Hematopoieza (hp)

Definitie
Capacitatea organismului de a regenera celulele sanguine normale ce formeaza continutul
compartimentului celular al sangelui periferic prin inlocurea celulelor sanguine periferice
imbatranite dupa o durata de viata variabila cu noi generatii formate in organele hematopoietice

Hematopoieza embrio-fetala: localizare

1. Eritropoieza apare la embrionul uman de 19 zile, in sacul vitelin
 Hemocitoblastii (primele celule hematopoietice) deriva din vasele sacului vitelin
 Initial: preponderent intravasculara si megaloblastica
 Apoi: apar noi zone hematopoietice prin migrarea celulelor stem
2. Ficatul devine activ in saptamana 5 – 6
 Eritropoieza extravasculara
 Sursa principala de celule rosii in perioada 9 – 24 saptamani
3. Splina devine activa in saptamana 9 – 10, atinge maximul in luna 4, devine inactiva in luna 6
 Activitate de tip “mieloid”, mult mai redusa decat ficatul
 In perioada de declin a mielopoiezei apare limfopoieza ce creste in intensitate pana la
nastere
 Dupa nastere ramane ca organ limfoid periferic cu potential hematopoietic
4. Maduva devine activa in saptamana 10 – 11, devenind principalul sediu dupa saptamana 24
 La nastere, hematopoieza se face in totalitate in maduva
 Hematopoieza embrio-fetala: dinamica

Hematopoieza primitiva
 Incepe in insulele sanguine ale sacului vitelin in ziua 19
 Inceteaza in saptamana 6
 Majoritatea celulelor sunt eritrocite cu Hb cu lanturi embrionare de globina
 Se formeaza si macrofage si megacariocite
Celulele din stratul extern al mezodermului nediferentiat se aplatizeaza si devin celule endoteliale iar celulele din stratul intern se
rotunjesc si devin aglomerari de precursori eritroizi numiti insule sanguine; aceste doua tipuri de celule au un precursor comun,
hemangioblastul

Hematopoieza definitiva
 Incepe in saptamana 4 – 6
 3 locusuri: 1. insulele sanguine din sacul vitelin
2. portiunea anterioara a regiunii aorta-gonada-mezonefros
3. portiunea alantoica a placentei
 CSH migreaza din regiunile 1-3 spre ficatul fetal unde se localizeaza si se matureaza in elemente
sanguine
 ficatul este principalul sediu al hp in perioada mijlocie a gestatiei
 Principalele celule sunt eritrocite, mai mici decat cele primitive, cu Hb cu lanturi de globina fetala si
matura
 In ultima 1/3 a gestatiei
 CSH si progenitoare timpurii migreaza din ficatul fetal in splina si MO
 Hp hepatica declina
 MO devine sediul principal al hp
fig 4-1 williams cap II4
Granulocitopoieza
1. Ficat, tesut conjunctiv: sapt 7
2. MO: incepe in sapt 10 – 11 (din luna 5 fetala, exclusiv in MO)
Limfopoieza
3. Plexuri limfatice: sapt 9
4. Ganglioni limfatici: sapt 11
5. Ficat: din sapt 13 pot fi detectate subpopulatii limfocitare
Megacariopoieza
6. Sac vitelin, ficat: din sapt 6
7. Splina: din sapt 10
8. MO: din sapt 13, apoi in mod constant in MO (din luna 5 fetala, exclusiv in MO)

Hematopoieza postnatala

• La nou-nascut toate cavitatile MO contin in totalitate celule hematopoietice proliferante

• Pe masura ce inainteaza in varsta, incepand de la 4 ani, maduva hematopoietica (rosie) se
contracta centripet, fiind inlocuita de maduva grasa (galbena); procesul este complet in jurul varstei
de 20 de ani
• La adultul tanar, maduva hematopoietica este localizata in craniu, vertebre, coaste, clavicule, stern,
pelvis si jumatatea proximala a humerusului si a femurului
• Ca raspuns la cerere, volumul cavitatii medulare ocupate de tesut hematopoietic se poate extinde
• In cazul unor boli, situsurile extramedulare pot deveni sedii primare pentru hp
– Sediile hp fetale: ficat, splina
– Sediile hp ale adultului care in conditii normale sunt inactive: maduva galbena
 Maduva osoasa (MO)
Osul
• Cortex = os lamelar (in principal) + os spongios
• Din cortex se extinde spre interior o retea de trabecule ce imparte spatiul medular
– Trabeculele si suprafata interioara a cortexului sunt tapetate de endost
– Endost = celule aplatizate, majoritatea inaparente histologic, unele active:
 Osteoblasti pe masura ce sunt incorporati in os se transforma in osteocite
 Osteoclaste
− In trabeculele ososase si in cortex exista lacune ocupate de osteocite
 Medulara = os trabecular (spongios)
Fluxul sanguin arterial
 Artera nutritiva si sistemul capilar cortical din capilarele periostale din a. musculare
↓
 Retea sinusoidala medulara ce sustine celulele hp
↓
 Sinus medular central
↓
 Vene emisare fig 4-2 Williams cap 4

Circulatia medulara
 Sangele arterial se insinueaza printre cordoanele de tesut hp si se dreneaza apoi prin fenestratiile
membranei bazale in sinusul venos central
 Sinusoidele = vase largi, cu pereti subtiri prin care celulele hp nou formate intra in circulatie

Celulele hp sunt incluse in stroma de tesut conjunctiv ce ocupa spatiile intertrabeculare ale medularei,
intre sinusurile medulare
Maduva osoasa
Stroma este alcatuita din
 Adipocite
 Reteaua de vase sanguine
− Peretele sinusului: 1. celule endoteliale la interior
2. membrana bazala fenestrata
3. manson de celule reticulare adventiciale, incomplet
 Fibroblasti ramificati
 Macrofage
 Fibre nervoase (cateva)
 Reticulina (in cantitate redusa)
 Celulele reticulare

Matricea proteica extracelulara

• Fibre de colagen tip I, III,, IV produse de fibroblasti asigura scheletul structural pentru compartimentele hp
• Laminina contin peptidul universal de adeziune (acid arginin-glicin-aspartic); leaga celulele hp de Fibronectina colagen
si de factorii de crestere; ataseaza precursorii celulari de stroma
• Hemonectina proteina adeziva; leaga celulele mieloide si le fixeaza in MO pana la maturare si eliberare
• Proteoglicani
– Condroitinsulfat pot lega factorii de crestere; rol in formarea niselor de micromediu specializate cu rol in
– Acid hialuronic stimularea hematopiezei specifice de linie
– Heparansulfat rol in interactiunile celulare si in diferentiere
– Dermatan
• Tenascina rol in adeziunea celulara la stroma; semnal mitogenic
• Trombospondina (limfopoieza), vitronectina (megacariopoieza)
 Celulele medulare
Osteoblasti
• Origine mezenchimala (aceeasi celula stem ca si condrocitele si fibroblastii stromei)
• Sintetizeaza glicozaminoglicanii din matricea osoasa, fibre de colagen
• Formeaza osteoidul (os necalcificat) ce se va mineraliza ulterior
Osteoclaste
• Origine hematopoietica (din celula stem hp; se formeaza prin fuziunea de celule de linie
monocitara)
• Asigura resorbtia osoasa
Adipocite
• Se dezvolta prin lipogeneza in celule fibroblast-like (celulele reticulare adventiciale)
• Relativ rezistente la lipoliza din inanitie
• Grasimea bruna medulara este sursa de leptina, adiponectina
Celule endoteliale
• Activitate de endocitoza
Celule reticulare adventiciale
• Sintetizeaza fibre reticulinice ce se extind in compartimentele hp formand o retea pe care se
aseaza celulele hp
• Contin in membrana concentratii crescute de FAL
Fibroblasti
Macrofage
Celulele medulare
 Maduva osoasa
Situsuri de diferentiere a celulelor precursoare

Celulele hematopoietice se gasesc in cordoane/gramezi intre sinusurile vasculare

Megacariocitele
– de-a lungul suprafetei externe a sinusurilor
– Elibereaza transe citoplasmatice (trombocite) prin fenestratii, direct in circulatie
Eritroblastii
− Aproape de suprafata externa a sinusurilor
− Sub forma de insule eritroblastice ce au in centru un macrofag inconjurat de eritroblasti
dispusi in inele concentrice
− celulele mature se “strecoara” prin deschizaturile sinusurilor lasand in urma nucleii picnotici
− In cadrul insulei, eritroblastii mai apropiati de centru sunt mai putin maturi decat cei de la
periferie
− Macrofagul central trimite prelungiri membranare subtiri ce infasoara fiecare eritroblast si
poate fagocita eritroblasti cu defecte sau nuclei exocitati
Precursorii granulo-monocitari
− In profunzime, departe de sinusuri
Celulele stem multipotente limfoide
− In jurul vaselor arteriale
− Parasesc maduva si se diferentiaza complet la nivelul nodulilor limfatici (lfB) si al timusului
(lfT)
 Celula stem hematopoietica (CSH)

Definitie
CSH = celula cu urmatoarele caracteristici:
1. Capacitate de auto-reinnoire
2. Capacitate de diferentiere multiliniala
3. Capacitatea de a reconstitui sistemul hematopoietic la o gazda iradiata letal

In functie de momentul dezvoltarii:

4. CS embrionare
 Deriva din blastocist
 Caracteristici de CS pluripotente (1 – 3)
− Auto-reinnoire
− Diferentiere multiliniala in toate straturile germinative (endoderm, mezoderm,
ectoderm)
− Repopularea functionala a tesuturillor cand sunt transplantate

5. CS adulte
 Deriva din tesuturi/organe specifice in etapa fetala/postnatala
Proprietati ale CSH
 Multipotenta
 Capacitatea de auto-reinnoire
 Plasticitatea
− Capacitatea CS adulte specifice unui anumit tesut de a se diferentia in celule mature si
functionale ale aceluiasi/altui strat germinativ de origine
− Ex: celulele donoare din MO→neuroni/miocard/epiteliu/muschi scheletici/hepatocite
 Mobilitatea
− Potential mai crescut decat alte celule imature de a trece bariera MO
− Pot circula in sange de la un os la altul, spre ficat/splina
− Pot fi recoltate direct din sange
− Rolul migrarii CSH:
1. Permite interventia in sectoarele MO supuse unei solicitari mai intense
2. Cautare de noi sedii de colonizare pentru hp (ex: anemiile hemolitice cronice, metaplazia mieloida,
leucemii etc)
3. Mentinerea unei rezerve pentru cazurile de lezare a MO

• In conditii normale aproape toate CSH pluripotente sunt in repaus mitotic (G0 = stare
dormanta)
• Populatia activa este cea a celulelor orientate
• In solicitari mari cand capacitatea de autointretinere a celulelor orientate este depasita,
ijntervine influxul de CSH pluripotente
• Oricat de putine CSH supravietuiesc dupa iradiere, citostatice etc, pot reface hp
• Daca mor toate CSH = aplazie ireversibila – necesita transplant de MO ce contine CSH
Metode de caracterizare

1. Markeri de suprafata
– CD34+/- ?
• Expresia CD34 este folosita clinic pentru numararea celulelor transplantabile
• Celulele CD34-Lin- pot genera celule CD34+ in vitro si in vivo
• Celulele CD34- sunt mai primitive decat celulele CD34+
• In practica, celulele CD34+ se grefeaza stabil, pe termen lung

– C-kit /CD117+ (receptor pentru factorul CS)

– Lin- (negativ pentru atg granulocitare, eritroide, limfoide)
– CD38-
– CD133+
– CD59+

− Codul SLAM
 Familia SLAM (signaling lymphocyte activation molecule) = grup de molecule implicate in stimularea cT
 Apartine superfamiliei imunoglobulinelor
 Include CD48, CD 150, CD244 etc
 CSH = CD150+CD48-CD244-
2. Efluxul de coloranti fluorescenti
– CSH elimina colorantii fluorescenti vitali mitocondriali
• Rhodamina – 123
• Hoechst – 33342
– Exprima cel putin 2 proteine transportoare, proces dependent de ATP-aze
– Permite identificarea CSH prin citometrie de flux pe baza imprastierii laterale reduse ( side
population cells)
3. Cultivare in vitro
4. Modele de transplantare
– Abilitatea CSH de a reconstitui intregul sistem hematopoietic al unui primitor mieloablat
– Modele de transplant xenogeneic cu celule umane hp injectate la soareci/oi fetale
preimune
5. Modele de primate
– Macac, babuin

Morfologia CS
• Aspect limfocitar; la microscopul optic nu pot fi deosebite de limfocite
• Microscopie electronica: diametru 8 – 10 μ
Rotunda
Nucleu rotund/reniform cu cromatina fina si nucleoli
Citoplasma albastru deschis, fara granulatii
Evolutia CSH
1. Auto-reinnoire (autoreplicare)
2. Diferentiere
3. Apoptoza

Auto-reinnoire simetrica: 1 CSH → 2 CSH identice

Auto-reinnoire asimetrica: 1 CSH → 1 CSH + 1 CSH apoptotica
1 CSH → 1 CSH + 1 CS orientata spre diferentiere in celule mature de diferite linii

 In perioadele foarte timpurii, decizia CSH de auto-reinnoire/diferentiere poate fi stochastica (aleatoare)

 In perioadele urmatoare, diferentierea si maturarea liliala a celulelor progenitoare e controlata prin
indicatii externe din micromediu

Reglarea evolutiei CSH

1. Prin factori genetici transcriptionali
− Clase de gene puternic exprimate in CSH
− SCL (dereglarea asociata cu LAL-T), GATA2 (anemia aplastica), LMO2 (LAL-T), AML1 (LAM2)

2. Prin reglare epigenetica (modificarea componentelor cromatiniene)

– Nucleozomul (unitatea cromatiniana de baza) = proteine histone + ADN dublu spiralat
– Aranjament de margele pe sfoara, configuratie ce asigura impachetarea genomului in interiorul limitelor nucleului
– Modificari ale histonelor (fosforilare, acetilare, metilare sau ribozilarea/ubiquitinarea ADP) pot afecta structura nucleozomului si sa
codifice astfel informatii pentru reglarea genetica
– Importanta pentru transcriptie, repararea ADN, recombinare
– CSH pot interpreta modificarile genetice ca semnale restrictive/permisive pentru diferentiere
– Interactiuni proteice ulterioare ce implica aceste coduri vor modula activitatea genelor asociate restrictionand diferentierea de-a lungul
liniei alese
Long-term Short-term
CSH CSH
In perioada embrionara, CSH pot deriva din
• hemangioblasti (precursori de CSH si celule endoteliale)
• endoteliul hemogen (celule endoteliale ce dobandesc potentialul de a genera
hematopoieza)
CSH au capacitate de:
• auto-reinnoire
• diferentiere in celule progenitoare mieloide sau limfoide
 Nomenclatura
CS limfo-hematopoietice pluripotente (CFU-blast)

CS multipotente limfoide CS multipotente mieloide (CFU-S/CFU-mix/CFC-GEMM)

Pre-B pre-T c. progenitoare tri/bipotente c. progenitoare unipotente

CFU-GM

lfB lfT Ne Mf osteoclaste

(Noduli) (timus)

EOS-CFC Bas-CFC CFU-E Meg-CFC

eo ba eritrotrombo
CFU = unitati formatoare de colonii
CFC = celule formatoare de colonii
 Celulele hematopoiezei
CS limfo-hematopoietice pluripotente (primitive) (CD34+)
• Se gasesc la om in MO, splina, sange, diverse tesuturi (nr scazut)
• Semidormante
• Capabile de diferentiere spre CS multipotente limfoide si mieloide
• Capacitate de auto-reinnoire continua
• Stimul specific: IL3
• La soarecii iradiati letal si injectati cu celule medulare singenice in splina: capacitate de a genera
colonii (pure sau nu) de celule progenitoare la nivelul splinei (CFU-S = unitati formatoare de colonii in
splina)
• La om: in culturile medulare umane a fost identificata o unitate celulara cu proprietati similare cu
CFU-S, = CFU-blast = CS pluripotente umane
• In sangele uman: din fractiunea limfoida se izoleaza CFU-S cu anumite caracteristici:
– Morfologie identica cu lf mici
– Nu prezinta reactia de rozetare cu hematii de oaie (nu sunt instruite)

CS multipotente mieloide si limfoide (CS progenitoare timpurii) (CD34+, CD38+)

• “prima linie” de CS detectate in MO
• Turnover redus
• Capacitate de autoreplicare crescuta dar limitata (epuizare)
• Autoreplicare si proliferare sub actiunea mult-CSF (multipotential colony stimulating factor)
• Diferentiere declansata de semnale de la celulele progenitoare orientate (depletie celulara/injurii)
• Stimul specific: IL3
Celulele progenitoare

• Bipotente (CFU-GM) sau unipotente

• Fara capacitate de auto-reinnoire
• Turnover foarte activ
• Proliferare si maturare initiatade FSC (factori de stimulare a coloniilor)
• Sunt celule orientate ce nu pot fi recunoscute morfologic dar din care se diferentiaza precursorii
cu morfologie cunoscuta

Celulele precursoare (nu sunt CS)

• Se dezvolta din celule progenitoare orientate, prin diviziuni mitotice (celule blastice eritroide si
granulocitare) sau diviziuni nucleare endomitotice (megacariocitele)

Eliberarea celulelor din MO

• Celula migratoare trece printre celulele adventiciale si produce canale de migrare in citoplasma
celulelor endoteliale, cu diametrul mai mic decat diametrul celulelro ceea ce duce la deformari
(diapedeza)
• Mijloace: pseudopode – granulocite, megacariocite
Gradient transmembranar – reticulocite
• Controlata de factorii de eliberare
– Ex: pentru granulocite: C3a, H glucocorticoizi, steroizi, androgeni; endotoxine
 Refacerea hematopoiezei dupa o agresiune/terapie citotoxica/transplant
Faza I
• scurta
• Pe seama progenitorilor celulari unipotenti
• Asigura refacerea de scurta durata si supravietuirea dupa transplant medular

Faza a II – a
• Scurta
• Pe seama celulelor multipotente

Faza a III – a
• Lunga
• Intra in activitate CS

Factorii de crestere hematopoietica

• Produsi de celulele stromei medulare: limfocite, monocite, macrofage, c. endoteliale, fibroblasti

• Hormoni-proteine
• Controleaza multiplicarea si diferentierea CS in celule mature circulante in sange
• Intervin in functionarea celulelor mature
• Actioneaza pe celulele tinta prin receptori specifici
• Majoritatea genelor ce ii codifica sunt pe crz 5; exceptie: CSF-G (crz 17)
 Factorii de crestere hematopoietica: clasificare
1. Factori de crestere neliniari
• Actioneaza pe CS pluri si multipotente
• Initiaza diferentierea si maturarea lor
– Multi CSF (IL3): induce formarea coloniilor de G, Mo, Eo, E, Mgk, mastocite
– CSF-GM induce formarea coloniilor de G si Mo
o Produs de limfocitele T, macrofage, c. endoteliale, fibroblasti, mastocite
o Indus de TNFα, IL1
2. Factori de crestere liniari
• Actioneaza pe celulele progenitoare
• Initiaza diferentierea si maturarea lor si in stadii mai avansate
– CSF-G
– CSF-M
– CSF-Eo
– Eritropoietina
– Trombopoietina
3. Limfokine si monokine
• Eliberate de limfocite si macrofage
• Asigura diverse interactiuni (raspunsul imun, invazia tumorala etc)
– IL1, IL4 modifica raspunsul celulelor mieloide progenitoare fata de CSF
– IL5 stimul puternic pentru maturarea Eo
– IL6 influenteazan proliferarea celulelor mieloide multipotente
– IL3 = multiCSF
Actiunea factorilor de crestere

• Pe CS: proliferare
• Pe c. mature: exacerbarea functiilro (cresc diapedeza, fagocitoza, productia de prostaglandine,
leucotriene etc)
• In situatii de stres creste eliberarea de factori de crestere:
I. Eliberare de celule mature (L, T)
II. Stimularea maturarii elementelor mieloide (L, T)
III. Stimularea proliferarii CS

Factorii inhibitori ai hematopoiezei

• Localizati pe membrana celulelor stromale

• semnalele negative sunt transmise prin intermediul moleculelor de adeziune cu structura
asemanatoare cu cea a Ig
– Inhibitorul celulei stem
– TNF, IFNα si γ in anumite conditii
– F4 plachetar, IL2, IL4 inhiba mgk-poieza
– Ciclosporina A
– etc
 Aplicatii clinice ale factorilor de crestere

• Dupa chimioterapie (Ne < 500/mmc = risc vital)

– CSF-G, CSF-GM
• Dupa transplant de maduva
– CSF-G, CSF-GM
• In SMD si neutropenii
• In tratamentul LAM (factorii de crestere pot recruta CS dormante in ciclul celular facandu-le
sensibile la efectele citotoxice ale chimiotrerapicelor)
– CSF-G, CSF-GM, IL3

Eritropoietina
• Glicoproteina sintetizata in rinichi (si ficat/splina dar in cantitati reduse) in functie de
concentratia de oxigen din sange
• Receptor EPO pe suprafata eritroblastilor, activarea cascadei JAK2
• Rol in maturarea eritroida finala: sinteza Hb, a proteinelor membranare
• Protejeaza eritroblastii de apoptoza
• Coopereaza cu diversi factori de crestere in dezvoltarea precursorilor eritroizi
• CFU-E, BFU-E – raspund la EPO
• Creste absorbtia fierului prin inhibarea hepcidinei

Preparate: NeoRecormon (epoetina beta- solutie injectabila), Aranesp, Epogen, Eprex, Epofit
trombopoietina
• Glicoproteina produsa in principal in ficat si rinichi (in cantitati reduse in muschiul striat si
celulele stromale MO)
• Sintezan hepatica e stimulata de IL6
• Stimuleaza productia si diferentierea megacariocitelor si trombocitopoieza
• Creste expansiunea si adeziunea celulelor CD34+ (adeziunea megacarioblastilor la
fibronectina)
• Receptor Tpo, semnalizare JAK/STAT si Ras/MapK

Preparate: Revolade (eltrombopag olamine) – administrat in PTI

G-CSF
• Glicoproteina produsa de endoteliu, macrofage si celule imune
• Stimuleaza proliferarea si diferentierea progenitorilor orientati spre granulocitopoieza ce
exprima pe suprafata receptori specifici
• CSH primitive nu exprima receptori pentru G-CSF dar IL3 poate induce exprimarea receptorilor
G-CSF pe CSH primitive
• Agentul de mobilizare medulara cel mai utilizat

Preparate: Neupogen, Filgrastim (recombinant), Pegfilgrastim (Neulasta)

SCF= Stem Cell Factor Tpo= Thrombopoietin IL= Interleukin
GM-CSF= Granulocyte Macrophage-colony stimulating factor Epo= Erythropoietin
M-CSF= Macrophage-colony stimulating factor G-CSF= Granulocyte-colony stimulating factor
SDF-1= Stromal cell-derived factor-1 FLT-3 ligand= FMS-like tyrosine kinase 3 ligand
TNF-a = Tumour necrosis factor-alpha TGFβ = Transforming growth factor beta