Tem genetic

Reacia de polimerizare n lan (PCR):este definit ca o metod de sintez i amplificare enzimatic in

vitro a unor secvene de ADN -Reacia PCR este contituit din serii de trei pai eseniali, care definesc un ciclu PCR: 1. 2. 3. denaturarea ADN matri dublu catenar alinierea perechilor de primeri la matricele de ADN monocatenar extensia primerilor sub aciunea ADN polimerazei

-ADN ce urmeaz a fi amplificat se afl n cantitate foarte mic i este utilizat ca matri pe un sector limitat (ADN int), delimitat de doi primeri, cu orientare opus, unul pe catena matri 5' -3 iar cellalt pe catena matri 3'-5'. Primerii sunt reprezentai de oligonucleotide sintetizate ,,in vitro", reprezentnd piese scurte de ADN monocatenar, de numai 20-50 nucleotide lungime. Aplicaii ale tehnicii PCR Identificarea si analiza mutatiilor in ADN. Detectarea mutatiilor punctiforme cunoscute si necunoscute, prin digestie cu endonucleaze de restrictie a produsului amplificat. Detectarea polimorfismelor ADN pentru depistarea indirecta a mutatiilor producatoare de boli. Pe baza metodei PCR au fost elaborate programe de screening al familiilor in care exista predispozitie la diabet zaharat, boli coronariene, hipertensiune arteriala, precum si unele forme de cancer. Rol important in diagnosticul prenatal si presimptomatic al bolilor monogenice (boli cauzare de o sigura mutatie genica)

Analiza citogenetic-Cariotipare-FISH
Principiul acestei metode de citogenetica moleculara este hibridizarea prin complementariatea a unei sonde de AND monocatenar de cca kb cu o anumita regiune a unui cromozom. Sonda este marcata fie direct prin incorporarea unui nucleotid fluorescent fie indirect prin incorporarea unui nucleotid modificat ce contine o molecula reporter (precum bioti na sau digoxigenina) care e recunoscuta de un ligand specific (streptavidina pt biotina si Ac specifici pt digoxigenina) conjugat cu un fluorocrom. Sondele pot fi clasificate in tipuri in functie de aplicatia practica: - sonde specifice unui locus dat pt detectarea deletiilor sau duplicatiilor submicroscopice; daca sonda nu se fixeaza pe zona cromozomica careia ii corespunde(absenta semnalului), atunci se poate concluziona deletia acestei zone -sonde centromerice pt identificarea centromerului -sonde telomerice -sonde specifice unui cromozom care permit colorarea par ticulara a unui/unor cromozom/i.

Tehnica Microarray Principii Generale

Tehnica ADN MICROARRAY reprezinta o tehnologie multiplex utilizata in studii de biologie moleculara si medicina. S-a dezvoltat din metoda de analiza SOUTHERN BLOTTING fragmente de ADN sunt atasate pe un substrat si sunt hibridizate cu sonde marcate care reprezinta fragmente de gene sau gene integrale Spoturile pot fi fragmente scurte de gene SONDE utilizate la hibridizarea ADNc TINTA, in conditii foarte bine definite Complexele SONDA-TINTA pot fi vizualizate si cuantificate pe baza detectiei in fluorescenta a unui fluorofor marker fluorescent atasat tintei in vederea cuantificarii relative a abundentei acizilor nucleici existenti in proba tinta Tehnica ADN microarray poate fi utilizata in: Detectarea single nucleotide polymorphisms (SNPs) Detectare ADN (studii de hibridizare genomica comparata) sau ARN (detectat ca ADNc dupa realizarea revers transcrierii) care poate fi sau nu implicat in traducere de proteine Masurarea nivelului de expresie genica pe baza ADNc poarta denumirea de ANALIZA DE EXPRESIE GENICA Microcipurile microarray traditionale reprezinta o colectie de spoturi ADN microscopice atasate de o suprafata solida sticla, plastic sau silicon - BIOCIPURI

Schema experiment microarray

Etapa de hibridizare se realizeaza cu 2 probe de ADNc care urmeaza a fi comparate (probe de tesut bolnav / tesut sanatos; celule tratate / celule netratate) marcate cu doi fluorofori diferiti Markeri fluorescenti : Cy3, cu lungime de unda de emisie 570 nm (corespunzator spectrului cu lumina verde), si Cy5 cu lungime de unda de emisie 670 nm (corespunzator spectrului cu lumina rosie) Cele doua tipuri de probe - Cy-labelled cDNA sunt amestecate si hibridizate pe acelasi cip microarray care va fi scanat pentru a analiza intensitatea semnalului fluorescent a celor doi fluorocromi Intensitatile relative ale semnalului fluorescent a celor doi markeri pot fi analizate ca raport in vederea identificarii genelor cu expresie stimulata sau inhibata - up-regulated sau down-regulated

BANDAREA CROMOZOMILOR
Identificarea cromozomilor se realizeaza cu ajutorul tehnicilor de bandare = colorare cu anumite substante. Bandarea se bazeaza afinitatea diferita a portiunilor cromozomiale pt un colorant (Giemsa). Astfel clorhidratul de quinacrina manifesta afinitate fata de AND bogat in A-T care maresc intensitatea fluorescentei in timp ce G-C o reduc. S-a observat ca si gradul de condensare al cromatinei influenteaza intensitate coloratiei benzilor. Fiecare cromozom are o succesiune (benzi G) specifice de benzi , generate de prezenta eucromatinei, sau heterocromatinei ca si de compozitia chimica de baze azotate a ADN. Benzile: sunt identice in cromozomii omologi; nu se modifica , fiind la fel in orice fel de celula , tesut; Importanta bandarii: Bandarea Q: benzile Q identifica regiunile satelitilor cromozomilor acrocentrici; polimorfismul acestor regiuni si al cromozomului Y poate fi detectat prin bandare Q; Bandarea G: a devenit cea mai uzuala tehnica pentru cromozomii umani Benzile G se obtin prin digestie enzimatica controlata cu tripsina urmata de colorarea Giemsa. Bandarea R: se obtine prin denaturare termica controlata ( 85) a preparatelor intr-o solutie salina inaintea colorarii cu acridin oranje benzile G negative devin prin aceasta tehnica benzi R pozitive si invers Bandarea T: evidentiaza telomerele Bandarea C: Evidentiaza centromerii cu exceptia cromozomului Y, la care banda intens colorata e localizata in regiunea distala a bratului q. identificare perechilor de omologi; recunoasterea restructurarilor cromozomiale; remanieri cromozomiale translocatii aditii deletii inversii