UNIVERSITATEA DIN BUCURESTI CICLUL 1.

LICENTA IN BIOCHIMIE METABOLISMUL TESUTURILOR SPECIALIZATE

REGLAREA COAGULARII SANGELUI. FIBRINOLIZA

Cursul 26

10/4/2013

Prof. Dr. Dana Iordachescu

Anticoagulanti Citratul, oxalacetatul, EDTA sunt agenti anticoagulanti deoarece fixeaza Ca2+ Analogii vitaminei K dicumarolul si warfarina inhiba formarea resturilor Gla, legarea Ca2+ nu mai este eficienta si coagularea nu mai are loc baza utilizarii lor ca agenti anticoagulanti in tratamentul trombozei

Vitamina K

Dicumarol

Warfarina

Anticoagulanti pe baza de heparina: heparina, heparina cu MM mica, fondaparinux si idraparinux

Hirudina (din lipitori): lepirudin, desirudin, bivalirudin

Anticoagulanti naturali: antitrombina, TFPT (Tissue Factor Pathway Inhibitor), proteina C
10/4/2013 Prof. Dr. Dana Iordachescu 2

Rolul Ca2+ si vitaminei K in coagulare Unii din factorii de coagulare: protrombina, VII, IX si X contin un rest Glu modificat, -carboxiglutamatul (Gla) care este un situs de legare a ionilor de Ca2+. Complexele Gla-factorilor cu Ca2+ stabilesc interactii specifice cu lipide acide membranare ce permit acestor complexe sa adopte structuri tertiare si cuaternare compatibile cu interactii proteina-proteina. Sinteza resturilor Gla modificari post-translationale realizate de o carboxilaza (vit K)

Baza moleculara pentru care vitamina K vitamina coagularii

10/4/2013

Prof. Dr. Dana Iordachescu

Heparina anticoagulant natural produs de leucocitele (granulocite) bazofile si mastocite - moduleaza coagularea sangelui prin inhibitia Ser proteazelor: XIIa, XIa, Xa, IXa si IIa (trombina), fie direct, fie prin activarea antitrombinei inhibitor al Ser proteazelor din plasma. De asemenea, heparina inhiba activarea plachetara mucopolizaharid cu MM variabile (6000-40000 Da), unitate dizaharidica repetitiva formata din D-glucozamina si un ac. uronic legate 1,4. Un numar de gr.0H sunt sulfatate conferindu-i o sarcina totala negativa
10/4/2013 Prof. Dr. Dana Iordachescu 4

Hirudina Peptida cu 65 resturi de aminoacizi, care se gaseste in glandele salivare ale lipitorilor Hirudo medicinalis ce are proprietati anticoagulante Puternic inhibitor al trombinei, cu care formeaza un compus chimic 1:1, cu blocarea activitatii catalitice In prezent, preparate recombinate de hirudina, utilizate in concentratii de 10 mg/L previn formarea cheagurilor de sange; avantajul fata de alti anticoagulanti este ca nu interfera cu activ biologica a altor factori de coagulare Un numar mare de bolnavi cu blocaj renal pot supravietui prin dializa in scopul indepartarii toxinelor si deseurilor metabolice. Prevenirea coagularii sangelui in tuburi de dializa este conditia succesului dializei realizabila prin tratament cu hirudina. Hirudina blocheaza activarea plachetelor sangvine si cresterea trombusului, nu este metabolizata in fluxul sangvin al omului si este eliminata intr-o stare nemodificata prin filtrare renala
10/4/2013 Prof. Dr. Dana Iordachescu 5

Inhibitori ai Ser proteazelor (serpine): antitrombina (AT) si TFPI

Antitrombina III (AT) inhiba factorii de coagulare activati II (trombina), IX, X, XI, XII, kalikreina, plasmina si probabil factorul VII; activitatea inhibitorie a antitrombinei este crescuta de cca 1000 prin interactia cu heparina sau heparan sulfat (localizate pe celulele endoteliale) Deficiente in AT risc crescut la maladii trombotice (tromboza si embolie pulmonara) Inhibitorul TFPI (tissue factor pathway inhibitor) este un inhibitor tip Kunitz al proteazelor, are 3 motive inhibitoare aranjate in tandem (K1, K2 si K3), un capat N-terminal incarcat negativ si unul C-terminal incarcat pozitiv. TFPI - sintetizat in celulele endoteliale, exista pe endoteliu si in plasma intr-o forma libera si in forme asociate cu lipoproteine.

TFPI inhiba reactiile initiale de TF din calea de coagulare extrinseca interactionand cu factorul Xa via K2 si cu complexul TF/VIIa via K1.

10/4/2013

Prof. Dr. Dana Iordachescu

Alaturi de AT si TFPI, proteinele C si S alcatuiesc sistemele anticoagulant majore.

Proteina C este un receptor-zimogen de pe endoteliul vascular. Complexul trombina/trombomodulina, leaga proteina C si o activeaza la enzima activa APC (activated protein C).

APC leaga proteina S la fosfolipidele de pe suprafata celulei endoteliale sau de pe plachete sangvine, formand complexul proteina C/proteina S ce degradeaza Va si VIIIa, diminuand nivelul formarii trombinei si fibrinei (coagularea). Proteinele C si S au resturi Gla proteine sintetizate in ficat

In afara functiei anticoagulante, proteina APC are activitati fibrolitice (indirect), anti-inflamatorii si antiapoptotice
10/4/2013 Prof. Dr. Dana Iordachescu 7

hirudin

10/4/2013

Prof. Dr. Dana Iordachescu

Controlul coagularii sangelui Initiere amplificare inhibare

10/4/2013

Prof. Dr. Dana Iordachescu

Controlul coagularii sangelui prin intermediul fosfolipidelor. Fosfolipidele favorizeaza formarea a 3 complexe: (1) complexul tenazei; (2) complexul protrombinazei si (3) complexul de activare al proteinei C. Proteina C activata inactiveaza factorul Va si factorul VIIIa in prezenta proteinei S si fosfolipidelor. Asterixurile indica situsurile la care anticorpii anti-fosfolipide pot avea efecte procoagulante sau "lupus anticoagulant effect" (prin inhibitia conversiei protrombinei la trombina)
10/4/2013 Prof. Dr. Dana Iordachescu 10

Echilibrul hemostatic

Prot. S

PAI-1 Antiplasmin Tissue factor* Clotting Factors

Prot. C TFPI
Fibrinolytic System

ATIII

Procoagulant
10/4/2013 Prof. Dr. Dana Iordachescu

Anticoagulant
11

Fibrinoliza
Scindarea cheagului de fibrina format ca rezultat al coagularii sangelui realizat de un sistem fibrinolitic a carui principal component este plasmina

Plasmina este o Ser endoproteinaza ce scindeaza reteaua de fibrina la nivelul mai multor situsuri cu producerea unor fragmente proteice eliberate in circulatie si scindate ulterior cu proteaze din rinichi si ficat

10/4/2013

Prof. Dr. Dana Iordachescu

12

Principalele componente ale sistemului fibrinolitic

10/4/2013

Prof. Dr. Dana Iordachescu

13

Plasminogen Extrinsec: t-PA, urokinaza activare Intrinsec: XIIa, HMWK, kalikreina Exogen: streptokinaza Fibrina, fibrinogen Plasmina Produsi de degradare

Plasmina este produsa din plasminogen sub actiunea TPA (tissue plasmalogen activator) - degradeaza fibrinogenul si fibrina la produsi de degradare;degradeaza factorii de coagulare: V, VIII, IX, XI si XII si este inhibata de 2antiplasmina si 2-macroglobulina plasmatica
10/4/2013 Prof. Dr. Dana Iordachescu 14

Plasminogenul este un zimogen din fluxul sangvin care se transforma in plasmina (enzima activa) sub actiunea unor activatori: 1) Din peretii vaselor de sange (activarea intrinseca) factorul XIIa, kalikreina 2) Din tesuturi sau din agenti exogeni (activarea extrinseca) 2a) ca urmare a unor leziuni: tPA (tissue plasminogen activator), uPA (urokinase-like plasminogen activator) eliberate de celulele activate si lezate; 2b) sub actiunea unor agenti exogeni, ca streptokinaza sau t-PA sau u-PA terapeutici

10/4/2013

Prof. Dr. Dana Iordachescu

15

Plasminogenul Componentul central al sistemului glicoproteina formata dintr-o singura catena polipeptidica de 791 aminoacizi si 2 % glucide, MM 92 kDa. Sintetizat in ficat, prezent in plasma si majoritatea fluidelor extravasculare

Structura pe domenii: PAP (preactivation peptide), 5 domenii kringle si un domeniu catalitic P (proteazic). Peptida PAP este indepartata prin actiunea plasminei si conduce la formarea unei structuri mai scurte Lys-plasminogenul. Prin cele 5 domenii kringle se leaga la fibrina. Activarea plasminogenului la plasmina are loc numai atunci cand activatorii t-PA si u-PA scindeaza o singura legatura peptidica (Arg 560 Val 561) din domeniul catalitic cu formarea a doua catene tinute asamblat prin 2 punti disulfurica. Centrul catalitic activ al plasminei are triada His-603Asp-646.. Ser-741. Mutatia Ala 601 Thr creste riscul la tromboza
10/4/2013 Prof. Dr. Dana Iordachescu 16

In plasma circula mai multe forme de plasminogen care pot fi separate prin cromatografie de afinitate. Forma nativa are in poztia N-terminala acid glutamic si se numeste Gluplasminogen. Forma generata de proteoliza cu plasmina are in pozitia N-terminala lizina si se numeste Lysplasminogen. Glu-plasminogenul are o conformatie inchisa care se destinde la legarea resturilor Lys pe suprafata fibrinei. Se pare ca aceste modificari conformationale cresc capacitatea de activare a plasminogenului de catre tPA. Efect opus, ionul Cl stabilizeaza forma inchisa a Glu-plasminogenului.
10/4/2013 Prof. Dr. Dana Iordachescu 17

Generarea plasminei are loc preferential la suprafata fibrinei, care ofera situsuri de legare pt plasminogen si t-PA principalul activator din sange al plasminogenului. Aceasta legare stimuleaza activarea plasminogenului si localizeaza actiunea plasminei pe fibrina promovand o liza eficienta a cheagului.

10/4/2013

Prof. Dr. Dana Iordachescu

18

Activatorii plasminogenului
Activatori endogeni: t-PA si u-PA prezenti in sange si alte fluide corporale Activatori exogeni: streptokinaza, urokinaza utilizati clinic pentru dizolvarea cheagurilor (agenti trombolitici) si pentru tratamente (embolie pulmonara, infarct miocardic)

t-PA are are cel putin 5 domenii: un domeniu finger (omolog fibronectinei), un domeniu EGF (epidermal growth factor), 2 domenii kringle si un domeniu proteazic u-PA contine un domeniu EGF, un domeniu kringle si un dom proteazic. Domeniul EGF confera afinitate pentru receptorii de pe suprafata celulara

10/4/2013

Prof. Dr. Dana Iordachescu

19

t-PA
Activatorul plasminogenului de tip tisular - principalul activator endogen al plasminogenului din sange Ser proteaza (o catena polipep. de 527-530 resturi aminoacizi, glicoproteina cu 7-13 % glucide)- produsa de celulele endoteliale care captusesc vasele de sange si secretat continuu in sange Codificat de gena PLAT (cromozom 8) prin splicing alternativ 3 forme mRNA t-PA este activ in prezenta fibrinei (sau a fragmentelor fibrinice) cand are loc liza eficienta a cheagului; in plasma circula in stare complexata cu PAI-1 (plasminogen activator inhibitor-1) t-PA scindeaza o legatura peptidica Arg275-Ile276 din plasminogen cu formarea a 2 catene legate printr-o punte disulfurica (plasmina) Sinteza t-PA indusa de conditii ischemice; apar fluctuatii in nivelul tPA ca raspuns la exercitiu, ocluzie venosa, consum de alcool si droguri, de steroizi anabolici

Cresterea activitatii enzimatice a t-PA hiperfibrinoliza (singerare excesiva); scaderea activitatii enzimatice a t-PA hipofibrinoliza (tromboza, embolie)
t-PA recombinat utilizat in terapia trombozei in embolia pulmonara,infarct miocardic
10/4/2013 Prof. Dr. Dana Iordachescu 20

Urokinaza u-PA Urokinaza = activatorul urinar al plasminogenului deoarece a fost izolata din urina. In prezent, este cunoscut ca este sintetizata in celulele endoteliale, SMC, epiteliale, fibroblaste, monocite/ macrofage, celule maligne. Este utilizata limitat in embolia pulmonara ca agent fibrinolitic In afara functiei fibrinolitice, urokinaza are multiple alte roluri in remodelarea tisulara regland adeziunea si motilitatea celulara prin legarea la receptori de pe suprafata celulei. Multiplele functii sunt datorate structurii cu 3 domenii a u-PA: domeniul proteolitic C-terminal care confera o activitate Ser-proteazica, domeniul central kringle si domeniul omolog EGF N-terminal u-PA este sintetizat sub forma unui zimogen de 411 resturi am. acizi, monocatenar Gena pro-uPA (6,4 kbaze) izolata si caracterizata, contine in regiune promotor secvente sensibile la forbol esteri, factori de crestere, hormoni steroidici, etc
10/4/2013 Prof. Dr. Dana Iordachescu 21

Pro-uPA are o slaba activitate enzimatica, catalizand transformarea plasminogenului in plasmina. Plasmina la rindul ei scindeaza structura monocatenara la nivelul legaturii peptidice Lys158-Ile159 cu formarea structurii dicatenare (catena A light si catena B heavy, domeniul proteazic se afla pe catena B) stabilizata printr-o legatura disulfurica (Cys148-Cys279). Aceasta proteoliza limitata este catalizata si de kalikreina, factorul XIIa si catepsina B. Poate urma si un alt clivaj la Arg135-Lys136 care elibereaza fragmentul N-terminal (include domeniul like EGF si domeniul Kregle) si fragmentul C-terminal (LMW urokinase, aminoacizii 136-411) care contine intreaga activitate catalitica Se pare ca astfel de modificari post-translationale au loc in vivo pe suprafata celulei, diferite variante ale u-PA (forma monocatenara, forma dicatenara si LMW) avand afinitati diferite fata de receptor u-PAR/CD87. Legarea urokinazei la receptor permite o proteoliza strict localizata a proteinelor matricei extracelulare ce faciliteaza motilitatea celulara. Complexul urokinaza-receptor de fapt regleaza toate evenimentele intracelulare (semnalizarea).
10/4/2013 Prof. Dr. Dana Iordachescu 22

Plasminogen
CELULA uPAR u-PA

PAI-1
ECM matricea extracelulara MMP metaloproteinaze matriceale

Plasmina

Dizolvarea fibrinei

Scindarea ECM

Activarea MMP

Domeniul GFD (growth factor-like domain) este responsabil pentru interactia urokinazei cu receptorul uPAR/CD87

Domeniul kringle contine o secventa ce interactioneaza cu inhibitorul specific PAII

Domeniul proteazic include situsul activ al enzimei: His-204, Asp-255 si Ser-356 (triada Ser proteazelor)
10/4/2013 Prof. Dr. Dana Iordachescu 23

Receptorul urokinazei (uPAR) contine 3 domenii legate prin punti disulfurice, este atasat la suprafata celulara printr-o ancora glicozil fosfatidil inozitol (GPI). Domeniul D1 reprezinta situsul de legare al urokinazei (uPA). uPAR solubil (suPAR) este eliberat de pe membrana plasmatica prin scindarea ancorei GPI. Ambele forme uPAR si suPAR pot fi scindate la nivelul regiunii dintre domeniile D1 si D2 producand D1 si un fragment D2D3 cu activitate chemotactica.

10/4/2013

Prof. Dr. Dana Iordachescu

24

Streptokinaza (SK)
Proteina (47 kDa), fara activitate enzimatica, produsa de streptococul betahemolitic, utilizata ca medicament (fibrinolitic) pt dizolvarea cheagurilor de sange dupa infarct miocardic si embolie pulmonara viata ~ 20 minute 6 ore (SK interactioneaza cu plasminogenul (Pg) plasmatic si formeaza un complex stoichiometric (1:1) activator (SK.Pg) care activeaza Pg la plasmina (Pm)

De fapt, plasminogenul se adsoarbe pe cheagul de sange. SK penetreaza cheagul activand Pg la plasmina enzima activa care dizolva cheagul.
10/4/2013 Prof. Dr. Dana Iordachescu 25

Inhibitorii activatorilor plasminogenului

PAI-1 (plasminogen activator inhibitor-1) - glicoproteina (54 kDa), principalul inhibitor al tPA si uPA, produs de endoteliu, PS, hepatocite, fibroblaste, adipocite. Gena umana PAI-1 este localizata pe cromozomul 7 (q21.3-q22) si contine 9 exoni si 8 introni. S cunosc 8 polimorfisme diferite ale PAI-1 PAI-1 este stimulat direct de insulina, glucoza, triacilgliceroli din VLDL. Cresterea nivelului insulinei creste nivelul PAI-1 creste formarea cheagului de sange. In hiperglicemie creste nivelul PAI-1 in sange. Nivelul VLDL-TAG creste in sindromul metabolic.

PAI-2 este secretat de placenta - nivelul creste in timpul graviditatii.

Deficienta congenitala in PAI-1 Diateza hemoragica Niveluri crescute de PAI-1 in diferite forme de cancer, obezitate, sindrom metabolic corelat cu incidenta crescuta de tromboza la pacientii cu aceste maladii In conditii inflamatoare cand fibrina se depune in tesuturi, PAI-1 joaca un rol important in evolutia fibrozei.
10/4/2013 Prof. Dr. Dana Iordachescu 26

Alti inhibitori ai fibrinolizei 2-antiplasmina si 2-macroglobulina inhiba direct plasmina libera din plasma TAFI (thrombin-activable fibrinolysis inhibitor) scade activitatea plasminei deoarece modifica fibrina 2-antiplasmina este o glicoproteina monocatenara cu 452 resturi de aminoacizi, cu 13 % glucide, se gaseste in plasma intr-o concentratie mare 1 mol/L gasita in granulele ale plachetelor sangvine eliberate cand plachetele sunt stimulate de trombina principalul inhibitor fiziologic al plasminei (actioneaza cel mai rapid); inhiba fibrinoliza interferind la 3 niveluri diferite: inactivarea rapida a plasminei, interferenta in adsorbtia plasminogenului pe fibrina si cross-linkarea fibrinei. Inhiba plasmina prin formarea unui complex inactiv stoichiometric 1:1, urmat de scindarea specifica a legaturii Arg 364-Met 365 din inhibitor
10/4/2013 Prof. Dr. Dana Iordachescu 27

2-macroglobulina produsa in principal in ficat, dar si in monocite-macrofage, fibroblaste, hepatocite, astrocite transporta o varietate de proteine, peptide, citokine (PDGF, TGF-, IL-1, bFGF), Zn inhiba multe tipuri de proteinaze functioneaza in clearance plasminei 4, M 180 kDa, actioneaza printr-un receptor glicoproteina de 600 kDa de pe suprafata celulei TAFI (thrombin-activable fibrinolysis inhibitor) este un zimogen din plasma, care atunci cand este expus la complexul trombina-trombomodulina, este transformat prin proteoliza la Arg 92 cu formare TAFI activat (cu activitate carboxipeptidazica) ce inhiba fibrinoliza prin indepartarea resturilor Lys C-terminale din fibrina partial degradata, importanta in activarea cu maxima eficienta a plasminogenului
10/4/2013 Prof. Dr. Dana Iordachescu 28

Plasmina
enzima din sange, Ser proteinaza like-tripsina, este formata prin scindarea legaturii Arg 560-Val 561 din structura plasminogenului sub actiunea t-PA sau a urokinazei. degradeaza (dizolva) cheagurile de fibrina dar si multe alte proteine din plasma si din spatiul extracelular: fibronectina, trombospondina, factorul von Willebrand, laminina, activeaza colagenaze, etc structura: 2 catene H (heavy) si L (light) unite prin 2 punti disulfurice; MM a catenei H variaza in vivo de la 63 kDa la 12 kDa in functie de gradul de proteoliza
t-PA/u-PA

plasminogen

plasmina

degradeaz a fibrina
10/4/2013 Prof. Dr. Dana Iordachescu

remodelar e ECM

promoveaz a migrarea celulara

29

Perturbari ale sistemului fibrinolitic

Fibrinoliza exagerata => hemoragii

-n

insuficienta hepatica, -postoperator, -n accidente transfuzionale

Coagularea intravasculara diseminata (CID) Cauza: alterari endoteliu + staza capilara + factori trombogeni. - Etapa I: agregate trombotice mici, diseminate, datorita activarii difuze a trombinei. - Etapa II: consumul anormal de factori procoagulanti stare de hipocoagulabilitate + fibrinoliza

10/4/2013

Prof. Dr. Dana Iordachescu

30

Medicamente

fibrinolitice Streptokinaza, Urokinaza induc dizolvarea trombusului dupa constituirea lui Indicatii: tratamentul emboliilor si trombozelor anti-fibrinolitice Acidul aminocaproic actioneaza asupra activatorilor plasminogenului previne formarea plasminei Aprotinin (Trasylol) Inhiba plasmina reducerea fibrinolizei Indicatii: fibrinoliza exagerata

10/4/2013

Prof. Dr. Dana Iordachescu

31

10/4/2013

Prof. Dr. Dana Iordachescu

32

Hemoragia

Hemostaza (trombus alb)

Coagularea (trombus rosu))

10/4/2013

Prof. Dr. Dana Iordachescu

33

Restaurarea

Hemostaza (trombus alb)

Restaurarea

10/4/2013

Prof. Dr. Dana Iordachescu

34