansamblu prin aceste incercari duc la avansarea tehnologiei in viitor .

Metode moderne de crioconservare

Crioconservarea este un proces, n care celulele sau esuturi ntregi sunt conservate prin rcire, la temperaturi sczute, sub-zero, cum ar fi (de obicei) 77 K sau -196 C (punctul de fierbere de azot lichid). La aceste temperaturi sczute, orice activitate biologic, inclusiv reacii biochimice care ar conduce la moartea celulelor, este efectiv oprit. Cu toate acestea, atunci cand solutiile crioprotectoare nu sunt utilizate, celulele fiind conservate, sunt de multe ori avariate din cauza congelarii n timpul abordarea la temperaturi sczute sau nclzirea la temperatura camerei.

Factori si constatari
Temperatura. Depozitarea produselor criogenate la temperaturi foarte sczute presupune a oferi o durat nedeterminat, dac nu chiar n apropierea de infinit, longevitatea la celule, dei real "termenul de valabilitate", este destul de dificil de dovedit. n experimentele cu probe uscate, semine, cercettorii au constatat c nu a existat variabilitate, deteriorare evident n cazul n care probele au fost inute diferit "ngheate" la temperaturi ultra-chiar i cele rece. Temperaturi sub punctul de tranziie de sticl (Tg) de ap (n jur de minus 136 C), par a fi acceptate ca limite n care activitatea biologic incetineste substantial, i minus 196 C (fazei lichide de azot lichid) este temperatura preferat pentru depozitare a exemplarelor importante, n general, zona ultra rece de azot lichid la -196 C, este necesar pentru conservarea cu succes a structurilor mai complexe biologice pentru a opri aproape toate activitiile biologice. Riscuri. Fenomenele care pot cauza deteriorarea celulelor n timpul crioconservari au loc n principal n timpul etapei de congelare, i includ: soluie de efecte, formarea extracelulara de ghea, deshidratare i formarea intracelular de ghea. Multe dintre aceste efecte pot fi reduse prin crioprotectanti. Atunci cnd au ajuns n faza de congelare, materialul este relativ conservat n condiii de siguran fata de viitoarele daune (distrugeri). Cu toate acestea, estimri bazate pe acumularea de radiaii induse de deteriorarea ADN-ului n timpul depozitrii criogenice au sugerat o perioad maxim de depozitare de 1000 de ani. Efecte si soluii Deoarece cristalele de ghea cresc dizolvarea substanelor n ap de congelare acestea sunt excluse pentru a preveni formarea extracelulare de gheata. Atunci cnd esuturile sunt rcite lent, apa migreaz din celule i formandu-se cristale de ghea n spaiul extracelular. Prea mult ghea extracelulara poate provoca leziuni mecanice membranei celulelor din cauza de zdrobire. Deshidratarea Migraia de ap care cauzeaz formarea extracelulara de ghea poate provoca, de asemenea, deshidratarea celulelor. Formarea intracelular de ghea. n timp ce unele organisme i esuturi pot tolera cantitati mici de ghea extracelulara, orice ghea semnificativ intracelulara este aproape ntotdeauna fatala n celule. Prevenirea riscurilor

Vitez controlat printr-o congelare lenta, sunt stabilite tehnici de pionier la nceputul anilor 1970, care a permis embrionului uman, prima natere congelata (Zoe Leyland) n 1984. De atunci, mainile care congeleaza probe biologice, utiliznd paii programabili, cu rate controlate, au fost utilizate n ntreaga lume. Aceste maini sunt utilizate pentru nghearea ovocitelor, a pielii, a produselor din snge, embrionilor, spermei, celulelor stem i conservarea general de esut n spitale, in practicile de uz veterinar i in laboratoarele de cercetare din ntreaga lume. Ca un exemplu, estimrile au pus numrul de nateri vii de la lent ngheate ", la aproximativ 300.000 de la 400.000 sau 20 de embrioni congelai '% din cele aproximativ 3 milioane nateri din fertilizarea in vitro. Letala este nghearea intracelulara, care poate fi evitat dac rcirea este destul de lenta pentru a permite suficient apei de a prsi celula n timpul nghearii progresive a lichidului extracelular. Mai multe studii independente au furnizat dovezi c embrionii congelai stocati,utiliznd tehnici de congelare lent,ar putea, n anumite moduri s fie "mai buna" dect n stare proaspt a fertilizarii in vitro.Studiile indic faptul c folosind embrioni congelai, mai degrab dect embrioni proaspei a redus riscul de ft mort i natere prematur dei motivele exacte sunt nc explorate.

Vitrificarea
Cercettorii care au dezvoltat o nou tehnic, vitrificarea, din anul 2000, ca cerere pentru a oferi beneficiile de crioconservare, fr deteriorri cauzate de formarea cristalelor de ghea. n crioconservarea clinica, vitrificarea necesit de obicei adugarea de crioprotectori nainte de rcire. Crioprotectorii acioneaza ca antigel: la cele mai mici temperaturi de congelare. Ei, de asemenea, cresc viscozitatea. n loc de cristalizare, soluia siropoasa se transform ntr-o ghea amorfa, se vitrifica. Vitrificarea de ap este promovat prin rcirea rapid, i poate fi realizata fr crioprotectori de ctre o scdere extrem de rapid a temperaturii (megakelvins pe secund). Cele dou condiii ,de obicei necesare pentru a permite vitrificarea, sunt, o cretere a vscozitatii i o depresiune de temperatura de congelare. Rcirea rapid, de asemenea, promoveaz vitrificarea. n stabilirea metodelor de crioconservare, substantele dizolvate trebuie s ptrund membrana celulelor, n scopul de a realiza viscozitatea a crescut i deprim temperatura de congelare din interiorul celulei. Zaharurile nu ptrund cu uurin prin membrana. Aceste substane dizolvate fac, cum ar fi sulfoxidul de dimetil, un crioprotector comun, si sunt de multe ori toxice, n concentraie mare. Unul dintre compromisurile dificile cu care se confrunt n crioconservarea este vitrificarea, de a limita daunele produse de crioprotector insusi.

UTILIZAREA MATERIALELOR BIOLOGICE CELULARE IN CRIOCONSERVARE Material seminal Crioprotectorul mass-media poate fi completat cu glbenu de ou, fie sau lecitin de soia, cu cele dou care nu au diferene semnificative statistic, n comparaie cu privire la motilitate, morfologie sau integritatea ADN-ului, dup decongelare. Embrioni Crioconservarea pentru embrionii este utilizata pentru depozitarea de embrioni, de exemplu, atunci cnd fertilizarea in vitro a avut drept rezultat embrioni mai mult dect este necesar n prezent.

Crioconservarea embrionilor de oarece de laborator

Odat cu descoperirea noilor tehnologii de manipulare a liniei germinale a oarecelui de laborator prin microinjecia de fragmente de ADN n pronucleu, prin microinjecia de celule ES modificate n blastociti de oarece de laborator sau prin mutageneza ENU, se nasc noi modele respectiv linii de oarece de laborator. Prin descoperirea tehnologiei de crioconservare este ndeplinit dorina de a pstra aceste animale fr spaiu i costuri de cretere semnificative pentru studii viitoare. Aplicaiile congelrii embrionilor nu se limiteaz numai la factorii financiari i spaiali mai sus enumerai ci i la factorii naturali ce pot afecta o colonie: boli, incendii, contaminri genetice sau driftul genetic. n desemnarea stadiului de conservare a materialului genetic se disting bnci haploide (ovocite sau spermatozoizi) i bnci de embrioni.

Principiul crioconservrii
Crioconservarea embrionilor de oarece este posibil n toate stadiile preimplantaionale prin utilizarea diferiilor crioconservani (dimetilsulfoxid DMSO, propilen glicol, glicerol, etilen glicol), a diferitelor metode de congelare ct i diferite recipiente de crioconservare (tuburi, paiete). Factorii cu un rol crucial n supravieuirea embrionilor la congelare sunt: 1. Factori legai de celul sau embrion: mrimea, forma, permeabilitatea la ap (Mazur et. al, 1984), 2. Factori fiziologici sunt legai de crioconservare, susceptibilitatea la frig i toxicitate. (Jackson I.J. et al, 2000).

Principiul crioconservrii embrionilor de oarece de laborator n trepte

Crioconservarea embrionilor n trepte este o metod ce const n utilizarea unui aparat de rcire dirijat a embrionilor pn la o anumit temperatur, -30C, dup care acetia sunt depozitai n azot lichid, -196C. Caracteristic acestei metode este utilizarea de crioconservani de concentraii reduse (1-2 M) ceea ce determin modificarea embrionilor n volum n timpul rcirii dirijate i nclzirii dirijate. n figura 1 este redat modelul matematic pe baza cruia are loc modificarea volumetric a embrionilor n decursul crioconservrii. Fig 1. Reprezentare schematic a modificrii volumului celular n timpul congelrii dirijate (dup Glenister P.H. i Rall, 2000). n urma recoltrii embrionilor acetia sunt meninui n condiii izotonice de mediu ceea ce determin meninerea constant a volumului. Prin introducerea embrionilor n soluia de crioconservant pentru echilibrare, pe o perioad de 10-15 min, are loc o reducere n volum a embrionilor urmat de o cretere n volum pe baza osmozei ceea ce determin nlocuirea unei cantiti din apa intracelular cu crioconsevant. n urma seedingului i a rcirii controlate a mediul extracelular al embrionilor sufer o cretere a concentraiei ionice, datorit formrii cristalelor de ap. Concentraia ridicat din exterior face ca apa intracelular s prseasc embrionul fapt ce determin o scdere n volum a embrionului. Volumul embrionilor se reduce pn la aproximativ 60%. n timpul nclzirii are loc diluia mediului de suspensie al embrionilor ceea ce determin creterea n volum a embrionilor. Pentru nlocuirea crioprotectantului din celule se utilizeaz o soluie de sucroz. La introducerea embrionilor n diluantul de sucroz acetia i micoreaz volumul osmotic pe baza eliminrii crioconservatului. Volumul izotonic este reatins odat cu introducerea embrionilor n mediu de cultur izotonic.

Principiul crioconservrii embrionilor de oarece de laborator prin vitrificare

Vitrificarea este o metod foarte rapid de crioconservare a embrionilor pe baza unei concentraii ridicate de crioprotectant. Aceast metod a fost introdus de Rall n 1987. Caracteristic vitrificrii este faptul c n decursul congelrii are loc solidificarea direct a mediului de crioconservare fr formarea cristalelor de ghea. Spre deosebire de congelarea n trepte modificarea n volum a celulelor are loc n faza de deshidratare sau n faza de rehidratare i nu n faza de congelare. Dinamica modificrii volumului celulelor are loc pe baza osmozei i este redat n figura 2.

Fig. 2: Reprezentare schematic a modificrii volumului celular n timpul vitrificrii (dup Glenister P.H. i Rall, 2000). Echilibrarea are loc n trei etape. n prima etap are loc echilibrarea embrionilor n glicerol 1,6 M, timp de 15 min., ceea ce duce la eliminarea apei din celule, deci o scdere n volum a embrionilor, urmat de o revenire la volumul izotonic prin acumularea de crioconservant. n treapta urmtoare embrionii sunt transferai n picturi de crioconservant de concentraii crescnde, fapt ce determin o scdere continu a volumului embrionilor. n treapta a treia embrionii sunt introdui pentru un minut n mediu de vitrificare, fiind ulterior (dup aproximativ un minut) direct plonjai n azot lichid. n timpul congelrii, depozitrii i decongelrii embrionilor nu are loc modificarea volumului osmotic al embrionilor.

La decongelare modificarea n volumul embrionilor are loc la eliberarea glicerolului din celule, pe baza soluiei de sucroz. Iniial embrionii sunt plasai ntr-o soluie de sucroz cu o concentraie redus fapt ce determin creterea n volum a embrionilor. Plasarea ulterioar ntr-o concentraie ridicat de sucroz pentru eliminarea crioconservantului din celule duce la scderea n volum a embrionilor. Prin transferul embrionilor n mediul de cultur acetia revin la volum lor izotonic. Avantajul acestei metode const n faptul c este o metod ieftin, ce nu necesit achiziionarea de aparatur suplimentar, nu exist pericolul leziunii celulare datorate formrii cristalelor de ghea, este o metod foarte rapid ce implic o congelare i o decongelare rapid a embrionilor. Dezavantajele acestei metode sunt reprezentate de concentraiile ridicate de crioconservani utilizate pentru deshidratarea embrionilor. Concentraia, timpul i temperatura crioconservantului sunt factori determinani asupra viabilitii embrionilor

Bibliografie
Bencsik I. Multiplicarea organismelor genetic superioare prin embriotransfer i biotehnici asociate. Tez de doctorat 1999. Biggers J.D. (1998): Reflection on the culture of the preimplantation embryo. Int. J. Dev. Biol. 42: pg. 879-884. G. J. Morris, Rapidly cooled human sperm: no evidence of intracellular ice formation, Human Reproduction, vol. 21, no. 8, pp. 20752083, 2006. Fahy GM, Wowk B, Wu J, Paynter S (2004a) Improvedvitrification solutions based on the predictability ofvitrification solution toxicity. Cryobiology 48: 22-35.

Mazur P., Rall W.F., Leibo S.P. (1984): Kinetics of water loss and the likelihood of intracellular freezing in mouse ova. Influence of the method of calculating the temperature dependence of water permeability. Cell Biophys, 6 (3), 197-213. Thornton E.C., Brown S.D.M., Gleinster P.H. (1999): Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses. Ed. Springer, pg. 987-992. H. Ekwall, Cryo-scanning electron microscopy discloses differences in dehydration of frozen boar semen stored in large containers, Reproduction in Domestic Animals, vol. 44, no. 1, pp. 6268, 2009. http://en.wikipedia.org/wiki/Cryopreservation