Istoric Analiza chimic cromatografic este un domeniu mai recent al analizei instrumentale care include mai multe metode

de separare i totodat de analiz a componenilor amestecului din prob. n toate variantele, separarea precede analiza i se realizeaz prin repetarea, de un numr mare de ori, a echilibrului de distribuie ntre dou faze. Una dintre faze este imobil i poart denumirea de faz staionar (aflat de regul ntr-un tub numit coloan) iar cealalt - faza mobil - aflat n micare, se deplaseaz prin golurile primei faze. Separarea se petrece n coloana cromatografic, piesa cheie a ntregii metode. Faza mobil, denumit i eluent - scurgndu-se continuu (deci cu vitez constant) prin interstiiile fazei staionare, adeseori poroase, poate provoca migrarea, cu viteze diferite, a celor n componeni ai amestecului de separat de-a lungul coloanei. Amestecul supus separrii se introduce sub form de soluie la nceputul coloanei, folosindu-se un dispozitiv de introducere a probei (de exemplu o microsering), i se afl iniial fixat ntr-o zon ngust de la nceputul coloanei. Splai de eluent, o parte din componenii probei migreaz apoi prin coloan cu viteze diferite. Acest lucru se datoreaz interaciunilor fizice specifice, dintre moleculele probei i faza staionar (desigur, nu orice molecul poate migra pe orice faz staionar). Efectul, este numit retenie i aceasta provoac o aa-numit migrare difereniat. Adic moleculele migreaz n grupri, n fiecare grup existnd doar molecule de acelai fel. Aceasta face posibil sesizarea componenilor, pe rnd, la prsirea coloanei, de ctre un instrument, n grupurile respective - denumite uneori zone. Instrumentul amintit este un analizor fizico-chimic, sensibil la mai muli (n mod ideal la oricare) dintre componeni ce ies din coloan i care este plasat n eluent, imediat dup ieirea din coloan. Acest analizor, denumit detector este capabil s dea un semnal proporional cu masa sau cu concentraia soluiei de component n faza mobil. n consecin, dispozitivul, "marcheaz" trecerea fiecreia din substanele ce formeaz iniial proba, similar cu o fotocelul care nregistreaz trecerea concurenilor la sosire n atletism. Reprezentarea grafic a semnalului detectorului n funcie de timp poart numele de cromatogram

Clasificarea metodelor cromatografice

S-au imaginat i realizat numeroase variante ale metodei cromatografice, diferind unele de altele n primul rnd prin natura fazei mobile, dar i a celei staionare. Astfel se distinge cromatografia de lichide (LC) cnd faza mobil este un lichid, cromatografia de gaze (GC) cnd aceasta este un gaz sau cromatografia cu fluide supracritice la care faza mobil este un lichid aflat peste temperatura critic. n cadrul cromatografiei de lichide se mai face distincie ntre cromatografia pe coloan deschis i cea pe coloan nchis Pe de alt parte, n cadrul fiecreia dintre acestea, distingem mai multe variante. n cadrul LC se disting, n funcie de mecanismele de separare: Cromatografia de adsorbie, una dintre primele tehnici utilizate, veche de mai bine un secol (vet, 1903), utilizat pentru separarea substanelor organice cu molecule de dimensiuni mici i medii pe adsorbeni, ca silicagel i alumin, folosindu-se, ca faze mobile, diferite amestecuri de solveni organici. Cromatografia ionic (de schimb ionic), care se petrece pe o faz staionar solid, poroas, format din materiale specifice - schimbtorii de ioni - substane cu o reea solid afnat, de natur organic sau anorganic, pe care se gsesc grefate, prin procesul de obinere, nite centre de schimb ionic. Cele mai rspndite sunt rinile schimbtoare de ioni - organice - la care scheletul-suport este unul organic - un polimer poros. Pe aceste centre are loc o reacie ionic sau o interaciune ntre substana din soluie (electrolit sau neelectrolit) i funciunea legat chimic de suportul solid, numit reacie de schimb ionic. Cromatografia de excluziune steric se desfoar pe faze staionare poroase dar cu porozitatea selecionat astfel nct s corespund dimensiunilor moleculelor supuse separrii. O parte dintre molecule intr prin pori, reuind s interacioneze cu suportul solid, prin fore de adsorbie foarte slabe, iar altele sunt excluse deplasndu-se practic nereinute odat cu faza mobil. Se obine astfel un soi de sit la scar molecular separarea moleculelor fcndu-se n funcie de dimensiune. Tehnica se mai ntlnete i

sub denumirea de filtrare prin geluri sau permeaie prin geluri n funcie de natura apoas sau organic a fazei mobile. Cromatografia lichid-lichid (LLC), n care faza staionar este o faz lichid, nemiscibil cu cea mobil i imobilizat pe un suport solid, ntr-o coloan. Aici suportul solid este, cel puin principial, inert fa de componentele din prob. ntruct simpla impregnare a unui suport poros cu un lichid permitea splarea acestuia n timp, s-a recurs la legarea pe cale chimic a acestora de suport, obinndu-se nite faze cu totul specifice faze staionare legate chimic. Molecule organice de dimensiuni mici sunt, prin sintez, legate de suportul poros, fenomenul de pierdere prin splare de ctre faza mobil, fiind practic anulat. Acest tehnic este cea mai rspndit devenind aproape sinonim cu cromatografia de lichide. Cromatografia pe coloan deschis sau cromatografia planar (PC), se refer la un grup de tehnici nrudite cu cele din LC, care au toate n comun faptul c faza mobil circul printr-un material poros dispus ntr-un plan i formnd un strat relativ subire, dar de compoziie asemntoare cu cele menionate la cromatografia pe coloan. Se disting: Cromatogafia pe hrtie, tehnic n care faza staionar este o hrtie poroas din celuloz (iniial o hrtie de filtru) care este irigat de solvent prin fore capilare - o tehnic, azi, de importn istoric. Cromatografia pe strat subire (TLC), n care faza staionar pulverulent este fixat de suportul plan (sticl, aluminiu, material plastic) cu un liant, formnd un strat subire (0.10.5mm) de asemenea irigat prin capilaritate. Cromatografia pe strat subire de nalt performan (HPTLC), n care faza staionar are granulaie extrem de fin ridicndu-se astfel eficiena separrilor dar i viteza acestora. Toate acestea se caracterizeaz prin simplitate, accesibilitate i pre de cost cobort, dar totodat prin performane ceva mai slabe dect cromatografia de lichide pe coloan sub presiune ridicat (HPLC) varianta modern a LC. n mod analog, n cazul cromatografiei de gaze (sau mai pretenios cromatografiei n faz gazoas), denumit prescurtat GC se disting urmtoarele tehnici: Cromatografia gaz-lichid n care faza staionar este un lichid nevolatil imobilizat pe un

suport solid. Aici suportul poate fi unul granular, poros, situat ntr-o coloan n aanumita cromatografie de gaze convenional sau chiar pe pereii coloanei, confecionat de dimensiuni capilare, n cromatografia pe coloan capilar. Cromatografia gaz-solid este analog cu cele discutate la cromatografia de adsorbie i la cea de excluziune steric cu deosebirea c schimbarea gazului nu modific selectivitatea. Faza staionar o constituie tot silicagelul sau alumina, respectiv sitele moleculare (nite silicai naturali sau sintetici) respectiv granulele de carbon poros. Metoda este extrem de important pentru separarea gazelor permanente (CO, CO2, O2, N2, gaze nobile etc.) Din punct de vedere istoric, evoluia cromatografiei a cunoscut o suit de progrese, care au adus-o din situaia iniial de metod de separare i purificare de laborator la o tehnic de separare i analiz chimic cu o arie de aplicare aproape universal. Iniial rusul vet, a introdus n 1903 cromatografia de lichide pe coloan (LC). Aceast metod a fost uitat mult vreme i abia dup 1930, anul descoperirii cromatografiei n strat subire pe alumin, s-a perfecionat metoda utiliznd coloana, o dat cu nevoile de separare i purificare a compuilor organici naturali sau sintetici implicai n biochimie. n 1941 enlezii Martin i Synge descoper cromatografia de repartiie pe hrtie, reuind s separe cu ajutorul unui amestec de solveni care irig o band de hrtie de filtru (coninnd o pictur de prob) aproape toi aminoacizii, descoperire extrem de important pentru dezvoltarea ulterior a biochimiei. Doar n 1952 aceiai A. J. P. Martin and R. L. M. Synge [102] au nlocuit faza mobil lichid cu un gaz, realiznd pentru prima oar cromatografia de repartiie gaz-lichid. n aceast variant, detecia a fost realizat fizico-chimic, n efluentul gazos, dup ieirea din coloan, reuind astfel s mbunteasc marcant separrile. Din acest moment asistm la demarajul extraordinar al acestor tehnici, devenite azi cteva din principalele mijloace de analiz n chimia organic i biochimie, dar i n criminalistic, igien, controlul alimentelor, industria metalurgic etc. Din 1968 Halazs, (profesor la Franckfurt/Main), a pus la punct LC folosind un solvent sub presiune n calitate de faz mobil i detecie fizico-chimic n efluentul lichid, acesta fiind nceputul dezvoltrii cromatografiei de lichide sub presiune nalt (200 atm). Din 1980 s-a reuit i obinerea unor separri analitice performante bazate pe schimb ionic prin introducerea eluenilor diluai i a

supresorului ionic - datorate americanilor Hamisch i Schmall, tehnic care de atunci a primit denumirea de cromatografie ionic (IC). Azi se lucreaz nu numai cu cromatografe de laborator, analitice, ci i cromatografe de proces, dedicate analizelor automate ale proceselor industriale sau cromatografe preparative, destinate obinerii de substane pure n industria farmaceutic sau n biotehnologii.

Cromatografia de gaze (GC)

Aceast tehnic cromatografic este printre cele mai rspndite i totodat este prima dintre metodele de analiz cromatografic aplicat pe scar larg n analizele chimice. Compuii amestecului supus separrii nu trebuie s fie neaprat gaze, ci pot s fie i lichide sau chiar solide volatile. Substanele de analizat se introduc n coloana de separare, la o temperatur potrivit, prin intermediul unui dispozitiv de introducere a probei. Singura restricie este temperatura de vaporizare care uneori poate fi mai mare dect temperatura de descompunere a substanelor de analizat. n aceste cazuri se poate recurge la alte tehnici cromatografice care au ca eluent un lichid sau fluid supracritic. De asemenea, se mai pot realiza, nainte de introducerea probei n cromatograf, nite derivai (compui noi), volatili, utiliznd anumite reacii chimice specifice, procedeu denumit derivatizare. Uurina cu care se pune la punct o analiz nou, sensibilitatea sa, posibilitatea de automatizare precum i largile posibiliti de aplicare sunt avantajele principale ale acestei metode. Printre domeniile n care GC i-a cucerit un loc de prim rang sunt: petrochimia, industria farmaceutic, protecia mediului, analiza aromelor, igiena i criminalistica.

Cromatograful de gaze Instrumentul care realizeaz separrile i totodat analiza n GC poart numele de cromatograf de gaze. Funcionarea acestuia se poate nelege urmrind schema din fig. 1.

Schia prezint concis doar componentele principale. Astfel gazul purttor (eluentul), de exemplu hidrogenul sau heliul, prsete cilindrul sub presiune, 1, n care acesta se gsete iniial i ptrunde n coloan, la o presiune de intrare, cu ceva peste cea atmosferic (1-3atm), prin intermediul unui reductor 2. Apoi gazul se ramific (opional) prin dou conducte. O parte intr n coloan, n mod continuu iar cealalt ramur, direct n detector. Coloana 4, se afl ntr-o etuv - termostat, 3, izolat termic i prevzut n exterior cu un dispozitiv pentru introducerea probei (care de regul include i o microsering), notat S, etuv care mai este dotat n interior cu un ventilator V i cu un dispozitiv electric de nclzire - termostatare, R. n coloana cromatografic se produce separarea probei. Aceasta se introduce n coloan doar dup ce instrumentul este n regim de funcionare continu i a fost adus la temperatura de lucru. Dup ce prsete coloana 4, gazul purttor intr, antrennd pe rnd componentele separate, n celula de msur din detector de unde iese n atmosfer sau se colecteaz separat. Faza mobil n aceast tehnic este un gaz: hidrogenul, heliul, azotul sau argonul. Aceasta poate fi eliberat, prin intermediul unor ventile i regulatoare de presiune, din cilindri de gaze presurizate, fie obinute din generatoare (cazul N2 sau H2) - direct n

laborator. Gazul nu trebuie s conin urme de ap, oxigen sau dioxid de carbon care pot prejudicia fazele staionare. De aceea se mai intercaleaz filtre cu dublu rol: uscare, respectiv, reducerea oxigenului, dispozitive situate imediat dup sursa de gaz. n cazuri excepionale se pot utiliza i ali elueni cum ar fi CO2, Ne etc. Spre deosebire de cromatografia cu elueni lichizi, n GC natura gazului are o importan minor asupra selectivitii separrii deoarece gazul, practic, nu interacioneaz cu componentele probei sau cu suportul. Desigur c viteza optim nu este aceeai pentru toate gazele i se stabilete pe baza ecuaiei Van Deemter. Presiunea de la captul coloanei se regleaz cu ajutorul unui regulator de presiune i ventil ac. Introducerea probei se realizeaz cu aa-numitele seringi micrometrice (fig. 2), n cazul probelor care au volumele n domeniul 0.1-10l. Cu acestea, dup umplerea cu volumul de prob necesar, apsnd pistonul, se injecteaz coninutul prin cauciucul siliconic sau garnitura inelar a unui septum din dispozitivul de introducere a probei. Pentru gaze se folosesc fie seringi ceva mai mari, de 0.5ml, fie nite dispozitive speciale numite ventile pentru introducerea probei.

Dispozitivele pentru injecie au rolul de a permite introducerea seringii i totodat, de a provoca volatilizarea probei n curentul de gaz purttor ct mai aproape de intrarea n coloan. Aceste dispozitive sunt diferite n funcie de coloanele utilizate. De exemplu n coloanele cu umplutur i cele capilare, cu diametre de 530m - wide bore, se folosesc dispozitive cu volatilizare direct. Aceste dispozitive (fig. 3) au toate o inserie din sticl, nclzit, introdus ntr-un tub prin care trece gazul purttor, aflat la o temperatur suficient de ridicat pentru a permite volatilizarea probei simultan cu injectarea acestuia. Captul de sus al dispozitivului din fig. 3, situat n afara cromatografului, conine un septum, adic o pastil din cauciuc siliconic care permite ptrunderea acului ascuit al

seringii. Cellalt capt al dispozitivului este legat la coloana cromatografic prin intermediul unui racord filetat i a unei garnituri. Astfel, imediat dup injectarea probei, aceasta ptrunde n capul coloanei.

Pentru coloane capilare, care au debitele mult mai mici iar volumele introduse n coloane deosebit de mici, introducerea cu o sering a probelor, direct, ar compromite coloana definitiv. De aceea se folosesc nite dispozitive speciale cu ajutorul crora doar o mic fraciune din prob, cunoscut, intr n coloan iar restul este evacuat n atmosfer. Dispozitivele se numesc split/splitless iar fraciunea de prob introdus efectiv n coloan reprezint 1/20 pn la 1/500 din volumul injectat cu seringa. Incinta termostatat n care se afl coloana, numit etuv-termostat, are temperature reglabil ntr-un domeniu larg (40-450C) fiind foarte precis stabilizat (0.1C) i totodat ventilat, pentru o egalizare rapid a temperaturii. La anumite cromatografe, se pot

executa i programe de temperatur, adic nclziri controlate ale coloanei, n timp, pe parcursul efecturii analizei. Are loc n acest fel o volatilizare treptat a compuilor - la nceput ies cei volatili care migreaz rapid i la urm, cei mai puin volatili care migreaz foarte lent mrind mult durata analizei. Programele se stabilesc prin ncercri experimentale. Detectorii gaz cromatografici Detectorii sunt instrumentele analitice propriu zise din gaz cromatografe, avnd rolul de a sesiza n mod continuu, rapid i cu o mare sensibilitate, componentele din proba supus analizei. n corpul detectorului zonele cromatografice care ies separate din coloan, coninnd de preferin moleculele unei singure substane, se transform n semnale electrice (picuri). Pentru a se putea compara, ca performane, fiecare detector este caracterizat de nite mrimi fizice: specificitate, sensibilitate, zgomot de fond, drift, limit de detecie, constant de timp, reactivitate, efect asupra probei i altele, comune multor metode analitice. De asemenea, unii detectori distrug proba iar alii o las nealterat, permind separarea fizic a acesteia. Despre sensibilitate i limita de detecie am amintit n cursurile introductive cteva lucruri eseniale valabile i aici. n orice gaz cromatograf trebuie s existe cel puin un detector universal care s permit nregistrarea sigur a tuturor componenilor. n afar de acesta mai pot exista i ali detectori specifici, care mresc sigurana analizei componenilor de interes practic, deoarece rspund doar la anumite tipuri de molecule. Zgomotul de fond (fig. 4) apare din cauz c urmrindu-se ca metoda s fie ct mai sensibil, lucreaz la limita unde interfer zgomotul electronic cu cel dat de detector. Att zgomotul de fond ct i driftul, de regul exprimat n variaia semnalului, timp de o or, sunt prezentate schematic pe fig. 4. Se observ c zgomotul de fond const n perturbaii minuscule ale liniei de baz avnd cauze multiple iar driftul este devierea liniei de baz ntr - un timp dat (1 or) exprimat n unitile de msur uzuale ale semnalului nregistrat (mV, mA).

Domeniul dinamic liniar al detectorului reprezint domeniul n care semnalul variaz liniar cu concentraia (sau alteori cu debitul masei de component) ce trece prin detector. Acesta se msoar de la limita de detecie pn la nivelul superior de concentraie la care apar abateri de la liniaritate de peste 5%. Domeniul dinamic liniar se stabilete experimental prin construirea curbei de etalonare n urma injeciei unor cantiti cresctoare de component. Exist mari diferene ntre metodele de detecie (tabelul 1) dar toate au domeniul liniar mai ridicat dect multe dintre metodele de analiz optice. Cei mai utilizai detectori sunt n practica curent detectorii cu un domeniu liniar larg, anume: detectorul bazat pe conductibilitate termic (TCD), detectorul cu ionizare n flacr (FID), detectorul cu fotoionizare (PID) i cel cu captur de electroni (ECD). Se observ de asemenea c cei patru detectori acoper mpreun un larg domeniu de concentraii motiv pentru care gaz cromatografele comerciale au n dotare cel puin doi din aceti detectori.

Constanta de timp reprezint viteza de rspuns a instrumentului din momentul intrrii componentului n detector. Mai riguros, acesta reprezint timpul necesar rspunsului detectorului pentru a atinge 90% din valoarea limit final. Acest parametru include i ntrzierea datorat electronicii. Reactivitatea include i posibilitatea reinerii de componente ale probei sau provenite din aceasta prin degradare, prin adsorbie sau prin reacii chimice. Efectul aspra probei poate fi distructiv sau nedistructiv. n ultimul caz proba separat poate fi izolat. De exemplu, FID este un detector distructiv pe cnd TCD este nedistructiv. Detectorul bazat pe conductibilitate termic (catarometrul) Principiul a fost cunoscut i utilizat pentru analizoare de gaze nc din secolul trecut (XX). Catarometrul a rmas detectorul cel mai utilizat i n zilele noastre deoarece este simplu, nedistructiv, universal, are stabilitate bun precum i un domeniu larg de liniaritate (tabelul 1). Funcionarea sa se bazeaz pe diferena dintre conductibilitatea termic dintre component i eluentul gazos. Astfel fiecare gaz este caracterizat printr-o conductibilitate termic constant i diferit, de la un gaz la altul. Pentru detecie se utilizeaz de regul un montaj n punte Wheatstone. Curentul I, generat de sursa de tensiune Ui, se bifurc scurgndu- se prin cele dou brae ale punii. Tensiunea de ieire U0 depinde de diferena dintre R1 i R2. Astfel se observ c dac R1 = R2 atunci U0 = 0. Rezistena este un filament metalic spiral (asemntor cu cel din becurile electrice) izolat electric fa de incint, prin care circul gazul purttor. Detectorul (fig. 5) are dou celule: una de msur, R1, creia i variaz rezistena n funcie de componentul intrat i alta - numit celul de referin, R2, prin care trece doar gazul purttor (a crei rezisten rmne constant). Volumul celulelor difer, fiind cuprins ntre 2.5-100l. Cea mai ridicat conductivitate termic dintre toate gazele o au hidrogenul i heliul. De aceea acest detector este preferat cnd gazul purttor este unul dintre acestea.

Catarometrul (TCD) este de altfel singurul detector capabil s analizeze gazele permanente: N2, O2, CO, CO2, CH4 etc., motiv pentru care nu lipsete aproape din nici un gaz - cromatograf.

Detectorul bazat pe ionizare n flacr (FID) Acesta este unul din cei mai folosii detectori, n special datorit sensibilitii sale ridicate la compuii cu carbon, practic nelipsii din orice tip de gaz-cromatograf dedicat analizei substanele organice. Dei distruge proba, a fost detectorul care a consacrat definitive cromatografia de gaze. Funcionarea sa are la baz modificarea conductibilitii electrice a gazelor n prezena unor particule ncrcate (de regul molecule ionizate). Dac la presiunea i temperatura ambiant un gaz aflat ntre doi conductori este un izolator foarte bun, n momentul cnd ntre cei doi electrozi apar particule ncrcate electric, n urma deplasrii acestora n cmpul electric creat, apare un curent electric. Ionizarea moleculelor probei este intensificat de prezena unei flcri de hidrogen, care arde n aer ntr-o incint, flacr ce atinge temperaturi ridicate (20002200C). Cele mai slabe semnale, care nu pot servi unei analize chimice, le dau substanele alctuite din moleculele covalente simple: N2, O2, CO, CO2, H2O, CS2, NH3, CCl4, SiCl4,oxizi de azot, He i alte gaze rare. De aceea gazul purttor n cromatografia de

gaze este N2, He sau Ar, condiii n care detectorul d un semnal de baz minim, foarte stabil. Schia simplificat este prezentat n fig. 6.

n momentul apariiei in flacr a unor molecule organice, de exemplu hidrocarburi sau derivai, ionizarea duce la un semnal (curent) specific fiecreia dintre acestea. Curentul se transform n tensiune pe rezistena cu valoare ridicat R. i aici debitele gazelor trebuie s fie riguros constante. Sensibilitatea FID la fluctuaiile debitului i ale temperaturii sunt ceva mai mici dect la detectorul bazat pe conductibilitatea termic. n gazul purttor provenit din coloan, se dilueaz cu hidrogenul i aerul necesare i eventual cu un alt gaz inert (N2, Ar). FID (fig. 6) este confecionat adeseori din oel inoxidabil iar ntre corpul metalic i placa cilindric pozitiv, de deasupra sa, se aplic un potenial de polarizare de 100-300V, continuu. Rspunsul detectorului, depinde de numrul de molecule ionizate ce apar n flacr. Cele mai stabile rezultate se obin pentru alcani. Pentru alte substane semnalul n general scade cu creterea numrului de heteroatomi din molecul. De aceea, aici este nevoie de un factor de corecie specific pentru fiecare compus analizat. De regul se folosesc factori de corecie relativi, adic raportul dintre arie i unitatea de mas a unui compus de referin i rspunsul, pentru unitatea de mas a speciei chimice analizate.

Detectorul cu captur de electroni

Gazul purttor este n acest caz azotul. La ptrunderea n detector, acesta este ionizat de ctre o surs - radioactiv (sunt suficieni civa mCi furnizai de o surs coninnd 63Ni). Gazul, trece apoi printre doi electrozi, ntre care se asigur o cdere de tensiune de o sut de voli (fig. 7), de regul ntre un electrod central, pozitiv i corpul electrodului - negativ. n lipsa oricrei molecule organice n gazul purttor, exist un curent de baz redus datorat moleculelor de diazot (N2) - ionizate negativ. La apariia n detector a unei molecule organice M, care conine elemente electronegative (ca Cl sau F) - cu mare afinitate pentru electroni, aceasta va capta o parte dintre electronii radiaiei -. Va aprea, n consecin, o diminuare a curentului de recombinare a ionilor de semne contrare. Au loc aadar transformrile: N2 N2 + e-, Curent de fond M + e- M-; M- + N2+ M + N2, Diminuarea curentului de fond Se produc deci picuri negative, ceea ce nu deranjeaz cu nimic rezultatul final analiza chimic. Fiecare particul - poate genera prin ciocniri ntre 100 i 1000 electroni termici. Acetia avnd o mobilitate ridicat vor fi colectai de anod nainte de a se putea recombina cu ionii pozitivi de diazot. De aici rezult sensibilitatea mare a metodei. Curirea detectorului se face prin scoaterea electrodului +, pe care se depun o mic parte dintre moleculele organice ionizate. Acest detector este unul selectiv, adecvat pentru detecia compuilor halogenai (pesticide), avnd o liniaritate a rspunsului aproximativ. Detectorul bazat pe fotoionizare (PID) Detectorul bazat pe fotoionizare (PID) este un detector deopotriv sensibil i specific pentru hidrocarburi aromatice i cu heteroatomi (P i S) n molecul. Dispozitivul (fig. 8) se bazeaz pe capacitatea razelor UV de a ioniza moleculele organice, care prsesc coloana o dat cu gazul purttor. Analog cu metoda precedent, bazat tot pe ionizare, ionii produi sunt colectai pe doi electrozi, cel pozitiv fiind cel

demontabil (permind astfel ntreinerea periodic). Deoarece fraciunea moleculelor ionizate este mic, PID se consider un detector nedistructiv i poate fi nseriat cu ali detectori. Lmpile UV cu energii cuprinse ntre 5.6 i 11.7eV pot furniza o selectivitate suplimentar, peste 10.6eV practic toate moleculele organice ioniznd.

Ali detectori Mai exist i ali detectori, de exemplu detectorul fotometric n IR (simplu sau bazat pe transformata Fourier), detectorul cu flamfotometru destinat pentru detecia specific a compuilor cu sulf i fosfor, detectorul bazat pe emisie atomic cu plasm cuplat inductive sau detectorul cu ionizare termoionic (termoalcalin) - NPD - bazat tot pe o flacr, dar la care ntre flacr (cu hidrogen - aer) i arztor se introduce o pastil de sare alcalin, ceea ce provoac o cretere a intensitii semnalului de 100 de ori. Ultimul este un detector specific pentru azot i fosfor care este util, de exemplu, pentru analize de pesticide. Mai puin utilizai sunt detectorii cu absorbie atomic sau cel cu chemiluminescen. Dar cea mai spectaculoas intrare n domeniul detectorilor a realizat-o recent spectrograful de mas, care preia direct efluentul coloanei i n urma unei ionizri, fragmentele intr n spectrograful de mas propriu zis. Acest lucru a devenit posibil datorit calculatoarelor, care au permis prelucrarea volumului uria de date care se

obin pe aceast cale. Cuplajul denumit GC-MS este chiar mai sensibil dect detectorul bazat pe fotoionizare n UV (vezi tabelul 1).

Coloanele gaz cromatografice Coloanele sunt inima oricrui cromatograf de gaze i sediul separrii respectiv al corectitudinii rezultatului analizei chimice. Iniial au existat dou tipuri de coloane: (A) cu umplutur i (B) coloane capilare (fig. 9). Din anii 1990 a mai aprut un tip coloanele 530m (whide bore) - care dei nu mai sunt coloane capilare, n adevratul sens al cuvntului, pstreaz geometria i tipurile de umplutur ale coloanelor capilare. Coloanele cu umplutur -primele coloane cunoscute n GC - sunt confecionate din tuburi (oel, sticl sau alte materiale), avnd diametre cuprinse ntre 2-8 mm - cel mai frecvent de 1/8 oli (3.18mm) sau oli (6.35mm) - i conin adsorbeni, site moleculare sau un support inert pe care se gsete depus sau legat chimic un film subire dintr-o faz staionar. Raportul diametrelor coloanei i umpluturii trebuie s fie cuprins ntre 25 i 20. n ultimul timp au aprut i coloane cu umplutur de 1/16 oli. Umplutura coloanei const dintr-o anumit faz staionar - activ care se depune pe granulele umpluturii inerte i poroase, n afara coloanei (dup dizolvarea acesteia ntrun solvent potrivit ales) prin amestecare urmnd apoi evaporarea solventului ntr-o etuv Doar apoi umplutura se introduce n coloan i coloana se monteaz n cromatograf, prin intermediul unor racorduri filetate. Debitul gazului purttor la aceste coloane este cel mai mare, fiind cuprins ntre 10 i 40mLmin-1. Astfel de coloane sunt din ce n ce mai puin utilizate.

Fig. 9. Cele dou tipuri de coloane, cu umputur - A i capilare - B; coloanele 530 m (wide bore) nu difer ca geometrie de cele capilare Suportul poros (i totodat inert) este format dintr-un material solid, elaborat industrial, de form preferat sferic i cu o granulaie ct mai uniform (de exemplu 6080 mesh sau 80-100 mesh [109]). n raport cu suportul poros, faza staionar constituie doar 3- 25%. Cele mai rspndite sunt confecionate din pmnturi diatomitice (de ex. diversele tipuri de Chromosorb) dar multe sunt fabricate din silice (de ex. Spherosil). Acestea se modific chimic prin silanizare pentru a deveni inerte. Coloanele capilare sunt, la rndul lor, de cel puin dou tipuri: faz staionar depuse chiar pe peretele coloanei capilare (WCOT) faza staionar depus pe un suport solid, poros, aderent, format n prealabil pe peretele acesteia (SCOT). Au diametre 0.1-0.35mm i lungimi ntre 5-100m, separarea durnd ceva mai mult dect la cele cu umplutur. Cu ct coloana este mai lung durata analizei crete. Coloanele capilare se confecioneaz n ultimul timp mai ales din sticl de cuar. n exterior acestea

sunt mbrcate ntr-un polimer - poliamid - pentru a rezista mai bine la ocuri mecanice respectiv la coroziune (n acelai scop se mai folosete aluminiul). Coloanele sunt bobinate pe suporturi metalice avnd o form circular (fig. 10).

Fig. 10. Bobin de coloan capilar n forma care se folosete n gaz-cromatograf Coloanele WCOT conin faza staionar sub form de film subire n interiorul capilarei, grosimea acestuia variind ntre 0.05-5m. Faza staionar poate fi depus fizic sau chiar legat chimic de grupele -OH ale silicei hidratate. Si aceste coloane sunt disponibile deja comercial pentru majoritatea aplicaiilor curente. Eficacitatea unei astfel de coloane poate atinge 150mii talere teoretice. nlimea echivalent a unui taler teoretic, H, n cazul acestor tipuri de coloane, are o expresie deosebit de ecuaia lui Van Deemter i a fost descoperit de Golay, anume:

unde termenul A lipsete iar CG este coeficientul de difuzie al speciei moleculare separate n faza gazoas, CL, fiind acelai coeficient pentru faza lichid. Coloanele 530m sau wide bore sunt confecionate tot din silice (SiO2) avnd lungimi cuprinse ntre 5-50m. Le-am putea denumi coloane semicapilare deoarece pstreaz caracteristicile coloanelor capilare dar dimensiunile nu mai sunt apropiate de dimensiunea firelor de pr. Debitul prin aceste coloane atinge 15mLmin-1 (adic intr n domeniul celor cu umplutur), dar au performane superioare acestora. Fazele staionare sunt i ele de mai multe feluri: polare, de exemplu polietilenglicoli, nepolare de exemplu cauciucuri siliconice, intermediare i n sfrit cele cu puni de hidrogen sau cele specifice (de exemplu cele destinate separrii amestecurilor racemice). Fazele staionare sunt lichide sau solide. Fazele staionare lichide sunt formate din lichide nevolatile avnd o compoziie chimic foarte variat (peste 100 de tipuri). Pentru a se putea lega chimic numrul acestora a fost restrns la cele care pot, prin sintez, s duc la un film grefat pe partea intern a coloanei. La ora actual se pot distinge dou tipuri de compui preferai: polisiloxanii i polietilenglicolii fiecare ntr-o varietate care s permit modificarea polaritii acestora. Formulele acestora sunt ilustrate pe fig. 11.

Pentru separarea enantiomerilor (izomeri optici cu exact aceeai structur chimic) sau impus recent fazele staionare formate din ciclodextrine. Toate aceste faze au o temperatur minim i una maxim de utilizare, deoarece n partea de jos a acestor limite, echilibrele care au loc la retenie sunt deranjate, iar la partea superioar are loc un nceput de degradare a fazei care deranjeaz detecia, respectiv uniformitatea separrii.

Fazele staionare solide sunt constituite din diferii adsorbeni: silicagel sau alumin (dezactivate cu sruri minerale), sticle poroase, sau polimeri poroi iar n ultimul timp chiar carbon poros. Acestea au diferite denumiri comerciale: Site moleculare, Porapak, Carbopak, PoraPLOT i sunt folosite mai ales pentru separri de gaze permanente sau compui foarte volatili H2O, hidrocarburi etc. Astfel de materiale se pot depune i pe pereii interiori ai coloanelor capilare - coloane denumite n literatura internaional coloane PLOT (adic coloane deschise cu suport poros = Porous Layer Open Tubular, l. engl.) Analiza calitativ i cantitativ n GC Analiza calitativ n GC analiza calitativ se poate realiza fie pe baza utilizrii timpilor de retenie ajustai, tR' fie pe baza volumelor de retenie ajustate, VR' msurate experimental n cazul probei necunoscute i comparate cu valorile similare ale unor probe cunoscute. Deci pentru orice analiz calitativ este nevoie de substana pur, lucru nu ntotdeauna accesibil. De aceea cuplajul cu spectrometria de mas a depit acest neajuns, devenind una dintre cele mai bune tehnici de analiz calitativ. n cazul LC eluentul, un lichid, este necompresibil i n consecin, debitul acestuia nu se va modifica la nceputul coloanei fa de sfritul acesteia. n cazul CG, ns, presiunile iniial, pi i cea final, pf, fiind diferite, este necesar introducerea unei corecii a volumului de retenie msurat, cu ajutorul unui factor, j, numit factorul de corecie corespunztor cderii de presiune. Acesta se poate calcula din ecuaia dat n cele ce urmeaz, fr deducie:

n care cu p s-a simbolizat raportul presiunilor, iniial (pi) respectiv final (pf), adic p = pi/pf.

Cu ajutorul acestei mrimi semnale de retenie din diverse condiii experimentale se pot face comparabile n analiza calitativ prin CG. Volumul de retenie corectat, VR definit prin produsul: VR0 = jVR unde j este factorul de corecie de mai sus iar VR - volumul de retenie. Volumul de retenie net, VN, este volumul de retenie ajustat dar corectat i pentru cderea de presiune VN = jVR' Aceste volume sunt utilizate cu precdere n analiza calitativ fiind mai sigure dect volumul de retenie simplu mai ales cnd nu se mai recurge la alte tehnici. Volumul de retenie specific, Vg. Prin mrirea cantitii de faz lichid staionar, fie prin utilizarea unei cantiti (grosimi) mai mari fie prin utilizarea unei coloane mai lungi, crete volumul de retenie. Pentru a se lua n considerare i acest factor se definete volumul de retenie specific (exprimat de regul n mL/g) cu ecuaia de definiie: Vg = 273VN/(TcmL) unde Tc este temperatura absolut a coloanei, VN - volumul de retenie net al componentului i mL - masa fazei staionare lichide din coloan. Dar pentru c toi aceti parametri depind, n mare msur, de o serie de condiii experimentale ca temperatura, debitul gazului purttor, cantitatea de faz lichid etc, pentru identificarea substanelor se recurge n ultimul timp la utilizarea indicilor de retenie Kovts. Aceti indici, notai n continuare cu I, sunt practic independeni de factorii amintii. Astfel, pentru orice substan de analizat calitativ se caut o pereche de n-alcani care dau picuri situate ca timp de retenie unul nainte, altul dup substana amintit. Din cele trei valori tR' msurate se calculeaz valorile I. Indicii de retenie Kovts exprim retenia relativ a unei substane oarecare, fie cunoscut, fie necunoscut, raportat la cea a unor alcani normali, luai drept substane de referin (sau etalon). Formula de calcul, propus de autorul metodei, pentru indicii amintii este:

unde tR,X', tR,n' i tR,n+1' sunt timpii de retenie ajustai pentru substana necunoscut X respectiv alcanii cu n respectiv n+1 atomi de carbon. Valoarea n se alege astfel ca tR,n' < tR,X' < tR,n+1' adic, n aa fel ca timpul de retenie al substanei necunoscute s fie cuprins ntre timpii de retenie ai celor doi alcani. De exemplu, benzenul are timpul de retenie cuprins ntre cel al n-hexanului i al n-heptanului (ca i cum ar avea cam 6,5 atomi de carbon). Schimbnd condiiile experimentale se schimb tR', respectiv VR', dar niciodat valoarea indicilor de retenie I. Metoda se bazeaz pe faptul c practic nu exist substan chimic separat prin GC creia s nu i se poat asocia o pereche de n-alcani care au timpul de retenie, unul mai mare i altul mai mic dect substana respectiv. Pentru seria omoloag a alcanilor este respectat ecuaia: log(tR') = an + b unde a i b sunt nite constante numerice gsite pe cale experimental, care sunt aceleai pentru o coloan i condiii fizico-chimice date. Se observ c n formula valorii I, termenul b se va reduce i factorul a se va simplific. Astfel, indicele Kovts, I, va depinde doar de numrul aparent de atomi de carbon ai substanei respective - constant. Experimental se procedeaz astfel: dup cteva ncercri preliminare se injecteaz mpreun cei doi alcani, cu Cn respectiv Cn+1 mpreun cu substana de analizat, X iar dup msurarea pe cromatogram a valorilor tR' pentru toate trei picurile componentelor amestecului, prin nlocuirea acestora n formula precedent sau pe cale grafic, se obine indicele Kovats, I (v. fig. 12).

Analiza cantitativ n anumite condiii (pe poriuni liniare ale rspunsului detectorului, condiii experimentale identice etc.), suprafaa dintre linia de baz i curba picului cromatografic - semnalul analitic - este proporional cu cantitatea de component injectat. Deci, pe domeniul liniar al detectorului, oricare ar fi acesta, exist relaia: Masa injectat = K(Aria picului) unde K este o constant numeric. Aceast proprietate poate servi pentru construirea unei curbe de etalonare fiind general valabil att n cazul GC ct i n celelalte tehnici cromatografice. Se poate i aici aplica metoda adausului standard, mai ales la domenii liniare largi. Pentru valori tR' mici, cnd picurile sunt i ascuite i nguste, se poate utiliza n locul ariei nlimea sa - cu rezerva unei pierderi din precizia determinrii. Amintim n cele ce urmeaz cteva practici de baz legate de analiza cantitativ folosind ariile picurilor.

Metoda factorului de rspuns Cnd se dovedete c detectorul rspunde la fel de bine pentru fiecare component al amestecului, aria relativ a picurilor este proporional cu cantitatea diverselor componente. Aceast condiie este ndeplinit extrem de rar. De exemplu, sensibilitatea detectorului bazat pe conductibilitatea termic a gazelor depinde de natura substanelor iar a celui bazat pe ionizarea n flacr are rspunsul dependent de numrul de atomi de carbon din molecul. Pentru aceste cazuri este necesar ca toi componenii analizai s aib determinai n prealabil cte un factor de rspuns, F. Factorii de rspuns se obin cu ajutorul formulei:

unde cu CX i CS s-au notat concentraiile componentelor X respectiv a substanei etalon (standard), S, iar AX i AS sunt ariile picurilor corespunztoare acestora. Semnificaia fizic a factorului de rspuns este aceea c indic de cte ori este mai mare raportul concentraie per semnal analitic n cazul unui component al probei fa de etalonul ales. Metoda standardului (etalonului) intern De multe ori apar fluctuaii neateptate n condiiile experimentale de la o prob la alta. Pentru evitarea surprizelor de acest gen (i a erorilor aferente analizelor) se utilizeaz, analog cu alte metode instrumentale, un standard intern, diferit de substana de analizat. Acesta este o substan pur cunoscut, introdus intenionat n amestecul care constituie proba, i totodat aflat pe cromatogram n vecintatea componentelor de analizat, de fiecare dat n aceeai cantitate. Motivul introducerii este tocmai acela c raportul dintre ariile unui pic oarecare i standardul intern este constant, indiferent de

debitul gazului sau al altor perturbaii uoare ale condiiilor experimentale, tocmai datorit asemnrii fizice dintre substana etalon i prob. Analitic, concentraia necunoscut se calculeaz, n acest caz, n funcie de standardul intern i proba cunoscut:

unde CX,N este concentraia substanei X n proba de analizat (necunoscut), CX,S concentraia substanei X, ce urmeaz a fi analizat, n proba etalon (cunoscut), AX,N aria picului substanei X n proba de analizat, ASI,N - aria picului corespunztoare standardului intern din proba necunoscut, ASI,S - aria picului standardului intern n proba etalon. Se observ c raportul ASI,N /ASI,S, apropiat de unu, corecteaz micile abateri care apar la analiza probei necunoscute n timpul cromatografierii, n raport cu proba cunoscut, de concentraie CX,S (denumit prob etalon i executat pe o alt cromatogram, separat). Ariile ce intervin n raportul amintit se refer la aceeai cantitate din aceeai substan standardul intern - coninut att n proba necunoscut ct i n cea cunoscut. Determinarea ariei picurilor Determinarea ariei picurilor i.e. semnalul analitic al metodei - se poate realiza prin mai multe procedee, multe dintre acestea mai mult de importan istoric: 1. Metoda triangulaiei bazat pe aproximarea picului cu un triunghi i calcularea ariei prin nmulirea limii picului la jumtate din nlimea sa, w1/2, cu nlimea acestuia, h (picul se consider gaussian). 2. Metoda planimetrrii, se bazeaz pe msurarea ariei propriu zise. 3. Metoda integratorului - utilizeaz un aparat, numit integrator, ce d un semnal proporional cu aria de sub pic.