Vitamine.

Determinarea vitaminei C
din ser și din sucul de fructe.
Vitaminele

sunt substanţe indispensabile activităţii de creştere

şi reproducerii omului şi altor animale superioare.

nu se sintetizează de către organism ci se asigură

prin aport alimentar.

sunt molecule implicate în procesele metabolice ca

și cofactori enzimatici sau ca antioxidanți.
Necesarul zilnic de vitamine

este de ordinul μg–mg

depinde de vârstă, sex, greutate, gen de activitate, climă

crește în sarcină, lactaţie, creștere, în cursul deficitului de

resorbţie și al acţiunii unor antivitamine

scade în cazul sintezei unora dintre vitamine de către flora

intestinală sau în cazul tezaurizării
Lipsa sau aportul insuficient de vitamine
determină o stare cronică de deficit care se manifestă,
într-o primă etapă mai puţin specific - hipovitaminoză,
apoi prin semne caracteristice şi în cele din urmă, în formă
avansată - stările de avitaminoză - evoluează spre exitus.

Aportul excesiv de vitamine

determină, de regulă, eliminarea surplusului, uneori însă

determină modificări patologice - hipervitaminoză.

Vitaminele obţinute predominant din alimentaţie sunt
vitamina A, B6, B12, C, E, tiamina, riboflavina, acidul folic, acidul
pantotenic.

Vitaminele obţinute predominant din sinteză endogenă sunt

vitamina D şi niacina.

Vitaminele obţinute predominant prin sinteza de către flora

intestinală sunt vitamina K şi biotina.
 descoperite de biochimistul Kazimierz
Funk, cel care a izolat prima dată
vitamina B1 din tărâțele de orez, în
1912.

 termenul de vitamină provine din

limba latină “Vita” - viață, iar “amine”
- gruparea chimică de amină;
1884 - 1967
 nu toate vitaminele sunt amine
Clasificarea vitaminelor

 În funcție de solubilitate:

vitamine hidrosolubile: tiamina (B1), riboflavina (B2),

niacina (B3 sau PP), acid pantotenic (B5), piridoxina (B 6),
cobalamina (B12), biotina (H), acidul folic (Bc), vitamina C,
bioflavonoidele;

vitamine liposolubile: vitaminele A, D, E şi K.

 În funcţie de modalitatea lor de acţiune:

 cu funcţie de cofactori enzimatici: tiamina, riboflavina, acidul

pantotenic, piridoxina, acidul folic, cobalamina, biotina,
filochinona, retinolul;

 fără funcţie certă de cofactori enzimatici: calciferolii,

tocoferolii, acidul ascorbic;

 substanţe active de tip vitaminic: flavonoidele, niacina, acidul

lipoic, colina, ubichinona (CoQ), carnitina, tetrahidrobiopterina.
 Vitamina C
Surse

 vegetale: citrice (lămâie, portocală, grapefruit), kiwi, măceşe,

tomate, papaya, brocoli, varză de Bruxelles, coacăze, căpşuni,
conopidă, spanac, pepene galben, merişoare, frunze de pătrunjel,
ardei iuţi.

 țesuturi animale: splină, ficat, rinichi

În cursul fierberii alimentelor pierderea poate fi de 15 - 60%, iar prin

depozitare (peste iarnă) de până la 80%.
Structura chimică

 Vitamina C (acidul ascorbic) este –lactona acidului L–gulonic

(2,3–dienol), un acid cu 6 atomi de carbon, cu 4 grupări OH:
două alcoolice la C4 şi C5 şi două enolice, la C2 şi C3.

 este extrem de labil, prin expunere la aer, mai ales în soluţii

alcaline, trece în acidul dehidroascorbic

 este ușor oxidabil, foarte sensibil la căldură și la radiații IR și UV.

 concentraţia plasmatică este de 0,5 - 1,5 mg/100 ml

 eliminarea urinară: 10 - 100 mg/zi

 pragul renal: 1,5 mg/100 ml

Rolul biochimic și fiziologic:

Cuplul acid ascorbic – acid dehidroascorbic funcţionează ca sistem

redox într-o serie de procese biochimice.

 ROS apar în mod normal în cadrul proceselor metabolice și pot

ataca proteinele și ADN-ul.

 Vitamina C și alte sisteme specializate interacționează cu ROS

Sistemul oxido-reducător intervine în reacţii de hidroxilare conform

reacţiei generale:

R–H + acid ascorbic + O2  R–OH + acid dehidroascorbic + H 2O

 hidroxilarea prolinei la hidroxiprolină în sinteza colagenului

 în degradarea tirozinei
o oxidarea p–hidroxifenil–piruvatului la homogentizat necesită
vitamina C, care poate menţine cuprul în formă redusă,
necesar pentru o activitate enzimatică maximă.
o următoarea treaptă este catalizată de homogentizat
dioxigenaza, enzimă ce conţine Fe 2+ şi care necesită, de
asemenea, acid ascorbic.
lasinteza (la faza de hidroxilare) noradrenalinei din dopamină.
ovitamina C se concentrează în cortexul suprarenal unde se consumă
rapid sub acţiunea ACTH, intervenind în sinteza hormonilor steroizi.

la sinteza acizilor biliari, la faza iniţială de 7–hidroxilare.

la reducerea dihidrobiopterinei la tetrahidrobiopterină (forma activă).

absorbţia fierului este semnificativ crescută în prezenţa vitaminei C.

oIntervine la trecerea ionilor Fe3+ de pe transferină pe apoferitină,
pentru a forma feritina, favorizând constituirea formei de depozitare
tisulară a fierului.
 exercită un efect protector faţă de alte vitamine ca tiamina, riboflavina,
acidul pantotenic, biotina, acidul folic, vitamina E.

 poate inhiba formarea nitrozaminelor în timpul digestiei.

 vitamina C este protejată de agenţi reducători ca glutationul şi cisteina.

 este necesară în procesul de creştere, pentru integritatea

tegumentelor, în buna funcţionare a aparatului cardiovascular.

 are rol în procesele de apărare imunitară, în mărirea rezistenţei la

efort, în hematopoieză.
Aportul zilnic de vitamina C

 30 mg pentru copii
 70 mg pentru adulţi

 70–90 mg în sarcină şi în perioada de alăptare

 120 mg pentru fumători
Carenţa de vitamina C

 Cauze:
o aport alimentar insuficient
o malabsorbţie digestivă
o creşterea necesităţilor
o eliminarea excesivă

 apare de cele mai multe ori la persoanele vârstnice, alcoolici,

suferind de malabsorbţie cronică sau supuşi unei hrăniri prin
perfuzii nesuplimentate cu vitamina C.
 Deficitul de durată (4 - 5 luni)  SCORBUT.

◦ fragilitate capilară (manifestată sub aspectul unor hemoragii

subcutanate, gingivale, în articulaţii, muşchi)

Manifestările hemoragice sunt cauzate de afectarea sintezei de colagen

◦ alterări ale ţesutului conjunctiv (cu modificări osteoperiostale,

tulburări de creştere şi rarefieri osoase, mobilizarea dinţilor,
tegumente aspre, distrofice).

◦ Evoluţia bolii este spre exitus, în cazul în care nu se intervine

cu medicaţie de suplinire.

Vasco da Gama, navigator portughez, a pierdut 100 de marinari în timpul

unei călătorii din Portugalia în India în 1497.
Deficitul latent (cauzat de gătirea excesivă a alimentelor sau în
perioadele post chirurgicale/post traumatice)  fatigabilitate,
apatie, scădere ponderală, anemie, predispoziţie spre infecţii,
gingivită

Ingerarea excesivă de vitamina C

 poate antrena agitaţie şi insomnii, excesul este eliminat în

urină şi fecale.
Metode de determinare a vitaminei C în ser

 spectrofotometrice

 polarimetrice

 cromatografice

 radiometrice
 • determinarea trebuie să fie specifică pentru ascorbat

• metoda trebuie să fie stabilă

• ascorbatul se va oxida în soluţie funcţie de lumină, tărie ionică,

temperatură (> 4°C), concentraţii scăzute, prezenţa unor cationi bivalenţi
(fier, cupru).

• acidul dehidroascorbic se hidrolizează în soluţii funcţie de creşterea pH-

ului, concentraţie scăzută, lumină, temperatură peste 4ºC şi prezenţa
fierului/cuprului.

Din aceste motive trebuie îndeplinite anumite condiţii în momentul în care

probele sunt preparate, depozitate şi analizate.
Determinarea vitaminei C din ser prin cromatografia de lichide de înaltă
presiune (HPLC)

 Pregătire pacient – à jeun (pe nemâncate); se va evita consumul de alcool

cu 24 ore înainte de recoltare
 Specimen recoltat – sânge venos recoltat pe heparinat de litiu
 Prelucrare necesară după recoltare – se separă plasma prin centrifugare,
se congelează imediat şi se acoperă cu o folie de aluminiu în vederea
protejării de lumină
 Volum probă – 1mL plasmă
 Cauze  de respingere a probei – specimen intens hemolizat, lipemic,
decongelat sau neprotejat faţă de lumină
 Stabilitate probă – plasma separată este stabilă 5 zile la -20°C
 Valori de referinţă – 4,6-14,9 mg/L.
 Aparat : HPLC cu detector de UV
 Faza mobilă: soluție ce conține EDTA, carbonat acid de potasiu și acid fosforic
 Standard intern: soluție apoasă ce conține acid percloric, DTPMPA
[dietilentriamino penta (acid metilen fosfonic)] și acid clorhidric
 Faza staționară: fază inversă C18
 Limita de detecție: 0,4 mg/l
 Liniaritatea metodei: 0,4–100 mg/l
 Timp de analiză: 5 min
 Volum de injectare: 20 µl
 Debit: 1,5 ml/min
 Temperatura coloanei: ~25 °C
 Lungimea de undă: 245 nm

Prepararea probei
o se pipetează 100 μl probă deproteinizată/calibrator (15,3 mg/l)/control într-un

flacon protejat de lumină.

o se adaugă 100 μl standard intern și se omogenizează 30 de secunde.

o se centrifughează 5 minute la 13000 x g.

o se injectează 20 μl supernatant în HPLC.

Componentele cromatografului de lichide de înaltă performanță (HPLC)
Cromatograma HPLC la analiza vitaminei C din ser; timp de retenție vitamina C = 2,2 minute

Calcul:
C (mg/l) = (Avit C ser x ASI std)/(Avit C std x ASI ser)

unde:
Avit C ser = aria picului vitaminei C din cromatograma probei de ser
ASI std= aria picului standardului intern din cromatograma standardului
Avit C std = aria picului vitaminei C din cromatograma standardului
ASI ser = aria picului standardului intern din cromatograma probei de ser
 Aplicație practică
Determinarea vitaminei C din sucul de fructe prin iodimetrie

Principiu
Iodul reacţionează cu acidul ascorbic producând ioni iodură şi acid
dehidroascorbic
Acidul ascorbic este uşor oxidat de oxigenul din aer în mediu neutru sau alcalin,

astfel că, pentru a preîntâmpina acest proces, se menţine un mediu acid prin
adăugare de acid acetic.
 Se adaugă amidon la soluţia de titrat pentru ca excesul de iod, care nu este

consumat în reacţia cu acid ascorbic, să dea o reacţie de culoare.

Formarea culorii albastre este utilizată în general ca indicator pentru amidon, însă

în acest experiment va indica excesul de iod rămas la sfârşitul titrării.

Reactivi
 Soluţie standard de acid ascorbic de 1 mg/ml
 Suc de portocale din comerţ fără adaos de vitamina C (soluția A)
 Suc obţinut prin stoarcerea unei portocale (soluția B)
 Suc obţinut prin stoarcerea unei lămâi (soluția C)
 Suc obţinut prin stoarcerea unei clementine (soluția D)
 Soluţie de iod 0,02 M
 Soluţie de acid acetic 6 M
 Soluţie de amidon 1%.

Materiale
◦ pahare Erlenmeyer de 100 ml
◦ pahar Berzelius de 100 ml
◦ biuretă de 50 ml
◦ pâlnie
◦ pipete de 1, 5, 10 ml
◦ pară de cauciuc
Mod de lucru
Într-un pahar Erlenmeyer se introduc:
 10 ml apă distilată

 1 ml soluţie acid acetic 6 M

 5 ml soluţie de acid ascorbic

 1 ml soluţie de amidon 1%.

o Se pregăteşte o biuretă de 50 ml umplută cu soluţie de iod având grijă la

îndepărtarea aerului din vârful biuretei.

o Se titrează încet, sub agitare, soluţia din pahar, observându-se apariţia

unei culori albastre care dispare.

o Atunci când culoarea albastră persistă 30 secunde se opreşte titrarea şi se

notează volumul de titrare (volumul de soluție de iod utilizat la titrare,
citit la biuretă).
Vstd – volumul de soluție de iod utilizat la titrarea soluției
standard de acid ascorbic (1mg/ml)

VA – volumul de soluție de iod utilizat la titrarea sucului de

portocale din comerț

VB – volumul de soluție de iod utilizat la titrarea sucului obținut

prin stoarcerea unei portocale

VC – volumul de soluție de iod utilizat la titrarea sucului obținut

prin stoarcerea unei lămâi

VD – volumul de soluție de iod utilizat la titrarea sucului obținut

prin stoarcerea unei clementine
Calcul:

CA = (VA/ Vstd) x 100 (mg/ml)

CB = (VB/ Vstd) x 100 (mg/ml)

CC= (VC/ Vstd) x 100 (mg/ml)

CD= (VD/ Vstd) x 100 (mg/ml)

Video determinarea vitaminei C din sucul de fructe:

https://drive.google.com/file/d/18bNqGZEhvp9P6mlbZRjTKtoAQAy3F4zQ/view?
usp=sharing