Biotehnologia Obtinerii Preparatelor Enzimatice Culturi Starter de Microorganisme

Capitolul 1. Definiia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi starter de microorganisme.
1.1 BIOTEHNOLOGII ALIMENTARE DEFINIIE. OBIECTUL BIOTEHNOLOGIEI
Biotehnologia este o tiin complex, ce se caracterizeaz prin utilizarea integrat a biochimiei, microbiologiei, biologiei celulare i a ingineriei genetice. (fig. 1.1).
enzimatice proprii esuturilor egetale i animale sau a celor elaborate de microflora de contaminare. ,nzimele proprii esuturilor egetale i animale sunt eseniale %n transformrile pe care le ofer produsele agroalimentare! maturarea fructelor i legumelor, cerealelor i finurilor sau diferitelor produse alimentare pe baz de cereale germinate, maturarea br*nzeturilor, maturarea crnii. ,nzimele pot a ea %ns i rol deteriorati cu implicaii %n modificarea caracteristicilor senzoriale i a alorii nutriti e a materiilor prime agroalimentare p*n la prelucrarea termic a acestora. De asemenea, rolul microorganismelor este hotr*tor, unele dintre ele a *nd aciune duntoare, altele a *nd rol esenial %n obinerea unor produse alimentare datorit aciunii lor fermentati e! produse lactate acide, br*nzeturi, bere, in, spirt, p*ine, salamuri crude, alimente fermentate din cereale i leguminoase. -icroorganismele inter in i %n fermentarea unor produse egetale! arza, murturi, msline, castra ei, cacao, etc. Biotehnologiile %n industria alimentar s"au dez oltat impresionant prin folosirea enzimelor exogene (industria laptelui, berii, spirtului, amidonului, crnii, sucurilor de fructe, zahrului, panificaiei, etc.) i a culturilor starter (industria berii, laptelui, crnii, panificaiei, etc.) (a toate acestea trebuie s a em %n edere obinerea de metabolii secundari (alcool etilic, aceton, acizi organici, aminoacizi, etc.) prin folosirea de microorganisme precum i de biomas alimentar i fura)er, etc. .u a)utorul enzimelor microorganismelor se pot accelera procesele biochimice, se pot perfeciona procesele de producie, se poate %mbunti calitatea produselor alimentare i se poate mri gradul de di ersificare a produciei alimentare.
////////////////////////////////////////////////// ////////////////////////////////////////////////// ////////////////////////////////////////////////// ////////////////////////////////////////////////// //////////////////////////////////////////////////
Figura 1.1. Biotehnologia o tiin complex Denumirea de biotehnologie pro ine de la cu intele greceti! "#Bios$ care %nseamn ia, "#&ehni'os$ care %nseamn tehnici i "#(ogos$ care %nsemn #studiu al$. Biotehnologia este aplicat in di erse domenii, cum ar fi! agricultur, industria alimentar, producie industrial, mediu i medicin. Biotehnologia alimentar se refer la prelucrarea industrial a diferitelor materii prime cu a)utorul microorganismelor i enzimelor proprii sau a unor ageni biologici (microorganime, enzime) adugai %n scopul realizrii unor produse sau a ameliorrii unor procese tehnologice. Rolul biotehnologiei este co *ritor %n industria alimentar. +n fapt, industria alimentar este o biotehnologie, deoarece materiile prime agroalimentare sunt produse biologice i prin urmare conser area lor p*n la consum, %n stare proaspt (cazul fructelor i legumelor) sau p*n la industrializare (cazul tuturor produselor agroalimentare) implic controlul acti itii
Capitolul 1. Definiia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 2 Culturi starter de microorganisme. ////////////////////////////////////////////////// 3.1idrolaze ce catalizeaz scindarea hidrolitic (implic apa) a legturilor chimice co alente5 //////////////////////////////////////////////////
////////////////////////////////////////////////
4.(iaze, care catalizeaz scindarea legrutilor chimice altfel dec*t prin hidroliz sau oxidare5 <.7zomeraze ce catalizeaz rearan)area structural a moleculelor5 :.(igaze sau sintetaze care catalizeaz formarea de noi legturi te tip ."=, .";, ."., .">, cu consumare de 0&?.
1.2. PREPARATE ENZIMATICE 1.2.1. Aspecte generale ,nzimele sunt din punct de edere structural proteine constituite din aminoacizi, iar din punct de edere funcional acioneaz ca nite biocatalizatori biologici care au rolul de a permite realizarea unor reacii cu o itez mrit. ,nzimele sunt utilizate drept catalizatori %n condiiile %n care exist i catalizatori chimici, deoarece prezint urmtoarele a anta)e! 1. 0u capacitatea de a cataliza reaciile chimice %n condiii bl*nde de temperatur, p1, presiune. 0ceasta permite un consum mai redus de energie i nu necesit echipamente scumpe rezistente la coroziune. 2. ,nzimele sunt catalizatori specifici, deseori stereoselecti e, care nu conduc la obinerea de produi de reacie secundari nedorii. +n aceste condiii nu sunt necesare cheltuieli mari pri ind rafinarea i purificarea produsului ce urmeaz a fi fabricat. 3. .omparati cu procesele chimice, enzimele sunt din punctul de edere al mediului compui biodegradabili care nu necesit costuri semnificati e de epurare. 4. 0numite enzime nu sunt limitate numai la aciunea %n mediul apos, put*nd aciona i la interfaa dintre dou faze, ap! sol ent organic sau ap!ulei etc. &otui exist i o serie de deza anta)e! " " au stabilitate limitat5 de cele mai multe ori sunt utilizate industrial o singur dat.
Utili !ri al" "# i$"l%r &# i#'u(tri"! ?rincipalele domenii %n care enzimele i"au gsit utilizri sunt! " " " " " " " @abricarea unor produse prin transformarea enzimatic a amidonului5 (a fabricarea altor produse alimentare ! produse lactate, bere, sucuri, in, panificaie5 +n compoziia detergenilor5 7ndustria textil, h*rtiei i a fura)elor pentru animale5 >inteza catalitic a unor substane chimice5 0naliza terapie5 alimentelor, diagnoz chimic i
7nginerie genetic5
.lasificarea enzimelor. ,nzimele se clasific conform sistemului stabilit de .omisia de ,nzime a 6niunii 7nternaionale de Biochimie (1898). .onform acestei clasificri exist : clase principale grupate conform cu reaciile pe care le catalizeaz astfel!
Biotehnologia preparatelor enzimatice este un domeniu de baz al biotehnologiei, a *nd drept scop studierea tehnicilor de obinere a preparatelor enzimatice folosind materii prime de origine animal, egetal i microbian, sub form liber sau imobilizat pentru a fi folosite ca ageni biologici %n industria alimentar, industria fura)elor, industria textil, detergenilor, farmaceutic, cosmetic, chimic, etc. ?rin utilizarea preparatelor enzimatice, tehnologiile tradiionale se transform %n biotehnologii, de enind mai eficiente i mai puin poluante. +n figura 1.2. este prezentat ponderea de utilizarea a preparatelor enzimatice %n diferite ramuri.
1.
;xidoreductaze care catalizeaz reacii de oxidoreducere, transfer de atomi de hidrogen, oxigen sau electroni5 &ransferaze care catalizeaz transferul unei grupri de pe o molecul pe alta5
2.
Capitolul 1. Definiia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi starter de microorganisme. Pr"*arat" "# i$ati+" li+-i'"
Alte domenii; " Morarit, ani!icatie; 5 Sucuri, vinuri; 10 Bere; 4 Amidon; 30
1. Preparate enzimatice brute, form sub care se li reaz enzimele extracelulare (eliberate de ctre microorganisme %n mediul de cultur %n timpul fermentaiei). 2. Preparate parial purificate, %n care se adaug conser ani pentru a le mri stabilitatea %n timp. 7n tabelul de mai )os sunt prezentate principalele tipuri de preparate enzimatice, sursele din care se obin i aplicaile %n industria alimentar.
Distilate; 5 Produse lactate; 5
Detergenti; 35
Figura 1.2. ?oderea utilizrii preparatelor enzimatice 0a cum se obser din datele de mai sus, cea mai mare pondere o are utilizarea %n industria alimentar, urmat de industria detergenilor. +n figura 1.3. sunt prezentate principalele tipuri de preparate enzimatice produse pe plan mondial. .ea mai mare pondere o au preparatele de proteaze urmate de amilaze.
1.2.). .ur(" '" "# i$" ?reparatele fabricate la scar industrial folosesc trei tipuri de surse! esuturi animale i egetale sau microorganisme. Sursele animale sunt reprezentate de subprodusele din industria crnii (ficat, pancreas, inim, rinichi, creier, mucoas stomacal i intestinal). 6tilizarea acestr surse este pe scar din ce %n ce mai redus, fiind %nlocuite de sursele microbiene, deoarece sursele animate prezint o serie de deza anta)e, cum ar fi! producia limitat, apariia unor boli cum ar fi encefalopatia spongiform la bo ine. ?rincipalele enzime de origine animal care se obin sub form de preparate sunt chimozin (renina) care se extrage din stomacul de miel sau iei care se utilizeaz pentru coagularea laptelui la fabricarea br*nzeturilor. ; alt enzim este "amilaza pancreatic care are utilizri %n industria farmaceutic. Sursele egetale sunt reprezentate de semine(germinate sau negerminate), rdcini, fructe, se , latexuri, frunze. 6tilizarea surselor egetale pentru obinerea preparatelor enzimatice ridic o serie de probleme, cum ar fi! prezena unor substane potenial duntoare sntii omului (ex. .ompuii fenolici) sau a unor compui toxici de comtaminare. 0ceste deza anta)e face ca sursele de origine egetal s fie destul de puin utilizate. ?rincipalele enzime obinute din surse egetale sunt. " papaina, proteaz obinut din latexul fructelor de Caryca Papaia. ,nzima este utilizat pentru tenderiBarea crnii sau %n industria berii5 " ficina, proteaz obinut din latexul fructului de smochin (Ficus carica), utilizat pentru degradarea proteinelor miofibrilare.
Pectina#e; 10 Protea#e !ungice; 4
Alte en#ime; 4
&luco#i#omera#e; 14 Amila#e !ungice; 1%
Amila#e $cteriene; 10 Protea#e $acteriene; 35 Protea#e de coagulare; 5
Figura 1.). ?rincipalele tipuri de preparate enzimatice. 1.2.2. Tipuri de preparate enzimatice. ?reparatele enzimatice se comercializeaz sub di erse forme i grade de purificare! Pr"*arat" "# i$ati+" (%li'", 1. Preparate enzimatice brute, sub form de pulbere, obinute prin uscarea i mcinarea mediului fermentat5 2. Preparate sub form cristalizat, enzime pure utilizate preponderent %n chimia analitic i ingineria genetic5 3. Preparate liofilizate, care sunt enzime purificate %n amestec cu substane crioprotectoare, care sunt urcate %n acum la temperaturi de "2A......"<A..
Capitolul 1. Definiia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 4 Culturi starter de microorganisme. " bromelina, proteaz obinut din sucul de ananas ( condiiilor optime fizice i chimice pentru producerea de Ananas comosus ), folosit pentru hidroliBa proteinelor enzime5 colagenice. " proprietile enzimelor i specificitatea de aciune 0lte enzime de origine egetal sunt lipoxigenaza din difer cu natura microorganismelor productoare, astfel soia i complexul enzimatic din mal ( amilaze, industrial se pot obine preparate care corespund proteaze, glucanaze). ?reparatele enzimatice ale acestor %ntocmai scopului dorit. enzime nu sunt purificate, fiind sub form de fin de " preparatele enzimatice obinute pot a ea acti iti soia sau de mal. diferite cu predominana unei acti iti. -icroorganismele reprezint principala surs pentru 1.2./. T"-#%l%gii '" %01i#"r" a *r"*arat"l%r obinerea de preparate enzimatice. 0 anta)ele utilizrii "# i$ati+" microorganimelor constau %n! >chema tehnologic general de obinere a preparatelor " microorganismele se pot obine %n cantiti mari enzimatice este prezentat %n figura &ehnologia de (biomas) prin culti are %n instalaii speciale pe medii de obinere a preparatelor enzimatice implic operaiile cultur ieftine (tr* de gr*u, extract de porumb, indicate %n schema prezentat %n fig. 1.4. din care rezult melas, roturi de soia sau floarea soarelui, zer), ca preparatele enzimatice pot fi obinute sub form de! " ciclul de dez oltare al microorganismelor este foarte " preparate enzimatice brute"uscate5 scurt fa de cel al plantelor sau animalelor5 " preparate enzimatice brute C lichide concentrate5 " producia de enzime de ctre microorganisme poate fi " preparate enzimatice purificate C concentrate, respecti mrit prin selectarea i utilizarea de tulpini mutante, i uscate. %nalt performante (producti e) i prin stabilirea
"
Figura 1.4. >chema tehnologic general de obinere a preparatelor enzimatice
Capitolul 1. Definiia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. ' Culturi starter de microorganisme. ?rocesele biotehnologice de obinere a preparatelor 2 a %t a#%rga#i+, amoniac, sruri de amoniu, sulfatul microbiene sunt complexe, realizarea lor presupune de amoniu, forfatul acid de diamoniu, parcurgerea a trei etape! 2 a %t %rga#i+! hidrolizate proteice de cazein, soia, 1. Pregtirea mediului de cultur, prin prelucrarea carne etc. mecanic i fizico chimic a materiilor prime ce intr %n .ur(" '" i%#i a#%rga#i+i. ?entru dez oltarea compoziia mediului de cultur (fermentati ). 0ceast microorganimelor %n timpul procesului de fermentaie etap presupune operaii de dozare, mrunire, este necesar prezena ionilor anorganici, acetia solubilizare, sterilizare etc. reprezint circa ED din substana urcat a a celulelor 2 !tapa biologic care const %n obinerea culturilor microbiene. ?rincipalii ioni anorganici care trebuie s starter intermediare i a culturii de producie, urmat de fie prezeni %n mediul de cultur sunt! macronutrienii etapa fermentati prorpiu"zis. (azot, fosfor, sulf, potasiu, i magneziu) i micronutrienii (sodiu, calciu, clor, fier, cobalt, zinc, 3. !tapa de separare" purificare #i standardizare a molibden, cupru, mangan, nichel i seleniu). enzimelor. .ur(" '" 3a+t%ri '" +r"4t"r". @actorii de cretere sunt compui organici a cror prezen %n mediul de cultur A. Pr"g!tir"a $"'iului '" +ultur! este necesar %n cantiti mici, a *nd un rol catalitic sau structural pentru microorganisme. @actorii de cretere $aterii prime utilizate pentru fabricarea mediilor de includ itaminele, purine, pirimidine, nucleotide i cultur. nucleozide, aminoacizi, acizi grai, steroli i poliamide. -ateriile prime trebuie s asigure principalii nutrieni ?rincipalele itamine necesare ca factori de cretere microorganismelor %n ederea dez oltrii lor %n timpul sunt! biotina, acid pantotenic, acidul nicotinic, tiamina. fermentaiei. .ur(" '" +ar0%#. ?rincipala surs de carbon (surs de energie) pentru microorganisme o constituie glucidele, sub form de glucoz, fructoz, galactoz care sunt uor asimilabile, %n timp ce maltoz, zaharoza i lactoza sunt asimilate doar dac microorganismele posed enzime capabile s le transforme %n monoglucide. ?oliglucidele pot fi utilizate doar de ctre microorganismele apte s sitetizeze enzimele care s le hidrolizeze extracelular %n monoglucide capabili s difuzeze prin membrana celular. .a surse de carbon %n reetele mediilor industriale se folosesc urmatoarele! " Melasele care pro in de la rafinarea zahrului. " Extractul de porumb" este reprezentat de extractul obinut din industria amidonului dup ce sufer o concentrare p*n la <AD >.6. " Leiile sulfitice pro in din industria h*rtiei ca urmate a transformrii masei lemnoase %n pulp celulozic sub aciunea bisulfitului de calciu. .ur(" '" a %t. 0zotul din mediul de cultur are rol anabolic, particip*nd la biosinteza proteinelor structurale, a enzimelor i acizilor nucleici. ?rincipalele surse de azot sunt! Tratementul termic al mediilor de cultur. ?entru buna desfurare a procesului de fermentaie este necesar culti area microorgnimelor pe un mediu de cultur steril pentru a pre eni contaminarea. >terilizarea mediului de cultur se poate realiza direct %n bioreatorul %n care se realizeaz fermentaia sau %ntr"un as sub presiune separat, ulterior fiind transferat %n bioreactor. B. Eta*a 0i%l%gi+!. %binerea culturilor starter de producie ?entru producerea enzimelor, fermentaiile industriale se desfoar %n olume de 1<A C 2<A de mc de mediu, moti pentru care trebuie pregtit o cantitate suficient de inocul. .ultura folosit drept inocul trebuie s fie %n faza exponenial de cretere. (a microorganismele care au itez de cretere redus, se recomand s se foloseasc o cantitate mai mare de inocul, pentru a se reduce durata iniieirii fermentaiei. .ultura starter de producie trebuie s conin celule acti e, adaptate la mediul industrial pentru ca fermentaia s se declaneze rapid. +n cazul fermentaiilor desfurate pe mediul solid, pentru care se utilizeaz inocule sporifere se recomand s se asigure prin inoculare concentraii de 1A<"1A: spori pe g mediu, iar %n cazul celor submerse cultura starter de producie s fie de circa 1AD din mediul de cultur.
Figura 1.5. >chema bloc pe operaii de obinere a preparatelor enzimatice microbiene brute
T"-#i+i '" 3"r$"#ta1i" ?entru producia de preparate enzimatice de origine microbian se poate aplica dou tehnici de baz ! &ermentaia de suprafa %n care se utilizeaz un mediu solid pe care se culti microorganismul (de regul un mucegai filamentos). 0ceast tehnic are a anta)ul c mediul de cultur a de eni un mediu bogat %n acti itate enzimatic 5 &ermentaia de submers, %n care mediul este lichid ce se afl %ntr"un reactor unde toi parametrii fermentaiei sunt perfect controlai. 0ceast ultim tehnic este superioar primei metode din punct de edere tehnologic i biochimic. Dintre speciile de microorganisme ce se folosesc menionm urmtoarele ! Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Mucor miehei, accharomyces cere!isiae, Endothia parasitica, Penicillium emersonii, "luy!eromyces lactis, #acillus amylolichefaciens, #acillus licheniformis, #acillus stearothermophilus, Actinoplanes missouriens, "lebsiella planicola$ (a sf*ritul fermentaiei microorganismul trebuie distrus cu condiia pstrrii intacte a acti itii enzimatice. -icroorganismele culti ate pot produce extracelular sau intracelular. +n funcie de tipul ariaz i procedeul de extracie. +n ceea ce tipurile de culturi submerse, ne putem situa din urmtoarele cazuri! enzime acestora pri ete %n unul " concentraia %n enzim (acti itatea enzimatic a mediului) 5 " consumul de glucide 5 " ni elul de proteine. (a procedeul nealimentat se pot monta diferii senzori care arat ! " p1"ul C care se poate regla prin adaus de baze sau acid 5 " temperatura C care se poate regla prin debitul de circulaie al apei reci %n mantaua fermentatorului sau %n serpentina din interiorul fermentatorului 5 " ni elul de spum C care se poate combate cu un antispumant aflat %ntr"un rezer or ataat fermentatorului5 " presiunea C care se regleaz prin supape care se deschid la presiuni de 1 p*n la 3 bar 5 " coeficientul respirator FG C care se msoar prin cantitatea de .;2 produs fa de cantitatea de oxigen consumat 5 " ni elul de oxigen consumat, pornind de la analiza efluenilor. Procedeul alimentat, %n care se %ncepe cu un olum de 1A C 3AD de substrat %n care se introduce inoculum, dup care fermentatorul se alimenteaz cu restul de mediu, dup care oprirea fermentaiei se face dup un anumit timp fixat experimental. 0cest procedeu se aplic %n cazul %n care sinteza enzimelor ar fi reprimat de concentraiile ridicate %ntr"unul din nutrienii mediului de cultur sau %n cazul c*nd creterea microorganismelor, %n funcie de concentraia %n unul din componenii mediului, ar pro oca creterea *scozitii, care trebuie s fie reglat %n timp. 0limentarea fermentatorului poate fi repetat de mai multe ori efectu*ndu"se sutira)e (e acuri) programate, dar %ntotdeauna trebuie lsat %n fermentator un olum de 3AD, care ser ete %n acest caz drept cultur de producie.
Procedeul nealimentat, %n care caz toate ingredientele mediului de fermentare sunt pregtite %n fermentator la p1"ul i temperatura dorit %nainte de a introduce inoculum. Dup introducerea inoculum, fermentaia principal %ncepe i finalizarea ei se urmrete prin prele area de probe, %n mod steril, care arat ! " creterea microorganismelor (biomas, *scozitatea mediului) 5
10
@ig. 1.E. .ulti area submers a microorganismelor.
Capitolul 1. Definiia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 11 Culturi starter de microorganisme. Procedeul continuu necesit alimentarea continu a chimice 5 fermentatorului cu mediu i folosirea unei culturi "costurile energetice sunt destul de ridicate5 concentrate de microorganisme. +n acest caz, "mediul de cultur poate fi colmatant pentru bioreactorul (fermentatorul) de dez oltare a celulelor membrana de ultrafiltrare5 este cuplat cu o unitate de micro sau ultrafiltrare. +n figura 1.8. se arat schia unei astfel de instalaii "chiar la densiti mari de celule, la sf*ritul ciclului format dintr"un bioreactor cuplat cu o unitate de de dez oltare este posibil o oarecare liz a ultrafiltrare la care exist i posibilitatea de a celulelor, ceea ce face necesar o pur)are a recicla biomasa. bioreactorului prin unitatea de ultrafiltrare, fapt care conduce la micorarea rm*n %n sistem. *rstei medii a celulelor care
; ariant a procedeului continuu de obinere a biomaseiH enzimelor const %n folosirea bioreactorului cu membran.
.. Eta*a '" ("*arar" a "# i$"l%r
?rocedeul continuu 0 anta)ele unui urmtoarele ! astfel de procedeu cultur sunt prin
E6tra+1ia. (a procedeul discontinuu (nealimentat) i cel alimentat, dup terminarea fermentaiei se separ partea solid insolubil (celule i produse insolubile) de partea lichid care conine enzimele, separare care se poate face prin centrifugare, filtrare frontal sau microfiltrare. >oluia steril obinut este apoi ultrafiltrat pentru a concentra enzimele. +n cazul %n care enzimele sunt destinate a intra %n compoziia unui preparat comercial lichid, ultrafiltratul se stabilizeaz cu polioli (sorbitol, glicerol) iHsau sruri (=a.l, -g>;4), respecti se adaug bacteriostatici alimentari (benzoat, sorbat, ascorbat). +n cazul %n care enzima (enzimele) intr %n compoziia unui preparat comercial pulbere, ultrafiltratul se suplimenteaz cu un suport i se usuc prin atomizare (suplimentarea se face cu amidon, dextrine). +nainte de atomizare mai poate fi realizat o filtrare steril. ?entru a obine i enzimele intracelulare, biomasa din fermentator, separat de partea lichid, este supus lizei. (iza poate fi realizat chiar de enzimele proprii microorganismelor ce alctuiesc biomasa, fie prin folosirea de preparate exogene, cum ar fi lizozimul din albuul de ou, preparate enzimatice exogene complexe de natur bacterian care conin chitinaz, mananaz, "1,:Cglucanaz, proteaze, c*teodat %n combinaie cu adaosul de metabisulfit. +n cazul %n care enzima este periplasmic, un oc osmotic este suficient pentru a elibera enzimele. >e poate realiza i o liz mecanic (folosire de presiuni mari de :AA C 1AAA bar, urmat de detenta brutal) >e pot folosi i ultrasunetele cu frec ene mai mari de 2A -1z pentru liza celulelor i deci pentru eliberarea enzimelor intracelulare. ;dat eliberate, enzimele intracelulare sunt supuse operaiilor aplicate i enzimelor extracelulare.
"se poate detoxifica mediul de eliminarea produsului de inhibare 5 "celulele reciclate de in perfuzate 5
"cantitatea de mediu de cultur care se introduce %n bioreactor este controlat de cantitatea de permeat care tra erseaz membrana de ultrafiltrare 5 "celulele au posibilitatea de a se dez olta p*n la concentraii relati mari ( 3AA g substan uscatHl, %n cazul dro)diilor) 5 "aceste concentraii mari de celule se constituie ca o barier eficace fa de contaminarea exterioar 5 "retenatul poate fi e acuat i el periodic, fiind constituit din biomas care conine enzime intracelulare, dup care este trecut la prelucrare ulterioar (extracie) 5 "permeatul de la ultrafiltrare, care conine enzime nu mai are celule microbiene i poate fi, deci, stocat sau diri)at direct la o operaie %n a al de purificare sau concentrare. =ea)unsurile acestui procedeu de obinere biomasei i enzimelor sunt urmtoarele ! a
"membranele trebuie s fie rezistente la sterilizarea cu apori de ap i la igienizare cu substane
Capitolul 1. Definiia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 12 Culturi starter de microorganisme. ?reparatele enzimatice se comercializeaz de regul de edere al reglrii automate a parametrilor de sub form de pulbere, de microgranule, precum i lucru5 sub form lichid. enzima nu ptrunde %n substratul ce se trateaz ?reparatele enzimatice sub form de pulbere sunt %n cursul catalizei enzimatice5 formulate cu un suport cum ar fi amidonul, se poate modula micromediul %n care acioneaz maltodextrinele, zahrul, sarea. (a aceste preparate se enzima imobilizat (concentraie substrat, controleaz granulometria, umiditatea ( :D). >uportul %ncrcarea suportului cu enzim, gruprile trebuie s nu fie higroscopic pentru a se e ita hidrofile)5 formarea de cocoloae. +n preparatele comerciale pulbere sau lichide, coninutul de enzim este redus refolosirea treptat a enzimei, deci cu aceeai raportat la suport i de aceea cantitatea de preparat cantitate de enzim se poate transforma o comercial este mult mai mare, %n comparaie cu cantitate mai mare de substrat5 ni elul de enzim coninut. se poate lucra %n sistem semicontinuu sau +n ceea ce pri ete preparatele comerciale continuu, put*ndu"se automatiza procesul, ceea ce microgranulate, acestea se obin dintr"un ultrafiltrat asigur un control riguros al parametrilor de care se amestec cu un suport (sare, amidon solubil, lucru5 maltodextrine etc.). .antitatea de substrat este astfel are loc o cretere a itezei de lucru, prin calculat %nc*t s se obin titrul enzimatic dorit %n controlul riguros al itezei fluxului de substrat microgranule. 0mestecul respecti este pul erizat i al concentraiei acestuia5 %mpreun cu un agent liant care reprezint A,1D p*n la A,<D fa de masa suportului. ?icturile se poate stopa reacia enzimatic la momentul pul erizate sunt uscate %ntr"un turn de uscare, cu aer dorit i se e it trecerea enzimei %n produsul la 9A " 8A.. transformat5 ?reparatele comerciale lichide sunt formulate %n general cu polioli (gliceroli, sorbitol) care se utilizeaz %n proporie de 2A C <AD fa de preparatul lichid. (a aceste formulri se adaog o substan bacteriostatic (de exemplu benzoat de sodiu %n proporie de A,1 C A,2D). 1.2.5. E# i$" i$%0ili at" 7mobilizarea unei enzime (sau a unui sistem multifuncional) %nseamn legarea sau fixarea acesteia de un suport care trebuie s %ndeplineasc urmtoarele condiii ! "s fie insolubil %n ap 5 "s asigure pstrarea proprietilor catalitice enzimelor, respecti specificitatea de aciune 5 ale costurile globale de producie sunt mai mici %n comparaie cu procedeele %n care se folosesc enzime libere5 se pot folosi i enzime care nu sunt trecute %n liste IG0> (IenerallB Geconized as >afe)5 costuri pri ind imobilizarea5 pierderi ale acti itii enzimatice, o in estiie iniial %n utila)e mai mare, un proces mai complex din punct de edere tehnic i o supra eghere mai atent5 utilizarea numai a unor substraturi solubile.
,xist i deza anta)e, cum ar fi!
"s asigure aciunea enzimei la un p1 i temperatur optime, apropiate de cele ale enzimelor libere (neimobilizate). A anta'ele imobilizrii enzimelor sunt urmtoarele ! creterea stabilitii enzimei, ca protein i ca acti itate catalitic. 0ceast stabilitate este %n legtur cu diminuarea gradului de libertate al macromoleculei, ceea ce are consecin asupra ariaiilor de conformaie a enzimei (se diminueaz aceste ariaii). 7mobilizarea conduce i la cretere a concentraiei locale a protein" enzimei care are un efect stabilizant5 se poate lucra %n flux continuu din punct de edere al catalizei enzimatice, dar i din punct
A(*"+t" t"%r"ti+" *ri7i#' "# i$"l" i$%0ili at". +n cazul enzimelor imobilizate se obser un comportament cinetic diferit fa de cel al enzimelor libere, solubile. 0cti itatea enzimatic scade ca urmare a imobilizrii. 0cest lucru se datoreaz schimbrilor conformaionale ale enzimei dup imobilizare. ; astfel de modificare apare %n primul r*nd %n cazul legrii co alente a enzimelor de suport. 6n alt aspect este influena mediului, %n cazul enzimelor imobilizate acesta este diferit de cel apos. 0stfel, gruprile funcionale acide (a imobilizare, %n funcie de enzim i catalizator se poate orbi de ! " randament de fixare care reprezint cantitatea efecti de enzim imobilizat %n raport cu
Capitolul 1. Definiia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 13 Culturi starter de microorganisme. cantitatea de enzim introdus %n procesul de " eficiena economic a imobilizrii imobilizare ! determinate de ! costul enzimei, costul suportului, costul tehnicii de imobilizare 5 enzim fixat pe suport " acti itatea enzimei imobilizate care este J K 1AA influenat de ! tehnica de imobilizare5 enzim utilizat caracteristicile materialului suport, iteza de " randament de acti itate care reprezint acti itatea rezidual a enzimei imobilizate! 0cti itatea (,A) dup fixare K 1AA 0cti itatea (,LA) %nainte de fixare &actorii critici care trebuie luai (n consideraie la folosirea enzimelor imobilizate 0ceti factori se refer la ! difuzie a substratului la enzim produsului (lor) de transformare 5 "
"
caracteristicile transformat 5
substratului
ce
trebuie
stabilitatea enzimei care trebuie meninut acti un timp c*t mai %ndelungat 5 contaminarea microbiologic a sistemului enzimHsuport %n timpul utilizrii reactorului respecti .
"
Figura 1.18. M"t%'" '" i$%0ili ar" a "# i$"l%r $etode de imobilizare a enzimelor a) $etode fizice, la care enzima se leag de un suport prin intermediul legturilor slabe sau relati puternice (legturi Man der Naals, legturi de hidrogen, interaciuni protein C protein, legturi ionice). 7mobilizarea %n cadrul metodelor fizice poate fi ! " prin adsorbie pe suporturi organice ! amidon, colagen, >epharoz modificat, polistiren modificat, rini schimbtoare de ioni (D,0, celuloz, D,0, >ephadex, carboximetil"celuloz, 0mberlit, DoOex <A etc.) 5 " prin adsorbie pe suporturi minerale ! alumin, argil (bentonit, montmonirolit etc.), ceramic, hidroxiapatit, sticl poroas sau silice poroas, titanit (puni metalice cu &i.l4). 0dsorbia se realizeaz prin contactul dintre o soluie apoas de enzim cu suportul solid i a fi influenat de ! p1, tipul de sol ent utilizat pentru solubilizarea enzimei, puterea ionic, calitatea enzimei, temperatura i durata de contact a enzimei cu suportul. ?ractic imobilizarea se face prin amestecul dintre soluia de enzim i suport %ntr"un reactor cu agitator sau prin trecerea soluiei de enzim %ntr"o coloan %n care suportul este meninut sub forma unui pat. 0dsorbia enzimei de suport poate fi %mbuntit prin ataarea de suport a unor cofactori, cum ar fi piridoxal"fosfatul sau lanuri cu grupri hidrofile. 0dsorbia este influenat de raportul dintre suprafaa i olumul suportului, mrimea particulelor, raportul dintre gruprile hidrofile i hidrofobe.
0 anta)ele i deza anta)ele imobilizrii prin adsorbie A anta'e >implicitate %n execuie (incubarea enzimei cu suportul, agitare c*te a minute, enzima care rm*ne %n soluie fiind eliminat prin splare). 0bsena reaciilor chimice (numai dac nu se formeaz puni metalice). ?osibilitatea de regenerare a complexului enzimHsuport. *eza anta'e >tabilizare slab. Giscul de desorbie a enzimei de ctre ! fluxul de substrat, ariaie le)er de p1, fora ionic, temperatur
14
coreticulare utiliz*nd ageni bi" sau polifuncionali. .el mai mult utilizat pentru reticulare este glutaraldehida. A anta'ele #i deza anta'ele legrii enzimelor de suport prin legturi co alente A anta'e >tabilitate mrit datorit faptului c legturile co alente sunt cele mai puternice dintre toate legturile menionate anterior Marietatea mare a suporturilor ! sticl, silice, ceramic, celuloz, polimeri sintetici etc. ?osibilitatea de a efectua imobilizarea %n prezena unui substrat pentru a se e ita inacti area (protecia situsului acti ). *eza anta'e &rebuie realizate reacii chimice, adesea complexe ,tapa de acti are a suportului este lung Gandamentul de fixare este < 1AAD ,xist riscul modificrii chimice a enzimei (pierdere de acti itate) ,ste necesar ca enzima s fie purificat %n prealabil 7n estiia (costul) este important Suporturi de imobilizare comerciale
"prin includere %ntr"un suport, %n care caz se pot include i microorganisme. 7ncluderea poate fi fcut %n gel, microincapsulare, includere %n fibre. A anta'ele #i deza anta'ele imobilizrii enzimelor prin incluziune A anta'e Geaciile de polimerizare sau gelificare sunt bine cunoscute Geaciile chimice dintre suport i enzim sunt limitate (enzima este inclus %n geluri naturale) >e poate aplica la toate enzimele (chiar i la amestec de enzime) >e pot folosi suporturi cu forme diferite ! filme, fibre, bile. Giscul de Qe adare$ a enzimei este redus prin reticularea suportului dup imobilizare *eza anta'e 0numite polimerizri necesit ageni denaturani sau radicalici >e pun probleme de transfer de mas (inaccesibilitatea unor substraturi la enzim) Giscul de e adare al enzimei prin micropori ?roprietile mecanice ale gelurilor sunt nesatisfctoare
>uporturile comerciale cele mai des utilizate pentru imobilizarea enzimelor sunt ! " polizaharide ! agaroz, celuloz i deri ai, alginai, carageenani, dextrani 5 " poliacrilamide utilizate sub form de bile 5 " polistiren (bile i tuburi) 5 " silicea i sticla poroas. 1.2.9. C%#'i1iil" '" i#%+uitat" *" +ar" tr"0ui" (! l" &#'"*li#"a(+! *r"*arat"l" "# i$ati+" =umr total de germeni (=&I), maximum <.1A4Hg 5 .oliformi, maximum 3AHg 5 ,scherichia coli C absentH 2< g 5 >almonella C absentH 2< g 5 0cti itate antibiotic de origine microbian C absent 5 0flatoxina B1, ochratoxin 0, sterigmatocistin, toxina & C 2 (zearalenona) %n cazul preparatelor de origine microbian C absente 5 -etale grele ! "arseniu "plumb "alte metale grele < 3 mgHPg 5 < 1A mgHPg 5 < 4A mgHPg (exprimat la ?b).
b) $etode chimice de imobilizare, %n care caz imobilizarea se face prin intermediul legturilor co alente de suporturi insolubile, care posed grupri reacti e sau care pot fi acti ate prin diferite reacii chimice. >e poate realiza imobilizarea i prin copolimerizarea enzimelor cu un monomer reacti i legarea %ncruciat (.ross"lin'ing) sau reticular intra i intermolecular a enzimelor de un suport prin intermediul unui reacti multifuncional. (a legarea prin legturi co alente, imobilizarea poate fi fcut ! prin fixare de un suport insolubil, dar trebuie s se in seama de gruparea funcional care poate reaciona cu protein"enzima i de caracteristicile fizico" chimice ale suportului. 0desea este necesar s se creeze, pe cale chimic, funcii reacti e pe suport5 prin
::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::
::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: 1.). CULTURI .TARTER DE MICROORGANI.ME -icroorganismele sunt utilizate %n industria alimentar pentru! " %b&inerea de celule (culturi starter J culturi pure) care la r*ndul lor sunt folosite pentru fermentarea produselor lactate acide sau br*nzeturi, la fabricarea produselor de carne (salamuri crude uscate), produse tradiionale egetale, produse lactate acide, p*ine etc. +n acest produsele se consum fie %mpreun cu celulele respecti e fie dup %ndeprtarea celulelor cum este cazul buturilor de tipul berii, inului. %b&inerea de biomas' care poate fi utilizat ca ingredient de fermentare (dro)dia de panificaie ) sau de %mbogire a unor produse alimentare cu proteine, respecti ca fura)e proteice pentru psri, pete, porcine.
15
?rima situaie se %nt*lnete la obinerea biomasei de dro)die de panificaie, represiunea catabolic de ctre glucide antreneaz i o producie de alcool etilic, producie ce trebuie e itat prin dou soluii i anume! e itarea excesului de substrat i lucru cu cultura Q%n pat$ i respecti plasarea unui detector de alcool %n efluentul de gaz (.;2) care permite s se cunoasc ce aport de substrat trebuie furnizat. 0 doua situaie se %nt*lnete la producia de culturi lactice a cror dez oltare este %nsoit de acumularea de acid lactic (bacterii lactice homofermentati e) sau acid lactic i acetic (bacterii lactice heterofermentati e). >oluia care se impune %n acest caz este o dializ a culturii sau centrifugarea substratului cu celule, celulele fiind apoi reciclate. Dac dez oltarea culturii are loc fr acumularea de metabolii, alimentarea cu substrat se poate face la un debit constant, dar la o concentraie cresctoare a acestuia, respecti la o concentraie constant a substratului dar la un debit programat exponenial. M"t%'a +%#ti#u!, %n care caz are loc alimentarea constant a aparatului de culti are a microorganismelor cu substane nutriti e i eliminarea ne%ntrerupt a biomasei sau metaboliilor. 0ceast metod poate fi realizat prin culti area de suprafa sau de ad*ncime a microorganismelor. (a fermentarea continu se are %n edere natura catalizatorului (imobilizat sau nu5 sistem eterogen sau nu5 celule incluse, adsorbite, grefate prin co alen)5 gradul de reciclare al celulelor microbiene5 gradul de amestecare a fluidelor %n reactorul cu funcionare continu. .reterea concentraiei de celule se poate realiza prin! folosirea tehnicilor de membran sau centrifugarea5 folosirea de celule imobilizate5 reciclarea celulelor. 1.+.1. $icroorganisme utilizate (n industria alimentar BACTERIILE utilizate %n industria alimentar aparin urmtoarelor genuri! ,enul Streptococcus 0cest gen cuprinde specii de bacterii sub form de coci sferici sau o ali cu < 2 , grupate %n diplo sau form de lanuri. >unt Iram poziti e, facultati anaerobe, neciliate, nesporulate, unele specii fiind capsulate. 7mportani pentru industria alimentar sunt! >treptococii mezofili ! treptococcus lactis (Lactococcus lactis subsp$ lactis), tr$ cremoris (Lactococcus lactis subsp$ cremoris), tr$ diacetilactis (Lactococcus lactis subsp$ diacetilactis)* >treptococii termofili! tr$ thermophilus$ 0ceti streptococi lactici sunt homofermentati i, produc acid lactic ((R) i prezint urmtoarele acti iti! " acti itate fermentati ! fermenteaz lactoza i glucoza5 " acti itate proteolitic5 " produc diacetil i acetoin din acid citric ( %n principal tr$ diacetilactis).
"
+n ceea ce pri ete metodele de culti are ale microorganismelor se folosesc metode periodice (discontinui) i metode continui, %n ambele cazuri fiind necesar optimizarea procesului. M"t%'a *"ri%'i+! de culti are a microorganismelor pre ede alimentarea continu a aparatului de culti are cu substane nutriti e i %nlturarea culturii de microorganisme. +n acest fel, se creeaz condiii optime de acumulare a cantitii necesare de biomas sau a metaboliilor. (a culti area periodic concentraia substanelor nutriti e scade, iar cea a celulelor i metaboliilor crete, fapt care conduce la modificarea cineticii creterii microorganismelor. (a metoda periodic trebuie s a em %n edere dou situaii i anume! " c*nd substratul este inhibitor pentru producia de biomas i metabolii5 " c*nd produsul este inhibitor.
Fermentarea lactozei de ctre streptococii lactici se face prin transformarea iniial a acesteia %n glucoz i galactoz C :? prin intermediul fosfo" "galactozidazei. +n continuare, glucoza este apoi fermentat pe calea hexozo C difosfatului %n acid lactic, iar galactoza C :? este utilizat pe calea tagatozei %n ederea producerii unei cantiti suplimentare de acid lactic (fig. 1.11.).
1"
@igura 1.11. .alea tagatozei de degradare a lactozei de ctre streptococii lactici Fermentarea glucozei de ctre streptococii lactici poate fi fcut pe cale homofermentati cu producerea %n principal de acid lactic i pe cale heterofermentati , %n condiile %n care glucoza este limitat, calea heterofermentati fiind calea ribulozei C <? cu formare de acid acetic, etanol i acid lactic (fig. 1.12.).
@igura 1.13. &ransformarea citratului de ctre tr$ lactis subsp$ diacetilactis i Leuconostoc ,enul -euconostoc 0cest gen cuprinde bacterii cu form sferic, lenticular, grupate %n perechi sau lanuri, imobile, asporogene, Iram negati e, facultati anaerobe. ?entru dez oltare, leuconostocii au ne oie de itamine (acid nicotinic, tiamin, biotin) i zaharuri fermentescibile. =u sunt proteolitici i nu reduc azotaii. >pecii de Leuconostoc formeaz polimeri (dextran). >e dez olt bine la 2A"3A.. Ienul Leuconostoc cuprinde speciile! Leuconostoc cremoris (citro!orum)* Leuconostoc lactis* Leuconostoc dextranicum* Leuconostoc mezenteroides$ 0ceste specii sunt heterofermentati e i se dez olt greu %n laptele fr adaos de stimulatori. +n produsele lactate, leuconostocii au dou funcii de baz! " produc compui de arom (diacetil, acetoin)5 " produc ochiuri de fermentare prin formare de .;2 %n unele tipuri de br*nzeturi (,dam, Ioude, &ilsit). 0mbele funcii sunt realizate prin metabolismul citratului, dar leuconostocii produc .;2 i din lactoz. (euconostocii inter in deci %n metabolismul glucidelor i al citratului. Metabolismul glucidelor @ermentarea glucidelor de ctre leuconostoci se face pe calea fosfocetohexozelor, dintr"un mol de hexoz regener*ndu"se c*te un mol de 0&?. Ienele care codific etapele iniiale ale fermentrii lactozei (ca de altfel i ale metabolizrii citratului, producerii de proteaze) sunt localizate %n plasmide. Metabolismul citratului -etabolismul citratului de ctre leuconostoci este acelai ca i la streptococi cu meniunea c leuconostocii produc diacetil i acetoin la p1 sczut. 0cetoina se poate forma pe dou ci! " prin decarboxilarea acetolactatului5 " din diacetil prin intermediul diacetil reductazei, %ntr"o
@igura 1.12. .alea homo i heterofermentati de degradare a glucozei de ctre bacteriile lactice Fermentarea acidului citric cu formare de diacetil, acetoin i 2,3 butilenglicol este artat %n figura 1.13. 0celai mecanism %l folosesc i leuconostocii.
reacie care necesit =0D1 sau =0D?1. 0ceast ultim cale este redus sau chiar lipsete %n cazul lui tr$ diacetilactis, din cauza capacitii limitate a acestuia de a produce acetil" .o0, unul din precursorii diacetilului. .ulturi starter &emperatura de Durata, p1"ul ore incubare, . P$ pentosaceus 2:,9 2A <,AA P$ acidilacti 2:,9 3E <,:< P$ pentosaceus 28,4 13 <,AA P$ pentosaceus 28,4 2E <,4A (euconostocii (ca de altfel i lactobacilii) pot produce la unele br*nzeturi unele defecte i anume! " crparea pastei la br*nza .heddar ( defect numit QBlit opennes$)5 " apariia timpurie de gaze la br*nza Ioude ( tr$ diacetilactis poate produce i el defectul de Qplutire$ a coagulului, la br*nza .ottage). 0ceste defecte se datoreaz formrii de .;2. ?entru a se pre eni defectul de Qplutire$ a coagulului, br*nza .ottage se fabric cu o cultur care nu conine tr$ diacetilactis, adug*ndu"se apoi %n br*nza obinut o cultur de Leuconostoc citro!orum culti at pe lapte cu adaos de citrat sau o cultur concentrat de Leuconostoc citro!orum.
1'
unor produse de carne la temperatura de 1:"29., producia de acid lactic este mai lent i implicit se pot dez olta i microorganismele care contamineaz carnea, durata de fermentaie fiind mai mare. P$ pentosaceus produce o fermentaie rapid c*nd substratul conine un glucid fermentescibil, temperatura de fermentare fiind cuprins %ntre 1<"29.. Din tabelul de mai sus rezult c P$ pentosaceus este mai eficace %n ceea ce pri ete producia de acid lactic at*t la 2:,9. c*t i 28,4. %n comparaie cu P$ acidilactici. 0 *nd %n edere c pediococii produc acid lactic i bacteriocine, ei exercit o aciune inhibitoare fa de microorganismele patogene i cele de alterare (stafilocici, salmonele, Cl$ botulinum, bacili, enterobacterii gram negati e, dro)dii). +n produsele de carne fermentate, pediococii pot scade p1" ul de la <,: la 4,<"<,2 ceea ce face ca proteinele s fie aduse aproape de punctul izoelectric fapt ce fa orizeaz sinereza i deci uscarea produsului. 0cidul lactic produs contribuie la denaturarea proteinelor din carne ceea ce contribuie la realizarea unei texturi ferme a produsului finit. ,enul -actobacillus. 0cest gen aparine familiei Lactobacillaceae. 0ceast familie cuprinde bacterii sub form de bastonae de lungimi i grosimi ariabile, precum i cocobacili scuri, aezai obinuit %n lanuri %n faza de %nmulire logaritmic.
+n afar de industria laptelui, leuconostocii se utilizeaz i pentru! " fermentarea unor produse egetale ( arz, castra ei, msline) inter enind %n cadrul microflorei spontane sau sub form de culturi concentrate5 " fermentarea malolactic a inurilor5 " producia de dextran. +n industria laptelui se folosesc culturi lactice care conin streptococi acidifiani ( tr$ lactis i tr$ cremoris), precum i bacterii productoare de arom i unele specii de Leuconostoc i tr$ diacetilactis, ultimul fiind aromatizant i acidifiant. ,enul Pediococcus. 0cest gen aparine familiei treptococaceae i cuprinde bacterii sub form de coci perechi sau tetrade. -etabolismul acestor bacterii este predominant fermentati , homolactic. >e produce acid lactic racemic (D() din glucoz, fructoz, manoz. >orbitolul i amidonul nu sunt fermentai. -ulte specii sunt catalaz"negati e, dar se %nt*lnesc i specii care au acti itate catalazic independent de hem. ?rincipalele criterii de difereniere %ntre diferitele specii de pediococi sunt menionate %n tabelul 3.E P$ acidilacti, %n culturi starter, este utilizat pentru obinerea de produse din carne fermentate la temperaturi mai ridicate, deoarece are o dez oltare bun la 42"<2., produc*nd rapid acidul lactic i deci scade efecti p1"ul, produsul obinut a *nd gust acrior. 0tunci c*nd se utilizeaz la fermentarea
>unt asporogene, imobile, Iram poziti e, anaerobe sau facultati anaerobe. +n general sunt catalaz Cnegati e citocrom"oxidaz Cnegati e, nu reduc azotaii, nu lichefiaz gelatina. 0u acti itate proteolitic i lipolitic redus. Ilucidele cele mai bine fermentate sunt! lactoza, maltoza, zaharoza (mai ales %n faza de dez oltare), apoi hexozele (glucoza, fructoza, galactoza). ?entru dez oltare necesit substane minerale i toate itaminele din grupul B. >e dez olt bine %n mediu cu p1 <,<"<,E, dar i la p1 < . >e pot dez olta %n limite largi de temperatur (<"<3.), dar temperatura optim este cuprins %ntre 3A i 4<.. +n funcie de temperatura optim de dez oltare lactobacilii pot fi! termofili! L$ lactis, L$ hel!eticus, L$ bulgaricus, L$ acidophilus, temperatura optim fiind 39"4<.5 mezofili! L$ casei, L$ plantarum, L$ bre!is etc.5 temperatura optim de dez oltare fiind 2:"3A.. ;rla Sensen a %mprit genul Lactobacillus %n urmtoarele grupe! 1. grupa +hermobacterium care cuprinde lactobacili homofermentati i termofili! L$ lactis, L$ hel!eticus, L$ bulgaricus, L$ acidophilus, L$ delbruec,ii* L$ leichmanii* 2. grupa treptobacterium C care cuprinde lactobacilii homofermentati i mezofili! L. casei, L, plantarum5
3. grupa! #etabacterium C care cuprinde lactobacili heterofermentati i, ce contamineaz frec ent br*nzeturile! L fermenti, L$ buchneri, L$ bre!is, L$ !iridiscens. >treptobacteriile la r*ndul lor, au fost clasificate de ctre unii autori %n neacidorezistente i acidorezistente. (actobacilii neacidorezisteni produc compui aromatici (diacetil, acetoin). >e prezint sub form de bastonae de lungimi ariabile i rar formeaz lanuri . >e pot dez olta la 2"1<.. =u se dez olt la p1 < <,:. >e utilizeaz %n culturi starter la fermentarea salamurilor crude cu p1 J <,: C :,1, produsele a *nd o durat mare de maturare, iar gustul final fiind slab acrior dulceag. (actobacilii acidorezisteni au form de bastonae scurte care formeaz lanuri. >e dez olt bine la p1 <,A. 0cti itatea metabolic a lactobacililor %n produsele alimentare fermentate se refer la metabolismul lactozei, galactozei i glucozei. Taharoza este fermentat numai dup hidroliza acesteia %n glucoz i fructoz. Metabolismul lactozei ?entru a se dez olta %n lapte, lactobacilii homofermentati i hidrolizeaz lactoza cu a)utorul "galactozidazei iHsau "DCfosfogalactozidC galactohidrolazei, aa cum arat %n schema din figura 1.14.
1%
fosforilat al glucozei (glucozo":?), care apoi sufer transformri pe calea ,mbden C -eBerhof (fig. 1.1<.).
@igura 1.1<. &ransformarea galactozei %n glucoz":? de ctre lactobacili Acti!itatea proteolitic'$ 0cti itatea proteolitic a lactobacililor contribuie at*t la textura c*t i la aroma unor produse alimentare (produse lactate, produse egetale fermentate, produse din carne fermentate etc.), dar i la eliberarea unor aminoacizi care stimuleaz creterea i acti itatea altor bacterii lactice folosite %n culturile starter %n amestec cu lactobacilii. >e consider c acti itatea endoproteinazic a lactobacililor este asociat cu membrana celulelor, iar acti itatea exopeptidazic este localizat intracelular. ,nzimele din membrana celulelor produc hidroliza parial a macromoleculelor proteice, din care se formeaz peptide suficient de mici pentru a fi transportate %n interiorul celulelor unde se continu degradarea lor p*n la aminoacizi, necesari creterii (figura 1.1:.). 0cti itatea proteolitic a lactobacililor este optim la p1 <,2" <,E i temperatura de 4<"<A.. (a temperaturi mai mari de <<. acti itatea proteolitic este mult redus datorit termodenaturrii enzimei iar la 9A.H1min enzimele sunt complet inacti ate. +n cazul laptelui, proteinazele extracelulare ale L$ bulgaricus sunt acti e fa de "cazein, apoi %n ordine descresctoare i fa de U i cazein.
@igura 1.14. &ransformarea lactozei %n glucoz i galactoz respecti glucoza i galactoza :? de ctre lactobacilii homofermentati i "D"galactozidCgalactohidrolaza este utilizat de Lb$ casei iar "galactozidaza este utilizat de ma)oritatea lactobacililor (L$ bulgaricus, L$ lactis, L$ hel!eticus etc.), dei acetia din urm au i acti itate "DCfosfogalactozidC galactohidrolazic, %ns mai redus. L$ bulgaricus are "galactozidaz acti la p1 J 9,A i este acti at de -g2R, -n2R i @e2R. +n cele mai multe cazuri, lactobacilii folosesc mai mult glucoza ca surs de energie %n comparaie cu lactoza i galactoza. 6nii lactobacili elibereaz %n mediu galactoz care se acumuleaz. Metabolismul hexozelor Dup hidroliza lactozei %n celulele lactobacililor homofermentati i, hexozele rezultate sunt metabolizate pe calea ,mbden C -eBerhof. (actobacilii heterofermentati i fermenteaz hexozele pe calea hexozomonofosfatului, aceti lactobacili nea *nd aldolaz i triozofosfat izomeraz care sunt enzime cheie %n calea ,mbden C -eBerhof. 0ceasta este de fapt i diferena dintre cele dou grupe de microorganisme, adic lactobacilii homofermentati i posed at*t aldolaz c*t i triozofosfatizomeraz, %n timp ce lactobacilii heterofermentati i nu posed aceste enzime. Ialactoza, rezultat din lactoz, pentru a fi fermentat trebuie mai %nt*i s fie transformat %ntr"un deri at
@igura 1.1:. 0ciunea endoproteinazelor extracelulare i a exopetidazelor intracelulare %n cazul lactobacililor Producerea de compui de arom' i -.%. ?rincipala contribuie a lactobacililor este producia de acid lactic. +n cazul produselor lactate acide, dei speciile de lactobacili implicate sunt homofermentati e, acestea %ns produc i ali metabolii, printre care produi olatili ca! acetaldehida, diacetil i alcool. 7n cantitate mai mare fiind produs
acetaldehida. +n plus, L$ casei produce diacetil din citrat, mai ales atunci c*nd laptele se suplimenteaz cu citrat (L$ casei nu este %ns un productor ma)or de diacetil). 0numii lactobacili produc 12;2 care se acumuleaz %n mediul i )eneaz dez oltarea altora. 0cumularea 12;2 %n mediul de cultur este posibil pentru ca lactobacilii sunt catalaz C negati i. 7ncapacitatea lactobacililor de a distruge metabolic 12;2 explic de ce acetia nu se dez olt bine %n condiii puternic aerobe, oxigenul fiind toxic pentru lactobacili care nu posed superoxiddismutaz, enzim care se constituie ca un sistem de protecie fa de toxicitatea oxigenului, cum este cazul altor bacterii. 0ciunea lactobacililor este %mbuntit prin interaciuni cu alte bacterii lactice. De exemplu, cultura mixt format din L$ bulgaricus i tr$ thermophilus este adec at pentru fabricarea iaurtului, deoarece cultura mixt produce mai rapid acid lactic. 7nteraciunea dintre cele dou bacterii lactice este benefic din urmtoarele moti e!
1(
folosete glucono C delta C lactona ca acidifiant chimic. Lactobacillus plantarum poate reduce =a=;3 dac p1"ul mediului este mai mare de :,A i nu exist zaharuri fermentescibile %n mediul de cultur. Lactobacillus sa,e i Lactobacillus cur!atus produc 12;2 %n prezena ;2 atmosferic. .ei doi lactobacili se %nt*lnesc frec ent %n salamurile crude fr adaos de culturi starter (sunt componeni ai microflorei spontane a compoziiei de carne). 0lte utilizri (actobacilii intereseaz i %n fermentarea mslinelor, erzii, castra eilor, gogonelelor, %n producerea spirtului i dro)diei presate %n ederea acidifierii plmezilor, la fermentarea unor produse fermentate din cereale (brag, c as), la fabricarea acidului lactic prin fermentare etc. ,enul $icrococcus #i Staph.lococcus -icroorganismele din genurile Micrococcus i taphylococcus aparin familiei Micrococaceae care cuprinde bacterii sub form de coci. >e pot dez olta %n medii care conin 1<D =a.l. ?entru industria crnii intereseaz anumite specii de micrococi i stafilococi care sunt folosite pentru! " capacitatea lor de a reduce azotaii la azotii (contribuie la formarea culorii crnii srate %n prezen de azotai)5 " acti itatea lor catalazic5 " acti itatea de acidificare, proteolitic i lipolitic. Dintre speciile de micrococci intereseaz Micrococcus aurantiacus i Micrococcus !arians$ ?entru industria laptelui, micrococii formeaz partea principal a populaiei nelactice din laptele crud i respecti br*nzeturile fabricate din laptele crud. Din br*nza .heddar fabricat din lapte crud a fost izolat Micrococcus freundenreichii, care a fost ulterior utilizat sub form de cultur pur %n scopul accelerrii formrii aromei br*nzei fabricate din lapte pasteurizat datorit acti itii proteolitice i lipolitice. &ot %n scopul maturrii unor br*nzeturi cu past presat s"a utilizat un preparat enzimatic i anume Gulactina ce conine o metal"proteaz cu acti itate strict endoproteinazic obinut din Micrococcus caseolyticus. Din genul taphylococcus intereseaz speciile de stafilococi coagulaz"negati i, nepatogeni cum ar fi! taphylococcus carnosus, taphylococcus xilosus, taphylococcus simulans$ .ombinaiile de micrococi i stafilococi sunt eficace pentru acti itatea azotat"reductazic i catalazic. +n aceste combinaii, taphylococcus carnosus acioneaz mai bine dec*t micrococii %n formarea culorii, reduc*nd azotaii la azotii i respecti azotiii la oxid de azot, chiar %n condiii de aciditate ridicat a substratului. 0roma produselor la care este utilizat cultura starter de taphylococcus carnosus este superioar. ,enul Streptom.ces. >pecii din genul treptomyces pot altera alimentele, produc*nd mirosuri i gusturi dezagreabile, altele (puine la numr) sunt patogene.
" L$ bulgaricus produce aminoacizi liberi, %n particular histidin, care stimuleaz producia de acid lactic a lui tr$ thermophilus5 " tr$ thermophilus, pe de alt parte, produce acid formic, care stimuleaz acti itatea lui L$ bulgaricus5 " tr$ thermophilus, dei produce o cantitate suficient i de .;2 care stimuleaz dez oltarea lui L$ bulgaricus, totui dez oltarea acestuia este mai redus, deoarece tr$ thermophilus utilizeaz mai rapid anumite substane nutriti e eseniale pentru dez oltarea lui L$ bulgaricus. +n plus, lactobacilii, %n general, sunt sensibili chiar la ni eluri foarte reduse de antibiotice, %n comparaie cu tr$ thermophilus ( de aici i necesitatea ca laptele s nu conin urme de antibiotice).
Utili ar"a +ulturil%r '" la+t%0a+ili,
+n industria laptelui se utilizeaz Lactobacillus lactis i Lactobacillus bulgaricus, singuri sau %n amestec la fabricarea iaurtului, chefirului, cum*sului, br*nzei ,menthal, br*nzeturilor italiene. Lactobacillus hel!eticus este i el implicat %n unele din aceste produse. Lactobacillus acidophilus este folosit la fabricarea laptelui acidofil, laptelui acidofil nefermentat i a altor produse acidofile. Lactobacillus casei se utilizeaz pentru obinerea produsului Ba'ult. +n industria crnii intereseaz Lactobacillus sa,e, Lactobacillus cur!atus i %n special Lactobacillus plantarum care se caracterizeaz prin faptul c nu produce .;2 la fermentarea glucozei dar produce .;2 din gluconat. Giboza este fermentat la acid lactic i acid acetic. ?osed acti itate aldolazic, glucozo C :? C dehidrogenazic. ?rin fermentaie lactic se produce acid lactic racemic (D(). Lactobacillus plantarum este facultati anaerob, nu produce =13 din arginin. ?oate acidifica laptele i are temperatura optim de dez oltare la 3A"3<.. =u necesit pantotenat, tiamin, niacin pentru dez oltare.
Lactobacillus plantarum ca i Lactobacillus sa,e pot descompune acidul gluconic cu formare de acid acetic ceea ce este deza anta)os %n cazul salamurilor la care se
treptomyces griseus senso -/tter este %ns inofensi i a fost folosit pentru capacitatea sa de a reduce azotatul la azotit, put*ndu"se dez olta bine %n substraturi care conin V ED =a.l i care au p1 J <,E"E,<. &emperatura optim de dez oltare este la 3A.. ,ste catalaz C poziti a *nd capacitate proteolitic dar nu i lipolitic. ?oate fi asociat cu micrococii iHsau lactobacilii. +n salamurile crude se inoculeaz la ni el de <K1A3 Hg compoziie. ,enul Propionibacterium$ Bacterile din genul Propionibacterium fac parte din familia Propionibacteriaceae. Bacteriile propionice fermenteaz carbohidraii, piru atulHlactatul. Bacteriile propionice Qtip lapte$ sunt! Propionibacterium freundreichii (cu subspeciile freundreichii, globosum i shermani), Propionibacterium theonii, acidipropionici i 0ensenii$ ?rincipalii produi de fermentaie a bacteriilor propionice sunt .;2, cantiti mari de acid propionic i acetic i cantiti mici de acid izo alerianic, formic, succinic, lactic. &oate speciile produc acid lactic din glucoz. >e dez olt foarte bine la 3A"39. i la p1 J 9,A. Producerea de propionat, acetat i C%. (actatul (respecti piru atul) este transformat %n propionat prin reacia! 3.13".1;1".;;1 2.13".12".;;1 R .13".;;1 R .;2 R 12; ?ropionatul, acetatul i .;2 se formeaz %n proporie de 2H1H1. Diferitele tulpini de bacterii propionice se deosebesc %ntre ele prin raportul acid propionic Hacid acetic format, o influen %n acest sens a *nd i aciditatea substratului, cantitatea de lactat i adaosul de carbonat i succinat. Producerea de prolin' ?rolina este considerat ca principalul component care confer arom dulceag br*nzeturilor de tip aier, prezena prolinei fiind asociat cu dez oltarea bacteriilor propionice la maturarea br*nzeturilor de tip aier. >e consider c exist trei ci pentru producerea de prolin! " " " proteoliza general5 hidroliza peptidelor care conin prolin5 biosinteza prolinei.
20
br*nzeturi este sporit prin dez oltarea anterioar sau concomitent a bacteriilor lactice. Miteza formrii prolinei la alorile p1 i concentraia de =a.l atins %n br*nza aier este temporar %ncetinit, dar maturarea prelungit anuleaz efectele de inhibare ale p1"ului i concentraia de =a.l. >e consider c ionii de cupru ar inhiba producerea de prolin pe unele ci, aceast inhibare parial fiind benefic, deoarece permite e oluarea altor procese de aromatizare. Producerea de diacetil i acetoin' Bacteriile propionice pot produce diacetil i acetoin, cantitile formate fiind mai mari la 21. dec*t la 32"39.. ?roducia de diacetil este urmat de reducerea acestuia la acetoin i 2,3 butilenglicol. .antitatea de diacetil crete prin adaos de citrat, piru at sau glucoz %n mediu de cultur. +n culturile mixte de tr$ lactis i bacterii propionice, producia de diacetil se intensific ca o consecin a scderii p1"ului de ctre streptococi. Bacteriile propionice produc i alte substane care contribuie la aroma br*nzeturilor! aldehid acetic, aldehid propionic, alcool etilic, alcool propilic, dimetilsulfur, acid izo alerianic. Alte acti!it'&i metabolice Bacteriile propionice pot a ea i acti itate proteolitic i lipolitic. Bacteriile propionice pot contribui %ntr"o msur mai mic la acti itatea proteolitic din br*nza W aier prin enzimele proteinazice (V12 enzime) i peptidazice (V 9 enzime), dar acti itatea proteolitic a bacteriilor propionice este inferioar bacteriilor lactice (L$ bulgaricus, L$ hel!eticus, tr$ thermophilus). Bacteriile propionice pot contribui i la lipoliza trigliceridelor, eliber*nd acizi grai cu lan lung, dar aceast acti itate lipolitic este nesemnificati . DRO;DIILE, ciuperci unicelulare care se %nmulesc prin %nmugurire, mai rar prin sciziparitate i care formeaz ascospori (sunt i dro)dii care nu formeaz spori, acestea denumindu"se dro)diiHfalse torule i micoderme), sunt ageni tipici ai fermentaiei alcoolice. >e prezint sub form de celule rotunde sau o oide ( accharomyces cere!isiae), eliptice ( accharomyces elipsoideus), foarte alungite ( accharomyces pasteurianus), de forma unei lm*i ( accharomyces apiculans), de forma unei sticle ( accharomyces lud1igii) sau sub form de cilindru (Pichia). Dintre dro)dii intereseaz (%n sens util) cele aparin*nd familiei accharomycetaceae, genul accharomyces care cuprinde dro)dii alcooligene folosite %n industria berii, inului, p*inii, spirtului, genul "luy!eromices care fermenteaz lactoza, genul 2ebaryomices care se utilizeaz %n industria crnii. -ai intereseaz dro)diile familiei Cryptococcaceae (genurile Candida, +orulopsis) care se folosesc ca ageni de fermentare i productori de biomas. /tilizri ale dro'diilor 3$ 4tilizarea pentru fermentarea alcoolic' ?entru fermentaia alcoolic se folosesc dro)diile ade rate care aparin genului accharomyces (Meyen) 5ess i care se
(a prima cale se ia %n considerare producerea de prolin prin hidroliza cazeinei. (a a doua cale se ia %n considerare formarea de prolin din hidrolizatul cazeinic prin aciunea peptidazelor (Propionibacterium shermanii posed imidopeptidaz i proliniminopeptidaz intracelulare cu optim de p1 la <,<" :,A). (a a treia cale se are %n edere biosinteza prolinei din arginin i mai puin din acid glutamic, dar calea de biosintez este nesemnificati %n raport cu cea de"a doua cale menionat. +n orice caz, concentraia de prolin din interiorul celulelor este mai mic dec*t cea a prolinei din mediul de cultur . ,liberarea prolinei din peptide coincide cu eliberarea enzimelor celulare %n mediu. Bacteriile propionice singure hidrolizeaz %ncet cazeina, dar producerea de prolin %n
caracterizeaz prin aceea c nu formeaz micelii tipic, produc 1"4 spori, iar puterea de fermentare depete puterea de respiraie. >unt adaptate la condiii de anaerobioz i prin urmare nu formeaz oaluri la suprafa. Dup modul de comportare %n timpul fermentaiei dro)diile pot fi!
21
0ceti alcooli superiori se formeaz prin reacii de dezaminare i decarboxilare ale aminoacizilor leucin, izoleucin i alin. @ermentaia alcoolic se aplic la! obinerea alcoolului din produse amidonoase (cartofi, porumb, secar), produse care conin zaharoz (sfecl, melas), produse care conin lactoz (zer), produse care conin glucoz (hidrolizate celulozice, leii sulfitice)5 obinerea berii i inului, cidrului inclusi c as din p*ine, rom, Ohis'B5 obinerea de buturi fermentate pe baz de cereale i leguminoase5 obinerea unor tipuri de produse lactate (chefir)5 obinerea de buturi fermentate pe baz de zer.
de fermentaie superioar care se ridic %n cantiti mari la suprafaa lichidului de fermentare sub forma unui strat gros de spum care se pstreaz astfel p*n la sf*ritul fermentrii. Dup sedimentare aceste dro)dii rar dau un precipitat dens. 0u optim de temperatur la 2EX3A. i fermenteaz 1H3 din rafinoz. +n categoria dro)diilor de fermentare superioar se %ncadreaz cele care produc fermentarea alcoolic %n cazul obinerii alcoolului etilic, p*inii i unele sue pentru bere ( accharomyces cere!isiae)5 de fermentaie inferioar care se dez olt %n lichidul fermentat, nu se ridic la suprafa %n spum, dar formeaz flocoane i se sedimenteaz repede. 0u optim la temperatura de EX12. i fermenteaz complet rafinoza. Dro)diile de fermentare inferioar se folosesc la obinerea berii, inului, cidrului ( accharomyces carlsbergensis, accharomyces o!iformis, accharomyces !ini, accharomyces u!arum)$
@ermentaia influenat de! alcoolic produs de dro)dii este
.$ 4tilizarea pentru ob&inerea de biomas' (s"a menionat anterior)5 7$ 4tilizarea 8n industria c'rnii, %n care caz se folosete dro)dia 2ebaromyces hansenii care este tolerant la =a.l, nu reduce =a=;3 i necesit oxigen atmosferic pentru dez oltare. >e dez olt bine %n straturile periferice ale salamurilor neafumate sau puin afumate. 0ceast dro)die are capacitatea de a consuma oxigenul din past i de a distruge peroxizii produi de bacteriile lactice. De regul, 2ebaromyces hansenii se folosete %n combinaie cu taphylococcus carnosus i Lactobacillus plantarum sau taphylococcus xilosus i Lactobacillus sa,e. >e consider c prin folosirea dro)diei menionate produsele capt o arom cu totul deosebit. 9$ 4tilizarea 8n industria laptelui (a fabricarea br*nzeturilor, dro)diile se dez olt la suprafaa br*nzeturilor dar i %n interiorul br*nzeturilor cu past moale sau cu mucegai %n past %n timpul presrii, z *ntrii i maturrii, a *nd urmtoarele aciuni poziti e! consum lactatul i %n acest fel contribuie la neutralizarea pastei, %mbuntind prin aceasta consistena i fa oriz*nd implantarea bacteriilor5 produc factori de cretere pentru dez oltarea bacteriilor5 produc o pelicul de Qacoperire$ la anumite tipuri de br*nzeturi5 produc proteoliz i lipoliz i prin urmare contribuie la consistena i aroma br*nzei respecti e5 produc compui olatili de arom. Dintre dro)dii, Candida hansei a fost culti at %n asociaie cu lactobacili i tr$ thermophilus, fa oriz*nd oxidarea lactatului, scderea potenialului de oxidoreducere i producerea de factori de cretere, precum i dez oltarea culturilor starter %n care este asociat. Dro)dia Candida lipolitica este uneori folosit la fabricarea br*nzeturilor cu mucegai %n past, datorit faptului c prin lipazele coninute realizeaz o hidroliz a lipidelor din br*nz, fapt ce fa orizeaz utilizarea acizilor grai de ctre Penicillium
" concentraia zahrului fermentescibil din mediu5

" temperatur 5 " coninutul %n alcool din substrat5 " felul dro)diei. .oncentraia fa orabil de zahr fermentescibil este de 1A" 1<D. @ermentaia alcoolic se desfoar lent la p1 4"4,<, %n mediu alcalin sensul fermentaiei fiind schimbat. Miteza maxim de fermentare este la 3A., dar %n practic se realizeaz la 4X2E.. 0lcoolul pe msura acumulrii %n mediu de ine toxic pentru dro)dii. ,xist dro)dii care se dez olt la 1:"1ED alcool ( accharomyces che!alieri 6uilliermond, accharomyces o!iformis), %ns %n cele mai multe cazuri fermentaia se oprete la 12"14D ( accharomyces u!arum, accharomyces carlsbergensis, accharomyces !ini, accharomyces cere!isiae)$ ;dat cu creterea temperaturii de fermentare se mrete toxicitatea alcoolului. @ermentaia alcoolic este un proces anaerob. ?rin trecerea la aerobioz, dro)diile se %nmulesc rapid i produc biomas. @ermentarea alcoolic nu este o fermentaie pur. >e mai formeaz glicerin ( ED din totalul zaharurilor existente %n mediu), acid lactic, acid acetic, substane acetoinice (acetil metil carbinol J acetoin i diacetil), acid malic, acid succinic, acid propionic, acid citramalic, acid dimetilgliceric, alcooli superiori! izobutilic, izoamilic, amilic, care pro in din aminoacizii rezultai la degradarea substanelor pectice din musturi i plmezi.
%n reaciile de "oxidare. Dro)dia +orulopsis candida gsit pe br*nzeturi se dez olt bine %n medii acide i suport concentraii de =a.l p*n la 1AD. Dro)dia Candida ,efir i alte dro)dii din granula de chefir realizeaz fermentaia alcoolic %n produsul lactat acid dietetic chefir. "luy!eromices lactis i "luy!eromices fragilis se utilizeaz la obinerea de lactaz care are multe utilizri. "luy!eromices lactis i "luy!eromices fragilis se utilizeaz la obinerea de biomas prin culti are aerob pe zer (procedeul Bell C @rana). "luy!eromices fragilis i Candida pseudotropicalis se utilizeaz pentru obinerea alcoolului etilic din zer (procedeul .arberB C7rlanda). MUCEGAIURILE ?entru industria alimentar intereseaz clasa Ph.com.cetes cu urmtoarele genuri! ,enul $ucor #i Rhizopus aparin*nd familiei Mucoraceae. 0ceste mucegaiuri care se %nt*lnesc pentru diferite produse egetale i alimentare, sub form de colonii pufoase, au o aciune fermentati net. pecii de Mucor i 5hizopus se folosesc pentru! " obinerea unor produse alimentare fermentate %n ;rientul +ndeprtat, pe baz de cereale i leguminoase5
22
+n cazul salamurilor crude afumateHneafumate, mucegaiurile de acoperire contribuie la! " reglarea eliminrii apei din produs i a schimbului de gaze5 " formarea aromei5 " %mbuntirea aspectului comercial al produsului. 0roma este mai e ident la salamurile cu diametru mai mic. ?rodusele pot fi li rate cu mucegaiul de acoperire intact sau dup Q periere$. .uloarea miceliului rmas este dependent de arietatea mucegaiului folosit! alb"i orie (preferabil %n 7talia)5 gri (preferabil %n 6ngaria)5 alb"mat (preferabil %n Gom*nia). ?rin utilizarea culturilor pure de mucegai se suprim apariia la suprafaa salamurilor a mucegaiurilor toxicogene, %n special a celor productoare de aflatoxine precum i a mucegaiurilor de Qptare$ care produc spoturi de culoare erde sau neagr. Penicillium nalgio!ensis >e utilizeaz spori de Penicillium nalgio!ensis pentru salamurile crude cu miceliu alb la suprafa. >porii, %n suspensie, se pul erizeaz la suprafaa produselor. Dup 3"4 zile de la %nsm*nare se formeaz micelii, iar dup <": zile de la %nsm*nare apar corpii de fructificaie purttori de conidii. &emperatura optim de dez oltare a mucegaiului este de 22"23.. Penicillium nalgio!ensis folosete ca substrat nutriti glucidele dar are i acti itate proteolitic i lipolitic. =u are acti itate celulazic i nu produce micotoxine. Penicillium expansum se dez olt bine la 22. i umiditatea relati a aerului este de V E2D pentru sporulare i V EED pentru germinare. Dez oltarea bun este la J 82"8<D. >porii pul erizai la suprafaa batoanelor formeaz un miceliu pufos %n circa E zile de la %nsm*nare, maturizarea deplin a *nd loc dup 3A zile de la %nsm*nare. Penicillum expansum nu produce micotoxine dac substratul conine proteine cu sulf (cazul pastei salamurilor crude). +n i#'u(tria la*t"lui culturile de spori de mucegai se utilizeaz, aa cum de)a s"a menionat, la fabricarea br*nzeturilor cu mucegai %n past c*t i cu mucegai la suprafa (br*nzeturi cu past moale). ?entru br*nzeturile cu mucegai %n past (Br*nza GoYuefort, Iorgonzola, >tilton, Iammelost) se utilizeaz spori de Penicillium ro<uefort. ?entru br*nzeturile de tip .amembert se utilizeaz sporii de la dou specii de Penicillium; P$ camemberti i P$ caseicolum$ -ucegaiurile dez oltate %nHpe aceste br*nzeturi au rol fundamental %n! " formarea aromei i gustului5 " formarea consistenei5
" %n producia de spirt prin zaharificarea amidonului

(procedeul 0milo care folosete Amylomyces rouxi : Mucor rouxianus)5
" %n producia de enzime, %n principal amilolitice i

proteolitice. 2in clasa Ascomycetes intereseaz ordinul Plectascales cu genurile Aspergillus i Penicillium$ Mucegaiurile din genul Aspergillus se utilizeaz' 8n; " producia de unc %n >60 i >pania (mai puin)5 " obinerea de produse fermentate tradiionale %n ;rientul +ndeprtat (ce a mai mult)5 " obinerea de pectolitice. enzime! amilaze, proteaze, enzime
Mucegaiurile din genul Penicillium se utilizeaz' 8n;
" industria br*nzeturilor cu mucegai la suprafa i %n past

(Penicillium camemberti i Penicillium ro<ueforti)*
" industria crnii cu mucegaiuri de acoperire (Penicillium

nalgio!ensis i Penicillium exposus)* " obinerea de enzime amilolitice, proteolitice, pectolitice. +n i#'u(tria +!r#ii, culturile de spori de mucegai se utilizeaz pentru maturarea unor unci, care se %nsm*neaz cu spori de Penicillium netoxicogen, %n special P$ nalgio!ensis, P$ exposum, i P$ chrysogenum, respecti .ountrB curred ham i Sambon >erano, care se %nsm*neaz cu spori de Aspergillus glaucus i a unor tipuri de salamuri crude fabricate %n Gom*nia , 7talia, 6ngaria, ,l eia, >pania, @rana, Bulgaria5 0ustria, Belgia, Iermania (i mai puin %n >60, 7srael, 7ugosla ia, ?olonia).
" definiti area aspectului, procesele care inter in %n

formarea aromei i consistenei fiind proteoliza, lipoliza i "oxidarea acizilor grai. >uspensiile de spori se pot adugaHfolosi!
" %n laptele destinat br*nzeturilor sau amestecarea cu coagulul obinut %n cazul br*nzei cu mucegai %n past5 " %n laptele destinat fabricrii br*nzei, sau pul erizare la suprafaa br*nzei formate %n cazul br*nzeturilor cu mucegai la suprafa. -ucegaiurile mai importante pentru industria laptelui sunt! Penicillium ro<ueforti +hom se dez olt bine la 2A"2<. i p1 4,<"9,<. &olereaz concentraii de <"ED =a.l. 0re acti itate proteolitic, lipolitic i de "oxidare a acizilor grai. 0cti itatea mucegaiului este st*n)enit de prezena acidului propionic %n br*nz, la concentraii mari de 3AD .;2 %n aerul depozitului. ?entru intensificarea formrii aromei se recomand ca lipidele din lapte s fie %n prealabil lipolizate cu esteraz pregastric, astfel ca pe msur ce mucegaiul sporuleaz, acizii grai liberi s fie "oxidai p*n la metilcetone. P$ ro<ueforti se dez olt %n canalele i golurile practicate %n pasta br*nzei, sporii formai a *nd culoare erde %nchis care confer br*nzei un aspect marmorat. Penicillium camemberti i Penicillium caseicolum >porii acestor mucegaiuri se utilizeaz %n producia br*nzeturilor de tip .amembert incluz*nd .amembert, Brie, =eufchatel, .oulommier, IarrZ de lL,st, ;li et. Penicillium camemberti +hom (Penicillium album) se utilizeaz la br*nzeturile tip .amembert cu past mai untoas, mai parfumat, de culoare gri C alburie. Penicillium caseicolum #ainer (Penicillium candidum) se utilizeaz la br*nzeturile de tip .amembert cu pasta mai compact, o arom mai delicat, mai discret i de culoare alb C imaculat. (a %nsm*nare prin pul erizare de spori la suprafa a br*nzeturilor cu umiditate V <<":AD se formeaz miceliile de mucegai care consum din aciditatea pastei, consecina fiind creterea p1"ului %ncep*nd cu a 12 Ca zi, iar dup 29 de zile p1"ul rm*ne constant. -ucegaiurile din genul Penicillium au acti itate endoproteinazic fa de " i cazein, dar au i acti itate exopeptidazic important, fiind demonstrat faptul c at*t P$ ro<ueforti c*t i P$ camemberti sintetizeaz 2 endopeptidaze (o metal proteinaz i o aspartil proteinaz) precum i dou exopeptidaze cu aciune carboxi" i aminopeptidazic, acti itatea celor dou grupe de enzime fiind relati echi alent %n stratul de suprafa al br*nzeturilor. 6nele specii de Penicillium camemberti pot produce o micotoxin* (acidul ciclopiazonic, dar acti itatea toxicogen a mucegaiului este aproape nul la temperatura tehnologic de maturare a br*nzei (14"1:.). (a br*nza .amembert se pot utiliza i spori de 6eotricum candidum care se introduc %n lapte. 6eotricum reduce pericolul formrii peptidelor amare, inhib dez oltarea lui Penicillium, consum acidul lactic i deci contribuie la neutralizarea pastei, a *nd i aciune protolitic i lipolitic. Br*nza .amembert obinut din lapte pasteurizat cu adaos de 6eotricum candidum are o arom asemntoare cu cea a br*nzei .amembert tradiionale, adic fabricat din lapte crud. 1.).2. Culturi (tart"r
23
.ulturile starter sunt definite ca acele culturi care se obin plec*nd de la o cultur pur stoc i care prin trecere prin culturi intermediare (pasa)e) de in apte de a fi folosite pentru producia unor alimente fermentate. .ulturile starter pot fi formate numai dintr"un singur microorganism sau din mai multe microorganisme. .ulturile starter de microorganisme sunt utilizate %n ederea! diri)rii unor procese biochimice prin care se asigur produsului un anumit grad de inocuitate (inclusi capacitatea de conser are)5 asigurrii unor %nsuiri senzoriale5 asigurrii, %n unele cazuri, i a unor %nsuiri nutriti e. (a folosirea culturilor starter %n industria alimentar trebuie s se aib %n edere urmtoarele! s conin un anumit numr de microorganisme iabile (gHml) i un numr c*t mai redus de germeni nedorii5 produii metabolici, primari i secundari, s nu prezinte pericol pentru sntatea oamenilor5 s nu conin i s nu produc antibiotice care se utilizeaz %n scop terapeutic la oameni5 s aib o anumit (anumite) acti iti specifice! de producere a acidului lactic, de reducere a azotului etc5 microorganismele existente %n cultur s fie declarate cu numele tiinific %ntreg5 speciile (suele) noi care se introduc %n producie, trebuie s fie %nregistrate la -> i s fie depozitate %n colecii cu nomenclator5 %nainte de utilizare %n producie s fie testate din punct de edere al inocuitii %n conformitate cu legislaia %n igoare5 suele declarate a fi sigure trebuie controlate la inter ale regulate de ctre institute specializate, %n ceea ce pri ete puritatea lor5 speciile, care pe baza noilor cunotine tiinifice au fost recunoscute ca a *nd potenial patogen sau toxicogen, trebuie s fie supuse unui control riguros pentru fiecare su, realiz*ndu"se studii de toxicitate pe termen lung, de carcinogenitate i mutagenitate. &oate cele menionate trebuie s se constituie ca o obligati itate absolut deoarece! culturile starter se pot consuma %n stare ie, odat cu produsul alimentar, aa cum este cazul produselor lactate acide, br*nzeturilor, salamurilor i c*rnailor cruzi, a unor sortimente de bere, a unor produse egetale! arz murat, castra ei murai, gogonele murate, msline erzi5 culturile starter se pot consuma dup distrugerea lor, rm*n*nd %n produsul alimentar at*t ele c*t i produii lor de metabolism, aa cum este cazul br*nzei proaspete de aci i a iaurtului care au fost pasteurizate, br*nzeturilor topite, produselor de panificaie etc.5
produii de metabolism ai culturilor starter se consum odat cu produsele alimentare, %ns microorganismele sunt eliminate %n cea mai mare parte, aa cum este cazul berii, inului, alcoolului, oetului, acidului citric, acidului lactic etc. Culturi (tart"r '" 0a+t"rii la+ti+" .ulturile starter de bacterii lactice sunt folosite %n diferite domenii! industria laptelui, crnii, produselor egetale murate, industria inului, industria panificaiei, industria sucurilor de fructe i legume fermentate etc. @olosirea culturilor starter de bacterii lactice asigur produselor alimentare %n care se introduc un anumit grad de inocuitate. 0ceast asigurare este realizat deoarece bacteriile lactice produc! acizi organici, %n principal acid lactic, dar i acid acetic, alcool, .;25 substane bacteriocine eliberate %n mediul de cultur5 peroxizi organici (12;2).
24
" bacteriocinele sunt excretate %n mediu %n cea mai mare parte5 o mic parte rm*n %n celulele bacteriene5 " bacteriocinele difer de antibiotice prin natura speciilor i suelor productoare, modalitile de producere i natura lor chimic5 " bacteriocinele secretate de bacteriile lactice din culturile starter sau de protecie au un spectru de aciune relati limitat %n raport cu mai multe specii sau mai multe sue ale aceleiai specii. " bacteriocinele sunt sensibile la aciunea enzimelor proteolitice metabolice, ceea ce %nseamn c ingerarea de produse ce conin bacteriocine nu modific microbiota tractului intestinal i nu a conduce la riscuri %n ceea ce pri ete folosirea de antibiotice comune5 " bacteriocinele sunt stabile la cldur, deci rezist %n laptele pasteurizat la :3.H3As minimum sau la 92.H1< s5 rezistena lor termic se datoreaz structurii moleculare simple (excepie face hel eticina S care are o structur proteic mai elaborat)5 " bacteriocinele sunt stabile la p1 neutru sau acid, ceea ce %nseamn c sunt adaptate la condiiile de mediu ale bacteriilor productoare5 " eficacitatea bacteriocinelor %n produsele fermentate este limitat de condiiile de conducere a fermentaiei (temperatur, p1, aO) Culturi (tart"r utili at" i# i#'u(tria la*t"lui (a obinerea culturilor starter trebuie s a em %n edere %n mod deosebit urmtoarele! " " " mediul de cultur (laptele)5 tratamentul termic aplicat laptelui5 condiiile de incubare5
+n plus, bacteriile lactice intr %n competiie cu microorganismele patogene i cele de alterare %n ceea ce pri ete consumul de substane nutriti e, iar datorit i acidifierii mediului, consecin a acumulrii acizilor organici, bacteriile patogene i de alterare sunt inhibate %n dez oltarea lor. Dintre bacteriile patogene sunt inhibate stafilococii, salmonelele, Listeria monocytogenes, Cl$ botulinum etc. Datorit aciditii se inhib i dez oltarea microflorei cu acti itate proteolitic i decarboxilazic, deci se formeaz cantiti mai reduse de amine biogene, iar %n cazul crnurilor srate %n prezen de azotii, datorit aciditii se fa orizeaz descompunerea mai complet a azotiilor, deci scade producia de nitrozamine, mai ales la produsele care se supun coacerii i pr)irii. .ulturile starter de bacterii lactice folosite ca atare sau sub form de produse lactate dietetice acide sunt benefice pentru sntatea oamenilor deoarece! aciditatea lactic fa orizeaz aciunea pepsinei ce produce hidroliza proteinelor, respecti coagularea cazeinei laptelui care este %n continuare degradat de tripsina pancreatic5 aciditatea mediului intestinal blocheaz dez oltarea microflorei cu acti itate patogen i fa orizeaz implantarea bifidobacteriilor cu consecine poziti e pentru organismul uman ( ezi capitolul probiotice). +n legtur cu bacteriocinele, %n continuare se fac urmtoarele precizri! " bacteriocinele sunt secretate de bacteriile Iram negati e5 " bacteriocinele sunt proteine i acti itatea lor dispare prin hidroliza lor de ctre proteaze5 " bacteriocinele au aciune bactericid, dar nizina este i bacteriostatic. -ulte bacteriocine sunt bacteriostatice la aplicarea lor %n produsele alimentare5
" interaciunile dintre speciileHtulpinile din cultura starter5 " " e entualele infectri cu bacteriofagi5 instabilitatea culturilor starter de bacterii lactice.
De la %nceput, facem precizarea c prin cultur starter %nelegem culturile obinute din cultura pur stoc (inoculum) prin diferite pasa)e. .ulturile starter sunt folosite la fabricarea unor produse lactate acide, sm*nt*n, unt, br*nzeturi. .ulturile starter de bacterii lactice utilizate %n industria laptelui pot fi clasificate %n mezofile i termofile. 0ulturile starter mezofile" care la r*ndul lor, pot fi clasificate %n! a) Culturi starter singulare (single strain starter) care conin numai tr$ lactis subsp$ lactis i respecti tr$ lactis subsp$ cremoris (Lactococcus lactis i Lactococcus cremoris) ambii homofermentatic i care produc acid lactic ((R) %n proporie de A,ED. @olosirea acestor culturi starter singulare a aprut ca o necesitate de a se e ita formarea
Qochiurilor$ de fermentare la unele br*nzeturi, Qochiuri$ formate %n urma producerii de .;2 de ctre bacteriile aromatizante. .ulturile starter singulare mezofile prezint urmtoarele a7a#ta<"! " se poate utiliza continuu aceeai cultur cu acti itate relati constant i pre izibil5 " nu este necesar alternarea culturilor, elimin*ndu" se riscul deprecierii acestora de ctre fagi, " se folosesc cantiti mai mici de inoculum pentru obinerea de cultur primar i secundar5 " influenele compoziionale sezoniere ale laptelui sunt mai reduse5 " se creeaz condiii de realizare a unei producii standardizate de produse lactate de calitate superioar5 " cultura poate fi controlat i supra egheat din punct de edere al caracteristicilor sale (sensibilitate la fagi, producerea de acid lactic, compatibilitatea ei, aglutinarea i e entual lisogenia). .ulturile starter singulare urmtoarele '" a7a#ta<"! mezofile prezint %ns
25
culturi starter mixte tip (D care conin at*t specii de leuconostoci c*t i tr$ lactis subsp$ diacetilactis ca productori de arom. (a folosirea culturilor starter mixte trebuie s a em %n edere c! " streptococii acidifiani mezofili homofermentati i produc acid lactic din lactoz5 " leuconostocii, cei heterofermentati i, i tr$ lactis subsp$ diacetilactis (homofermentati ) produc diacetil i acetoin din citrat, dar produc i acid lactic, acetic prin fermentarea lactozei i glucozei5 0ulturi starter termofile .ulturile starter termofile pot fi! acidifiante! Lactobacillus acidophilus5 acidifianteHaromatizante care la r*ndul lor pot fi constituite din unul sau mai multe specii de lactobacili i dintr"o specie de streptococi. +n aceast direcie amintim! " cultura starter termofil pentru iaurt! Lactobacillus bulgaricus i tr$ therrmophilus5 " cultura starter termofil pentru br*nzeturi! Lactobacillus bulgaricus = Lactobacillus lactis = Lactobacillus hel!eticus = tr$ thermophilus. 0ceast cultur starter se folosete la fabricarea br*nzeturilor cu past tare i semitare, deci la care se practic %nclzirea a doua a bobului de coagul. 6tilizarea deoarece! culturilor starter termofile este benefic
" pot fi depreciate de tulpinile productoare de bacteriocine5 " pot fi depreciate de fagi, deci sunt predispuse la liz fagic5 " pot suferi pierderi de plasmide i deci pot pierde una sau mai multe din funciile lor. b) Culturi starter multiple mezofile sunt acele culturi care se bazeaz pe folosirea a <": tulpini selecionate, ne%nrudite pe plan fagic i culti ate separat p*n la stadiul de cultur primar sau chiar p*n la stadiul de cultur starter de producie c*nd se amestec %ntre ele. +n aceste condiii, tulpinile nu se dez olt %mpreun dec*t cel mult timp de 1A generaii, ceea ce face ca nici o tulpin s nu de in dominant. 0semenea culturi pot fi folosite mai multe luni %n ir fr a"i pierde capacitatea de acidifiere. c) Culturi starter mezofile mixte 0ceste culturi sunt formate, de regul, din dou tipuri de bacterii lactice! " bacterii lactice acidifiante! cremoris5 tr$ lactis sau tr$
produc acid lactic deci scad p1"ul laptelui i determin coagularea acestuia (cazul iaurtului)5 la br*nzeturi acidifierea fa orizeaz eliminarea zerului din coagul5 au acti itate proteolitic i prin urmare contribuie la ameliorarea proprietilor reologice i la aroma produselor fermentate5 ca urmare a acti itii proteolitice rezult i aminoacizi din proteine care stimuleaz dez oltarea celorlalte bacterii din culturile starter termofile5 produc i compui de arom, dar %n principal aldehid acetic, aceton, precum i urme de acetoin5 produc i substane cu caracter filant care influeneaz *scozitatea produsului ( tr$ thermophilus %n cultura pentru iaurt)5 produc o serie de bacteriocine (Lactobacillus hel!eticus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei etc.)5 produc 12;2 (Lactobacillus bulgaricus). 0 *nd %n edere cantitile mari de iaurt ce se fabric pe plan mondial, este necesar s cunoatem factorii care influeneaz performana optim a culturilor pentru iaurt. 0ceti factori se refer la! temperatura de incubare care este de 41"42. (apropiat de temperatura optim de dez oltare a lui Lactobacillus bulgaricus ). Dup 3 ore de incubare se
" bacterii lactice productoare de arom! tr$ diacetilactis (Lactococcus lactis !ar$ diacetilactis) sau specii de leuconostoci. Dup tipul bacteriilor aromatizante culturile starter mixte mezofile pot fi clasificate %n urmtoarele grupe! culturi starter mixte tip ( care conin numai specii din genul Leuconostoc; Leuconostoc cremoris (citro!orum), Leuconostoc dextranicum iHsau Leuconostoc lactis care sunt toi heterofermentati i i produc acid lactic D(")5 culturi starter mixte de tip D care conin tr$ lactis bio!$ diacetilactis ca singur specie productoare de arom5
a)unge la V <AA mil bacteriiHg, raportul dintre L$ bulgaricus i tr$ thermophilus fiind 1H15 tratamentul laptelui : pasteurizarea influeneaz poziti dez oltarea lui L$ bulgaricus prin! " modificarea structurii proteinelor5 " eliminarea parial a oxigenului i realizarea unei microaerofilii propice5 " distrugerea inhibitorilor din lapte5 acid formic care fa orizeaz " formarea de dez oltarea culturii5
2"
rezistena la rcire care este important pentru produsele lactate ce se congeleaz (iaurt, %ngheata de iaurt). Gezistena la rcire se urmrete la C : " 8. i apoi la "1E. sau "2<. 5 producerea de substane filante care const %n msurarea *scozitii pe o prob inoculat de lapte cu 12D s.u., cu adaos de .a.l2 A,A12D, incubat 4 oreH39. p*n ce se atinge un p1 de 4,2"4,3. >e pot depista %n acest fel culturile filante5 acti itatea proteolitic se poate urmri pe o cultur pstrat la 4. la care se determin tirozina sau aminoacizii liberi prin metoda formol titrimetric5 acti itatea lipolitic se poate determina prin msurarea indicelui de aciditate din grsimea culturii (lapte)5 proprietile senzoriale se determin la culturile de 24"4E ore la 2A. (se pot determina i substanele de arom respecti diacetilul, acetaldehida, acetoina). CULTURI .TARTER CONCENTRATE DE MICROORGANI.ME D"3i#i1i" .ulturile starter concentrate sunt definite ca acele culturi dez oltate %n condiii controlate, concentrate %ntr"un olum mic i conser ate prin congelare sau uscare %n ederea depozitrii i transportului. .ulturile concentrate pot fi de bacterii, dro)dii, spori de mucegai. +n ceea ce pri ete culturile starter concentrate de bacterii cele mai des utilizate sunt culturile de bacterii lactice. ?e l*ng acestea se folosesc i alte culturi de bacterii concentrate! micrococi, pediococi, stafilococi, streptomicii, bacterii propionice etc. .ulturile concentrate de bacterii pot fi utilizate pentru! obinerea culturilor starter de producie (maiele de producie)5 obinerea produselor fermentate prin utilizare direct %n lapte, compoziii carnate etc.
disponibilitatea substratului (aptele este un bun substrat dar trebuie artat c Lactobacillus bulgaricus are preferin fa de glucoz i deci ar trebui ca lactoza s fie prehidrolizat la "galactozidaza5 metaboli&i produi 8n mediu. Lactobacillus bulgaricus produce 12;2 %n mediul de cultur i deci adausul de catalaz a stimula producia de acid lactic de ctre tr$ thermophilus care este mai sensibil la 12;2 dec*t Lactobacillus bulgaricus. (aptele destinat iaurtului nu trebuie s fie agitat prea mult ca s nu includ aer (oxigen) care ar strica condiiile de microaerofilie pentru L$ bulgaricus i ar de eni toxic pentru tr$ thermophilus$ Lactobacillus bulgaricus se apr de aciunea oxigenului prin intermediul manganului intracelular care %nlocuiete aciunea superoxiddismutazei5 interac&iunile dintre bacterii din cultura pur (inoculum) sau cultura starter. +ntre cele dou microorganisme exist un sinergism deosebit. Lactobacillus bulgaricus produce aminoacizi din cazein care sunt necesari dez oltrii lui tr$ thermophilus care, la r*ndul su, fa orizeaz dez oltarea lui L$ bulgaricus prin producerea de acid formic i .;25 calitatea laptelui ca substrat de fermentare. 0cesta nu trebuie s conin antibiotice, substane conser ante, dezinfectante i s pro in de la animale sntoase cu maximum 4AAAAA leucociteHml.
C%#tr%lul +ulturil%r (tart"r '" 0a+t"rii la+ti+" .ontrolul culturilor determinri! starter implic urmtoarele
7ndiferent de domeniul de utilizare, culturile starter concentrate pot fi obinute prin dou procedee! procedeul de culti are periodic5 procedeul de culti are continu.
examenul microscopic care trebuie s arate raportul dintre coci i bacili, raport care trebuie s se situeze %n limitele 1H1"1,<H15 acti itatea acidifiant care se urmrete prin determinarea aciditii titrabile atunci c*nd cultura se afl %n faz logaritmic. +n acest fel se pot pune %n e iden culturile Qrapide$ i Qlente$ (fast and sloO)5 rezistena la aciditate, in*ndu"se seama c Lactobacillus bulgaricus rezist p*n la V 1,9D aciditate iar tr$ thermophilus p*n la A,ED. Gezistena la aciditate se urmrete prin determinarea supra ieuitorilor dup ce %n mediul de cultur se atinge o aciditate critic5
T"-#%l%gia '" %01i#"r" a +ulturil%r (tart"r +%#+"#trat" &ehnologia de obinere include urmtoarele operaii de baz! inocularea mediului de cultur cu microorganismul din cultura stoc5 incubare pentru multiplicare la ni el maxim5 concentrarea mediului %mpreun cu celulele sau separarea celulelor, de regul prin centrifugare i resuspendare %ntr"un lichid adec at,
conser are prin congelare i uscare5 depozitare %n stare congelat i uscat.
2'
introduce %n pungi de plastic care se congeleaz %n azot lichid. Depozitarea culturilor starter concentrate se poate face! a) la temperaturi de C2AX"4A.5 b) la temperatura de "18:. (%n azot lichid)5 " +%#("r7ar"a *ri# r"'u+"r"a +%#1i#utului '" a*! se face prin liofilizare, %n care caz concentratul de bacterii se amestec cu un suport adec at (lapte praf degresat, lactoproteine pulbere lactoz, zaharoz) dup care se liofilizeaz. (a liofilizare (faza de desicare secundar) temperatura produsului nu trebuie s depeasc 4A"4<.. Dup liofilizare se face ambalarea sub id sau %n atmosfer de gaz inert. Depozitarea produselor liofilizate trebuie s se fac la temperaturi sczute ("1E.). .ulturile starter concentrate trebuie s conin %ntre 2,<K1A1A C <,<K1A1A celule iabile"acti eH g sau ml. Utili ar"a +ulturil%r (tart"r +%#+"#trat" '" 0a+t"rii la+ti+" &# i#'u(tria la*t"lui .ulturile starter concentrate de bacterii lactice care se folosesc %n industria laptelui sunt acelea destinate! pentru br*nza .heddar, br*nzeturi tip italian i el eian5 pentru br*nza de aci, sm*nt*n, lapte btut, iaurt. 0 anta)ele i deza anta)ele folosirii culturilor starter de bacterii lactice %n industria laptelui sunt artate %n tabelul de mai )os. 0 anta)ele i deza anta)ele folosirii culturilor starter de bacterii acterii lactice Culturi (tart"r +%#+"#trat" '" 0a+t"rii *r%*i%#i+" *"#tru i#'u(tria la*t"lui -ediul de cultur pentru realizarea culturilor starter concentrate de bacterii propionice poate fi laptele degresat cu adaos de 1D tripticaz, 1D extract de dro)die ca surs de itamine i factori suplimentari de cretere 1D lactat de sodiu5 A,A2<D P12?;45 A,AAA<D -n>;4. -ediul de cultur se a)usteaz la p1 J 9,A i se sterilizeaz. 7ncubarea mediului de cultur inoculat cu bacterii propionice din cultura stoc se face la 32.H3 zile. Dac mediul de cultur conin*nd bacterii propionice dez oltate dup incubare se utilizeaz ca o cultur (maia) de producie, atunci dez oltarea bacteriilor propionice se oprete %nainte de coagularea laptelui, deoarece %n stare de coagul, cultura starter se repartizeaz greu %n laptele destinat fabricrii br*nzeturilor. .elelalte operaii de obinere a culturii starter concentrate de bacterii propionice sunt aceleai ca cele descrise la celelalte tipuri de culturi starter concentrate. Depozitarea culturilor starter concentrate de bacterii propionice se face la <. %n care caz celulele %i pstreaz
+n tehnologia de obinere a culturilor starter concentrate trebuie ales un mediu de cultur care s asigure toate substanele pentru dez oltarea (multiplicarea) culturii, realiz*ndu"se un control riguros al temperaturii i meninerii p1"ului la alori optime. ?entru e entuala neutralizare a aciditii se utilizeaz A7a#ta<" D" a7a#ta<" 0cti itatea culturilor =ecesit spaii de poate fi controlat i depozitare la temperaturi supra egheat %nainte de sczute at*t la productor expediere c*t i la cumprtor pentru >e elimin operaiile pstrare p*n la folosire de %ntreinere i de preparare .oncentrarea nu a maielelor intermediare este posibil la toate (primar, secundar, teriar) culturile starter >e face economie la Depozitarea %n fora de munc stare congelat sau uscat, >e pot stabili uor %n funcie de timp, poate sistemele de rotaie %n conduce la micorarea ederea e itrii infeciei cu drastic a numrului de celule iabile bacteriofagi .ulturile pot s fie >e obin produse de influenate negati %n ceea calitate mai constant >e scurteaz ce pri ete unele plasmide codific anumite procesele tehnologice ale ce funciuni fabricrii produselor prin accelerarea acidifierii, deoarece se suprim faza de dez oltare logaritmic %n laptele de fabricaie hidroxid de amoniu iHsau hidroxid de calciu. .onser area prin congelare a concentratului microorganisme se face %n dou moduri! de
" (u0 3%r$! li+-i'!, %n care caz, concentratul de bacterii se suspend %ntr"un antigel solubil %n ap (alcooli polihidrici) care se utilizeaz %n proporie de 4A"<AD fa de concentrat. .ongelarea se face la "4A. (de fapt se realizeaz o subrcire). 0cest gen de conser are prezint urmtoarele a anta)e! se %mpiedic aciunea duntoare a gheii asupra celulelor de bacterii5 manipularea concentratului este mai uoar5 concentratul se poate %nclzi p*n la temperatura de utilizare chiar %n timpul manipulrii fr ca celulele s"i piard iabilitatea i acti itatea5 " +%#g"lar"a &# a %t li+-i' ("18:.) %n care caz concentratul se amestec cu un agent crioprotector! 1AD glicerol, 9,<D lactoz %n cazul bacteriilor lactice. ?entru culturile starter concentrate de pediococi s"a propus ca la concentrat s se adauge ageni de stabilizare cum ar fi! glicerolul, lapte praf degresat, extract de mal, metalglicerofosfai alcalini, glutamat monosodic, acid glutamic, cistin iHsau dextran. 0mestecul respecti se
iabilitatea i acti itatea E sptm*ni. Depozitarea la 2<. poate fi fcut pentru cel mult 2 sptm*ni. .ulturile starter concentrate se adaug direct %n laptele destinat fabricrii br*nzeturilor (deci nu se mai folosesc obinerea de culturi intermediare). Utili ar"a +ulturil%r (tart"r +%#+"#trat" '" 0a+t"rii &# i#'u(tria +!r#ii .ulturile starter concentrate de bacterii folosite %n industria crnii pot fi singulare sau %n amestec. ,le pot fi formate din bacterii lactice (L$ plantarum, L$ sa,e, L$ pentosus, L$ alimentarius), pediococi (P$ acidilacti, P$ pentosaceus), stafilococi ( $ carnosus, $ xilosus), micrococi (M$ !arians), streptomicii ( treptomyces griseus). +n literatura de specialitate sunt menionate urmtoarele culturi starter concentrate de bacterii singulare sau %n amestec! $ carnosus $ carnosus = P$ pentosaceus* $ xylosus = P$ pentosaceus* M$ !arians* M$ !arians = P$ pentosaceus = P$ acidilacti* M$ !arians = P$ pentosaceus* $ carnosus = treptomyces griseus$ .ulturile starter de micrococi sau stafilococi sunt recomandate la maturarea lent a salamurilor crude unde se realizeaz o scdere lent a p1"ului i deci consistena produsului se realizeaz %n timp. Iustul acestor produse este puin acrior (p1 <,:":,1). .ulturile starter mixte (microcociHstafilocociHlactobacili) se utilizeaz la maturarea rapid a salamurilor crude %n care caz realizarea consistenei merge paralel cu acidifierea. .ulturile starter concentrate de utilizare %n industria crnii pot fi li rate %n stare lichid subrcit sau uscat. 0daosul %n compoziie trebuie s asigure o concentraie de cel puin 1A:"1A9Hg past. -odul de folosire al culturilor starter concentrate este %n funcie de modul lor de conser are. .ele congelate %n antigel se utilizeaz ca atare5 cele liofilizate se suspend %n ap pentru o distribuie mai uniform %n compoziie. .ulturile starter concentrate de bacterii lactice pentru industria crnii nu se amestec cu sare, condimente, acid ascorbic, acizi alimentari i nici nu se pstreaz %n amestec cu substanele menionate deoarece se inacti eaz rapid. De asemenea trebuie s se aib %n particulare! edere dou situaii
2%
@olosirea culturilor starter %n pasta cu adaos de uleiuri eterice. 0ceste uleiuri eterice au aciune bacteriostatic, mai ales dac sol entul lor este i alcoolul etilic i, deci, inhib culturile starter. +n acest caz se recomand s se foloseasc o cantitate mult mai mare de cultur starter, pe de alt parte uleiurile eterice s fie %ncapsulate. .ulturile starter concentrate folosite %n industria crnii trebuie s %ndeplineasc urmtoarele condiii! " " s fie tolerante la =a.l (concentraie 2,<"3D)5 s se dez olte bine %n saramura de concentraie :D5
" s se dez olte bine %n prezen de EA"1AA mg =a=;2H'g compoziie dar s acioneze i la temperatur mai sczut (14"24.)5 " s produc numai acid lactic (culturile starter concentrate de bacterii lactice s cuprind numai specii homofermentati e)5 " s fie puin lipolitice i proteolitice5 " s nu produc mirosuri i gusturi nedorite din cauza produilor secundari de metabolism5 " s fie nepatogene (s nu produc infecii i s nu produc toxine)5 " s se adapteze compoziiei de carne utilizat i condiiilor de fermentare a produselor, respecti la creterea concentraiei de =a.l, la temperatura de afumare rece i de uscare, de acti itate a apei care scade progresi pe msura uscrii produsului5 " s produc catalaz i nitratreductaz (cele cu micrococi, streptomicii, stafilococi)5 " s fie inacti ate la <9":A..
@olosirea culturilor starter concentrate de bacterii (%n special lactice i pediococi) prezint urmtoarele a anta)e! " se micoreaz durata de maturare a produselor carnate5 " se %mbuntesc proprietile senzoriale (gust, miros, consisten)5 " se asigur un grad %nalt de inocuitate produsului carnat (salamurile i c*rnai cruzi) prin controlul dez oltrii microorganismelor patogene i de alterare i prin limitarea folosirii unor substane cu caracter toxic (amine i nitrozamine).
@olosirea culturilor starter concentrate %n pasta cu adaos de ID( (glucono delta lactona). +n condiiile folosirii ID( p1"ul pastei scade rapid, proteinele sunt aduse la p1 izolelectric i pierd apa de hidratare, azotitul de reduce bine la =;, se fa orizeaz dez oltarea bacteriilor lactice care produc i 12;2. 0cidifierea rapid %mpiedic %ns dez oltarea micrococilor care sunt necesari dac se lucreaz cu =a=;3. (a folosirea ID( este deci recomandat s se foloseasc culturi starter concentrate de stafilococi care produc catalaz, reduc azotatul la azotit i se pot dez olta la p1 4,9 fiind i un bun productor de arom5
(actobacilii din culturile starter concentrate produc %n compoziia salamurilor crude urmtoarele efecte! acidifierea pastei cu urmtoarele consecine! " scderea p1"ului i deci aducerea proteinelor la punctul izoelectric deci i la starea de hidratare minim, fa oriz*ndu"se %n acest fel uscarea5 " reducerea mai rapid i mai complet a =a=;25
" inhibarea microorganismelor patogene! taphilococcus aureus, almonella, Cl$ botulinum* producerea de substane de arom5 controlul produciei de amine biogene prin inhibarea bacteriilor cu acti itate decarboxilazic (inhibare prin competiie fa de nutrieni i, respecti , prin acidifiere)5 controlul produciei de nitrozamine (aciditate format, respecti p1"ul sczut fa orizeaz transformarea =a=;2 %n =; i deci rm*ne %n produs o cantitate mai mic de =a=;2 care ar putea intra %n combinaie cu aminele secundare pentru a forma nitrozaminele5 controlul microflorei de alterare i patogene prin producia de 12;2, bacteriocine. ?ediococii din culturile starter concentrate produc %n compoziia salamurilor crude urmtoarele efecte! acidifierea mai redus a pastei la temperaturi mai ridicate fr formarea de produi care s afecteze negati gustul i mirosul5 producerea de 12;2, bacteriocine cu aciune inhibitoare fa de microorganismele patogene. Culturi (tart"r +%#+"#trat" '" (*%ri '" $u+"gai &ehnologia de obinere include urmtoarele operaii! prepararea mediului de cultur, sterilizarea acestuia i repartizarea %n eprubete (agar %nclinat)5 %nsm*narea mediului %n eprubete cu spori de mucegai ce se dorete a se culti a5 termostatare pentru germinare spori cu organe purttoare de spori i sporulare5 preluare spori cu 2 ml ser fiziologic A,ED i %nsm*nare medii de cultur .zape' cu 2D agar aflate %n ase Goux5 recoltare spori din ase Goux cu ser fiziologic A,ED astfel ca s se asigure %n suspensie 1AE"1A1A sporiHml5 pstrare suspensie la A"4..
2(
.ultura cu spori de mucegai concentrat poate fi li rat i sub form de emulsie liofilizat, emulgatorul fiind polietilsorbitanul . >e pot realiza culturi starter concentrate de spori cu mucegaiurile utilizate %n industria laptelui i crnii, utilizarea lor fiind %n funcie de produsul alimentar %n care se folosete cultura respecti de spori de mucegai. ?entru industria crnii, la utilizare suspensia de spori de mucegai concentrat se dilueaz cu ap fiart i rcit %n raport de 1H3.

Biotehnologia Obtinerii Preparatelor Enzimatice Culturi Starter de Microorganisme

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Biotehnologia Obtinerii Preparatelor Enzimatice Culturi Starter de Microorganisme

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Capitolul 1. Definiia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi starter de microorganisme.

1.1 BIOTEHNOLOGII ALIMENTARE DEFINIIE. OBIECTUL BIOTEHNOLOGIEI

Distilate; 5 Produse lactate; 5

Pectina#e; 10 Protea#e !ungice; 4

&luco#i#omera#e; 14 Amila#e !ungice; 1%

Amila#e $cteriene; 10 Protea#e $acteriene; 35 Protea#e de coagulare; 5

Figura 1.4. >chema tehnologic general de obinere a preparatelor enzimatice

@ig. 1.E. .ulti area submers a microorganismelor.

"membranele trebuie s fie rezistente la sterilizarea cu apori de ap i la igienizare cu substane

,xist i deza anta)e, cum ar fi!

::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::

" concentraia zahrului fermentescibil din mediu5

" %n producia de spirt prin zaharificarea amidonului

" %n producia de enzime, %n principal amilolitice i

Mucegaiurile din genul Penicillium se utilizeaz' 8n;

" industria br*nzeturilor cu mucegai la suprafa i %n past

" industria crnii cu mucegaiuri de acoperire (Penicillium

" definiti area aspectului, procesele care inter in %n

S-ar putea să vă placă și