Spectrofotometrie

1. Scopul lucrarii

Metoda spectrofotometrica face parte din clasa metodelor fizice de determinare a concentratiei unei
solutii in laborator. Similar celorlalte metode fizice, este simpla, rapida si ieftina. Folosind un
spectrofotometru Spekol, se va determina concentratie unei solutii.


2. Teoria lucrarii

Spectrofotometria reprezinta o clasa larga de metode de investigare. Ea face parte dintr-o clasa si mai
mare si anume, clasa metodelor spectrometrice. Orice metoda spectrometrica inregistreaza si masoara
spectre electromagnetice.
Spectru electromagnetic

Un spectru reprezinta totalitatea valorilor unei marimi ce caractereizeaza un sistem. In cazul unui spectru
electromagnetic acesta reprezinta totalitatea lungimilor de unde ( frecventelor ) pe care un sistem le poate
emite sau absorbi. Atunci cand un sistem absoarbe radiatii electrimagnetice, el trece pe un nivel energetic
superior, iar cand emite, pe unul inferior. Conditia ( de rezonanta ) ce trebuie indeplinita esti :
h=

Unde

= energia nivelului superior

= energia nivelului inferior

= frecventa radiatiei

Din conditia de rezonanta rezulta ca sistemele pot absorbi aceleasi radiatii pe care le pot si emite. Vom
obtine deci, practice, aceleasi informatii, fie ca analizam ce emite sistemul, fie ca inregistram ce absoarbe.
Daca lungimile de unde emise sau absorbite au valori intr-un domeniu cvasicontinuu, obtinem spectre de
benzi, iar daca variaza discontinuu, sunt spectre de linii. Spectrele de linii sunt in general specific
substantelor in stare atomica, in timp ce spectrele de benzi sunt, in general, specific substantelor in stare
moleculara.
Fiind vorba de un numar foarte mare de metode, se impune clasificarea lor. Si in acest caz se pot face mia
multe clasificari, vand in vedere mai multe criteria :
Fiind vorba de un numar foarte mare de metode, se impune clasificarea lor. Si in acest caz se pot face
mai multe clasificari, vand in vedere mai multe criteria :
Criteriul domeniului spectral investigat. In toate domeniile spectrale electromagnetice exista metode
de investigare, multe dintre ele cu aplicatii clinice. Domeniile spectrale electromagnetice sunt, in
ordinea crescatoare a lungimii de unda, urmatoarele : gama (Y), raza X, ultraviolete (UV),vizibil,
infrarosu (IR), microunde si radiounde. In cazul metodelor spectrometrice din domeniile UV, vizibil
si IR, metodele se numesc, in general, spectrofotometrice.

Criteriul modului de obtinere a spectrelor. Sistemele analizate pot fi puse sa emita sau sa absoarba
radiatii electromagnetice. Vorbim astfel de spectrometrie de emisie, respective de absorbtie.


Metode cu implicatii clinice :
Domeniul
spectral

Numele metodei Informatii
(actiuni) directe

Informatii
(actiuni) indirecte

Semnificatii
clinice
Gama-terapie
(cabaltoterapie)
Absorbtia
radiatiilor in
tesuturi
Distrugerea
celulelor
canceroase
Terapia
cancerului
Scintigrafia Inregistrarea
emisiei de radiatii
Determinarea
distributiei
radioizotopilor
introdusi in
organism
Diagnostic
functional al
organului
X Radiografie Absorbtia
radiatiilor X in
tesuturi
Imagini ale
organelor interne
Diagnisticarea
fracturilor etc.
X Tomografie
computerizate cu
raze X
Absorbtia razelor
X in tesuturi
Imagini ale
oricarei sectiuni
prin corp
Imagini cu detalii
de ordinul
milimetrului
UV, vizibil, IR Spectrofotometrie Absorbtia acestor
radiatii de catre
molecule
Determinarea
conc. Diferitelor
molecule
Diagnosticarea
diferitelor maladii
Vizibil, IR Oximetrie Abosrbita
radiatiilor rosii si
IR de catre sange
Determinarea
raportului

Monitorizarea
gradului de
oxigenare a
sangelui
Microunde RES Absorbtia
microundelor de
catre rad. Liberi
aflati in camp
magnetic
Urmarirea
proceselor in care
apar radicalii
liberi
Se spera ca se vor
putea urmari
procesele
metabloice
Radiounde RMN Absorbtia
radioundelor de
catre necleele de
H plasate in camp
magnetic
Imagini ale
oricarei sectiuni
prin corp
Imagini cu detalii
de ordinul
milimetrului






Un fascicol de radiaii de intensitate I
0
,ce strbate sub o inciden normal un strat absorbant, pierde o
parte din energia sa radiant prin reflexie I
r
iar o parte din aceasta este absorbit de ctre sistemul Ia.
Metoda de analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie este o metoda care are la baza legea
LAMBERT-BEER.


Deci din intensitatea iniial numai o parte din radiaie este transmis i ea se noteaz cu I
t
.
Gradul de diminuare al intensitii radiaiei incidente este (conform legii lui Beer-Lambert) proporional
cu grosimea stratului traversat i cu concentraia speciei absorbante:


Legea Beer-Lambert - exprim legtura ntre intensitatea luminii care traverseaz o soluie i
concentraia soluiei respective.



n spectrofotometrie se folosesc uzual doi parametri pentru a cuantifica absorbia:
T - este transmisia E - este extincia .

Se observa ca

x d. Este evident ca marimea absorbtiei depinde de numarul centrilor absorbanti,

respective de concentratia acestora, fapt explicat de Beer, care a stability relatia :

x C
Unde : C-concentratia substantei, masurata in mol/l


coeficient de extinctie, masurat in l/mol x cm
Coeficientul de extinctie depinde numai de lungimea de unda a radiatiei si caracterizeaza substanta
absorbanta. Asa cum atomii pot fi identificati, in emisie, dupa spectrele proprii de emisie, tot astfel o
anumita specie de atomi poate fi identificata prin studierea curbelor de absorbtie

()






3. Descrierea aparatului

Spectrofotometrul este un aparat optoelectronic care msoar raportul a dou valori ale unei mrimi
radiometrice la aceeai lungime de und i n acelai interval ngust de lungime de und . Cu ajutorul unor
oglinzi mobile din monocromator se schimb n salturi foarte mici frecvena luminii selectate din
radiaia total a sursei. De fiecare dat se msoar absorbia, transmisia sau extinia i se calculeaz
valoarea coeficientului de extinie E. Reprezentnd grafic variaia lui E n funcie de frecven sau
lungimea de und se obine o spectrogram (un spectru).

(T-100%)


Schema bloc a unui spectrofotometru

S- sursa de radiatii
M-monocromator, allege din ce emite sursa o singura lungime de unda
B-solventul (blanc) foloseste la etalonarea de T=100%
P-proba pentru care masura E (sau T)
D-detectorul transform alumina in current electric ( fotocelula sau fotomultiplicator)
A-amplificator
I-inregistrator, microampermetru gradat in unitati liniare de transmisie si unitati logaritmice de extinctie






M
B
P
D A I S
4. Mod de lucru


1. Se traseaz un grafic A = f()
2. Se traseaz cele patru curbe pentru fiecare soluie de AO (2, 4, 8, x); Obs: toate cele patru
curbe se traseaz pe acelai grafic
3. Se selecteaz lungimea de und corespunztoare maximului de absorbie pentru toate cele patru
soluii de AO

4. Se calculeaz concentraia necunoscut a soluiei de AO - dou metode:

a) calcularea concentraiei folosind metoda grafic:
se traseaz un grafic A = f(c) - cu valorile absorbanei pentru maximul de absorbie al soluiilor
de AO
se determin concentraia necunoscut a soluiei de AO prin intrapolare
b) calcularea concentraiei prin metoda matematic (metoda celor mai mici ptrate):
se scrie ecuaia dreptei de regresie:
Y=a+bX
A =a+b cx

A = absorbana; c
x
= concentraia necunoscut
se calculeaz parametrii a i b - cu ajutorul unui program pentru calcularea parametrilor dreptei
de regresie.
se nlocuiesc n ecuaia dreptei de regresie valorile parametrilor asi b
se calculeaz concentraia necunoscut a soluiei de AO.
6. Se compar valoarea concentraiei obinut prin metoda grafic cu valoarea
obinut prin metoda matematic .

5. Rezultat


n funcie de masa probei, volumul final al soluiei, softul aparatului prelucreaz aceste date i
afieaz direct rezultatul.
Se ia n considerare media celer dou determinri, dac sunt ndeplinite condiiile de
repetabilitate.
r-repetabilitatea : valoarea sub care diferena absolut dintre rezultatele a dou teste
separate obinut n condiii de repetabilitate (de exemplu : aceeai prob, acelai
operator, acelai aparat, acelai laborator i interval scurt de timp) se situeaz n limitele
unei probabiliti specifice ( n principiu 95%), astfel r= 2.8xs(r).
s(r) - deviaia standard, calculat din rezultatele obinute n condiii de repetabilitate.