Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Biofizicamembranelor
Biofizicamembranelor
II. MODELEIMETODEBIOFIZICEDESTUDIUAL BIOMEMBRANELOR III. UTILIZAREAIZOTOPILORRADIOACTIVINSTUDIUL BIOMEMBRANELOR.APLICAIIPRACTICE IV. CARACTERISTICILEBIOFIZICEALE MOLECULELORMEMBRANARE: 1)Proprietilebiofizicealefosfolipidelorcomponenteale bistratuluimembranar 2)Proprietilebiofizicealeproteinelormembranare.Topografia moleculelorproteicelanivelulbistratuluilipidic
V.
1)Clasificareatuturormembranelor(artificialeivii)dinpunct devederealpermeabilitii.LegileluiFickifactoriidecare depindedifuziuneamembranaraunorsubstane 2)Clasificareaproceselordetransportdelanivelul biomembranelor 3)Reprezentareaschematicaproceselordemicrotransportn relaiecustructuramolecularabiomembranelor 4)Descriereaprincipalelortipuridetransportmembranar: (a) Difuziuneasimplprindublulstratfosfolipidica substanelorliposolubile,datoritcoeficientuluide partaj (b) Difuziuneaionilormediatdepeptide: Ionoforiicaprobaexisteneidifuziuniiionilormediat depeptide Canaleionice:punereneviden,izolare,purificare, metoda patchclamp Tipuridecanaleionice.Caracteristicialecanalelorde + + Na ideK .Canaleleionicencadrulbiopotenialului derepausideaciune Mecanismemolecularealefenomenuluideosmoz Transportorimembranaridedifuziunefacilitat Transportulactivprinpompeionice.Caracteristicile + + + + molecularealePATPazelordeNa /K ,H /K 2+ (protonic)ideCa
CONCEPTULDE SUPRAFACELULAR
1.matriceextracelular 2.glicocalix 3. membran celular 4.citoschelet
COMPONENTELECITOSCHELETULUII FUNCIILESALE
a) modelul mozaicului fluid Singer Nicholson, b) o versiune nou mai mult mozaic dect fluid Donald M. Engelman (dup Nature, 438, 2005, pag. 578).
c) modelul mozaicului fluid Singer Nicholson, d) o versiune nou mai mult mozaic dect fluid Donald M. Engelman (dup Nature, 438, 2005, pag. 578).
d) Model al MP a eritrocitului observat la nivelul feei interne citoplasmatice. Sunt reprezentate proteinele intrinseci ncastrate n bistratul lipidic i dispoziia proteinelor periferice care constituie scheletul intern al membranei. Dimerul benzii 3 este reprezentat foarte simplificat. e) Micrografie electronic n care se observ dispoziia proteinelor scheletului intern al membranei.
substane liposolubile
IONI
BISTRAT LIPIDIC
energie
(ATP) directprin bistrat prin proteine canal prinproteine dedifuziune facilitat (carriers)
DIFUZIUNE SIMPL
TRANSPORT PASIV
n general, sistemele de transport pasiv sunt de tip UNIPORT
TRANSPORT ACTIV
Sistemeledetransportactivsuntde tip COTRANSPORT cu dou alternative:
FUNCIILEBIOMEM BRANELO R
Deoimportancapitalpentrutoateproceselevieii,funciilebiomembranelor suntnumeroase. ncontinuare, enumermidescriempescurt aceste funcii.Ordinea enumerriinuseaflnrelaiecueventualaimportanafuncieirespective.Defapt,n realitate toate funciile biomembranelor sunt importante i cel mult acestea se pot deosebi prin amploarea lor. Pentru nelegerea datelor pe care le prezentm n continuare este absolut necesar aprofundarea cunoaterii fiecrei funcii a biomembranelor.Subiectulbiomembraneesteextremdeimportantdeoarece: nuexistviafrbiomembrane proceseledemebransuntimplicatentoateproceselefiziologice nuexistboalfrimplicareadirectsauindirectabiomembranelor.
1 Funciadebarierfizicaceluleloridedelimitarea compartimentelorintracelulare
Plasmalema sau membrana plasmatic (engl. plasma membrane, fr. membrane plasmique) separ interiorul celulei de mediul nconjurtor. Acest mediu, uneoriexclusivmineralidecompoziiesimpl,nuestenniciuncazcomparabilcu coninutul celular. Acesta din urm este infinit mai complex prin diversitatea moleculelor sale (mai multe mii sau zeci de mii de tipuri, pentru celulele cele mai simple) care au, fiecare, o complexitate proprie, cu rol determinant n procesele celulare. De aceea, coninutul intracelular trebuie prezervat, iar constituenii si nu trebuie s difuzeze liber la exterior. Lupta mpotriva entropiei (adic meninerea ordinii stabilite), condiie prim a vieii, ncepe cu bariera fizic, reprezentat de membrana plasmatic. Bariera membranar este ns compatibil cu schimburi indispensabile de materie pe care celula le ntreine cu mediul (v. punctul 2). n interiorul celulelor, toate biomembranele organitelor ndeplinesc, de asemenea, acest rol de compartimentare fizic sau chimic, care se asociaz cu funciile specifice diferitelor organite celulare (asupra organitelor se vor face referiri la disciplina de Biologiecelular).
2 Funciadeschimbdematerie
Aceast funcie este inseparabil de prima i este comun aproape tuturor biomembranelor,fiinddenumitadeseacutermenulgenericdetransport.Funciilede schimb de materie cele mai evidente se produc la nivelul membranei plasmatice, deoarececelulelesuntsistemetermodinamicedeschise.Caurmare,ioniminerali,mici molecule organice (ndeosebi glucoz i aminoacizi) iar uneori chiar macromolecule tranziteaz la nivelul membranei plasmatice, intra sau extracelular. ntruct bistratul fosfolipidic al membranei este permeabil doar pentru o serie de substane lipofile (v. coeficient de partaj) diferitele procese de transport se produc datorit unor structuri alctuite din proteine inserate la nivelul dublului strat fosfolipidic. Enumerate, aceste structuriproteicesunturmtoarele: + + 2+ canaleionice(difuziuneaanumitorioni,ndeosebiNa ,K ,Ca ,Cl), acvaporine(ap),
transportoriproteicidedifuziunefacilitat(ioni,glucoz,aminoacizietc.), + + + + 2+ pompe ionice ATPazice (Na K , H K , Ca ), receptori membranari de transport (pentru LDL, feritin etc.). V. descrierea tuturor acestor tipuri de transport.
Funciadesuportalactivitilorenzimatice
La majoritatea biomembranelor au fost puse n eviden proteine intrinseci cu funcieenzimatic,intervenindnmetabolismulintermediarsauncelenergetic.Aceste proteine se gsesc att n membrana plasmatic a tuturor celulelor (procariote sau eucariote) ca ila nivelulunororganiteintracelulare.Proteinele enzimaticedetermin lanivelulbiomembranelorsuprafeeactive,carepermitcretereaconsiderabilavitezei metabolismului. Aceasta, deoarece diversele enzime care particip la nivelul unei aceleiaicibiochimiceseaflmaiapropiatensnulaceleiaistructuriplane,ceeace diminu fenomenele de difuziune ale reactivilor i faciliteaz accesul la situsurile catalitice. ntrunvolumcare aretalia aproximativauneiceluleeucariotemedii(10 m diametru),secalculeazcprobabilitateadentlnireauneimoleculedesubstrati a uneimoleculedeenzimestemultiplicatde10pnla100deoricndseadaugla simpla difuziune aleatorie n trei dimensiuni o component de difuziune n dou dimensiuni.ngeneral,moleculeleint(enzimele)suntlegatelaomembran,ntimp cemoleculelecetrebuiessentlneasccuenzimele(substraturile)suntsusceptibile de difuziune n citoplasm, n poriunea amorf i omogen a acesteia, denumit hialoplasm,careconineorganiteleiincluziunilecelulare.
Funciadecapturidetransformaredeenergie
Graieanumitorproteinepecareleconin,diversetipuridemembranebiologice suntcapabilescaptezeoformdeenergiefizic,lumina,pecaresotransformefie ntro alt form de energie direct utilizabil de celul (energie chimic), fie ntrun semnal ceinduceunsimplurspunsinformaionaldinparteaceluleisensibile(organe senzoriale). n toate cazurile, captura de energie luminoas implic prezena de pigmeni legai de proteinele membranare. Nivelele de energie puse n joc n aceste dou procese, nu sunt, evident, identice, ca i mecanismele moleculare care permit asigurareafenomenelordetransformaresaudetransducieasociatenmodnecesar. Uncazparticularimportantlreprezintmembranamitocondrialintern,care permite transformarea unei forme de energie chimic (cea coninut n moleculele organicereduse)nalta,coninutnATP,utilizabilntoateactivitilecelulei.
Membrana plasmatic a fiecrei celule conine proteine intrinseci care ndeplinescfunciadedetecieaunorsemnalevariateprovenitedinmediulnconjurtor alcelulei.Acesteproteineintrinseciaparinmariifamiliidereceptorimembranari.
Oricereceptorestespecificpentruunanumittipdesemnal,caresemnalesteconinuti purtatdeobiceintromolecul.Deaceeaputemsafirmmc unanumitreceptoreste specificpentruoanumitmoleculpurttoaredeinformaie,denumitligandspecific deoarece doar molecula respectiv se poate lega la receptor. De aceea, orice receptor posed un domeniu extracelular voluminos care i servete ca anten capabil s recunoasc i s fixeze molecule specifice: hormoni polipeptidici, factori de cretere, proteine ale matricei extracelulare, proteine asociate la membranele altor celule etc. Dup fixarea ligandului la receptorla nivelul membranei este transmis oinformaie, deregulcaurmareamodificriiconformaieireceptorului.Acestprocesdeclaneazo seriedereaciincascadninteriorulcelulei,traduseprintromodificaremaimultsau mai puinprofund a activitii celulare, directla nivelul metabolismului,sau,uneori, lanivelulexpresieigenelor. Se numete transducia unui semnal ansamblul proceselor care contribuie depotriv la trecerea unei informaii de natur extracelular prin membran (via receptori) i realizarea rspunsului fiziologic. n sens mai larg, transducia reprezint conversiaunuisemnaldeuntipdatntrunsemnalintracelulardealttip. n cazul celulelor nervoase, membrana plasmatic a prelungirilor denumite axoni,posedproprietatearemarcabildeaconducepedistanelungioinformaiesub forma unui curent electric transmembranar localizat. Acest curent electric, denumit potenialdeaciune,sepropagdelacorpulcelularlaextremitilesinaptice.Aceast proprietateamembraneiestedeterminatdecanaleleionice(v.).
Funciaderecunoatereideaderenntrecelule
Celulele organizate n esuturi prezint legturi directe unele cu altele. Legturile se realizeaz prin intermediul unor proteine intrinseci membranare care constituie structuri denumite jonciuni intercelulare ca i datorit unor proteine denumite de aderen. Jonciunile celulare pot fi strnse (etane) n acest caz membranele celulelor fiind foarte apropiate (acolate) sau comunicante (deschise). Jonciunile comunicante, aflate la nivelul membranelor celulelor nvecinate, permit trecerealiberdelaocelullaaltaaunormoleculeavndomasmoleculardepn la 1200 Da. Este cazul unor nutrimente (glucoz, aminoacizi, nucleotide) sau a unor moleculesauioniavndroldemediatorsaudemesagerintracelular(AMPciclic,ioni 2+ deCa ). Aceasta nseamn c jonciunile comunicante membranare permit nunumai asigurarea unei cooperri metabolice, dar i o coordonare a activitilor sau a rspunsurilorcelularelastimuliprecumhormonii. Deasemenea,membraneleceluleloraparinndaceluiaiesutsuntpurttoarea numeroasemoleculecareasigurorecunoaterereciprocspecific.nfine,nceamai mare parte a esuturilor animale sau vegetale, celulele sunt n contact printrun constituent extracelular format din macromolecule secretate (proteine i polizaharide) denumit matrice extracelular. Date asupra acestor structuri vor fi prezentate la Biologiecelular.
Itwasasimplequestionthatwetriedtoanswer,when Bert Sakman and my self made attempt to record singlechannel currentsinthe early 1970s.What are the molecular mechanisms underlying the electrically and chemically induced permeability changes in excitable tissue: ion channels or other kinds of transporters? Our attentionwasfocusedonthetraditionalexcitablecells: nerve, muscle neuroendocrine. We did not anticipate thatinchannelsarefoundinbasicallyanycelltype and they mediate an incredible variety of regulatory functions. Even less would we have anticipatedthatmutationsinchannelsarethebasis ofawholerangeofdisorders.
ErwinNeher, ProfesordeBiofizic,laureatNobel Medicin1991(nprefaala monografiaCHANNELOPATHIES, EditedbyF.LehmannHornandK. JurkutRott,Elsevier,Amsterdam,2000)
CANALELE
IONICE
Definiie caracteristici
n cele ce urm eaz prezen tm o sintez asu p ra caracteristici lor cele m ai generale ale can alelor i on ice, p roteine intrinseci ale m embran ei celu lare d e im portan cap ital n aproape toate fu nciile d in organismul u m an . Can alele ionice reprezint un subie ct interd isci p lina r, adic l a stud iu l acestora p articip m ajo ritatea d iscip linelo r fundam en tale, ndeo seb i fi ziolo gia, bio fizica, biologia celu la r i bio log ia mo lecu la r . n aceast sintez d e d ate, d up cum se va o bserva, p rezen tm caracterist i cile canalelo r ion ice n optica fi ecreia din cele 4 direcii de cercet are. Din reunirea acestor d ate rezult defin ireadea nsamb lua ca na lelo rionice.
Definire Biofizic
Uncanalreprezintorezisten(r)lanivelulcruiasepoatedisipaun curent(i).
LarndulsuocelulcareposednmembranasaNcanaleprezintorezistenR,astfelnct:
1/R=SN(1/r) Deobiceiseutilizeazconductana,carereprezintinversulrezistenei,ca urmare: g= SNg unde: g=conductanauneicelule(sauaunuifragmentmaredemembran), g=conductanaunuicanal. Conductana se msoar n who (inversul unitii de msur a rezistenei,ohm)saunSiemens(S). Intensitateacurentului(i)traversnduncanalestedescrisdelegealui Ohmtranspuslaungradientelectrochimic: Is =gs(VV s)
Iarintensitateacurentului(I)cetraverseazansamblulcanalelor unueiceluleeste:
Is =gs(VVs) Unde:is iIs suntcureniitransportaideunionS, gs igs sunt,respectiv,conductaneleunuicanaliaceluleipentruionulS, Vestepotenialulmembranar, Vs estepotenialuldeechilibrualionuluiSdefinitprinecuaialuiNernst: RT [S] V = log e s ZF [ ] S i unde:R=constantagazelorperfecte(8,315JK1mol1anuseconfundacurezistenaelectric,R),
T=temperaturaabsolut(273+tC), Z=valenaionuluiS, 1 F=constantaluiFaraday(94489Cmol ), [S]ei[S]i =concentraiileextra iintracelularealeionuluiS.
Vs =58log 10
[S] e [S] i
Ca regul general, CI sunt deschise sau nchise i, ca urmare, conductana lor poate avea dou valori, g sau 0. Conductana g este caracteristicunuianumittipdecanal,ncondiiiledatedetemperaturide mediuionic. Curentulcaretraverseazunsingurcanal(curentelementar)seprezint penregistrarecaotreaptrectangularipoatefipusnevidenprinmetoda patchclamp:
Cureni elementari 2pA
Curentul nregistrat pe o celul ntreag (denumit i curent macroscopic) se prezint ca un traseu neted (n care nu se observ curenii elementari,corespunztorideschideriiunuisingurcanal).Iatcumseprezint traseuldecurentmacroscopicnregistratpeocelulntreagicorespunznd activitiiacirca600deCIidentice.
Studiulcurenilorelementarii/saumacroscopicipermitecaracterizarea proprietilor fiziologice i farmacologice ale CI. tiind c un curent care ptrunde n celul este depolarizanti c, invers, uncurentieind din celul estehiperpolarizant,cunoatereaproprietilorCIpermitesseneleagis se prevad activitatea electric a unei celule, ca i modificarea sa n diferite condiiiexperimentalesaupatologice.
Definire Biologiecelular
Prima consecin a unei schimbri de activitate a CI este geneza unui curent i a unei variaii de potenial transmembranar. Aceste efecte n cazul celulelor excitabile se propagpe toat suprafaa celular, n celelalte cazuri semnalele fiind localizate doar ntrun punct al celulei. n toate cazurile, o modificare de activitate a canalelor ionice se traduce, ntrun timp mai lung saumaiscurt,prinschimbrileconcentraiilorintrasauextracelulare.Aceste modificri de concentraie reprezint, n general, legturi directe ntre CI i funciile celulare. CI prin intermediul fluxurilor ionice i/sau variaiile de potenial membranar sunt considerate ca vectori ai unui semnal ionic. De aceea, se nregistreaz sau se studiaz pe termen mediu (secunde ore), fie modificrile concentraiilor ionice, fie consecinele acestora: modificarea volumuluicelularsauaactivitilorenzimatice.Evident,nmodsistematicse ineseama,pedeoparte,destructuraiproprietileCIi,pedealtparte,de lanul reaciilor fizicochimice cuprinse ntre modificrile concentraiilor ionice i modificrile unei anumite funcii celulare. nplus,trebuieluaten consideraie diferitele sisteme de transport ionic (transportori, pompe) prezentencelul, caiinteraciunileacestoracuCI.
DefinireBiologiemolecular
Utilizareatehnicilordefiziologie,biofizicibiologiecelularpermite cunoatereamoduluidefuncionareaCIiaroluriloracestora.Acestestudii nu furnizeaz, ns, date asupra structurii i geneticii canalelor ionice. "Disecia" CI se realizeaz prin tehnici de biologie molecular: clonare, secvenareimutaiedirijatutilizndanticorpi.Totodat,prinasociereaunor tehnicidefiziologieibiofizicsencearcdeterminareaunuianumitsitusal unui canal (aminoacid sau grup de aminoacizi) responsabil de o anumit funcie. n prezent este cunoscut structura molecular a mai multor CI, + + 2+ ndeosebiacelorspecificepentruNa ,K iCa .
ROLURILEFIZIOLOGICEALECANALELOR IONICE
DeiCIreprezintcantitativofraciunemicdinproteinelecelulare,eleau rolurifiziologicemajoreinumeroase: ninteriorulcelulelorrelaiecitosol organite, norganism comunicarecelulemediuintern schimburiintercelularesistemnervos releuntremediulfizicexterniorganism,printransformarean semnalevitaleaunorfenomenefizicecaemisiaunuifluxdefotonisau aunorvibraiisonore.
ENUMERAREAROLURILORFIZIOLOGICEALECI:
1. 2. potenialulmembranarderepaus potenialuldeaciune(succesiunedefazededepolarizarei repolarizare) 3. conducie 4. secreie(exocitoz) 5. nocicepie,olfacie,audiie,vedere 6. osmoreglare(volumcelularimetabolism) 7. contracie 8. secreiedefluidedectreglandeleexocrine 9. reabsorbieafluidelor 10. micritransmembranarealemoleculelororganicepolare 11. micritransmembranarealemoleculelororganicenonpolare 12. echilibruldesarcinielectricencompartimenteleintracelulare 13. controlulactivitilorenzimatice 14. controlulcilorintracelularedesemnalizare 15. embriogenez 16. expresiagenelor 17. controlulcitoscheletului 18. rspunsullamediulfizicochimic(pH,pO2)
CANALE IONICE
Cele4subuniti formeazcanalul
+ CANALULDENa voltajdependent
Tipde canal
2+ Ca 2+ Ca
Gena
CACNL1A4 CACNL1A4
Consecineclinice
Migrene Ataxie(pierderea echilibruluiia
CACNL1A3
coordonrii) Miotonieperiodic(redoare
Paralizieperiodic hipokalemic
+ K + K
KCNA1 KCNQ2
+ K + K
KCNQ4 HERGsau KVLQT1 Surditate Vertij,moartesubitprin fibrilaieventricular Miotonieiparalizie periodic Hipertensiune Obosealmuscular Calculirenali Miotonieperiodic Congestiepulmonari infecii Ritmcardiacneregulatsau accelerat
Na
+ Na + Na Cl
Cl Cl +
Na ,K , Numeroase Ca
2+
genediferite
TRANSPORTORIMEMBRANARII POMPEIONICE
Canaleleionicesuntsimplepori: trecereaionilordelaconcentraiemareconcentraiemic, decinutransportreal,cipasaj.
Asimetriaionicaintremediile extracelularsiintracelularlaom
Ioni
+ K + Na 2+ Mg 2+ Ca Cl HCO3
A. Proteinetransportoarelipsitedeactivitate enzimatic
Transportoriiauoselectivitatefoartevariat: ioni, darinutrimentecelulareglucoz,aminoacizi metaboliineuromediatori
B.
PompeionicecuactivitateATPazic:
POMPEsauATPazemonosaubidirecionale
+ + Pompeleioniceasigurnumaitransportuldeioni:Na ,K , + + Ca ,H .
TRANSPORTORIIDEDIFUZIUNE FACILITAT
I. Transportoriiionici
reglareapHului ndeosebincelulele
+ 3Na influx 2+ 1Ca eflux + + 1.Schimb.Na /H intracelular. + 2+ 2.Schimb.Na /Ca excitabile.
III.Transportoriimembranariainutrimentelor
1. Transportoriideglucoz + cotransportulNa /glucoz(ficat, rinichi) transportorideglucoz:celemaimulte celule(492R,12elice )
RECEPTOR LIGAND
reciclat reciclat reciclat degradat degradat reciclat
transporttranscelular
Molecula GLUT
Tipul GluT
Distribuianorganism eritrocite,celuleendotelialealebariereihematoencefalice,esutembrionari fetal,placent,creierubicuitar ficat,intestin,rinichi,celulebpancreatice creier(neuroni),endoteliuvascularcerebral esutadipos,muchischeleticimuchicardiac colon,rinichi,testicule,microglie creier,splin,leucocite ficat placent,testicule,creier,precumialteesuturi ficat,rinichi ficat,pancreas muchischeleticimiocard muchischeleticimiocard,esutadipos,intestinsubire,prostat predominlanivelcerebral
Afinitateapentru glucoz Gn <G,fructozn >G >G fructoz n,<<G Gn n.d. Gn n.d. Gn <G,fructozn n.d.
+ H mioinozitol
GluT1 GluT2 GluT3 GluT4 GluT5 GluT6 GluT7 GluT8 GluT9 GluT10 GluT11 GluT12 GluT13 (HMIT)
PETCT
18
FFDG
b)
a)
b)
a)
b)
b)
Citoscheletulmicrotubularla fibroblasteincultura:a)celule normale:b)celuletransformate. Aspect microscopical tesutului cerebralal uneipersoane decedatede boala Alzheimer. Prioni: a)normal, b)anormal,
Hemidezmozomi:a)ImagineMEC: b)Schemacurelatiamatricecitoschelet.
BIBLIOGRAFIE RECOMANDAT 1. V. Rusu i colab. Biomembrane i patologie, vol. I, Edit. Medical, Bucureti, 1988. 2. N. Voicule, Liliana Puiu Biologia molecular a celulei, Edit. ALL, Bucureti, 1997. 3. Orice tratat de Biologie molecular a celulei n limba englez existent la Biblioteca Central a UMF Gr. T. Popa . 4. Utilizarea bazelor de date de pe Internet accesibile prin nscrierea la Biblioteca Central a UMF Gr. T. Popa .